JPH0322978A - Ｈｉｎｃ２制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼの製造方法 - Google Patents
Ｈｉｎｃ２制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼの製造方法Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
- C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
Landscapes
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- Medicinal Chemistry (AREA)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
隻艶立１１
本発明は、ＨｉｎｃＩＩ制限エンドヌクレアーゼ及びｉ
ｏメチラーゼ用のクローン、並びにこのクローンからの
これらの酵素の製造に関する。
ｏメチラーゼ用のクローン、並びにこのクローンからの
これらの酵素の製造に関する。
制限エンドヌクレアーゼは、細菌中に天然に生起する酵
素の一種である。制限エンドヌクレアーゼを、混在する
他の細菌或分から精製した場合には、これを実験室で用
いてＤＮＡ分子を正確な断片に切断することができる。
素の一種である。制限エンドヌクレアーゼを、混在する
他の細菌或分から精製した場合には、これを実験室で用
いてＤＮＡ分子を正確な断片に切断することができる。
この特性により、ＤＮＡ分子を唯一のものとして同定す
ることができ、またその構成遺伝子に分画することがで
きる．制限エンドヌクレアーゼは、現代の遺伝子研究に
おける不可欠の道具であることが立証されている。
ることができ、またその構成遺伝子に分画することがで
きる．制限エンドヌクレアーゼは、現代の遺伝子研究に
おける不可欠の道具であることが立証されている。
それらは生化学的な「鋏」であって、それを用いて遺伝
子工学及び分析が行なわれる。
子工学及び分析が行なわれる。
制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子に沿った特定の
ヌクレオチド配列（「認識配列」）を認識し、これに結
合することにより作用する。一旦結合すると、それらは
該配列内か又はその一方の銅で分子を開裂する。異なる
制限エンドヌクレアーゼは異なる認識配列に対して親和
性を有する。
ヌクレオチド配列（「認識配列」）を認識し、これに結
合することにより作用する。一旦結合すると、それらは
該配列内か又はその一方の銅で分子を開裂する。異なる
制限エンドヌクレアーゼは異なる認識配列に対して親和
性を有する。
百個以上の異なる制限エンドヌクレアーゼが、今日まで
に調べられた数百種の細菌種の中から同定されている。
に調べられた数百種の細菌種の中から同定されている。
細菌は、通常、種当たり少数の制限エンドヌクレアーゼ
しか有していない。エンドヌクレアーゼは、それらが由
来する細菌に従って命名される。
しか有していない。エンドヌクレアーゼは、それらが由
来する細菌に従って命名される。
したがって、例えばＨａｅｌｏｐｈｉｌｕｓ ａｅｇｙ
ｐｔｉｕｓは、Ｈａｅ Ｉ、Ｈａｅ Ｕ、及びＨａｅ
ｌ［ｌと名づけられた３つの異なる制限エンドヌクレア
ーゼを合成する。これらのｌＩｌｉＡは、それぞれ配列
（ＡＴ）ＧＧＣＣ（ＡＴ）、ＰｕＧＣＧＣＰｙ及びＧＧ
ＣＣを認識し、開裂する。一方、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ ＲＹ１３は、配列 Ｇ＾＾ＴＴＣを認識
する一つの醇素ＥｃｏＲＩのみを含威する。
ｐｔｉｕｓは、Ｈａｅ Ｉ、Ｈａｅ Ｕ、及びＨａｅ
ｌ［ｌと名づけられた３つの異なる制限エンドヌクレア
ーゼを合成する。これらのｌＩｌｉＡは、それぞれ配列
（ＡＴ）ＧＧＣＣ（ＡＴ）、ＰｕＧＣＧＣＰｙ及びＧＧ
ＣＣを認識し、開裂する。一方、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ ＲＹ１３は、配列 Ｇ＾＾ＴＴＣを認識
する一つの醇素ＥｃｏＲＩのみを含威する。
理論に結びつけることを望んでいるわけではないが、天
然においては、制限エンドヌクレアーゼはＩｌｌ［ｌｉ
！ｉａ胞の繁栄に保護的役割を演じている。制限エンド
ヌクレアーゼにより、細菌を破壊するか又はこれに寄生
するウィルス及びブラスミドのような外来ＤＮＡ分子に
よる感染に対し、細菌は抵抗することができる。制限エ
ンドヌクレアーゼは、認識配列が生起するたびに＠染Ｄ
ＮＡ分子に結合しこれを開裂することにより、細菌に耐
性を付与する。その結果生じる破壊番よ感染遺伝子の多
くを不活性化し、そのＤＮＡをエキソヌクレアーゼによ
りさらに分解され易くする。
然においては、制限エンドヌクレアーゼはＩｌｌ［ｌｉ
！ｉａ胞の繁栄に保護的役割を演じている。制限エンド
ヌクレアーゼにより、細菌を破壊するか又はこれに寄生
するウィルス及びブラスミドのような外来ＤＮＡ分子に
よる感染に対し、細菌は抵抗することができる。制限エ
ンドヌクレアーゼは、認識配列が生起するたびに＠染Ｄ
ＮＡ分子に結合しこれを開裂することにより、細菌に耐
性を付与する。その結果生じる破壊番よ感染遺伝子の多
くを不活性化し、そのＤＮＡをエキソヌクレアーゼによ
りさらに分解され易くする。
細菌防御系の第二の成分は修飾メチラーゼである。
これらの酵素は制限エンドヌクレアーゼと相補的であっ
て、細菌がそれ自身のＤＮＡを保護し、そのＤＮＡと外
来＠染ＤＮＡとを区別することができる手段を提供する
。修飾メチラーゼは対応する制限エンドヌクレアーゼと
同じヌクレオチド認識配列を認識して結合するが、ＤＮ
Ａを破壊する代わりに、メチル基を付加することにより
その配列内のある又は他のヌクレオチドを化学的にｒｌ
篩する。メチル化後、認識配列はもはや制限エンドヌク
レアーゼによって結合されないか、あるいは開裂されな
い。細菌細胞のＤＮＡは、その修飾メチラーゼの活性に
よって常に十分に修飾され、したがって内因性制限エン
ドヌクレアーゼの存在に対して完全に非感受性である。
て、細菌がそれ自身のＤＮＡを保護し、そのＤＮＡと外
来＠染ＤＮＡとを区別することができる手段を提供する
。修飾メチラーゼは対応する制限エンドヌクレアーゼと
同じヌクレオチド認識配列を認識して結合するが、ＤＮ
Ａを破壊する代わりに、メチル基を付加することにより
その配列内のある又は他のヌクレオチドを化学的にｒｌ
篩する。メチル化後、認識配列はもはや制限エンドヌク
レアーゼによって結合されないか、あるいは開裂されな
い。細菌細胞のＤＮＡは、その修飾メチラーゼの活性に
よって常に十分に修飾され、したがって内因性制限エン
ドヌクレアーゼの存在に対して完全に非感受性である。
制限エンドヌクレアーゼ認識及び攻撃に対して感受性で
あるＤＮＡは、未修飾の、したがって同定可能な外来Ｄ
ＮＡだけである。
あるＤＮＡは、未修飾の、したがって同定可能な外来Ｄ
ＮＡだけである。
遺伝子工学技術の出現により、現在では、遺伝子をクロ
ーン化し、慣用の精製技術によって得られるよりも大量
に、該遺伝子がコードする崇白質及び酵素を産生ずるこ
とが可能である。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクロ
ーンを単離するためのキーポイントは、それらが１０−
３〜１０−４という低い頻度で生じる場合に、複雑な「
ライブラリー」中の該クローン、即ち「ショットガン」
法によって誘導されるクローンの集団を同定するための
簡単且つ確実な方法を開発することである。好ましくは
、望ましくない大多数のクローンは破壊され、望ましい
少数のクローンは生存するというような方法を選択する
必要がある。
ーン化し、慣用の精製技術によって得られるよりも大量
に、該遺伝子がコードする崇白質及び酵素を産生ずるこ
とが可能である。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクロ
ーンを単離するためのキーポイントは、それらが１０−
３〜１０−４という低い頻度で生じる場合に、複雑な「
ライブラリー」中の該クローン、即ち「ショットガン」
法によって誘導されるクローンの集団を同定するための
簡単且つ確実な方法を開発することである。好ましくは
、望ましくない大多数のクローンは破壊され、望ましい
少数のクローンは生存するというような方法を選択する
必要がある。
■型制限一修篩系がクローン化されるＶ４度が増しつつ
ある。第１のクローニング系は、制限エンドヌクレアー
ゼクローンを同定又は選択する手段としてバクテリオフ
ァージ感染を用いた［Ｈｈａ ＩＩ ：Ｈａｎｎ等、Ｇ
ｅｎｅ３ ： ９７ 〜１１２（１９７８） ： Ｅ
ｏｃＲＩＩ ：ＫＯＳＶｋｈ等、Ｈｏｌｅｃ．ａｅｎ．
Ｇｅｎｅｔ １７８：７１７ 〜７１９（１９８０）
： Ｐｓｔｌ ： Ｗａｌｄｅｒ等、Ｐｒｏｃ． Ｎａ
ｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃ ｉ ，ＵＳＡ ７８： １
５０３ 〜１５０７（１９８１）］ ． ＩＩＩ菌中に
制限一修飾系が存在すると、細菌はバクテリオファージ
による感染に抵抗できるため、クローン化された制限一
修飾遺伝子を保有する細胞は、主として、ファージに晒
されていたライブラリーから生存細胞として選択的に単
離され得る。しかしながら、この方法はその有用性に限
界があることが判明した。即ち、クローン化された制限
一修飾遺伝子は常に十分なファージ耐性を発現して選択
的な生存を授けるわけではないことが判明した。
ある。第１のクローニング系は、制限エンドヌクレアー
ゼクローンを同定又は選択する手段としてバクテリオフ
ァージ感染を用いた［Ｈｈａ ＩＩ ：Ｈａｎｎ等、Ｇ
ｅｎｅ３ ： ９７ 〜１１２（１９７８） ： Ｅ
ｏｃＲＩＩ ：ＫＯＳＶｋｈ等、Ｈｏｌｅｃ．ａｅｎ．
Ｇｅｎｅｔ １７８：７１７ 〜７１９（１９８０）
： Ｐｓｔｌ ： Ｗａｌｄｅｒ等、Ｐｒｏｃ． Ｎａ
ｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃ ｉ ，ＵＳＡ ７８： １
５０３ 〜１５０７（１９８１）］ ． ＩＩＩ菌中に
制限一修飾系が存在すると、細菌はバクテリオファージ
による感染に抵抗できるため、クローン化された制限一
修飾遺伝子を保有する細胞は、主として、ファージに晒
されていたライブラリーから生存細胞として選択的に単
離され得る。しかしながら、この方法はその有用性に限
界があることが判明した。即ち、クローン化された制限
一修飾遺伝子は常に十分なファージ耐性を発現して選択
的な生存を授けるわけではないことが判明した。
別のクローニング法は、プラスミドーボーン（ ｐｌａ
ｓｌｉｄ−ｂｏｒｎｅ）として最初に特性化された、Ｅ
．ｃｏｌｉにクローニングプラスミドを移入する系を含
む［ ＥｃｏＲＶ ： Ｂｏｕｇｕｅ ｌｅｒｅｔ等、
Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ． １２：３６５９
〜３６７Ｂ （ １９８４）；ＰａｅＲ７：Ｇｉｎｏ
ｅｒａｓと８ｒｏｏｋｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．＾ｃａ
ｄ．ｓｃｉ．ｔｌｓ＾８０ ： ４０２ 〜４０６（１
９８３） ： ＴｈｅｒｉａｕｌｔとＲａｙ，Ｇｅｎｅ
ｌ９：３５５ 〜３５９（１９８２）： ＰｖｕＩＩ
： Ｂｌｕｌｅｎｔｈａｌ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ． １６４：５０１〜５０９， （１９８５） ］
。
ｓｌｉｄ−ｂｏｒｎｅ）として最初に特性化された、Ｅ
．ｃｏｌｉにクローニングプラスミドを移入する系を含
む［ ＥｃｏＲＶ ： Ｂｏｕｇｕｅ ｌｅｒｅｔ等、
Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ． １２：３６５９
〜３６７Ｂ （ １９８４）；ＰａｅＲ７：Ｇｉｎｏ
ｅｒａｓと８ｒｏｏｋｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．＾ｃａ
ｄ．ｓｃｉ．ｔｌｓ＾８０ ： ４０２ 〜４０６（１
９８３） ： ＴｈｅｒｉａｕｌｔとＲａｙ，Ｇｅｎｅ
ｌ９：３５５ 〜３５９（１９８２）： ＰｖｕＩＩ
： Ｂｌｕｌｅｎｔｈａｌ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ． １６４：５０１〜５０９， （１９８５） ］
。
第３の方法、即ち増大数の系をクローン化するために使
用される方法は、活性メチラーゼ遺伝子を選択すること
を含む［例えば、ＥＰＯ特許第 １９３，４１３号（１
９８６年 ９月 ３宕チ９、及びＢＳｔｌＲＩＫｉｓｓ
等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１３：６４０
３ 〜６４２１（１９８５）参照］。制限及び修飾遺伝
子は近接して結合する傾向があるため、両遺伝子を含有
するクローンは、正に一方の遺伝子について選択するこ
とによりしばしば単離され得る。メチル化活性について
の選択により、常に完全な制限一修飾系が得られるわけ
ではないけれども、その代わりに時々、メチラーゼ遺伝
子のみが得られる［ＢｓｐＲｌ：ＳＺＯ＠Ｏｌａｎｙｉ
等、Ｇｅｎｅ１０：２１９ 〜２２５（１９８０）
：Ｂ ｃ ｎ Ｉ ：Ｊａｎｕｌａｉｔｉｓ等、Ｇｅｎ
ｅ２０ ：１９７ 〜２０４（１９８２） ： Ｂ ｓ
ｕＲ Ｉ ： ＫｉｓｓとＢａｌｄａｕｆ，Ｇｅｎｅ
２１： １１１〜１１９（１９８３） ：並びにＭ
ｓｐｌ ：ｌ４ａｌｄｅｒ等、Ｊ．Ｂｉｏ１．Ｃｈｅｌ
．２５８：１２３Ｓ 〜１２４Ｈ１９８３）］ 。
用される方法は、活性メチラーゼ遺伝子を選択すること
を含む［例えば、ＥＰＯ特許第 １９３，４１３号（１
９８６年 ９月 ３宕チ９、及びＢＳｔｌＲＩＫｉｓｓ
等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１３：６４０
３ 〜６４２１（１９８５）参照］。制限及び修飾遺伝
子は近接して結合する傾向があるため、両遺伝子を含有
するクローンは、正に一方の遺伝子について選択するこ
とによりしばしば単離され得る。メチル化活性について
の選択により、常に完全な制限一修飾系が得られるわけ
ではないけれども、その代わりに時々、メチラーゼ遺伝
子のみが得られる［ＢｓｐＲｌ：ＳＺＯ＠Ｏｌａｎｙｉ
等、Ｇｅｎｅ１０：２１９ 〜２２５（１９８０）
：Ｂ ｃ ｎ Ｉ ：Ｊａｎｕｌａｉｔｉｓ等、Ｇｅｎ
ｅ２０ ：１９７ 〜２０４（１９８２） ： Ｂ ｓ
ｕＲ Ｉ ： ＫｉｓｓとＢａｌｄａｕｆ，Ｇｅｎｅ
２１： １１１〜１１９（１９８３） ：並びにＭ
ｓｐｌ ：ｌ４ａｌｄｅｒ等、Ｊ．Ｂｉｏ１．Ｃｈｅｌ
．２５８：１２３Ｓ 〜１２４Ｈ１９８３）］ 。
制限一修ａｉｉ伝子のクローニングに対して考えられる
障害は、前もって修飾によって防御されていない宿主に
エンドヌクレアーゼ遺伝子を導入しようとする際に生じ
る。メチラーゼ遺伝子とエンドヌクレアーゼ遺伝子が単
一クローンとして一緒に導入される場合には、エンドヌ
クレアーゼが宿主ＤＮＡを開裂する機会を有する前に、
メチラーゼは宿主ＤＮＡを保護的に修飾しなければなら
ない。したがって、時として、それら遺伝子を引き続い
て、即ち先ずメラーゼ遺伝子、次いでエンドヌクレアー
ゼ遺伝子をクローン化することが唯一可能であるかもし
れない。制限一修飾系のクローニングに対する別の障害
は、Ｅ ｃｏｌｉのいくつかの株がシトシン又はアデ
ニン修飾に対して逆反応するという発見にある；それら
の株はメチル化シトシン［ Ｒａｌｅｉｇｈ とーｉ
Ｉｓｏｎ， ＰｒＯＣ．Ｎａｔｌ．＾ｃａｄ．Ｓｃｉ．
，ＵＳＡ ８３ ： ９０７０〜９０７４（１９８６）
］ 、又はメチル化アデニン［ ＨｅｉｔｌａｎとＮｏ
ｄｅｌ，Ｊ．Ｂａｃｔ．，１９６：３２４３〜３２５０
，＋１９８７） ］を含有するＤＮＡを破壊する系を有
する。シトシン特異性又はアデニン特異性メチラーゼ遺
伝子は、単独であっても、あるいはそれらに対応するエ
ンドヌクレアーゼ遺伝子と一緒であっても、これらの株
中で容易にクローン化できない。この問題を回避するた
めには、これらの系を欠＜Ｅ．ｃｏｌｉの突然変異株（
Ｈｃｒ＾一及びＨｃｒＢ ”又はＨｒｒ−）を用いる必
要がある。
障害は、前もって修飾によって防御されていない宿主に
エンドヌクレアーゼ遺伝子を導入しようとする際に生じ
る。メチラーゼ遺伝子とエンドヌクレアーゼ遺伝子が単
一クローンとして一緒に導入される場合には、エンドヌ
クレアーゼが宿主ＤＮＡを開裂する機会を有する前に、
メチラーゼは宿主ＤＮＡを保護的に修飾しなければなら
ない。したがって、時として、それら遺伝子を引き続い
て、即ち先ずメラーゼ遺伝子、次いでエンドヌクレアー
ゼ遺伝子をクローン化することが唯一可能であるかもし
れない。制限一修飾系のクローニングに対する別の障害
は、Ｅ ｃｏｌｉのいくつかの株がシトシン又はアデ
ニン修飾に対して逆反応するという発見にある；それら
の株はメチル化シトシン［ Ｒａｌｅｉｇｈ とーｉ
Ｉｓｏｎ， ＰｒＯＣ．Ｎａｔｌ．＾ｃａｄ．Ｓｃｉ．
，ＵＳＡ ８３ ： ９０７０〜９０７４（１９８６）
］ 、又はメチル化アデニン［ ＨｅｉｔｌａｎとＮｏ
ｄｅｌ，Ｊ．Ｂａｃｔ．，１９６：３２４３〜３２５０
，＋１９８７） ］を含有するＤＮＡを破壊する系を有
する。シトシン特異性又はアデニン特異性メチラーゼ遺
伝子は、単独であっても、あるいはそれらに対応するエ
ンドヌクレアーゼ遺伝子と一緒であっても、これらの株
中で容易にクローン化できない。この問題を回避するた
めには、これらの系を欠＜Ｅ．ｃｏｌｉの突然変異株（
Ｈｃｒ＾一及びＨｃｒＢ ”又はＨｒｒ−）を用いる必
要がある。
精製制限エンドヌクレアーゼ、及びその程度は低いが修
飾メチラーゼは、実験室でＤＮＡを特性づけ且つ再配列
するための有用な道具であるため、組換えＤＮＡ技術に
より、これらの酵素を大量に合成するＩＩＩ菌株を得る
ことは商業的に利益となる。
飾メチラーゼは、実験室でＤＮＡを特性づけ且つ再配列
するための有用な道具であるため、組換えＤＮＡ技術に
より、これらの酵素を大量に合成するＩＩＩ菌株を得る
ことは商業的に利益となる。
このような菌株は、精製の仕事を簡単にし、同時に商業
的に有省輸で生産する手段を提供するので、有用である
。
的に有省輸で生産する手段を提供するので、有用である
。
発明の要約
本発明は、ＨａｅＩｌｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎ
ｚａｅ （ＮＥＢ株１１２６，寄託番号第５３８７６号
として＾ＴＣＣｋ：寄託されている）由来の旧ｎｃＩ［
制限エンドヌクレアーゼ遺伝子及び修飾メチラーゼ遺伝
子を含有するクローンを提供し、且つそれらの酵素の製
造方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、ＤＮＡ配
列ＧＴＰｙ’ ＰｕＡＣを認識し、且つ矢印で最初の
５’ Ｐｙ．！：Ｐｕの間に示されているように開裂す
る酵素である制限エンドヌクレアーゼ旧ｎｃＩＩを発現
するクＯ−ンに関する。これについては以下を参照され
たい： Ｌａｎｄｙ， Ｒｕｅｓｄ ｉｓｕｅ ｌ ｉ
， Ｒｏｂ ｉｎｓｏｎ及びＲＯＳＳ，ＢｉＯＣｈｅ
ｆｌｉＳｔｒｙ， １３：２１３４ 〜２１４２（１９
７４） ：Ｋｅ１１Ｖ とＳｎｉｔｈ，Ｊ．Ｎｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．，５１： ３９３ 〜４０９（１９７０）
； ＲＯＶとＳｌｉｔｈ，Ｊ．Ｈｏｌ．Ｂｉｏｌ。，８
１ ：４２７〜４４４ｆｌ９７３） ： Ｒｏｗ とＳ
ｎｉｔｈ，Ｊ．Ｈｏｌ．Ｂｉｏｌ．８１ ：４４５〜４
５９（１９７３） ： ＳｌｉｔｈとＷｉ１ｃｏｘ，Ｊ
．Ｈｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５１：３７９〜３９ｍ９７０）
。これらの記載内容は参照により水明ＳＳ中に含めるも
のとする。
ｚａｅ （ＮＥＢ株１１２６，寄託番号第５３８７６号
として＾ＴＣＣｋ：寄託されている）由来の旧ｎｃＩ［
制限エンドヌクレアーゼ遺伝子及び修飾メチラーゼ遺伝
子を含有するクローンを提供し、且つそれらの酵素の製
造方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、ＤＮＡ配
列ＧＴＰｙ’ ＰｕＡＣを認識し、且つ矢印で最初の
５’ Ｐｙ．！：Ｐｕの間に示されているように開裂す
る酵素である制限エンドヌクレアーゼ旧ｎｃＩＩを発現
するクＯ−ンに関する。これについては以下を参照され
たい： Ｌａｎｄｙ， Ｒｕｅｓｄ ｉｓｕｅ ｌ ｉ
， Ｒｏｂ ｉｎｓｏｎ及びＲＯＳＳ，ＢｉＯＣｈｅ
ｆｌｉＳｔｒｙ， １３：２１３４ 〜２１４２（１９
７４） ：Ｋｅ１１Ｖ とＳｎｉｔｈ，Ｊ．Ｎｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．，５１： ３９３ 〜４０９（１９７０）
； ＲＯＶとＳｌｉｔｈ，Ｊ．Ｈｏｌ．Ｂｉｏｌ。，８
１ ：４２７〜４４４ｆｌ９７３） ： Ｒｏｗ とＳ
ｎｉｔｈ，Ｊ．Ｈｏｌ．Ｂｉｏｌ．８１ ：４４５〜４
５９（１９７３） ： ＳｌｉｔｈとＷｉ１ｃｏｘ，Ｊ
．Ｈｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５１：３７９〜３９ｍ９７０）
。これらの記載内容は参照により水明ＳＳ中に含めるも
のとする。
この酵素をクローニングするための好ましい方法は、Ｈ
ａｅｎｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｒｃか
ら得たＤＮＡを含有するライブラリーを形戊し、Ｈｉｎ
ｃｌ修篩メチラーゼに関してコードするＤＮＡを含有す
るクローンを単離し、ＨｉｎｃＩＩ制限エンドヌクレア
ーゼ遺伝子をも含有するクローンを同定するためにこれ
らの間でスクリーニングすることより或る。
ａｅｎｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｒｃか
ら得たＤＮＡを含有するライブラリーを形戊し、Ｈｉｎ
ｃｌ修篩メチラーゼに関してコードするＤＮＡを含有す
るクローンを単離し、ＨｉｎｃＩＩ制限エンドヌクレア
ーゼ遺伝子をも含有するクローンを同定するためにこれ
らの間でスクリーニングすることより或る。
色艶聖盈１
本発明は、Ｈｉｎｃ［制限及び修飾遺伝子をクローニン
グし、それによって生じるクローンから制限エンドヌク
レアーゼ旧ｎｃＩＩを￥ｉ造するための方法を提供する
。このアプローチは、エンドヌクレアーゼ選択を用いる
ことにより、発現されるｌＩｉｎｃＩＩ制限及びメラチ
ーゼ遺伝子を含有するということに基づいてクローンが
選択されたという事実を利用する。このようなクローン
は、ＨｉｎｃＩｌ制限エンドヌクレアーゼによるｉｎ
ｖｉｔｒｏ消化に耐性である。
グし、それによって生じるクローンから制限エンドヌク
レアーゼ旧ｎｃＩＩを￥ｉ造するための方法を提供する
。このアプローチは、エンドヌクレアーゼ選択を用いる
ことにより、発現されるｌＩｉｎｃＩＩ制限及びメラチ
ーゼ遺伝子を含有するということに基づいてクローンが
選択されたという事実を利用する。このようなクローン
は、ＨｉｎｃＩｌ制限エンドヌクレアーゼによるｉｎ
ｖｉｔｒｏ消化に耐性である。
本発明はさらに、ＨｉｎｄＩＩ修篩及び制限還伝子をク
ローニングし、それによって生じるクローンから旧ｎｄ
ｌＩ制限エンドヌクレアーゼを製造する方法に関する。
ローニングし、それによって生じるクローンから旧ｎｄ
ｌＩ制限エンドヌクレアーゼを製造する方法に関する。
Ｈｉｎｃｎ制限遺伝子及びメチラーゼ遺伝子が好適にク
ローン化され、発現される本明細潅記載の方法は、以下
の段階を包含する： （１） ｌｌａｅｌｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎ
ｚａｅ Ｒｃ株又はＨａｅ１ｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌ
ｕｅｎｚａｅ Ｒｄ株のゲノムＤＮＡを精製する。
ローン化され、発現される本明細潅記載の方法は、以下
の段階を包含する： （１） ｌｌａｅｌｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎ
ｚａｅ Ｒｃ株又はＨａｅ１ｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌ
ｕｅｎｚａｅ Ｒｄ株のゲノムＤＮＡを精製する。
（２）ゲノムＤＮＡをＢＱＩ ＩＩ制限エンドヌクレア
ーゼのような制限エンドヌクレアーゼを用いて十分に消
化する。
ーゼのような制限エンドヌクレアーゼを用いて十分に消
化する。
（３）その結果得られたＢ（１１ ＩＩ断片を、ＤＢ
Ｉ Ｉ０ １ （ＡＴＣＣ ６７９０１）のようなク
ローニングベクターの８（＋１１１クローニング部位、
又はｐＵｃ１９（ＡＴＣＣ ３７２５４）もしくはＩ）
ＢＲ３２２ （＾ＴＣＣ ３７０１７）もしくはｐＡ
Ｃ Ｙ Ｃ １７７（＾ＴＣＣ ３７０３１）のＢａ
ｎ口■部位に連結し、その混合物を用いてＥｃｏｌｉＲ
Ｒ１細胞のｌｒｒ一株のような適切な宿主細胞を形質転
換する。
Ｉ Ｉ０ １ （ＡＴＣＣ ６７９０１）のようなク
ローニングベクターの８（＋１１１クローニング部位、
又はｐＵｃ１９（ＡＴＣＣ ３７２５４）もしくはＩ）
ＢＲ３２２ （＾ＴＣＣ ３７０１７）もしくはｐＡ
Ｃ Ｙ Ｃ １７７（＾ＴＣＣ ３７０３１）のＢａ
ｎ口■部位に連結し、その混合物を用いてＥｃｏｌｉＲ
Ｒ１細胞のｌｒｒ一株のような適切な宿主細胞を形質転
換する。
（４）形質転換混合物を、抗生物質アンビシリン、テト
ラサイクリン、又はクロラムフェニコールのような、形
質転換ａ胞を選択する培地上にプレーティングする。イ
ンキユベーシコンした後、形質転換コロニーを＝緒に集
めて単一培養物とし、即ち、細胞ライブラリーを形成す
る。
ラサイクリン、又はクロラムフェニコールのような、形
質転換ａ胞を選択する培地上にプレーティングする。イ
ンキユベーシコンした後、形質転換コロニーを＝緒に集
めて単一培養物とし、即ち、細胞ライブラリーを形成す
る。
（５）組換えプラスミドを細胞ライブラリから全部精製
して、ブラスミドライブラリーを作る。
して、ブラスミドライブラリーを作る。
（６）上記一ａｔｓｏｎ等が記載したと同様の方法によ
り１１ａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ
Ｒｃから調製したｆｌｉｎｅｌＩ制限エンドヌクレアー
ゼを用いてプラスミドライブラリーを完結するまで消化
する。Ｈｉｎｃｎ消化は非修飾、メチラーゼ非含有クロ
ーンを特異的に破壊し、ＨｉｎｃＩＩメチラーゼクロー
ンの相対的＠度を増大させる。
り１１ａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ
Ｒｃから調製したｆｌｉｎｅｌＩ制限エンドヌクレアー
ゼを用いてプラスミドライブラリーを完結するまで消化
する。Ｈｉｎｃｎ消化は非修飾、メチラーゼ非含有クロ
ーンを特異的に破壊し、ＨｉｎｃＩＩメチラーゼクロー
ンの相対的＠度を増大させる。
（７）選択されたＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ Ｒ Ｒ １
（１）ヨうな適切な宿主に形質転換し戻一し、選択培地
上にブレーティングすることにより形質転換体を取り出
すす。コロニーを取り上げ、ＨｉｎｃＩ［修ｆｓＭ伝子
の存在に関してそれらのＤＮＡを分析する：コロニーが
保有するプラスミドを精製し、ＨｉｎｃＩＩエンドヌク
レアーゼと共にインキユベートしてプラスミドが消化に
耐性であるか否かを調べる。全細胞ＤＮＡ（染色体及び
プラスミドのＤＮＡ）も精製し、ＨｉｎｃＩＩ制限エン
ドヌクレアーゼと共にインキユベートする。ＨｉｎｃＩ
Ｉ修飾遺伝子を保有するクローンのＤＮＡは十分に修飾
されねばならず、さらにブラスミドＤＮＡと全てのＤＮ
Ａはともに実質的に消化に耐性であるべきである。
（１）ヨうな適切な宿主に形質転換し戻一し、選択培地
上にブレーティングすることにより形質転換体を取り出
すす。コロニーを取り上げ、ＨｉｎｃＩ［修ｆｓＭ伝子
の存在に関してそれらのＤＮＡを分析する：コロニーが
保有するプラスミドを精製し、ＨｉｎｃＩＩエンドヌク
レアーゼと共にインキユベートしてプラスミドが消化に
耐性であるか否かを調べる。全細胞ＤＮＡ（染色体及び
プラスミドのＤＮＡ）も精製し、ＨｉｎｃＩＩ制限エン
ドヌクレアーゼと共にインキユベートする。ＨｉｎｃＩ
Ｉ修飾遺伝子を保有するクローンのＤＮＡは十分に修飾
されねばならず、さらにブラスミドＤＮＡと全てのＤＮ
Ａはともに実質的に消化に耐性であるべきである。
（８） Ｈｉｎｃｎ制限及びｖｉｆｌＩＩｉ３ｌｌ伝子
を保有するＨａｅｉｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚ
ａｅ Ｒｃ ［１胞から旧ｎｃｌｌ制限エンドヌクレア
ーゼを産生させる。この細胞を、アンビシリンを含有す
る富裕培地中に入れ、発醇槽内で増殖させる。
を保有するＨａｅｉｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚ
ａｅ Ｒｃ ［１胞から旧ｎｃｌｌ制限エンドヌクレア
ーゼを産生させる。この細胞を、アンビシリンを含有す
る富裕培地中に入れ、発醇槽内で増殖させる。
（９）遠心分離して細胞を採集する。
（１０）Ｉｔ胞を超音波処理により破砕して、Ｈｉｎｃ
ＩＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を含有する粗細胞抽出
物を得る。
ＩＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を含有する粗細胞抽出
物を得る。
［１１）ＨｉｎｃＩｌ制限エンドヌクレアーゼ活性を含
有する粗細胞抽出物を標準イオン交換及びアフィニティ
ーク口マトグラフィ技術により精製する。
有する粗細胞抽出物を標準イオン交換及びアフィニティ
ーク口マトグラフィ技術により精製する。
（１２）そのようにして精製したエンドヌクレアーゼは
ＳＤＳボリアクリルアミドゲル電気泳動上では均質で、
分子１２７，０００ダルトン、ラムダＤＮＡで力価測定
した場合、約２５０，０００単位／蛋白質１Ｉ＃ｇの比
活性を有している。
ＳＤＳボリアクリルアミドゲル電気泳動上では均質で、
分子１２７，０００ダルトン、ラムダＤＮＡで力価測定
した場合、約２５０，０００単位／蛋白質１Ｉ＃ｇの比
活性を有している。
（１３）そのエンドヌクレアーゼのアミノ末端配列を得
て、その倶白賀配列に基づいてＤＮＡオリゴブローブを
作製する。
て、その倶白賀配列に基づいてＤＮＡオリゴブローブを
作製する。
（１４）メチラーゼ並びにＨａｅｎｏｐｈｉｌｕｓ ｉ
ｎｆｌｕｅｎｚａｅＲｃ及びＨａｅｎｏｐｈｉｌｕｓ
ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｒｄゲノムに対するエンドヌク
レアーゼの位置をマップ化する。
ｎｆｌｕｅｎｚａｅＲｃ及びＨａｅｎｏｐｈｉｌｕｓ
ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｒｄゲノムに対するエンドヌク
レアーゼの位置をマップ化する。
（１５）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ
ｅ ＲｃゲノムＤＮＡを、Ｂｉｎｄｕ［制限エンドヌク
レアーゼのような制限エンドヌクレアーゼを用いて十分
に消化する。Ｈａｅｌ０１）ｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅ
ｎｚａｅ ＲｄグノムＤＮＡは、Ｈｉｎｄｌｌｌ１飾及
び制限遺伝子を含むことが公知の断片を生成するＣｌａ
Ｉ又はＥｃｏＲＩのような制限エンドヌクレアーゼを
用いて十分に消化され得る。
ｅ ＲｃゲノムＤＮＡを、Ｂｉｎｄｕ［制限エンドヌク
レアーゼのような制限エンドヌクレアーゼを用いて十分
に消化する。Ｈａｅｌ０１）ｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅ
ｎｚａｅ ＲｄグノムＤＮＡは、Ｈｉｎｄｌｌｌ１飾及
び制限遺伝子を含むことが公知の断片を生成するＣｌａ
Ｉ又はＥｃｏＲＩのような制限エンドヌクレアーゼを
用いて十分に消化され得る。
（１６）その結果得られた旧ｎｄＩＩ断片を、ｏＢＩｆ
Ｈ１．２のようなクローニングベクターのＨｉｎｄｌｌ
ｌクローニング部位、又はｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、
もしくはｐＡＣＹＣ １７７のＨｉｎｄｌｌ１部位に
連結し、その混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉ Ｒ Ｒ １
細胞のような適切な宿主細胞を形質転換する。
Ｈ１．２のようなクローニングベクターのＨｉｎｄｌｌ
ｌクローニング部位、又はｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、
もしくはｐＡＣＹＣ １７７のＨｉｎｄｌｌ１部位に
連結し、その混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉ Ｒ Ｒ １
細胞のような適切な宿主細胞を形質転換する。
（１７）形質転換混合物を、抗生物質アンピシリン、ス
トレプトマイシン、又はクロラムフエニコールのような
、形質転換細胞を選択する培地上にブレーティングする
。インキュベーション後、形質転換コロニーを一緒に集
めて単一培養物とし、細胞ライブラリーを形或する。
トレプトマイシン、又はクロラムフエニコールのような
、形質転換細胞を選択する培地上にブレーティングする
。インキュベーション後、形質転換コロニーを一緒に集
めて単一培養物とし、細胞ライブラリーを形或する。
（１８）組み換えブラスミドを細胞ライブラリーから全
部そっくり精製し、ブラスミドライブラリーを作る。
部そっくり精製し、ブラスミドライブラリーを作る。
（１９）ブラスミドライブラリーを、上記一ａｔｓｏｎ
等が記載したと同様の方法によりｌｌａｅＩｏｐｈｉ
ｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｒｃから調製した旧ｎｃ
ｌｌ制限エンドヌクレアーゼを用いて完結するまで消化
する。旧ｎｃ■消化は未修篩、メチラーゼ非含有クロー
ンを特異的に破壊し、ＨｉｎｃＩ［メチラーゼクローン
の相対的頻度を増大させる。
等が記載したと同様の方法によりｌｌａｅＩｏｐｈｉ
ｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｒｃから調製した旧ｎｃ
ｌｌ制限エンドヌクレアーゼを用いて完結するまで消化
する。旧ｎｃ■消化は未修篩、メチラーゼ非含有クロー
ンを特異的に破壊し、ＨｉｎｃＩ［メチラーゼクローン
の相対的頻度を増大させる。
（２０）選択されたＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ Ｒ Ｒ １
のような適切な宿主に形質転換し戻し、選択培地上にブ
レーティングすることにより形質転換体を取り出す。
のような適切な宿主に形質転換し戻し、選択培地上にブ
レーティングすることにより形質転換体を取り出す。
コロニーを摘み取り、ＨｉｎｃｌＩ修８ｌ！ｉ遺伝子の
存在に関してそれらのＤＮＡを分析する：コ〇二−が保
有するブラスミドを精製し、ＨｉｎｃｌＩ制限エンドヌ
クレアーゼを用いてインキユベートして、プラス４ドが
消化に耐性であるか否かを調べる。全細胞ＤＮＡ （染
色体及びブラスミドのＤＮＡ）も精製し、ＨｉｎｃＩＩ
制限エンドヌクレアーゼを用いてインキユベートする。
存在に関してそれらのＤＮＡを分析する：コ〇二−が保
有するブラスミドを精製し、ＨｉｎｃｌＩ制限エンドヌ
クレアーゼを用いてインキユベートして、プラス４ドが
消化に耐性であるか否かを調べる。全細胞ＤＮＡ （染
色体及びブラスミドのＤＮＡ）も精製し、ＨｉｎｃＩＩ
制限エンドヌクレアーゼを用いてインキユベートする。
ＨｉｎｃＩ［修飾遺伝子を保有するクローンのＤＮＡは
十分に修飾されねばならないし、さらにブラスミドＤＮ
Ａ及び全てのＤＮＡはともに実賞的に消化に耐性でなけ
ればならない。
十分に修飾されねばならないし、さらにブラスミドＤＮ
Ａ及び全てのＤＮＡはともに実賞的に消化に耐性でなけ
ればならない。
（２１）ＨｉｎｃｌＩ制限エンドヌクレアーゼを保有す
るクローンを、ＨｉｎｃＩ［メチラーゼｉｆｆｔａ子を
保有することが確定されたクローンの粗抽出物を調製し
、ＨｉｎｃＩＩ制限エンドヌクレアーゼ活性に関して粗
抽出物をアッセイすることにより、同定する。粗細胞抽
出物の中の旧ｎｃＩＩ活性レベルは、クローンＤ（１）
Ｂ Ｉ Ｉ Ｈ Ｉ ． ２ ） ＨｉｎｃＩＩ ＲＭ
−８．０−Ａ Ｉの細胞１ｇ当たり約１，０００単位で
あると確定される。
るクローンを、ＨｉｎｃＩ［メチラーゼｉｆｆｔａ子を
保有することが確定されたクローンの粗抽出物を調製し
、ＨｉｎｃＩＩ制限エンドヌクレアーゼ活性に関して粗
抽出物をアッセイすることにより、同定する。粗細胞抽
出物の中の旧ｎｃＩＩ活性レベルは、クローンＤ（１）
Ｂ Ｉ Ｉ Ｈ Ｉ ． ２ ） ＨｉｎｃＩＩ ＲＭ
−８．０−Ａ Ｉの細胞１ｇ当たり約１，０００単位で
あると確定される。
（２２）メチラーゼ及びエンドヌクレアーゼ遺伝子を含
有する旧ｎｄｌ［［ｌ！ｌｉ片を旧ｎｄ［［開裂及び脱
リン酸化１）ＵＣ１９中にサブクローニングした。
有する旧ｎｄｌ［［ｌ！ｌｉ片を旧ｎｄ［［開裂及び脱
リン酸化１）ＵＣ１９中にサブクローニングした。
（２３）Ｈ ｉｎｃ ＩＩ制限エンドヌクレアーゼ活性
に関して陽性である組み換えブラスミドｐ（ｐＵ Ｃ
１９）旧ｎｃ ＩＩ Ｒ Ｍ −５． ７−４及びｐ（
ｐＵ Ｃ １９） ＨｉｒｉｃＩＩ Ｒ Ｍ−５． ７
−１０を含有するクローンは、ｐＵｃ１９のＨｉｎｄ■
クローニング部位に挿入される単一の３． ＯｋｂＨｉ
ｎｄｌｎ Ｄ Ｎ Ａ断片を含有する。
に関して陽性である組み換えブラスミドｐ（ｐＵ Ｃ
１９）旧ｎｃ ＩＩ Ｒ Ｍ −５． ７−４及びｐ（
ｐＵ Ｃ １９） ＨｉｒｉｃＩＩ Ｒ Ｍ−５． ７
−１０を含有するクローンは、ｐＵｃ１９のＨｉｎｄ■
クローニング部位に挿入される単一の３． ＯｋｂＨｉ
ｎｄｌｎ Ｄ Ｎ Ａ断片を含有する。
（２４）種々の制限エンドヌクレアーゼに対する多数の
制限エンドヌクレアーゼ部位をこのブラスミド上でマッ
プ化したが、それを第３図に示す。遺伝子の位置は、欠
失サブクローニング（ｄｅｌｅｔ１ｏｎｓｕｂｃｌｏｎ
ｉｎｑ）と、ブＯ−ブとしてＤＮＡオリゴマーを用いる
Ｓｏｕｔｈｅｒｎハイブリダイゼーションによるマッピ
ングとにより決定した。
制限エンドヌクレアーゼ部位をこのブラスミド上でマッ
プ化したが、それを第３図に示す。遺伝子の位置は、欠
失サブクローニング（ｄｅｌｅｔ１ｏｎｓｕｂｃｌｏｎ
ｉｎｑ）と、ブＯ−ブとしてＤＮＡオリゴマーを用いる
Ｓｏｕｔｈｅｒｎハイブリダイゼーションによるマッピ
ングとにより決定した。
（２５）Ｈｉｎａｌｌ制限エンドヌクレアーゼをブラス
ミドｐ（ｐｔＪ Ｃ１９） ＨｉｎｃＩＩ ＲＭ−５．
７−１０上に旧ｎｃＩＩ制限及び修ａＭ伝子を保有する
細胞から産生させる。
ミドｐ（ｐｔＪ Ｃ１９） ＨｉｎｃＩＩ ＲＭ−５．
７−１０上に旧ｎｃＩＩ制限及び修ａＭ伝子を保有する
細胞から産生させる。
そのａ胞を発醇槽内で、アンビシリンを含む富裕培地中
で増殖させる。
で増殖させる。
（２６）遠心分離して細胞を採集する。
（２７）超音波処理によりｌＩＩ］胞を破砕させて、ｔ
ｌｉｎｃｌＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を含有する粗
細胞抽出物を得る。
ｌｉｎｃｌＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を含有する粗
細胞抽出物を得る。
（２８）ＨｉｎＣＩＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を含
有する粗ＩＩＩｗ＆抽出物を標準イオン交換及びアフイ
ニティーク口マトグラフィ技術により精製する。
有する粗ＩＩＩｗ＆抽出物を標準イオン交換及びアフイ
ニティーク口マトグラフィ技術により精製する。
（２９）そのようにして精製したエンドヌクレアーゼは
、ＳＯＳボリアクリルアミド電気泳動上では均質であっ
て、分子量は２７，０００ダルトン、ラムダＤＮＡで力
価測定すると蛋白質１ｑ当たり約２５０，０００単位の
比活性を示すことが判明している．概要を記した上記の
段階は本発明を実行するための好ましい態様を示してい
るけれども、上記アプローチが当業界に公知の技術に従
って可変可能であることは当業者には明らかであろう。
、ＳＯＳボリアクリルアミド電気泳動上では均質であっ
て、分子量は２７，０００ダルトン、ラムダＤＮＡで力
価測定すると蛋白質１ｑ当たり約２５０，０００単位の
比活性を示すことが判明している．概要を記した上記の
段階は本発明を実行するための好ましい態様を示してい
るけれども、上記アプローチが当業界に公知の技術に従
って可変可能であることは当業者には明らかであろう。
以下の実施例を、現在実行するに好ましい本発明の実施
態様を説明するために示す。本実施例は説明のためのも
のであり、本発明は、添付の請求の範囲に示されている
場合を除いて、これらの実施例に限定されるものではな
いと理解されたい。
態様を説明するために示す。本実施例は説明のためのも
のであり、本発明は、添付の請求の範囲に示されている
場合を除いて、これらの実施例に限定されるものではな
いと理解されたい。
実施例
旧ｎｋＩＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクロー二＞
ｆ （１）ゲノムＤＮＡｆｉ製：約５９のＨｅａｌＯｌ）ｈ
ｉｌＬＩｓｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｒｃ細胞を解凍し、Ｃ
ｏｒｎｉｒ＋ｏプラスチッ’）チュ−７ （５０ｄ）
ニ入れた０．ＩＨ Ｔｒｙｓ −口Ｃｊ ， ｐＨ７．
１ ， ０．Ｉ ＭＥＤＴＡ （２５ｄ）に再懸濁した
。上記Ｉａ衝液３５−にリゾチーム６０ｍ３を溶解した
溶液を２本の５０−プラスチックチューブに分け、等１
（１５ｍ）のＩｌｌＩ胞懸濁液を各々に加えた。
ｆ （１）ゲノムＤＮＡｆｉ製：約５９のＨｅａｌＯｌ）ｈ
ｉｌＬＩｓｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｒｃ細胞を解凍し、Ｃ
ｏｒｎｉｒ＋ｏプラスチッ’）チュ−７ （５０ｄ）
ニ入れた０．ＩＨ Ｔｒｙｓ −口Ｃｊ ， ｐＨ７．
１ ， ０．Ｉ ＭＥＤＴＡ （２５ｄ）に再懸濁した
。上記Ｉａ衝液３５−にリゾチーム６０ｍ３を溶解した
溶液を２本の５０−プラスチックチューブに分け、等１
（１５ｍ）のＩｌｌＩ胞懸濁液を各々に加えた。
その溶液を３７℃で１５分間インキユベートした。２０
％保存溶液からＳＤＳを加えて、ＳＤＳの最終濃度を１
％に調整した。プＯテイナーゼＫ（２０＃ＩＳＦ／一で
保存）２００μ』を加え、３７℃で１時間インキユベー
トした。溶液は、この時点では粘賀性で且つ拡散性であ
るように見えたが、透明ではなかつた。チューブ（各１
−）に１０％ＳＯＳ／８％サルコシル２ｒｌ１を加え、
５５℃で２時間加熱した。サンプルは依然として粘質で
あったが、全体的に透明テハなかった。サンプルをＴ
Ｅ （ １０ｌＨ Ｔｒｉｓ − ＨＣｌ ， ｐＨ７
。１ ．１ｎＭＥＤＴＡ）（２ｊ）に対して、１回のＴ
Ｅ交換を含めて計１６時間透析した。透析後、等量のＴ
Ｅ （ ｐＨ８．０）で希釈してＣｓＣｊ勾配液用に
溶液（９８−）を調製し、これを２つに分け、各々にＣ
ｓ Ｃｌ ９８．０９と５ ｍｓ ／ ｒｄ臭化エチ
ジウム１ｒｄを添加した。２０本のチューブを、Ｔ ｉ
７０口ーター中で４４， ＯＯＯｒｌ）ＴＩで４８時
間回転させた。バンドを取り出し、水飽和イソプタノー
ルで抽出した。
％保存溶液からＳＤＳを加えて、ＳＤＳの最終濃度を１
％に調整した。プＯテイナーゼＫ（２０＃ＩＳＦ／一で
保存）２００μ』を加え、３７℃で１時間インキユベー
トした。溶液は、この時点では粘賀性で且つ拡散性であ
るように見えたが、透明ではなかつた。チューブ（各１
−）に１０％ＳＯＳ／８％サルコシル２ｒｌ１を加え、
５５℃で２時間加熱した。サンプルは依然として粘質で
あったが、全体的に透明テハなかった。サンプルをＴ
Ｅ （ １０ｌＨ Ｔｒｉｓ − ＨＣｌ ， ｐＨ７
。１ ．１ｎＭＥＤＴＡ）（２ｊ）に対して、１回のＴ
Ｅ交換を含めて計１６時間透析した。透析後、等量のＴ
Ｅ （ ｐＨ８．０）で希釈してＣｓＣｊ勾配液用に
溶液（９８−）を調製し、これを２つに分け、各々にＣ
ｓ Ｃｌ ９８．０９と５ ｍｓ ／ ｒｄ臭化エチ
ジウム１ｒｄを添加した。２０本のチューブを、Ｔ ｉ
７０口ーター中で４４， ＯＯＯｒｌ）ＴＩで４８時
間回転させた。バンドを取り出し、水飽和イソプタノー
ルで抽出した。
その溶液を前記と同じ！ｌ衝液（４ｊ）に対して透析し
、次いでフェノール及びクロロホルムで抽出したく各１
回）。この溶液を再度透析してフェノールを除去し、次
いで電気泳動にかけた。
、次いでフェノール及びクロロホルムで抽出したく各１
回）。この溶液を再度透析してフェノールを除去し、次
いで電気泳動にかけた。
（２）限定消化：精製ＤＮＡを８ｇｌＩＩで切断して、
以下のような全体的消化を達成した。： １０１１８Ｔ
ｒｉｓ ｐＨ？．５， １０ｍＨＭ ｇＣＪ ， １
００ｎＨ Ｎ ａ Ｃｊ ，２ １０ｎＨメルカプトエタノール緩衝液に １◇０μ９／
ｒｄで溶解したＤＮＡ３００μ（を３本のチューブに分
配した。そのチューブに５０単位のＢａｌＩＩを加えた
。
以下のような全体的消化を達成した。： １０１１８Ｔ
ｒｉｓ ｐＨ？．５， １０ｍＨＭ ｇＣＪ ， １
００ｎＨ Ｎ ａ Ｃｊ ，２ １０ｎＨメルカプトエタノール緩衝液に １◇０μ９／
ｒｄで溶解したＤＮＡ３００μ（を３本のチューブに分
配した。そのチューブに５０単位のＢａｌＩＩを加えた
。
そのチューブを３７℃で１時間インキユベートし、次い
でフェノール／クロロホルムで抽出して、エタノール沈
澱した。ペレットを１０１Ｍトリス塩酸，１１１８ＥＤ
ＴＡ，ｐＨ８．０． ３００μｐ中に再溶解し、各１
０μ１をアガロースゲル電気泳動で分析した。
でフェノール／クロロホルムで抽出して、エタノール沈
澱した。ペレットを１０１Ｍトリス塩酸，１１１８ＥＤ
ＴＡ，ｐＨ８．０． ３００μｐ中に再溶解し、各１
０μ１をアガロースゲル電気泳動で分析した。
（３）連結：ｌ！ｌｉ片化したＤＮＡを以下のようにｏ
Ｂ Ｉ １０ １ （ＥｃｏＲ １部位にＢｇｌＩ！リ
ンカーを挿入したｐＢＲ ３２２）に連結した：１０．
Ｏμ９の８（１１１１消化Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉ
ｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｒｃ ＤＮＡ｛１００μ１〉を
２．０μ９の８９１■開裂及び脱リン酸化１）Ｂ Ｉ
Ｉ Ｏ Ｉ （２０．０μ』〉と混合して、エタノール
沈澱した。ＤＮＡを１２，０００ｇで、４℃で１５分間
遠心分離し、７０％エタノール１００ｕｊで１回洗浄し
た。そのＤＮＡを９９μ１の１×連結ＭｋＶＩＪ液（５
０ｌＨ Ｔｒｉｓ ， ｐＨ７．５ ， １０１Ｈ
Ｍ ａ ＣＪＩ ２，１０ｎＨ ＤＴＴ． ０．５ｌ
Ｈ ＡＴＰ）に再懸濁し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１μ１を
加えて、その混合液を１６℃で１６時間インキユベート
した。２．５及び５．０μ』のアリコートを用いて、以
下のようにＥ．ｃｏｌｉ Ｒ Ｒ １株を形質転換した
：各アリコートを２００μ１の氷冷コンビテントＥ，ｃ
ｏｌｉ Ｒ Ｒ １細胞と混合し、３０分間氷上に放置
した。４２℃で２分間ヒートショック後、細胞を１−の
Ｌｔｌｒｌａブロス（Ｌ−ブロス）で希釈して、３７℃
で１時間増殖させた。
Ｂ Ｉ １０ １ （ＥｃｏＲ １部位にＢｇｌＩ！リ
ンカーを挿入したｐＢＲ ３２２）に連結した：１０．
Ｏμ９の８（１１１１消化Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉ
ｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｒｃ ＤＮＡ｛１００μ１〉を
２．０μ９の８９１■開裂及び脱リン酸化１）Ｂ Ｉ
Ｉ Ｏ Ｉ （２０．０μ』〉と混合して、エタノール
沈澱した。ＤＮＡを１２，０００ｇで、４℃で１５分間
遠心分離し、７０％エタノール１００ｕｊで１回洗浄し
た。そのＤＮＡを９９μ１の１×連結ＭｋＶＩＪ液（５
０ｌＨ Ｔｒｉｓ ， ｐＨ７．５ ， １０１Ｈ
Ｍ ａ ＣＪＩ ２，１０ｎＨ ＤＴＴ． ０．５ｌ
Ｈ ＡＴＰ）に再懸濁し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１μ１を
加えて、その混合液を１６℃で１６時間インキユベート
した。２．５及び５．０μ』のアリコートを用いて、以
下のようにＥ．ｃｏｌｉ Ｒ Ｒ １株を形質転換した
：各アリコートを２００μ１の氷冷コンビテントＥ，ｃ
ｏｌｉ Ｒ Ｒ １細胞と混合し、３０分間氷上に放置
した。４２℃で２分間ヒートショック後、細胞を１−の
Ｌｔｌｒｌａブロス（Ｌ−ブロス）で希釈して、３７℃
で１時間増殖させた。
（４）一次細胞ライブラリー：形質転換細胞培１！物を
遠心分離し、２５０μ』容量に再懸濁して、１００μｇ
／−アンピシリンを含有するＬｕｒｉａ−寒天（し−寒
天）平板上にブレーテイングした。３７℃で一晩インキ
ユベーションした後、平板を取り出して約５０００コロ
ニーを抗生物質を含むし８２５一中に掻き出した。プラ
スミドＤＮＡを以下と同様にしてこれらのＳ胞から調製
した：細胞を遠心分離によりペレット化し、３ｇのＩＩ
ｌｌ胞ペーストを２５ｎＨトリス塩酸、１０渇ＨＥＤＴ
Ａ，ｔ）Ｈ８．０及び５０ｉＨグルコースより成る１４
一液に再懸濁した。その懸濁液にリゾチーム４．Ｏ ｒ
Ｆｊ／一を溶解して、２５℃で５分間インキコベートし
た。１％ドデシル１Ｍナトリウム及び０．２ＮＮ ａ
Ｏ口のアリコート２７−を加え、その後その溶液を混合
して、Ｏ℃で５分間インキユベートした。水冷３Ｍ酢酸
カリウム（ｐＨ４．８ ）２０ｄを加えてグノムＤＮＡ
を沈澱させ、１０秒間静かに撹拌し、５分間氷上に放置
して、１２，０００ｘ ｇで１０分間遠心分離した。上
澄を取り出して、等容量のフェノール／クロロホルムＮ
：１）で抽出した。１０，ＯＯＯｘ ｇで５分間遠心分
離して各層に分離した。上層を取り出して等容量のクロ
ロホルムで抽出した。１０，０００ｇで５分間遠心分離
して層に分けた。上層を取り出して、２容積のエタノー
ルを加えて核酸を沈澱した。１２，０００ｘ ｇで２０
分間遠心分離して沈澱物を採集した。そのベレットを７
０％エタノールで１回洗浄し、前記と同様に再ベレッ１
・化した。そのベレットを真空乾燥して、８ｒｄの１０
＋１Ｈ トリス塩酸，１ｎＨ ＥＤＴＡ．ｐｈｓ．ｏ
液中に再懸濁した。８．９ｇの塩化セシウムを加え、０
．９艷の臭化エチジウム｛５■／一｝溶液を加えて、塩
化セシウムー臭化エチジウム平衡密度遠心分離用にＤＮ
Ａ溶液を調製した。そのＤＮＡ溶液を４４， ＯＯＯｒ
ｐｌで４８時間遠心分離し、その結果生じたＤＮＡのプ
ラスミドバンドを１８ｇ針付注射器で取り出した。臭化
エチジウムは、等容量のＣｓＣｊ一水飽和イソプＯパノ
ールを用いて抽出することにより除去した。
遠心分離し、２５０μ』容量に再懸濁して、１００μｇ
／−アンピシリンを含有するＬｕｒｉａ−寒天（し−寒
天）平板上にブレーテイングした。３７℃で一晩インキ
ユベーションした後、平板を取り出して約５０００コロ
ニーを抗生物質を含むし８２５一中に掻き出した。プラ
スミドＤＮＡを以下と同様にしてこれらのＳ胞から調製
した：細胞を遠心分離によりペレット化し、３ｇのＩＩ
ｌｌ胞ペーストを２５ｎＨトリス塩酸、１０渇ＨＥＤＴ
Ａ，ｔ）Ｈ８．０及び５０ｉＨグルコースより成る１４
一液に再懸濁した。その懸濁液にリゾチーム４．Ｏ ｒ
Ｆｊ／一を溶解して、２５℃で５分間インキコベートし
た。１％ドデシル１Ｍナトリウム及び０．２ＮＮ ａ
Ｏ口のアリコート２７−を加え、その後その溶液を混合
して、Ｏ℃で５分間インキユベートした。水冷３Ｍ酢酸
カリウム（ｐＨ４．８ ）２０ｄを加えてグノムＤＮＡ
を沈澱させ、１０秒間静かに撹拌し、５分間氷上に放置
して、１２，０００ｘ ｇで１０分間遠心分離した。上
澄を取り出して、等容量のフェノール／クロロホルムＮ
：１）で抽出した。１０，ＯＯＯｘ ｇで５分間遠心分
離して各層に分離した。上層を取り出して等容量のクロ
ロホルムで抽出した。１０，０００ｇで５分間遠心分離
して層に分けた。上層を取り出して、２容積のエタノー
ルを加えて核酸を沈澱した。１２，０００ｘ ｇで２０
分間遠心分離して沈澱物を採集した。そのベレットを７
０％エタノールで１回洗浄し、前記と同様に再ベレッ１
・化した。そのベレットを真空乾燥して、８ｒｄの１０
＋１Ｈ トリス塩酸，１ｎＨ ＥＤＴＡ．ｐｈｓ．ｏ
液中に再懸濁した。８．９ｇの塩化セシウムを加え、０
．９艷の臭化エチジウム｛５■／一｝溶液を加えて、塩
化セシウムー臭化エチジウム平衡密度遠心分離用にＤＮ
Ａ溶液を調製した。そのＤＮＡ溶液を４４， ＯＯＯｒ
ｐｌで４８時間遠心分離し、その結果生じたＤＮＡのプ
ラスミドバンドを１８ｇ針付注射器で取り出した。臭化
エチジウムは、等容量のＣｓＣｊ一水飽和イソプＯパノ
ールを用いて抽出することにより除去した。
ＤＮＡは等容量のフェノール／クロロホルム（１：１＞
を用いて抽出し、エタノール沈澱した。
を用いて抽出し、エタノール沈澱した。
その結果得られたＤＮＡベレットを１０１Ｈトリス塩酸
、１ ｉＨＥ Ｄ Ｔ Ａ ． ｐＨ８．０の液１０ｄ
に再懸濁した。
、１ ｉＨＥ Ｄ Ｔ Ａ ． ｐＨ８．０の液１０ｄ
に再懸濁した。
（５）一次選択及び選択されたライブラリー：２μｇ（
３０．０μｊ）のブラスミドライブラリーを６０μ』の
制限エンドヌクレアーゼ消化緩衝液（ １０ｎＨＴｒｉ
ｓ ｐＨ７．５ ． １０ｎＨ ＭＱＣ．Ｑ ，
１０１Ｍメルカブ２ トエタノール，１００ｌＨ Ｎ ａ Ｃｊ及び１００
μ９のウシ血清アルブミン）中に希釈した。１００単位
（３μＪ）の旧ｎｋＩ［制限エンドヌクレアーゼを加え
、チューブを３７℃で２時間インキユベートし、その時
点で７Ｕ（１μＪ！）の仔ウシ腸ホスフ７ターゼを加え
て、その反応液をさらに３０分間インキュベートした。
３０．０μｊ）のブラスミドライブラリーを６０μ』の
制限エンドヌクレアーゼ消化緩衝液（ １０ｎＨＴｒｉ
ｓ ｐＨ７．５ ． １０ｎＨ ＭＱＣ．Ｑ ，
１０１Ｍメルカブ２ トエタノール，１００ｌＨ Ｎ ａ Ｃｊ及び１００
μ９のウシ血清アルブミン）中に希釈した。１００単位
（３μＪ）の旧ｎｋＩ［制限エンドヌクレアーゼを加え
、チューブを３７℃で２時間インキユベートし、その時
点で７Ｕ（１μＪ！）の仔ウシ腸ホスフ７ターゼを加え
て、その反応液をさらに３０分間インキュベートした。
この反応混合液のアリコート２μ１及び４μ１を氷冷コ
ンピテントＥ．ｃｏｌｉ Ｒ Ｒ １ ｍ胞と混合し、
形質転換して、平板培地上に置き、次ライブラリーの場
合と同様に一晩増殖した。
ンピテントＥ．ｃｏｌｉ Ｒ Ｒ １ ｍ胞と混合し、
形質転換して、平板培地上に置き、次ライブラリーの場
合と同様に一晩増殖した。
（６） Ｉ！Ｉ々の分析：上記形質転換により得られた
コロニーを取り上げて、アンビシリン及びテトラサイク
リンを含むＬＢ寒天平板上に置いた。ａｌｐ’及びｔｅ
ｔＲであった１８個のコロニーを１０ｒＲ１培ＩＩ物中
で増殖させ、それらが保有するブラスミドを、Ｂ；ｒｎ
ｂｏｉｎとＤｏｌｙ （Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．７：１５１３（１９７９） ）の方法から採用
した以下に示すミニプリーブ（１ｎｉＤｒｅｌ））精製
法により調製した。
コロニーを取り上げて、アンビシリン及びテトラサイク
リンを含むＬＢ寒天平板上に置いた。ａｌｐ’及びｔｅ
ｔＲであった１８個のコロニーを１０ｒＲ１培ＩＩ物中
で増殖させ、それらが保有するブラスミドを、Ｂ；ｒｎ
ｂｏｉｎとＤｏｌｙ （Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．７：１５１３（１９７９） ）の方法から採用
した以下に示すミニプリーブ（１ｎｉＤｒｅｌ））精製
法により調製した。
ミニプリーブ法：各培養物を以下の通りに処理した：１
．５−の一晩培養した培養物を６，ＯＯＯｘ ｇで５分
間ベレット化した。その上清をデカントして除き、細胞
ペレットをＩ Ｑ／ａ！のリゾチームを含有する２５Ｉ
Ｈ Ｔｒｉｓ，１◇ｌＨ ＥＤＴＡ， ５ＧｌＩＮグ
ルコース， ｐＨ８．０の１５０μ』液中に再懸濁した
。室温で５分後、０．２Ｈ Ｎ ａ Ｏ口，１％ＳＤ
Ｓを２００μ』加え、そのチューブを振冶して細胞を溶
解し、次いで氷上に放置した。５分後、３Ｍ酢酸ナトリ
ウム， ｐＨ４．８を１５０μ』加え、振盪して、さら
に５分間氷上に放置した。生じた沈澱物を１２，ＯＯＯ
Ｘ９で４℃で１０分間遠心した。その上清を取り出して
、等容量のフェノール／クロロホルム（１：１）で抽出
した。１０，ＯＯＯＸ ９で５分間遠心分離することに
より各層に分離した。その上清を８８０μ１のエタノー
ルを含有する遠心チューブ中に注ぎ入れ、混合した。室
温で１０分後、その遠心チューブを１２，０００ｘ ｇ
で１０分間回転し、沈澱した核酸をペレット化した。そ
の上清を捨て、ベレットを１−の７０％エタノールー水
で再び洗浄して再ペレット化し、室温で３０分間真空乾
燥した。一旦乾燥させた後、ベレットを、２０ｕ ９
／ｒｄのＲ Ｎ ａｓｅを含む５０μ１溶液（１０ｎＮ
Ｔｒｉｓ．１＋ｌＨ ＥＤＴＡ， ｐｔ＋ａ．ｏ
）中に再懸濁し、３７℃で１時間インキユベートして、
ＲＮＡを消化した。
．５−の一晩培養した培養物を６，ＯＯＯｘ ｇで５分
間ベレット化した。その上清をデカントして除き、細胞
ペレットをＩ Ｑ／ａ！のリゾチームを含有する２５Ｉ
Ｈ Ｔｒｉｓ，１◇ｌＨ ＥＤＴＡ， ５ＧｌＩＮグ
ルコース， ｐＨ８．０の１５０μ』液中に再懸濁した
。室温で５分後、０．２Ｈ Ｎ ａ Ｏ口，１％ＳＤ
Ｓを２００μ』加え、そのチューブを振冶して細胞を溶
解し、次いで氷上に放置した。５分後、３Ｍ酢酸ナトリ
ウム， ｐＨ４．８を１５０μ』加え、振盪して、さら
に５分間氷上に放置した。生じた沈澱物を１２，ＯＯＯ
Ｘ９で４℃で１０分間遠心した。その上清を取り出して
、等容量のフェノール／クロロホルム（１：１）で抽出
した。１０，ＯＯＯＸ ９で５分間遠心分離することに
より各層に分離した。その上清を８８０μ１のエタノー
ルを含有する遠心チューブ中に注ぎ入れ、混合した。室
温で１０分後、その遠心チューブを１２，０００ｘ ｇ
で１０分間回転し、沈澱した核酸をペレット化した。そ
の上清を捨て、ベレットを１−の７０％エタノールー水
で再び洗浄して再ペレット化し、室温で３０分間真空乾
燥した。一旦乾燥させた後、ベレットを、２０ｕ ９
／ｒｄのＲ Ｎ ａｓｅを含む５０μ１溶液（１０ｎＮ
Ｔｒｉｓ．１＋ｌＨ ＥＤＴＡ， ｐｔ＋ａ．ｏ
）中に再懸濁し、３７℃で１時間インキユベートして、
ＲＮＡを消化した。
引き続いて、ＨｉｎｃＩＩ及びＢｏｌＩＩを用いて消化
することにより、プラスミドミニブリープを分析した。
することにより、プラスミドミニブリープを分析した。
（７）メチラーゼ遺伝子クローン：分析したプラスミド
の１０％は、ＨｉｎｃｌＩに耐性であり、また約６．２
ｋｂの長さのＢｏｌＩＩ断片を保有することが判明した
。その後、これらのブラスミドは、ＨｉｎｃＩＩｔｌ篩
メチラーゼ遺伝子のみを保有し、制限エンドヌクレアー
ゼ遺伝子を保有しないことが示された。
の１０％は、ＨｉｎｃｌＩに耐性であり、また約６．２
ｋｂの長さのＢｏｌＩＩ断片を保有することが判明した
。その後、これらのブラスミドは、ＨｉｎｃＩＩｔｌ篩
メチラーゼ遺伝子のみを保有し、制限エンドヌクレアー
ゼ遺伝子を保有しないことが示された。
観察されたプラスミドの他の９０％はＨｉｎｃｎに耐性
でなく、擬似断片を含有していたか、あるいは再連結さ
れたベクターであった。
でなく、擬似断片を含有していたか、あるいは再連結さ
れたベクターであった。
（８）制限遺伝子クローン：旧ｎｃｎ修篩メチラーゼ遺
伝子を保有するものとして上記（セクション７）で同定
されたクローンを、ＨｉｎＣＩＩ制限エンドヌクレアー
ゼ遺伝子に関しても調べた。これは以下の通りに実施し
た：一晩培養したものの残留部分を用いて、エンドヌク
レアーゼ活性を調べた。これは以下の通りに実施した： エンドヌクレアーゼアツセイ： １０Ｘ制限エントヌクレアーセ！ａｖｊＪ液：１００ｌ
ＨＴｒｉｓ， ｐＨ７．５ ， １００ｎＨ Ｍ（ＪＣ
ｊ ， １００ＩＨ ２−メ２ ルカブトエタノール，ＩＭ ＮａＣｊ０以下の通りに細
胞抽出物を調製した： ４，ＯＯＯｒｐｎで５分間遠心
分離することにより、１−から１８胞をペレット化した
。上清を捨て、ベレットを１ｒｄの超音波処理用１ｉ１
ｉｌｊ液（１０１Ｈ Ｔｒｉｓ， ｐＨ７．５，ｔｏｏ
ｌＨ ＮａＣｊ ， ５ＩＩＨ ＤＴＴ， ０．１ｉ
Ｈ ＥＤＴＡ）中に再懸濁し、１０秒間ずつ２回静かに
超音波処理して、細胞を破砕した。チューブをミクロ遠
心分Ｍｉｌｌ機内で４℃で１０分間回転し、その上清を
細胞抽出物として用いた。１μ』及び５μ１の抽出物を
、１ｘ制限エンドヌクレアーゼ！ｉｉｊ液５０μ１に溶
解したラムダＤＮＡ１μ９を用いて、３７℃で１５分間
インキユベートした。試験したクＯ−ンはいずれもエン
ドヌクレアーゼ活性を示さなかった。
伝子を保有するものとして上記（セクション７）で同定
されたクローンを、ＨｉｎＣＩＩ制限エンドヌクレアー
ゼ遺伝子に関しても調べた。これは以下の通りに実施し
た：一晩培養したものの残留部分を用いて、エンドヌク
レアーゼ活性を調べた。これは以下の通りに実施した： エンドヌクレアーゼアツセイ： １０Ｘ制限エントヌクレアーセ！ａｖｊＪ液：１００ｌ
ＨＴｒｉｓ， ｐＨ７．５ ， １００ｎＨ Ｍ（ＪＣ
ｊ ， １００ＩＨ ２−メ２ ルカブトエタノール，ＩＭ ＮａＣｊ０以下の通りに細
胞抽出物を調製した： ４，ＯＯＯｒｐｎで５分間遠心
分離することにより、１−から１８胞をペレット化した
。上清を捨て、ベレットを１ｒｄの超音波処理用１ｉ１
ｉｌｊ液（１０１Ｈ Ｔｒｉｓ， ｐＨ７．５，ｔｏｏ
ｌＨ ＮａＣｊ ， ５ＩＩＨ ＤＴＴ， ０．１ｉ
Ｈ ＥＤＴＡ）中に再懸濁し、１０秒間ずつ２回静かに
超音波処理して、細胞を破砕した。チューブをミクロ遠
心分Ｍｉｌｌ機内で４℃で１０分間回転し、その上清を
細胞抽出物として用いた。１μ』及び５μ１の抽出物を
、１ｘ制限エンドヌクレアーゼ！ｉｉｊ液５０μ１に溶
解したラムダＤＮＡ１μ９を用いて、３７℃で１５分間
インキユベートした。試験したクＯ−ンはいずれもエン
ドヌクレアーゼ活性を示さなかった。
＋９）ＮＥＢｌ１２６と呼ばれる１１ａｆ３ｌ１０ｐｈ
ｉｌｕＳ ｉｎｆｌｕｅｎＺａｌ３Ｒｃから得た旧ｎｃ
ｌｌエンドヌクレアーゼを、発酵槽内で、以下の成分よ
り成るＴＲＹ−ＹＥプロス培地中、３７℃で増殖させた
： トリブトン（１０。Ｏｇ／Ｊｌ）；醇母菌抽出物（５，
Ｏｇ／Ｍ ） ：ＮａＣＪ ＜２．０ ９／ｊ ＞
：Ｋ２ＨＰＯ４（４．４ ｇ／Ｊ ） ：フトウｌｌｔ
（２．０ ｇ／１）；ウシのヘミン（１０■／ｊ）：
ＮＡＤ：ＤＰＮ （２．Ｏ ｑ／ｊ ）。遠心分離によ
り［１胞を集め、新鮮なものを使用するために細胞ペー
ストを一７０℃で保存する。
ｉｌｕＳ ｉｎｆｌｕｅｎＺａｌ３Ｒｃから得た旧ｎｃ
ｌｌエンドヌクレアーゼを、発酵槽内で、以下の成分よ
り成るＴＲＹ−ＹＥプロス培地中、３７℃で増殖させた
： トリブトン（１０。Ｏｇ／Ｊｌ）；醇母菌抽出物（５，
Ｏｇ／Ｍ ） ：ＮａＣＪ ＜２．０ ９／ｊ ＞
：Ｋ２ＨＰＯ４（４．４ ｇ／Ｊ ） ：フトウｌｌｔ
（２．０ ｇ／１）；ウシのヘミン（１０■／ｊ）：
ＮＡＤ：ＤＰＮ （２．Ｏ ｑ／ｊ ）。遠心分離によ
り［１胞を集め、新鮮なものを使用するために細胞ペー
ストを一７０℃で保存する。
（１０）その後の全段階は、４℃で実施する。
（１１）ＩＩ胞ペースト（２００９）を解凍し、細胞を
４００−の超音波処理用ａｍ液（２０ｆｆｉＨ Ｋ２
Ｐ ０４ ，ｐｔｌ７．３ ， ０．１ｍＨ Ｅ Ｄ
ＴＡ ， １０ＩＩＨ β−メルカプトエタノール
，０、１Ｈ ＮａＣ１）中に再懸濁する。
４００−の超音波処理用ａｍ液（２０ｆｆｉＨ Ｋ２
Ｐ ０４ ，ｐｔｌ７．３ ， ０．１ｍＨ Ｅ Ｄ
ＴＡ ， １０ＩＩＨ β−メルカプトエタノール
，０、１Ｈ ＮａＣ１）中に再懸濁する。
（１２）細胞を超音波処理で破砕しく２５０ワットで２
分間。氷上で５分間冷却。３回実施）、懸濁Ｉｌｌ胞１
ｄ当たり約５０ｑの可溶性蛋白質が放出された。
分間。氷上で５分間冷却。３回実施）、懸濁Ｉｌｌ胞１
ｄ当たり約５０ｑの可溶性蛋白質が放出された。
（１３）不溶性細胞破片を−２１，ＯＯＯｘ ｇで２０
分間遠心分離することにより除去する。
分間遠心分離することにより除去する。
（１４）その上消液を２０ｍＨＫ口２ Ｐ Ｏ，ｔ ．
ｐＨ６．９ ，１００ｌＨ Ｎ ａ Ｃｊ，及び１０
ｎＨ ２−メノレカプトエタノールで平衡化されたホ
スフォセルロース力ラム（５Ｘ ５（Ｊ） （Ｗｈａ
ｔｉａｎ Ｐ−Ｎ）にｉｌｌ！［１する。そのカラムを
２倍カラム容量の上記！ｌｔｉ液で洗浄する。カラムか
らの流出物を単一フラスコ中に採集する。ｔｌｉｎｅＩ
［エンドヌクレアーゼはそのカラムに保持され、０．３
Ｍ 〜０．６Ｈ Ｎ ａ ＣＪＩで溶出する。
ｐＨ６．９ ，１００ｌＨ Ｎ ａ Ｃｊ，及び１０
ｎＨ ２−メノレカプトエタノールで平衡化されたホ
スフォセルロース力ラム（５Ｘ ５（Ｊ） （Ｗｈａ
ｔｉａｎ Ｐ−Ｎ）にｉｌｌ！［１する。そのカラムを
２倍カラム容量の上記！ｌｔｉ液で洗浄する。カラムか
らの流出物を単一フラスコ中に採集する。ｔｌｉｎｅＩ
［エンドヌクレアーゼはそのカラムに保持され、０．３
Ｍ 〜０．６Ｈ Ｎ ａ ＣＪＩで溶出する。
大半の活性画分をプールし、２０ｎＨＫ２ＰＯ４，ｐＨ
７．３ ， ０．１ｍＨ Ｅ ＤＴＡ． １０僧Ｈ β
−メノレカブトエタノール，０。ＩＮ ＫＣｊに対し
て透析する。
７．３ ， ０．１ｍＨ Ｅ ＤＴＡ． １０僧Ｈ β
−メノレカブトエタノール，０。ＩＮ ＫＣｊに対し
て透析する。
｛１５）ホスフォセノレロース力ラムからのプールを、
２０ｉＨＫ２ＰＯ４， ｐＨ７．４ ， ０．１ｌＨ
Ｅ ＤＴＡ， １０ｎＨβ−メノレカプトエタノーノレ
，０．１Ｎ ＫＣＪで平衡化されたヘリバンーセファ
ロースＣＬ−６Ｂカラム（２．５ ｘ２．５ ｕ）に載
置し、２倍カラム容量の同一緩衝液で洗浄１る。０．１
Ｈ 〜１．ＯＭ（７）ＫＣｊ （ａ容量７００ｄ＞の
直線的勾配を展開し、カラムに適用する。１０−ずつの
画分を採集する。その両分を、ラムダＤＮＡに対する旧
ｎｃｌｌ制限エンドヌクレアーゼ活性の存在に関してア
ンセイする。その活性画分をプールし、１００容量の緩
衝液（１０１１８ Ｋ２ＰＯ４． ｐＨ７．３ ，
０．１信Ｈ ＥＤＴＡ，１０帥 β−メノレカブトエタ
ノーノレ， ０．１１４ ＫＣｊ ）に対して透析で
る。
２０ｉＨＫ２ＰＯ４， ｐＨ７．４ ， ０．１ｌＨ
Ｅ ＤＴＡ， １０ｎＨβ−メノレカプトエタノーノレ
，０．１Ｎ ＫＣＪで平衡化されたヘリバンーセファ
ロースＣＬ−６Ｂカラム（２．５ ｘ２．５ ｕ）に載
置し、２倍カラム容量の同一緩衝液で洗浄１る。０．１
Ｈ 〜１．ＯＭ（７）ＫＣｊ （ａ容量７００ｄ＞の
直線的勾配を展開し、カラムに適用する。１０−ずつの
画分を採集する。その両分を、ラムダＤＮＡに対する旧
ｎｃｌｌ制限エンドヌクレアーゼ活性の存在に関してア
ンセイする。その活性画分をプールし、１００容量の緩
衝液（１０１１８ Ｋ２ＰＯ４． ｐＨ７．３ ，
０．１信Ｈ ＥＤＴＡ，１０帥 β−メノレカブトエタ
ノーノレ， ０．１１４ ＫＣｊ ）に対して透析で
る。
ｔ１６）ＨｉｎｃＩ［活性の透析プール＜ ５０ｄ ）
を１−Ｍｏｎｏ Ｑ ＦＰＬＣ力ラム（ Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ ）に載置し、緩衝液Ｓ （２０ｍＨ Ｋ２
ＰＯ４ ， ｐＨ６．９ ， １０ｌＨ β一メルカ
ブトエタノーノレ， ０．０５８ ＫＣｊ ）で洗浄し
、５０ｎＨから０．１０Ｍまでの直線勾配のＫＣＪ４０
−をＳｍｌ語液中で展開し、カラムに適用ずる。１ｆｆ
ｉｌ！ずつの画分を採集し、ＨｉｎＣＩｆ制限エンドヌ
クレアーゼ活性の存在に関してアッセイする。
を１−Ｍｏｎｏ Ｑ ＦＰＬＣ力ラム（ Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ ）に載置し、緩衝液Ｓ （２０ｍＨ Ｋ２
ＰＯ４ ， ｐＨ６．９ ， １０ｌＨ β一メルカ
ブトエタノーノレ， ０．０５８ ＫＣｊ ）で洗浄し
、５０ｎＨから０．１０Ｍまでの直線勾配のＫＣＪ４０
−をＳｍｌ語液中で展開し、カラムに適用ずる。１ｆｆ
ｉｌ！ずつの画分を採集し、ＨｉｎＣＩｆ制限エンドヌ
クレアーゼ活性の存在に関してアッセイする。
（１７）大部分の旧ｎｃｌｌ活性を含有する中央画分を
１一ボリＣａｔ−Ａ ＦＰＬＣカラム（Ｐｈａｒｌａ
ｃｉａ ）に戟置し、４ｌ衝液Ｓ （２０ＩＩＭ Ｋ
２ＰＯ４，酎＋６．９ ， １０Ｉ β−メルカブトエ
タノーノレ， ０．０５８ Ｋ．Ｃｊ ）で洗浄し、５
０ｎＨから０． １０８までの直線勾配のＫＣｊ４０−
をＳａｔ液中で展開し、カラムに適用する。１−ずつの
画分を収集し、旧ｎｃｌＩ制限エンドヌクレアーゼ活性
の存在に関してアッセイする。
１一ボリＣａｔ−Ａ ＦＰＬＣカラム（Ｐｈａｒｌａ
ｃｉａ ）に戟置し、４ｌ衝液Ｓ （２０ＩＩＭ Ｋ
２ＰＯ４，酎＋６．９ ， １０Ｉ β−メルカブトエ
タノーノレ， ０．０５８ Ｋ．Ｃｊ ）で洗浄し、５
０ｎＨから０． １０８までの直線勾配のＫＣｊ４０−
をＳａｔ液中で展開し、カラムに適用する。１−ずつの
画分を収集し、旧ｎｃｌＩ制限エンドヌクレアーゼ活性
の存在に関してアッセイする。
最も活性の高い２つの画分は均質である。エンドヌクレ
アーゼは、蛋白質１ｑ当たり約２５０， ０００単位の
比活性を示し、ＳＯＳ−ポリアクリルアミドゲル上での
分子量は２７，０００ダルトンであった。
アーゼは、蛋白質１ｑ当たり約２５０， ０００単位の
比活性を示し、ＳＯＳ−ポリアクリルアミドゲル上での
分子量は２７，０００ダルトンであった。
（１８）１０μ９の均賀旧ｎ＋４エンドヌクレアーゼを
＾ｐｐｌｉｅｄ ＢｉＯＳＶＳｔｅｌＳモデル４７０Ａ
気相蛋白質シーケンサーに掛けてアミノ末端蛋白賀配列
決定を行った。最初の２４残塁を分解した。その結果得
られた配列を以下に示す。： ＸＦＩＫＰＩＸＱＤＩＮＸＸＬＩＧＱＫＶＫＸＸＫＸ
（蛋白質配列の１文字コードの説明に関しては表１を参
照のこと）。
＾ｐｐｌｉｅｄ ＢｉＯＳＶＳｔｅｌＳモデル４７０Ａ
気相蛋白質シーケンサーに掛けてアミノ末端蛋白賀配列
決定を行った。最初の２４残塁を分解した。その結果得
られた配列を以下に示す。： ＸＦＩＫＰＩＸＱＤＩＮＸＸＬＩＧＱＫＶＫＸＸＫＸ
（蛋白質配列の１文字コードの説明に関しては表１を参
照のこと）。
（１９）蛋白賀配列に基づいて、以下の配列を用いて１
４−ｎｅｒオリゴマーを作製した。；５ ’ ＡＴＨ
ＧＧＮ ＣＡＲ＾＾＾ＧＴ３’ （口＝Ａ．Ｃ，又は
Ｔ：Ｎ＝Ａ．Ｃ，Ｇ又はＴ：Ｒ＝Ａ又はＧ）。
４−ｎｅｒオリゴマーを作製した。；５ ’ ＡＴＨ
ＧＧＮ ＣＡＲ＾＾＾ＧＴ３’ （口＝Ａ．Ｃ，又は
Ｔ：Ｎ＝Ａ．Ｃ，Ｇ又はＴ：Ｒ＝Ａ又はＧ）。
これを用いて、ｐ （ ＥＬＳ Ｉ Ｉ ０ １ ）
ＨｉｎｃＭ − １０．５−１上のエンドヌクレアーゼ
のアミノ末端の位置をマッピングした。このオリゴマー
を用いて、蛋白質配列を立証するＤＮＡ配列が得られた
し、また以下の配列を用いて作製される２５−ｎｅｒオ
リゴマーに特有の配列が示された： ５ ’ ＡＴＯ ＡＧＴ ＴＴＣ ＡＴＡ ＡＡＡ
ＣＣＴ ＡＴＴ Ｔ＾ＴＣ３’この２５−ｎｅｒ
オリゴマーを用いて、エンドヌクレアーゼの方向を決定
する助けとなり、さらにエンドヌクレアーゼのアミノ末
端の位置及びｐ（ ｐＢｌ １０１）ＨｉｎｃＭ−１０
．５−１ニ存在Ｌ６エンドヌクレアーゼ遺伝子部分を明
確にするＤＮＡ配列を得た。得られたＤＮＡ配列を以下
に示ｔ：５’ ＴＡＣ ＴＣＡ ＡＡＧ ＴＡＴ ＴＴ
Ｔ ＧＧＡ ＴＡＡ ＡＴＡ ＧＴＣ ＣＴ＾■＾Ａ
ＴＴＧ ＮＮＡ ＡＴＡ ＴＴＡ＾ＴＣ ＧＧＧ ＣＡ
Ａ ＡＡ＾ＧＴＧ＾ＡＡＣＧＴ ＣＣＴ ＡＡＡ ＴＣ
Ａ ＧＧＴ ＡＣＴ ＣＴＧ ＴＣＡ ＧＧＴ ＣＡＴ
ＧＣＴＧＣＡ ＧＧＧ ＧＡＡ ＣＣＡ ＴＴＴ Ｇ
ＡＡ ＡＡＡ ＴＴＡ ＧＴＡ ＴＡＴ ＡＡＧＴＴＴ
ＴＴＧ ＡＡＡ ＧＡＡ ＡＡＣ ＣＴＧ ＴＣＡ
ＧＡＴ ＴＴＡ ＡＣＡ ＴＴＴＡＡＧ ＣＡＡ Ｔ＾
Ｔ ＧＡ＾１＾Ｔ ＣＴＴ ＡＡＴ ＧＡＴ ＴＴＡ
ＴＴＴ ＡＴＧＡＡＧ ＡＡＣ ＣＣＴ ＧＣＧ ＡＴ
＾ＡＴＴ ＧＡＧ Ｃ＾ＩＧ３′。２５−間『オリゴマ
ーを用いて、ＨａｅｌＯＩ）ｈｉｌｌＪｓｉｎｆｌｕｅ
ｎｚａｅ Ｒｃゲノムの種々の制限断片にエンドヌクレ
アーゼ遺伝子をマッピングした。ベクターＤＮＡに対し
て作製された配列特異性オリゴマー及びメチラーゼ遺伝
子内に位置することが公知の欠失クローンを用いて、メ
チラーゼ遺伝子の方向が、エンドヌクレアーゼ遺伝子の
方向が決定されだのと同じ方法で決定された。
ＨｉｎｃＭ − １０．５−１上のエンドヌクレアーゼ
のアミノ末端の位置をマッピングした。このオリゴマー
を用いて、蛋白質配列を立証するＤＮＡ配列が得られた
し、また以下の配列を用いて作製される２５−ｎｅｒオ
リゴマーに特有の配列が示された： ５ ’ ＡＴＯ ＡＧＴ ＴＴＣ ＡＴＡ ＡＡＡ
ＣＣＴ ＡＴＴ Ｔ＾ＴＣ３’この２５−ｎｅｒ
オリゴマーを用いて、エンドヌクレアーゼの方向を決定
する助けとなり、さらにエンドヌクレアーゼのアミノ末
端の位置及びｐ（ ｐＢｌ １０１）ＨｉｎｃＭ−１０
．５−１ニ存在Ｌ６エンドヌクレアーゼ遺伝子部分を明
確にするＤＮＡ配列を得た。得られたＤＮＡ配列を以下
に示ｔ：５’ ＴＡＣ ＴＣＡ ＡＡＧ ＴＡＴ ＴＴ
Ｔ ＧＧＡ ＴＡＡ ＡＴＡ ＧＴＣ ＣＴ＾■＾Ａ
ＴＴＧ ＮＮＡ ＡＴＡ ＴＴＡ＾ＴＣ ＧＧＧ ＣＡ
Ａ ＡＡ＾ＧＴＧ＾ＡＡＣＧＴ ＣＣＴ ＡＡＡ ＴＣ
Ａ ＧＧＴ ＡＣＴ ＣＴＧ ＴＣＡ ＧＧＴ ＣＡＴ
ＧＣＴＧＣＡ ＧＧＧ ＧＡＡ ＣＣＡ ＴＴＴ Ｇ
ＡＡ ＡＡＡ ＴＴＡ ＧＴＡ ＴＡＴ ＡＡＧＴＴＴ
ＴＴＧ ＡＡＡ ＧＡＡ ＡＡＣ ＣＴＧ ＴＣＡ
ＧＡＴ ＴＴＡ ＡＣＡ ＴＴＴＡＡＧ ＣＡＡ Ｔ＾
Ｔ ＧＡ＾１＾Ｔ ＣＴＴ ＡＡＴ ＧＡＴ ＴＴＡ
ＴＴＴ ＡＴＧＡＡＧ ＡＡＣ ＣＣＴ ＧＣＧ ＡＴ
＾ＡＴＴ ＧＡＧ Ｃ＾ＩＧ３′。２５−間『オリゴマ
ーを用いて、ＨａｅｌＯＩ）ｈｉｌｌＪｓｉｎｆｌｕｅ
ｎｚａｅ Ｒｃゲノムの種々の制限断片にエンドヌクレ
アーゼ遺伝子をマッピングした。ベクターＤＮＡに対し
て作製された配列特異性オリゴマー及びメチラーゼ遺伝
子内に位置することが公知の欠失クローンを用いて、メ
チラーゼ遺伝子の方向が、エンドヌクレアーゼ遺伝子の
方向が決定されだのと同じ方法で決定された。
（２０）段階（１８）で得られたデータに基づいて、精
製Ｈａｅｎｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｒ
ｃゲノムＤＮＡ （段階（１）同様に調製される）を、
以下の通りに、Ｈｉｎｄｌｌを用いて限定消化した：
１０ｍｔ４ Ｔｒｉｓ．Ｉ）Ｈ７．５，１０１１８
ＭＱＣｊ ， １００１１８ ＮａＣｊ ， １０１
１８メノレカ２ プトエタノール緩衝液中に １００μｇ／Ｉｄの濃度で
溶解したＤＮＡ？Ｗ液３００μ１を１本のチューブ中に
分配した。そのチューブに５０単位の旧ｎｄｌを加えた
。チューブを３７℃で１時間インキユベートし、次いで
フェノール／クロロホルムで抽出して、エタノールで沈
澱した。そのベレットを１０ｍｔ４トリス塩酸．１＋ｓ
Ｈ ＥＤＴＡ．ｐＨ８．０の３００μＡ液に再溶解し
、各１０μ』をアガロースゲル電気泳動で分析した。
製Ｈａｅｎｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｒ
ｃゲノムＤＮＡ （段階（１）同様に調製される）を、
以下の通りに、Ｈｉｎｄｌｌを用いて限定消化した：
１０ｍｔ４ Ｔｒｉｓ．Ｉ）Ｈ７．５，１０１１８
ＭＱＣｊ ， １００１１８ ＮａＣｊ ， １０１
１８メノレカ２ プトエタノール緩衝液中に １００μｇ／Ｉｄの濃度で
溶解したＤＮＡ？Ｗ液３００μ１を１本のチューブ中に
分配した。そのチューブに５０単位の旧ｎｄｌを加えた
。チューブを３７℃で１時間インキユベートし、次いで
フェノール／クロロホルムで抽出して、エタノールで沈
澱した。そのベレットを１０ｍｔ４トリス塩酸．１＋ｓ
Ｈ ＥＤＴＡ．ｐＨ８．０の３００μＡ液に再溶解し
、各１０μ』をアガロースゲル電気泳動で分析した。
（２１）連結：断片化したＤＮＡを以下の通りに１）Ｂ
Ｉ ＩＨ １． ２ （ＰｖｕｌＩ部位に挿入された
｝｛ ｐａ Ｉリンカーと、ＥｃｏＲ１部位に挿入され
たＢｏｌｌｌリンカーを有するｐＮ ０１５２３）に連
結した：１０．０／，！ ９の旧ｎｄｌｌ消化Ｈａｅｍ
ｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｔｕｅｎｚａｅＲｃ ＤＮＡ
（ １００μ１）をｚ．ｏμｇの旧ｎｄｌｌｌ一間裂
及び脱リン酸化ｐＢ ｉ ＩＨ Ｉ． ２ （２０μｊ
）と混合し、エタノールで沈澱した。そのＤＮＡを１２
．０００９で、４℃で１５分間遠心分離し、７０％エタ
ノール１００μ１で１回洗浄した。そのＤＮＡを１ｘ連
結ａｍ液（５０１ＩＨ Ｔｒｉｓ．ｔ）Ｈ７．５，１０
１ＭＭＱＣｊ ，１０ｎｌ４ ＤＴＴ．０．５ｎＨ
ＡＴＰ）９９２ μＪに再懸濁してＴ４ＤＮＡリガーゼ１μ１を加え、そ
の混合液を１６℃で１６時間インキュベートした。２．
５μ』及び５．０μ１のアリコー１−を用いて、以下の
通りにＥ．ｃｏｌｉ Ｒ Ｒ Ｉ株を形賀転換した：各
アリコートを２００μ１の氷冷コンビテント Ｅ．ｃｏ
ｌｉ Ｒ Ｒ １細胞と混合し、氷上に３０分間敢置し
た。４２℃での２分間ヒートショツクした後、ＩＩＩ胞
を１ｄのＬｕｒｉａプロス（しープロス〉で希釈し、３
７℃で１時間増殖した。
Ｉ ＩＨ １． ２ （ＰｖｕｌＩ部位に挿入された
｝｛ ｐａ Ｉリンカーと、ＥｃｏＲ１部位に挿入され
たＢｏｌｌｌリンカーを有するｐＮ ０１５２３）に連
結した：１０．０／，！ ９の旧ｎｄｌｌ消化Ｈａｅｍ
ｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｔｕｅｎｚａｅＲｃ ＤＮＡ
（ １００μ１）をｚ．ｏμｇの旧ｎｄｌｌｌ一間裂
及び脱リン酸化ｐＢ ｉ ＩＨ Ｉ． ２ （２０μｊ
）と混合し、エタノールで沈澱した。そのＤＮＡを１２
．０００９で、４℃で１５分間遠心分離し、７０％エタ
ノール１００μ１で１回洗浄した。そのＤＮＡを１ｘ連
結ａｍ液（５０１ＩＨ Ｔｒｉｓ．ｔ）Ｈ７．５，１０
１ＭＭＱＣｊ ，１０ｎｌ４ ＤＴＴ．０．５ｎＨ
ＡＴＰ）９９２ μＪに再懸濁してＴ４ＤＮＡリガーゼ１μ１を加え、そ
の混合液を１６℃で１６時間インキュベートした。２．
５μ』及び５．０μ１のアリコー１−を用いて、以下の
通りにＥ．ｃｏｌｉ Ｒ Ｒ Ｉ株を形賀転換した：各
アリコートを２００μ１の氷冷コンビテント Ｅ．ｃｏ
ｌｉ Ｒ Ｒ １細胞と混合し、氷上に３０分間敢置し
た。４２℃での２分間ヒートショツクした後、ＩＩＩ胞
を１ｄのＬｕｒｉａプロス（しープロス〉で希釈し、３
７℃で１時間増殖した。
（２２）一次細胞ライブラリー：段階｛４｝にさらに１
段階加えた方法で調製した：段階（１８）から得られた
データに基づいて、配列特異性２５−Ｔｉｅｒオリゴマ
ー（段１％！Ｉ（１９））を用いてライブラリーをプロ
ーブし、エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼ遺伝子を含
有すると思われる適当なサイズの旧ｎｄｌｌｌ！ｌｉ片
を探した。この断片は一次細胞ライブラリー中に存在し
た。
段階加えた方法で調製した：段階（１８）から得られた
データに基づいて、配列特異性２５−Ｔｉｅｒオリゴマ
ー（段１％！Ｉ（１９））を用いてライブラリーをプロ
ーブし、エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼ遺伝子を含
有すると思われる適当なサイズの旧ｎｄｌｌｌ！ｌｉ片
を探した。この断片は一次細胞ライブラリー中に存在し
た。
（２３）一次選択及び選択されるライブラリー：段階（
５）と同様に調製した。
５）と同様に調製した。
（２４）個々の分析：上記形質転換から得られたコロニ
ーを取り出し、アンビシリンを含むＬＢ寒天平板上と、
アンピシリン及びストレプトマイシンを含むＬＢ寒天平
板上にプレーテイングした。
ーを取り出し、アンビシリンを含むＬＢ寒天平板上と、
アンピシリン及びストレプトマイシンを含むＬＢ寒天平
板上にプレーテイングした。
ａｌＤＲ及ヒｓｔｒ．ｅｐ” ｒ−あル１８個ノコロニ
ーを１０一の培養物中で増殖し、それらが保有するプラ
スミドを、段１＠ （６）に記載のミニブリーブ精製法
によってｆｉｌｌ製した。続いてプラスミドミニブリー
ブをＨｉｎｃｎ及び旧ｎｄ■で消化して分析した。
ーを１０一の培養物中で増殖し、それらが保有するプラ
スミドを、段１＠ （６）に記載のミニブリーブ精製法
によってｆｉｌｌ製した。続いてプラスミドミニブリー
ブをＨｉｎｃｎ及び旧ｎｄ■で消化して分析した。
（２５）メチラーゼ遺伝子クローン：分析したブラスミ
ドの２７％は旧ｎｃｌＩに耐性であり、また約３． Ｏ
ｋｂの長さの旧ｎｄｌ断片を保有することが判明した。
ドの２７％は旧ｎｃｌＩに耐性であり、また約３． Ｏ
ｋｂの長さの旧ｎｄｌ断片を保有することが判明した。
これらのブラスミドは、その後、ＨｉｎｃＩＮＩｌメチ
ラーゼ遺伝子及び制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の両方
を保有することが示された。これらのブラスミドも、各
々、１つ又はそれ以上の擬似断片を保有することが判明
した。観察されたプラスミドの他の６３％は Ｈｉｎｃ
ＩＩに耐性でなく、また擬似断片を含有するかあるいは
再連結されたベクターであった。
ラーゼ遺伝子及び制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の両方
を保有することが示された。これらのブラスミドも、各
々、１つ又はそれ以上の擬似断片を保有することが判明
した。観察されたプラスミドの他の６３％は Ｈｉｎｃ
ＩＩに耐性でなく、また擬似断片を含有するかあるいは
再連結されたベクターであった。
（２６）制限遺伝子クローン：ＨｉｎＣｎ修篩メチラー
ゼ遺伝子を保有するものとして上記（階段（２４））で
同定されたクローンを、ｎｉｎｃＩＩ制限エンドヌクレ
アーゼ遺伝子に関しても調べた。これは、段階（８）に
記載の通りに実施した。調べたクＯ−ンはすべて、エン
ドヌクレアーゼ活性を有していた。
ゼ遺伝子を保有するものとして上記（階段（２４））で
同定されたクローンを、ｎｉｎｃＩＩ制限エンドヌクレ
アーゼ遺伝子に関しても調べた。これは、段階（８）に
記載の通りに実施した。調べたクＯ−ンはすべて、エン
ドヌクレアーゼ活性を有していた。
（２７）メチラーゼ陽性クローンはすべて、エンドヌク
レアーゼを含有することが判明した。これらのクローン
は、いずれかの方向に１グラムの湿潤細胞ペースト当た
り約１ ， ０００単位の旧ｎｃｌｌ制限エンドヌクレ
アーゼを合成することが判明した。
レアーゼを含有することが判明した。これらのクローン
は、いずれかの方向に１グラムの湿潤細胞ペースト当た
り約１ ， ０００単位の旧ｎｃｌｌ制限エンドヌクレ
アーゼを合成することが判明した。
（２８） ｐ（ ＤＢ Ｉ ＩＨ Ｉ． ２）Ｈｉｎｃ
ＩＩＲＭ−８．０ 一Ａ１を用いて同一遺伝子系Ｅ．ｃ
ｏｌｉ株を形質転換し、表現型ＭｃｒＡ． ＭｃｒＢま
たは−『『によって生じる（２９） ｐ（ ｐＢＩ
ＩＨ Ｉ．２）ＨｉｎｃＩＩＲＭ−８．０Ａ１から
得られる３．Ｏｋｂの旧ｎｄＩＩ［断片を、以下の方法
で、ゲルａ＠ｌ（ｇｅｌ ｐｒｅｐ） Ｌ、Ｈｉｎｄｌ
ｌｌで切断され且つ脱リン酸化されたＩ）ＵＣ１９との
連結反応に用いた：２５０ｎｇの２． ７ｋｂゲル調製
断片（２０μＮ）を１００ｎ ＳＦ （ １μＪ！
）のＨｉｎｄＤＩ一切断及び脱リン酸化ｐＵｃ１９と混
合し、エタノール沈澱した。そのＤＮＡを１２，０００
！？で、４℃で１５分間遠心分離し、７０％エタノール
１００μ１で１回洗浄した。
ＩＩＲＭ−８．０ 一Ａ１を用いて同一遺伝子系Ｅ．ｃ
ｏｌｉ株を形質転換し、表現型ＭｃｒＡ． ＭｃｒＢま
たは−『『によって生じる（２９） ｐ（ ｐＢＩ
ＩＨ Ｉ．２）ＨｉｎｃＩＩＲＭ−８．０Ａ１から
得られる３．Ｏｋｂの旧ｎｄＩＩ［断片を、以下の方法
で、ゲルａ＠ｌ（ｇｅｌ ｐｒｅｐ） Ｌ、Ｈｉｎｄｌ
ｌｌで切断され且つ脱リン酸化されたＩ）ＵＣ１９との
連結反応に用いた：２５０ｎｇの２． ７ｋｂゲル調製
断片（２０μＮ）を１００ｎ ＳＦ （ １μＪ！
）のＨｉｎｄＤＩ一切断及び脱リン酸化ｐＵｃ１９と混
合し、エタノール沈澱した。そのＤＮＡを１２，０００
！？で、４℃で１５分間遠心分離し、７０％エタノール
１００μ１で１回洗浄した。
ＤＮＡｔ１Ｘ３１結緩衝液（５０ｎＨ Ｔｒｉｓ，ｐｌ
ｌ７，５ ． １０ｉＨ ＭＱＣｊ ， １０ｍＨ
ＤＴＴ， ０．５僧Ｈ ＡＴＰ）２ １０μ１に再懸濁して、１μ』のＴ４ ＤＮＡリガー
ゼを加え、その混合液を１６℃で１６時間インキュベー
トした。５８０μ』のアリコートを用いて、以下の通り
Ｅ．ｃｏｌｔ Ｒ Ｒ ｌ株を形賀転換した：各アリコ
ートを２００μ（の氷冷コンピテントＥ．ｃｏｌｉＲＲ
１細胞と混合し、氷上に３０分間放置した。４２℃で２
分間ヒートショックした後、細胞を１ｒｄのＬｕｒｉａ
ブロス（Ｌ−プロス）で希釈し、３７℃で１時間増殖し
た。形質転換細胞培養物を遠心分離し、２５０μ１容量
に再懸濁し、１００μｇ／一のアンピシリンを含むＬｕ
ｒｉａ一寒天（Ｌ一寒天）平板上にブレーティングした
。３７℃で一晩インキユベーションした後、コロニーを
摘み取ってアンビシリンを含むＬＢ寒天上にブレーティ
ングし、３７℃で一晩インキユベートした。ａｍｐ’で
ある１８４！ｌのコロニーを１０ｄ培養物中で培養し、
それらが保有するブラスミドを、段階（６）に記載のミ
ニプリープ精製法によって調製した。引き続いて、プラ
スミドミニプリープを、Ｈｉｎｃｌｌ及び旧ｎｄｌで消
化して分析した。
ｌ７，５ ． １０ｉＨ ＭＱＣｊ ， １０ｍＨ
ＤＴＴ， ０．５僧Ｈ ＡＴＰ）２ １０μ１に再懸濁して、１μ』のＴ４ ＤＮＡリガー
ゼを加え、その混合液を１６℃で１６時間インキュベー
トした。５８０μ』のアリコートを用いて、以下の通り
Ｅ．ｃｏｌｔ Ｒ Ｒ ｌ株を形賀転換した：各アリコ
ートを２００μ（の氷冷コンピテントＥ．ｃｏｌｉＲＲ
１細胞と混合し、氷上に３０分間放置した。４２℃で２
分間ヒートショックした後、細胞を１ｒｄのＬｕｒｉａ
ブロス（Ｌ−プロス）で希釈し、３７℃で１時間増殖し
た。形質転換細胞培養物を遠心分離し、２５０μ１容量
に再懸濁し、１００μｇ／一のアンピシリンを含むＬｕ
ｒｉａ一寒天（Ｌ一寒天）平板上にブレーティングした
。３７℃で一晩インキユベーションした後、コロニーを
摘み取ってアンビシリンを含むＬＢ寒天上にブレーティ
ングし、３７℃で一晩インキユベートした。ａｍｐ’で
ある１８４！ｌのコロニーを１０ｄ培養物中で培養し、
それらが保有するブラスミドを、段階（６）に記載のミ
ニプリープ精製法によって調製した。引き続いて、プラ
スミドミニプリープを、Ｈｉｎｃｌｌ及び旧ｎｄｌで消
化して分析した。
（３０）メチラーゼ遺伝子クローン：分析したプラスミ
ドの５０％以上が旧ｎｃ［消化に耐性であり、また約３
．Ｏｋｂの長さの旧ｎｄｌ［断片を保有することが判明
した。これらのブラスミドは、その後、ＨｉｎｃＩＩ修
飾メチラーゼ遺伝子及び制限エンドヌクレアーゼ遺伝子
の両方を保有することが示された。残りのブラスミドは
、再連結されたＩ）ＵＣ１９であった。
ドの５０％以上が旧ｎｃ［消化に耐性であり、また約３
．Ｏｋｂの長さの旧ｎｄｌ［断片を保有することが判明
した。これらのブラスミドは、その後、ＨｉｎｃＩＩ修
飾メチラーゼ遺伝子及び制限エンドヌクレアーゼ遺伝子
の両方を保有することが示された。残りのブラスミドは
、再連結されたＩ）ＵＣ１９であった。
（３１）制限遺伝子クローン；ＨｉｎａｌｌｌＩ篩メチ
ラーゼ遺伝子を保有するものとして上記《段階（２８）
）で同定されたクローンは、ＨｉｎＣＩｌ制限エンド
ヌクレアーゼ遺伝子に関しても調べた。これは、段階（
８）に記載の通りに実施した。試験したクローンはすべ
て、エンドヌクレアーゼ活性を示した。
ラーゼ遺伝子を保有するものとして上記《段階（２８）
）で同定されたクローンは、ＨｉｎＣＩｌ制限エンド
ヌクレアーゼ遺伝子に関しても調べた。これは、段階（
８）に記載の通りに実施した。試験したクローンはすべ
て、エンドヌクレアーゼ活性を示した。
（３２）メチラーゼ陽性クローンはすべて、エンドヌク
レアーゼを含有することが判明した。これらのクローン
は、Ｅ） （ ｐｕ Ｃ１９） Ｈｉｎｃｌｌ ＲＭ−
５．７ −１０ （ ＮＥＢｌ５２０）では方向Ａに湿
ＷＪＩＩＩ胞ペースト１ｇ当たり約８０， ０００単位
のＨｉｎｃ［制限エンドヌクレアーゼを合成し、ｐ （
ｐｕ Ｃ１９） ＨｉｎｃＩＩ ＲＭ−５．７−４
では方向Ｂに湿潤細胞ペースト１９当たり２，０００単
位の旧ｎｃｌｌ制限エンドヌクレアーゼを含或すること
が判明した。
レアーゼを含有することが判明した。これらのクローン
は、Ｅ） （ ｐｕ Ｃ１９） Ｈｉｎｃｌｌ ＲＭ−
５．７ −１０ （ ＮＥＢｌ５２０）では方向Ａに湿
ＷＪＩＩＩ胞ペースト１ｇ当たり約８０， ０００単位
のＨｉｎｃ［制限エンドヌクレアーゼを合成し、ｐ （
ｐｕ Ｃ１９） ＨｉｎｃＩＩ ＲＭ−５．７−４
では方向Ｂに湿潤細胞ペースト１９当たり２，０００単
位の旧ｎｃｌｌ制限エンドヌクレアーゼを含或すること
が判明した。
（３３）ＨｉｎｃＩＩ制限エンドヌクレアーゼ及びメチ
ラーゼをコードする遺伝子を保有する組換えプラスミド
Ｉ）（ ＤＬＩＣ）ＨｉｎｃＩ［ＲＭ−１０−５．７
（ＮＥＢｌ５２０ ）を形質転換によりＥ．ｃｏｌｉ
Ｒ Ｒ ｌ株中に移入した。
ラーゼをコードする遺伝子を保有する組換えプラスミド
Ｉ）（ ＤＬＩＣ）ＨｉｎｃＩ［ＲＭ−１０−５．７
（ＮＥＢｌ５２０ ）を形質転換によりＥ．ｃｏｌｉ
Ｒ Ｒ ｌ株中に移入した。
段１＠ （２８）におけると同様の同一遺伝子系株を形
質転換するに際しては、Ｉ） （ ＤＵ Ｃ ） Ｈｉ
ｎｃｌｌ ＲＭ −１０−５．７ （ＮＥＢｌ５２０
）はこれらの株中に形質転換可能であったが、しかし
１０ｄ以上の液体培養物中では増殖不可能であった。
質転換するに際しては、Ｉ） （ ＤＵ Ｃ ） Ｈｉ
ｎｃｌｌ ＲＭ −１０−５．７ （ＮＥＢｌ５２０
）はこれらの株中に形質転換可能であったが、しかし
１０ｄ以上の液体培養物中では増殖不可能であった。
（３４）段階（９）〜（１６）に記載の通り（ある変更
を加えて） ， Ｈｉｎｃｌｌエンドヌクレアーゼを１
１ｆＪし、細胞を以下の成分より成るＬＢブロス培地中
で培養した：１０９／ｊのカゼイン加水分解物：５９／
ｊの酵母菌抽出物：１０ｇ／ｊのＮａＣｊ：１１？／ｊ
の塩化マグネシウム・６水和物：１ｇ／ｊのブドウ糖：
１００１１ｇ／ｊのアンビシリン。ｐｌｌはＮａＯ
口で７．２に調節する。ｍ製されたエンドヌクレアーゼ
は１ｑの蛋白質につき約２５０， ０００単位の比活性
を示すことが判明した。
を加えて） ， Ｈｉｎｃｌｌエンドヌクレアーゼを１
１ｆＪし、細胞を以下の成分より成るＬＢブロス培地中
で培養した：１０９／ｊのカゼイン加水分解物：５９／
ｊの酵母菌抽出物：１０ｇ／ｊのＮａＣｊ：１１？／ｊ
の塩化マグネシウム・６水和物：１ｇ／ｊのブドウ糖：
１００１１ｇ／ｊのアンビシリン。ｐｌｌはＮａＯ
口で７．２に調節する。ｍ製されたエンドヌクレアーゼ
は１ｑの蛋白質につき約２５０， ０００単位の比活性
を示すことが判明した。
ｍＲＮＡ （ＤＮＡ）Ｈａ＋’ｌｌ；少１１１アξノ＆
Ｌダ′１々磯ａ体＃口４を 二４へ，−７の叫目晶シＪ鵠ζ杓代ＸＵＰＡＣ−１υｅ
傅弁一ξトエＬネ■菟ギ（冫．Ａ Ｃ Ｇ Ｕ／Ｔ ＡＧＡ Ｇ Ｂ．Ｉ’）スＩｉＮ Ｚ−Ｈメ幡Ｑ ４ ．図面の簡単な説明 第１図は、Ｈｉｎｃ［制限エンドヌクレアーゼをクロー
ニングするための概要を示す。● 第２図は、ｌｌｉｎｅｎ制限エンドヌクレアーゼを製造
するための概要を示す。
Ｌダ′１々磯ａ体＃口４を 二４へ，−７の叫目晶シＪ鵠ζ杓代ＸＵＰＡＣ−１υｅ
傅弁一ξトエＬネ■菟ギ（冫．Ａ Ｃ Ｇ Ｕ／Ｔ ＡＧＡ Ｇ Ｂ．Ｉ’）スＩｉＮ Ｚ−Ｈメ幡Ｑ ４ ．図面の簡単な説明 第１図は、Ｈｉｎｃ［制限エンドヌクレアーゼをクロー
ニングするための概要を示す。● 第２図は、ｌｌｉｎｅｎ制限エンドヌクレアーゼを製造
するための概要を示す。
第３図は、ＩＩｉｎｃ［制限エンドヌクレアーゼ及び修
飾メチラーゼをコードするｌｌａｅｎｏｐｈｉ ｔｕｓ
ｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｒｃから得た３．Ｏｋｂ ｌｌｉ
ｎｄＩＩ断片の制限地図である。その断片をρＢｉｌＨ
１．２（ＡＩＣＣ ６７９０２）のｌｌｉｎｄｉｎ部位
中にクローン化して１）（Ｄｅｌｌ口１ ． ２ ）
Ｈｉｎｃｌｌ ＲＭ−８、０−Ａ１を作製し、続いてｐ
Ｕ Ｃ １９ （ ＡＴＣＣ ３７２５４ ）中にサ７
’） ローン化シテＯ （ ｐＬＪ ０１９） ｌｌ
ｉｎｃＩ［ ＲＭ５．７−４及びｐ （ ＰＵ Ｃ１９
） ｌｌｉｎｅｌｌ ＲＭ−５．７ −１０を作った。
飾メチラーゼをコードするｌｌａｅｎｏｐｈｉ ｔｕｓ
ｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｒｃから得た３．Ｏｋｂ ｌｌｉ
ｎｄＩＩ断片の制限地図である。その断片をρＢｉｌＨ
１．２（ＡＩＣＣ ６７９０２）のｌｌｉｎｄｉｎ部位
中にクローン化して１）（Ｄｅｌｌ口１ ． ２ ）
Ｈｉｎｃｌｌ ＲＭ−８、０−Ａ１を作製し、続いてｐ
Ｕ Ｃ １９ （ ＡＴＣＣ ３７２５４ ）中にサ７
’） ローン化シテＯ （ ｐＬＪ ０１９） ｌｌ
ｉｎｃＩ［ ＲＭ５．７−４及びｐ （ ＰＵ Ｃ１９
） ｌｌｉｎｅｌｌ ＲＭ−５．７ −１０を作った。
第４図は、ｐ （ ｐＵ Ｃ １９） ＩｉｉｎｃＩＩ
Ｒ Ｍ − ５．７−４及ヒＩ）（ １）ＵＣ１９
） ｌＩｉｎｃｌＩＲＭ−５．７ −１０（ＮＥＢｌ５
２０ ）を保有ずるＥ．ｃｏｌｉ Ｒ Ｒ １（ＡＴ
ＣＣ ３１３４３）の細胞抽出物中のｌＩｉｒ＋ｃ［制
限エンドヌクレアーゼ活性を立証するアガロースゲルの
１７真である。
Ｒ Ｍ − ５．７−４及ヒＩ）（ １）ＵＣ１９
） ｌＩｉｎｃｌＩＲＭ−５．７ −１０（ＮＥＢｌ５
２０ ）を保有ずるＥ．ｃｏｌｉ Ｒ Ｒ １（ＡＴ
ＣＣ ３１３４３）の細胞抽出物中のｌＩｉｒ＋ｃ［制
限エンドヌクレアーゼ活性を立証するアガロースゲルの
１７真である。
ｈａ人 ニュー゛イン７フｙ（ ノくイ１”レＡ７入
゛イ〉冫一牛０レＡテ・／ド 代理人ブｒ理士 船 山 武 口ｉｎｃ ＩＩ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｐｕｒｉ
ｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ ｆｎｔｅｒｅｓｔ ｕ帥１ ＋ ｕｌ Ｐｕｒｌｆｍ Ｈｉｎｃ ＩＩ Ｅ
ｎｄａｎｕｃｍｓｅイｒａｍ Ｈａ＊ｍｏｐｈｌｌｕ訓
ｎｆｌｕｅｎｚａｓ Ｒｃ ｃｅｌｌｓＬｉｎｅ ２
１ｕｌ ｏｌ ａ ｃｅｌｌ ｍ陽ｃｌ ｊｒｏｍεｃ
ｏｌｔ ｓｔｒａｉｎ ＲＲＩ ｃｏ＋ｎａｌｎｉｎｇ
ｐ（ｐｕｃ＋９１ＨｉｎｃｌｌＲＭ−５．７−ａＬａ
ｒｍ ３ ５ ｕｌ ｏｊ ａ Ｃ＠ＩＩ ＊ｘｔｒａ
ｃＩｆｒｏｍεｃｏｌｉ ｓ＋＋ａｉｎ ＲＲＩ ｃｏ
ｍａｌｎｉｎｇ ｐ（ｐＵ（ｊＱＩＨｉｎｃｌｌＲＭ．
５．７−ａＬａｎ＠ＩＩ １ ｕｌ ｏｌ ａ ｃｅｌ
ｌ ｓａｒａｃｔ ｆｒｏｍεｃｏｌｉ ｓｔｒａｉｎ
ＲＲＩ ｅｏｎｌａ＋ｆｉｉｎ９ ｐ（ｐυＣｊ９）
ＨｍｌｌＲＭ５．７．ＩＯＬａｒ１＠９ ５ ｕｌ ｏ
ｊ ａ ｃｅｌｌ ｅｎａｃｔ ｔｈｏｒｎ Ｅ． ｃ
ｏｌｉ ｍａｉｎ ＲＲＩ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐ
ｉｐＵｃ１９１ＨｉｎｃｌｌＲＭ−５．７・ｌＯＦｊＧ
．４ 第１頁の続き ［相］Ｉｎｔ． Ｃｌ．’ 識別記号 庁内整理番号 Ｃ １２ Ｒ １：２１） 手続？ｍ正書 特許庁長官 古 田 文 毅 殿 １．事件の表示 平成２年特許願第６５５４２号 ２．発明の名称 ＨｉｎｃｌＩＩＩ限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼ
の製造方法 ３． 補正をする者 事件との関係 特許出願人 名 称 ニュー・イングランド・バイオレイブス・インコーポレ
イテッド ５． 補正命令の日付 自 発 ８．補正の内容
゛イ〉冫一牛０レＡテ・／ド 代理人ブｒ理士 船 山 武 口ｉｎｃ ＩＩ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｐｕｒｉ
ｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ ｆｎｔｅｒｅｓｔ ｕ帥１ ＋ ｕｌ Ｐｕｒｌｆｍ Ｈｉｎｃ ＩＩ Ｅ
ｎｄａｎｕｃｍｓｅイｒａｍ Ｈａ＊ｍｏｐｈｌｌｕ訓
ｎｆｌｕｅｎｚａｓ Ｒｃ ｃｅｌｌｓＬｉｎｅ ２
１ｕｌ ｏｌ ａ ｃｅｌｌ ｍ陽ｃｌ ｊｒｏｍεｃ
ｏｌｔ ｓｔｒａｉｎ ＲＲＩ ｃｏ＋ｎａｌｎｉｎｇ
ｐ（ｐｕｃ＋９１ＨｉｎｃｌｌＲＭ−５．７−ａＬａ
ｒｍ ３ ５ ｕｌ ｏｊ ａ Ｃ＠ＩＩ ＊ｘｔｒａ
ｃＩｆｒｏｍεｃｏｌｉ ｓ＋＋ａｉｎ ＲＲＩ ｃｏ
ｍａｌｎｉｎｇ ｐ（ｐＵ（ｊＱＩＨｉｎｃｌｌＲＭ．
５．７−ａＬａｎ＠ＩＩ １ ｕｌ ｏｌ ａ ｃｅｌ
ｌ ｓａｒａｃｔ ｆｒｏｍεｃｏｌｉ ｓｔｒａｉｎ
ＲＲＩ ｅｏｎｌａ＋ｆｉｉｎ９ ｐ（ｐυＣｊ９）
ＨｍｌｌＲＭ５．７．ＩＯＬａｒ１＠９ ５ ｕｌ ｏ
ｊ ａ ｃｅｌｌ ｅｎａｃｔ ｔｈｏｒｎ Ｅ． ｃ
ｏｌｉ ｍａｉｎ ＲＲＩ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐ
ｉｐＵｃ１９１ＨｉｎｃｌｌＲＭ−５．７・ｌＯＦｊＧ
．４ 第１頁の続き ［相］Ｉｎｔ． Ｃｌ．’ 識別記号 庁内整理番号 Ｃ １２ Ｒ １：２１） 手続？ｍ正書 特許庁長官 古 田 文 毅 殿 １．事件の表示 平成２年特許願第６５５４２号 ２．発明の名称 ＨｉｎｃｌＩＩＩ限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼ
の製造方法 ３． 補正をする者 事件との関係 特許出願人 名 称 ニュー・イングランド・バイオレイブス・インコーポレ
イテッド ５． 補正命令の日付 自 発 ８．補正の内容
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）ＨｉｎｃII制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含有
するクローニングベクター。 （２）請求項１記載のクローニングベクターを含む形質
転換宿主。 （３）該ＨｉｎｃII遺伝子をＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ
ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅＲｃゲノムＤＮＡから切り出すか
、又は該ＨｉｎｄII遺伝子をＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ
ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＲｄゲノムＤＮＡから切り出す
ことを特徴とする請求項１記載のクローニングベクター
。 （４）ＨｉｎｃII修飾遺伝子を含有するクローニングベ
クター。 （５）請求項４記載のクローニングベクターを含む形質
転換宿主。 （６）ＨｉｎｃII又はＨｉｎｄII制限エンドヌクレアー
ゼ遺伝子をクローニングする方法であって： （ａ）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ
Ｒｃ又はＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚ
ａｅ Ｒｄから得たプラスミドＤＮＡからライブラリー
を形成し； （ｂ）ＨｉｎｃII又はＨｉｎｄII修飾遺伝子を含有する
クローンを単離し； （ｃ）制限エンドヌクレアーゼ蛋白質を精製して、蛋白
質配列を得； （ｄ）ＤＮＡシーケンシングを通してエンドヌクレアー
ゼの方向を決定し、メチラーゼクローン内における該エ
ンドヌクレアーゼの位置を定め、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕ
ｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｒｃ又はＨａｅｍｏｐｈｉ
ｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｒｄゲノム内におけるエ
ンドヌクレアーゼの位置を定め； （ｅ）ｂ〜ｄの段階で得られるデータに基づいてライブ
ラリーを形成し； （ｆ）ＨｉｎｃII又はＨｉｎｄII修飾及び制限遺伝子を
含有するクローンを単離する； 各段階から成る方法。 （７）該ライブラリー下記の段階： （ａ）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ
Ｒｃ又はＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚ
ａｅ ＲｄからゲノムＤＮＡを精製し； （ｂ）該精製ＤＮＡを消化してＤＮＡ断片を形成し； （ｃ）該断片をクローニングベクターに連結し；（ｄ）
段階（ｃ）のクローニングベクターを用いて宿主細胞を
形質転換して細胞ライブラリーを形成し； （ｅ）該細胞ライブラリーから組換えベクターを精製し
てプラスミドライブラリーを形成する；段階により形成
することを特徴とする請求項６記載の方法。 （８）該クローニングベクターがｐＢＩＩＨＩ．２、ｐ
ＢＩＩＯＩ、又はｐＵＣ１９であることを特徴とする請
求項７記載の方法。 （９）該宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉＭｒｒ＾−株であるこ
とを特徴とする請求項７記載の方法。 （１０）ＨｉｎｃIIでプラスミドライブラリーを消化し
て消化プールを形成し、その消化プールを宿主細胞に形
質転換し、修飾遺伝子を含むクローンを選択することに
より、ＨｉｎｃII修飾遺伝子を含有するクローンを単離
することを特徴とする請求項７記載の方法。 （１１）ＨｉｎｃII制限エンドヌクレアーゼを製造する
ための方法であって： （ａ）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ
ＲｃからＤＮＡを精製し； （ｂ）精製したＤＮＡを適切な制限エンドヌクレアーゼ
で消化してＤＮＡ断片を形成し； （ｃ）該断片をクローニングベクターに連結してＤＮＡ
混合物を形成し； （ｄ）宿主細胞を段階（ｃ）のＤＮＡ混合物で形質転換
してライブラリーを形成し； （ｅ）該ＨｉｎｃII修飾メチラーゼ遺伝子を含有するク
ローンを単離し； （ｆ）該ＨｉｎｃII修飾メチラーゼ遺伝子を含有するク
ローンをスクリーニングして、さらに該ＨｉｎｃII制限
エンドヌクレアーゼ遺伝子をも含有するクローンを単離
し； （９）段階（ｆ）のクローンを含む宿主細胞を培養し； （ｈ）該培養物からｈｉｎｃII制限エンドヌクレアーゼ
を取り出す； 各段階から成ることを特徴とする方法。 （１２）該クローニングベクターがプラスミド又はウイ
ルスＤＮＡ分子であることを特徴とする請求項１１記載
の方法。 （１３）該プラスミドがｐＢＩＩＯＩであることを特徴
とする請求項１２記載の方法。 （１４）該プラスミドがｐＵＣ１９であることを特徴と
する請求項１２記載の方法。 （１５）該プラスミドがｐＢＩＩＨ１．２であることを
特徴とする請求項１２記載の方法。 （１６）その中に以下のＤＮＡ配列：５′ＴＡＣ ＴＣ
ＡＡＡＧ ＴＡＴ ＴＴＴ ＧＧＡ ＴＡＡ ＡＴＡ
ＧＴＣ ＣＴＡ ＴＡＡ ＴＴＧ ＮＮＡＡＴＡ ＴＴ
Ａ ＡＴＣ ＧＧＧ ＣＡＡ ＡＡＡ ＧＩＧ ＡＡＡ
ＣＧＴ ＣＣＴ ＡＡＡＴＣＡ ＧＧＴ ＡＣＴ Ｃ
ＴＧ ＴＣＡ ＧＧＴ ＣＡＴ ＧＣＴ ＧＣＡ ＧＧ
Ｇ ＧＡＡＣＣＡ ＴＴＴ ＧＡＡ ＡＡＡ ＴＴＡ
ＧＴＡ ＴＡＴ ＡＡＧ ＴＴＴ ＴＴＧ ＡＡＡＧＡ
Ａ ＡＡＣ ＣＴＧ ＴＣＡ ＧＡＴ ＴＴＡ ＡＣＡ
ＴＴＴ ＡＡＧ ＣＡＡ ＴＡＴＧＡＡ ＴＡＴ Ｃ
ＴＴ ＡＡＴ ＧＡＴ ＴＴＡ ＴＴＴ ＡＴＧ ＡＡ
Ｇ ＡＡＣ ＣＣＴＧＣＧ ＡＴＡ ＡＴＴ ＧＡＧ
ＣＡＴ Ｇ３′を有するＨｉｎｃII修飾及び制限遺伝子
を含有するクローン。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/324,402 US5015581A (en) | 1989-03-15 | 1989-03-15 | Method for producing the Hinc II restriction endonuclease and methylase |
| US324,402 | 1989-03-15 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11991397A Division JP3156759B2 (ja) | 1989-03-15 | 1997-05-09 | Ｈｉｎｃ ＩＩ制限エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡセグメント |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0322978A true JPH0322978A (ja) | 1991-01-31 |
| JP2672683B2 JP2672683B2 (ja) | 1997-11-05 |
Family
ID=23263422
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2065542A Expired - Lifetime JP2672683B2 (ja) | 1989-03-15 | 1990-03-15 | Ｈｉｎｃ▲ＩＩ▼制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼの製造方法 |
| JP11991397A Expired - Lifetime JP3156759B2 (ja) | 1989-03-15 | 1997-05-09 | Ｈｉｎｃ ＩＩ制限エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡセグメント |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11991397A Expired - Lifetime JP3156759B2 (ja) | 1989-03-15 | 1997-05-09 | Ｈｉｎｃ ＩＩ制限エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡセグメント |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5015581A (ja) |
| EP (1) | EP0388212B1 (ja) |
| JP (2) | JP2672683B2 (ja) |
| CA (1) | CA2012149C (ja) |
| DE (2) | DE69023789T2 (ja) |
Families Citing this family (11)
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|---|---|---|---|---|
| US5298404A (en) * | 1989-10-13 | 1994-03-29 | New England Biolabs, Inc. | Method for producing the Hpa I restriction endonuclease and methylase |
| US5278060A (en) * | 1990-08-30 | 1994-01-11 | New England Biolabs, Inc. | Method for producing the Nla III restriction endonuclease and methylase |
| US5288696A (en) * | 1990-09-07 | 1994-02-22 | New England Biolabs, Inc. | Method for producing and cloning SacII restriction endonuclease and methylase |
| US5202248A (en) * | 1990-11-02 | 1993-04-13 | New England Biolabs, Inc. | Method for cloning and producing the nco i restriction endonuclease and methylase |
| US5192676A (en) * | 1991-02-05 | 1993-03-09 | New England Biolabs, Inc. | Type ii restriction endonuclease, asci, obtainable from arthrobacter species and a process for producing the same |
| US5200337A (en) * | 1991-10-25 | 1993-04-06 | New England Biolabs, Inc. | Type ii restriction endonuclease, apo i, obtainable from arthrobacter protophormiae and a process for producing the same |
| JP3400124B2 (ja) * | 1994-08-08 | 2003-04-28 | 株式会社日立製作所 | パストランジスタ型セレクタ回路及び論理回路 |
| US5731185A (en) * | 1995-07-21 | 1998-03-24 | New England Biolabs, Inc. | Isolated DNA encoding the hphi restriction endonuclease and related methods for producing the same |
| US5824529A (en) * | 1996-03-06 | 1998-10-20 | New England Biolabs, Inc. | Method for cloning and producing the PshAI restriction endonuclease |
| EP2565267A1 (en) | 2005-08-04 | 2013-03-06 | New England Biolabs, Inc. | Novel restriction endonucleases, DNA encoding these endonucleases and methods for identifying new endonucleases with the same or varied specificity |
| CN109880841A (zh) * | 2018-12-31 | 2019-06-14 | 吴江近岸蛋白质科技有限公司 | 一种HindIII限制性核酸内切酶的制备方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61265094A (ja) * | 1985-02-06 | 1986-11-22 | ニユ−・イングランド・バイオラブズ・インコ−ポレ−テツド | 制限および修飾遺伝子のクロ−ニング |
-
1989
- 1989-03-15 US US07/324,402 patent/US5015581A/en not_active Ceased
-
1990
- 1990-03-14 CA CA002012149A patent/CA2012149C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-15 DE DE69023789T patent/DE69023789T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-15 DE DE90302817T patent/DE388212T1/de active Pending
- 1990-03-15 JP JP2065542A patent/JP2672683B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-15 EP EP90302817A patent/EP0388212B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-01-12 US US08/003,277 patent/USRE35248E/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-05-09 JP JP11991397A patent/JP3156759B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61265094A (ja) * | 1985-02-06 | 1986-11-22 | ニユ−・イングランド・バイオラブズ・インコ−ポレ−テツド | 制限および修飾遺伝子のクロ−ニング |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0388212A1 (en) | 1990-09-19 |
| US5015581A (en) | 1991-05-14 |
| JPH1080284A (ja) | 1998-03-31 |
| JP3156759B2 (ja) | 2001-04-16 |
| DE69023789T2 (de) | 1996-08-08 |
| DE69023789D1 (de) | 1996-01-11 |
| USRE35248E (en) | 1996-05-21 |
| JP2672683B2 (ja) | 1997-11-05 |
| EP0388212B1 (en) | 1995-11-29 |
| DE388212T1 (de) | 1994-02-03 |
| CA2012149C (en) | 1999-11-16 |
| CA2012149A1 (en) | 1990-09-15 |
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