JP3195604B2 - ＳｆｉＩ制限エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼのクローニングおよび製造方法 - Google Patents
ＳｆｉＩ制限エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼのクローニングおよび製造方法Info
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- C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
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Description
【０００１】本発明は、 SfiI 制限エンドヌクレアーゼ
及び修飾メチラーゼをコードする組み換えＤＮＡと、当
該組み換えＤＮＡからこれらの酵素を製造する方法とに
関する。
及び修飾メチラーゼをコードする組み換えＤＮＡと、当
該組み換えＤＮＡからこれらの酵素を製造する方法とに
関する。
【０００２】制限エンドヌクレアーゼは天然の細菌中に
見られる酵素の一群である。制限エンドヌクレアーゼを
夾雑する他の細菌成分から精製すると、それらは実験室
でＤＮＡ分子を切断して各々相応する正確なフラグメン
トを形成するのに用いることができる。この特質の故
に、ＤＮＡ分子は１つずつ独自に同定することができ、
また分画してその構成遺伝子を単離することができる。
制限エンドヌクレアーゼは、現代の遺伝子研究にとって
不可欠の道具であることが立証されている。制限エンド
ヌクレアーゼは生化学的な「ハサミ」であり、これを用
いて遺伝子工学や遺伝子解析が実施される。
見られる酵素の一群である。制限エンドヌクレアーゼを
夾雑する他の細菌成分から精製すると、それらは実験室
でＤＮＡ分子を切断して各々相応する正確なフラグメン
トを形成するのに用いることができる。この特質の故
に、ＤＮＡ分子は１つずつ独自に同定することができ、
また分画してその構成遺伝子を単離することができる。
制限エンドヌクレアーゼは、現代の遺伝子研究にとって
不可欠の道具であることが立証されている。制限エンド
ヌクレアーゼは生化学的な「ハサミ」であり、これを用
いて遺伝子工学や遺伝子解析が実施される。
【０００３】制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子上
の特定のヌクレオチド配列（「認識配列」）を認識し、
そこに結合することによって作用する。これらの酵素は
ＤＮＡ分子に一旦結合すると、その認識配列の内部また
はその一端でＤＮＡ分子を切断する。異なる制限エンド
ヌクレアーゼは、それぞれ異なる認識配列に対して親和
性を持つ。今日まで調べられた何百種もの細菌の中か
ら、百を越える数の異なる制限エンドヌクレアーゼが同
定されている。
の特定のヌクレオチド配列（「認識配列」）を認識し、
そこに結合することによって作用する。これらの酵素は
ＤＮＡ分子に一旦結合すると、その認識配列の内部また
はその一端でＤＮＡ分子を切断する。異なる制限エンド
ヌクレアーゼは、それぞれ異なる認識配列に対して親和
性を持つ。今日まで調べられた何百種もの細菌の中か
ら、百を越える数の異なる制限エンドヌクレアーゼが同
定されている。
【０００４】細菌は、一菌種当りごく少数の制限エンド
ヌクレアーゼしか含まないことが多い。制限エンドヌク
レアーゼは、通常、それの由来となった細菌に因んで命
名される。例えば、Haemophilus aegyptius 菌種は三つ
の異なる制限エンドヌクレアーゼを合成するが、これら
は、HaeI, HaeII および HaeIII と命名されている。こ
れらの酵素は、それぞれ配列 (AT)GGCC(AT), PuGCGCPy
および GGCC を認識して切断する。一方、大腸菌 RY13
は、ただ一つの制限酵素 EcoRIを合成するだけであり、
この酵素は配列 GAATTC を認識する。
ヌクレアーゼしか含まないことが多い。制限エンドヌク
レアーゼは、通常、それの由来となった細菌に因んで命
名される。例えば、Haemophilus aegyptius 菌種は三つ
の異なる制限エンドヌクレアーゼを合成するが、これら
は、HaeI, HaeII および HaeIII と命名されている。こ
れらの酵素は、それぞれ配列 (AT)GGCC(AT), PuGCGCPy
および GGCC を認識して切断する。一方、大腸菌 RY13
は、ただ一つの制限酵素 EcoRIを合成するだけであり、
この酵素は配列 GAATTC を認識する。
【０００５】理論によって拘束されるつもりはないが、
自然界では、制限エンドヌクレアーゼは細菌細胞の増殖
において防衛的な役割を演じていると考えられる。これ
らの酵素によって、細菌は、これらの細菌を破壊したり
またはこれらに寄生したりするウィルスやプラスミドの
ような外来ＤＮＡ分子による感染を防ぐことができる。
制限エンドヌクレアーゼは、感染している外来ＤＮＡ分
子の長さを走査し、認識配列が現われる度ごとにそれら
を切断することによって、細菌に抵抗性を付与する。こ
れによって生じた破壊の結果、感染外来ＤＮＡの多くを
不能にし、さらに、このＤＮＡを非特異的エンドヌクレ
アーゼによって分解しやすくする。
自然界では、制限エンドヌクレアーゼは細菌細胞の増殖
において防衛的な役割を演じていると考えられる。これ
らの酵素によって、細菌は、これらの細菌を破壊したり
またはこれらに寄生したりするウィルスやプラスミドの
ような外来ＤＮＡ分子による感染を防ぐことができる。
制限エンドヌクレアーゼは、感染している外来ＤＮＡ分
子の長さを走査し、認識配列が現われる度ごとにそれら
を切断することによって、細菌に抵抗性を付与する。こ
れによって生じた破壊の結果、感染外来ＤＮＡの多くを
不能にし、さらに、このＤＮＡを非特異的エンドヌクレ
アーゼによって分解しやすくする。
【０００６】細菌の防衛系のもう一つの成分として、修
飾メチラーゼがある。これらの酵素は制限エンドヌクレ
アーゼと相補的であり、細菌が外来の感染性ＤＮＡから
自身のＤＮＡを防御し区別できるようにする手段を提供
する。修飾メチラーゼは、対応する制限エンドヌクレア
ーゼのものと同じヌクレオチド認識配列を認識してそれ
に結合するが、このＤＮＡを破壊する代わりに、メチル
基を付加することによってその配列内のヌクレオチドの
いずれかを化学的に修飾する。メチル化されると、認識
配列はもはや制限エンドヌクレアーゼによって結合され
ないし、また切断もされない。細菌細胞のＤＮＡはその
修飾メチラーゼの活性によって、常に完全に修飾されて
おり、従って、自身の内因性制限エンドヌクレアーゼの
存在に対して完全に非感受性となっている。制限エンド
ヌクレアーゼの認識と攻撃に対して感受性を持つもの
は、修飾されていないＤＮＡ、従って外来のものである
ことが確認できるＤＮＡのみである。この制限エンドヌ
クレアーゼと修飾メチラーゼは、一緒になって、いわゆ
る制限−修飾系（「Ｒ−Ｍ系」）を形成する。
飾メチラーゼがある。これらの酵素は制限エンドヌクレ
アーゼと相補的であり、細菌が外来の感染性ＤＮＡから
自身のＤＮＡを防御し区別できるようにする手段を提供
する。修飾メチラーゼは、対応する制限エンドヌクレア
ーゼのものと同じヌクレオチド認識配列を認識してそれ
に結合するが、このＤＮＡを破壊する代わりに、メチル
基を付加することによってその配列内のヌクレオチドの
いずれかを化学的に修飾する。メチル化されると、認識
配列はもはや制限エンドヌクレアーゼによって結合され
ないし、また切断もされない。細菌細胞のＤＮＡはその
修飾メチラーゼの活性によって、常に完全に修飾されて
おり、従って、自身の内因性制限エンドヌクレアーゼの
存在に対して完全に非感受性となっている。制限エンド
ヌクレアーゼの認識と攻撃に対して感受性を持つもの
は、修飾されていないＤＮＡ、従って外来のものである
ことが確認できるＤＮＡのみである。この制限エンドヌ
クレアーゼと修飾メチラーゼは、一緒になって、いわゆ
る制限−修飾系（「Ｒ−Ｍ系」）を形成する。
【０００７】遺伝子工学技術の出現によって、現在で
は、遺伝子をクローン化し、それらの遺伝子によってコ
ードされる蛋白質や酵素を従来の精製技術で入手可能な
量よりももっと多量に生産することが可能である。制限
エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローンを単離する際に決
定的に重要なことは、そのようなクローンの出現頻度が
１０-3〜１０-4程度に低い場合、複雑な「ライブラリ
ー」、すなわち「ショットガン」法によって得られたク
ローン集団の中で目的とするクローンを同定するための
簡単で信頼性の高い方法を開発することである。好まし
くは、その方法は選択性が高く、望まないクローンの大
多数は破壊され、好ましい希なクローンは生存させるよ
うなものであることが好ましい。
は、遺伝子をクローン化し、それらの遺伝子によってコ
ードされる蛋白質や酵素を従来の精製技術で入手可能な
量よりももっと多量に生産することが可能である。制限
エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローンを単離する際に決
定的に重要なことは、そのようなクローンの出現頻度が
１０-3〜１０-4程度に低い場合、複雑な「ライブラリ
ー」、すなわち「ショットガン」法によって得られたク
ローン集団の中で目的とするクローンを同定するための
簡単で信頼性の高い方法を開発することである。好まし
くは、その方法は選択性が高く、望まないクローンの大
多数は破壊され、好ましい希なクローンは生存させるよ
うなものであることが好ましい。
【０００８】ＩＩ型Ｒ−Ｍ系は次第に高い頻度でクロー
ン化されるようになっている。最初にクローン化された
系では、制限エンドヌクレアーゼクローンの同定または
選択の手段として、バクテリオファージ感染が用いられ
た(EcoRII:Kosykhら、Molec.gen. Genet 178: 717-719,
(1980); HhaII:Mannら、 Gene 3: 97-112,(1978);Pst
I:Walder ら、Proc. Nat. Acad. Sci. 78: 1503-1507,
(1981) ）。細菌中にＲ−Ｍ系が存在することによっ
て、細菌はバクテリオファージによる感染に対して抵抗
することができるので、クローン化されたＲ−Ｍ遺伝子
を保有する形質転換された宿主細胞は、原理的には、フ
ァージに暴露されたライブラリーからの生き残りとして
選択的に分離され得る。しかしながら、この方法は、あ
まり有効ではないことが判明した。特に、クローン化さ
れたＲ−Ｍ遺伝子は、選択的な生き残りを可能にするほ
どに十分なファージ耐性を常に示すとは限らないことが
判明した。
ン化されるようになっている。最初にクローン化された
系では、制限エンドヌクレアーゼクローンの同定または
選択の手段として、バクテリオファージ感染が用いられ
た(EcoRII:Kosykhら、Molec.gen. Genet 178: 717-719,
(1980); HhaII:Mannら、 Gene 3: 97-112,(1978);Pst
I:Walder ら、Proc. Nat. Acad. Sci. 78: 1503-1507,
(1981) ）。細菌中にＲ−Ｍ系が存在することによっ
て、細菌はバクテリオファージによる感染に対して抵抗
することができるので、クローン化されたＲ−Ｍ遺伝子
を保有する形質転換された宿主細胞は、原理的には、フ
ァージに暴露されたライブラリーからの生き残りとして
選択的に分離され得る。しかしながら、この方法は、あ
まり有効ではないことが判明した。特に、クローン化さ
れたＲ−Ｍ遺伝子は、選択的な生き残りを可能にするほ
どに十分なファージ耐性を常に示すとは限らないことが
判明した。
【０００９】もう一つのクローニング法の場合、最初プ
ラスミド由来とされていた系を E. coliのクローニング
プラスミド中に組み込む(EcoRV:Bougueleretら、Nucl.
AcidRes. 12: 3659-3676, (1984); PaeR7: Gingerasと
Brooks, Proc. Natl. Acad.Sci. USA 80: 402-406, (19
83); Theriault と Roy, Gene 19: 355-359 (1982);Pvu
II: Blumenthal ら、J. Bacteriol. 164: 501-509, (19
85)）。
ラスミド由来とされていた系を E. coliのクローニング
プラスミド中に組み込む(EcoRV:Bougueleretら、Nucl.
AcidRes. 12: 3659-3676, (1984); PaeR7: Gingerasと
Brooks, Proc. Natl. Acad.Sci. USA 80: 402-406, (19
83); Theriault と Roy, Gene 19: 355-359 (1982);Pvu
II: Blumenthal ら、J. Bacteriol. 164: 501-509, (19
85)）。
【００１０】第三の方法として多くの系のクローニング
に使用されている方法は、活性メチラーゼ遺伝子につい
て選択することによってクローン化することを含む（例
えば、１９８６年９月３日公開の EPO No. 193,413と、
BsuRI:Kissら、Nucl. Acid.Res. 13: 6403-6421, (198
5)を参照）。簡単に言うと、メチラーゼ選択は、形質転
換した宿主由来のＤＮＡを対応する制限エンドヌクレア
ーゼに暴露することによって、メチラーゼクローンにつ
いてスクリーニングすることを含む。おそらく宿主のＤ
ＮＡは修飾されており、制限エンドヌクレアーゼによる
攻撃に対して感受性を持たないために、生存物がメチラ
ーゼ遺伝子の存在を示している。制限遺伝子と修飾遺伝
子とは近接して結合していることが多いので、同時に両
方の遺伝子がクローン化されることがよくある。しかし
ながら、メチラーゼ選択は必ずしも常に完全な制限系を
生成するとは限らず、むしろメチラーゼ遺伝子しか生成
しないことがある（例えば、BspRI:Szomolanyliら、Gen
e 10: 219-225, (1980);Bcn I: Janulaitis ら、 Gene
20: 197-204 (1982); BsuRI: Kiss と Baldauf,Gene 2
1:111-119, (1983); Msp I: Walderら、J. Biol. Chem.
258: 1235-1241,(1983)を参照。また、Wilson, Gene 7
4: 281-289, (1988); Slatkoら、Gene 74:45-50, (198
8); Lunnen ら、Gene 74: 25-32, (1988); VanCott
ら、 Gene 74:55-59, (1988)を参照）。
に使用されている方法は、活性メチラーゼ遺伝子につい
て選択することによってクローン化することを含む（例
えば、１９８６年９月３日公開の EPO No. 193,413と、
BsuRI:Kissら、Nucl. Acid.Res. 13: 6403-6421, (198
5)を参照）。簡単に言うと、メチラーゼ選択は、形質転
換した宿主由来のＤＮＡを対応する制限エンドヌクレア
ーゼに暴露することによって、メチラーゼクローンにつ
いてスクリーニングすることを含む。おそらく宿主のＤ
ＮＡは修飾されており、制限エンドヌクレアーゼによる
攻撃に対して感受性を持たないために、生存物がメチラ
ーゼ遺伝子の存在を示している。制限遺伝子と修飾遺伝
子とは近接して結合していることが多いので、同時に両
方の遺伝子がクローン化されることがよくある。しかし
ながら、メチラーゼ選択は必ずしも常に完全な制限系を
生成するとは限らず、むしろメチラーゼ遺伝子しか生成
しないことがある（例えば、BspRI:Szomolanyliら、Gen
e 10: 219-225, (1980);Bcn I: Janulaitis ら、 Gene
20: 197-204 (1982); BsuRI: Kiss と Baldauf,Gene 2
1:111-119, (1983); Msp I: Walderら、J. Biol. Chem.
258: 1235-1241,(1983)を参照。また、Wilson, Gene 7
4: 281-289, (1988); Slatkoら、Gene 74:45-50, (198
8); Lunnen ら、Gene 74: 25-32, (1988); VanCott
ら、 Gene 74:55-59, (1988)を参照）。
【００１１】このようにメチラーゼ選択法においてすら
遺伝子工学が直面している上記の不備および様々な潜在
的障害に対して多数の可能な説明がされている。ある系
の場合、クローニングの問題は、まだ修飾によって保護
されていない宿主の中にエンドヌクレアーゼ遺伝子を導
入しようとする際に存するだろう。もし、メチラーゼ遺
伝子とエンドヌクレアーゼ遺伝子とが共通のＤＮＡフラ
グメント上に導入されるとするならば、メチラーゼ遺伝
子は、エンドヌクレアーゼ遺伝子が宿主のゲノムを切断
する前に、宿主を修飾ないし保護しなければならない。
遺伝子工学が直面している上記の不備および様々な潜在
的障害に対して多数の可能な説明がされている。ある系
の場合、クローニングの問題は、まだ修飾によって保護
されていない宿主の中にエンドヌクレアーゼ遺伝子を導
入しようとする際に存するだろう。もし、メチラーゼ遺
伝子とエンドヌクレアーゼ遺伝子とが共通のＤＮＡフラ
グメント上に導入されるとするならば、メチラーゼ遺伝
子は、エンドヌクレアーゼ遺伝子が宿主のゲノムを切断
する前に、宿主を修飾ないし保護しなければならない。
【００１２】このような系をE. coli 中でクローン化す
る際に見られるもう一つの障害が、各種メチラーゼをク
ローン化する過程で発見された。例えば、E. coli 株の
多くは（通常クローニングに使用されるものを含め
て）、メチル化を含むＤＮＡの導入に対して抵抗する系
を持っている。（Raleigh とWilson, Proc. Natl. Aca
d.Sci., USA 83: 9070-9074, (1986) 参照）。したがっ
て、クローニングにどのE.coli 株を使用するかについ
ては、慎重に考慮する必要がある。
る際に見られるもう一つの障害が、各種メチラーゼをク
ローン化する過程で発見された。例えば、E. coli 株の
多くは（通常クローニングに使用されるものを含め
て）、メチル化を含むＤＮＡの導入に対して抵抗する系
を持っている。（Raleigh とWilson, Proc. Natl. Aca
d.Sci., USA 83: 9070-9074, (1986) 参照）。したがっ
て、クローニングにどのE.coli 株を使用するかについ
ては、慎重に考慮する必要がある。
【００１３】高純度の制限エンドヌクレアーゼは、実験
室でＤＮＡの特性を明らかにしたり、ＤＮＡを再構成す
るのに有用な道具である。また、それほどではないけれ
ども、修飾メチラーゼも同様の目的のために役立つ。そ
のため、組み換えＤＮＡ技術によって、上記酵素を大量
に合成する細菌株を得ようとする活発な商業的な動きが
ある。もしそのような細菌株が見つかれば、それは商業
的に有用な量を生産する手段を提供するばかりでなく、
精製作業を単純化するという意味でも、有用であろう。
室でＤＮＡの特性を明らかにしたり、ＤＮＡを再構成す
るのに有用な道具である。また、それほどではないけれ
ども、修飾メチラーゼも同様の目的のために役立つ。そ
のため、組み換えＤＮＡ技術によって、上記酵素を大量
に合成する細菌株を得ようとする活発な商業的な動きが
ある。もしそのような細菌株が見つかれば、それは商業
的に有用な量を生産する手段を提供するばかりでなく、
精製作業を単純化するという意味でも、有用であろう。
【００１４】
【発明の概要】本発明により、Streptomyces fimbriatu
s (ATCC 15051)から入手可能な、SfiI制限エンドヌクレ
アーゼと修飾メチラーゼをコードする組み換えＤＮＡが
提供され、また、前記組み換えＤＮＡをクローン化する
ための関連方法が提供される。本発明はまた、前記組み
換えＤＮＡを含むベクターおよび形質転換宿主細胞、前
記 SfiI 組み換えＤＮＡから産生された組み換え SfiI
修飾制限エンドヌクレアーゼおよび組み換え SfiI 修飾
メチラーゼ、並びに前記酵素の製造方法に関する。
s (ATCC 15051)から入手可能な、SfiI制限エンドヌクレ
アーゼと修飾メチラーゼをコードする組み換えＤＮＡが
提供され、また、前記組み換えＤＮＡをクローン化する
ための関連方法が提供される。本発明はまた、前記組み
換えＤＮＡを含むベクターおよび形質転換宿主細胞、前
記 SfiI 組み換えＤＮＡから産生された組み換え SfiI
修飾制限エンドヌクレアーゼおよび組み換え SfiI 修飾
メチラーゼ、並びに前記酵素の製造方法に関する。
【００１５】SfiI 制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ
配列 5′-GGCCNNNNNGGCC-3′を認識してＮ4 とＮ5ヌク
レオチドの間で切断し、３塩基３′のオーバーハング
（overhang）を残す酵素である。Qiang, B.-Q.とSchild
kraut,I.(1984) Nucleic AcidsRes. 12, 4507-4515 を
参照されたい。その開示内容を参照として本明細書に取
り入れるものとする。
配列 5′-GGCCNNNNNGGCC-3′を認識してＮ4 とＮ5ヌク
レオチドの間で切断し、３塩基３′のオーバーハング
（overhang）を残す酵素である。Qiang, B.-Q.とSchild
kraut,I.(1984) Nucleic AcidsRes. 12, 4507-4515 を
参照されたい。その開示内容を参照として本明細書に取
り入れるものとする。
【００１６】SfiI Ｒ−Ｍ系をクローン化するのに好ま
しい方法は、ライブラリーの作製に適切なベクターを構
築すること、S. fimbriatus 由来のＤＮＡを含む多数の
ライブラリーを形成すること、 SfiI 修飾メチラーゼを
コードするＤＮＡを含むクローンを分離すること、SfiI
修飾メチラーゼ遺伝子近傍の染色体ＤＮＡを分離する
こと、および SfiI 制限エンドヌクレアーゼをコードす
るＤＮＡのために、メチラーゼ遺伝子を含むすべてのＤ
ＮＡをスクリーニングすることを含む。 SfiI 制限エン
ドヌクレアーゼに関する選択はそのエンドヌクレアーゼ
のアミノ末端をコードするＤＮＡを含むクローンをスク
リーニングすることによって実施するのが好ましい。そ
して、この選択は、好ましくは、S. fimbriatus 由来の
SfiI エンドヌクレアーゼを精製し、アミノ末端のアミ
ノ酸残基の配列を決定し、得られたアミノ酸配列に相当
するＤＮＡオリゴマーを作製し、このＤＮＡオリゴマー
とハイブリダイズするクローンをスクリーニングするこ
とによって実現される。
しい方法は、ライブラリーの作製に適切なベクターを構
築すること、S. fimbriatus 由来のＤＮＡを含む多数の
ライブラリーを形成すること、 SfiI 修飾メチラーゼを
コードするＤＮＡを含むクローンを分離すること、SfiI
修飾メチラーゼ遺伝子近傍の染色体ＤＮＡを分離する
こと、および SfiI 制限エンドヌクレアーゼをコードす
るＤＮＡのために、メチラーゼ遺伝子を含むすべてのＤ
ＮＡをスクリーニングすることを含む。 SfiI 制限エン
ドヌクレアーゼに関する選択はそのエンドヌクレアーゼ
のアミノ末端をコードするＤＮＡを含むクローンをスク
リーニングすることによって実施するのが好ましい。そ
して、この選択は、好ましくは、S. fimbriatus 由来の
SfiI エンドヌクレアーゼを精製し、アミノ末端のアミ
ノ酸残基の配列を決定し、得られたアミノ酸配列に相当
するＤＮＡオリゴマーを作製し、このＤＮＡオリゴマー
とハイブリダイズするクローンをスクリーニングするこ
とによって実現される。
【００１７】本発明に基づいて製造される SfiI メチラ
ーゼと制限エンドヌクレアーゼは、実質的に純粋であ
り、従来の方法（例えば、上記 QiangとSchildkraut 参
照）に基づいて産生された制限エンドヌクレアーゼに通
常見られる夾雑物質を含まない。
ーゼと制限エンドヌクレアーゼは、実質的に純粋であ
り、従来の方法（例えば、上記 QiangとSchildkraut 参
照）に基づいて産生された制限エンドヌクレアーゼに通
常見られる夾雑物質を含まない。
【００１８】
【発明の詳細】本発明は、８塩基ヌクレオチド配列を認
識するＲ−Ｍ系について、満足できる成果をもたらした
最初のクローニング法を提供する。従来のクローニング
系は、４塩基ないし６塩基系であった。 SfiI 制限エン
ドヌクレアーゼは特に有用な酵素である。なぜなら、 S
fiI 認識配列は、ゲノム内に比較的希にしか見られな
い、特に、ヒト染色体のようなＡＴの豊富なゲノムでは
希であるからである。特に、 SfiI 部位はヒトＤＮＡで
は200,000塩基対ごとに僅かに約１回出現すると考えら
れる。したがって、本発明に従って産生された組み換え
SfiI 制限エンドヌクレアーゼは、ヒト・ゲノムをマッ
プ化する際に特に有効であろう。
識するＲ−Ｍ系について、満足できる成果をもたらした
最初のクローニング法を提供する。従来のクローニング
系は、４塩基ないし６塩基系であった。 SfiI 制限エン
ドヌクレアーゼは特に有用な酵素である。なぜなら、 S
fiI 認識配列は、ゲノム内に比較的希にしか見られな
い、特に、ヒト染色体のようなＡＴの豊富なゲノムでは
希であるからである。特に、 SfiI 部位はヒトＤＮＡで
は200,000塩基対ごとに僅かに約１回出現すると考えら
れる。したがって、本発明に従って産生された組み換え
SfiI 制限エンドヌクレアーゼは、ヒト・ゲノムをマッ
プ化する際に特に有効であろう。
【００１９】S. fimbriatus 由来の SfiI Ｒ−Ｍ遺伝子
をE. coli 中でクローン化することは、多くの理由によ
りきわめて困難であることを立証した。これまでにクロ
ーン化された他のＲ−Ｍ系と違って、 SfiI エンドヌク
レアーゼとメチラーゼ遺伝子は、E. coli 中で十分発現
しないことが判明した。 SfiI メチラーゼ遺伝子に対す
る内因性プロモーターはE. coli の転写因子によって認
識されないと考えられている。さらに、E. coli翻訳因
子は、 SfiI Ｒ−Ｍ系と十分な相互作用を持たないよう
である。
をE. coli 中でクローン化することは、多くの理由によ
りきわめて困難であることを立証した。これまでにクロ
ーン化された他のＲ−Ｍ系と違って、 SfiI エンドヌク
レアーゼとメチラーゼ遺伝子は、E. coli 中で十分発現
しないことが判明した。 SfiI メチラーゼ遺伝子に対す
る内因性プロモーターはE. coli の転写因子によって認
識されないと考えられている。さらに、E. coli翻訳因
子は、 SfiI Ｒ−Ｍ系と十分な相互作用を持たないよう
である。
【００２０】おまけに、 SfiI Ｒ−Ｍ系をうまくクロー
ン化するには、先に引用したＥＰＯ出願公開第 193,413
号に記載されたメチラーゼ選択法の多数の修正法および
変法を必要とした。後に述べるように、メチラーゼ選択
は、次の場合を除き、メチラーゼクローンを産生するこ
とができないと結論された。その例外的な場合とは、メ
チラーゼ遺伝子の開始コドンがクローニングベクター上
のプロモーターと十分近く、かつ、それと直線的に配列
しているように、メチラーゼ遺伝子が十分小さいＤＮＡ
フラグメント上にクローン化されている場合である。こ
のような場合では、メチラーゼ遺伝子は発現され、か
つ、そのクローンはメチラーゼ選択、すなわちSfiI消化
に抵抗して生き残る能力に基づいたメチラーゼクローン
の同定、において生き残ることができる。 SfiI Ｒ−Ｍ
系のクローニングを成功裡に実現するために、合計１６
種の、異なる制限エンドヌクレアーゼを用いて５４個の
ライブラリーを作製した。ＡＴに富む配列を認識するエ
ンドヌクレアーゼ、例えば、HindIII, EcoRI, XbaIおよ
びNsiIは、 SfiI 染色体ＤＮＡの切断に対しては非効率
的であることが判明した。BclIで成功裡にクローン化し
た後で、実施例Ｉに記載した Southern ブロットデータ
から、ＡＴに富む配列を認識するエンドヌクレアーゼが
有効なクローン化を行なうのに十分な大きさのフラグメ
ントを産生することが判明した。
ン化するには、先に引用したＥＰＯ出願公開第 193,413
号に記載されたメチラーゼ選択法の多数の修正法および
変法を必要とした。後に述べるように、メチラーゼ選択
は、次の場合を除き、メチラーゼクローンを産生するこ
とができないと結論された。その例外的な場合とは、メ
チラーゼ遺伝子の開始コドンがクローニングベクター上
のプロモーターと十分近く、かつ、それと直線的に配列
しているように、メチラーゼ遺伝子が十分小さいＤＮＡ
フラグメント上にクローン化されている場合である。こ
のような場合では、メチラーゼ遺伝子は発現され、か
つ、そのクローンはメチラーゼ選択、すなわちSfiI消化
に抵抗して生き残る能力に基づいたメチラーゼクローン
の同定、において生き残ることができる。 SfiI Ｒ−Ｍ
系のクローニングを成功裡に実現するために、合計１６
種の、異なる制限エンドヌクレアーゼを用いて５４個の
ライブラリーを作製した。ＡＴに富む配列を認識するエ
ンドヌクレアーゼ、例えば、HindIII, EcoRI, XbaIおよ
びNsiIは、 SfiI 染色体ＤＮＡの切断に対しては非効率
的であることが判明した。BclIで成功裡にクローン化し
た後で、実施例Ｉに記載した Southern ブロットデータ
から、ＡＴに富む配列を認識するエンドヌクレアーゼが
有効なクローン化を行なうのに十分な大きさのフラグメ
ントを産生することが判明した。
【００２１】SfiI Ｒ−Ｍ系をクローン化するに当り、
メチラーゼ選択の初期の試みとして多くの異なる温度で
宿主細胞の形質転換を行なったが不成功であった。例え
ば、pUC19 をベースとしたライブラリーのあるものにつ
いて、３０℃での増殖を用いてみた。これは、pUC19 誘
導体はそれより高温では不安定になる傾向があるからで
ある。ある好ましい宿主、E.coli の増殖にとって最適
の温度は３７℃である。しかしながら、初期の試みは不
成功であったので、E. coli を４２℃で増殖させること
をやってみた。 SfiI 制限エンドヌクレアーゼの至適温
度は５０℃であるから、メチラーゼについても同様であ
ろうと考えられた。 SfiIＲ−Ｍ系のクローン化に成功
した後で、最初のメチラーゼクローンを４２℃で獲得す
ることができたけれども、E. coli のin vivo のメチラ
ーゼ活性の至適温度は３７℃であり、in vitroの至適温
度は４０℃であると決定された。
メチラーゼ選択の初期の試みとして多くの異なる温度で
宿主細胞の形質転換を行なったが不成功であった。例え
ば、pUC19 をベースとしたライブラリーのあるものにつ
いて、３０℃での増殖を用いてみた。これは、pUC19 誘
導体はそれより高温では不安定になる傾向があるからで
ある。ある好ましい宿主、E.coli の増殖にとって最適
の温度は３７℃である。しかしながら、初期の試みは不
成功であったので、E. coli を４２℃で増殖させること
をやってみた。 SfiI 制限エンドヌクレアーゼの至適温
度は５０℃であるから、メチラーゼについても同様であ
ろうと考えられた。 SfiIＲ−Ｍ系のクローン化に成功
した後で、最初のメチラーゼクローンを４２℃で獲得す
ることができたけれども、E. coli のin vivo のメチラ
ーゼ活性の至適温度は３７℃であり、in vitroの至適温
度は４０℃であると決定された。
【００２２】SfiI Ｒ−Ｍ系をクローン化する試みの中
で、５種の異なるベクターを構築した。具体的に述べる
と、２個のpBR322誘導体、２個の pUC19誘導体、１個の
pBR328 誘導体を構築した。 pBR328 ベクター（以下に
さらに詳しく述べる）が、唯一、活性 SfiI メチラーゼ
クローンを生成した。 pBR328 によるクローン化が成功
したのは、 pBR328 が安定なプラスミド pBR322 よりも
高いコピー数を持っていること、およびきわめて高いコ
ピー数を持つプラスミド pUC19よりも高い安定性を持つ
こと（特により高温では、すなわち約３６℃よりも高い
温度では、安定性が優れていた）によると思われる。コ
ピー数の高いプラスミドを使用すると、目的の組み換え
ＤＮＡのコピー数は増加し、従って、ＤＮＡのメチル化
を増す。しかしながら、上に述べたように、コピー数が
高ければ高いほど、pUC19 のようなベクターの不安定性
は増す。これは、高温では特にそうである。 SfiI Ｒ−
Ｍ系については、 pBR328 に若干の変形を施したものが
正当なバランスを持つことが判明した。 pBR328 の変形
についてさらに具体的に述べると、以下にさらに論ずる
筈であるが、次の通りであった。プラスミドの抗生物質
耐性遺伝子をプラスミド起源の複製物から分離すること
によって、メチラーゼ選択の効率が最大になるような位
置に、 SfiI 部位を挿入することであった。
で、５種の異なるベクターを構築した。具体的に述べる
と、２個のpBR322誘導体、２個の pUC19誘導体、１個の
pBR328 誘導体を構築した。 pBR328 ベクター（以下に
さらに詳しく述べる）が、唯一、活性 SfiI メチラーゼ
クローンを生成した。 pBR328 によるクローン化が成功
したのは、 pBR328 が安定なプラスミド pBR322 よりも
高いコピー数を持っていること、およびきわめて高いコ
ピー数を持つプラスミド pUC19よりも高い安定性を持つ
こと（特により高温では、すなわち約３６℃よりも高い
温度では、安定性が優れていた）によると思われる。コ
ピー数の高いプラスミドを使用すると、目的の組み換え
ＤＮＡのコピー数は増加し、従って、ＤＮＡのメチル化
を増す。しかしながら、上に述べたように、コピー数が
高ければ高いほど、pUC19 のようなベクターの不安定性
は増す。これは、高温では特にそうである。 SfiI Ｒ−
Ｍ系については、 pBR328 に若干の変形を施したものが
正当なバランスを持つことが判明した。 pBR328 の変形
についてさらに具体的に述べると、以下にさらに論ずる
筈であるが、次の通りであった。プラスミドの抗生物質
耐性遺伝子をプラスミド起源の複製物から分離すること
によって、メチラーゼ選択の効率が最大になるような位
置に、 SfiI 部位を挿入することであった。
【００２３】SfiI Ｒ−Ｍ系をクローン化するためのメ
チラーゼ選択工程を改善するために、クローニングベク
ター以下の大きさを持つすべてのプラスミドを、調製し
たライブラリーの最終グループから取り除いた。挿入Ｄ
ＮＡフラグメントを欠くプラスミドを除去すると、非メ
チラーゼクローン生存物の全数は低下するから、メチラ
ーゼクローンを見出す確率は向上する。
チラーゼ選択工程を改善するために、クローニングベク
ター以下の大きさを持つすべてのプラスミドを、調製し
たライブラリーの最終グループから取り除いた。挿入Ｄ
ＮＡフラグメントを欠くプラスミドを除去すると、非メ
チラーゼクローン生存物の全数は低下するから、メチラ
ーゼクローンを見出す確率は向上する。
【００２４】非メチラーゼクローンの破壊を促進するた
めに、メチラーゼ選択後処理としていくつかの異なる処
理を行なった。 SfiI によって切断されたＤＮＡから
５′燐酸を取り除くために、仔牛腸フォスファターゼお
よび細菌のアルカリフォスファターゼを用いた。 SfiI
によって切断されたＤＮＡから全ヌクレオチドを取り除
くために、エキソヌクレアーゼ III、 Bal-31 ヌクレア
ーゼを用いた。この処理によって、 SfiIによって切断
された（非メチラーゼ）プラスミドが再結合して生き残
る確率はさらに減少した。
めに、メチラーゼ選択後処理としていくつかの異なる処
理を行なった。 SfiI によって切断されたＤＮＡから
５′燐酸を取り除くために、仔牛腸フォスファターゼお
よび細菌のアルカリフォスファターゼを用いた。 SfiI
によって切断されたＤＮＡから全ヌクレオチドを取り除
くために、エキソヌクレアーゼ III、 Bal-31 ヌクレア
ーゼを用いた。この処理によって、 SfiIによって切断
された（非メチラーゼ）プラスミドが再結合して生き残
る確率はさらに減少した。
【００２５】２種の宿主細胞株（E.coli RRIおよびK80
2）を用いた。これは、SfiI−メチラーゼ含有プラスミ
ドによる形質転換がどちらか一方に致命的である場合に
備えたものである。 SfiI Ｒ−Ｍ系をクローン化するに
は、ＲＲＩが好ましい宿主細胞であることが判明した。
2）を用いた。これは、SfiI−メチラーゼ含有プラスミ
ドによる形質転換がどちらか一方に致命的である場合に
備えたものである。 SfiI Ｒ−Ｍ系をクローン化するに
は、ＲＲＩが好ましい宿主細胞であることが判明した。
【００２６】先に引用したＥＰＯ出願公開第 193,413号
に対する上記変更を、様々の組み合わせで用いた。これ
は、制限エンドヌクレアーゼを形成する１６種の異なる
ライブラリー合計５４個のライブラリーを構築しかつス
クリーニングするためであった。以下に論ずるように、
これらのライブラリーのうちただ一つ、すなわち pEV32
8-8-6 の BclI ライブラリーだけがメチラーゼクローン
を生成した。
に対する上記変更を、様々の組み合わせで用いた。これ
は、制限エンドヌクレアーゼを形成する１６種の異なる
ライブラリー合計５４個のライブラリーを構築しかつス
クリーニングするためであった。以下に論ずるように、
これらのライブラリーのうちただ一つ、すなわち pEV32
8-8-6 の BclI ライブラリーだけがメチラーゼクローン
を生成した。
【００２７】この遺伝子の両側のメチラーゼ遺伝子とＤ
ＮＡをクローン化し分析して始めて、なぜ構築されたラ
イブラリーの大部分が SfiI Ｒ−Ｍクローンを生成する
ことができなかったのか、その理由を推量することが可
能になった。理論に拘束されるつもりはないが、BglII,
KpnI, PstI, SacI, SalI, SphI および XhoI のような
ライブラリー形成エンドヌクレアーゼはメチラーゼ遺伝
子の遥か上流を切断するために、プラスミドプロモータ
ーがメチラーゼ遺伝子をコントロールすることができな
いと考えられる。したがって、プラスミドプロモーター
のコントロールが無ければ、 SfiI メチラーゼは発現し
ないために、これらのライブラリーからのクローンは、
メチラーゼ選択において生き残ることができなかったの
であろう。さらに、BglII および SacI はまたメチラー
ゼ遺伝子内部を切断し、活性メチラーゼを獲得する確率
をさらに低下させることが結論された。
ＮＡをクローン化し分析して始めて、なぜ構築されたラ
イブラリーの大部分が SfiI Ｒ−Ｍクローンを生成する
ことができなかったのか、その理由を推量することが可
能になった。理論に拘束されるつもりはないが、BglII,
KpnI, PstI, SacI, SalI, SphI および XhoI のような
ライブラリー形成エンドヌクレアーゼはメチラーゼ遺伝
子の遥か上流を切断するために、プラスミドプロモータ
ーがメチラーゼ遺伝子をコントロールすることができな
いと考えられる。したがって、プラスミドプロモーター
のコントロールが無ければ、 SfiI メチラーゼは発現し
ないために、これらのライブラリーからのクローンは、
メチラーゼ選択において生き残ることができなかったの
であろう。さらに、BglII および SacI はまたメチラー
ゼ遺伝子内部を切断し、活性メチラーゼを獲得する確率
をさらに低下させることが結論された。
【００２８】他の２種のクローニングエンドヌクレアー
ゼ（BamHI, XmaI ）は、プラスミドプロモーターによっ
て発現されるメチラーゼ遺伝子を含むフラグメントを生
成したが、このフラグメントはあまりに大きすぎて（20
kb ）、効率的にクローン化することができなかった。
大フラグメントは、一般的に、クローニングベクター中
にきわめて結合しにくい。（注−実施例１、工程１６
参照。 SfiI メチラーゼをクローン化し、特徴を明らか
にした後、ゲル精製した多量のライブラリーを用いて20
kb BamHl フラグメントを成功裡に分離した）。
ゼ（BamHI, XmaI ）は、プラスミドプロモーターによっ
て発現されるメチラーゼ遺伝子を含むフラグメントを生
成したが、このフラグメントはあまりに大きすぎて（20
kb ）、効率的にクローン化することができなかった。
大フラグメントは、一般的に、クローニングベクター中
にきわめて結合しにくい。（注−実施例１、工程１６
参照。 SfiI メチラーゼをクローン化し、特徴を明らか
にした後、ゲル精製した多量のライブラリーを用いて20
kb BamHl フラグメントを成功裡に分離した）。
【００２９】残る６種のクローニングエンドヌクレアー
ゼ（HinPl, HpaI, NarI, Sau3AI, TaqI, XhoI (BstY
I)）は SfiI 染色体をあまりに小片に切断しすぎたた
め、所期のメチラーゼ遺伝子を保有させることができな
かった。したがって、その染色体の部分消化物からライ
ブラリーを構築したが、 SfiI メチラーゼクローンは全
く得られなかった。上に論じたように、また、実施例１
の工程１７−１８でさらに詳細に述べるように、この部
分消化物は、その一端近くに SfiI メチラーゼＤＮＡの
５′末端を保有するフラグメントを生成しなかったと考
えられる。従って、そのようなプラスミドはメチラーゼ
選択において生き残ることはできなかった。
ゼ（HinPl, HpaI, NarI, Sau3AI, TaqI, XhoI (BstY
I)）は SfiI 染色体をあまりに小片に切断しすぎたた
め、所期のメチラーゼ遺伝子を保有させることができな
かった。したがって、その染色体の部分消化物からライ
ブラリーを構築したが、 SfiI メチラーゼクローンは全
く得られなかった。上に論じたように、また、実施例１
の工程１７−１８でさらに詳細に述べるように、この部
分消化物は、その一端近くに SfiI メチラーゼＤＮＡの
５′末端を保有するフラグメントを生成しなかったと考
えられる。従って、そのようなプラスミドはメチラーゼ
選択において生き残ることはできなかった。
【００３０】一旦、 SfiI Ｒ−Ｍクローンを入手できた
としても、SfiI エンドヌクレアーゼ遺伝子に関して
は、エンドヌクレアーゼの発現はさらに非効率的なもの
であった。他の多くのＲ−Ｍ系由来のメチラーゼクロー
ンを、in vitroアッセイを用いて制限エンドヌクレアー
ゼ活性についてスクリーニングすることができる。通
常、制限遺伝子が存在するならば、in vitro制限エンド
ヌクレアーゼ活性は検出できる。
としても、SfiI エンドヌクレアーゼ遺伝子に関して
は、エンドヌクレアーゼの発現はさらに非効率的なもの
であった。他の多くのＲ−Ｍ系由来のメチラーゼクロー
ンを、in vitroアッセイを用いて制限エンドヌクレアー
ゼ活性についてスクリーニングすることができる。通
常、制限遺伝子が存在するならば、in vitro制限エンド
ヌクレアーゼ活性は検出できる。
【００３１】逆に、エンドヌクレアーゼ活性は、 SfiI
メチラーゼクローンに関する上に引用したＥＰＯ出願公
開第 193,413号記載のin vitroアッセイによっては検出
されなかった。また、粗抽出物のフォスフォセルロース
カラム濃縮によっても、この陰性結果は改善されなかっ
た。このように制限酵素活性が見られなかったことにつ
いて、最初は、制限遺伝子がメチラーゼ遺伝子に結合し
ていないか、あるいは、結合しているがメチラーゼ遺伝
子と無傷のままクローン化されていないか、あるいは、
無傷でクローン化されてはいるが発現していないか、の
いずれかであることが示された。
メチラーゼクローンに関する上に引用したＥＰＯ出願公
開第 193,413号記載のin vitroアッセイによっては検出
されなかった。また、粗抽出物のフォスフォセルロース
カラム濃縮によっても、この陰性結果は改善されなかっ
た。このように制限酵素活性が見られなかったことにつ
いて、最初は、制限遺伝子がメチラーゼ遺伝子に結合し
ていないか、あるいは、結合しているがメチラーゼ遺伝
子と無傷のままクローン化されていないか、あるいは、
無傷でクローン化されてはいるが発現していないか、の
いずれかであることが示された。
【００３２】上記三つの可能性のどれが実際の状況に当
てはまるのかを決定するために、クローン化した SfiI
フラグメントについて制限マッピングを行い、さらに欠
失解析を行い、メチラーゼ遺伝子がクローン化フラグメ
ント内のどこに位置するのかを決定した。次に、このよ
うにして得られた情報を用いて、このメチラーゼ遺伝子
のどちらか一方の側に、もしメチラーゼ遺伝子とエンド
ヌクレアーゼ制限遺伝子が結合した場合、無傷のエンド
ヌクレアーゼ制限遺伝子をコードするのに十分なＤＮＡ
があるかどうかを決定した。
てはまるのかを決定するために、クローン化した SfiI
フラグメントについて制限マッピングを行い、さらに欠
失解析を行い、メチラーゼ遺伝子がクローン化フラグメ
ント内のどこに位置するのかを決定した。次に、このよ
うにして得られた情報を用いて、このメチラーゼ遺伝子
のどちらか一方の側に、もしメチラーゼ遺伝子とエンド
ヌクレアーゼ制限遺伝子が結合した場合、無傷のエンド
ヌクレアーゼ制限遺伝子をコードするのに十分なＤＮＡ
があるかどうかを決定した。
【００３３】BclI クローンの場合、右側には（約 2 kb
）おそらく十分な余地があるが、左側の 0.6 kb は遺
伝子をコードするには不十分と判断された。従って、よ
り多くのＤＮＡのクローニングを試みて、制限エンドヌ
クレアーゼ活性の欠落は、制限遺伝子がそのクローン内
部に存在していないためであるという可能性を調べた。
特に、メチラーゼ遺伝子の一部を SfiI 染色体の消化物
をプローブするために用い、クローン化したメチラーゼ
ＤＮＡの境界部を越えて延びている領域のゲノムマップ
を作成した。このデータから、Ｒ−Ｍ領域を個々のフラ
グメントに切断するエンドヌクレアーゼ遺伝子がいくつ
か特定された。このフラグメントはメチラーゼ遺伝子お
よびそれよりも多量の隣接ＤＮＡを保有している。この
ようなエンドヌクレアーゼによって生成されるフラグメ
ントの正確な大きさも、このデータから得られた。もし
制限遺伝子と修飾遺伝子が結合しているならば、このよ
うなフラグメントも制限遺伝子をコードしているだろう
と考えた。次に、フラグメントのクローン化を、メチラ
ーゼ遺伝子の両側に少なくとも 3-4 kb ＤＮＡがクロー
ン化するまで続けた。フラグメントの一端近くにメチラ
ーゼ遺伝子の５′末端を持ち、かつメチラーゼ遺伝子の
３′末端から下流に付加的ＤＮＡを持つメチラーゼ遺伝
子を保有するフラグメントは、ベクタープロモーターと
並んでクローニングベクター内に結合されると、メチラ
ーゼを発現できることが判明した。従って、メチラーゼ
選択によりこのようなフラグメントを分離することがで
きた。さらに、メチラーゼ遺伝子の５′末端から下流に
付加的ＤＮＡを持つメチラーゼ遺伝子を保有するフラグ
メントは、クローニングベクター内に結合されると、メ
チラーゼを発現できないことが分かった。この種のフラ
グメントがメチラーゼを発現できなかったのは、ベクタ
ープロモーターがメチラーゼ遺伝子から遠すぎて、発現
を促進することができなかったためと考えられる。実
際、これらのフラグメントは、メチラーゼ選択によって
分離されなかった。代わりに、これらのフラグメント
は、Grunstein ブロットを用いると分離された。これ
は、 BclI クローン中のＤＮＡ配列と同一のＤＮＡ配列
を持つプラスミドを個別に同定する方法である。
）おそらく十分な余地があるが、左側の 0.6 kb は遺
伝子をコードするには不十分と判断された。従って、よ
り多くのＤＮＡのクローニングを試みて、制限エンドヌ
クレアーゼ活性の欠落は、制限遺伝子がそのクローン内
部に存在していないためであるという可能性を調べた。
特に、メチラーゼ遺伝子の一部を SfiI 染色体の消化物
をプローブするために用い、クローン化したメチラーゼ
ＤＮＡの境界部を越えて延びている領域のゲノムマップ
を作成した。このデータから、Ｒ−Ｍ領域を個々のフラ
グメントに切断するエンドヌクレアーゼ遺伝子がいくつ
か特定された。このフラグメントはメチラーゼ遺伝子お
よびそれよりも多量の隣接ＤＮＡを保有している。この
ようなエンドヌクレアーゼによって生成されるフラグメ
ントの正確な大きさも、このデータから得られた。もし
制限遺伝子と修飾遺伝子が結合しているならば、このよ
うなフラグメントも制限遺伝子をコードしているだろう
と考えた。次に、フラグメントのクローン化を、メチラ
ーゼ遺伝子の両側に少なくとも 3-4 kb ＤＮＡがクロー
ン化するまで続けた。フラグメントの一端近くにメチラ
ーゼ遺伝子の５′末端を持ち、かつメチラーゼ遺伝子の
３′末端から下流に付加的ＤＮＡを持つメチラーゼ遺伝
子を保有するフラグメントは、ベクタープロモーターと
並んでクローニングベクター内に結合されると、メチラ
ーゼを発現できることが判明した。従って、メチラーゼ
選択によりこのようなフラグメントを分離することがで
きた。さらに、メチラーゼ遺伝子の５′末端から下流に
付加的ＤＮＡを持つメチラーゼ遺伝子を保有するフラグ
メントは、クローニングベクター内に結合されると、メ
チラーゼを発現できないことが分かった。この種のフラ
グメントがメチラーゼを発現できなかったのは、ベクタ
ープロモーターがメチラーゼ遺伝子から遠すぎて、発現
を促進することができなかったためと考えられる。実
際、これらのフラグメントは、メチラーゼ選択によって
分離されなかった。代わりに、これらのフラグメント
は、Grunstein ブロットを用いると分離された。これ
は、 BclI クローン中のＤＮＡ配列と同一のＤＮＡ配列
を持つプラスミドを個別に同定する方法である。
【００３４】４種の異なるメチラーゼ遺伝子含有クロー
ンの中で、メチラーゼ遺伝子のいずれか一方の側にある
少なくとも 3-4 kb が一旦クローン化されると、もしメ
チラーゼ遺伝子と制限遺伝子が結合しているならば、こ
の４種の異なるメチラーゼクローンの少なくとも１個に
制限遺伝子が存在すると推定された。そのクローン各々
について、 SfiI 制限エンドヌクレアーゼ活性を測定し
た。活性が検出されなかったので、制限遺伝子が SfiI
メチラーゼ遺伝子に結合していないか、あるいは結合し
ていてメチラーゼクローン中に存在するが発現しない
か、のいずれかであると推定された。
ンの中で、メチラーゼ遺伝子のいずれか一方の側にある
少なくとも 3-4 kb が一旦クローン化されると、もしメ
チラーゼ遺伝子と制限遺伝子が結合しているならば、こ
の４種の異なるメチラーゼクローンの少なくとも１個に
制限遺伝子が存在すると推定された。そのクローン各々
について、 SfiI 制限エンドヌクレアーゼ活性を測定し
た。活性が検出されなかったので、制限遺伝子が SfiI
メチラーゼ遺伝子に結合していないか、あるいは結合し
ていてメチラーゼクローン中に存在するが発現しない
か、のいずれかであると推定された。
【００３５】制限遺伝子はメチラーゼクローン中にある
が発現しないという可能性を求めて、さらに SfiI メチ
ラーゼクローンのスクリーニングを行い、 SfiI 制限エ
ンドヌクレアーゼ遺伝子があるかどうか調べてみた。S.
fimbriatus から SfiI エンドヌクレアーゼの超純粋標
本を調製し、エンドヌクレアーゼ蛋白質のアミノ末端の
アミノ酸配列を決定する必要があった。次に、このエン
ドヌクレアーゼのアミノ酸配列に対応するＤＮＡオリゴ
マーを合成した。次に、このＤＮＡオリゴマーとのハイ
ブリダイゼーションについて、メチラーゼクローンをス
クリーニングした。このようにして、制限遺伝子が４種
の異なるメチラーゼクローンのうちの２種に存在するこ
とが判明した。従って、制限遺伝子は、たとえクローン
中にあっても、E. coli 中では発現しないのであった。
が発現しないという可能性を求めて、さらに SfiI メチ
ラーゼクローンのスクリーニングを行い、 SfiI 制限エ
ンドヌクレアーゼ遺伝子があるかどうか調べてみた。S.
fimbriatus から SfiI エンドヌクレアーゼの超純粋標
本を調製し、エンドヌクレアーゼ蛋白質のアミノ末端の
アミノ酸配列を決定する必要があった。次に、このエン
ドヌクレアーゼのアミノ酸配列に対応するＤＮＡオリゴ
マーを合成した。次に、このＤＮＡオリゴマーとのハイ
ブリダイゼーションについて、メチラーゼクローンをス
クリーニングした。このようにして、制限遺伝子が４種
の異なるメチラーゼクローンのうちの２種に存在するこ
とが判明した。従って、制限遺伝子は、たとえクローン
中にあっても、E. coli 中では発現しないのであった。
【００３６】SfiI エンドヌクレアーゼ遺伝子を含むク
ローンのＤＮＡ配列および詳細なマッピングデータを
得、これに基づいて、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の
発現レベルを増大する方法を考案した。
ローンのＤＮＡ配列および詳細なマッピングデータを
得、これに基づいて、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の
発現レベルを増大する方法を考案した。
【００３７】本明細書に記載する方法は、 SfiI Ｒ−Ｍ
系を好ましいやり方でクローン化し、発現する方法であ
るが、これを図１および図２に示す。これはまた次の工
程を含む。
系を好ましいやり方でクローン化し、発現する方法であ
るが、これを図１および図２に示す。これはまた次の工
程を含む。
【００３８】１．S. fimbriatus ＤＮＡを既知の方法を
用いて精製する。
用いて精製する。
【００３９】２．このＤＮＡを、 BclI のような制限エ
ンドヌクレアーゼによって完全にまた部分的に消化す
る。このエンドヌクレアーゼは、全 SfiI メチラーゼ遺
伝子を切断してフラグメントにするが、このフラグメン
トは、その一端にまたはその近傍にメチラーゼ遺伝子の
５′末端を保有している。このフラグメントは約1.5-13
kbであることが好ましい。
ンドヌクレアーゼによって完全にまた部分的に消化す
る。このエンドヌクレアーゼは、全 SfiI メチラーゼ遺
伝子を切断してフラグメントにするが、このフラグメン
トは、その一端にまたはその近傍にメチラーゼ遺伝子の
５′末端を保有している。このフラグメントは約1.5-13
kbであることが好ましい。
【００４０】３． SfiI 部位を含むクローニングベクタ
ーを、pUC19, pBR322 およびpBR328から誘導して構築し
た。好ましいベクターは pBR328 誘導体である。もっと
も好ましいベクターは pEV328-8-6 誘導体であり、その
構築物を実施例１の工程３に記載する。
ーを、pUC19, pBR322 およびpBR328から誘導して構築し
た。好ましいベクターは pBR328 誘導体である。もっと
も好ましいベクターは pEV328-8-6 誘導体であり、その
構築物を実施例１の工程３に記載する。
【００４１】４．工程２から得た消化ＤＮＡを、工程３
のクローニングベクターに結合する。それによって生じ
た混合物を用いて、適当な宿主の形質転換を行なう。こ
の宿主はE. coli 株 RR1または K802 細胞が好ましい
（それぞれ、ATCC 31343およびATCC 33526）。もっとも
好ましい宿主細胞は RR1である。
のクローニングベクターに結合する。それによって生じ
た混合物を用いて、適当な宿主の形質転換を行なう。こ
の宿主はE. coli 株 RR1または K802 細胞が好ましい
（それぞれ、ATCC 31343およびATCC 33526）。もっとも
好ましい宿主細胞は RR1である。
【００４２】５．ＤＮＡ細胞混合物を、形質転換細胞を
選択する抗生物質添加培地上にプレーティングする。こ
の培地は、例えば、アンピシリンまたはクロラムフェニ
コールを含むものである。インキュベーション後、形質
転換細胞コロニーをプールし、一次細胞ライブラリーを
形成する。
選択する抗生物質添加培地上にプレーティングする。こ
の培地は、例えば、アンピシリンまたはクロラムフェニ
コールを含むものである。インキュベーション後、形質
転換細胞コロニーをプールし、一次細胞ライブラリーを
形成する。
【００４３】６．組み換えプラスミドを一次細胞ライブ
ラリーからまるごと精製し、一次プラスミドライブラリ
ーを作製する。
ラリーからまるごと精製し、一次プラスミドライブラリ
ーを作製する。
【００４４】７．非組み換えプラスミドの数を減らすた
めに、好ましくは、このライブラリーをアガロースゲル
で電気泳動し、クローニングベクター自身を越える大き
さのプラスミドのみを選んで、その後の分析に用いる。
めに、好ましくは、このライブラリーをアガロースゲル
で電気泳動し、クローニングベクター自身を越える大き
さのプラスミドのみを選んで、その後の分析に用いる。
【００４５】８．次に、ゲル精製したプラスミドライブ
ラリーを、 SfiI制限エンドヌクレアーゼによって、in
vitroで完全に消化する。このエンドヌクレアーゼは、
S. fimbriatus細胞から調製される。 SfiI 制限エンド
ヌクレアーゼ消化によって、非修飾、メチラーゼ非含有
クローンの選択的破壊が起こり、その結果、 SfiI メチ
ラーゼ保有クローンの相対的頻度が増加する。この消化
物にエキソヌクレアーゼおよび／またはフォスファター
ゼを加えてもよく、これは、非メチラーゼクローンの破
壊を強化するためである。
ラリーを、 SfiI制限エンドヌクレアーゼによって、in
vitroで完全に消化する。このエンドヌクレアーゼは、
S. fimbriatus細胞から調製される。 SfiI 制限エンド
ヌクレアーゼ消化によって、非修飾、メチラーゼ非含有
クローンの選択的破壊が起こり、その結果、 SfiI メチ
ラーゼ保有クローンの相対的頻度が増加する。この消化
物にエキソヌクレアーゼおよび／またはフォスファター
ゼを加えてもよく、これは、非メチラーゼクローンの破
壊を強化するためである。
【００４６】９． SfiI メチラーゼクローンの同定：消
化されたプラスミドライブラリーＤＮＡを、再び適当な
宿主（例えば、E. coli 株の RR1またはK802）に戻して
形質転換を行ない、抗生物質添加プレート上にプレーテ
ィングして再び形質転換コロニーを得る。これらのコロ
ニーを取り上げ、そのＤＮＡを、次の様にして、SfiI修
飾遺伝子の存在に関して分析する。すなわち、プラスミ
ドＤＮＡを精製し、invitroで SfiI 制限エンドヌクレ
アーゼと一緒にインキュベートし、 SfiI による消化に
対する抵抗性を確かめる。プラスミドＤＮＡは、この消
化に対して完全にもしくは実質的に抵抗性を持っていな
ければならない。
化されたプラスミドライブラリーＤＮＡを、再び適当な
宿主（例えば、E. coli 株の RR1またはK802）に戻して
形質転換を行ない、抗生物質添加プレート上にプレーテ
ィングして再び形質転換コロニーを得る。これらのコロ
ニーを取り上げ、そのＤＮＡを、次の様にして、SfiI修
飾遺伝子の存在に関して分析する。すなわち、プラスミ
ドＤＮＡを精製し、invitroで SfiI 制限エンドヌクレ
アーゼと一緒にインキュベートし、 SfiI による消化に
対する抵抗性を確かめる。プラスミドＤＮＡは、この消
化に対して完全にもしくは実質的に抵抗性を持っていな
ければならない。
【００４７】上に述べたように、前に引用したＥＰＯ出
願公開第 193,413号に記載した方法を用いて、クローン
の全細胞ＤＮＡ（染色体ＤＮＡおよび、プラスミド）も
精製し、この方法のこの段階で、 SfiI 制限エンドヌク
レアーゼと一緒にインキュベートした。しかしながら、
E. coli 染色体は、切断するにはごく少数の SfiI 部位
しか含んでいないので、通常のアガロースゲル上では検
出できない。代わりに、 SfiIメチラーゼ遺伝子がクロ
ーン化されたことをさらに証拠づけるには、挿入部を欠
失し、残ったベクターについて無傷の SfiI 部位の存在
を分析し、クローンからの細胞粗抽出物について SfiI
メチラーゼのin vitro活性を測定する必要があった。こ
れは、後に、実施例１の工程１１に述べる通りである。
願公開第 193,413号に記載した方法を用いて、クローン
の全細胞ＤＮＡ（染色体ＤＮＡおよび、プラスミド）も
精製し、この方法のこの段階で、 SfiI 制限エンドヌク
レアーゼと一緒にインキュベートした。しかしながら、
E. coli 染色体は、切断するにはごく少数の SfiI 部位
しか含んでいないので、通常のアガロースゲル上では検
出できない。代わりに、 SfiIメチラーゼ遺伝子がクロ
ーン化されたことをさらに証拠づけるには、挿入部を欠
失し、残ったベクターについて無傷の SfiI 部位の存在
を分析し、クローンからの細胞粗抽出物について SfiI
メチラーゼのin vitro活性を測定する必要があった。こ
れは、後に、実施例１の工程１１に述べる通りである。
【００４８】１０．メチラーゼ遺伝子がクローン化され
たことを確かめてから、クローンについて、 SfiI 制限
エンドヌクレアーゼ活性をアッセイする。もし活性が検
出されなければ、メチラーゼクローンをマップ化し、欠
失分析に掛け、クローン化されたフラグメント内のメチ
ラーゼ遺伝子の位置を決定する。S. fimbriatus 染色体
の、 SfiI メチラーゼ領域の制限マップが得られた。こ
のマップから、 SfiI メチラーゼと、付加的なもっと大
きいＤＮＡ片とを含む制限フラグメントが同定された。
本発明に従えば、制限遺伝子とメチラーゼ遺伝子とは結
合していることが判明しているので、比較的大きいメチ
ラーゼ含有フラグメントは制限遺伝子もコードしている
筈である。
たことを確かめてから、クローンについて、 SfiI 制限
エンドヌクレアーゼ活性をアッセイする。もし活性が検
出されなければ、メチラーゼクローンをマップ化し、欠
失分析に掛け、クローン化されたフラグメント内のメチ
ラーゼ遺伝子の位置を決定する。S. fimbriatus 染色体
の、 SfiI メチラーゼ領域の制限マップが得られた。こ
のマップから、 SfiI メチラーゼと、付加的なもっと大
きいＤＮＡ片とを含む制限フラグメントが同定された。
本発明に従えば、制限遺伝子とメチラーゼ遺伝子とは結
合していることが判明しているので、比較的大きいメチ
ラーゼ含有フラグメントは制限遺伝子もコードしている
筈である。
【００４９】１１．メチラーゼ遺伝子に富むライブラリ
ーは、工程１０に記載したＤＮＡフラグメントをゲル精
製し、それらを適当なベクター、例えば、 pEV328-8-6
(pBR328 の誘導体で、その構築については実施例１、工
程３に記載する）中に結合させて、構築してもよい。メ
チラーゼ遺伝子の下流にＤＮＡを保有するクローンは、
メチラーゼ選択によって分離できる。上流にＤＮＡを保
有するクローン、または両側にＤＮＡを持つクローンは
発現しないが、Grunstein ブロットを用いて分離できる
（図４および５参照）。
ーは、工程１０に記載したＤＮＡフラグメントをゲル精
製し、それらを適当なベクター、例えば、 pEV328-8-6
(pBR328 の誘導体で、その構築については実施例１、工
程３に記載する）中に結合させて、構築してもよい。メ
チラーゼ遺伝子の下流にＤＮＡを保有するクローンは、
メチラーゼ選択によって分離できる。上流にＤＮＡを保
有するクローン、または両側にＤＮＡを持つクローンは
発現しないが、Grunstein ブロットを用いて分離できる
（図４および５参照）。
【００５０】１２．制限遺伝子クローンの同定：SfiI制
限エンドヌクレアーゼ遺伝子を保有するクローンは、前
に引用したＥＰＯ出願公開第 193,413号に記載された細
胞粗抽出物アッセイでは同定できなかった。その理由は
おそらく、E. coli 中のSfiIエンドヌクレアーゼ遺伝子
の発現が低レベルだからであろう。従って、 SfiI エン
ドヌクレアーゼをS. fimbriatus からできるだけ均質に
近い状態で精製し、最初の２０−４０個のアミノ酸配列
を決定する。この配列情報から、縮重オリゴマーＤＮＡ
プローブを設計し、放射性標識を行なう。同時に、制限
エンドヌクレアーゼ蛋白質の大きさを蛋白質ゲルで定量
したところ、約 32kDであった。これは、エンドヌクレ
アーゼ遺伝子をコードするのに必要なＤＮＡ量が SfiI
については約 1 kb であることを示す。SfiI 制限エン
ドヌクレアーゼを保有するクローンは、制限遺伝子ＤＮ
Ａプローブとハイブリダイズし、ハイブリダイゼーショ
ン位置に隣接する少なくとも 1 kb のＤＮＡを保有する
ものと同定された。好ましくは、ハイブリダイゼーショ
ン位置の両側に隣接して少なくとも 1 kb のＤＮＡがあ
るのがよい。ハイブリダイゼーション位置のＤＮＡ配列
が決定されれば、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の、ハ
イブリダイゼーション位置に対する相対的位置を決める
ことができよう。
限エンドヌクレアーゼ遺伝子を保有するクローンは、前
に引用したＥＰＯ出願公開第 193,413号に記載された細
胞粗抽出物アッセイでは同定できなかった。その理由は
おそらく、E. coli 中のSfiIエンドヌクレアーゼ遺伝子
の発現が低レベルだからであろう。従って、 SfiI エン
ドヌクレアーゼをS. fimbriatus からできるだけ均質に
近い状態で精製し、最初の２０−４０個のアミノ酸配列
を決定する。この配列情報から、縮重オリゴマーＤＮＡ
プローブを設計し、放射性標識を行なう。同時に、制限
エンドヌクレアーゼ蛋白質の大きさを蛋白質ゲルで定量
したところ、約 32kDであった。これは、エンドヌクレ
アーゼ遺伝子をコードするのに必要なＤＮＡ量が SfiI
については約 1 kb であることを示す。SfiI 制限エン
ドヌクレアーゼを保有するクローンは、制限遺伝子ＤＮ
Ａプローブとハイブリダイズし、ハイブリダイゼーショ
ン位置に隣接する少なくとも 1 kb のＤＮＡを保有する
ものと同定された。好ましくは、ハイブリダイゼーショ
ン位置の両側に隣接して少なくとも 1 kb のＤＮＡがあ
るのがよい。ハイブリダイゼーション位置のＤＮＡ配列
が決定されれば、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の、ハ
イブリダイゼーション位置に対する相対的位置を決める
ことができよう。
【００５１】１３．過剰発現（overexpression）：制限
遺伝子を含むクローンは、多数ある技術の内いずれを用
いても過剰発現させることができる。これについては、
実施例２にさらに詳しく述べる通りである。 SfiI 制限
エンドヌクレアーゼ遺伝子を最大に発現させるには、こ
れらの技術を個々に用いてもよいし、あるいは併用して
もよい。
遺伝子を含むクローンは、多数ある技術の内いずれを用
いても過剰発現させることができる。これについては、
実施例２にさらに詳しく述べる通りである。 SfiI 制限
エンドヌクレアーゼ遺伝子を最大に発現させるには、こ
れらの技術を個々に用いてもよいし、あるいは併用して
もよい。
【００５２】例えば、E. coli によって確実に認識され
る、ラムダ pL のようなプロモーターを、 SfiI エンド
ヌクレアーゼ遺伝子の開始点のすぐ上流に挿入する。こ
の組み込みは、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて
行なってもよい。好ましくは、この制限遺伝子は、プロ
モーターに、約 0.5 kb よりも接近しているのがよい。
る、ラムダ pL のようなプロモーターを、 SfiI エンド
ヌクレアーゼ遺伝子の開始点のすぐ上流に挿入する。こ
の組み込みは、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて
行なってもよい。好ましくは、この制限遺伝子は、プロ
モーターに、約 0.5 kb よりも接近しているのがよい。
【００５３】SfiIエンドヌクレアーゼ遺伝子の発現を増
大させる第二の方法は、その遺伝子の上流に強力なリボ
ソーム結合部位を挿入することを含む（Shine とDalgar
no,1974, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71, 1342-134
6）。この開示内容を参照として本明細書に取り入れる
ものとする。
大させる第二の方法は、その遺伝子の上流に強力なリボ
ソーム結合部位を挿入することを含む（Shine とDalgar
no,1974, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71, 1342-134
6）。この開示内容を参照として本明細書に取り入れる
ものとする。
【００５４】SfiI エンドヌクレアーゼ遺伝子の発現を
増大する第三の方法は、部位特異的突然変異誘発によっ
て、または、E. coli 中でより効率的に利用できるよう
なコドンを使えるように遺伝子そのものを再合成するこ
とによって、その遺伝子のＤＮＡ配列を変えることを含
む。
増大する第三の方法は、部位特異的突然変異誘発によっ
て、または、E. coli 中でより効率的に利用できるよう
なコドンを使えるように遺伝子そのものを再合成するこ
とによって、その遺伝子のＤＮＡ配列を変えることを含
む。
【００５５】SfiI エンドヌクレアーゼ遺伝子の発現は
また、ポリメラーゼ連鎖反応や、この遺伝子の５′およ
び３′の両末端にハイブリダイズさせた合成プライマー
を用いて増幅させることもできる。
また、ポリメラーゼ連鎖反応や、この遺伝子の５′およ
び３′の両末端にハイブリダイズさせた合成プライマー
を用いて増幅させることもできる。
【００５６】１４．生産： SfiI メチラーゼまたはエン
ドヌクレアーゼは、適当な培地を含む発酵槽中で増殖さ
せることにより、 SfiI 修飾遺伝子および過剰発現の制
限遺伝子を保有するクローンから生産してもよい。その
後、遠心分離によって細胞を回収し、超音波処理によっ
てこれを破壊して、 SfiI メチラーゼおよび制限エンド
ヌクレアーゼ活性を含む細胞粗抽出物を生産する。
ドヌクレアーゼは、適当な培地を含む発酵槽中で増殖さ
せることにより、 SfiI 修飾遺伝子および過剰発現の制
限遺伝子を保有するクローンから生産してもよい。その
後、遠心分離によって細胞を回収し、超音波処理によっ
てこれを破壊して、 SfiI メチラーゼおよび制限エンド
ヌクレアーゼ活性を含む細胞粗抽出物を生産する。
【００５７】１５．精製： SfiI メチラーゼおよびエン
ドヌクレアーゼを含む細胞粗抽出物を、既知の蛋白質精
製技術によって精製する。この精製技術としては、例え
ば、アフィニティークロマトグラフィーまたはイオン交
換クロマトグラフィーがある。
ドヌクレアーゼを含む細胞粗抽出物を、既知の蛋白質精
製技術によって精製する。この精製技術としては、例え
ば、アフィニティークロマトグラフィーまたはイオン交
換クロマトグラフィーがある。
【００５８】上述した概略工程は、本発明を実施するに
あたって、好ましい方法を表わしたものではあるが、当
業者にとっては、前述の方法はこの分野で既知の技術に
従って変更することができることは明白であろう。
あたって、好ましい方法を表わしたものではあるが、当
業者にとっては、前述の方法はこの分野で既知の技術に
従って変更することができることは明白であろう。
【００５９】下記の実施例は、本発明を実施するにあた
り現在好ましいとされる実施態様を説明するために挙げ
たものである。この実施例はあくまでも例示であって、
本発明は、添付のクレームに示した場合を除き、この実
施例に限定されるものではない。
り現在好ましいとされる実施態様を説明するために挙げ
たものである。この実施例はあくまでも例示であって、
本発明は、添付のクレームに示した場合を除き、この実
施例に限定されるものではない。
【００６０】
【実施例】実施例 １ SfiI修飾メチラーゼ遺伝子および制限エン
ドヌクレアーゼ遺伝子のクローニング １．ＤＮＡ精製：ライソゾームをトリトンＸ−１００で
溶解し、その後にフェノール／クロロホルム抽出と透析
を行なうことにより、少量のS. fimbriatus ＤＮＡを得
た。Sfi 細胞は、Ｒ−Ｍ系を保有する他の多くの細菌細
胞よりも溶解するのが難しいことが分かった。溶解に対
する抵抗性は、他のStreptomyces菌株や近縁のNorcadia
菌株、例えば、NaeI, NcoI, NarIに共通の性質のようで
ある。ライソゾーム処理中に、細胞の溶解を促進するた
めに、凍結−解凍操作を加えると、大量のＤＮＡが生成
されるが、回収率は比較的低かった。しかし、このＤＮ
Ａを用いて、ライブラリーを構築することができた。
ドヌクレアーゼ遺伝子のクローニング １．ＤＮＡ精製：ライソゾームをトリトンＸ−１００で
溶解し、その後にフェノール／クロロホルム抽出と透析
を行なうことにより、少量のS. fimbriatus ＤＮＡを得
た。Sfi 細胞は、Ｒ−Ｍ系を保有する他の多くの細菌細
胞よりも溶解するのが難しいことが分かった。溶解に対
する抵抗性は、他のStreptomyces菌株や近縁のNorcadia
菌株、例えば、NaeI, NcoI, NarIに共通の性質のようで
ある。ライソゾーム処理中に、細胞の溶解を促進するた
めに、凍結−解凍操作を加えると、大量のＤＮＡが生成
されるが、回収率は比較的低かった。しかし、このＤＮ
Ａを用いて、ライブラリーを構築することができた。
【００６１】S. fimbriatus ＤＮＡを分離するのにもっ
と好ましい方法は、以下に述べるものである。 2.5ｇの
細胞ペーストを、0.1M Tris-HCl, 0.1 M EDTA pH 7.6の
１０ml中に再懸濁した。この懸濁液を乳鉢に移し、乳棒
で穏やかに混合すると、ＤＮＡ収量は大きく向上した。
この懸濁液を、 5.0mlずつ２つに分けた。これらの各々
に、0.1 M Tris-HCl, 0.1 M EDTA pH 7.6 にライソゾー
ムを 1.7mg／mlの割合で溶かした溶液 7.0mlを加え、各
々３７℃で９０分間インキュベートし、さらに、４℃で
一晩インキュベートした。ＳＤＳを加え、最終濃度１％
にし、プロテイナーゼＫを0.13 mg/mlになるように加
え、さらに各々を３７℃で２２分間インキュベートし
た。１０％ＳＤＳと８％ザルコシルの溶液 0.8mlを各々
に加え、インキュベーションを５５℃で４２分間継続し
て行った。次に、二つの部分を一緒にし、２４時間にＤ
ＮＡバッファー（10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 8.0）
を４回変えて透析した。透析したＤＮＡ液の全容量をＤ
ＮＡバッファーで８０mlに増して、塩化セシウム−臭化
エチヂウム平衡密度勾配遠心用に調製し、このＤＮＡ溶
液を２０mlずつ４つに分け、その各々に塩化セシウム２
０グラムと5 mg／ml臭化エチヂウムの 0.2mlを加えた。
このＤＮＡ溶液を、 44,000 rpm で４８時間遠心し、そ
れによって生じたＤＮＡバンドを、等量の氷冷した水飽
和Ｎ−ブタノールで４回抽出して取り出した。塩化セシ
ウムは透析で除去した。次に、 0.5Ｍとなるまで NaCl
を加え、最上部に 0.55 容量のイソプロピルアルコール
を重層して、このＤＮＡを沈澱させた。沈澱したＤＮＡ
をガラス棒に巻き付けた。このＤＮＡを3 mlの 10 mM T
ris, 1 mM EDTA(pH 8) に最終濃度約 1700 g/mlになる
よう溶解した。
と好ましい方法は、以下に述べるものである。 2.5ｇの
細胞ペーストを、0.1M Tris-HCl, 0.1 M EDTA pH 7.6の
１０ml中に再懸濁した。この懸濁液を乳鉢に移し、乳棒
で穏やかに混合すると、ＤＮＡ収量は大きく向上した。
この懸濁液を、 5.0mlずつ２つに分けた。これらの各々
に、0.1 M Tris-HCl, 0.1 M EDTA pH 7.6 にライソゾー
ムを 1.7mg／mlの割合で溶かした溶液 7.0mlを加え、各
々３７℃で９０分間インキュベートし、さらに、４℃で
一晩インキュベートした。ＳＤＳを加え、最終濃度１％
にし、プロテイナーゼＫを0.13 mg/mlになるように加
え、さらに各々を３７℃で２２分間インキュベートし
た。１０％ＳＤＳと８％ザルコシルの溶液 0.8mlを各々
に加え、インキュベーションを５５℃で４２分間継続し
て行った。次に、二つの部分を一緒にし、２４時間にＤ
ＮＡバッファー（10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 8.0）
を４回変えて透析した。透析したＤＮＡ液の全容量をＤ
ＮＡバッファーで８０mlに増して、塩化セシウム−臭化
エチヂウム平衡密度勾配遠心用に調製し、このＤＮＡ溶
液を２０mlずつ４つに分け、その各々に塩化セシウム２
０グラムと5 mg／ml臭化エチヂウムの 0.2mlを加えた。
このＤＮＡ溶液を、 44,000 rpm で４８時間遠心し、そ
れによって生じたＤＮＡバンドを、等量の氷冷した水飽
和Ｎ−ブタノールで４回抽出して取り出した。塩化セシ
ウムは透析で除去した。次に、 0.5Ｍとなるまで NaCl
を加え、最上部に 0.55 容量のイソプロピルアルコール
を重層して、このＤＮＡを沈澱させた。沈澱したＤＮＡ
をガラス棒に巻き付けた。このＤＮＡを3 mlの 10 mM T
ris, 1 mM EDTA(pH 8) に最終濃度約 1700 g/mlになる
よう溶解した。
【００６２】工程２−１０に関する注記：前述したよう
に、全部で１６種の異なるエンドヌクレアーゼの各々を
用いて、Sfi 染色体を消化し、５４個のライブラリーを
構築しスクリーニングした。メチラーゼ遺伝子は、BclI
ライブラリーを除いては、いずれの場合も選択において
生き残るほど十分な発現を示さなかったので、BclIライ
ブラリーの詳細についてのみ述べることにする。
に、全部で１６種の異なるエンドヌクレアーゼの各々を
用いて、Sfi 染色体を消化し、５４個のライブラリーを
構築しスクリーニングした。メチラーゼ遺伝子は、BclI
ライブラリーを除いては、いずれの場合も選択において
生き残るほど十分な発現を示さなかったので、BclIライ
ブラリーの詳細についてのみ述べることにする。
【００６３】２．完全および部分消化：精製ＤＮＡを、
次のようにして、 BclI エンドヌクレアーゼによって切
断した。10 mM Tris pH 7.5, 10 mM MgCl2 , 50 mM Na
Cl,10 mM メルカプトエタノールのバッファーに1700μg
/mlの割合で溶かしたＤＮＡ液21μl を、100 μl アリ
コート１個、50μl アリコート５個に分注した。100 μ
l 試験管に10単位のBclIエンドヌクレアーゼ（New Engl
and Biolabs, Beverly, Massachusetts ）を加え、ＤＮ
Ａ 1μg あたり酵素１単位となるようにした。第１の試
験管から50μl を抜取り、第２の試験管に移し入れ、Ｄ
ＮＡ 1μg あたり BclI ０．５単位となるようにした。
以下、同じ工程に従って、後続の試験管の各々に、直前
の試験管の BclI 含有量の半分を加える。これらの試験
管を３７℃で１時間インキュベートし、次に、７２℃で
１５分間熱処理し、それぞれから15μl を取り、これを
アガロースゲル電気泳動によって分析した。中程度で、
不完全な消化を示す試験管を、クローニング用の部分消
化フラグメントのソースとして選び、完全に消化された
ＤＮＡは、別に、一緒に混ぜ合わせた。（部分消化試験
管は0.25 u／μg, 0.12 u/μg, 0.06 u/μg および 0.0
3 u/μg の試験管であり、一方、1.0 u/μg および 0.5
u／μg が完全消化試験管であった。これらの溶液を互
いに混ぜ合わせ、下記の工程４に記載するやり方に従っ
て用いた。）３． pEV328-8-6 の構築： pBR328 ＤＮＡ
（ATCC 37517）を、 SspI エンドヌクレアーゼ（New En
gland Biolabs, Beverly, Massachusetts）を用いて、
部分的に消化した。この消化を、SspIバッファー（100
mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH7.5, 10 mM MgCl2 , 10 mM
ベータ−メルカプトエタノール）に溶解した80μg/ml
のpBR328セシウム精製ＤＮＡ 100μl を調製して行なっ
た。６単位のSspIエンドヌクレアーゼを加え、その混合
物を直ちに３７℃に置いた。３７℃で、１．５、２．
５、３．５、４．５、５．５および６．５分後に15μl
のアリコートを取出した。 SspI 消化物を直ちに７２℃
で１５分間加熱することにより分解を停止させた。各ア
リコートからの 10 μl をアガロースゲル電気泳動によ
って分析した。直線状ＤＮＡの最大量および未切断、超
螺旋状のＤＮＡの最小量を示したものは、 4.5分および
5.5分のサンプルであった。これらの試験管を次の工
程、すなわち SfiI リンカーの pBR328 への挿入のため
に選んだ。 0.6μg のSspI部分消化 pBR328 ＤＮＡ（4.
5 分試験管から 5μl, 5.5分試験管から 2.5μl ）、９
μl の蒸留水、２μl の１０Ｘ結合バッファー（下記の
工程４参照）、1.5 μl の 400u/μl T4 DNAリガーゼ(N
ew England Biolabs, Beverly, Massachusetts) 、４μ
l の、リン酸化していない 200μg/ml SfiI リンカー
（GGCCGCAGCGGCC とGGCCGCTGCGGCC)を一緒に混合し、室
温で一晩インキュベートした。 5μl を E. coliＲＲＩ
細胞に形質転換し、クロラムフェニコールプレート上に
プレーティングした（下記の工程４参照）。１４個の生
存細胞のＤＮＡを、ミニプレパレーション法によって分
析した（下記の工程９参照）。３個の生存細胞におい
て、SfiIリンカーが pBR328 の最初の SspI 部位に挿入
されていることが判明し、この細胞を pEV328-8 と命名
した。
次のようにして、 BclI エンドヌクレアーゼによって切
断した。10 mM Tris pH 7.5, 10 mM MgCl2 , 50 mM Na
Cl,10 mM メルカプトエタノールのバッファーに1700μg
/mlの割合で溶かしたＤＮＡ液21μl を、100 μl アリ
コート１個、50μl アリコート５個に分注した。100 μ
l 試験管に10単位のBclIエンドヌクレアーゼ（New Engl
and Biolabs, Beverly, Massachusetts ）を加え、ＤＮ
Ａ 1μg あたり酵素１単位となるようにした。第１の試
験管から50μl を抜取り、第２の試験管に移し入れ、Ｄ
ＮＡ 1μg あたり BclI ０．５単位となるようにした。
以下、同じ工程に従って、後続の試験管の各々に、直前
の試験管の BclI 含有量の半分を加える。これらの試験
管を３７℃で１時間インキュベートし、次に、７２℃で
１５分間熱処理し、それぞれから15μl を取り、これを
アガロースゲル電気泳動によって分析した。中程度で、
不完全な消化を示す試験管を、クローニング用の部分消
化フラグメントのソースとして選び、完全に消化された
ＤＮＡは、別に、一緒に混ぜ合わせた。（部分消化試験
管は0.25 u／μg, 0.12 u/μg, 0.06 u/μg および 0.0
3 u/μg の試験管であり、一方、1.0 u/μg および 0.5
u／μg が完全消化試験管であった。これらの溶液を互
いに混ぜ合わせ、下記の工程４に記載するやり方に従っ
て用いた。）３． pEV328-8-6 の構築： pBR328 ＤＮＡ
（ATCC 37517）を、 SspI エンドヌクレアーゼ（New En
gland Biolabs, Beverly, Massachusetts）を用いて、
部分的に消化した。この消化を、SspIバッファー（100
mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH7.5, 10 mM MgCl2 , 10 mM
ベータ−メルカプトエタノール）に溶解した80μg/ml
のpBR328セシウム精製ＤＮＡ 100μl を調製して行なっ
た。６単位のSspIエンドヌクレアーゼを加え、その混合
物を直ちに３７℃に置いた。３７℃で、１．５、２．
５、３．５、４．５、５．５および６．５分後に15μl
のアリコートを取出した。 SspI 消化物を直ちに７２℃
で１５分間加熱することにより分解を停止させた。各ア
リコートからの 10 μl をアガロースゲル電気泳動によ
って分析した。直線状ＤＮＡの最大量および未切断、超
螺旋状のＤＮＡの最小量を示したものは、 4.5分および
5.5分のサンプルであった。これらの試験管を次の工
程、すなわち SfiI リンカーの pBR328 への挿入のため
に選んだ。 0.6μg のSspI部分消化 pBR328 ＤＮＡ（4.
5 分試験管から 5μl, 5.5分試験管から 2.5μl ）、９
μl の蒸留水、２μl の１０Ｘ結合バッファー（下記の
工程４参照）、1.5 μl の 400u/μl T4 DNAリガーゼ(N
ew England Biolabs, Beverly, Massachusetts) 、４μ
l の、リン酸化していない 200μg/ml SfiI リンカー
（GGCCGCAGCGGCC とGGCCGCTGCGGCC)を一緒に混合し、室
温で一晩インキュベートした。 5μl を E. coliＲＲＩ
細胞に形質転換し、クロラムフェニコールプレート上に
プレーティングした（下記の工程４参照）。１４個の生
存細胞のＤＮＡを、ミニプレパレーション法によって分
析した（下記の工程９参照）。３個の生存細胞におい
て、SfiIリンカーが pBR328 の最初の SspI 部位に挿入
されていることが判明し、この細胞を pEV328-8 と命名
した。
【００６４】pEV328-8の EcoRV部位に第二のリンカーを
挿入するために、２０単位のEcoRV エンドヌクレアーゼ
を含む EcoRVバッファー（150 mM NaCl, 6 mM Tris-HCl
pH8.0, 6 mM MgCl2 , 6 mMベータ−メルカプトエタノ
ール）中の80μg/ml pEV328-8 50μl を３７℃で２時間
インキュベートした。 0.6μg の完全に消化されたＤＮ
Ａを、前記のように、0.8 μg のリンカーと結合させ
た。調べた８個の形質転換体のうち６個が、 pEV328-8
のEcoRV部位にリンカーを含んでいることが判明し、こ
れを pEV328-8-6 と命名した。pEV328-8-6の１サンプル
は、AmericanTypeCulture Collection に ATCC 手得番
号第 63217号で寄託されている。
挿入するために、２０単位のEcoRV エンドヌクレアーゼ
を含む EcoRVバッファー（150 mM NaCl, 6 mM Tris-HCl
pH8.0, 6 mM MgCl2 , 6 mMベータ−メルカプトエタノ
ール）中の80μg/ml pEV328-8 50μl を３７℃で２時間
インキュベートした。 0.6μg の完全に消化されたＤＮ
Ａを、前記のように、0.8 μg のリンカーと結合させ
た。調べた８個の形質転換体のうち６個が、 pEV328-8
のEcoRV部位にリンカーを含んでいることが判明し、こ
れを pEV328-8-6 と命名した。pEV328-8-6の１サンプル
は、AmericanTypeCulture Collection に ATCC 手得番
号第 63217号で寄託されている。
【００６５】４．結合：工程２から得たＤＮＡフラグメ
ントを、次のようにしてpEV328-8-6に結合した。BclIで
完全に消化したS. fimbriatus ＤＮＡ（60μl ） 6μg
と、BclI で部分的に消化したS. fimbriatus ＤＮＡ（6
0μl ） 6μg とをそれぞれBamHI で切断し、脱リン酸
化した3.0 μg の pEV328-8-6 (7.5μl)と混合した。20
μl の１０Ｘ結合用混合液（500 mM Tris, pH 7.5, 100
mM MgCl2 , 100 mM DTT, 5mM ATP）を加え、さらに 1
10.5μl の滅菌蒸留水を加え、最終容量を 198μl とし
た。1.875 μl の濃厚な T4 DNA リガーゼ(2×106 u/m
l) を加え、混合液を１６℃で４時間インキュベート
し、次いで、10μl のクロロホルムを加えて滅菌した。
結合ＤＮＡ約 125μl を用いて、次のようにして、E. c
oli ＲＲ１株の形質転換を行なった。このＤＮＡを 1.0
ml のSSC/CaCl2 （50 mM NaCl, 5 mMクエン酸ナトリウ
ム、67 mM CaCl2 ）と氷上で混合し、氷冷E. coli ＲＲ
１のコンピテント細胞（hsd Ｒ- Ｍ- , ATCC No. 3134
3) 2.0 mlを添加した。４２℃で５分間インキュベート
した後、細胞にルリア−ブロス（Ｌ−ブロス）を８ml加
えて希釈し、次いで、これを３７℃で１時間インキュベ
ートした。
ントを、次のようにしてpEV328-8-6に結合した。BclIで
完全に消化したS. fimbriatus ＤＮＡ（60μl ） 6μg
と、BclI で部分的に消化したS. fimbriatus ＤＮＡ（6
0μl ） 6μg とをそれぞれBamHI で切断し、脱リン酸
化した3.0 μg の pEV328-8-6 (7.5μl)と混合した。20
μl の１０Ｘ結合用混合液（500 mM Tris, pH 7.5, 100
mM MgCl2 , 100 mM DTT, 5mM ATP）を加え、さらに 1
10.5μl の滅菌蒸留水を加え、最終容量を 198μl とし
た。1.875 μl の濃厚な T4 DNA リガーゼ(2×106 u/m
l) を加え、混合液を１６℃で４時間インキュベート
し、次いで、10μl のクロロホルムを加えて滅菌した。
結合ＤＮＡ約 125μl を用いて、次のようにして、E. c
oli ＲＲ１株の形質転換を行なった。このＤＮＡを 1.0
ml のSSC/CaCl2 （50 mM NaCl, 5 mMクエン酸ナトリウ
ム、67 mM CaCl2 ）と氷上で混合し、氷冷E. coli ＲＲ
１のコンピテント細胞（hsd Ｒ- Ｍ- , ATCC No. 3134
3) 2.0 mlを添加した。４２℃で５分間インキュベート
した後、細胞にルリア−ブロス（Ｌ−ブロス）を８ml加
えて希釈し、次いで、これを３７℃で１時間インキュベ
ートした。
【００６６】５．一次細胞ライブラリー：形質転換を行
なった細胞培養物を簡単に遠心し、上清を捨て、細胞を
1.0 ml のＬ−ブロス中に再懸濁した。200 μl ずつの
分液を、100 μg/mlのアンピシリンを含むルリア−アガ
−（Ｌ−アガ−）プレートにプレーティングし、３７℃
で一晩インキュベーションした後、これらのプレートを
それぞれ、10 mM Tris, pH 7.5, 10 mM MgCl2 の 2.5 m
l で浸潤させ、形質転換を行なったコロニーを一つにか
き集めて、これを一次細胞ライブラリーとした。
なった細胞培養物を簡単に遠心し、上清を捨て、細胞を
1.0 ml のＬ−ブロス中に再懸濁した。200 μl ずつの
分液を、100 μg/mlのアンピシリンを含むルリア−アガ
−（Ｌ−アガ−）プレートにプレーティングし、３７℃
で一晩インキュベーションした後、これらのプレートを
それぞれ、10 mM Tris, pH 7.5, 10 mM MgCl2 の 2.5 m
l で浸潤させ、形質転換を行なったコロニーを一つにか
き集めて、これを一次細胞ライブラリーとした。
【００６７】６．一次プラスミドライブラリー：一次プ
ラスミドライブラリーの調製は以下のようにして行なっ
た。2.5 mlの一次細胞ライブラリーを、100 μｇ／mlア
ンピシリンを含む、500 mlのＬ−ブロス中に接種した。
この培養物を３７℃で一晩振盪し、次に 4000 rpm で５
分間遠心した。上清を捨て、細胞ペレットを25％スクロ
ース、50 mM Tris, pH 8.0 10 ml中に再懸濁した。0.25
M EDTA, pH 8.0 5mlを加え、その後、0.25 M Tris, pH
8.0 に 10 mg/ml で溶解したライソゾーム3 mlを加え
た。この溶液を氷上に３時間放置し、この中に溶解用混
合液（1% TritonX-100, 50 mM Tris, pH 8.0, 67 mM ED
TA ） 12 mlを強制的にピペット注入し、細胞懸濁液を
穏やかに撹拌し、完全に溶解した。
ラスミドライブラリーの調製は以下のようにして行なっ
た。2.5 mlの一次細胞ライブラリーを、100 μｇ／mlア
ンピシリンを含む、500 mlのＬ−ブロス中に接種した。
この培養物を３７℃で一晩振盪し、次に 4000 rpm で５
分間遠心した。上清を捨て、細胞ペレットを25％スクロ
ース、50 mM Tris, pH 8.0 10 ml中に再懸濁した。0.25
M EDTA, pH 8.0 5mlを加え、その後、0.25 M Tris, pH
8.0 に 10 mg/ml で溶解したライソゾーム3 mlを加え
た。この溶液を氷上に３時間放置し、この中に溶解用混
合液（1% TritonX-100, 50 mM Tris, pH 8.0, 67 mM ED
TA ） 12 mlを強制的にピペット注入し、細胞懸濁液を
穏やかに撹拌し、完全に溶解した。
【００６８】溶解後、混合液を50 ml のプラスチック製
遠心管に移し、 17000 rpm, ４℃で、４５分間遠心し
た。上清をピペットで取出した。20.0 gm の固体 CsCl
を秤量し、50 ml のねじ込みキャップ付きプラスチック
管に投じ、22.0 gm の上清をこの試験管にピペットで注
入し、混合した。臭化エチジウム液（10 mM Tris, pH
8.0, 1mM EDTA, 100 mM NaCl中に、臭化エチジウムを 5
mg/mlの割合で溶解したもの）1.0 mlをこの混合液に加
えた。この溶液を、２個の、５／８インチ×３インチの
ポリアロマー製遠心管に移し、密閉した。次ぎにこれら
の管を、BeckmanTi70ローターで、44000 rpm,１７℃で
４２時間遠心した。プラスミドを回収するために、この
管の頂上をメスで貫き、２つの蛍光性ＤＮＡバンドのう
ち低い方のバンドを紫外線下で注射器を使って回収し
た。両方の管の、低い方のバンドをまとめて、ねじ込み
ふた付きガラス管に投じ、臭化エチジウムを等量の水飽
和氷冷Ｎ−ブタノールで４回抽出することによって除去
した。
遠心管に移し、 17000 rpm, ４℃で、４５分間遠心し
た。上清をピペットで取出した。20.0 gm の固体 CsCl
を秤量し、50 ml のねじ込みキャップ付きプラスチック
管に投じ、22.0 gm の上清をこの試験管にピペットで注
入し、混合した。臭化エチジウム液（10 mM Tris, pH
8.0, 1mM EDTA, 100 mM NaCl中に、臭化エチジウムを 5
mg/mlの割合で溶解したもの）1.0 mlをこの混合液に加
えた。この溶液を、２個の、５／８インチ×３インチの
ポリアロマー製遠心管に移し、密閉した。次ぎにこれら
の管を、BeckmanTi70ローターで、44000 rpm,１７℃で
４２時間遠心した。プラスミドを回収するために、この
管の頂上をメスで貫き、２つの蛍光性ＤＮＡバンドのう
ち低い方のバンドを紫外線下で注射器を使って回収し
た。両方の管の、低い方のバンドをまとめて、ねじ込み
ふた付きガラス管に投じ、臭化エチジウムを等量の水飽
和氷冷Ｎ−ブタノールで４回抽出することによって除去
した。
【００６９】抽出液を透析チューブに移し、ＤＮＡバッ
ファーを４回変えて、２４時間透析した。次に、透析し
たＤＮＡ溶液をあらかじめ秤量しておいた 50 mlの滅菌
遠心管に移し、その容量を測定した。5 M NaClを最終濃
度が 0.4 Mになるように加え、次に２倍容量のイソプロ
パノールを加えて、混合した。この溶液を−２０℃で一
晩保存し、ＤＮＡを沈澱させた。沈澱後、溶液を 15000
rpm, ０℃で１５分間遠心し、上清を捨てた。この管を
実験台に放置し、１５分間空気乾燥し、次にＤＮＡペレ
ットを 500μl のＤＮＡバッファーに溶解し、−２０℃
で保存した。このようにして調製したプラスミドのＤＮ
Ａ濃度は、100-200 μg/mlであった。
ファーを４回変えて、２４時間透析した。次に、透析し
たＤＮＡ溶液をあらかじめ秤量しておいた 50 mlの滅菌
遠心管に移し、その容量を測定した。5 M NaClを最終濃
度が 0.4 Mになるように加え、次に２倍容量のイソプロ
パノールを加えて、混合した。この溶液を−２０℃で一
晩保存し、ＤＮＡを沈澱させた。沈澱後、溶液を 15000
rpm, ０℃で１５分間遠心し、上清を捨てた。この管を
実験台に放置し、１５分間空気乾燥し、次にＤＮＡペレ
ットを 500μl のＤＮＡバッファーに溶解し、−２０℃
で保存した。このようにして調製したプラスミドのＤＮ
Ａ濃度は、100-200 μg/mlであった。
【００７０】７．工程６で得たプラスミドライブラリー
108μl (100μｇ) を、0.01% SDS を含む 1％アガロー
スゲル中で４時間電気泳動した。長波長ＵＶを用いてゲ
ルを視覚化し、親ベクターよりも移動の遅いプラスミド
（例えば、−2.8 kbマーカー（この位置を pEV328-8-6
超螺旋状プラスミドが移動する）の上部にあるものはす
べて）をゲルから切断し、清潔なカミソリの刃を用いて
細かく切り刻んだ。この混合液を、２２ゲージ注射器に
よって、0.01% SDS を含む5 mlの１×アガロースゲルバ
ッファー中に強制注入し、17000 rpm で４５分間遠心し
た。0.5 mlの 5M NaClと 1.1 ml のイソプロパノールを
加え、−２０℃で一晩かけてこの上清を沈澱させた。こ
のＤＮＡを15000 rpm で１５分間遠心し、ペレット化し
た。このペレットを、10 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA 500
μl に再懸濁し、フェノール／クロロホルム抽出し、ク
ロロホルム抽出を３回行い、48μl の 5M NaClと1100μ
l のイソプロパノールを加え、再び−２０℃で３時間か
けて沈澱させた。このペレットを70％イソプロパノール
ですすぎ、空気乾燥し、10 mM Tris pH8, 1mM EDTAの最
終容量100μl 中に再懸濁した。
108μl (100μｇ) を、0.01% SDS を含む 1％アガロー
スゲル中で４時間電気泳動した。長波長ＵＶを用いてゲ
ルを視覚化し、親ベクターよりも移動の遅いプラスミド
（例えば、−2.8 kbマーカー（この位置を pEV328-8-6
超螺旋状プラスミドが移動する）の上部にあるものはす
べて）をゲルから切断し、清潔なカミソリの刃を用いて
細かく切り刻んだ。この混合液を、２２ゲージ注射器に
よって、0.01% SDS を含む5 mlの１×アガロースゲルバ
ッファー中に強制注入し、17000 rpm で４５分間遠心し
た。0.5 mlの 5M NaClと 1.1 ml のイソプロパノールを
加え、−２０℃で一晩かけてこの上清を沈澱させた。こ
のＤＮＡを15000 rpm で１５分間遠心し、ペレット化し
た。このペレットを、10 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA 500
μl に再懸濁し、フェノール／クロロホルム抽出し、ク
ロロホルム抽出を３回行い、48μl の 5M NaClと1100μ
l のイソプロパノールを加え、再び−２０℃で３時間か
けて沈澱させた。このペレットを70％イソプロパノール
ですすぎ、空気乾燥し、10 mM Tris pH8, 1mM EDTAの最
終容量100μl 中に再懸濁した。
【００７１】８．プラスミドプールの消化：ゲル精製し
た一次プラスミドプールを下記にしたがって消化し、非
SfiI メチラーゼクローンを破壊した。プラスミドＤＮ
Ａを、10mM Tris pH 8.0, 10 mM MgCl2 , 10 mM メルカ
プトエタノール、50 mM NaClに溶解して、50μg/mlまで
希釈した。総計 120μl を調製した。8 u/μg のSfiIを
加え、その混合液を５０℃で２時間インキュベートし
た。
た一次プラスミドプールを下記にしたがって消化し、非
SfiI メチラーゼクローンを破壊した。プラスミドＤＮ
Ａを、10mM Tris pH 8.0, 10 mM MgCl2 , 10 mM メルカ
プトエタノール、50 mM NaClに溶解して、50μg/mlまで
希釈した。総計 120μl を調製した。8 u/μg のSfiIを
加え、その混合液を５０℃で２時間インキュベートし
た。
【００７２】９．形質転換：各試験管から12.5μl のサ
ンプルを取り、これをE. coli ＲＲ１を形質転換するの
に用いた。３分間加熱し、ルリア−ブロス中で３７℃で
４５分間増殖した後、この細胞／ＤＮＡ混合液を、200
μg/mlクロラムフェニコールを含むＬ−アガ−プレート
にプレーティングした。３７℃で一晩インキュベーショ
ンした後、プレートを調べた。 SfiI を含むプラスミド
ライブラリーの消化によって、形質転換体の数は約１０
3 のファクターまで減少することが判明した。コロニー
を個別にプレートから取り上げた。各コロニーを、ミニ
培養物を調製するために、クロラムフェニコールを含む
Ｌ−ブロス 10 mlに接種した。また、クロラムフェニコ
ールを含むＬ−アガ−レート上に線条接種した。これ
は、マスター保存液を調製するためである。
ンプルを取り、これをE. coli ＲＲ１を形質転換するの
に用いた。３分間加熱し、ルリア−ブロス中で３７℃で
４５分間増殖した後、この細胞／ＤＮＡ混合液を、200
μg/mlクロラムフェニコールを含むＬ−アガ−プレート
にプレーティングした。３７℃で一晩インキュベーショ
ンした後、プレートを調べた。 SfiI を含むプラスミド
ライブラリーの消化によって、形質転換体の数は約１０
3 のファクターまで減少することが判明した。コロニー
を個別にプレートから取り上げた。各コロニーを、ミニ
培養物を調製するために、クロラムフェニコールを含む
Ｌ−ブロス 10 mlに接種した。また、クロラムフェニコ
ールを含むＬ−アガ−レート上に線条接種した。これ
は、マスター保存液を調製するためである。
【００７３】１０．生存個体の分析：工程９で得た生存
コロニーのうち１０個を、10 ml 培養液中で増殖し、そ
れらのコロニーが保有するプラスミドを、下記のミニプ
レパレーション精製法によって調製した。この精製法は
Birnboinと Doly の方法に習ったものである（Nucleic
Acids Res. 7: 1513 (1979) ）。
コロニーのうち１０個を、10 ml 培養液中で増殖し、そ
れらのコロニーが保有するプラスミドを、下記のミニプ
レパレーション精製法によって調製した。この精製法は
Birnboinと Doly の方法に習ったものである（Nucleic
Acids Res. 7: 1513 (1979) ）。
【００７４】ミニプレパレーション法：各培養物を 800
0 rpm で５分間遠心し、上清を捨て、細胞ペレットを、
1mg/mlライソゾームを含む 25 mM Tris, 10 mM EDTA, 5
0 mMグルコース、pH 8.0中に再懸濁した。室温で10分放
置後、各試験管に、0.2M NaOH,1% SDSの 2.0 ml を加
え、試験管を振盪して細胞を溶解し、氷上に置いた。一
旦溶液を澄明にした後、1.5 mlの 3M 酢酸ナトリウム、
pH 4.8を各試験管に加え、振とうした。ここに形成され
た沈澱を、 15000 rpm, ４℃で、１０分間遠心分離し
た。各上清を3 mlのイソプロパノールを含む遠心管に注
ぎ、混合した。室温で１０分間放置後、各管を再び 150
00 rpmで１０分管遠心し、沈澱した核酸のペレットを得
た。上清を捨て、ペレットを室温で３０分間空気乾燥し
た。
0 rpm で５分間遠心し、上清を捨て、細胞ペレットを、
1mg/mlライソゾームを含む 25 mM Tris, 10 mM EDTA, 5
0 mMグルコース、pH 8.0中に再懸濁した。室温で10分放
置後、各試験管に、0.2M NaOH,1% SDSの 2.0 ml を加
え、試験管を振盪して細胞を溶解し、氷上に置いた。一
旦溶液を澄明にした後、1.5 mlの 3M 酢酸ナトリウム、
pH 4.8を各試験管に加え、振とうした。ここに形成され
た沈澱を、 15000 rpm, ４℃で、１０分間遠心分離し
た。各上清を3 mlのイソプロパノールを含む遠心管に注
ぎ、混合した。室温で１０分間放置後、各管を再び 150
00 rpmで１０分管遠心し、沈澱した核酸のペレットを得
た。上清を捨て、ペレットを室温で３０分間空気乾燥し
た。
【００７５】一旦乾燥したら、そのペレットを、10 mM
Tris, 1mM EDTA pH8.0 850μl に再懸濁した。75μl
の 5M NaClを各懸濁液に加え、その溶液を、 575μl の
イソプロパノールを含むエッペンドルフ管に移し、再び
１０分間室温で沈澱させた。次に、この管を微小遠心器
で４５秒管遠心し、上清を捨て、ペレットを空気乾燥し
た。次にペレットを 100μg/mlの RNaseを含む 10 mM T
ris, 1 mM EDTA, pH8.0 500μl に溶解し、３７℃で１
時間インキュベートし、ＲＮＡを消化した。50μl の 5
M NaCl を加え、さらにその後 350μl のイソプロパノ
ールを加えて、ＤＮＡをもう一度沈澱させた。室温で１
０分間放置後、ＤＮＡを４５秒間遠心し、上清を捨て、
ペレットを、 150μl の10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.
0 最終溶液に再び溶かした。次いで、プラスミドミニプ
レパレーションを SfiI で消化して分析した。
Tris, 1mM EDTA pH8.0 850μl に再懸濁した。75μl
の 5M NaClを各懸濁液に加え、その溶液を、 575μl の
イソプロパノールを含むエッペンドルフ管に移し、再び
１０分間室温で沈澱させた。次に、この管を微小遠心器
で４５秒管遠心し、上清を捨て、ペレットを空気乾燥し
た。次にペレットを 100μg/mlの RNaseを含む 10 mM T
ris, 1 mM EDTA, pH8.0 500μl に溶解し、３７℃で１
時間インキュベートし、ＲＮＡを消化した。50μl の 5
M NaCl を加え、さらにその後 350μl のイソプロパノ
ールを加えて、ＤＮＡをもう一度沈澱させた。室温で１
０分間放置後、ＤＮＡを４５秒間遠心し、上清を捨て、
ペレットを、 150μl の10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.
0 最終溶液に再び溶かした。次いで、プラスミドミニプ
レパレーションを SfiI で消化して分析した。
【００７６】１１．メチラーゼ遺伝子クローン（pEV123
RM612-16と命名）。９個のプラスミドが SfiI に抵抗性
を示し、3.9kb BclI フラグメントを保有していること
が判明した（図３参照）。いずれの場合も、フラグメン
トは、プラスミドのテトラサイクリン耐性遺伝子プロモ
ーターに関して同一方向にあった。次ぎに、これら９個
のプラスミドは SfiI 修飾メチラーゼ遺伝子を保有する
ことが分かった。これは次のようにして証明された。す
なわち、以下に示すように、 BclI 挿入物を欠失し、残
余のベクターに、無傷の切断可能な SfiI 部位があるか
どうかチェックすることによって、さらにはまた、E. c
oli から調製した抽出物について、 in vitro で修飾メ
チラーゼアッセイを実施することによって、確かめた。
但し、このE. coli 中には、形質転換によってプラスミ
ドを移入した。
RM612-16と命名）。９個のプラスミドが SfiI に抵抗性
を示し、3.9kb BclI フラグメントを保有していること
が判明した（図３参照）。いずれの場合も、フラグメン
トは、プラスミドのテトラサイクリン耐性遺伝子プロモ
ーターに関して同一方向にあった。次ぎに、これら９個
のプラスミドは SfiI 修飾メチラーゼ遺伝子を保有する
ことが分かった。これは次のようにして証明された。す
なわち、以下に示すように、 BclI 挿入物を欠失し、残
余のベクターに、無傷の切断可能な SfiI 部位があるか
どうかチェックすることによって、さらにはまた、E. c
oli から調製した抽出物について、 in vitro で修飾メ
チラーゼアッセイを実施することによって、確かめた。
但し、このE. coli 中には、形質転換によってプラスミ
ドを移入した。
【００７７】テストするクローンの 500 ml 培養液を、
100 μg/mlアンピシリンを含むＬ−ブロス中で、３７℃
で一晩増殖させ、この細胞を、4000 rpmで、５分間遠心
してペレットにした。上清は捨て、ペレットを 7.5 ml
の超音波処理用バッファー（20mM Ｋ3 ＰＯ4 pH 7.4,
10 mMベータ−メルカプトエタノール）に再懸濁した。
一旦再懸濁したら、細胞を１５秒間ずつ３回超音波処理
して、細胞を破砕した。超音波処理細胞を10,000 rpmで
１５分間遠心し、上清を細胞抽出物として用いた。この
抽出物を、下記のように、1 mlのフォスフォセルロース
カラムで、４℃で精製した。すなわち、0.4 mlの 2M KC
l を抽出物に加え、最終濃度が0.1M KClとなるようにし
た。カラムは、3-4 mlの0.1M KCl, 20mM K3 PO4 pH 7.
4, 10mM ベータ−メルカプトエタノール、５％グリセロ
ールで平衡化させた。抽出物をこのカラムにロードし、
溶出液を５滴ずつの画分として収集した。カラムを3.5
mlの前記バッファーで洗浄し、次いで、0.3M濃度の KCl
を含む前記バッファー3.5mlで、さらに0.5M濃度の KCl
を含む前記バッファーで、最後に、0.7M濃度の KClを含
む前記バッファーで、洗浄した。各５滴画分の電気伝導
度を記録し、どの画分がＫＣｌ濃度の最初の増加を含む
ものかを決めた。これらの試験管について、下記のよう
にして、メチラーゼ活性をアッセイした。１μl のカラ
ム画分を、メチラーゼバッファー（50mM Tris, pH7.5,
10mM EDTA, 5mMベータ−メルカプトエタノール、0.1mM
Ｓ−アデノシルメチオニン）に T4 DNA を 50 μg/mlの
割合で溶かした溶液50μl に加えた。３７℃で１時間放
置後、下記の混合物の50μl を、各試験管に加えた。そ
の混合物の成分は、50mM Tris, pH 8.0, 40mM MgCl2 ,5
mM ベータ−メルカプトエタノール、80 units／mlの Sf
iI エンドヌクレアーゼ、100mM NaClである。それぞれ
100μl を含む試験管を、５０℃で１時間インキュベー
トした。各試験管から25μl のサンプルを取り、これを
ゲル電気泳動によって分析した。0.3Mと 0.5M KCl を含
む試験管は、１ml当り約 2500 単位の力価に相当するメ
チラーゼ活性を含んでいることが分かった。これは湿潤
細胞ペースト１グラム当り約 6000 単位のSfiI メチラ
ーゼに相当する。（図６参照）。
100 μg/mlアンピシリンを含むＬ−ブロス中で、３７℃
で一晩増殖させ、この細胞を、4000 rpmで、５分間遠心
してペレットにした。上清は捨て、ペレットを 7.5 ml
の超音波処理用バッファー（20mM Ｋ3 ＰＯ4 pH 7.4,
10 mMベータ−メルカプトエタノール）に再懸濁した。
一旦再懸濁したら、細胞を１５秒間ずつ３回超音波処理
して、細胞を破砕した。超音波処理細胞を10,000 rpmで
１５分間遠心し、上清を細胞抽出物として用いた。この
抽出物を、下記のように、1 mlのフォスフォセルロース
カラムで、４℃で精製した。すなわち、0.4 mlの 2M KC
l を抽出物に加え、最終濃度が0.1M KClとなるようにし
た。カラムは、3-4 mlの0.1M KCl, 20mM K3 PO4 pH 7.
4, 10mM ベータ−メルカプトエタノール、５％グリセロ
ールで平衡化させた。抽出物をこのカラムにロードし、
溶出液を５滴ずつの画分として収集した。カラムを3.5
mlの前記バッファーで洗浄し、次いで、0.3M濃度の KCl
を含む前記バッファー3.5mlで、さらに0.5M濃度の KCl
を含む前記バッファーで、最後に、0.7M濃度の KClを含
む前記バッファーで、洗浄した。各５滴画分の電気伝導
度を記録し、どの画分がＫＣｌ濃度の最初の増加を含む
ものかを決めた。これらの試験管について、下記のよう
にして、メチラーゼ活性をアッセイした。１μl のカラ
ム画分を、メチラーゼバッファー（50mM Tris, pH7.5,
10mM EDTA, 5mMベータ−メルカプトエタノール、0.1mM
Ｓ−アデノシルメチオニン）に T4 DNA を 50 μg/mlの
割合で溶かした溶液50μl に加えた。３７℃で１時間放
置後、下記の混合物の50μl を、各試験管に加えた。そ
の混合物の成分は、50mM Tris, pH 8.0, 40mM MgCl2 ,5
mM ベータ−メルカプトエタノール、80 units／mlの Sf
iI エンドヌクレアーゼ、100mM NaClである。それぞれ
100μl を含む試験管を、５０℃で１時間インキュベー
トした。各試験管から25μl のサンプルを取り、これを
ゲル電気泳動によって分析した。0.3Mと 0.5M KCl を含
む試験管は、１ml当り約 2500 単位の力価に相当するメ
チラーゼ活性を含んでいることが分かった。これは湿潤
細胞ペースト１グラム当り約 6000 単位のSfiI メチラ
ーゼに相当する。（図６参照）。
【００７８】１２．この抽出物についてさらに制限エン
ドヌクレアーゼ活性もアッセイした。それには、各カラ
ム画分 1μl に、50mM Tris pH8, 50mM NaCl,10mM MgCl
2 ,10mMベータ−メルカプトエタノール、50μg/ml T4 D
NA の35μl を加え、これを５０℃で１時間インキュベ
ートした。25μl のサンプルを電気泳動で分析したが、
制限エンドヌクレアーゼ活性の証拠は見られなかった。
ドヌクレアーゼ活性もアッセイした。それには、各カラ
ム画分 1μl に、50mM Tris pH8, 50mM NaCl,10mM MgCl
2 ,10mMベータ−メルカプトエタノール、50μg/ml T4 D
NA の35μl を加え、これを５０℃で１時間インキュベ
ートした。25μl のサンプルを電気泳動で分析したが、
制限エンドヌクレアーゼ活性の証拠は見られなかった。
【００７９】１３．3.9 kb BclI 挿入物内のメチラーゼ
遺伝子の位置： SfiI メチラーゼクローンを多数の制限
エンドヌクレアーゼで消化し、クローン化ＤＮＡの制限
マップを得た。このマップを用い、挿入物内の様々の領
域を欠失して、その結果がメチル化にどのような影響を
及ぼすかを測定した。次ぎに、3.9 kb挿入物内の約１kb
メチラーゼ遺伝子の位置を決め、さらにこの遺伝子のい
ずれか一方の側のクローン化ＤＮＡの長さが約 0.6 kb
と約 2 kb であることを明らかにした。メチラーゼクロ
ーンは、メチラーゼ遺伝子の左側には結合した制限エン
ドヌクレアーゼ遺伝子をコードするのに十分なＤＮＡ
（0.6 kb）を含んでおらず、またその右側にも十分なＤ
ＮＡ（約 2 kb ）を恐らく含んではいないようであっ
た。というのは、この２遺伝子間の距離、これら遺伝子
の正確な大きさ、および両遺伝子が結合しているのか否
かが不明だからである（図４参照）。このクローンに S
fiI エンドヌクレアーゼ活性が見られないことから、制
限遺伝子はクローン中に存在しないか、または存在はし
ているが発現しないか、のどちらかであることが明らか
となった。制限遺伝子が存在しているが、発現しない場
合、メチラーゼクローンのＤＮＡ配列および蛋白質配列
決定を行い、クローン中に制限遺伝子の一部があるの
か、全部があるのか、全部が無いのかを決定した。これ
を、工程１９−２１に記載するやり方に従って行なっ
た。制限遺伝子全部が無い場合、メチラーゼ遺伝子に隣
接するＤＮＡの大領域のクローニングを、工程１４−１
８に記載するやり方に従って実施した。
遺伝子の位置： SfiI メチラーゼクローンを多数の制限
エンドヌクレアーゼで消化し、クローン化ＤＮＡの制限
マップを得た。このマップを用い、挿入物内の様々の領
域を欠失して、その結果がメチル化にどのような影響を
及ぼすかを測定した。次ぎに、3.9 kb挿入物内の約１kb
メチラーゼ遺伝子の位置を決め、さらにこの遺伝子のい
ずれか一方の側のクローン化ＤＮＡの長さが約 0.6 kb
と約 2 kb であることを明らかにした。メチラーゼクロ
ーンは、メチラーゼ遺伝子の左側には結合した制限エン
ドヌクレアーゼ遺伝子をコードするのに十分なＤＮＡ
（0.6 kb）を含んでおらず、またその右側にも十分なＤ
ＮＡ（約 2 kb ）を恐らく含んではいないようであっ
た。というのは、この２遺伝子間の距離、これら遺伝子
の正確な大きさ、および両遺伝子が結合しているのか否
かが不明だからである（図４参照）。このクローンに S
fiI エンドヌクレアーゼ活性が見られないことから、制
限遺伝子はクローン中に存在しないか、または存在はし
ているが発現しないか、のどちらかであることが明らか
となった。制限遺伝子が存在しているが、発現しない場
合、メチラーゼクローンのＤＮＡ配列および蛋白質配列
決定を行い、クローン中に制限遺伝子の一部があるの
か、全部があるのか、全部が無いのかを決定した。これ
を、工程１９−２１に記載するやり方に従って行なっ
た。制限遺伝子全部が無い場合、メチラーゼ遺伝子に隣
接するＤＮＡの大領域のクローニングを、工程１４−１
８に記載するやり方に従って実施した。
【００８０】１４．隣接領域のゲノムマップを、メチラ
ーゼクローンの一部をプローブとして用い、Southernブ
ロット技術によって決定した（Southern, E., 1975, J.
Mol. Biol., 98:503 ）。プローブには特に、あらかじ
めゲル精製し、アルファ32P-ATP でニックトランスレー
ションした約 1.7 kb BamHI-KpnIフラグメントを用い
た。ゲル精製は、工程７に記載してある。ゲル精製プロ
ーブのニックトランスレーションは次のようにして行な
った。５μl (0.5μｇ）のDNA, 1.5μl のバッファー
（500mM Tris pH 7.5, 10mM ベータ−メルカプトエタノ
ール、 50mM MgCl2 ）， 1μl のGTC (500 pmoles/μ
l), 5 μl のアルファ−32P-dATP-(100 pmoles， 800キ
ュリー／ミリモル）、2 μl のＤＮＡポリメラーゼＩ
（20単位）および1 μl のDNase Ｉ（1 μg/ml）を混合
し、１６℃で２時間インキュベートした。次にこの混合
物を１０分間煮沸し、その直後に氷上に置いた。
ーゼクローンの一部をプローブとして用い、Southernブ
ロット技術によって決定した（Southern, E., 1975, J.
Mol. Biol., 98:503 ）。プローブには特に、あらかじ
めゲル精製し、アルファ32P-ATP でニックトランスレー
ションした約 1.7 kb BamHI-KpnIフラグメントを用い
た。ゲル精製は、工程７に記載してある。ゲル精製プロ
ーブのニックトランスレーションは次のようにして行な
った。５μl (0.5μｇ）のDNA, 1.5μl のバッファー
（500mM Tris pH 7.5, 10mM ベータ−メルカプトエタノ
ール、 50mM MgCl2 ）， 1μl のGTC (500 pmoles/μ
l), 5 μl のアルファ−32P-dATP-(100 pmoles， 800キ
ュリー／ミリモル）、2 μl のＤＮＡポリメラーゼＩ
（20単位）および1 μl のDNase Ｉ（1 μg/ml）を混合
し、１６℃で２時間インキュベートした。次にこの混合
物を１０分間煮沸し、その直後に氷上に置いた。
【００８１】Southern ブロットの調製は次のようにし
て行なった。S. fimbriatus ＤＮＡを別々に次の制限エ
ンドヌクレアーゼによって消化した。その制限エンドヌ
クレアーゼとは、AseI, BamHI, BclI, ClaI, DraI, Eco
RI, EcoRV, NcoI, NdeI, NheI, NotI, PstI, PvuII, Sa
lI, ScaI, SmaI, SpeI, SphI, XhoIである。消化物を
１．０％アガロースゲル上で電気泳動した。このゲル
を、0.25M HCl に１０分間、0.4M NaOH, 0.8M NaClに３
０分間、0.5M Tris-HCl pH 7.5, 1.5M NaCl に３０分
間、浸潤した。ニトロセルロース紙を短時間水に浸し、
次に 5×SSC （0.75MNaCl, 75mMクエン酸ナトリウム）
に浸した。このゲルを、300 mlの20×SSC （3MNaCl, 0.
3M クエン酸ナトリウム）に浸したクロマトグラフィー
紙(Whatman) の１／２インチ厚積層の最上部に置いた。
この時、バッファーの水位を、積層紙の高さのすぐ下に
来るようにした。ニトロセルロース紙をゲルの最上部に
置き、クロマトグラフィー紙(Whatman) を重ね吸い取り
紙として作用するようにした。このサンドイッチに重石
をかけ、室温で一晩放置して、ゲル内容物がニトロセル
ロース紙に移動するようにした。次に、このニトロセル
ロース紙を、 1×SSC 中で１０分間すすぎ、真空オーブ
ン中で、８０℃で1.5 時間乾燥し、ニトロセルロースに
移動したＤＮＡフラグメントを固定した。この紙を、次
の組成を持つ溶液15mlを含むプラスチック製袋に移し
た。その溶液組成は、3 mlの 10 g/l Ficoll,10 g/lポ
リビニルピロリドン、10 g/l牛血清アルブミン、 4.5 m
l の20×SSC 、1.5 mlの 10% SDS, 3 mlの硫酸デキスト
ラン、3 mlの水である。次いで、振とうしながら６５℃
で３時間インキュベートしてハイブリダイゼーション前
処理を行った。7 μl の放射性標識プローブを袋に加
え、６５℃で振盪しながら一晩インキュベーションを続
けた。次ぎに、ニトロセルロース紙を、0.3M NaCl, 30m
M クエン酸ナトリウムにより、室温で５分間ずつ３回洗
浄した。また、0.5% SDSを含む同じバッファーを用い
て、６５℃で２０分間の洗浄を１回行なった。次にこの
紙を空気乾燥し、一晩オートラジオグラフィー処理をし
た。
て行なった。S. fimbriatus ＤＮＡを別々に次の制限エ
ンドヌクレアーゼによって消化した。その制限エンドヌ
クレアーゼとは、AseI, BamHI, BclI, ClaI, DraI, Eco
RI, EcoRV, NcoI, NdeI, NheI, NotI, PstI, PvuII, Sa
lI, ScaI, SmaI, SpeI, SphI, XhoIである。消化物を
１．０％アガロースゲル上で電気泳動した。このゲル
を、0.25M HCl に１０分間、0.4M NaOH, 0.8M NaClに３
０分間、0.5M Tris-HCl pH 7.5, 1.5M NaCl に３０分
間、浸潤した。ニトロセルロース紙を短時間水に浸し、
次に 5×SSC （0.75MNaCl, 75mMクエン酸ナトリウム）
に浸した。このゲルを、300 mlの20×SSC （3MNaCl, 0.
3M クエン酸ナトリウム）に浸したクロマトグラフィー
紙(Whatman) の１／２インチ厚積層の最上部に置いた。
この時、バッファーの水位を、積層紙の高さのすぐ下に
来るようにした。ニトロセルロース紙をゲルの最上部に
置き、クロマトグラフィー紙(Whatman) を重ね吸い取り
紙として作用するようにした。このサンドイッチに重石
をかけ、室温で一晩放置して、ゲル内容物がニトロセル
ロース紙に移動するようにした。次に、このニトロセル
ロース紙を、 1×SSC 中で１０分間すすぎ、真空オーブ
ン中で、８０℃で1.5 時間乾燥し、ニトロセルロースに
移動したＤＮＡフラグメントを固定した。この紙を、次
の組成を持つ溶液15mlを含むプラスチック製袋に移し
た。その溶液組成は、3 mlの 10 g/l Ficoll,10 g/lポ
リビニルピロリドン、10 g/l牛血清アルブミン、 4.5 m
l の20×SSC 、1.5 mlの 10% SDS, 3 mlの硫酸デキスト
ラン、3 mlの水である。次いで、振とうしながら６５℃
で３時間インキュベートしてハイブリダイゼーション前
処理を行った。7 μl の放射性標識プローブを袋に加
え、６５℃で振盪しながら一晩インキュベーションを続
けた。次ぎに、ニトロセルロース紙を、0.3M NaCl, 30m
M クエン酸ナトリウムにより、室温で５分間ずつ３回洗
浄した。また、0.5% SDSを含む同じバッファーを用い
て、６５℃で２０分間の洗浄を１回行なった。次にこの
紙を空気乾燥し、一晩オートラジオグラフィー処理をし
た。
【００８２】Southernブロットデータから、メチラーゼ
をコードしている６個のフラグメントの正確な大きさが
判明した。NcoI, PstI, PvuII および SalI フラグメン
トはメチラーゼ遺伝子の左側にＤＮＡを保有している。
一方、BamHI および SmaI は右側にＤＮＡを保有してい
る（図５）。このプローブは、PstI消化物およびNcoI消
化物中の単一の 6 kb バンド、SalI消化物中の 8 kb バ
ンド、PvuII 消化物中の5.5 kbバンド、並びにBamHI 消
化物および SmaI 消化物中の20 kbバンドにハイブリダ
イズした。他のバンドは、クローン化するには大きすぎ
ると判断された。
をコードしている６個のフラグメントの正確な大きさが
判明した。NcoI, PstI, PvuII および SalI フラグメン
トはメチラーゼ遺伝子の左側にＤＮＡを保有している。
一方、BamHI および SmaI は右側にＤＮＡを保有してい
る（図５）。このプローブは、PstI消化物およびNcoI消
化物中の単一の 6 kb バンド、SalI消化物中の 8 kb バ
ンド、PvuII 消化物中の5.5 kbバンド、並びにBamHI 消
化物および SmaI 消化物中の20 kbバンドにハイブリダ
イズした。他のバンドは、クローン化するには大きすぎ
ると判断された。
【００８３】１５． 6個のライブラリー（BamHI, NcoI,
PstI, PvuII, SalI, SmaI）は、工程２−６、８−１０
と同一の方法によって構築されおよび選択された（工程
７は行なわなかった）。ただし、工程２と４について
は、次の修正を施した。30μl(30 μg)の SfiI 染色体
ＤＮＡを、過剰の BamHI (150 単位）を含む、300 μl
の 10mM Tris pH 7.5, 10mM MgCl2 , 150mM NaCl, 10mM
メルカプトエタノール中で、３７℃で３時間インキュベ
ートして完全に消化した。全容量を、0.01% SDS を含む
1％アガロースゲル中で５時間電気泳動した。長波長の
ＵＶを用いてゲルを視覚化し、メチラーゼ遺伝子を保有
するフラグメントの既知の大きさの範囲内にあるフラグ
メントをゲルから切り出し、清浄なカミソリの刃で細切
した。このフラグメントを、工程７と同じ方法に従って
精製した。15μl (0.8μg)を、1200単位の T4 DNA リガ
ーゼを含む 1 X結合用バッファー 70 μl 中で、１６℃
で４時間インキュベートし、2 μl (0.8μg)の、BamHI
により切断され脱リン酸化された pEV328-8-6 に結合し
た。70μl すべてがＲＲ１に形質転換した。
PstI, PvuII, SalI, SmaI）は、工程２−６、８−１０
と同一の方法によって構築されおよび選択された（工程
７は行なわなかった）。ただし、工程２と４について
は、次の修正を施した。30μl(30 μg)の SfiI 染色体
ＤＮＡを、過剰の BamHI (150 単位）を含む、300 μl
の 10mM Tris pH 7.5, 10mM MgCl2 , 150mM NaCl, 10mM
メルカプトエタノール中で、３７℃で３時間インキュベ
ートして完全に消化した。全容量を、0.01% SDS を含む
1％アガロースゲル中で５時間電気泳動した。長波長の
ＵＶを用いてゲルを視覚化し、メチラーゼ遺伝子を保有
するフラグメントの既知の大きさの範囲内にあるフラグ
メントをゲルから切り出し、清浄なカミソリの刃で細切
した。このフラグメントを、工程７と同じ方法に従って
精製した。15μl (0.8μg)を、1200単位の T4 DNA リガ
ーゼを含む 1 X結合用バッファー 70 μl 中で、１６℃
で４時間インキュベートし、2 μl (0.8μg)の、BamHI
により切断され脱リン酸化された pEV328-8-6 に結合し
た。70μl すべてがＲＲ１に形質転換した。
【００８４】１６．メチラーゼ遺伝子から下流のＤＮＡ
大領域を保有する新しい BamHIメチラーゼクローンの同
定(pEV123RM603-2と命名) ：工程１５において得られた
１５個の生存菌は、BamHI ライブラリー由来のものであ
り、その内の一つは、 SfiI メチラーゼ遺伝子をコード
する 20kb BamHI フラグメントを保有していることが判
明した。このクローンは、図５に示したように、もとの
BclIクローンと重複しており、また約 1 kb の制限エン
ドヌクレアーゼ遺伝子を、もしそれがメチラーゼ遺伝子
の下流で結合されるとしたならば、コードするのに十分
な長さのＤＮＡを保有していた。メチラーゼ遺伝子の上
流のＤＮＡをクローン化するために構築した４個のライ
ブラリーに対するメチラーゼ選択はうまく行かず（Pst
I, PvuII,SalI, NcoI ）、メチラーゼ遺伝子の上流側は
まだクローン化されないままであった（後述するよう
に、後になって、この原因は発現不能によることが判明
した）。
大領域を保有する新しい BamHIメチラーゼクローンの同
定(pEV123RM603-2と命名) ：工程１５において得られた
１５個の生存菌は、BamHI ライブラリー由来のものであ
り、その内の一つは、 SfiI メチラーゼ遺伝子をコード
する 20kb BamHI フラグメントを保有していることが判
明した。このクローンは、図５に示したように、もとの
BclIクローンと重複しており、また約 1 kb の制限エン
ドヌクレアーゼ遺伝子を、もしそれがメチラーゼ遺伝子
の下流で結合されるとしたならば、コードするのに十分
な長さのＤＮＡを保有していた。メチラーゼ遺伝子の上
流のＤＮＡをクローン化するために構築した４個のライ
ブラリーに対するメチラーゼ選択はうまく行かず（Pst
I, PvuII,SalI, NcoI ）、メチラーゼ遺伝子の上流側は
まだクローン化されないままであった（後述するよう
に、後になって、この原因は発現不能によることが判明
した）。
【００８５】１７．メチラーゼ遺伝子の上流にＤＮＡ大
領域を保有する新しいメチラーゼクローンの手得（PstI
クローンをpEV123RM604-19と命名し、PvuII クローンを
pEV123RM625-11 と命名した）：新しい BamHIクローン
はエンドヌクレアーゼ活性を示さなかったので、メチラ
ーゼ遺伝子の上流部をクローン化しようという試みをさ
らに追求した。古いライブラリーのみならず、新しいが
不成功に終わっていたライブラリーについてもメチラー
ゼを用いてプローブし、これらのライブラリーの中に所
期のフラグメントがクローン化されているのか、それと
も存在しないのか、を調べた。予期しないメチラーゼ遺
伝子を保有するクローンを分離するために、次の工程に
記載するように、Grunstein ブロットを用いた。
領域を保有する新しいメチラーゼクローンの手得（PstI
クローンをpEV123RM604-19と命名し、PvuII クローンを
pEV123RM625-11 と命名した）：新しい BamHIクローン
はエンドヌクレアーゼ活性を示さなかったので、メチラ
ーゼ遺伝子の上流部をクローン化しようという試みをさ
らに追求した。古いライブラリーのみならず、新しいが
不成功に終わっていたライブラリーについてもメチラー
ゼを用いてプローブし、これらのライブラリーの中に所
期のフラグメントがクローン化されているのか、それと
も存在しないのか、を調べた。予期しないメチラーゼ遺
伝子を保有するクローンを分離するために、次の工程に
記載するように、Grunstein ブロットを用いた。
【００８６】１８． Maniatis らの記載したものと同じ
プロトコルを用いて、Grunstein ブロットによる PstI
および PvuIIライブラリーの内から、合計約 3200 個の
コロニーを個別に調べた。この場合も、プローブとし
て、ニックトランスレーションした BamHI-KpnI フラグ
メントを用いた（Maniatis, T.ら，MolecularCloning,C
old Spring Harbor, 1982, p. 313; Grunstein, M.と
D. Hogness,1975, Proc. Natl. Acad. Sci. 72: 396
1）。その開示内容を参照として本明細書に取り入れる
ものとする。細菌コロニーを接触プリントによってニト
ロセルロースフィルターに移動させた。フィルターを、
0.5M NaOH,2M NaClに３０秒間、0.5M Tris-HCl, pH 7.
5, 3M NaClに１分間、0.3M NaCl, 0.03Mクエン酸ナトリ
ウム、 0.1％SDS に５秒間、0.3M NaCl,0.03Mクエン酸
ナトリウムに１０秒間、浸した。フィルターを空気乾燥
し、次ぎに、真空オーブンで、８０℃で３０分間乾燥し
た。このフィルターをハイブリダイゼーション前処理
し、次ぎに、前記の方法を用いて、1.7 kb SfiI メチラ
ーゼ遺伝子プローブとハイブリダイズさせた。フィルタ
ーを空気乾燥し、一晩オートラディオグラフィー処理を
した。
プロトコルを用いて、Grunstein ブロットによる PstI
および PvuIIライブラリーの内から、合計約 3200 個の
コロニーを個別に調べた。この場合も、プローブとし
て、ニックトランスレーションした BamHI-KpnI フラグ
メントを用いた（Maniatis, T.ら，MolecularCloning,C
old Spring Harbor, 1982, p. 313; Grunstein, M.と
D. Hogness,1975, Proc. Natl. Acad. Sci. 72: 396
1）。その開示内容を参照として本明細書に取り入れる
ものとする。細菌コロニーを接触プリントによってニト
ロセルロースフィルターに移動させた。フィルターを、
0.5M NaOH,2M NaClに３０秒間、0.5M Tris-HCl, pH 7.
5, 3M NaClに１分間、0.3M NaCl, 0.03Mクエン酸ナトリ
ウム、 0.1％SDS に５秒間、0.3M NaCl,0.03Mクエン酸
ナトリウムに１０秒間、浸した。フィルターを空気乾燥
し、次ぎに、真空オーブンで、８０℃で３０分間乾燥し
た。このフィルターをハイブリダイゼーション前処理
し、次ぎに、前記の方法を用いて、1.7 kb SfiI メチラ
ーゼ遺伝子プローブとハイブリダイズさせた。フィルタ
ーを空気乾燥し、一晩オートラディオグラフィー処理を
した。
【００８７】メチラーゼ遺伝子とＤＮＡを予期した通り
左側に保有するクローンを、PstI,PvuII 両ライブラリ
ーから分離した。これらクローンは実際、メチラーゼ活
性をほとんど、あるいは全く示さなかった。すなわち、
メチラーゼ遺伝子は、どのベクタープロモーターからも
離れすぎていたからである。これらのクローンと、BamI
I, BclI クローンとの重複部分を図５に示す。
左側に保有するクローンを、PstI,PvuII 両ライブラリ
ーから分離した。これらクローンは実際、メチラーゼ活
性をほとんど、あるいは全く示さなかった。すなわち、
メチラーゼ遺伝子は、どのベクタープロモーターからも
離れすぎていたからである。これらのクローンと、BamI
I, BclI クローンとの重複部分を図５に示す。
【００８８】１９．新しいクローンを回収すると、メチ
ラーゼ遺伝子の両側には、制限エンドヌクレアーゼが結
合されているとした場合、結合遺伝子がどちらの側にコ
ードされるかに関わりなく、制限エンドヌクレアーゼ遺
伝子をコードするのに十分なクローン化ＤＮＡが備わっ
ていた。しかしながら、どのクローンも制限エンドヌク
レアーゼ活性を示さなかった。２個の SfiI Ｒ−Ｍ遺伝
子が結合しているという証拠は依然として得られなかっ
たので、 SfiI 制限エンドヌクレアーゼをできるだけ均
質に近い状態に精製し、これを下記のように蛋白質配列
決定に用いた。
ラーゼ遺伝子の両側には、制限エンドヌクレアーゼが結
合されているとした場合、結合遺伝子がどちらの側にコ
ードされるかに関わりなく、制限エンドヌクレアーゼ遺
伝子をコードするのに十分なクローン化ＤＮＡが備わっ
ていた。しかしながら、どのクローンも制限エンドヌク
レアーゼ活性を示さなかった。２個の SfiI Ｒ−Ｍ遺伝
子が結合しているという証拠は依然として得られなかっ
たので、 SfiI 制限エンドヌクレアーゼをできるだけ均
質に近い状態に精製し、これを下記のように蛋白質配列
決定に用いた。
【００８９】308 ｇのS. fimbriatus から得た１リット
ルの細胞粗抽出物を、下記のカラムに、下記の順序にし
たがって載せた。すなわち、カラム処理は、ヘパリン、
ＤＥＡＥ−セルロース、アフィ−ゲルブルー、monoQ HP
LC, monoS HPLCの順序で行い、これによって９５％以上
の純度の SfiI 制限エンドヌクレアーゼを得た。
ルの細胞粗抽出物を、下記のカラムに、下記の順序にし
たがって載せた。すなわち、カラム処理は、ヘパリン、
ＤＥＡＥ−セルロース、アフィ−ゲルブルー、monoQ HP
LC, monoS HPLCの順序で行い、これによって９５％以上
の純度の SfiI 制限エンドヌクレアーゼを得た。
【００９０】100 μl (2.5μg)の精製 SfiI 制限エンド
ヌクレアーゼを用いて、 Applied Biosystems Model 4
70A 気相蛋白質シークエンサーにより、アミノ末端蛋白
質の配列決定を行なった。最初の２８個のアミノ酸残基
は次のような配列を持っていた。
ヌクレアーゼを用いて、 Applied Biosystems Model 4
70A 気相蛋白質シークエンサーにより、アミノ末端蛋白
質の配列決定を行なった。最初の２８個のアミノ酸残基
は次のような配列を持っていた。
【００９１】メチオニン−ヒスチジン−グルタミン−ア
スパラギン酸−チロシン−アルギニン−グルタミン酸−
ロイシン−未定−ロイシン−アスパラギン酸−グルタミ
ン酸−ロイシン−グルタミン酸−未定−バリン−グルタ
ミン酸−リジン−グルタミン−スレオニン−ロイシン−
アルギニン−未定−イソロイシン−バリン−グルタミン
−アラニン−ロイシン。
スパラギン酸−チロシン−アルギニン−グルタミン酸−
ロイシン−未定−ロイシン−アスパラギン酸−グルタミ
ン酸−ロイシン−グルタミン酸−未定−バリン−グルタ
ミン酸−リジン−グルタミン−スレオニン−ロイシン−
アルギニン−未定−イソロイシン−バリン−グルタミン
−アラニン−ロイシン。
【００９２】２０．制限遺伝子クローンの同定：前記配
列に基づいて、８倍の縮重を持つ14mer ＤＮＡオリゴプ
ローブを構築した。
列に基づいて、８倍の縮重を持つ14mer ＤＮＡオリゴプ
ローブを構築した。
【００９３】 ATGCA(T,C)CA(G,A)GA(C,T)TA 最初の５個のアミノ酸残基だけを選び、これをＤＮＡ配
列の翻訳用とした。これは、ＤＮＡ長を増すことはハイ
ブリダイゼーションの特異性を増すことになるけれど
も、この場合は、縮重をも増すことになり特異性を低下
させるからである。もとのBclIクローン、もとのクロー
ンの上流に重複ＤＮＡを保有するその後のBamHI クロー
ン、もとのクローンの上流に重複ＤＮＡを保有する Pst
I クローンを、各種制限エンドヌクレアーゼによって消
化し、前記の操作法（工程１４）に従ってニトロセルロ
ース上にブロットした。ＤＮＡ 14 mer を２６μl 中で
下記のようにキナーゼ処理した。2.5 μl 10×キナーゼ
バッファー（700mM Tris-HClpH7.6, 100mM MgCl2 , 50m
M DTT, 2.6mM 5′-hydroxyl 末端を持つサケ精子ＤＮ
Ａ），５μl のガンマ32PATP（50μCi), 1μl キナーゼ
（１０単位）で、室温で、１．３時間処理した。この全
容量をハイブリダイゼーション前処理したブロットに加
え、室温で一晩振とうした。ブロットを洗浄し、工程１
４に記載したやり方に従って暴露した。その結果から、
このオリゴマーは、BclI, BamHI クローンの特定位置に
ハイブリダイズするが、PstIクローンにはハイブリダイ
ズしないこと、 SfiI 制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の
開始の正確な位置がメチラーゼクローンの特定の２００
塩基対領域内に特定されること（図５参照）、が分かっ
た。これは、 SfiI Ｒ−Ｍ遺伝子が結合されて、BamHI
クローン上では完全にともにクローン化され、 BclI ク
ローン上では少なくとも部分的にともにクローン化され
ることを示す、間接的ではあるが、確実な証拠である
（工程２１から、BclIクローンも完全なＲ−Ｍ遺伝子を
含むことが明らかになった）。
列の翻訳用とした。これは、ＤＮＡ長を増すことはハイ
ブリダイゼーションの特異性を増すことになるけれど
も、この場合は、縮重をも増すことになり特異性を低下
させるからである。もとのBclIクローン、もとのクロー
ンの上流に重複ＤＮＡを保有するその後のBamHI クロー
ン、もとのクローンの上流に重複ＤＮＡを保有する Pst
I クローンを、各種制限エンドヌクレアーゼによって消
化し、前記の操作法（工程１４）に従ってニトロセルロ
ース上にブロットした。ＤＮＡ 14 mer を２６μl 中で
下記のようにキナーゼ処理した。2.5 μl 10×キナーゼ
バッファー（700mM Tris-HClpH7.6, 100mM MgCl2 , 50m
M DTT, 2.6mM 5′-hydroxyl 末端を持つサケ精子ＤＮ
Ａ），５μl のガンマ32PATP（50μCi), 1μl キナーゼ
（１０単位）で、室温で、１．３時間処理した。この全
容量をハイブリダイゼーション前処理したブロットに加
え、室温で一晩振とうした。ブロットを洗浄し、工程１
４に記載したやり方に従って暴露した。その結果から、
このオリゴマーは、BclI, BamHI クローンの特定位置に
ハイブリダイズするが、PstIクローンにはハイブリダイ
ズしないこと、 SfiI 制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の
開始の正確な位置がメチラーゼクローンの特定の２００
塩基対領域内に特定されること（図５参照）、が分かっ
た。これは、 SfiI Ｒ−Ｍ遺伝子が結合されて、BamHI
クローン上では完全にともにクローン化され、 BclI ク
ローン上では少なくとも部分的にともにクローン化され
ることを示す、間接的ではあるが、確実な証拠である
（工程２１から、BclIクローンも完全なＲ−Ｍ遺伝子を
含むことが明らかになった）。
【００９４】２１．この領域のＤＮＡ配列の決定によっ
て、制限遺伝子の存在が確かめられ、その方向が明らか
にされ、下記の実施例２に示すように、E.coli 中にク
ローン化された制限遺伝子の発現を誘発するための、組
み換えプラスミドを後で操作する際の基礎となるデータ
を得ることができた。
て、制限遺伝子の存在が確かめられ、その方向が明らか
にされ、下記の実施例２に示すように、E.coli 中にク
ローン化された制限遺伝子の発現を誘発するための、組
み換えプラスミドを後で操作する際の基礎となるデータ
を得ることができた。
【００９５】実施例 ２ SfiI 制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の過
剰発現 この領域のＤＮＡ配列決定、詳細なマッピングおよび欠
失データは、多数の方法で、クローン化された SfiI 制
限エンドヌクレアーゼの最大発現を実現するのに用いる
ことができるであろう。
剰発現 この領域のＤＮＡ配列決定、詳細なマッピングおよび欠
失データは、多数の方法で、クローン化された SfiI 制
限エンドヌクレアーゼの最大発現を実現するのに用いる
ことができるであろう。
【００９６】そのような方法の一つは、E. coli が強く
認識するプロモーター、例えば、ラムダ pL を SfiI 制
限エンドヌクレアーゼ遺伝子の開始点の間近に挿入する
ことを含む。強力なプロモーターは、既知の方法を用い
て、適当なベクターに挿入してもよい。このような適切
なベクターの一つとして pGW7 (ATCC 40166)がある。強
力なプロモーターの挿入は、制限遺伝子の両末端近傍に
ある都合のよい制限標的と、ベクター上のプロモーター
近傍の共存可能な制限標的を特定することによって達成
されるし、また、強力なプロモーターの翻訳コントロー
ル下に入るような方向性を持つように、制限遺伝子をベ
クター中に組み込むことによって達成されよう。
認識するプロモーター、例えば、ラムダ pL を SfiI 制
限エンドヌクレアーゼ遺伝子の開始点の間近に挿入する
ことを含む。強力なプロモーターは、既知の方法を用い
て、適当なベクターに挿入してもよい。このような適切
なベクターの一つとして pGW7 (ATCC 40166)がある。強
力なプロモーターの挿入は、制限遺伝子の両末端近傍に
ある都合のよい制限標的と、ベクター上のプロモーター
近傍の共存可能な制限標的を特定することによって達成
されるし、また、強力なプロモーターの翻訳コントロー
ル下に入るような方向性を持つように、制限遺伝子をベ
クター中に組み込むことによって達成されよう。
【００９７】制限遺伝子の開始点からラムダ pL プロモ
ーター 0.5 kb を含む SfiI エンドヌクレアーゼのサブ
クローンは、予期したようなエンドヌクレアーゼの増幅
発現を示さなかった。従って、本発明に従って、本実施
態様を構築しながら、クローン化された SfiI を過剰発
現させるためには、制限遺伝子を遺伝子操作して、それ
がラムダ pL プロモーターの下流 0.5 kb 以内にあるよ
うにしなければならない。
ーター 0.5 kb を含む SfiI エンドヌクレアーゼのサブ
クローンは、予期したようなエンドヌクレアーゼの増幅
発現を示さなかった。従って、本発明に従って、本実施
態様を構築しながら、クローン化された SfiI を過剰発
現させるためには、制限遺伝子を遺伝子操作して、それ
がラムダ pL プロモーターの下流 0.5 kb 以内にあるよ
うにしなければならない。
【００９８】制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の発現レベ
ルは、工程１１−１２に記載されたように、既知の方法
を用いて決定することができる。
ルは、工程１１−１２に記載されたように、既知の方法
を用いて決定することができる。
【００９９】遺伝子の発現を増大させるよう、 SfiI 制
限エンドヌクレアーゼ遺伝子の上流に置かれた強力なリ
ボソーム結合部位を利用することによって、SfiIを過剰
発現させてもよい。Shine と Dalgarno, (1974) Proc.
Natl. Acad. Sci.USA 71,1342-1346 を参照せよ。この
開示内容は参照として本明細書に取り入れるものとす
る。
限エンドヌクレアーゼ遺伝子の上流に置かれた強力なリ
ボソーム結合部位を利用することによって、SfiIを過剰
発現させてもよい。Shine と Dalgarno, (1974) Proc.
Natl. Acad. Sci.USA 71,1342-1346 を参照せよ。この
開示内容は参照として本明細書に取り入れるものとす
る。
【０１００】SfiI 制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の発
現を増大する第三の方法は、部位特異的突然変異誘発あ
るいは再合成によって、その遺伝子のＤＮＡ配列を変
え、それによって、E. coli の中でより効率的に利用さ
れる開始コドンを含むようにするやり方である。
現を増大する第三の方法は、部位特異的突然変異誘発あ
るいは再合成によって、その遺伝子のＤＮＡ配列を変
え、それによって、E. coli の中でより効率的に利用さ
れる開始コドンを含むようにするやり方である。
【０１０１】SfiI 制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の発
現を増大するさらに別の方法は、ＤＮＡ配列に基づい
て、 SfiI 制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の両側にハイ
ブリダイゼーション用にオリゴヌクレオチドプライマー
を設計するやり方である。これは、ＤＮＡポリメラーゼ
連鎖反応を利用して、制限遺伝子を増幅するのである。
増幅されたフラグメントを、pGW7 (ATCC 40166) あるい
は pET3A（William Studier から入手、Brookhaven Na
t. Lab., Upton, New York ）のような発現ベクターに
挿入する。両ベクターとも強力なプロモーターとリボソ
ーム結合部位を含んでいる。
現を増大するさらに別の方法は、ＤＮＡ配列に基づい
て、 SfiI 制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の両側にハイ
ブリダイゼーション用にオリゴヌクレオチドプライマー
を設計するやり方である。これは、ＤＮＡポリメラーゼ
連鎖反応を利用して、制限遺伝子を増幅するのである。
増幅されたフラグメントを、pGW7 (ATCC 40166) あるい
は pET3A（William Studier から入手、Brookhaven Na
t. Lab., Upton, New York ）のような発現ベクターに
挿入する。両ベクターとも強力なプロモーターとリボソ
ーム結合部位を含んでいる。
【０１０２】SfiI 修飾メチラーゼまたはエンドヌクレ
アーゼは、発酵槽中の、適当な抗生物質を含む富裕培養
液中で増殖させることにより、 SfiI 修飾遺伝子と過剰
発現制限遺伝子とを保有するクローンから生産できる。
その後、細胞を遠心分離によって採集し、超音波処理に
よって破砕し、 SfiI メチラーゼおよび制限エンドヌク
レアーゼ活性を含む細胞粗抽出物を得る。
アーゼは、発酵槽中の、適当な抗生物質を含む富裕培養
液中で増殖させることにより、 SfiI 修飾遺伝子と過剰
発現制限遺伝子とを保有するクローンから生産できる。
その後、細胞を遠心分離によって採集し、超音波処理に
よって破砕し、 SfiI メチラーゼおよび制限エンドヌク
レアーゼ活性を含む細胞粗抽出物を得る。
【０１０３】SfiI メチラーゼとエンドヌクレアーゼを
含むこの細胞粗抽出物は、標準的な生成物精製技術、例
えば、アフィニティークロマトグラフィーやイオン交換
クロマトグラフィーによって精製される。
含むこの細胞粗抽出物は、標準的な生成物精製技術、例
えば、アフィニティークロマトグラフィーやイオン交換
クロマトグラフィーによって精製される。
【図１】図１は、 SfiI 制限エンドヌクレアーゼをクロ
ーン化および製造するのに好ましい方法を決めるために
採用された方法を示す。
ーン化および製造するのに好ましい方法を決めるために
採用された方法を示す。
【図２】図２は、図１に示した実際の結果に基づき、 S
fiI 制限エンドヌクレアーゼをクローン化および製造す
るための好ましい方法を示す。クローニング計画の当初
においては、 SfiI Ｒ−Ｍ系をクローニングするのにど
のエンドヌクレアーゼやどの条件が成功に導くのか、ま
たそのクローン内のどこに制限遺伝子や修飾遺伝子があ
るのかが不明であった。クローニング結果、その後のＤ
ＮＡ配列の決定、マッピング、並びに図１および実施例
１に記載したクローンの特性の明示によって、 SfiI Ｒ
−Ｍ系をクローン化および発現するための、以前には知
られていなかった直接経路を明らかにすることができ
た。
fiI 制限エンドヌクレアーゼをクローン化および製造す
るための好ましい方法を示す。クローニング計画の当初
においては、 SfiI Ｒ−Ｍ系をクローニングするのにど
のエンドヌクレアーゼやどの条件が成功に導くのか、ま
たそのクローン内のどこに制限遺伝子や修飾遺伝子があ
るのかが不明であった。クローニング結果、その後のＤ
ＮＡ配列の決定、マッピング、並びに図１および実施例
１に記載したクローンの特性の明示によって、 SfiI Ｒ
−Ｍ系をクローン化および発現するための、以前には知
られていなかった直接経路を明らかにすることができ
た。
【図３】図３は、4.9 kbのクローニングベクター、 pEV
328-8-6 のマップである。pEV328-8-6 は、 pBR328 の
誘導体である。pBR328 EcoRV部位と最初のpBR328Sspl部
位に挿入された SfiI リンカー（GGCCGCa/tGCGGCC ）を
もつ。これは、クロラムフェニコール（cm）耐性であ
り、アンピシリン（ap）耐性であり、テトラサイクリン
（tc）感受性を持つ。
328-8-6 のマップである。pEV328-8-6 は、 pBR328 の
誘導体である。pBR328 EcoRV部位と最初のpBR328Sspl部
位に挿入された SfiI リンカー（GGCCGCa/tGCGGCC ）を
もつ。これは、クロラムフェニコール（cm）耐性であ
り、アンピシリン（ap）耐性であり、テトラサイクリン
（tc）感受性を持つ。
【図４】図４は、 SfiI メチラーゼとエンドヌクレアー
ゼをコードする、もとの 3.9 kb BclI挿入物の制限マッ
プである。
ゼをコードする、もとの 3.9 kb BclI挿入物の制限マッ
プである。
【図５】図５は、クローン化されたStreptomyces fimbr
iatus ＤＮＡの約23kb（全体）の制限マップである。
iatus ＤＮＡの約23kb（全体）の制限マップである。
【図６】図６は、pEV123RM 612-16 の細胞抽出物から得
られた SfiI 修飾メチラーゼ活性を示すアガロースゲル
の写真である。50μg/mlの pEV328-8-6 250μl を１×
メチラーゼバッファー（50 mM Tris,pH 7.5, 10 mM EDT
A, 5 mM BME, 0.1 mM AdoMet ）に溶解して調製した。5
0μl を４本の試験管の各々に入れた。25μl を２本の
試験管の各々に入れ、コントロールとして用いた。 1μ
l のカラム画分を、最初の50μl 管に加え、混合した。
25μl を第２の50μl 管に入れ、混合した。第２の50μ
l 管から25μl を取り、第３の50μl 管に移し、混合し
た。次に、第３の50μl から25μl を取り、第４の50μ
l 管に移し、混合した。全ての試験管を３７℃で１時間
インキュベートした。下記の混合物 250μl を調製し
た。すなわち、 50mM Tris, pH 8.0, 40mM MgCl2 , 5m
M BME, 200単位の SfiI エンドヌクレアーゼ。この混合
物の等容量を、各管に加え（未切断の pEV328-8-6 コン
トロール管を除く）、５０℃で１時間インキュベートし
た。各管から25μl を取り、これをゲル電気泳動により
分析した（ゲル写真参照）。
られた SfiI 修飾メチラーゼ活性を示すアガロースゲル
の写真である。50μg/mlの pEV328-8-6 250μl を１×
メチラーゼバッファー（50 mM Tris,pH 7.5, 10 mM EDT
A, 5 mM BME, 0.1 mM AdoMet ）に溶解して調製した。5
0μl を４本の試験管の各々に入れた。25μl を２本の
試験管の各々に入れ、コントロールとして用いた。 1μ
l のカラム画分を、最初の50μl 管に加え、混合した。
25μl を第２の50μl 管に入れ、混合した。第２の50μ
l 管から25μl を取り、第３の50μl 管に移し、混合し
た。次に、第３の50μl から25μl を取り、第４の50μ
l 管に移し、混合した。全ての試験管を３７℃で１時間
インキュベートした。下記の混合物 250μl を調製し
た。すなわち、 50mM Tris, pH 8.0, 40mM MgCl2 , 5m
M BME, 200単位の SfiI エンドヌクレアーゼ。この混合
物の等容量を、各管に加え（未切断の pEV328-8-6 コン
トロール管を除く）、５０℃で１時間インキュベートし
た。各管から25μl を取り、これをゲル電気泳動により
分析した（ゲル写真参照）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:465） Ｃ１２Ｒ 1:465） ） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:465） Ｃ１２Ｒ 1:465） (56)参考文献 特開 昭61−265094（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−2371（ＪＰ，Ａ) Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅ ｓ．，Ｖｏｌ．12（11），ｐ．4507− 4516（1984) Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．, Ｖｏｌ．155，ｐ．15−21（1987) Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．74，ｐ．281−289 （1988) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 C12N 1/21 C12N 9/16 C12N 9/10 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (5)
- 【請求項１】 ＤＮＡ配列５′ＧＧＣＣＮＮＮＮＮＧＧ
ＣＣ３′を認識して第４番目のＮと第５番目のＮの間で
切断して３塩基３′突出を残すＳｆｉＩ制限エンドヌク
レアーゼをコードし、該ＳｆｉＩ制限エンドヌクレアー
ゼはStreptomyces fimbriatus ATCC 15051に由来し、下
図に示すような制限部位を有する、単離されたＤＮＡセ
グメント。 【化１】 - 【請求項２】 請求項１に記載の単離されたＤＮＡセグ
メントが挿入されているベクターを含む組換えＤＮＡベ
クター。 - 【請求項３】 請求項１に記載の単離されたＤＮＡセグ
メントを含むクローニングベクター。 - 【請求項４】 請求項２または３に記載のベクターによ
り形質転換された宿主細胞。 - 【請求項５】 ＳｆｉＩ制限エンドヌクレアーゼを製造
する方法であって、請求項２または３に記載のベクター
により形質転換された宿主細胞を、上記エンドヌクレア
ーゼの発現に適した条件下で培養することを含む、方
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US46590490A | 1990-01-11 | 1990-01-11 | |
| US465904 | 1990-01-11 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04211378A JPH04211378A (ja) | 1992-08-03 |
| JP3195604B2 true JP3195604B2 (ja) | 2001-08-06 |
Family
ID=23849639
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP01367091A Expired - Lifetime JP3195604B2 (ja) | 1990-01-11 | 1991-01-11 | ＳｆｉＩ制限エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼのクローニングおよび製造方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5637476A (ja) |
| EP (1) | EP0437100B1 (ja) |
| JP (1) | JP3195604B2 (ja) |
| DE (2) | DE437100T1 (ja) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0581436B1 (en) * | 1992-07-07 | 2000-02-09 | New England Biolabs, Inc. | Method for cloning and producing the AatII restriction endonuclease and methylase |
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