JPH0322978A - Hinc2制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼの製造方法 - Google Patents

Hinc2制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼの製造方法

Info

Publication number
JPH0322978A
JPH0322978A JP2065542A JP6554290A JPH0322978A JP H0322978 A JPH0322978 A JP H0322978A JP 2065542 A JP2065542 A JP 2065542A JP 6554290 A JP6554290 A JP 6554290A JP H0322978 A JPH0322978 A JP H0322978A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
dna
hincii
gene
endonuclease
restriction
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2065542A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2672683B2 (ja
Inventor
Ii Jack S Benner
ジヤツク・スタンリイ・ベナー・ザ・セカンド
Phyllis A Rees
フイリス・エイ・リーズ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
New England Biolabs Inc
Original Assignee
New England Biolabs Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by New England Biolabs Inc filed Critical New England Biolabs Inc
Publication of JPH0322978A publication Critical patent/JPH0322978A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP2672683B2 publication Critical patent/JP2672683B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14Hydrolases (3)
    • C12N9/16Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22Ribonucleases RNAses, DNAses
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10Transferases (2.)
    • C12N9/1003Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12N9/1007Methyltransferases (general) (2.1.1.)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 隻艶立11 本発明は、HincII制限エンドヌクレアーゼ及びi
oメチラーゼ用のクローン、並びにこのクローンからの
これらの酵素の製造に関する。
制限エンドヌクレアーゼは、細菌中に天然に生起する酵
素の一種である。制限エンドヌクレアーゼを、混在する
他の細菌或分から精製した場合には、これを実験室で用
いてDNA分子を正確な断片に切断することができる。
この特性により、DNA分子を唯一のものとして同定す
ることができ、またその構成遺伝子に分画することがで
きる.制限エンドヌクレアーゼは、現代の遺伝子研究に
おける不可欠の道具であることが立証されている。
それらは生化学的な「鋏」であって、それを用いて遺伝
子工学及び分析が行なわれる。
制限エンドヌクレアーゼは、DNA分子に沿った特定の
ヌクレオチド配列(「認識配列」)を認識し、これに結
合することにより作用する。一旦結合すると、それらは
該配列内か又はその一方の銅で分子を開裂する。異なる
制限エンドヌクレアーゼは異なる認識配列に対して親和
性を有する。
百個以上の異なる制限エンドヌクレアーゼが、今日まで
に調べられた数百種の細菌種の中から同定されている。
細菌は、通常、種当たり少数の制限エンドヌクレアーゼ
しか有していない。エンドヌクレアーゼは、それらが由
来する細菌に従って命名される。
したがって、例えばHaelophilus aegy
ptiusは、Hae I、Hae U、及びHae 
l[lと名づけられた3つの異なる制限エンドヌクレア
ーゼを合成する。これらのlIliAは、それぞれ配列
(AT)GGCC(AT)、PuGCGCPy及びGG
CCを認識し、開裂する。一方、Escherichi
a coli RY13は、配列 G^^TTCを認識
する一つの醇素EcoRIのみを含威する。
理論に結びつけることを望んでいるわけではないが、天
然においては、制限エンドヌクレアーゼはIll[li
!ia胞の繁栄に保護的役割を演じている。制限エンド
ヌクレアーゼにより、細菌を破壊するか又はこれに寄生
するウィルス及びブラスミドのような外来DNA分子に
よる感染に対し、細菌は抵抗することができる。制限エ
ンドヌクレアーゼは、認識配列が生起するたびに@染D
NA分子に結合しこれを開裂することにより、細菌に耐
性を付与する。その結果生じる破壊番よ感染遺伝子の多
くを不活性化し、そのDNAをエキソヌクレアーゼによ
りさらに分解され易くする。
細菌防御系の第二の成分は修飾メチラーゼである。
これらの酵素は制限エンドヌクレアーゼと相補的であっ
て、細菌がそれ自身のDNAを保護し、そのDNAと外
来@染DNAとを区別することができる手段を提供する
。修飾メチラーゼは対応する制限エンドヌクレアーゼと
同じヌクレオチド認識配列を認識して結合するが、DN
Aを破壊する代わりに、メチル基を付加することにより
その配列内のある又は他のヌクレオチドを化学的にrl
篩する。メチル化後、認識配列はもはや制限エンドヌク
レアーゼによって結合されないか、あるいは開裂されな
い。細菌細胞のDNAは、その修飾メチラーゼの活性に
よって常に十分に修飾され、したがって内因性制限エン
ドヌクレアーゼの存在に対して完全に非感受性である。
制限エンドヌクレアーゼ認識及び攻撃に対して感受性で
あるDNAは、未修飾の、したがって同定可能な外来D
NAだけである。
遺伝子工学技術の出現により、現在では、遺伝子をクロ
ーン化し、慣用の精製技術によって得られるよりも大量
に、該遺伝子がコードする崇白質及び酵素を産生ずるこ
とが可能である。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクロ
ーンを単離するためのキーポイントは、それらが10−
3〜10−4という低い頻度で生じる場合に、複雑な「
ライブラリー」中の該クローン、即ち「ショットガン」
法によって誘導されるクローンの集団を同定するための
簡単且つ確実な方法を開発することである。好ましくは
、望ましくない大多数のクローンは破壊され、望ましい
少数のクローンは生存するというような方法を選択する
必要がある。
■型制限一修篩系がクローン化されるV4度が増しつつ
ある。第1のクローニング系は、制限エンドヌクレアー
ゼクローンを同定又は選択する手段としてバクテリオフ
ァージ感染を用いた[Hha II :Hann等、G
ene3 : 97 〜112(1978)  : E
ocRII :KOSVkh等、Holec.aen.
Genet 178:717 〜719(1980) 
: Pstl : Walder等、Proc. Na
t. Acad. Sc i ,USA 78:  1
503 〜1507(1981)] . III菌中に
制限一修飾系が存在すると、細菌はバクテリオファージ
による感染に抵抗できるため、クローン化された制限一
修飾遺伝子を保有する細胞は、主として、ファージに晒
されていたライブラリーから生存細胞として選択的に単
離され得る。しかしながら、この方法はその有用性に限
界があることが判明した。即ち、クローン化された制限
一修飾遺伝子は常に十分なファージ耐性を発現して選択
的な生存を授けるわけではないことが判明した。
別のクローニング法は、プラスミドーボーン( pla
slid−borne)として最初に特性化された、E
.coliにクローニングプラスミドを移入する系を含
む[ EcoRV : Bougue leret等、
Nucleic AcidsRes. 12:3659
 〜367B ( 1984);PaeR7:Gino
erasと8rooks,Proc.Natl.^ca
d.sci.tls^80 : 402 〜406(1
983) : TheriaultとRay,Gene
l9:355 〜359(1982):  PvuII
 : Blulenthal等、J.Bacterio
l. 164:501〜509, (1985) ] 
第3の方法、即ち増大数の系をクローン化するために使
用される方法は、活性メチラーゼ遺伝子を選択すること
を含む[例えば、EPO特許第 193,413号(1
986年 9月 3宕チ9、及びBStlRIKiss
等、Nucleic Acid Res.13:640
3 〜6421(1985)参照]。制限及び修飾遺伝
子は近接して結合する傾向があるため、両遺伝子を含有
するクローンは、正に一方の遺伝子について選択するこ
とによりしばしば単離され得る。メチル化活性について
の選択により、常に完全な制限一修飾系が得られるわけ
ではないけれども、その代わりに時々、メチラーゼ遺伝
子のみが得られる[BspRl:SZO@Olanyi
等、Gene10:219 〜225(1980)  
:B c n I :Janulaitis等、Gen
e20 :197 〜204(1982) : B s
uR I  : KissとBaldauf,Gene
 21:  111〜119(1983) :並びにM
spl :l4alder等、J.Bio1.Chel
.258:123S 〜124H1983)]  。
制限一修aii伝子のクローニングに対して考えられる
障害は、前もって修飾によって防御されていない宿主に
エンドヌクレアーゼ遺伝子を導入しようとする際に生じ
る。メチラーゼ遺伝子とエンドヌクレアーゼ遺伝子が単
一クローンとして一緒に導入される場合には、エンドヌ
クレアーゼが宿主DNAを開裂する機会を有する前に、
メチラーゼは宿主DNAを保護的に修飾しなければなら
ない。したがって、時として、それら遺伝子を引き続い
て、即ち先ずメラーゼ遺伝子、次いでエンドヌクレアー
ゼ遺伝子をクローン化することが唯一可能であるかもし
れない。制限一修飾系のクローニングに対する別の障害
は、E  coliのいくつかの株がシトシン又はアデ
ニン修飾に対して逆反応するという発見にある;それら
の株はメチル化シトシン[ Raleigh とーi 
Ison, PrOC.Natl.^cad.Sci.
,USA 83 : 9070〜9074(1986)
] 、又はメチル化アデニン[ HeitlanとNo
del,J.Bact.,196:3243〜3250
,+1987) ]を含有するDNAを破壊する系を有
する。シトシン特異性又はアデニン特異性メチラーゼ遺
伝子は、単独であっても、あるいはそれらに対応するエ
ンドヌクレアーゼ遺伝子と一緒であっても、これらの株
中で容易にクローン化できない。この問題を回避するた
めには、これらの系を欠<E.coliの突然変異株(
Hcr^一及びHcrB ”又はHrr−)を用いる必
要がある。
精製制限エンドヌクレアーゼ、及びその程度は低いが修
飾メチラーゼは、実験室でDNAを特性づけ且つ再配列
するための有用な道具であるため、組換えDNA技術に
より、これらの酵素を大量に合成するIII菌株を得る
ことは商業的に利益となる。
このような菌株は、精製の仕事を簡単にし、同時に商業
的に有省輸で生産する手段を提供するので、有用である
発明の要約 本発明は、HaeIlophilus influen
zae (NEB株1126,寄託番号第53876号
として^TCCk:寄託されている)由来の旧ncI[
制限エンドヌクレアーゼ遺伝子及び修飾メチラーゼ遺伝
子を含有するクローンを提供し、且つそれらの酵素の製
造方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、DNA配
列GTPy’  PuACを認識し、且つ矢印で最初の
5’ Py.!:Puの間に示されているように開裂す
る酵素である制限エンドヌクレアーゼ旧ncIIを発現
するクO−ンに関する。これについては以下を参照され
たい: Landy, Ruesd isue l i
 , Rob inson及びROSS,BiOChe
fliStry, 13:2134 〜2142(19
74) :Ke11V とSnith,J.Nol.B
iol.,51:  393 〜409(1970) 
; ROVとSlith,J.Hol.Biol。,8
1 :427〜444fl973) : Row とS
nith,J.Hol.Biol.81 :445〜4
59(1973) : SlithとWi1cox,J
.Hol.Biol.,51:379〜39m970)
。これらの記載内容は参照により水明SS中に含めるも
のとする。
この酵素をクローニングするための好ましい方法は、H
aenophilus influenzae Rcか
ら得たDNAを含有するライブラリーを形戊し、Hin
cl修篩メチラーゼに関してコードするDNAを含有す
るクローンを単離し、HincII制限エンドヌクレア
ーゼ遺伝子をも含有するクローンを同定するためにこれ
らの間でスクリーニングすることより或る。
色艶聖盈1 本発明は、Hinc[制限及び修飾遺伝子をクローニン
グし、それによって生じるクローンから制限エンドヌク
レアーゼ旧ncIIを¥i造するための方法を提供する
。このアプローチは、エンドヌクレアーゼ選択を用いる
ことにより、発現されるlIincII制限及びメラチ
ーゼ遺伝子を含有するということに基づいてクローンが
選択されたという事実を利用する。このようなクローン
は、HincIl制限エンドヌクレアーゼによるin 
vitro消化に耐性である。
本発明はさらに、HindII修篩及び制限還伝子をク
ローニングし、それによって生じるクローンから旧nd
lI制限エンドヌクレアーゼを製造する方法に関する。
Hincn制限遺伝子及びメチラーゼ遺伝子が好適にク
ローン化され、発現される本明細潅記載の方法は、以下
の段階を包含する: (1) llaelmophilus influen
zae Rc株又はHae1ophilus infl
uenzae Rd株のゲノムDNAを精製する。
(2)ゲノムDNAをBQI II制限エンドヌクレア
ーゼのような制限エンドヌクレアーゼを用いて十分に消
化する。
(3)その結果得られたB(11  II断片を、DB
 I I0 1 (ATCC 67901)のようなク
ローニングベクターの8(+111クローニング部位、
又はpUc19(ATCC 37254)もしくはI)
BR322  (^TCC 37017)もしくはpA
 C Y C 177(^TCC 37031)のBa
n口■部位に連結し、その混合物を用いてEcoliR
R1細胞のlrr一株のような適切な宿主細胞を形質転
換する。
(4)形質転換混合物を、抗生物質アンビシリン、テト
ラサイクリン、又はクロラムフェニコールのような、形
質転換a胞を選択する培地上にプレーティングする。イ
ンキユベーシコンした後、形質転換コロニーを=緒に集
めて単一培養物とし、即ち、細胞ライブラリーを形成す
る。
(5)組換えプラスミドを細胞ライブラリから全部精製
して、ブラスミドライブラリーを作る。
(6)上記一atson等が記載したと同様の方法によ
り11aemophilus influenzae 
Rcから調製したflinelI制限エンドヌクレアー
ゼを用いてプラスミドライブラリーを完結するまで消化
する。Hincn消化は非修飾、メチラーゼ非含有クロ
ーンを特異的に破壊し、HincIIメチラーゼクロー
ンの相対的@度を増大させる。
(7)選択されたDNAをE.coli R R 1 
(1)ヨうな適切な宿主に形質転換し戻一し、選択培地
上にブレーティングすることにより形質転換体を取り出
すす。コロニーを取り上げ、HincI[修fsM伝子
の存在に関してそれらのDNAを分析する:コロニーが
保有するプラスミドを精製し、HincIIエンドヌク
レアーゼと共にインキユベートしてプラスミドが消化に
耐性であるか否かを調べる。全細胞DNA(染色体及び
プラスミドのDNA)も精製し、HincII制限エン
ドヌクレアーゼと共にインキユベートする。HincI
I修飾遺伝子を保有するクローンのDNAは十分に修飾
されねばならず、さらにブラスミドDNAと全てのDN
Aはともに実質的に消化に耐性であるべきである。
(8) Hincn制限及びviflIIi3ll伝子
を保有するHaeiophilus influenz
ae Rc [1胞から旧ncll制限エンドヌクレア
ーゼを産生させる。この細胞を、アンビシリンを含有す
る富裕培地中に入れ、発醇槽内で増殖させる。
(9)遠心分離して細胞を採集する。
(10)It胞を超音波処理により破砕して、Hinc
II制限エンドヌクレアーゼ活性を含有する粗細胞抽出
物を得る。
[11)HincIl制限エンドヌクレアーゼ活性を含
有する粗細胞抽出物を標準イオン交換及びアフィニティ
ーク口マトグラフィ技術により精製する。
(12)そのようにして精製したエンドヌクレアーゼは
SDSボリアクリルアミドゲル電気泳動上では均質で、
分子127,000ダルトン、ラムダDNAで力価測定
した場合、約250,000単位/蛋白質1I#gの比
活性を有している。
(13)そのエンドヌクレアーゼのアミノ末端配列を得
て、その倶白賀配列に基づいてDNAオリゴブローブを
作製する。
(14)メチラーゼ並びにHaenophilus i
nfluenzaeRc及びHaenophilus 
influenzae Rdゲノムに対するエンドヌク
レアーゼの位置をマップ化する。
(15)Haemophilus influenza
e RcゲノムDNAを、Bindu[制限エンドヌク
レアーゼのような制限エンドヌクレアーゼを用いて十分
に消化する。Hael01)hilus influe
nzae RdグノムDNAは、Hindlll1飾及
び制限遺伝子を含むことが公知の断片を生成するCla
 I又はEcoRIのような制限エンドヌクレアーゼを
用いて十分に消化され得る。
(16)その結果得られた旧ndII断片を、oBIf
H1.2のようなクローニングベクターのHindll
lクローニング部位、又はpUC19、pBR322、
もしくはpACYC  177のHindll1部位に
連結し、その混合物を用いてE.coli R R 1
細胞のような適切な宿主細胞を形質転換する。
(17)形質転換混合物を、抗生物質アンピシリン、ス
トレプトマイシン、又はクロラムフエニコールのような
、形質転換細胞を選択する培地上にブレーティングする
。インキュベーション後、形質転換コロニーを一緒に集
めて単一培養物とし、細胞ライブラリーを形或する。
(18)組み換えブラスミドを細胞ライブラリーから全
部そっくり精製し、ブラスミドライブラリーを作る。
(19)ブラスミドライブラリーを、上記一atson
等が記載したと同様の方法によりllaeIophi 
lusinfluenzae Rcから調製した旧nc
ll制限エンドヌクレアーゼを用いて完結するまで消化
する。旧nc■消化は未修篩、メチラーゼ非含有クロー
ンを特異的に破壊し、HincI[メチラーゼクローン
の相対的頻度を増大させる。
(20)選択されたDNAをE.coli R R 1
のような適切な宿主に形質転換し戻し、選択培地上にブ
レーティングすることにより形質転換体を取り出す。
コロニーを摘み取り、HinclI修8l!i遺伝子の
存在に関してそれらのDNAを分析する:コ〇二−が保
有するブラスミドを精製し、HinclI制限エンドヌ
クレアーゼを用いてインキユベートして、プラス4ドが
消化に耐性であるか否かを調べる。全細胞DNA (染
色体及びブラスミドのDNA)も精製し、HincII
制限エンドヌクレアーゼを用いてインキユベートする。
HincI[修飾遺伝子を保有するクローンのDNAは
十分に修飾されねばならないし、さらにブラスミドDN
A及び全てのDNAはともに実賞的に消化に耐性でなけ
ればならない。
(21)HinclI制限エンドヌクレアーゼを保有す
るクローンを、HincI[メチラーゼiffta子を
保有することが確定されたクローンの粗抽出物を調製し
、HincII制限エンドヌクレアーゼ活性に関して粗
抽出物をアッセイすることにより、同定する。粗細胞抽
出物の中の旧ncII活性レベルは、クローンD(1)
B I I H I . 2 ) HincII RM
−8.0−A Iの細胞1g当たり約1,000単位で
あると確定される。
(22)メチラーゼ及びエンドヌクレアーゼ遺伝子を含
有する旧ndl[[l!li片を旧nd[[開裂及び脱
リン酸化1)UC19中にサブクローニングした。
(23)H inc II制限エンドヌクレアーゼ活性
に関して陽性である組み換えブラスミドp(pU C 
19)旧nc II R M −5. 7−4及びp(
pU C 19) HiricII R M−5. 7
−10を含有するクローンは、pUc19のHind■
クローニング部位に挿入される単一の3. OkbHi
ndln D N A断片を含有する。
(24)種々の制限エンドヌクレアーゼに対する多数の
制限エンドヌクレアーゼ部位をこのブラスミド上でマッ
プ化したが、それを第3図に示す。遺伝子の位置は、欠
失サブクローニング(delet1onsubclon
inq)と、ブO−ブとしてDNAオリゴマーを用いる
Southernハイブリダイゼーションによるマッピ
ングとにより決定した。
(25)Hinall制限エンドヌクレアーゼをブラス
ミドp(ptJ C19) HincII RM−5.
7−10上に旧ncII制限及び修aM伝子を保有する
細胞から産生させる。
そのa胞を発醇槽内で、アンビシリンを含む富裕培地中
で増殖させる。
(26)遠心分離して細胞を採集する。
(27)超音波処理によりlII]胞を破砕させて、t
linclI制限エンドヌクレアーゼ活性を含有する粗
細胞抽出物を得る。
(28)HinCII制限エンドヌクレアーゼ活性を含
有する粗IIIw&抽出物を標準イオン交換及びアフイ
ニティーク口マトグラフィ技術により精製する。
(29)そのようにして精製したエンドヌクレアーゼは
、SOSボリアクリルアミド電気泳動上では均質であっ
て、分子量は27,000ダルトン、ラムダDNAで力
価測定すると蛋白質1q当たり約250,000単位の
比活性を示すことが判明している.概要を記した上記の
段階は本発明を実行するための好ましい態様を示してい
るけれども、上記アプローチが当業界に公知の技術に従
って可変可能であることは当業者には明らかであろう。
以下の実施例を、現在実行するに好ましい本発明の実施
態様を説明するために示す。本実施例は説明のためのも
のであり、本発明は、添付の請求の範囲に示されている
場合を除いて、これらの実施例に限定されるものではな
いと理解されたい。
実施例 旧nkII制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクロー二>
f (1)ゲノムDNAfi製:約59のHealOl)h
ilLIsnfluenzae Rc細胞を解凍し、C
ornir+oプラスチッ’)チュ−7 (50d) 
ニ入れた0.IH Trys −口Cj , pH7.
1 , 0.I MEDTA (25d)に再懸濁した
。上記Ia衝液35−にリゾチーム60m3を溶解した
溶液を2本の50−プラスチックチューブに分け、等1
(15m)のIllI胞懸濁液を各々に加えた。
その溶液を37℃で15分間インキユベートした。20
%保存溶液からSDSを加えて、SDSの最終濃度を1
%に調整した。プOテイナーゼK(20#ISF/一で
保存)200μ』を加え、37℃で1時間インキユベー
トした。溶液は、この時点では粘賀性で且つ拡散性であ
るように見えたが、透明ではなかつた。チューブ(各1
−)に10%SOS/8%サルコシル2rl1を加え、
55℃で2時間加熱した。サンプルは依然として粘質で
あったが、全体的に透明テハなかった。サンプルをT 
E ( 10lH Tris − HCl , pH7
。1 .1nMEDTA)(2j)に対して、1回のT
E交換を含めて計16時間透析した。透析後、等量のT
 E ( pH8.0)で希釈してCsCj勾配液用に
溶液(98−)を調製し、これを2つに分け、各々にC
 s Cl 98.09と5 ms / rd臭化エチ
ジウム1rdを添加した。20本のチューブを、T i
 70口ーター中で44, OOOrl)TIで48時
間回転させた。バンドを取り出し、水飽和イソプタノー
ルで抽出した。
その溶液を前記と同じ!l衝液(4j)に対して透析し
、次いでフェノール及びクロロホルムで抽出したく各1
回)。この溶液を再度透析してフェノールを除去し、次
いで電気泳動にかけた。
(2)限定消化:精製DNAを8glIIで切断して、
以下のような全体的消化を達成した。: 10118T
ris pH?.5, 10mHM gCJ  , 1
00nH N a Cj ,2 10nHメルカプトエタノール緩衝液に 1◇0μ9/
rdで溶解したDNA300μ(を3本のチューブに分
配した。そのチューブに50単位のBalIIを加えた
そのチューブを37℃で1時間インキユベートし、次い
でフェノール/クロロホルムで抽出して、エタノール沈
澱した。ペレットを101Mトリス塩酸,1118ED
TA,pH8.0.  300μp中に再溶解し、各1
0μ1をアガロースゲル電気泳動で分析した。
(3)連結:l!li片化したDNAを以下のようにo
B I 10 1 (EcoR 1部位にBglI!リ
ンカーを挿入したpBR 322)に連結した:10.
Oμ9の8(1111消化Haemophilus i
nfluenzae Rc  DNA{100μ1〉を
2.0μ9の891■開裂及び脱リン酸化1)B I 
I O I (20.0μ』〉と混合して、エタノール
沈澱した。DNAを12,000gで、4℃で15分間
遠心分離し、70%エタノール100ujで1回洗浄し
た。そのDNAを99μ1の1×連結MkVIJ液(5
0lH Tris , pH7.5 , 101H  
M a CJI 2,10nH  DTT. 0.5l
H ATP)に再懸濁し、T4DNAリガーゼ1μ1を
加えて、その混合液を16℃で16時間インキユベート
した。2.5及び5.0μ』のアリコートを用いて、以
下のようにE.coli R R 1株を形質転換した
:各アリコートを200μ1の氷冷コンビテントE,c
oli R R 1細胞と混合し、30分間氷上に放置
した。42℃で2分間ヒートショック後、細胞を1−の
Ltlrlaブロス(L−ブロス)で希釈して、37℃
で1時間増殖させた。
(4)一次細胞ライブラリー:形質転換細胞培1!物を
遠心分離し、250μ』容量に再懸濁して、100μg
/−アンピシリンを含有するLuria−寒天(し−寒
天)平板上にブレーテイングした。37℃で一晩インキ
ユベーションした後、平板を取り出して約5000コロ
ニーを抗生物質を含むし825一中に掻き出した。プラ
スミドDNAを以下と同様にしてこれらのS胞から調製
した:細胞を遠心分離によりペレット化し、3gのII
ll胞ペーストを25nHトリス塩酸、10渇HEDT
A,t)H8.0及び50iHグルコースより成る14
一液に再懸濁した。その懸濁液にリゾチーム4.O r
Fj/一を溶解して、25℃で5分間インキコベートし
た。1%ドデシル1Mナトリウム及び0.2NN a 
O口のアリコート27−を加え、その後その溶液を混合
して、O℃で5分間インキユベートした。水冷3M酢酸
カリウム(pH4.8 )20dを加えてグノムDNA
を沈澱させ、10秒間静かに撹拌し、5分間氷上に放置
して、12,000x gで10分間遠心分離した。上
澄を取り出して、等容量のフェノール/クロロホルムN
:1)で抽出した。10,OOOx gで5分間遠心分
離して各層に分離した。上層を取り出して等容量のクロ
ロホルムで抽出した。10,000gで5分間遠心分離
して層に分けた。上層を取り出して、2容積のエタノー
ルを加えて核酸を沈澱した。12,000x gで20
分間遠心分離して沈澱物を採集した。そのベレットを7
0%エタノールで1回洗浄し、前記と同様に再ベレッ1
・化した。そのベレットを真空乾燥して、8rdの10
+1H トリス塩酸,1nH  EDTA.phs.o
液中に再懸濁した。8.9gの塩化セシウムを加え、0
.9艷の臭化エチジウム{5■/一}溶液を加えて、塩
化セシウムー臭化エチジウム平衡密度遠心分離用にDN
A溶液を調製した。そのDNA溶液を44, OOOr
plで48時間遠心分離し、その結果生じたDNAのプ
ラスミドバンドを18g針付注射器で取り出した。臭化
エチジウムは、等容量のCsCj一水飽和イソプOパノ
ールを用いて抽出することにより除去した。
DNAは等容量のフェノール/クロロホルム(1:1>
を用いて抽出し、エタノール沈澱した。
その結果得られたDNAベレットを101Hトリス塩酸
、1 iHE D T A . pH8.0の液10d
に再懸濁した。
(5)一次選択及び選択されたライブラリー:2μg(
30.0μj)のブラスミドライブラリーを60μ』の
制限エンドヌクレアーゼ消化緩衝液( 10nHTri
s pH7.5 . 10nH  MQC.Q  , 
101Mメルカブ2 トエタノール,100lH  N a Cj及び100
μ9のウシ血清アルブミン)中に希釈した。100単位
(3μJ)の旧nkI[制限エンドヌクレアーゼを加え
、チューブを37℃で2時間インキユベートし、その時
点で7U(1μJ!)の仔ウシ腸ホスフ7ターゼを加え
て、その反応液をさらに30分間インキュベートした。
この反応混合液のアリコート2μ1及び4μ1を氷冷コ
ンピテントE.coli R R 1 m胞と混合し、
形質転換して、平板培地上に置き、次ライブラリーの場
合と同様に一晩増殖した。
(6) I!I々の分析:上記形質転換により得られた
コロニーを取り上げて、アンビシリン及びテトラサイク
リンを含むLB寒天平板上に置いた。alp’及びte
tRであった18個のコロニーを10rR1培II物中
で増殖させ、それらが保有するブラスミドを、B;rn
boinとDoly (Nucleic Acids 
Res.7:1513(1979) )の方法から採用
した以下に示すミニプリーブ(1niDrel))精製
法により調製した。
ミニプリーブ法:各培養物を以下の通りに処理した:1
.5−の一晩培養した培養物を6,OOOx gで5分
間ベレット化した。その上清をデカントして除き、細胞
ペレットをI Q/a!のリゾチームを含有する25I
H Tris,1◇lH  EDTA, 5GlINグ
ルコース, pH8.0の150μ』液中に再懸濁した
。室温で5分後、0.2H  N a O口,1%SD
Sを200μ』加え、そのチューブを振冶して細胞を溶
解し、次いで氷上に放置した。5分後、3M酢酸ナトリ
ウム, pH4.8を150μ』加え、振盪して、さら
に5分間氷上に放置した。生じた沈澱物を12,OOO
X9で4℃で10分間遠心した。その上清を取り出して
、等容量のフェノール/クロロホルム(1:1)で抽出
した。10,OOOX 9で5分間遠心分離することに
より各層に分離した。その上清を880μ1のエタノー
ルを含有する遠心チューブ中に注ぎ入れ、混合した。室
温で10分後、その遠心チューブを12,000x g
で10分間回転し、沈澱した核酸をペレット化した。そ
の上清を捨て、ベレットを1−の70%エタノールー水
で再び洗浄して再ペレット化し、室温で30分間真空乾
燥した。一旦乾燥させた後、ベレットを、20u 9 
/rdのR N aseを含む50μ1溶液(10nN
 Tris.1+lH  EDTA, pt+a.o 
)中に再懸濁し、37℃で1時間インキユベートして、
RNAを消化した。
引き続いて、HincII及びBolIIを用いて消化
することにより、プラスミドミニブリープを分析した。
(7)メチラーゼ遺伝子クローン:分析したプラスミド
の10%は、HinclIに耐性であり、また約6.2
kbの長さのBolII断片を保有することが判明した
。その後、これらのブラスミドは、HincIItl篩
メチラーゼ遺伝子のみを保有し、制限エンドヌクレアー
ゼ遺伝子を保有しないことが示された。
観察されたプラスミドの他の90%はHincnに耐性
でなく、擬似断片を含有していたか、あるいは再連結さ
れたベクターであった。
(8)制限遺伝子クローン:旧ncn修篩メチラーゼ遺
伝子を保有するものとして上記(セクション7)で同定
されたクローンを、HinCII制限エンドヌクレアー
ゼ遺伝子に関しても調べた。これは以下の通りに実施し
た:一晩培養したものの残留部分を用いて、エンドヌク
レアーゼ活性を調べた。これは以下の通りに実施した: エンドヌクレアーゼアツセイ: 10X制限エントヌクレアーセ!avjJ液:100l
HTris, pH7.5 , 100nH M(JC
j  , 100IH 2−メ2 ルカブトエタノール,IM NaCj0以下の通りに細
胞抽出物を調製した: 4,OOOrpnで5分間遠心
分離することにより、1−から18胞をペレット化した
。上清を捨て、ベレットを1rdの超音波処理用1i1
ilj液(101H Tris, pH7.5,too
lH NaCj , 5IIH  DTT, 0.1i
H EDTA)中に再懸濁し、10秒間ずつ2回静かに
超音波処理して、細胞を破砕した。チューブをミクロ遠
心分Mill機内で4℃で10分間回転し、その上清を
細胞抽出物として用いた。1μ』及び5μ1の抽出物を
、1x制限エンドヌクレアーゼ!iij液50μ1に溶
解したラムダDNA1μ9を用いて、37℃で15分間
インキユベートした。試験したクO−ンはいずれもエン
ドヌクレアーゼ活性を示さなかった。
+9)NEBl126と呼ばれる11af3l10ph
iluS influenZal3Rcから得た旧nc
llエンドヌクレアーゼを、発酵槽内で、以下の成分よ
り成るTRY−YEプロス培地中、37℃で増殖させた
: トリブトン(10。Og/Jl);醇母菌抽出物(5,
Og/M ) :NaCJ  <2.0 9/j > 
:K2HPO4(4.4 g/J ) :フトウllt
 (2.0 g/1);ウシのヘミン(10■/j):
NAD:DPN (2.O q/j )。遠心分離によ
り[1胞を集め、新鮮なものを使用するために細胞ペー
ストを一70℃で保存する。
(10)その後の全段階は、4℃で実施する。
(11)II胞ペースト(2009)を解凍し、細胞を
400−の超音波処理用am液(20ffiH  K2
 P 04 ,ptl7.3 , 0.1mH E D
 TA , 10IIH  β−メルカプトエタノール
,0、1H  NaC1)中に再懸濁する。
(12)細胞を超音波処理で破砕しく250ワットで2
分間。氷上で5分間冷却。3回実施)、懸濁Ill胞1
d当たり約50qの可溶性蛋白質が放出された。
(13)不溶性細胞破片を−21,OOOx gで20
分間遠心分離することにより除去する。
(14)その上消液を20mHK口2 P O,t .
 pH6.9 ,100lH N a Cj,及び10
nH  2−メノレカプトエタノールで平衡化されたホ
スフォセルロース力ラム(5X 5(J)  (Wha
tian P−N)にill![1する。そのカラムを
2倍カラム容量の上記!lti液で洗浄する。カラムか
らの流出物を単一フラスコ中に採集する。tlineI
[エンドヌクレアーゼはそのカラムに保持され、0.3
 M 〜0.6H  N a CJIで溶出する。
大半の活性画分をプールし、20nHK2PO4,pH
7.3 , 0.1mH E DTA. 10僧H β
−メノレカブトエタノール,0。IN  KCjに対し
て透析する。
{15)ホスフォセノレロース力ラムからのプールを、
20iHK2PO4, pH7.4 , 0.1lH 
E DTA, 10nHβ−メノレカプトエタノーノレ
,0.1N  KCJで平衡化されたヘリバンーセファ
ロースCL−6Bカラム(2.5 x2.5 u)に載
置し、2倍カラム容量の同一緩衝液で洗浄1る。0.1
H 〜1.OM(7)KCj  (a容量700d>の
直線的勾配を展開し、カラムに適用する。10−ずつの
画分を採集する。その両分を、ラムダDNAに対する旧
ncll制限エンドヌクレアーゼ活性の存在に関してア
ンセイする。その活性画分をプールし、100容量の緩
衝液(10118  K2PO4. pH7.3 , 
0.1信H EDTA,10帥 β−メノレカブトエタ
ノーノレ, 0.114  KCj )に対して透析で
る。
t16)HincI[活性の透析プール< 50d )
を1−Mono Q FPLC力ラム( Pharma
cia )に載置し、緩衝液S (20mH  K2 
PO4 , pH6.9 , 10lH  β一メルカ
ブトエタノーノレ, 0.058 KCj )で洗浄し
、50nHから0.10Mまでの直線勾配のKCJ40
−をSml語液中で展開し、カラムに適用ずる。1ff
il!ずつの画分を採集し、HinCIf制限エンドヌ
クレアーゼ活性の存在に関してアッセイする。
(17)大部分の旧ncll活性を含有する中央画分を
1一ボリCat−A  FPLCカラム(Pharla
cia )に戟置し、4l衝液S (20IIM  K
2PO4,酎+6.9 , 10I β−メルカブトエ
タノーノレ, 0.058 K.Cj )で洗浄し、5
0nHから0. 108までの直線勾配のKCj40−
をSat液中で展開し、カラムに適用する。1−ずつの
画分を収集し、旧nclI制限エンドヌクレアーゼ活性
の存在に関してアッセイする。
最も活性の高い2つの画分は均質である。エンドヌクレ
アーゼは、蛋白質1q当たり約250, 000単位の
比活性を示し、SOS−ポリアクリルアミドゲル上での
分子量は27,000ダルトンであった。
(18)10μ9の均賀旧n+4エンドヌクレアーゼを
^pplied BiOSVStelSモデル470A
気相蛋白質シーケンサーに掛けてアミノ末端蛋白賀配列
決定を行った。最初の24残塁を分解した。その結果得
られた配列を以下に示す。: XFIKPIXQDINXXLIGQKVKXXKX 
(蛋白質配列の1文字コードの説明に関しては表1を参
照のこと)。
(19)蛋白賀配列に基づいて、以下の配列を用いて1
4−nerオリゴマーを作製した。;5 ’ ATH 
GGN CAR^^^GT3’  (口=A.C,又は
T:N=A.C,G又はT:R=A又はG)。
これを用いて、p ( ELS I I 0 1 ) 
HincM − 10.5−1上のエンドヌクレアーゼ
のアミノ末端の位置をマッピングした。このオリゴマー
を用いて、蛋白質配列を立証するDNA配列が得られた
し、また以下の配列を用いて作製される25−nerオ
リゴマーに特有の配列が示された: 5 ’  ATO AGT  TTC ATA AAA
 CCT  ATT  T^TC3’この25−ner
オリゴマーを用いて、エンドヌクレアーゼの方向を決定
する助けとなり、さらにエンドヌクレアーゼのアミノ末
端の位置及びp( pBl 101)HincM−10
.5−1ニ存在L6エンドヌクレアーゼ遺伝子部分を明
確にするDNA配列を得た。得られたDNA配列を以下
に示t:5’ TAC TCA AAG TAT TT
T GGA TAA ATA GTC CT^■^A 
TTG NNA ATA TTA^TC GGG CA
A AA^GTG^AACGT CCT AAA TC
A GGT ACT CTG TCA GGT CAT
 GCTGCA GGG GAA CCA TTT G
AA AAA TTA GTA TAT AAGTTT
 TTG AAA GAA AAC CTG TCA 
GAT TTA ACA TTTAAG CAA T^
T GA^1^T CTT AAT GAT TTA 
TTT ATGAAG AAC CCT GCG AT
^ATT GAG C^IG3′。25−間『オリゴマ
ーを用いて、HaelOI)hillJsinflue
nzae Rcゲノムの種々の制限断片にエンドヌクレ
アーゼ遺伝子をマッピングした。ベクターDNAに対し
て作製された配列特異性オリゴマー及びメチラーゼ遺伝
子内に位置することが公知の欠失クローンを用いて、メ
チラーゼ遺伝子の方向が、エンドヌクレアーゼ遺伝子の
方向が決定されだのと同じ方法で決定された。
(20)段階(18)で得られたデータに基づいて、精
製Haenophilus influenzae R
cゲノムDNA (段階(1)同様に調製される)を、
以下の通りに、Hindllを用いて限定消化した: 
10mt4 Tris.I)H7.5,10118  
MQCj  , 100118 NaCj , 101
18メノレカ2 プトエタノール緩衝液中に 100μg/Idの濃度で
溶解したDNA?W液300μ1を1本のチューブ中に
分配した。そのチューブに50単位の旧ndlを加えた
。チューブを37℃で1時間インキユベートし、次いで
フェノール/クロロホルムで抽出して、エタノールで沈
澱した。そのベレットを10mt4トリス塩酸.1+s
H  EDTA.pH8.0の300μA液に再溶解し
、各10μ』をアガロースゲル電気泳動で分析した。
(21)連結:断片化したDNAを以下の通りに1)B
 I IH 1. 2 (PvulI部位に挿入された
}{ pa Iリンカーと、EcoR1部位に挿入され
たBolllリンカーを有するpN 01523)に連
結した:10.0/,! 9の旧ndll消化Haem
ophilus inftuenzaeRc DNA 
(  100μ1)をz.oμgの旧ndlll一間裂
及び脱リン酸化pB i IH I. 2 (20μj
)と混合し、エタノールで沈澱した。そのDNAを12
.0009で、4℃で15分間遠心分離し、70%エタ
ノール100μ1で1回洗浄した。そのDNAを1x連
結am液(501IH Tris.t)H7.5,10
1MMQCj  ,10nl4  DTT.0.5nH
ATP)992 μJに再懸濁してT4DNAリガーゼ1μ1を加え、そ
の混合液を16℃で16時間インキュベートした。2.
5μ』及び5.0μ1のアリコー1−を用いて、以下の
通りにE.coli R R I株を形賀転換した:各
アリコートを200μ1の氷冷コンビテント E.co
li R R 1細胞と混合し、氷上に30分間敢置し
た。42℃での2分間ヒートショツクした後、III胞
を1dのLuriaプロス(しープロス〉で希釈し、3
7℃で1時間増殖した。
(22)一次細胞ライブラリー:段階{4}にさらに1
段階加えた方法で調製した:段階(18)から得られた
データに基づいて、配列特異性25−Tierオリゴマ
ー(段1%!I(19))を用いてライブラリーをプロ
ーブし、エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼ遺伝子を含
有すると思われる適当なサイズの旧ndlll!li片
を探した。この断片は一次細胞ライブラリー中に存在し
た。
(23)一次選択及び選択されるライブラリー:段階(
5)と同様に調製した。
(24)個々の分析:上記形質転換から得られたコロニ
ーを取り出し、アンビシリンを含むLB寒天平板上と、
アンピシリン及びストレプトマイシンを含むLB寒天平
板上にプレーテイングした。
alDR及ヒstr.ep” r−あル18個ノコロニ
ーを10一の培養物中で増殖し、それらが保有するプラ
スミドを、段1@ (6)に記載のミニブリーブ精製法
によってfill製した。続いてプラスミドミニブリー
ブをHincn及び旧nd■で消化して分析した。
(25)メチラーゼ遺伝子クローン:分析したブラスミ
ドの27%は旧nclIに耐性であり、また約3. O
kbの長さの旧ndl断片を保有することが判明した。
これらのブラスミドは、その後、HincINIlメチ
ラーゼ遺伝子及び制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の両方
を保有することが示された。これらのブラスミドも、各
々、1つ又はそれ以上の擬似断片を保有することが判明
した。観察されたプラスミドの他の63%は Hinc
IIに耐性でなく、また擬似断片を含有するかあるいは
再連結されたベクターであった。
(26)制限遺伝子クローン:HinCn修篩メチラー
ゼ遺伝子を保有するものとして上記(階段(24))で
同定されたクローンを、nincII制限エンドヌクレ
アーゼ遺伝子に関しても調べた。これは、段階(8)に
記載の通りに実施した。調べたクO−ンはすべて、エン
ドヌクレアーゼ活性を有していた。
(27)メチラーゼ陽性クローンはすべて、エンドヌク
レアーゼを含有することが判明した。これらのクローン
は、いずれかの方向に1グラムの湿潤細胞ペースト当た
り約1 , 000単位の旧ncll制限エンドヌクレ
アーゼを合成することが判明した。
(28) p( DB I IH I. 2)Hinc
IIRM−8.0 一A1を用いて同一遺伝子系E.c
oli株を形質転換し、表現型McrA. McrBま
たは−『『によって生じる(29)  p(  pBI
  IH I.2)HincIIRM−8.0A1から
得られる3.Okbの旧ndII[断片を、以下の方法
で、ゲルa@l(gel prep) L、Hindl
llで切断され且つ脱リン酸化されたI)UC19との
連結反応に用いた:250ngの2. 7kbゲル調製
断片(20μN)を100n SF (  1μJ! 
)のHindDI一切断及び脱リン酸化pUc19と混
合し、エタノール沈澱した。そのDNAを12,000
!?で、4℃で15分間遠心分離し、70%エタノール
100μ1で1回洗浄した。
DNAt1X31結緩衝液(50nH Tris,pl
l7,5 . 10iH  MQCj  , 10mH
  DTT, 0.5僧H ATP)2 10μ1に再懸濁して、1μ』のT4  DNAリガー
ゼを加え、その混合液を16℃で16時間インキュベー
トした。580μ』のアリコートを用いて、以下の通り
E.colt R R l株を形賀転換した:各アリコ
ートを200μ(の氷冷コンピテントE.coliRR
1細胞と混合し、氷上に30分間放置した。42℃で2
分間ヒートショックした後、細胞を1rdのLuria
ブロス(L−プロス)で希釈し、37℃で1時間増殖し
た。形質転換細胞培養物を遠心分離し、250μ1容量
に再懸濁し、100μg/一のアンピシリンを含むLu
ria一寒天(L一寒天)平板上にブレーティングした
。37℃で一晩インキユベーションした後、コロニーを
摘み取ってアンビシリンを含むLB寒天上にブレーティ
ングし、37℃で一晩インキユベートした。amp’で
ある184!lのコロニーを10d培養物中で培養し、
それらが保有するブラスミドを、段階(6)に記載のミ
ニプリープ精製法によって調製した。引き続いて、プラ
スミドミニプリープを、Hincll及び旧ndlで消
化して分析した。
(30)メチラーゼ遺伝子クローン:分析したプラスミ
ドの50%以上が旧nc[消化に耐性であり、また約3
.Okbの長さの旧ndl[断片を保有することが判明
した。これらのブラスミドは、その後、HincII修
飾メチラーゼ遺伝子及び制限エンドヌクレアーゼ遺伝子
の両方を保有することが示された。残りのブラスミドは
、再連結されたI)UC19であった。
(31)制限遺伝子クローン;HinalllI篩メチ
ラーゼ遺伝子を保有するものとして上記《段階(28)
 )で同定されたクローンは、HinCIl制限エンド
ヌクレアーゼ遺伝子に関しても調べた。これは、段階(
8)に記載の通りに実施した。試験したクローンはすべ
て、エンドヌクレアーゼ活性を示した。
(32)メチラーゼ陽性クローンはすべて、エンドヌク
レアーゼを含有することが判明した。これらのクローン
は、E) ( pu C19) Hincll RM−
5.7 −10 ( NEBl520)では方向Aに湿
WJIII胞ペースト1g当たり約80, 000単位
のHinc[制限エンドヌクレアーゼを合成し、p (
  pu C19) HincII RM−5.7−4
では方向Bに湿潤細胞ペースト19当たり2,000単
位の旧ncll制限エンドヌクレアーゼを含或すること
が判明した。
(33)HincII制限エンドヌクレアーゼ及びメチ
ラーゼをコードする遺伝子を保有する組換えプラスミド
I)( DLIC)HincI[RM−10−5.7 
 (NEBl520 )を形質転換によりE.coli
R R l株中に移入した。
段1@ (28)におけると同様の同一遺伝子系株を形
質転換するに際しては、I) ( DU C ) Hi
ncll RM −10−5.7  (NEBl520
 )はこれらの株中に形質転換可能であったが、しかし
10d以上の液体培養物中では増殖不可能であった。
(34)段階(9)〜(16)に記載の通り(ある変更
を加えて) , Hincllエンドヌクレアーゼを1
1fJし、細胞を以下の成分より成るLBブロス培地中
で培養した:109/jのカゼイン加水分解物:59/
jの酵母菌抽出物:10g/jのNaCj:11?/j
の塩化マグネシウム・6水和物:1g/jのブドウ糖:
  10011g/jのアンビシリン。pllはNaO
口で7.2に調節する。m製されたエンドヌクレアーゼ
は1qの蛋白質につき約250, 000単位の比活性
を示すことが判明した。
mRNA (DNA)Ha+’ll;少111アξノ&
Lダ′1々磯a体#口4を 二4へ,−7の叫目晶シJ鵠ζ杓代XUPAC−1υe
傅弁一ξトエLネ■菟ギ(冫.A C G U/T AGA G B.I’)スIiN Z−Hメ幡Q 4 .図面の簡単な説明 第1図は、Hinc[制限エンドヌクレアーゼをクロー
ニングするための概要を示す。● 第2図は、llinen制限エンドヌクレアーゼを製造
するための概要を示す。
第3図は、IIinc[制限エンドヌクレアーゼ及び修
飾メチラーゼをコードするllaenophi tus
nfluenzae Rcから得た3.Okb lli
ndII断片の制限地図である。その断片をρBilH
1.2(AICC 67902)のllindin部位
中にクローン化して1)(Dell口1 . 2 ) 
Hincll RM−8、0−A1を作製し、続いてp
U C 19 ( ATCC 37254 )中にサ7
’) ローン化シテO (  pLJ 019) ll
incI[ RM5.7−4及びp ( PU C19
) llinell RM−5.7 −10を作った。
第4図は、p ( pU C 19) IiincII
 R M − 5.7−4及ヒI)(  1)UC19
) lIinclIRM−5.7 −10(NEBl5
20 )を保有ずるE.coli  R R 1(AT
CC 31343)の細胞抽出物中のlIir+c[制
限エンドヌクレアーゼ活性を立証するアガロースゲルの
17真である。
ha人 ニュー゛イン7フy(  ノくイ1”レA7入
゛イ〉冫一牛0レAテ・/ド 代理人ブr理士 船 山 武 口inc II Endonuclease Puri
ficationof fnterest u帥1 + ul Purlfm Hinc II E
ndanucmseイram Ha*mophllu訓
nfluenzas Rc cellsLine 2 
1ul ol a cell m陽cl jromεc
olt strain RRI co+nalning
 p(puc+91HincllRM−5.7−aLa
rm 3 5 ul oj a C@II *xtra
cIfromεcoli s++ain RRI co
malning p(pU(jQIHincllRM.
5.7−aLan@II 1 ul ol a cel
l saract fromεcoli strain
 RRI eonla+fiin9 p(pυCj9)
HmllRM5.7.IOLar1@9 5 ul o
j a cell enact thorn E. c
oli main RRI containing p
ipUc191HincllRM−5.7・lOFjG
.4 第1頁の続き [相]Int. Cl.’ 識別記号 庁内整理番号 C 12 R 1:21) 手続?m正書 特許庁長官 古 田 文 毅 殿 1.事件の表示 平成2年特許願第65542号 2.発明の名称 HinclIII限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼ
の製造方法 3. 補正をする者 事件との関係 特許出願人 名 称 ニュー・イングランド・バイオレイブス・インコーポレ
イテッド 5. 補正命令の日付 自 発 8.補正の内容

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 (1)HincII制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含有
    するクローニングベクター。 (2)請求項1記載のクローニングベクターを含む形質
    転換宿主。 (3)該HincII遺伝子をHaemophilus 
    influenzaeRcゲノムDNAから切り出すか
    、又は該HindII遺伝子をHaemophilus 
    influenzae RdゲノムDNAから切り出す
    ことを特徴とする請求項1記載のクローニングベクター
    。 (4)HincII修飾遺伝子を含有するクローニングベ
    クター。 (5)請求項4記載のクローニングベクターを含む形質
    転換宿主。 (6)HincII又はHindII制限エンドヌクレアー
    ゼ遺伝子をクローニングする方法であって: (a)Haemophilus influenzae
     Rc又はHaemophilus influenz
    ae Rdから得たプラスミドDNAからライブラリー
    を形成し; (b)HincII又はHindII修飾遺伝子を含有する
    クローンを単離し; (c)制限エンドヌクレアーゼ蛋白質を精製して、蛋白
    質配列を得; (d)DNAシーケンシングを通してエンドヌクレアー
    ゼの方向を決定し、メチラーゼクローン内における該エ
    ンドヌクレアーゼの位置を定め、Haemophilu
    s influenzae Rc又はHaemophi
    lusinfluenzae Rdゲノム内におけるエ
    ンドヌクレアーゼの位置を定め; (e)b〜dの段階で得られるデータに基づいてライブ
    ラリーを形成し; (f)HincII又はHindII修飾及び制限遺伝子を
    含有するクローンを単離する; 各段階から成る方法。 (7)該ライブラリー下記の段階: (a)Haemophilus influenzae
     Rc又はHaemophilus influenz
    ae RdからゲノムDNAを精製し; (b)該精製DNAを消化してDNA断片を形成し; (c)該断片をクローニングベクターに連結し;(d)
    段階(c)のクローニングベクターを用いて宿主細胞を
    形質転換して細胞ライブラリーを形成し; (e)該細胞ライブラリーから組換えベクターを精製し
    てプラスミドライブラリーを形成する;段階により形成
    することを特徴とする請求項6記載の方法。 (8)該クローニングベクターがpBIIHI.2、p
    BIIOI、又はpUC19であることを特徴とする請
    求項7記載の方法。 (9)該宿主細胞がE.coliMrr^−株であるこ
    とを特徴とする請求項7記載の方法。 (10)HincIIでプラスミドライブラリーを消化し
    て消化プールを形成し、その消化プールを宿主細胞に形
    質転換し、修飾遺伝子を含むクローンを選択することに
    より、HincII修飾遺伝子を含有するクローンを単離
    することを特徴とする請求項7記載の方法。 (11)HincII制限エンドヌクレアーゼを製造する
    ための方法であって: (a)Haemophilus influenzae
     RcからDNAを精製し; (b)精製したDNAを適切な制限エンドヌクレアーゼ
    で消化してDNA断片を形成し; (c)該断片をクローニングベクターに連結してDNA
    混合物を形成し; (d)宿主細胞を段階(c)のDNA混合物で形質転換
    してライブラリーを形成し; (e)該HincII修飾メチラーゼ遺伝子を含有するク
    ローンを単離し; (f)該HincII修飾メチラーゼ遺伝子を含有するク
    ローンをスクリーニングして、さらに該HincII制限
    エンドヌクレアーゼ遺伝子をも含有するクローンを単離
    し; (9)段階(f)のクローンを含む宿主細胞を培養し; (h)該培養物からhincII制限エンドヌクレアーゼ
    を取り出す; 各段階から成ることを特徴とする方法。 (12)該クローニングベクターがプラスミド又はウイ
    ルスDNA分子であることを特徴とする請求項11記載
    の方法。 (13)該プラスミドがpBIIOIであることを特徴
    とする請求項12記載の方法。 (14)該プラスミドがpUC19であることを特徴と
    する請求項12記載の方法。 (15)該プラスミドがpBIIH1.2であることを
    特徴とする請求項12記載の方法。 (16)その中に以下のDNA配列:5′TAC TC
    AAAG TAT TTT GGA TAA ATA 
    GTC CTA TAA TTG NNAATA TT
    A ATC GGG CAA AAA GIG AAA
     CGT CCT AAATCA GGT ACT C
    TG TCA GGT CAT GCT GCA GG
    G GAACCA TTT GAA AAA TTA 
    GTA TAT AAG TTT TTG AAAGA
    A AAC CTG TCA GAT TTA ACA
     TTT AAG CAA TATGAA TAT C
    TT AAT GAT TTA TTT ATG AA
    G AAC CCTGCG ATA ATT GAG 
    CAT G3′を有するHincII修飾及び制限遺伝子
    を含有するクローン。
JP2065542A 1989-03-15 1990-03-15 Hinc▲II▼制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼの製造方法 Expired - Lifetime JP2672683B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US324,402 1989-03-15
US07/324,402 US5015581A (en) 1989-03-15 1989-03-15 Method for producing the Hinc II restriction endonuclease and methylase

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP11991397A Division JP3156759B2 (ja) 1989-03-15 1997-05-09 Hinc II制限エンドヌクレアーゼをコードするDNAセグメント

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH0322978A true JPH0322978A (ja) 1991-01-31
JP2672683B2 JP2672683B2 (ja) 1997-11-05

Family

ID=23263422

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2065542A Expired - Lifetime JP2672683B2 (ja) 1989-03-15 1990-03-15 Hinc▲II▼制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼの製造方法
JP11991397A Expired - Lifetime JP3156759B2 (ja) 1989-03-15 1997-05-09 Hinc II制限エンドヌクレアーゼをコードするDNAセグメント

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP11991397A Expired - Lifetime JP3156759B2 (ja) 1989-03-15 1997-05-09 Hinc II制限エンドヌクレアーゼをコードするDNAセグメント

Country Status (5)

Country Link
US (2) US5015581A (ja)
EP (1) EP0388212B1 (ja)
JP (2) JP2672683B2 (ja)
CA (1) CA2012149C (ja)
DE (2) DE388212T1 (ja)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5298404A (en) * 1989-10-13 1994-03-29 New England Biolabs, Inc. Method for producing the Hpa I restriction endonuclease and methylase
US5278060A (en) * 1990-08-30 1994-01-11 New England Biolabs, Inc. Method for producing the Nla III restriction endonuclease and methylase
US5288696A (en) * 1990-09-07 1994-02-22 New England Biolabs, Inc. Method for producing and cloning SacII restriction endonuclease and methylase
US5202248A (en) * 1990-11-02 1993-04-13 New England Biolabs, Inc. Method for cloning and producing the nco i restriction endonuclease and methylase
US5192676A (en) * 1991-02-05 1993-03-09 New England Biolabs, Inc. Type ii restriction endonuclease, asci, obtainable from arthrobacter species and a process for producing the same
US5200337A (en) * 1991-10-25 1993-04-06 New England Biolabs, Inc. Type ii restriction endonuclease, apo i, obtainable from arthrobacter protophormiae and a process for producing the same
JP3400124B2 (ja) * 1994-08-08 2003-04-28 株式会社日立製作所 パストランジスタ型セレクタ回路及び論理回路
US5731185A (en) * 1995-07-21 1998-03-24 New England Biolabs, Inc. Isolated DNA encoding the hphi restriction endonuclease and related methods for producing the same
US5824529A (en) * 1996-03-06 1998-10-20 New England Biolabs, Inc. Method for cloning and producing the PshAI restriction endonuclease
EP2540823A1 (en) 2005-08-04 2013-01-02 New England Biolabs, Inc. Novel restriction endonucleases, DNA encoding these endonucleases and methods for identifying new endonucleases with the same or varied specificity
CN109880841A (zh) * 2018-12-31 2019-06-14 吴江近岸蛋白质科技有限公司 一种HindIII限制性核酸内切酶的制备方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61265094A (ja) * 1985-02-06 1986-11-22 ニユ−・イングランド・バイオラブズ・インコ−ポレ−テツド 制限および修飾遺伝子のクロ−ニング

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61265094A (ja) * 1985-02-06 1986-11-22 ニユ−・イングランド・バイオラブズ・インコ−ポレ−テツド 制限および修飾遺伝子のクロ−ニング

Also Published As

Publication number Publication date
JP2672683B2 (ja) 1997-11-05
JPH1080284A (ja) 1998-03-31
USRE35248E (en) 1996-05-21
DE388212T1 (de) 1994-02-03
EP0388212B1 (en) 1995-11-29
CA2012149A1 (en) 1990-09-15
DE69023789T2 (de) 1996-08-08
JP3156759B2 (ja) 2001-04-16
CA2012149C (en) 1999-11-16
EP0388212A1 (en) 1990-09-19
US5015581A (en) 1991-05-14
DE69023789D1 (de) 1996-01-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPH07108221B2 (ja) レンニンの製造方法
JP3217409B2 (ja) NcoI制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼのクローニング法及び製造法
JPH0322978A (ja) Hinc2制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼの製造方法
US5945326A (en) Method for cloning and producing the Spel restriction endonuclease
JPH06339374A (ja) バチルスコアグランスから得られる新規な制限エンドヌクレアーゼ及びその製造方法
US5248605A (en) Cloning and expressing restriction endonucleases from haemophilus
JP3162059B2 (ja) NdeI制限エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼの製造方法
JPH0216979A (ja) XbaI制限エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼの製造方法
JPH02150279A (ja) EagI制限エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼの製造方法
EP0581436B1 (en) Method for cloning and producing the AatII restriction endonuclease and methylase
JPH022371A (ja) HhaI制限エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼの製造方法
US5371006A (en) Isolated DNA encoding the NotI restriction endonuclease and related methods for producing the same
JP3195604B2 (ja) SfiI制限エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼのクローニングおよび製造方法
JPH0965884A (ja) SacI制限エンドヌクレアーゼのクローニング及び製造法
JPH022367A (ja) HgiAI制限エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼの製造方法
JPH022369A (ja) HinPI制限エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼの製造方法
JP2000316589A (ja) SwaI制限エンドヌクレアーゼのクローニングおよび精製のための方法
EP0959131B1 (en) Method for cloning and producing the AgeI restriction endonuclease in E. coli
JPH1057082A (ja) 大腸菌中で制限エンドヌクレアーゼSapIをクローニング及び産生する方法
EP0324248A2 (en) Method for producing the FnuDI restriction endonuclease and methylase
JP3003117B2 (ja) HpaI制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼの製法
JP2005034001A (ja) 大腸菌におけるBsaI制限エンドヌクレアーゼ及びBsaIメチラーゼのクローニング及び発現方法
JPH029373A (ja) AseI制限エンドヌクレアーゼとメチラーゼの製造方法
US5731185A (en) Isolated DNA encoding the hphi restriction endonuclease and related methods for producing the same
JP3910248B2 (ja) トランスポゼースを用いるin vitro反応によるDNA入れ子型欠失の作製方法

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20070711

Year of fee payment: 10

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080711

Year of fee payment: 11

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080711

Year of fee payment: 11

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090711

Year of fee payment: 12

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090711

Year of fee payment: 12

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100711

Year of fee payment: 13

EXPY Cancellation because of completion of term
FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100711

Year of fee payment: 13