DE69023789T2

DE69023789T2 - Verfahren zur Herstellung der Hinc-II-Restriktionsendonuklease und Methylase.

Info

Publication number: DE69023789T2
Application number: DE69023789T
Authority: DE
Inventors: Jack Stanley Benner; Phyllis A Rees
Original assignee: New England Biolabs Inc
Current assignee: New England Biolabs Inc
Priority date: 1989-03-15
Filing date: 1990-03-15
Publication date: 1996-08-08
Anticipated expiration: 2010-03-16
Also published as: JPH0322978A; JP2672683B2; EP0388212A1; EP0388212B1; JPH1080284A; CA2012149C; JP3156759B2; CA2012149A1; US5015581A; DE69023789D1; DE388212T1; USRE35248E

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Klone für die Hinc II- Restriktionsendonuklease und Modifikationsmethylase, sowie die Herstellung dieser Enzyme aus den Klonen.
Restriktionsendonukleasen sind eine Klasse von Enzymen, die natürlich in Bakterien vorkommen. Wenn sie von anderen verunreinigenden bakteriellen Bestandteilen gereinigt werden, können Restriktionsendonukleasen im Labor verwendet werden, um DNA-Moleküle in präzise Fragmente zu zertrennen. Diese Eigenschaft ermöglicht DNA-Molekülen, eindeutig identifiziert und in ihre aufbauenden Gene fraktioniert zu werden. Restriktionsendonukleasen haben sich als unentbehrliche Werkzeuge in der modernen genetischen Forschung erwiesen. Sie sind die biochemischen "Scheren", mittels derer Gentechnologie und -analyse durchgeführt werden.
Restriktionsendonukleasen wirken, indem sie bestimmte Nukleotidsequenzen (die "Erkennungssequenz") entlang des DNA-Moleküls erkennen und an diese binden. Wenn sie gebunden sind, spalten sie das Molekül innerhalb oder an einer Seite der Sequenz. Verschiedene Restriktionsendonukleasen haben eine Affinität für verschiedene Erkennungssequenzen. Über einhundert verschiedene Restriktionsendonukleasen sind unter vielen Hunderten von Bakterienspezies, die bis heute untersucht wurden, identifiziert worden.
Bakterien besitzen gewöhnlich nur eine kleine Anzahl von Restriktionsendonukleasen pro Spezies. Die Endonukleasen werden gemäß den Bakterien benannt, aus welchen sie abgeleitet sind. Somit synthetisiert beispielsweise die Spezies Haemophilus aegyptius 3 verschiedene Restriktionsendonukleasen, welche Hae I, Hae II und Hae in genannt werden. Diese Enzyme erkennen und spalten die Sequenzen (AT)GGCC(AT), PuGCGCPy bzw. GGCC. Andererseits syntheti-Seite - 1 -siert Escherichia coli RY13 nur ein Enzym, EcoR I, welches die Sequenz GAATTC erkennt.
Während man nicht durch eine Theorie gebunden sein möchte, wird angenommen, daß Restriktionsendonukleasen in der Natur eine schützende Rolle beim Wohlergehen der Bakterienzelle spielen. Sie ermöglichen Bakterien, einer Infektion durch fremde DNA-Moleküle, wie Viren und Plasmide, zu widerstehen, welche sie andernfalls zerstören oder parasitieren würden. Sie verleihen eine Resistenz, indem sie an infizierende DNA-Moleküle binden und diese jedesmal spalten, wenn die Erkennungssequenz auftritt. Das Zertrennen, welches stattfindet, inaktiviert viele der infizierenden Gene und macht die DNA für einen weiteren Abbau durch Exonukleasen empfänglich.
Ein zweiter Bestandteil von bakteriellen Schutzsystemen sind die Modifikationsmethylasen. Diese Enzyme sind komplementär zu den Restriktionsendonukleasen und sie stellen das Mittel zur Verfügung, durch welches Bakterien in der Lage sind, ihre eigene DNA zu schützen und sie von fremder, infizierender DNA zu unterscheiden. Modifikationsmethylasen erkennen und binden an dieselbe Nukleotid-Erkennungssequenz wie die entsprechende Restriktionsendonuklease, aber anstatt die DNA zu zertrennen, modifizieren sie chemisch das eine oder andere der Nukleotide innerhalb der Sequenz durch die Zufügung einer Methylgruppe. Gefolgt auf die Methylierung wird die Erkennungssequenz nicht länger durch die Restriktionsendonuklease gebunden oder gespalten. Die DNA einer Bakterienzelle ist mittels der Aktivität ihrer Modifikationsmethylase stets vollständig modifiziert und ist daher völlig unempfindlich gegenüber der Gegenwart der endogenen Restriktionsendonuklease. Es ist nur unmodifizierte, und daher identifizierbar fremde DNA, welche empfindlich gegenüber einer Erkennung und einem Angriff der Restriktionsendonuklease ist.
Mit dem Aufkommen der Gentechnologie ist es nun möglich, Gene zu klonieren und die Proteine und Enzyme, welche sie codieren, in größeren Mengen herzustellen, als sie durch herkömmliche Reinigungstechniken erhältlich sind. Der Schlüssel, um Klone von Restriktionsendonukleasegenen zu isolieren, ist, ein einfaches und verläßliches Verfahren zu entwickeln, um solche Klone innerhalb komplexer "Bibliotheken", d.h. Populationen von Klonen, die durch "Schrotschuß"-Verfahren abgeleitet wurden, zu identifizieren, wenn sie mit Häufigkeiten auftreten, die so niedrig wie 10&supmin;³ bis 10&supmin;&sup4; sind. Vorzugsweise sollte das Verfahren selektiv sein, so daß die unerwünschte Mehrheit der Klone zerstört wird, während die erwünschten, seltenen Klone überleben.
Restriktions-Modifikationssysteme vom Typ II werden mit wachsender Häufigkeit kloniert. Die ersten klonierten Systeme verwendeten eine Bakteriophageninfektion als ein Mittel, um Restriktionsendonukleaseklone zu identifizieren oder zu selektieren (Hha II: Mann et al., Gene 3: 97 - 112 (1978); EcoRr II: Kosykh et al., Molec. gen. Genet. 178: 717 - 719 (1980); Pst 1: Walder et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1503 - 1507 (1981)). Da die Gegenwart von Restriktions-Modifikationssystemen in Bakterien diesen ermöglicht, einer Infektion durch Bakteriophagen zu widerstehen, können Zellen, welche klonierte Restriktions-Modifikationsgene tragen, im Prinzip selektiv als Überlebende aus Bibliotheken isoliert werden, die einem Phagen ausgesetzt wurden. Jedoch wurde gefunden, daß dieses Verfahren nur einem beschränkten Wert hat. Insbesondere wurde gefunden, daß klonierte Restriktions-Modifikationsgene nicht immer eine ausreichende Phagenresistenz zeigen, um ein selektives Überleben zu ermöglichen.
Ein anderer Klonierungsansatz umfaßt ein Übertragen von Systemen, welche anfänglich als plasmidgetragen charakterisiert wurden, in E. coli-Klonierungsplasmide (EcoR V: Bougueleret et al., Nucleic Acids Res. 12: 3659 - 3676 (1984);
PaeR7: Gingeras und Brooks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 402 - 406 (1983); Theriault und Roy, Gene 19: 355 - 359 (1982); Pvu II: Blumenthal et al., J. Bacteriol. 164: 501 - 509 (1985)).
Ein dritter Ansatz, und einer, der verwendet wird, um eine wachsende Anzahl von Systemen zu klonieren, umfaßt das Selektieren auf ein aktives Methylasegen, siehe z.B. EPA- Veröffentlichung Nr. 193,413, veröffentlicht am 3. September 1986 und (BsuR I: Kiss et al., Nucleic Acids Res. 13: 6403 - 6421 (1985)). Da Restriktions- und Modifikationsgene dazu neigen, eng verbunden zu sein, können Klone, die beide Gene enthalten, oft durch ein Selektieren auf nur das eine Gen isoliert werden. Die Selektion auf Methylaseaktivität ergibt jedoch nicht immer ein vollständiges Restriktions- Modifikationssystem, sondern ergibt statt dessen manchmal nur das Methylasegen (BspR I: Szomolanyi et al., Gene 10: 219 - 225 (1980); Bcn I: Janulaitis et al., Gene 20: 197 - 204 (1982); BsuR I: Kiss und Baldauf, Gene 21: 111 - 119 (1983); und Msp I: Walder et al., J. Biol. Chem. 258: 1235 - 1241 (1983)).
Ein potentielles Hindernis beim Klonieren von Restriktions- Modifikationsgenen liegt in dem Versuch, das Endonukleasegen in einen Wirt einzuführen, der noch nicht durch Modifikation geschützt ist. Wenn das Methylasegen und das Endonukleasegen zusammen als ein einziger Klon eingeführt werden, muß die Methylase die Wirts-DNA schützend modifizieren, bevor die Endonuklease die Möglichkeit hat, diese zu spalten. Gelegentlich kann es daher nur möglich sein, die Gene aufeinanderfolgend zu klonieren, zuerst die Methylase und dann die Endonuklease. Ein anderes Hindernis beim Klonieren von Restriktions-Modifikationssystemen liegt in der Entdekkung, daß einige Stämme von E. coli nachteilig auf eine Cytosin- oder Adeninmodifikation reagieren; sie besitzen Systeme, welche DNA zerstören, die methyliertes Cytosin (Raleigh und Wilson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 9070 - 9074 (1986)) oder methyliertes Adenin (Heitman und Model, J. Bact. 196: 3243 - 3250 (1987); Raleigh, Trimarchi und Revel, Genetics (im Druck)) enthält. Cytosinspezifische oder adeninspezifische Methylasegene können nicht leicht,
entweder allein oder zusammen mit ihren entsprechenden Endonukleasegenen, in diese Stämme kloniert werden. Um dieses Problem zu vermeiden ist es nötig, Mutantenstämme von E. coli (McrA&supmin; und McrB&supmin; oder Mrr&supmin;) zu verwenden, bei welchen diese Systeme defekt sind.
Da gereinigte Restriktionsendonukleasen, und in einem geringeren Ausmaß Modifikationsmethylasen, nützliche Werkzeuge zum Charakterisieren und Umordnen von DNA im Labor sind, besteht ein kommerzieller Ansporn, Stämme von Bakterien durch rekombinante DNA-Techniken zu erhalten, welche diese Enzyme im Überfluß synthetisieren. Solche Stämme wären nützlich, da sie die Aufgabe der Reinigung vereinfachen würden und ebenfalls das Mittel zur Produktion in kommerziell nützlichen Mengen zur Verfügung stellen würden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden ein Klon, welcher die Gene für die Hinc II-Restriktionsendonuklease und Modifikationsmethylase enthält, welche aus Haemophilus influenzae Rc (vorzugsweise Haemophilus influenzae Rc NEB-Stamm #126, von welchem am 27. Februar 1989 gemäß den Vorschriften des Budapester Vertrages bei der ATCC unter der Bezeichnungsnummer 53876 eine Probe hinterlegt wurde) erhältlich sind, wie auch entsprechende Verfahren für die Herstellung der Enzyme zur Verfügung gestellt. Insbesondere betrifft diese Erfindung Klone, welche die Restriktionsendonuklease Hinc II, ein Enzym, das die DNA-Sequenz GTPy PuAC erkennt und wie durch den Pfeil angegeben zwischen dem ersten 5' Py und Pu spaltet, exprimieren. Siehe Landy, Ruesdisueli, Robinson und Ross, Biochemistry 13: 2134 - 2142 (1974); Kelly und Smith, J. Mol. Biol. 51: 393 - 409 (1970); Roy und Smith, J. Mol. Biol. 81: 427 - 444 (1973); Roy und Smith, J. Mol. Biol. 81: 445 - 459 (1973); Smith und Wilcox, J. Mol. Biol. 51: 379 - 391 (1970), auf deren Offenbarung hiermit vollinhaltlich Bezug genommen wird.
Das bevorzugte Verfahren zum Klonieren dieses Enzyms umfaßt das Bilden einer Bibliothek, welche die DNA aus Haemophilus influenzae Rc enthält, das Isolieren jener Klone, welche DNA enthalten, die für die Hinc II-Modifikationsmethylase codiert, und das Screenen unter diesen, um jene zu identifizieren, die ebenfalls das Hinc II-Restriktionsendonukle asegen enthalten.
Figur 1 stellt das Schema zum Klonieren der Hinc II- Restriktionsendonuklease dar.
Figur 2 stellt das Schema zum Herstellen der Hinc II- Restriktionsendonuklease dar.
Figur 3 ist eine Restriktionskarte des 3,0 Kb-Hind III- Fragmentes aus Haemophilus influenzae Rc, welches die Hinc II-Restriktionsendonuklease und Modifikationsmethylase codiert. Das Fragment wurde in die Hind III-Stelle von pBIIHI.2 (ATCC 67902) kloniert, um p(pBIIHI.2)HincIIRM-8.0- A1 zu erzeugen, und anschließend in pUC19 (ATCC 37254) subkloniert, um p(pUC19)HincIIRM-5.7-4 und p(pUC19)HincIIRM- 5.7-10 zu erzeugen.
Eine Probe von pBIIHI.2 wurde am 27. Februar 1989 gemäß den Vorschriften des Budapester Vertrages bei der ATCC unter der Bezeichnungsnummer 67902 hinterlegt.
Figur 4 ist eine Fotografie eines Agarosegels, welches die Hinc II-Restriktionsendonukleaseaktivität in Zellextrakten von E. coli RR1 (ATCC 31343) zeigt, welche p(pUC19)HincIIRM-5.7-4 und p(pUC19)HincIIRM-5.7-10 (NEB #520) trägt.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Klonieren von Hinc II-Restriktions- und Modifikationsgenen und zum Herstellen der Restriktionsendonuklease Hinc II aus dadurch hergestellten Klonen zur Verfügung. Dieser Ansatz nutzt die Tatsache aus, daß Klone auf der Grundlage, daß sie exprimierte Hinc II-Restriktions- und Methylasegene enthielten, durch die Verwendung einer Endonukleaseselektion selektiert wurden. Solche Klone sind gegenüber einem Verdau in vitro durch die Hinc II-Restriktionsendonuklease resistent.
Die hierin beschriebenen Verfahren, durch welche das Hinc II-Restriktionsgen und Methylasegen vorzugsweise kloniert und exprimiert werden, umfassen die folgenden Schritte:
1. Die genomische DNA des Haemophilus influenzae Rc-Stammes wird gereinigt.
2. Die genomische DNA wird vollständig mit einer Restriktionsendonuklease, wie z.B. der Bgl II-Restriktionsendonuklease, verdaut.
3. Die resultierenden Bgl II-Fragmente werden in die Bgl II-Klonierungsstelle eines Klonierungsvektors, wie z.B. pBIIOI (ATCC 67901), oder die BamH I-Stelle von pUC19 (ATCC 37254) oder pBR322 (ATCC 37017) oder pACYC177 (ATCC 37031) ligiert und die Mischung wird verwendet, um eine geeignete Wirtszelle, wie z.B. E. coli RR1-Zellen, welche mrr&supmin; sind, zu transformieren.
Eine Probe von pBIIOI wurde am 27. Februar 1989 gemäß den Vorschriften des Budapester Vertrages bei der ATCC unter der Bezeichnungsnummer 67901 hinterlegt. Die folgenden Vektoren sind öffentlich zugänglich: pUC19 (ATCC 37254), pBR322 (ATCC 37017), pACYC177 (ATCC 37031).
4. Die transformierte Mischung wird auf Medien plattiert, welche selektiv für transformierte Zellen sind, wie z.B. die Antibiotika Ampicillin, Tetracyclin oder Chloramphenicol. Nach einer Inkubation werden die transformierten Kolonien zu einer einzigen Kultur, der Zellbibliothek, zusammengesammelt.
5. Die rekombinanten Plasmide werden in toto aus der Zellbibliothek gereinigt, um die Plasmidbibliothek zu erzeugen.
6. Die Plasmidbibliothek wird vollständig mit der Hinc II-Restriktionsendonuklease verdaut, welche aus Haemophilus influenzae Rc durch ein Verfahren hergestellt wurde, das dem in Watson et al., supra, beschriebenen ähnelt. Der Hinc II-Verdau zerstört differentiell unmodifizierte, nicht-methylasehaltige Klone, was die relative Häufigkeit von Hinc II-Methylase-Klonen erhöht.
7. Die selektierte DNA wird in einen geeigneten Wirt, wie z.B. E. coli RR1, zurücktransformiert und Transformanten werden durch Plattieren auf selektiven Medien gewonnen. Die Kolonien werden gepickt und ihre DNA wird auf die Gegenwart des Hinc II-Modifikationsgens hin analysiert: die Plasmide, welche sie tragen, werden gereinigt und mit der Hinc II- Restriktionsendonuklease inkubiert, um zu bestimmen, ob sie resistent gegenüber einem Verdau sind. Die gesamte zelluläre DNA (chromosomale und Plasmid-) wird ebenfalls gereinigt und mit der Hinc II-Restriktionsendonuklease inkubiert. Die DNA von Klonen, die das Hinc II-Modifikationsgen tragen, sollte vollständig modifiziert sein und sowohl die Plasmid-DNA als auch die gesamte DNA sollte im wesentlichen resistent gegenüber einem Verdau sein.
8. Die Hinc II-Restriktionsendonuklease wird aus Haemophilus influenzae Rc-Zellen hergestellt, welche die Hinc II-Restriktions- und Modifikationsgene tragen. Die Zellen werden in einem Fermenter in einem Vollmedium, das Ampicillin enthält, vermehrt.
9. Die Zellen werden durch Zentrifugation geerntet.
10. Die Zellen werden durch Beschallung aufgebrochen, um einen rohen Zellextrakt herzustellen, welcher die Hinc II- Restriktionsendonukleaseaktivität enthält.
11. Der rohe Zellextrakt, welcher die Hinc II-Restriktionsendonukleaseaktivität enthält, wird durch standardmäßige Ionenaustausch- und Affinitätschromatographie-Techniken gereinigt.
12. Die so gereinigte Endonuklease ist bei einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese homogen und hat ein Molekulargewicht von 27.000 Dalton und eine spezifische Aktivität, titriert auf Lambda-DNA, von ungefähr 250.000 Einheiten/mg Protein.
13. Die aminoterminale Sequenz der Endonuklease wird erhalten, und eine DNA-Oligosonde wird auf der Grundlage der Proteinsequenz hergestellt.
14. Die Lage der Endonuklease wird in Bezug auf die Methylase wie auch das influenzae Rc-Genoms kartiert.
15. Genomische DNA aus Haemophilus influenzae Rc wird vollständig mit einer Restriktionsendonuklease, wie z.B. der Hind III-Restriktionsendonuklease, verdaut.
16. Die resultierenden Hind III-Fragmente werden in die Hind III-Klonierungsstelle eines Klonierungsvektors, wie z.B. pBIIHI.2, oder die Hind III-Stelle von pUC19, pBR322 oder pACYC177 ligiert und die Mischung wird verwendet, um eine geeignete Wirtszelle, wie z.B. E. coli RR1-Zellen, zu transformieren.
17. Die transformierte Mischung wird auf Medien plattiert, welche selektiv für transformierte Zellen sind, wie z.B. die Antibiotika Ampicillin, Streptomycin oder Chloramphenicol. Nach einer Inkubation werden die transformierten Kolonien zu einer einzigen Kultur, der Zellbibliothek, zusammengesammelt.
18. Die rekombinanten Plasmide werden in toto aus der Zellbibliothek gereinigt, um die Plasmidbibliothek herzustellen.
19. Die Plasmidbibliothek wird vollständig mit der Hinc II-Restriktionsendonuklease verdaut, welche aus Haemophilus influenzae Rc durch ein Verfahren hergestellt wurde, das dem in Watson et al., supra, beschriebenen ähnelt. Der Hinc II-Verdau zerstört differentiell unmodifizierte, nicht-methylasehaltige Klone, was die relative Häufigkeit von Hinc II-Methylase-Klonen erhöht.
20. Die selektierte DNA wird in einen geeigneten Wirt, wie z.B. E. coli RR1, zurücktransformiert und Transformanten werden durch Plattieren auf selektiven Medien gewonnen. Die Kolonien werden gepickt und ihre DNA wird auf die Gegenwart des Hinc II-Modifikationsgens hin analysiert: die Plasmide, welche sie tragen, werden gereinigt und mit der Hinc II- Restriktionsendonuklease inkubiert, um zu bestimmen, ob sie resistent gegenüber einem Verdau sind. Die gesamte zelluläre DNA (chromosomale und Plasmid-) wird ebenfalls gereinigt und mit der Hinc II-Restriktionsendonuklease inkubiert. Die DNA von Klonen, die das Hinc II-Modifikationsgen tragen, sollte vollständig modifiziert sein und sowohl die Plasmid-DNA als auch die gesamte DNA sollte im wesentlichen resistent gegenüber einem Verdau sein.
21. Klone, welche die Hinc II-Restriktionsendonuklease tragen, werden identifiziert, indem Rohextrakte der Klone hergestellt werden, von denen bestimmt wurde, daß sie das Hinc II-Methylasegen tragen, und indem der Rohextrakt auf Hinc II-Restriktionsendonukleaseaktivität hin getestet wird. Das Niveau der Hinc II-Aktivität in dem rohen Zellextrakt wird auf ungefähr 1.000 Einheiten pro Gramm an Zellen des Klons p(pBIIHI.2)HincIIRM-8.0-Al bestimmt.
22. Das Hind III-Fragment, welches die Methylase- und Endonukleasegene enthielt, wurde in mit Hind III gespaltenen und dephosphorylierten pUC19 subkloniert.
23. Der Klon, welcher die rekombinanten Plasmide p(pUC19)HincIIRM-5.7-4 und p(pUC19)HincIIRM-5.7-10 enthält, welcher positiv im Hinblick auf die Hinc II-Restriktionsendonukleaseaktivität ist, enthält ein einzelnes 3,0 Kb- Hind III-DNA-Fragment, das in die Hind III-Klonierungsstelle von pUC19 eingefügt ist.
24. Eine Anzahl von Restriktionsendonukleasestellen für verschiedene Restriktionsendonukleasen wurde auf diesem Plasmid kartiert und ist in Figur 3 gezeigt. Die Lagen der Gene wurden durch Deletionssubklonieren und Kartieren über Southern-Hybridisierungen unter Verwendung von DNA-Oligomeren als Sonden bestimmt.
25. Die Hinc II-Restriktionsendonuklease wird aus Zellen hergestellt, welche die Hinc II-Restriktions- und Modifikationsgene auf dem Plasmid p(pUC19)HincIIRM-5.7-10 tragen. Die Zellen werden in einem Fermenter in einem Vollmedium, welches Ampicillin enthält, vermehrt.
26. Die Zellen werden durch Zentrifugation geerntet.
27. Die Zellen werden durch Beschallung aufgebrochen, um einen rohen Zellextrakt herzustellen, der die Hinc II- Restriktionsendonukleaseaktivität enthält.
28. Der rohe Zellextrakt, welcher die Hinc II-Restriktionsendonukleaseaktivität enthält, wird durch standardmäßige Ionenaustausch- und Affinitätschromatographie-Techniken gereinigt.
29. Es wird gefunden, daß die so gereinigte Endonuklease bei einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese homogen ist und ein Molekulargewicht von 27.000 Dalton und eine spezifische Aktivität von ungefähr 250.000 Einheiten/mg Protein, titriert auf Lambda-DNA, aufweist.
Obwohl die oben ausgeführten Schritte die bevorzugte Weise zum Praktizieren der vorliegenden Erfindung darstellen, wird es den Fachleuten klar sein, daß der oben beschriebene Ansatz gemäß im Stand der Technik bekannten Techniken variieren kann.
Das folgende Beispiel wird angegeben, um Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darzustellen, wie sie derzeit bevorzugt praktiziert wird. Man wird verstehen, daß dieses Beispiel zur Veranschaulichung dient und daß die Erfindung, außer wie in den angefügten Ansprüchen angegeben, nicht als darauf beschränkt angesehen werden soll.

BEISPIEL

Klonieren des Hinc II-Restriktionsendonukleasegens

1. Reinigung der genomischen DNA: Ungefähr fünf Gramm Haemophilus influenzae Rc-Zellen wurden aufgetaut und in 0,1 M Tris-HCl, pH 7,1, 0,1 M EDTA (25 ml) in einem Corning-Plastikröhrchen (50 ml) resuspendiert. Eine Lösung von 60 mg Lysozym in 35 ml des obigen Puffers wurde auf zwei 50 ml-Plastikröhrchen verteilt und gleiche Portionen (15 ml) der Zellsuspension wurden zu jedem zugegeben. Die Lösungen wurden fünfzehn Minuten lang bei 37ºC inkubiert. SDS wurde von einer 20%igen Stammlösung zugegeben, um die Endkonzentration von SDS auf 1 % einzustellen. 200 µl einer Proteinase K (20 mg/ml Stammlösung) wurden zugegeben und eine Stunde lang bei 37ºC inkubiert. Die Lösung erschien zu diesem Zeitpunkt zähflüssig (stringy) und diffus, aber war nicht klar. 2 ml 10 % SDS/8 % Sarcosyl wurden zu den Röhrchen zugegeben (jeweils 1 ml) und zwei Stunden lang bei 55ºC erwärmt. Die Probe blieb zähflüssig aber nicht völlig aufgeklart. Die Proben wurden - mit einem einzigen Wechsel - insgesamt 16 Stunden lang gegen TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,1, 1 mM EDTA) (2 l) dialysiert. Nach der Dialyse wurde die Lösung (98 ml) durch Verdünnung mit einem gleichen Volumen TE pH 8,0 für CsCl-Gradienten vorbereitet, in zwei Portionen aufgeteilt, und zu jeder wurden 98,0 g CsCl und 1 ml 5 mg/ml Ethidiumbromid zugegeben. Die zwanzig Röhrchen wurden 48 Stunden lang bei 44.000 UpM in einem Ti7O-Rotor zentrifugiert. Die Banden wurden entfernt und mit wassergesättigtem Isobutanol extrahiert. Die Lösung wurde gegen denselben Puffer (4 1) wie vorher dialysiert und dann mit Phenol und Chloroform extrahiert (jeweils einmal). Diese Lösung wurde erneut dialysiert, um Phenol zu entfernen, und wurde dann einer Elektrophorese unterworfen.
2. Grenzverdau (limit digestion): Die gereinigte DNA wurde mit Bgl II geschnitten, um wie folgt einen vollständigen Verdau zu erreichen: 300 µl DNA mit 100 µg/ml in 10 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 100 mM NaCl, 10 mM Mercaptoethanol-Puffer, wurden in drei Röhrchen verteilt. Zu dem Röhrchen wurden 50 Einheiten Bgl II zugegeben. Die Röhrchen wurden eine Stunde lang bei 37ºC inkubiert, dann mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. Die Pellets wurden in 300 µl 10 mM Tris-HCL, 1 mM EDTA, pH 8, erneut gelöst und 10 µl von jedem wurden durch Agarosegelelektrophorese analysiert.
3. Ligation: Die fragmentierte DNA wurde wie folgt in pBIIOI (pBR322 mit einem Bgl II-Linker, welcher in die EcoR I-Stelle eingefügt war) ligiert: 10,0 µg mit Bgl II verdaute Haemophilus influenzae Rc-DNA (100 µl) wurden mit 2,0 µg mit Bgl II gespaltenem und dephosphoryliertem pBIIOI (20,0 µl) gemischt und mit Ethanol gefüllt. Die DNA wurde 15 Minuten lang bei 12.000 g und 4ºC zentrifugiert und einmal mit 100 µl 70%igem Ethanol gewaschen. Die DNA wurde in 99 µl 1X-Ligationspuffer (50 mM Tris, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP) resuspendiert, 1 µl T4-DNA-Ligase wurde zugegeben und der Mischung wurde erlaubt, 16 Stunden lang bei 16ºC zu inkubieren. Aliquots von 2,5 und 5,0 µl wurden verwendet, um den 5. coli-Stamm RR1 wie folgt zu transformieren: Jedes Aliquot wurde mit 200 µl eiskalten kompetenten E. coli RR1-Zellen gemischt und 30 Minuten lang auf Eis gestellt. Nach einem 2-minütigen Wärmeschock bei 42ºC wurden die Zellen mit einem ml Luria-Nährlösung (L- Nährlösung) verdünnt und eine Stunde lang bei 37ºC wachsen gelassen.
4. Primäre Zellbibliothek: Die transformierten Zellkulturen wurden zentrifugiert, in 250 µl-Volumen resuspendiert und auf Luria-Agar(L-Agar)-Platten, welche 100 µg/ml Ampicillin enthielten, plattiert. Nach einer Inkubation über Nacht bei 37ºC wurden die Platten entfernt und die ungefähr 5000 Kolonien in 25 ml LB mit Antibiotikum abgekratzt. Aus diesen Zellen wurde wie folgt Plasmid-DNA präpariert: die Zellen wurden durch Zentrifugation pelletiert und drei Gramm Zellpaste wurden in 14 ml 25 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA pH 8,0 und 50 InM Glucose resuspendiert. Die Suspension wurde auf 4,0 mg/ml an Lysozym gebracht und 5 Minuten lang bei 25 Grad inkubiert. Ein 27 ml-Aliquot aus 1%igem Natriumdodecylsulfat und 0,2 N NaOH wurde zugegeben, gefolgt von einem Mischen der Lösung, und es wurde 5 Minuten lang bei Grad inkubiert. Die genomische DNA wurde durch die Zugabe von 20 ml eiskaltem 3 M Kaliumacetat, pH 4,8, gefällt, 10 Sekunden lang leicht verwirbelt, 5 Minuten lang auf Eis gelassen und 10 Minuten lang bei 12.000 xg zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und mit einem gleichen Volumen Phenol/Chloroform (1:1) extrahiert. Die Schichten wurden durch eine Zentrifugation für 5 Minuten bei 10.000 xg getrennt. Die obere Schicht wurde entfernt und mit einem gleichen Volumen Chloroform extrahiert. Die Schichten wurden durch eine Zentrifugation für 5 Minuten bei 10.000 g getrennt. Die obere Schicht wurde entfernt und die Nukleinsäuren wurden durch die Zugabe von zwei Volumen Ethanol gefällt. Der Niederschlag wurde durch eine 20 Minuten lange Zentrifugation bei 12.000 xg gesammelt. Das Pellet wurde einmal mit 70%igem Ethanol gewaschen und wie vorher erneut pelletiert. Das Pellet wurde unter Unterdruck getrocknet und in 8 ml 10 mM Tris-HCL, 1 mM EDTA, pH 8,0 resuspendiert. Die DNA-Lösung wurde durch die Zugabe von 8,9 Gramm Cäsiumchlorid für eine Cäsiumchlorid-Ethidiumbromid-Gleichgewichtsdichtezentrifugation vorbereitet und 0,9 ml einer Ethidiumbromid-Lösung (5 mg/ml) wurden zugegeben. Die DNA- Lösung wurde 48 Stunden lang bei 44.000 UpM zentrifugiert und die resultierende DNA-Plasmid-Bande wurde mit einer Spritze und einer 18 g-Nadel entfernt. Das Ethidiumbromid wurde entfernt, indem mit einem gleichen Volumen von CsCl- Wasser-gesättigtem Isopropanol extrahiert wurde. Das Cäsiumchlorid wurde durch Dialyse entfernt. Die DNA wurde mit einem gleichen Volumen Phenol/Chloroform (1:1) extrahiert und mit Ethanol gefällt. Das resultierende DNA-Pellet wurde in 1,0 ml 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0 resuspendiert.
5. Primäre Selektion und selektierte Bibliothek: 2 µg (30,0 µl) der Plasmidbibliothek wurden in 60 µl Restriktionsendonuklease-Verdaupuffer (10 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM Mercaptoethanol, 100 mM NaCl und 100 µg Rinderserumalbumin) verdünnt. 100 Einheiten (3 µl) Hinc II- Restriktionsendonuklease wurden zugegeben und das Röhrchen wurde 2 Stunden lang bei 37ºC inkubiert, nach welcher Zeit 7 U (1 µl) Kalbsintestinumphosphatase zugegeben wurden, und die Reaktion wurde für weitere 30 Minuten inkubiert. Aliquots dieser Reaktionsmischung, 2 µl und 4 µl, wurden mit 200 µl eiskalten kompetenten E. coli RRl-Zellen gemischt und transformiert, plattiert und über Nacht kultiviert, wie für die primäre Bibliothek.
6. Analyse von Individuen: Kolonien aus der obigen Transformation wurden gepickt und auf LB-Agarplatten, welche Ampicillin und Tetracyclin enthielten, plattiert. Achtzehn Kolonien, welche amp und tet waren, wurden in 10 ml Kulturen kultiviert und die Plasmide, welche sie trugen, wurden durch das folgende Miniprep-Reinigungsverfahren, wel ches ausgehend von dem Verfahren von Birnboim und Doly (Nucleic Acids Res. 7: 1513 (1979)) angepaßt wurde, präpariert.
Miniprepverfahren: Jede Kultur wurde wie folgt verarbeitet: Die 1,5 ml-Übernachtkultur wurde 5 Minuten lang bei 6.000 xg pelletiert. Der Überstand wurde abgegossen und das Zellpellet wurde in 150 µl 25 mM Tris, 10 mM EDTA, 50 mM Glucose, pH 8,0, welche 1 mg/ml Lysozym enthielten, resuspendiert. Nach fünf Minuten bei Raumtemperatur wurden 200 µl 0,2 M NaOH, 1% SDS zu dem Röhrchen zugegeben und geschüttelt, um die Zellen zu lysieren, und dann auf Eis gestellt. Nach fünf Minuten wurden 150 µl 3 M Natriumacetat, pH 4,8, zugegeben und geschüttelt und für weitere fünf Minuten auf Eis gestellt. Der Niederschlag, welcher sich bildete, wurde 10 Minuten lang bei 12.000 xg und 4ºC abzentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und mit einem gleichen Volumen Phenol/Chloroform (1:1) extrahiert. Die Schichten wurden durch eine fünf Minuten lange Zentrifugation bei 10.000 xg getrennt. Der Überstand wurde in ein Zentrifugenröhrchen abgegossen, welches 880 µl Ethanol enthielt, und gemischt. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur wurde das Röhrchen 10 Minuten lang bei 12.000 xg zentrifugiert, um die gefällten Nukleinsäuren zu pelletieren. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet wurde erneut mit einem ml 70%igem Ethanol- Wasser gewaschen, erneut pelletiert, und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur unter Unterdruck getrocknet. Wenn es trocken war, wurde das Pellet in 50 µl 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0, welche 20 µg/ml RNase enthielten, resuspendiert und 1 Stunde lang bei 37ºC inkubiert, um die RNA zu verdauen.
Die Plasmid-Minipreps wurden nachfolgend durch Verdau mit Hinc II und Bgl II analysiert.
7. Methylasegenklone: Es wurde gefunden, daß 10 % der Plasmide, die analysiert wurden, gegenüber Hinc II resistent waren und ein Bgl II-Fragment mit ungefähr 6,2 Kb in der Länge trugen. Es wurde nachfolgend gezeigt, daß diese Plasmide nur das Hinc II-Modifikationsmethylasegen und nicht das Restriktionsendonukleasegen trugen. Die anderen 90 % der Plasmide, welche betrachtet wurden, waren gegenüber Hinc II nicht resistent und enthielten fehlerhafte Fragmente oder waren zurückligierter Vektor.
8. Restriktionsgenklone: Die oben (Abschnitt 7) als das Hinc II-Modifikationsmethylasegen tragend identifizierten Klone wurden ebenfalls auf das Hinc II-Restriktionsendonukleasegen hin getestet. Dieses wurde wie folgt durchgeführt: Der verbleibende Teil der Übernachtkultur wurde verwendet, um auf Endonukleaseaktivität zu prüfen. Dieses wurde wie folgt gemacht:

Endonukleasetests:

10X-Restriktionsendonukleasepuffer: 100 mM Tris, pH 7,5, 100 mM MgCl&sub2;, 100 mM 2-Mercaptoethanol, 1 M NaCl.
Zellextrakte wurden wie folgt hergestellt: Zellen aus einem ml wurden durch eine 5 Minuten lange Zentrifugation bei 4.000 UpM pelletiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet wurde in einem ml Beschallungspuffer (10 mM Tris, pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 0,1 mM EDTA) resuspendiert und leicht für zwei 10-Sekunden-Stöße beschallt, um die Zellen aufzubrechen. Das Röhrchen wurde zehn Minuten lang in einer Mikrozentrifuge bei 4ºC zentrifugiert, und der Überstand wurde als der Zellextrakt verwendet. Der Extrakt, 1 µl und 5 µl, wurden mit einem µg Lambda-DNA in 50 µl 1X-Restriktionsendonukleasepuffer fünfzehn Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Keiner der getesteten Klone wies eine Endonukleaseaktivität auf.
9. Hinc II-Endonuklease aus Haemophilus influenzae Rc, welche als NEB# 126 bezeichnet ist, wurde bei 37 ºC in einem Fermenter in TRY-YE-Nährlösungsmedium vermehrt, welches aus: Trypton, 10,0 g pro Liter; Hefeextrakt, 5,0 g pro Liter; NaCl, 2,0 g pro Liter; K&sub2;HPO&sub4;, 4,4 g pro Liter; Glucose, 2,0 g pro Liter; Rinderhämin, 10 mg pro Liter; NAD; DPN, 2,0 mg pro Liter, bestand. Die Zellen werden durch Zentrifugation gesammelt und die Zellpaste wird frisch verwendet oder bei -70ºC gelagert.
10. Alle nachfolgenden Schritte werden bei 4ºC durchgeführt.
11. Die Zellpaste (200 Gramm) wird aufgetaut und die Zellen werden in 400 ml Beschallungspuffer (20 mM K&sub2;PO&sub4;), pH 7,3, 0,1 mM EDTA, 10 mM B-Mercaptoethanol, 0,1 M NaCl) resuspendiert.
12. Die Zellen werden durch Beschallung aufgebrochen (250 Watt für zwei Minuten, für fünf Minuten auf Eis gekühlt, dreimal), um eine Freisetzung von ungefähr 50 mg löslichem Protein pro ml suspendierter Zellen zu erreichen.
13. Der unlösliche Zelldebris wird durch eine 20 Minuten lange Zentrifugation bei 21.000 xg entfernt.
14. Das Überstandsfluid wird auf eine Phosphocellulosesäule (5 x 35 cm) (Whatman P-11) aufgetragen, welche mit 20 mM KH&sub2;PO&sub4;, pH 6,9, 100 mM NaCl und 10 mM 2-Mercaptoethanol äquilibriert ist. Die Säule wird mit zwei Säulenvolumen des obigen Puffers gewaschen. Der Durchfluß aus der Säule wird in einem einzigen Kolben gesammelt. Hinc II-Endonuklease wird durch die Säule zurückgehalten und eluiert zwischen 0,3 und 0,6 M NaCl. Die aktivsten Fraktionen werden gepoolt und gegen 20 mM K&sub2;PO&sub4;, pH 7,3, 0,1 mM EDTA, 10 mM B- Mercaptoethanol, 0,1 M KCl dialysiert.
15. Der Pool von der Phosphocellulosesäule wird auf eine Heparin-Sepharose Cl-6B-Säule (2,5 x 25 cm) aufgetragen, welche mit 20 mM K&sub2;PO&sub4;, pH 7,4, 0,1 mM EDTA, 10 mM B- Mercaptoethanol, 0,1 M KCl äquilibriert ist, und mit zwei Säulenvolumen desselben Puffers gewaschen. Ein linearer KCl-Gradient von 0,1 M bis 1,0 M (Gesamtvolumen 700 ml) wird entwickelt und an die Säule angelegt. Zehn-ml-Fraktio nen werden gesammelt. Die Fraktionen werden mit Lambda-DNA auf die Gegenwart von Hinc II-Restriktionsendonukleaseaktivität hin getestet. Die aktiven Fraktionen werden gepoolt und gegen 100 Volumen an Puffer (20 mM K&sub2;PO&sub4;, pH 7,3, 0,1 mM EDTA, 10 mM B-Mercaptoethanol, 0,1 M KCl) dialysiert.
16. Der dialysierte Pool (50 ml) der Hinc II-Aktivität wird auf eine 1 ml-Mono Q-FPLC-Säule (Pharmacia) aufgetragen und mit Puffer S (20 mM K&sub2;PO&sub4;, pH 6,9, 10 mM B- Mercaptoethanol, 0,05 M KCl) gewaschen und ein linearer 40 ml-Gradient von 50 mM KCl bis 01,0 M KCl wird in S-Puffer entwickelt und an die Säule angelegt. Ein-ml-Fraktionen werden gesammelt und auf die Gegenwart von Hinc II-Restriktionsendonukleaseaktivität hin getestet.
17. Die mittleren Fraktionen, welche die Mehrheit der Hinc II-Aktivität enthalten, werden auf eine 1 ml-Poly Cat- A-FPLC-Säule (Pharmacia) aufgetragen und mit Puffer S (20 mM K&sub2;PO&sub4;, pH 6,9, 10 mM B-Mercaptoethanol, 0,05 M KCl) gewaschen und ein linearer 40 ml-Gradient von 50 mM KCl bis 01,0 M KCl wird in S-Puffer entwickelt und an die Säule angelegt. Ein-ml-Fraktionen werden gesammelt und auf die Gegenwart von Hinc II-Restriktionsendonukleaseaktivität hin getestet. Die zwei aktivsten Fraktionen sind homogen. Es wurde gefunden, daß die Endonuklease eine spezifische Aktivität von ungefähr 250.000 Einheiten/mg Protein und ein Molekulargewicht auf SDS-Polyacrylamidgelen von 27.000 Dalton aufwies.
18. 10 µg der homogenen Hinc II-Endonuklease wurden einer aminoterminalen Proteinsequenzierung auf einem Applied Biosystems Modell 470A Gasphasen-Proteinsequenziergerät unterworfen. Die ersten 24 Reste wurden abgebaut. Die erhaltene Sequenz war die folgende: X F I K P I X Q D I N X X L I G Q K V K X X K X (siehe Tabelle 1 für eine Erklärung des 1- Buchstabencodes für Proteinsequenzen).
19. Basierend auf der Proteinsequenz wurde ein 14er-Oligomer mit der folgenden Sequenz hergestellt: 5' ATH GGN CAR AAA GT 3' (H = A, C oder T; N = A, C, G oder T; R = A oder G), welches verwendet wurde, um die Lage des aminoterminalen Endes der Endonuklease auf p(pBIIOI)HincM-10.5-1 zu kartieren. Dieses Oligomer wurde ebenfalls verwendet, um eine DNA-Sequenz zu erhalten, welche die Proteinsequenz verifizierte, und wurde verwendet, um ein sequenzspezifisches 25er-Oligomer zu erzeugen, das die folgende Sequenz aufwies: 5' ATG AGT TTC ATA AAA CCT ATT TAT C 3'. Unter Verwendung dieses 25er-Oligomers wurde eine DNA-Sequenz erhalten, welche half, die Richtung der Endonuklease zu bestimmen, und welche weiterhin die Lage des aminoterminalen Endes der Endonuklease, wie auch den Teil des Endonukleasegens, der in p(pBIIOI)HincM-10.5-1 vorhanden war, definierte. Die erhaltene DNA-Sequenz war die folgende: 5' TAC TCA AAG TAT TTT GGA TAA ATA GTC CTA TAA TTG NNA ATA TTA ATC GGG CAA AAA GTG AAA CGT CCT AAA TCA GGT ACT CTG TCA GGT CAT GCT GCA GGG GAA CCA TTT GAA AAA TTA GTA TAT AAG TTT TTG AAA GAA AAC CTG TCA GAT TTA ACA TTT AAG CAA TAT GAA TAT CTT AAT GAT TTA TTT ATG AAG AAC CCT GCG ATA ATT GAG CAT G 3'.
Das 25er-Oligomer wurde ebenfalls verwendet, um das Endonukleasegen auf verschiedenen Restriktionsfragmenten des Hae- mophilus influenzae Rc-Genoms zu kartieren. Mit der Verwendung eines sequenzspezifischen Oligomers, welches für die Vektor-DNA erzeugt wurde, und eines Deletionsklons, von welchem bekannt war, daß er innerhalb des Methylasegens lag, wurde die Richtung des Methylasegens auf dieselbe Weise bestimmt, in welcher die Richtung des Endonukleasegens bestimmt worden war.
20. Basierend auf den in Schritt 18 erhaltenen Daten wurde gereinigte genomische Haemophilus influenzae Rc-DNA (hergestellt wie in Schritt 1) unter Verwendung von Hind III wie folgt einem Grenzverdau unterworfen: 300 µl DNA mit 100 µg/ml in 10 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 100 mM NaCl, 10 mM Mercaptoethanol-Puffer wurden in ein Röhrchen gegeben. Zu dem Röhrchen wurden 50 Einheiten Hind III zugegeben. Die Röhrchen wurden eine Stunde lang bei 37ºC inkubiert, dann mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. Die Pellets wurden in 300 µl 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0 erneut gelöst und 10 µl von jedem wurden durch Agarosegelelektrophorese analysiert.
21. Ligation: Die fragmentierte DNA wurde wie folgt in pBIIHI.2 (pNO1523, mit einem Hpa I-Linker, welcher in die Pvu II-Stelle eingefügt wurde, und einem Bgl II-Linker, welcher in die EcoR I-Stelle eingefügt wurde - der Vektor pNO1523 ist öffentlich zugänglich (ATCC 37095)) ligiert: 10,0 µg mit Hind III verdaute Haemophilus influenzae Rc-DNA (100 µl) wurden mit 2,0 µg mit Hind III gespaltenem und dephosphoryliertem pBRIHI.2 (20,0 µl) gemischt und mit Ethanol gefällt. Die DNA wurde 15 Minuten lang bei 12.000 g und 4ºC zentrifugiert und einmal mit 100 µl 70%igem Ethanol gewaschen. Die DNA wurde in 99 µl lX-Ligationspuffer (50 mM Tris, pH 7,5, 10 nM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP) resuspendiert, 1 µl T4-DNA-Ligase wurde zugegeben und der Mischung wurde erlaubt, 16 Stunden lang bei 16ºC zu inkubieren. Aliquots von 2,5 und 5,0 µl wurden verwendet, um den E. coli- Stamm RR1 wie folgt zu transformieren: Jedes Aliquot wurde mit 200 µl eiskalten kompetenten E. coli RR1-Zellen gemischt und 30 Minuten lang auf Eis gestellt. Nach einem 2-minütigen Wärmeschock bei 42ºC wurden die Zellen mit einem ml Luria-Nährlösung (L-Nährlösung) verdünnt und eine Stunde lang bei 37ºC wachsen gelassen.
22. Primäre Zellbibliothek: Hergestellt wie in Schritt 4 mit einem zusätzlichen Schritt: basierend auf den aus Schritt 18 erhaltenen Daten wurden die Bibliotheken mit dem sequenzspezifischen 25er-Oligomer (Schritt 19) sondiert, wobei nach einem Hind III-Fragment einer geeigneten Größe gesucht wurde, von welchem angenommen wurde, daß es die Endonuklease und Methylase enthielt. Dieses Fragment war in der primären Zellbibliothek vorhanden.
23. Primäre Selektion und selektierte Bibliothek: Hergestellt wie in Schritt 5.
24. Analyse von Individuen: Kolonien aus der obigen Transformation wurden gepickt und auf LB-Agarplatten, welche Ampicillin enthielten, und LB-Agarplatten, welche Ampicillin und Streptomycin enthielten, plattiert. Achtzehn Kolonien, welche amp und streps waren, wurden in 10 ml-Kulturen kultiviert und die Plasmide, welche sie trugen, wurden durch das Miniprep-Reinigungsverfahren, welches in Schritt 6 beschrieben ist, präpariert. Die Plasmidminipreps wurden nachfolgend durch Verdau mit Hinc II und Hind III analysiert.
25. Methylasegenklone: Es wurde gefunden, daß 27 % der Plasmide, welche analysiert wurden, resistent gegenüber Hinc II waren und ein Hind III-Fragment mit ungefähr 3,0 Kb in der Länge trugen. Von diesen Plasmiden wurde nachfolgend gezeigt, daß sie sowohl das Hinc II-Modifikationsmethylase- als auch das Restriktionsendonukleasegen trugen. Bei diesen Plasmiden wurde ebenfalls gefunden, daß sie jeweils eines oder mehrere fehlerhafte Fragmente trugen. Die anderen 63 % der Plasmide, welche betrachtet wurden, waren nicht resistent gegenüber Hinc II und enthielten entweder fehlerhafte Fragmente oder waren rückligierter Vektor.
26. Restriktionsgenklone: Die oben (Abschnitt 24) als das Hinc II-Modifikationsmethylasegen tragend identifizierten Klone wurden ebenfalls auf das Hinc II-Restriktionsendonukleasegen hin getestet. Dieses wurde wie in Schritt 8 beschrieben durchgeführt. Alle getesteten Klone wiesen Endonukleaseaktivität auf.
27. Es wurde gefunden, daß alle Methylase-positiven Klone die Endonuklease enthielten. Es wurde gefunden, daß diese Klone in jeder Orientierung ca. 1.000 Einheiten Hinc II- Restriktionsendonuklease pro Gramm nasser Zellpaste synthetisieren.
28. p(pBIIHI.2)HincIIRM-8.0-Al wurde verwendet, um eine isogene Reihe von E. coli-Stämmen zu transformieren, wobei nach möglichen Wirkungen gesucht wurde, welche durch jeden der Mcr A-, Mcr B- oder mrr-Phänotypen verursacht wurden. Es wurde entdeckt, daß dieser RM-Klon nicht in der Lage war, in irgendeinen der mrr&spplus;-Stämme transformiert und somit vermehrt zu werden.
29. Das 3,0 kb-Hind III-Fragment aus p(pBIIHI.2)HincIIRM-8.0-Al wurde über ein Gel präpariert und auf die folgende Weise in einer Ligationsreaktion mit Hind III-geschnittenem und dephosphoryliertem pUC19 verwendet: 250 ng des gelpräparierten 2,7 kb-Fragmentes (20 µl) wurden mit 100 ng (1 µl) mit Hind III geschnittenem und desphosphoryliertem pUC 19 gemischt und mit Ethanol gefällt. Die DNA wurde 15 Minuten lang bei 12.000 g und 4ºC zentrifugiert und einmal mit 100 µl 70%igem Ethanol gewaschen. Die DNA wurde in 10 µl 1X-Ligationspuffer (50 mM Tris, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP) resuspendiert, 1 µl T4-DNA-Ligase wurde zugegeben und der Mischung wurde erlaubt, 16 Stunden lang bei 16ºC zu inkubieren. Aliquots von 5,0 µl wurden verwendet, um E. coli-Stamm RR1 wie folgt zu transformieren: Jedes Aliquot wurde mit 200 µl eiskalten kompetenten E. coli RR1-Zellen gemischt und 30 Minuten lang auf Eis gestellt. Nach einem 2-minütigen Wärmeschock bei 42ºC wurden die Zellen mit einem ml Luria-Nährlösung (L-Nährlösung) verdünnt und eine Stunde lang bei 37ºC wachsen gelassen. Die transformierten Zellkulturen wurden zentrifugiert, in 250 µl-Volumen resuspendiert und auf Luria-Agar(L-Agar) Platten, welche 100 µg/ml Ampicillin enthielten, plattiert. Nach einer Inkubation über Nacht bei 37ºC wurden Kolonien gepickt und auf LB-Agar, welcher Ampicillin enthielt, plattiert, und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Achtzehn Kolonien, welche amp waren, wurden in 10 ml-Kulturen kultiviert, und die Plasmide, welche sie trugen, wurden durch das Mini- prep-Reinigungsverfahren, welches in Schritt 6 beschrieben ist, präpariert. Die Plasmidminipreps wurden nachfolgend durch Verdau mit Hinc II und Hind III analysiert.
30. Methylasegenklone: Es wurde gefunden, daß über 50 % der Plasmide, welche analysiert wurden, resistent gegenüber einem Hinc II-Verdau waren und ein Hind Irr-Fragment mit ungefähr 3,0 Kb in der Länge trugen. Von diesen Plasmiden wurde nachfolgend gezeigt, daß sie sowohl das Hinc II-Modifikationsmethylase- als auch das Restriktionsendonukleasegen trugen. Der Rest der Plasmide war rückligierter pUC19.
31. Restriktionsgenklone: Die oben (Abschnitt 28) als das Hinc II-Modifikationsmethylasegen tragend identifizierten Klone wurden ebenfalls auf das Hinc II-Restriktionsendonukleasegen hin getestet. Dieses wurde wie in Schritt 8 beschrieben durchgeführt. Alle getesteten Klone wiesen Endonukleaseaktivität auf.
32. Es wurde gefunden, daß alle Methylase-positiven Klone die Endonuklease enthielten. Es wurde gefunden, daß diese Klone in einer Orientierung A, p(pUC19)HincIIRM-5.7-10 (NEB #520), ca. 80.000 Einheiten Hinc II-Restriktionsendonuklease pro Gramm nasser Zellpaste und in einer Orientierung B, p(pUC19)HincIIRM-5.7-4, 2.000 Einheiten Hinc II- Restriktionsendonuklease pro Gramm nasser Zellpaste synthetisierten.
33. Das rekombinante Plasmid p(pUC)HincIIRM-10-5.7 (NEB #520), das die Gene trägt, welche die Hinc II-Restriktionsendonuklease und Methylase codieren, wurde durch Transfor mation in den E. coli-Stamm RR1 übertragen. Beim Transformieren derselben isogenen Reihe von Stämmen wie in Schritt 27 war p(pUC)HincIIRM-10-5.7 (NEB #520) in der Lage, in diese Stämme zu transformieren, war aber nicht in der Lage, in Flüssigkulturen vermehrt zu werden, die größer als 10 ml waren.
34. Hinc II-Endonuklease wurde wie in den Schritten 9 - 16 beschrieben präpariert, mit einer Änderung: die Zellen wurden in LB-B-Nährlösungsmedium kultiviert, bestehend aus: 10 Gramm pro Liter, Caseinhydrolysat; 5 Gramm pro Liter, Hefeextrakt; 10 Gramm pro Liter, NaCl; 1 Gramm pro Liter, Magnesiumchlorid-Hexahydrat; 1 Gramm pro Liter, Glucose; 100 mg pro Liter Ampicillin. Der pH wird mit NaOH auf 7,2 eingestellt. Es wurde gefunden, daß die gereinigte Endonuklease eine spezifische Aktivität von ungefähr 250.000 Einheiten/mg Protein aufwies. Tabelle 1 Aminosäuresequenz zu mRNA (DNA)-Sequenz 1-Buchstabencode Besondere Signale Ochre Amber Stop Besondere Aminosäuresymbole mehrdeutige Nukleotidabkürzungen Diese Abkürzungen entsprechen den vorgeschlagenen IUPAC-IUB-Standardabkürzungen Uracil/Thymin Guanin Cytosin Pyrimidin Adenin Purin

Claims

1. Isoliertes DNA-Segment, welches für die Hinc II- Restriktionsendonuklease codiert, wobei das isolierte DNA-Segment aus Haemophilus influenzae Rc ATCC Nr. 53876 erhältlich ist.

2. Rekombinanter DNA-Vektor, in welchen ein DNA-Segment gemäß Anspruch 1 eingefügt wurde.

3. Isoliertes DNA-Segment, welches für die Hinc II- Restriktionsendonuklease und Methylase codiert, wobei das isolierte DNA-Segment aus Haemophilus influenzae Rc ATCC Nr. 53876 erhältlich ist.

4. Klonierungsvektor, in welchen das isolierte DNA-Segment aus Anspruch 1 oder 3 eingefügt wurde.

5. Prokaryotische Wirtszelle, welche durch den Vektor aus Anspruch 2 oder 4 transformiert wurde.

6. Verfahren zur Herstellung von Hinc II-Restriktionsendonuklease, welches ein Kultivieren einer prokaryotischen Wirtszelle, die mit dem Vektor aus Anspruch 2 oder 4 transformiert wurde, unter Bedingungen für die Expression der Endonuklease umfaßt.