JPH0322978A - Hinc2制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼの製造方法 - Google Patents
Hinc2制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼの製造方法Info
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Abstract
め要約のデータは記録されません。
Description
oメチラーゼ用のクローン、並びにこのクローンからの
これらの酵素の製造に関する。
素の一種である。制限エンドヌクレアーゼを、混在する
他の細菌或分から精製した場合には、これを実験室で用
いてDNA分子を正確な断片に切断することができる。
ることができ、またその構成遺伝子に分画することがで
きる.制限エンドヌクレアーゼは、現代の遺伝子研究に
おける不可欠の道具であることが立証されている。
子工学及び分析が行なわれる。
ヌクレオチド配列(「認識配列」)を認識し、これに結
合することにより作用する。一旦結合すると、それらは
該配列内か又はその一方の銅で分子を開裂する。異なる
制限エンドヌクレアーゼは異なる認識配列に対して親和
性を有する。
に調べられた数百種の細菌種の中から同定されている。
しか有していない。エンドヌクレアーゼは、それらが由
来する細菌に従って命名される。
ptiusは、Hae I、Hae U、及びHae
l[lと名づけられた3つの異なる制限エンドヌクレア
ーゼを合成する。これらのlIliAは、それぞれ配列
(AT)GGCC(AT)、PuGCGCPy及びGG
CCを認識し、開裂する。一方、Escherichi
a coli RY13は、配列 G^^TTCを認識
する一つの醇素EcoRIのみを含威する。
然においては、制限エンドヌクレアーゼはIll[li
!ia胞の繁栄に保護的役割を演じている。制限エンド
ヌクレアーゼにより、細菌を破壊するか又はこれに寄生
するウィルス及びブラスミドのような外来DNA分子に
よる感染に対し、細菌は抵抗することができる。制限エ
ンドヌクレアーゼは、認識配列が生起するたびに@染D
NA分子に結合しこれを開裂することにより、細菌に耐
性を付与する。その結果生じる破壊番よ感染遺伝子の多
くを不活性化し、そのDNAをエキソヌクレアーゼによ
りさらに分解され易くする。
て、細菌がそれ自身のDNAを保護し、そのDNAと外
来@染DNAとを区別することができる手段を提供する
。修飾メチラーゼは対応する制限エンドヌクレアーゼと
同じヌクレオチド認識配列を認識して結合するが、DN
Aを破壊する代わりに、メチル基を付加することにより
その配列内のある又は他のヌクレオチドを化学的にrl
篩する。メチル化後、認識配列はもはや制限エンドヌク
レアーゼによって結合されないか、あるいは開裂されな
い。細菌細胞のDNAは、その修飾メチラーゼの活性に
よって常に十分に修飾され、したがって内因性制限エン
ドヌクレアーゼの存在に対して完全に非感受性である。
あるDNAは、未修飾の、したがって同定可能な外来D
NAだけである。
ーン化し、慣用の精製技術によって得られるよりも大量
に、該遺伝子がコードする崇白質及び酵素を産生ずるこ
とが可能である。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクロ
ーンを単離するためのキーポイントは、それらが10−
3〜10−4という低い頻度で生じる場合に、複雑な「
ライブラリー」中の該クローン、即ち「ショットガン」
法によって誘導されるクローンの集団を同定するための
簡単且つ確実な方法を開発することである。好ましくは
、望ましくない大多数のクローンは破壊され、望ましい
少数のクローンは生存するというような方法を選択する
必要がある。
ある。第1のクローニング系は、制限エンドヌクレアー
ゼクローンを同定又は選択する手段としてバクテリオフ
ァージ感染を用いた[Hha II :Hann等、G
ene3 : 97 〜112(1978) : E
ocRII :KOSVkh等、Holec.aen.
Genet 178:717 〜719(1980)
: Pstl : Walder等、Proc. Na
t. Acad. Sc i ,USA 78: 1
503 〜1507(1981)] . III菌中に
制限一修飾系が存在すると、細菌はバクテリオファージ
による感染に抵抗できるため、クローン化された制限一
修飾遺伝子を保有する細胞は、主として、ファージに晒
されていたライブラリーから生存細胞として選択的に単
離され得る。しかしながら、この方法はその有用性に限
界があることが判明した。即ち、クローン化された制限
一修飾遺伝子は常に十分なファージ耐性を発現して選択
的な生存を授けるわけではないことが判明した。
slid−borne)として最初に特性化された、E
.coliにクローニングプラスミドを移入する系を含
む[ EcoRV : Bougue leret等、
Nucleic AcidsRes. 12:3659
〜367B ( 1984);PaeR7:Gino
erasと8rooks,Proc.Natl.^ca
d.sci.tls^80 : 402 〜406(1
983) : TheriaultとRay,Gene
l9:355 〜359(1982): PvuII
: Blulenthal等、J.Bacterio
l. 164:501〜509, (1985) ]
。
用される方法は、活性メチラーゼ遺伝子を選択すること
を含む[例えば、EPO特許第 193,413号(1
986年 9月 3宕チ9、及びBStlRIKiss
等、Nucleic Acid Res.13:640
3 〜6421(1985)参照]。制限及び修飾遺伝
子は近接して結合する傾向があるため、両遺伝子を含有
するクローンは、正に一方の遺伝子について選択するこ
とによりしばしば単離され得る。メチル化活性について
の選択により、常に完全な制限一修飾系が得られるわけ
ではないけれども、その代わりに時々、メチラーゼ遺伝
子のみが得られる[BspRl:SZO@Olanyi
等、Gene10:219 〜225(1980)
:B c n I :Janulaitis等、Gen
e20 :197 〜204(1982) : B s
uR I : KissとBaldauf,Gene
21: 111〜119(1983) :並びにM
spl :l4alder等、J.Bio1.Chel
.258:123S 〜124H1983)] 。
障害は、前もって修飾によって防御されていない宿主に
エンドヌクレアーゼ遺伝子を導入しようとする際に生じ
る。メチラーゼ遺伝子とエンドヌクレアーゼ遺伝子が単
一クローンとして一緒に導入される場合には、エンドヌ
クレアーゼが宿主DNAを開裂する機会を有する前に、
メチラーゼは宿主DNAを保護的に修飾しなければなら
ない。したがって、時として、それら遺伝子を引き続い
て、即ち先ずメラーゼ遺伝子、次いでエンドヌクレアー
ゼ遺伝子をクローン化することが唯一可能であるかもし
れない。制限一修飾系のクローニングに対する別の障害
は、E coliのいくつかの株がシトシン又はアデ
ニン修飾に対して逆反応するという発見にある;それら
の株はメチル化シトシン[ Raleigh とーi
Ison, PrOC.Natl.^cad.Sci.
,USA 83 : 9070〜9074(1986)
] 、又はメチル化アデニン[ HeitlanとNo
del,J.Bact.,196:3243〜3250
,+1987) ]を含有するDNAを破壊する系を有
する。シトシン特異性又はアデニン特異性メチラーゼ遺
伝子は、単独であっても、あるいはそれらに対応するエ
ンドヌクレアーゼ遺伝子と一緒であっても、これらの株
中で容易にクローン化できない。この問題を回避するた
めには、これらの系を欠<E.coliの突然変異株(
Hcr^一及びHcrB ”又はHrr−)を用いる必
要がある。
飾メチラーゼは、実験室でDNAを特性づけ且つ再配列
するための有用な道具であるため、組換えDNA技術に
より、これらの酵素を大量に合成するIII菌株を得る
ことは商業的に利益となる。
的に有省輸で生産する手段を提供するので、有用である
。
zae (NEB株1126,寄託番号第53876号
として^TCCk:寄託されている)由来の旧ncI[
制限エンドヌクレアーゼ遺伝子及び修飾メチラーゼ遺伝
子を含有するクローンを提供し、且つそれらの酵素の製
造方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、DNA配
列GTPy’ PuACを認識し、且つ矢印で最初の
5’ Py.!:Puの間に示されているように開裂す
る酵素である制限エンドヌクレアーゼ旧ncIIを発現
するクO−ンに関する。これについては以下を参照され
たい: Landy, Ruesd isue l i
, Rob inson及びROSS,BiOChe
fliStry, 13:2134 〜2142(19
74) :Ke11V とSnith,J.Nol.B
iol.,51: 393 〜409(1970)
; ROVとSlith,J.Hol.Biol。,8
1 :427〜444fl973) : Row とS
nith,J.Hol.Biol.81 :445〜4
59(1973) : SlithとWi1cox,J
.Hol.Biol.,51:379〜39m970)
。これらの記載内容は参照により水明SS中に含めるも
のとする。
aenophilus influenzae Rcか
ら得たDNAを含有するライブラリーを形戊し、Hin
cl修篩メチラーゼに関してコードするDNAを含有す
るクローンを単離し、HincII制限エンドヌクレア
ーゼ遺伝子をも含有するクローンを同定するためにこれ
らの間でスクリーニングすることより或る。
グし、それによって生じるクローンから制限エンドヌク
レアーゼ旧ncIIを¥i造するための方法を提供する
。このアプローチは、エンドヌクレアーゼ選択を用いる
ことにより、発現されるlIincII制限及びメラチ
ーゼ遺伝子を含有するということに基づいてクローンが
選択されたという事実を利用する。このようなクローン
は、HincIl制限エンドヌクレアーゼによるin
vitro消化に耐性である。
ローニングし、それによって生じるクローンから旧nd
lI制限エンドヌクレアーゼを製造する方法に関する。
ローン化され、発現される本明細潅記載の方法は、以下
の段階を包含する: (1) llaelmophilus influen
zae Rc株又はHae1ophilus infl
uenzae Rd株のゲノムDNAを精製する。
ーゼのような制限エンドヌクレアーゼを用いて十分に消
化する。
I I0 1 (ATCC 67901)のようなク
ローニングベクターの8(+111クローニング部位、
又はpUc19(ATCC 37254)もしくはI)
BR322 (^TCC 37017)もしくはpA
C Y C 177(^TCC 37031)のBa
n口■部位に連結し、その混合物を用いてEcoliR
R1細胞のlrr一株のような適切な宿主細胞を形質転
換する。
ラサイクリン、又はクロラムフェニコールのような、形
質転換a胞を選択する培地上にプレーティングする。イ
ンキユベーシコンした後、形質転換コロニーを=緒に集
めて単一培養物とし、即ち、細胞ライブラリーを形成す
る。
して、ブラスミドライブラリーを作る。
り11aemophilus influenzae
Rcから調製したflinelI制限エンドヌクレアー
ゼを用いてプラスミドライブラリーを完結するまで消化
する。Hincn消化は非修飾、メチラーゼ非含有クロ
ーンを特異的に破壊し、HincIIメチラーゼクロー
ンの相対的@度を増大させる。
(1)ヨうな適切な宿主に形質転換し戻一し、選択培地
上にブレーティングすることにより形質転換体を取り出
すす。コロニーを取り上げ、HincI[修fsM伝子
の存在に関してそれらのDNAを分析する:コロニーが
保有するプラスミドを精製し、HincIIエンドヌク
レアーゼと共にインキユベートしてプラスミドが消化に
耐性であるか否かを調べる。全細胞DNA(染色体及び
プラスミドのDNA)も精製し、HincII制限エン
ドヌクレアーゼと共にインキユベートする。HincI
I修飾遺伝子を保有するクローンのDNAは十分に修飾
されねばならず、さらにブラスミドDNAと全てのDN
Aはともに実質的に消化に耐性であるべきである。
を保有するHaeiophilus influenz
ae Rc [1胞から旧ncll制限エンドヌクレア
ーゼを産生させる。この細胞を、アンビシリンを含有す
る富裕培地中に入れ、発醇槽内で増殖させる。
II制限エンドヌクレアーゼ活性を含有する粗細胞抽出
物を得る。
有する粗細胞抽出物を標準イオン交換及びアフィニティ
ーク口マトグラフィ技術により精製する。
SDSボリアクリルアミドゲル電気泳動上では均質で、
分子127,000ダルトン、ラムダDNAで力価測定
した場合、約250,000単位/蛋白質1I#gの比
活性を有している。
て、その倶白賀配列に基づいてDNAオリゴブローブを
作製する。
nfluenzaeRc及びHaenophilus
influenzae Rdゲノムに対するエンドヌク
レアーゼの位置をマップ化する。
e RcゲノムDNAを、Bindu[制限エンドヌク
レアーゼのような制限エンドヌクレアーゼを用いて十分
に消化する。Hael01)hilus influe
nzae RdグノムDNAは、Hindlll1飾及
び制限遺伝子を含むことが公知の断片を生成するCla
I又はEcoRIのような制限エンドヌクレアーゼを
用いて十分に消化され得る。
H1.2のようなクローニングベクターのHindll
lクローニング部位、又はpUC19、pBR322、
もしくはpACYC 177のHindll1部位に
連結し、その混合物を用いてE.coli R R 1
細胞のような適切な宿主細胞を形質転換する。
トレプトマイシン、又はクロラムフエニコールのような
、形質転換細胞を選択する培地上にブレーティングする
。インキュベーション後、形質転換コロニーを一緒に集
めて単一培養物とし、細胞ライブラリーを形或する。
部そっくり精製し、ブラスミドライブラリーを作る。
等が記載したと同様の方法によりllaeIophi
lusinfluenzae Rcから調製した旧nc
ll制限エンドヌクレアーゼを用いて完結するまで消化
する。旧nc■消化は未修篩、メチラーゼ非含有クロー
ンを特異的に破壊し、HincI[メチラーゼクローン
の相対的頻度を増大させる。
のような適切な宿主に形質転換し戻し、選択培地上にブ
レーティングすることにより形質転換体を取り出す。
存在に関してそれらのDNAを分析する:コ〇二−が保
有するブラスミドを精製し、HinclI制限エンドヌ
クレアーゼを用いてインキユベートして、プラス4ドが
消化に耐性であるか否かを調べる。全細胞DNA (染
色体及びブラスミドのDNA)も精製し、HincII
制限エンドヌクレアーゼを用いてインキユベートする。
十分に修飾されねばならないし、さらにブラスミドDN
A及び全てのDNAはともに実賞的に消化に耐性でなけ
ればならない。
るクローンを、HincI[メチラーゼiffta子を
保有することが確定されたクローンの粗抽出物を調製し
、HincII制限エンドヌクレアーゼ活性に関して粗
抽出物をアッセイすることにより、同定する。粗細胞抽
出物の中の旧ncII活性レベルは、クローンD(1)
B I I H I . 2 ) HincII RM
−8.0−A Iの細胞1g当たり約1,000単位で
あると確定される。
有する旧ndl[[l!li片を旧nd[[開裂及び脱
リン酸化1)UC19中にサブクローニングした。
に関して陽性である組み換えブラスミドp(pU C
19)旧nc II R M −5. 7−4及びp(
pU C 19) HiricII R M−5. 7
−10を含有するクローンは、pUc19のHind■
クローニング部位に挿入される単一の3. OkbHi
ndln D N A断片を含有する。
制限エンドヌクレアーゼ部位をこのブラスミド上でマッ
プ化したが、それを第3図に示す。遺伝子の位置は、欠
失サブクローニング(delet1onsubclon
inq)と、ブO−ブとしてDNAオリゴマーを用いる
Southernハイブリダイゼーションによるマッピ
ングとにより決定した。
ミドp(ptJ C19) HincII RM−5.
7−10上に旧ncII制限及び修aM伝子を保有する
細胞から産生させる。
で増殖させる。
linclI制限エンドヌクレアーゼ活性を含有する粗
細胞抽出物を得る。
有する粗IIIw&抽出物を標準イオン交換及びアフイ
ニティーク口マトグラフィ技術により精製する。
、SOSボリアクリルアミド電気泳動上では均質であっ
て、分子量は27,000ダルトン、ラムダDNAで力
価測定すると蛋白質1q当たり約250,000単位の
比活性を示すことが判明している.概要を記した上記の
段階は本発明を実行するための好ましい態様を示してい
るけれども、上記アプローチが当業界に公知の技術に従
って可変可能であることは当業者には明らかであろう。
態様を説明するために示す。本実施例は説明のためのも
のであり、本発明は、添付の請求の範囲に示されている
場合を除いて、これらの実施例に限定されるものではな
いと理解されたい。
f (1)ゲノムDNAfi製:約59のHealOl)h
ilLIsnfluenzae Rc細胞を解凍し、C
ornir+oプラスチッ’)チュ−7 (50d)
ニ入れた0.IH Trys −口Cj , pH7.
1 , 0.I MEDTA (25d)に再懸濁した
。上記Ia衝液35−にリゾチーム60m3を溶解した
溶液を2本の50−プラスチックチューブに分け、等1
(15m)のIllI胞懸濁液を各々に加えた。
%保存溶液からSDSを加えて、SDSの最終濃度を1
%に調整した。プOテイナーゼK(20#ISF/一で
保存)200μ』を加え、37℃で1時間インキユベー
トした。溶液は、この時点では粘賀性で且つ拡散性であ
るように見えたが、透明ではなかつた。チューブ(各1
−)に10%SOS/8%サルコシル2rl1を加え、
55℃で2時間加熱した。サンプルは依然として粘質で
あったが、全体的に透明テハなかった。サンプルをT
E ( 10lH Tris − HCl , pH7
。1 .1nMEDTA)(2j)に対して、1回のT
E交換を含めて計16時間透析した。透析後、等量のT
E ( pH8.0)で希釈してCsCj勾配液用に
溶液(98−)を調製し、これを2つに分け、各々にC
s Cl 98.09と5 ms / rd臭化エチ
ジウム1rdを添加した。20本のチューブを、T i
70口ーター中で44, OOOrl)TIで48時
間回転させた。バンドを取り出し、水飽和イソプタノー
ルで抽出した。
、次いでフェノール及びクロロホルムで抽出したく各1
回)。この溶液を再度透析してフェノールを除去し、次
いで電気泳動にかけた。
以下のような全体的消化を達成した。: 10118T
ris pH?.5, 10mHM gCJ , 1
00nH N a Cj ,2 10nHメルカプトエタノール緩衝液に 1◇0μ9/
rdで溶解したDNA300μ(を3本のチューブに分
配した。そのチューブに50単位のBalIIを加えた
。
でフェノール/クロロホルムで抽出して、エタノール沈
澱した。ペレットを101Mトリス塩酸,1118ED
TA,pH8.0. 300μp中に再溶解し、各1
0μ1をアガロースゲル電気泳動で分析した。
B I 10 1 (EcoR 1部位にBglI!リ
ンカーを挿入したpBR 322)に連結した:10.
Oμ9の8(1111消化Haemophilus i
nfluenzae Rc DNA{100μ1〉を
2.0μ9の891■開裂及び脱リン酸化1)B I
I O I (20.0μ』〉と混合して、エタノール
沈澱した。DNAを12,000gで、4℃で15分間
遠心分離し、70%エタノール100ujで1回洗浄し
た。そのDNAを99μ1の1×連結MkVIJ液(5
0lH Tris , pH7.5 , 101H
M a CJI 2,10nH DTT. 0.5l
H ATP)に再懸濁し、T4DNAリガーゼ1μ1を
加えて、その混合液を16℃で16時間インキユベート
した。2.5及び5.0μ』のアリコートを用いて、以
下のようにE.coli R R 1株を形質転換した
:各アリコートを200μ1の氷冷コンビテントE,c
oli R R 1細胞と混合し、30分間氷上に放置
した。42℃で2分間ヒートショック後、細胞を1−の
Ltlrlaブロス(L−ブロス)で希釈して、37℃
で1時間増殖させた。
遠心分離し、250μ』容量に再懸濁して、100μg
/−アンピシリンを含有するLuria−寒天(し−寒
天)平板上にブレーテイングした。37℃で一晩インキ
ユベーションした後、平板を取り出して約5000コロ
ニーを抗生物質を含むし825一中に掻き出した。プラ
スミドDNAを以下と同様にしてこれらのS胞から調製
した:細胞を遠心分離によりペレット化し、3gのII
ll胞ペーストを25nHトリス塩酸、10渇HEDT
A,t)H8.0及び50iHグルコースより成る14
一液に再懸濁した。その懸濁液にリゾチーム4.O r
Fj/一を溶解して、25℃で5分間インキコベートし
た。1%ドデシル1Mナトリウム及び0.2NN a
O口のアリコート27−を加え、その後その溶液を混合
して、O℃で5分間インキユベートした。水冷3M酢酸
カリウム(pH4.8 )20dを加えてグノムDNA
を沈澱させ、10秒間静かに撹拌し、5分間氷上に放置
して、12,000x gで10分間遠心分離した。上
澄を取り出して、等容量のフェノール/クロロホルムN
:1)で抽出した。10,OOOx gで5分間遠心分
離して各層に分離した。上層を取り出して等容量のクロ
ロホルムで抽出した。10,000gで5分間遠心分離
して層に分けた。上層を取り出して、2容積のエタノー
ルを加えて核酸を沈澱した。12,000x gで20
分間遠心分離して沈澱物を採集した。そのベレットを7
0%エタノールで1回洗浄し、前記と同様に再ベレッ1
・化した。そのベレットを真空乾燥して、8rdの10
+1H トリス塩酸,1nH EDTA.phs.o
液中に再懸濁した。8.9gの塩化セシウムを加え、0
.9艷の臭化エチジウム{5■/一}溶液を加えて、塩
化セシウムー臭化エチジウム平衡密度遠心分離用にDN
A溶液を調製した。そのDNA溶液を44, OOOr
plで48時間遠心分離し、その結果生じたDNAのプ
ラスミドバンドを18g針付注射器で取り出した。臭化
エチジウムは、等容量のCsCj一水飽和イソプOパノ
ールを用いて抽出することにより除去した。
を用いて抽出し、エタノール沈澱した。
、1 iHE D T A . pH8.0の液10d
に再懸濁した。
30.0μj)のブラスミドライブラリーを60μ』の
制限エンドヌクレアーゼ消化緩衝液( 10nHTri
s pH7.5 . 10nH MQC.Q ,
101Mメルカブ2 トエタノール,100lH N a Cj及び100
μ9のウシ血清アルブミン)中に希釈した。100単位
(3μJ)の旧nkI[制限エンドヌクレアーゼを加え
、チューブを37℃で2時間インキユベートし、その時
点で7U(1μJ!)の仔ウシ腸ホスフ7ターゼを加え
て、その反応液をさらに30分間インキュベートした。
ンピテントE.coli R R 1 m胞と混合し、
形質転換して、平板培地上に置き、次ライブラリーの場
合と同様に一晩増殖した。
コロニーを取り上げて、アンビシリン及びテトラサイク
リンを含むLB寒天平板上に置いた。alp’及びte
tRであった18個のコロニーを10rR1培II物中
で増殖させ、それらが保有するブラスミドを、B;rn
boinとDoly (Nucleic Acids
Res.7:1513(1979) )の方法から採用
した以下に示すミニプリーブ(1niDrel))精製
法により調製した。
.5−の一晩培養した培養物を6,OOOx gで5分
間ベレット化した。その上清をデカントして除き、細胞
ペレットをI Q/a!のリゾチームを含有する25I
H Tris,1◇lH EDTA, 5GlINグ
ルコース, pH8.0の150μ』液中に再懸濁した
。室温で5分後、0.2H N a O口,1%SD
Sを200μ』加え、そのチューブを振冶して細胞を溶
解し、次いで氷上に放置した。5分後、3M酢酸ナトリ
ウム, pH4.8を150μ』加え、振盪して、さら
に5分間氷上に放置した。生じた沈澱物を12,OOO
X9で4℃で10分間遠心した。その上清を取り出して
、等容量のフェノール/クロロホルム(1:1)で抽出
した。10,OOOX 9で5分間遠心分離することに
より各層に分離した。その上清を880μ1のエタノー
ルを含有する遠心チューブ中に注ぎ入れ、混合した。室
温で10分後、その遠心チューブを12,000x g
で10分間回転し、沈澱した核酸をペレット化した。そ
の上清を捨て、ベレットを1−の70%エタノールー水
で再び洗浄して再ペレット化し、室温で30分間真空乾
燥した。一旦乾燥させた後、ベレットを、20u 9
/rdのR N aseを含む50μ1溶液(10nN
Tris.1+lH EDTA, pt+a.o
)中に再懸濁し、37℃で1時間インキユベートして、
RNAを消化した。
することにより、プラスミドミニブリープを分析した。
の10%は、HinclIに耐性であり、また約6.2
kbの長さのBolII断片を保有することが判明した
。その後、これらのブラスミドは、HincIItl篩
メチラーゼ遺伝子のみを保有し、制限エンドヌクレアー
ゼ遺伝子を保有しないことが示された。
でなく、擬似断片を含有していたか、あるいは再連結さ
れたベクターであった。
伝子を保有するものとして上記(セクション7)で同定
されたクローンを、HinCII制限エンドヌクレアー
ゼ遺伝子に関しても調べた。これは以下の通りに実施し
た:一晩培養したものの残留部分を用いて、エンドヌク
レアーゼ活性を調べた。これは以下の通りに実施した: エンドヌクレアーゼアツセイ: 10X制限エントヌクレアーセ!avjJ液:100l
HTris, pH7.5 , 100nH M(JC
j , 100IH 2−メ2 ルカブトエタノール,IM NaCj0以下の通りに細
胞抽出物を調製した: 4,OOOrpnで5分間遠心
分離することにより、1−から18胞をペレット化した
。上清を捨て、ベレットを1rdの超音波処理用1i1
ilj液(101H Tris, pH7.5,too
lH NaCj , 5IIH DTT, 0.1i
H EDTA)中に再懸濁し、10秒間ずつ2回静かに
超音波処理して、細胞を破砕した。チューブをミクロ遠
心分Mill機内で4℃で10分間回転し、その上清を
細胞抽出物として用いた。1μ』及び5μ1の抽出物を
、1x制限エンドヌクレアーゼ!iij液50μ1に溶
解したラムダDNA1μ9を用いて、37℃で15分間
インキユベートした。試験したクO−ンはいずれもエン
ドヌクレアーゼ活性を示さなかった。
iluS influenZal3Rcから得た旧nc
llエンドヌクレアーゼを、発酵槽内で、以下の成分よ
り成るTRY−YEプロス培地中、37℃で増殖させた
: トリブトン(10。Og/Jl);醇母菌抽出物(5,
Og/M ) :NaCJ <2.0 9/j >
:K2HPO4(4.4 g/J ) :フトウllt
(2.0 g/1);ウシのヘミン(10■/j):
NAD:DPN (2.O q/j )。遠心分離によ
り[1胞を集め、新鮮なものを使用するために細胞ペー
ストを一70℃で保存する。
400−の超音波処理用am液(20ffiH K2
P 04 ,ptl7.3 , 0.1mH E D
TA , 10IIH β−メルカプトエタノール
,0、1H NaC1)中に再懸濁する。
分間。氷上で5分間冷却。3回実施)、懸濁Ill胞1
d当たり約50qの可溶性蛋白質が放出された。
分間遠心分離することにより除去する。
pH6.9 ,100lH N a Cj,及び10
nH 2−メノレカプトエタノールで平衡化されたホ
スフォセルロース力ラム(5X 5(J) (Wha
tian P−N)にill![1する。そのカラムを
2倍カラム容量の上記!lti液で洗浄する。カラムか
らの流出物を単一フラスコ中に採集する。tlineI
[エンドヌクレアーゼはそのカラムに保持され、0.3
M 〜0.6H N a CJIで溶出する。
7.3 , 0.1mH E DTA. 10僧H β
−メノレカブトエタノール,0。IN KCjに対し
て透析する。
20iHK2PO4, pH7.4 , 0.1lH
E DTA, 10nHβ−メノレカプトエタノーノレ
,0.1N KCJで平衡化されたヘリバンーセファ
ロースCL−6Bカラム(2.5 x2.5 u)に載
置し、2倍カラム容量の同一緩衝液で洗浄1る。0.1
H 〜1.OM(7)KCj (a容量700d>の
直線的勾配を展開し、カラムに適用する。10−ずつの
画分を採集する。その両分を、ラムダDNAに対する旧
ncll制限エンドヌクレアーゼ活性の存在に関してア
ンセイする。その活性画分をプールし、100容量の緩
衝液(10118 K2PO4. pH7.3 ,
0.1信H EDTA,10帥 β−メノレカブトエタ
ノーノレ, 0.114 KCj )に対して透析で
る。
を1−Mono Q FPLC力ラム( Pharma
cia )に載置し、緩衝液S (20mH K2
PO4 , pH6.9 , 10lH β一メルカ
ブトエタノーノレ, 0.058 KCj )で洗浄し
、50nHから0.10Mまでの直線勾配のKCJ40
−をSml語液中で展開し、カラムに適用ずる。1ff
il!ずつの画分を採集し、HinCIf制限エンドヌ
クレアーゼ活性の存在に関してアッセイする。
1一ボリCat−A FPLCカラム(Pharla
cia )に戟置し、4l衝液S (20IIM K
2PO4,酎+6.9 , 10I β−メルカブトエ
タノーノレ, 0.058 K.Cj )で洗浄し、5
0nHから0. 108までの直線勾配のKCj40−
をSat液中で展開し、カラムに適用する。1−ずつの
画分を収集し、旧nclI制限エンドヌクレアーゼ活性
の存在に関してアッセイする。
アーゼは、蛋白質1q当たり約250, 000単位の
比活性を示し、SOS−ポリアクリルアミドゲル上での
分子量は27,000ダルトンであった。
^pplied BiOSVStelSモデル470A
気相蛋白質シーケンサーに掛けてアミノ末端蛋白賀配列
決定を行った。最初の24残塁を分解した。その結果得
られた配列を以下に示す。: XFIKPIXQDINXXLIGQKVKXXKX
(蛋白質配列の1文字コードの説明に関しては表1を参
照のこと)。
4−nerオリゴマーを作製した。;5 ’ ATH
GGN CAR^^^GT3’ (口=A.C,又は
T:N=A.C,G又はT:R=A又はG)。
HincM − 10.5−1上のエンドヌクレアーゼ
のアミノ末端の位置をマッピングした。このオリゴマー
を用いて、蛋白質配列を立証するDNA配列が得られた
し、また以下の配列を用いて作製される25−nerオ
リゴマーに特有の配列が示された: 5 ’ ATO AGT TTC ATA AAA
CCT ATT T^TC3’この25−ner
オリゴマーを用いて、エンドヌクレアーゼの方向を決定
する助けとなり、さらにエンドヌクレアーゼのアミノ末
端の位置及びp( pBl 101)HincM−10
.5−1ニ存在L6エンドヌクレアーゼ遺伝子部分を明
確にするDNA配列を得た。得られたDNA配列を以下
に示t:5’ TAC TCA AAG TAT TT
T GGA TAA ATA GTC CT^■^A
TTG NNA ATA TTA^TC GGG CA
A AA^GTG^AACGT CCT AAA TC
A GGT ACT CTG TCA GGT CAT
GCTGCA GGG GAA CCA TTT G
AA AAA TTA GTA TAT AAGTTT
TTG AAA GAA AAC CTG TCA
GAT TTA ACA TTTAAG CAA T^
T GA^1^T CTT AAT GAT TTA
TTT ATGAAG AAC CCT GCG AT
^ATT GAG C^IG3′。25−間『オリゴマ
ーを用いて、HaelOI)hillJsinflue
nzae Rcゲノムの種々の制限断片にエンドヌクレ
アーゼ遺伝子をマッピングした。ベクターDNAに対し
て作製された配列特異性オリゴマー及びメチラーゼ遺伝
子内に位置することが公知の欠失クローンを用いて、メ
チラーゼ遺伝子の方向が、エンドヌクレアーゼ遺伝子の
方向が決定されだのと同じ方法で決定された。
製Haenophilus influenzae R
cゲノムDNA (段階(1)同様に調製される)を、
以下の通りに、Hindllを用いて限定消化した:
10mt4 Tris.I)H7.5,10118
MQCj , 100118 NaCj , 101
18メノレカ2 プトエタノール緩衝液中に 100μg/Idの濃度で
溶解したDNA?W液300μ1を1本のチューブ中に
分配した。そのチューブに50単位の旧ndlを加えた
。チューブを37℃で1時間インキユベートし、次いで
フェノール/クロロホルムで抽出して、エタノールで沈
澱した。そのベレットを10mt4トリス塩酸.1+s
H EDTA.pH8.0の300μA液に再溶解し
、各10μ』をアガロースゲル電気泳動で分析した。
I IH 1. 2 (PvulI部位に挿入された
}{ pa Iリンカーと、EcoR1部位に挿入され
たBolllリンカーを有するpN 01523)に連
結した:10.0/,! 9の旧ndll消化Haem
ophilus inftuenzaeRc DNA
( 100μ1)をz.oμgの旧ndlll一間裂
及び脱リン酸化pB i IH I. 2 (20μj
)と混合し、エタノールで沈澱した。そのDNAを12
.0009で、4℃で15分間遠心分離し、70%エタ
ノール100μ1で1回洗浄した。そのDNAを1x連
結am液(501IH Tris.t)H7.5,10
1MMQCj ,10nl4 DTT.0.5nH
ATP)992 μJに再懸濁してT4DNAリガーゼ1μ1を加え、そ
の混合液を16℃で16時間インキュベートした。2.
5μ』及び5.0μ1のアリコー1−を用いて、以下の
通りにE.coli R R I株を形賀転換した:各
アリコートを200μ1の氷冷コンビテント E.co
li R R 1細胞と混合し、氷上に30分間敢置し
た。42℃での2分間ヒートショツクした後、III胞
を1dのLuriaプロス(しープロス〉で希釈し、3
7℃で1時間増殖した。
段階加えた方法で調製した:段階(18)から得られた
データに基づいて、配列特異性25−Tierオリゴマ
ー(段1%!I(19))を用いてライブラリーをプロ
ーブし、エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼ遺伝子を含
有すると思われる適当なサイズの旧ndlll!li片
を探した。この断片は一次細胞ライブラリー中に存在し
た。
5)と同様に調製した。
ーを取り出し、アンビシリンを含むLB寒天平板上と、
アンピシリン及びストレプトマイシンを含むLB寒天平
板上にプレーテイングした。
ーを10一の培養物中で増殖し、それらが保有するプラ
スミドを、段1@ (6)に記載のミニブリーブ精製法
によってfill製した。続いてプラスミドミニブリー
ブをHincn及び旧nd■で消化して分析した。
ドの27%は旧nclIに耐性であり、また約3. O
kbの長さの旧ndl断片を保有することが判明した。
ラーゼ遺伝子及び制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の両方
を保有することが示された。これらのブラスミドも、各
々、1つ又はそれ以上の擬似断片を保有することが判明
した。観察されたプラスミドの他の63%は Hinc
IIに耐性でなく、また擬似断片を含有するかあるいは
再連結されたベクターであった。
ゼ遺伝子を保有するものとして上記(階段(24))で
同定されたクローンを、nincII制限エンドヌクレ
アーゼ遺伝子に関しても調べた。これは、段階(8)に
記載の通りに実施した。調べたクO−ンはすべて、エン
ドヌクレアーゼ活性を有していた。
レアーゼを含有することが判明した。これらのクローン
は、いずれかの方向に1グラムの湿潤細胞ペースト当た
り約1 , 000単位の旧ncll制限エンドヌクレ
アーゼを合成することが判明した。
IIRM−8.0 一A1を用いて同一遺伝子系E.c
oli株を形質転換し、表現型McrA. McrBま
たは−『『によって生じる(29) p( pBI
IH I.2)HincIIRM−8.0A1から
得られる3.Okbの旧ndII[断片を、以下の方法
で、ゲルa@l(gel prep) L、Hindl
llで切断され且つ脱リン酸化されたI)UC19との
連結反応に用いた:250ngの2. 7kbゲル調製
断片(20μN)を100n SF ( 1μJ!
)のHindDI一切断及び脱リン酸化pUc19と混
合し、エタノール沈澱した。そのDNAを12,000
!?で、4℃で15分間遠心分離し、70%エタノール
100μ1で1回洗浄した。
l7,5 . 10iH MQCj , 10mH
DTT, 0.5僧H ATP)2 10μ1に再懸濁して、1μ』のT4 DNAリガー
ゼを加え、その混合液を16℃で16時間インキュベー
トした。580μ』のアリコートを用いて、以下の通り
E.colt R R l株を形賀転換した:各アリコ
ートを200μ(の氷冷コンピテントE.coliRR
1細胞と混合し、氷上に30分間放置した。42℃で2
分間ヒートショックした後、細胞を1rdのLuria
ブロス(L−プロス)で希釈し、37℃で1時間増殖し
た。形質転換細胞培養物を遠心分離し、250μ1容量
に再懸濁し、100μg/一のアンピシリンを含むLu
ria一寒天(L一寒天)平板上にブレーティングした
。37℃で一晩インキユベーションした後、コロニーを
摘み取ってアンビシリンを含むLB寒天上にブレーティ
ングし、37℃で一晩インキユベートした。amp’で
ある184!lのコロニーを10d培養物中で培養し、
それらが保有するブラスミドを、段階(6)に記載のミ
ニプリープ精製法によって調製した。引き続いて、プラ
スミドミニプリープを、Hincll及び旧ndlで消
化して分析した。
ドの50%以上が旧nc[消化に耐性であり、また約3
.Okbの長さの旧ndl[断片を保有することが判明
した。これらのブラスミドは、その後、HincII修
飾メチラーゼ遺伝子及び制限エンドヌクレアーゼ遺伝子
の両方を保有することが示された。残りのブラスミドは
、再連結されたI)UC19であった。
ラーゼ遺伝子を保有するものとして上記《段階(28)
)で同定されたクローンは、HinCIl制限エンド
ヌクレアーゼ遺伝子に関しても調べた。これは、段階(
8)に記載の通りに実施した。試験したクローンはすべ
て、エンドヌクレアーゼ活性を示した。
レアーゼを含有することが判明した。これらのクローン
は、E) ( pu C19) Hincll RM−
5.7 −10 ( NEBl520)では方向Aに湿
WJIII胞ペースト1g当たり約80, 000単位
のHinc[制限エンドヌクレアーゼを合成し、p (
pu C19) HincII RM−5.7−4
では方向Bに湿潤細胞ペースト19当たり2,000単
位の旧ncll制限エンドヌクレアーゼを含或すること
が判明した。
ラーゼをコードする遺伝子を保有する組換えプラスミド
I)( DLIC)HincI[RM−10−5.7
(NEBl520 )を形質転換によりE.coli
R R l株中に移入した。
質転換するに際しては、I) ( DU C ) Hi
ncll RM −10−5.7 (NEBl520
)はこれらの株中に形質転換可能であったが、しかし
10d以上の液体培養物中では増殖不可能であった。
を加えて) , Hincllエンドヌクレアーゼを1
1fJし、細胞を以下の成分より成るLBブロス培地中
で培養した:109/jのカゼイン加水分解物:59/
jの酵母菌抽出物:10g/jのNaCj:11?/j
の塩化マグネシウム・6水和物:1g/jのブドウ糖:
10011g/jのアンビシリン。pllはNaO
口で7.2に調節する。m製されたエンドヌクレアーゼ
は1qの蛋白質につき約250, 000単位の比活性
を示すことが判明した。
Lダ′1々磯a体#口4を 二4へ,−7の叫目晶シJ鵠ζ杓代XUPAC−1υe
傅弁一ξトエLネ■菟ギ(冫.A C G U/T AGA G B.I’)スIiN Z−Hメ幡Q 4 .図面の簡単な説明 第1図は、Hinc[制限エンドヌクレアーゼをクロー
ニングするための概要を示す。● 第2図は、llinen制限エンドヌクレアーゼを製造
するための概要を示す。
飾メチラーゼをコードするllaenophi tus
nfluenzae Rcから得た3.Okb lli
ndII断片の制限地図である。その断片をρBilH
1.2(AICC 67902)のllindin部位
中にクローン化して1)(Dell口1 . 2 )
Hincll RM−8、0−A1を作製し、続いてp
U C 19 ( ATCC 37254 )中にサ7
’) ローン化シテO ( pLJ 019) ll
incI[ RM5.7−4及びp ( PU C19
) llinell RM−5.7 −10を作った。
R M − 5.7−4及ヒI)( 1)UC19
) lIinclIRM−5.7 −10(NEBl5
20 )を保有ずるE.coli R R 1(AT
CC 31343)の細胞抽出物中のlIir+c[制
限エンドヌクレアーゼ活性を立証するアガロースゲルの
17真である。
゛イ〉冫一牛0レAテ・/ド 代理人ブr理士 船 山 武 口inc II Endonuclease Puri
ficationof fnterest u帥1 + ul Purlfm Hinc II E
ndanucmseイram Ha*mophllu訓
nfluenzas Rc cellsLine 2
1ul ol a cell m陽cl jromεc
olt strain RRI co+nalning
p(puc+91HincllRM−5.7−aLa
rm 3 5 ul oj a C@II *xtra
cIfromεcoli s++ain RRI co
malning p(pU(jQIHincllRM.
5.7−aLan@II 1 ul ol a cel
l saract fromεcoli strain
RRI eonla+fiin9 p(pυCj9)
HmllRM5.7.IOLar1@9 5 ul o
j a cell enact thorn E. c
oli main RRI containing p
ipUc191HincllRM−5.7・lOFjG
.4 第1頁の続き [相]Int. Cl.’ 識別記号 庁内整理番号 C 12 R 1:21) 手続?m正書 特許庁長官 古 田 文 毅 殿 1.事件の表示 平成2年特許願第65542号 2.発明の名称 HinclIII限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼ
の製造方法 3. 補正をする者 事件との関係 特許出願人 名 称 ニュー・イングランド・バイオレイブス・インコーポレ
イテッド 5. 補正命令の日付 自 発 8.補正の内容
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 (1)HincII制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含有
するクローニングベクター。 (2)請求項1記載のクローニングベクターを含む形質
転換宿主。 (3)該HincII遺伝子をHaemophilus
influenzaeRcゲノムDNAから切り出すか
、又は該HindII遺伝子をHaemophilus
influenzae RdゲノムDNAから切り出す
ことを特徴とする請求項1記載のクローニングベクター
。 (4)HincII修飾遺伝子を含有するクローニングベ
クター。 (5)請求項4記載のクローニングベクターを含む形質
転換宿主。 (6)HincII又はHindII制限エンドヌクレアー
ゼ遺伝子をクローニングする方法であって: (a)Haemophilus influenzae
Rc又はHaemophilus influenz
ae Rdから得たプラスミドDNAからライブラリー
を形成し; (b)HincII又はHindII修飾遺伝子を含有する
クローンを単離し; (c)制限エンドヌクレアーゼ蛋白質を精製して、蛋白
質配列を得; (d)DNAシーケンシングを通してエンドヌクレアー
ゼの方向を決定し、メチラーゼクローン内における該エ
ンドヌクレアーゼの位置を定め、Haemophilu
s influenzae Rc又はHaemophi
lusinfluenzae Rdゲノム内におけるエ
ンドヌクレアーゼの位置を定め; (e)b〜dの段階で得られるデータに基づいてライブ
ラリーを形成し; (f)HincII又はHindII修飾及び制限遺伝子を
含有するクローンを単離する; 各段階から成る方法。 (7)該ライブラリー下記の段階: (a)Haemophilus influenzae
Rc又はHaemophilus influenz
ae RdからゲノムDNAを精製し; (b)該精製DNAを消化してDNA断片を形成し; (c)該断片をクローニングベクターに連結し;(d)
段階(c)のクローニングベクターを用いて宿主細胞を
形質転換して細胞ライブラリーを形成し; (e)該細胞ライブラリーから組換えベクターを精製し
てプラスミドライブラリーを形成する;段階により形成
することを特徴とする請求項6記載の方法。 (8)該クローニングベクターがpBIIHI.2、p
BIIOI、又はpUC19であることを特徴とする請
求項7記載の方法。 (9)該宿主細胞がE.coliMrr^−株であるこ
とを特徴とする請求項7記載の方法。 (10)HincIIでプラスミドライブラリーを消化し
て消化プールを形成し、その消化プールを宿主細胞に形
質転換し、修飾遺伝子を含むクローンを選択することに
より、HincII修飾遺伝子を含有するクローンを単離
することを特徴とする請求項7記載の方法。 (11)HincII制限エンドヌクレアーゼを製造する
ための方法であって: (a)Haemophilus influenzae
RcからDNAを精製し; (b)精製したDNAを適切な制限エンドヌクレアーゼ
で消化してDNA断片を形成し; (c)該断片をクローニングベクターに連結してDNA
混合物を形成し; (d)宿主細胞を段階(c)のDNA混合物で形質転換
してライブラリーを形成し; (e)該HincII修飾メチラーゼ遺伝子を含有するク
ローンを単離し; (f)該HincII修飾メチラーゼ遺伝子を含有するク
ローンをスクリーニングして、さらに該HincII制限
エンドヌクレアーゼ遺伝子をも含有するクローンを単離
し; (9)段階(f)のクローンを含む宿主細胞を培養し; (h)該培養物からhincII制限エンドヌクレアーゼ
を取り出す; 各段階から成ることを特徴とする方法。 (12)該クローニングベクターがプラスミド又はウイ
ルスDNA分子であることを特徴とする請求項11記載
の方法。 (13)該プラスミドがpBIIOIであることを特徴
とする請求項12記載の方法。 (14)該プラスミドがpUC19であることを特徴と
する請求項12記載の方法。 (15)該プラスミドがpBIIH1.2であることを
特徴とする請求項12記載の方法。 (16)その中に以下のDNA配列:5′TAC TC
AAAG TAT TTT GGA TAA ATA
GTC CTA TAA TTG NNAATA TT
A ATC GGG CAA AAA GIG AAA
CGT CCT AAATCA GGT ACT C
TG TCA GGT CAT GCT GCA GG
G GAACCA TTT GAA AAA TTA
GTA TAT AAG TTT TTG AAAGA
A AAC CTG TCA GAT TTA ACA
TTT AAG CAA TATGAA TAT C
TT AAT GAT TTA TTT ATG AA
G AAC CCTGCG ATA ATT GAG
CAT G3′を有するHincII修飾及び制限遺伝子
を含有するクローン。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US324,402 | 1989-03-15 | ||
US07/324,402 US5015581A (en) | 1989-03-15 | 1989-03-15 | Method for producing the Hinc II restriction endonuclease and methylase |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP11991397A Division JP3156759B2 (ja) | 1989-03-15 | 1997-05-09 | Hinc II制限エンドヌクレアーゼをコードするDNAセグメント |
Publications (2)
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