JP3156759B2 - Ｈｉｎｃ ＩＩ制限エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡセグメント - Google Patents
Ｈｉｎｃ ＩＩ制限エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡセグメントInfo
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- JP3156759B2 JP3156759B2 JP11991397A JP11991397A JP3156759B2 JP 3156759 B2 JP3156759 B2 JP 3156759B2 JP 11991397 A JP11991397 A JP 11991397A JP 11991397 A JP11991397 A JP 11991397A JP 3156759 B2 JP3156759 B2 JP 3156759B2
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- hinc
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- restriction endonuclease
- endonuclease
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
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- C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、Hinc II 制限エン
ドヌクレアーゼをコードするＤＮＡセグメントに関す
る。
ドヌクレアーゼをコードするＤＮＡセグメントに関す
る。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】制限
エンドヌクレアーゼは、細菌中に天然に生起する酵素の
一種である。制限エンドヌクレアーゼを、混在する他の
細菌成分から精製した場合には、これを実験室で用いて
ＤＮＡ分子を正確な断片に切断することができる。この
特性により、ＤＮＡ分子を唯一のものとして同定するこ
とができ、またその構成遺伝子に分画することができ
る。制限エンドヌクレアーゼは、現代の遺伝子研究にお
ける不可欠の道具であることが立証されている。それら
は生化学的な「鋏」であって、それを用いて遺伝子工学
及び分析が行なわれる。
エンドヌクレアーゼは、細菌中に天然に生起する酵素の
一種である。制限エンドヌクレアーゼを、混在する他の
細菌成分から精製した場合には、これを実験室で用いて
ＤＮＡ分子を正確な断片に切断することができる。この
特性により、ＤＮＡ分子を唯一のものとして同定するこ
とができ、またその構成遺伝子に分画することができ
る。制限エンドヌクレアーゼは、現代の遺伝子研究にお
ける不可欠の道具であることが立証されている。それら
は生化学的な「鋏」であって、それを用いて遺伝子工学
及び分析が行なわれる。
【０００３】制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子に
沿った特定のヌクレオチド配列（「認識配列」）を認識
し、これに結合することにより作用する。一旦結合する
と、それらは該配列内か又はその一方の側で分子を開裂
する。異なる制限エンドヌクレアーゼは異なる認識配列
に対して親和性を有する。百個以上の異なる制限エンド
ヌクレアーゼが、今日までに調べられた数百種の細菌種
の中から同定されている。
沿った特定のヌクレオチド配列（「認識配列」）を認識
し、これに結合することにより作用する。一旦結合する
と、それらは該配列内か又はその一方の側で分子を開裂
する。異なる制限エンドヌクレアーゼは異なる認識配列
に対して親和性を有する。百個以上の異なる制限エンド
ヌクレアーゼが、今日までに調べられた数百種の細菌種
の中から同定されている。
【０００４】細菌は、通常、種当たり少数の制限エンド
ヌクレアーゼしか有していない。エンドヌクレアーゼ
は、それらが由来する細菌に従って命名される。したが
って、例えばHaemophilus aegyptius は、Hae Ｉ、Hae
II、及びHae III と名づけられた３つの異なる制限エン
ドヌクレアーゼを合成する。これらの酵素は、それぞれ
配列(AT)GGCC(AT)、PuGCGCPy及びGGCCを認識し、開裂す
る。一方、Escherichiacoli RY13 は、配列GAATTCを認
識する一つの酵素ＥcoＲＩのみを合成する。
ヌクレアーゼしか有していない。エンドヌクレアーゼ
は、それらが由来する細菌に従って命名される。したが
って、例えばHaemophilus aegyptius は、Hae Ｉ、Hae
II、及びHae III と名づけられた３つの異なる制限エン
ドヌクレアーゼを合成する。これらの酵素は、それぞれ
配列(AT)GGCC(AT)、PuGCGCPy及びGGCCを認識し、開裂す
る。一方、Escherichiacoli RY13 は、配列GAATTCを認
識する一つの酵素ＥcoＲＩのみを合成する。
【０００５】理論に結びつけることを望んでいるわけで
はないが、天然においては、制限エンドヌクレアーゼは
細菌細胞の繁栄に保護的役割を演じている。制限エンド
ヌクレアーゼにより、細菌を破壊するか又はこれに寄生
するウイルス及びプラスミドのような外来ＤＮＡ分子に
よる感染に対し、細菌は抵抗することができる。制限エ
ンドヌクレアーゼは、認識配列が生起するたびに感染Ｄ
ＮＡ分子に結合しこれを開裂することにより、細菌に耐
性を付与する。その結果生じる破壊は感染遺伝子の多く
を不活性化し、そのＤＮＡをエキソヌクレアーゼにより
さらに分解され易くする。
はないが、天然においては、制限エンドヌクレアーゼは
細菌細胞の繁栄に保護的役割を演じている。制限エンド
ヌクレアーゼにより、細菌を破壊するか又はこれに寄生
するウイルス及びプラスミドのような外来ＤＮＡ分子に
よる感染に対し、細菌は抵抗することができる。制限エ
ンドヌクレアーゼは、認識配列が生起するたびに感染Ｄ
ＮＡ分子に結合しこれを開裂することにより、細菌に耐
性を付与する。その結果生じる破壊は感染遺伝子の多く
を不活性化し、そのＤＮＡをエキソヌクレアーゼにより
さらに分解され易くする。
【０００６】細菌防御系の第二の成分は修飾メチラーゼ
である。
である。
【０００７】これらの酵素は制限エンドヌクレアーゼと
相補的であって、細菌がそれ自身のＤＮＡを保護し、そ
のＤＮＡと外来感染ＤＮＡとを区別することができる手
段を提供する。修飾メチラーゼは対応する制限エンドヌ
クレアーゼと同じヌクレオチド認識配列を認識して結合
するが、ＤＮＡを破壊する代わりに、メチル基を付加す
ることによりその配列内のある又は他のヌクレオチドを
化学的に修飾する。メチル化後、認識配列はもはや制限
エンドヌクレアーゼによって結合されないか、あるいは
開裂されない。細菌細胞のＤＮＡは、その修飾メチラー
ゼの活性によって常に十分に修飾され、したがって内因
性制限エンドヌクレアーゼの存在に対して完全に非感受
性である。制限エンドヌクレアーゼ認識及び攻撃に対し
て感受性であるＤＮＡは、未修飾の、したがって同定可
能な外来ＤＮＡだけである。
相補的であって、細菌がそれ自身のＤＮＡを保護し、そ
のＤＮＡと外来感染ＤＮＡとを区別することができる手
段を提供する。修飾メチラーゼは対応する制限エンドヌ
クレアーゼと同じヌクレオチド認識配列を認識して結合
するが、ＤＮＡを破壊する代わりに、メチル基を付加す
ることによりその配列内のある又は他のヌクレオチドを
化学的に修飾する。メチル化後、認識配列はもはや制限
エンドヌクレアーゼによって結合されないか、あるいは
開裂されない。細菌細胞のＤＮＡは、その修飾メチラー
ゼの活性によって常に十分に修飾され、したがって内因
性制限エンドヌクレアーゼの存在に対して完全に非感受
性である。制限エンドヌクレアーゼ認識及び攻撃に対し
て感受性であるＤＮＡは、未修飾の、したがって同定可
能な外来ＤＮＡだけである。
【０００８】遺伝子工学技術の出現により、現在では、
遺伝子をクローン化し、慣用の精製技術によって得られ
るよりも大量に、該遺伝子がコードする蛋白質及び酵素
を産生することが可能である。制限エンドヌクレアーゼ
遺伝子のクローンを単離するためのキーポイントは、そ
れらが10-3〜10-4という低い頻度で生じる場合に、複雑
な「ライブラリー」中の該クローン、即ち「ショットガ
ン」法によって誘導されるクローンの集団を同定するた
めの簡単且つ確実な方法を開発することである。好まし
くは、望ましくない大多数のクローンは破壊され、望ま
しい少数のクローンは生存するというような方法を選択
する必要がある。
遺伝子をクローン化し、慣用の精製技術によって得られ
るよりも大量に、該遺伝子がコードする蛋白質及び酵素
を産生することが可能である。制限エンドヌクレアーゼ
遺伝子のクローンを単離するためのキーポイントは、そ
れらが10-3〜10-4という低い頻度で生じる場合に、複雑
な「ライブラリー」中の該クローン、即ち「ショットガ
ン」法によって誘導されるクローンの集団を同定するた
めの簡単且つ確実な方法を開発することである。好まし
くは、望ましくない大多数のクローンは破壊され、望ま
しい少数のクローンは生存するというような方法を選択
する必要がある。
【０００９】II型制限−修飾系がクローン化される頻度
が増しつつある。第１のクローニング系は、制限エンド
ヌクレアーゼクローンを同定又は選択する手段としてバ
クテリオファージ感染を用いた［Hha II：Mann等、Gene
３：97〜112 (1978)；EocRII：Kosykh等、Molec.gen.Ge
net 178:717 〜719 (1980)；PstI：Walder等、 Proc.Na
t.Acad.Sci.USA 78 ：1503〜1507(1981)］。細菌中に制
限−修飾系が存在すると、細菌はバクテリオファージに
よる感染に抵抗できるため、クローン化された制限−修
飾遺伝子を保有する細胞は、主として、ファージに晒さ
れていたライブラリーから生存細胞として選択的に単離
され得る。しかしながら、この方法はその有用性に限界
があることが判明した。即ち、クローン化された制限−
修飾遺伝子は常に十分なファージ耐性を発現して選択的
な生存を授けるわけではないことが判明した。
が増しつつある。第１のクローニング系は、制限エンド
ヌクレアーゼクローンを同定又は選択する手段としてバ
クテリオファージ感染を用いた［Hha II：Mann等、Gene
３：97〜112 (1978)；EocRII：Kosykh等、Molec.gen.Ge
net 178:717 〜719 (1980)；PstI：Walder等、 Proc.Na
t.Acad.Sci.USA 78 ：1503〜1507(1981)］。細菌中に制
限−修飾系が存在すると、細菌はバクテリオファージに
よる感染に抵抗できるため、クローン化された制限−修
飾遺伝子を保有する細胞は、主として、ファージに晒さ
れていたライブラリーから生存細胞として選択的に単離
され得る。しかしながら、この方法はその有用性に限界
があることが判明した。即ち、クローン化された制限−
修飾遺伝子は常に十分なファージ耐性を発現して選択的
な生存を授けるわけではないことが判明した。
【００１０】別のクローニング法は、プラスミド−ボー
ン(plasmid-borne) として最初に特性化された、E.coli
にクローニングプラスミドを移入する系を含む［EcoRV:
Bougueleret 等、 Nucleic Acids Res.12:3659〜3676(1
984);PaeR7:Gingeras とBrooks,Proc.Natl.Acad.Sci.US
A 80:402〜406 (1983)；Theriault とRoy,Gene19:355〜
359 (1982)；Pvu II：Blumenthal等、J.Bacteriol. 16
4:501〜509,(1985)］。
ン(plasmid-borne) として最初に特性化された、E.coli
にクローニングプラスミドを移入する系を含む［EcoRV:
Bougueleret 等、 Nucleic Acids Res.12:3659〜3676(1
984);PaeR7:Gingeras とBrooks,Proc.Natl.Acad.Sci.US
A 80:402〜406 (1983)；Theriault とRoy,Gene19:355〜
359 (1982)；Pvu II：Blumenthal等、J.Bacteriol. 16
4:501〜509,(1985)］。
【００１１】第３の方法、即ち増大数の系をクローン化
するために使用される方法は、活性メチラーゼ遺伝子を
選択することを含む［例えば、EPO 特許第 193,413号
（1986年 9月 3日公表）、及びBsuRI:Kiss等、Nucleic
Acid Res.13:6403〜6421(1985)参照］。制限及び修飾遺
伝子は近接して結合する傾向があるため、両遺伝子を含
有するクローンは、正に一方の遺伝子について選択する
ことによりしばしば単離され得る。メチル化活性につい
ての選択により、常に完全な制限−修飾系が得られるわ
けではないけれども、その代わりに時々、メチラーゼ遺
伝子のみが得られる［ＢｓｐＲＩ：Szomolanyi等、Gene
10:219〜225(1980) ；ＢｃｎＩ:Janulaitis 等、Gene2
0:197〜204 (1982)；ＢsuＲＩ：KissとBaldauf,Gene 2
1: 111〜119(1983）；並びにＭspＩ：Walder等、J.Bio
l.Chem.258:1235〜1241(1983)］。
するために使用される方法は、活性メチラーゼ遺伝子を
選択することを含む［例えば、EPO 特許第 193,413号
（1986年 9月 3日公表）、及びBsuRI:Kiss等、Nucleic
Acid Res.13:6403〜6421(1985)参照］。制限及び修飾遺
伝子は近接して結合する傾向があるため、両遺伝子を含
有するクローンは、正に一方の遺伝子について選択する
ことによりしばしば単離され得る。メチル化活性につい
ての選択により、常に完全な制限−修飾系が得られるわ
けではないけれども、その代わりに時々、メチラーゼ遺
伝子のみが得られる［ＢｓｐＲＩ：Szomolanyi等、Gene
10:219〜225(1980) ；ＢｃｎＩ:Janulaitis 等、Gene2
0:197〜204 (1982)；ＢsuＲＩ：KissとBaldauf,Gene 2
1: 111〜119(1983）；並びにＭspＩ：Walder等、J.Bio
l.Chem.258:1235〜1241(1983)］。
【００１２】制限−修飾遺伝子のクローニングに対して
考えられる障害は、前もって修飾によって防御されてい
ない宿主にエンドヌクレアーゼ遺伝子を導入しようとす
る際に生じる。メチラーゼ遺伝子とエンドヌクレアーゼ
遺伝子が単一クローンとして一緒に導入される場合に
は、エンドヌクレアーゼが宿主ＤＮＡを開裂する機会を
有する前に、メチラーゼは宿主ＤＮＡを保護的に修飾し
なければならない。したがって、時として、それら遺伝
子を引き続いて、即ち先ずメチラーゼ遺伝子、次いでエ
ンドヌクレアーゼ遺伝子をクローン化することが唯一可
能であるかもしれない。制限−修飾系のクローニングに
対する別の障害は、E.coliのいくつかの株がシトシン又
はアデニン修飾に対して逆反応するという発見にある；
それらの株はメチル化シトシン［Raleigh とWilson,Pro
c.Natl. Acad．Sci., USA 83：9070〜9074(1986)］、又
はメチル化アデニン［Heitman とModel,J.Bact.,196:32
43〜3250(1987)］を含有するＤＮＡを破壊する系を有す
る。シトシン特異性又はアデニン特異性メチラーゼ遺伝
子は、単独であっても、あるいはそれらに対応するエン
ドヌクレアーゼ遺伝子と一緒であっても、これらの株中
で容易にクローン化できない。この問題を回避するため
には、これらの系を欠くE.coliの突然変異株（McrA- 及
びMcrB- 又は Mrr- ）を用いる必要がある。
考えられる障害は、前もって修飾によって防御されてい
ない宿主にエンドヌクレアーゼ遺伝子を導入しようとす
る際に生じる。メチラーゼ遺伝子とエンドヌクレアーゼ
遺伝子が単一クローンとして一緒に導入される場合に
は、エンドヌクレアーゼが宿主ＤＮＡを開裂する機会を
有する前に、メチラーゼは宿主ＤＮＡを保護的に修飾し
なければならない。したがって、時として、それら遺伝
子を引き続いて、即ち先ずメチラーゼ遺伝子、次いでエ
ンドヌクレアーゼ遺伝子をクローン化することが唯一可
能であるかもしれない。制限−修飾系のクローニングに
対する別の障害は、E.coliのいくつかの株がシトシン又
はアデニン修飾に対して逆反応するという発見にある；
それらの株はメチル化シトシン［Raleigh とWilson,Pro
c.Natl. Acad．Sci., USA 83：9070〜9074(1986)］、又
はメチル化アデニン［Heitman とModel,J.Bact.,196:32
43〜3250(1987)］を含有するＤＮＡを破壊する系を有す
る。シトシン特異性又はアデニン特異性メチラーゼ遺伝
子は、単独であっても、あるいはそれらに対応するエン
ドヌクレアーゼ遺伝子と一緒であっても、これらの株中
で容易にクローン化できない。この問題を回避するため
には、これらの系を欠くE.coliの突然変異株（McrA- 及
びMcrB- 又は Mrr- ）を用いる必要がある。
【００１３】精製制限エンドヌクレアーゼ、及びその程
度は低いが修飾メチラーゼは、実験室でＤＮＡを特性づ
け且つ再配列するための有用な道具であるため、組換え
ＤＮＡ技術により、これらの酵素を大量に合成する細菌
株を得ることは商業的に利益となる。このような菌株
は、精製の仕事を簡単にし、同時に商業的に有益な量で
生産する手段を提供するので、有用である。
度は低いが修飾メチラーゼは、実験室でＤＮＡを特性づ
け且つ再配列するための有用な道具であるため、組換え
ＤＮＡ技術により、これらの酵素を大量に合成する細菌
株を得ることは商業的に利益となる。このような菌株
は、精製の仕事を簡単にし、同時に商業的に有益な量で
生産する手段を提供するので、有用である。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明は、Haemophilus
influenzae（NEB 株#126, 寄託番号第 53876号としてAT
CCに寄託されている）のHinc II 制限エンドヌクレアー
ゼ遺伝子及び修飾メチラーゼ遺伝子を含有するクローン
に由来する、ＤＮＡ配列ＧＴＰｙ↓ＰｕＡＣを認識し且
つ矢印で最初の５′ＰｙとＰｕの間に示されているよう
に開裂する酵素である制限エンドヌクレアーゼHinc II
をコードするＤＮＡセグメントを提供する。
influenzae（NEB 株#126, 寄託番号第 53876号としてAT
CCに寄託されている）のHinc II 制限エンドヌクレアー
ゼ遺伝子及び修飾メチラーゼ遺伝子を含有するクローン
に由来する、ＤＮＡ配列ＧＴＰｙ↓ＰｕＡＣを認識し且
つ矢印で最初の５′ＰｙとＰｕの間に示されているよう
に開裂する酵素である制限エンドヌクレアーゼHinc II
をコードするＤＮＡセグメントを提供する。
【００１５】さらに、本発明は、上記ＤＮＡセグメント
が挿入された組換えＤＮＡベクターを提供する。
が挿入された組換えＤＮＡベクターを提供する。
【００１６】この酵素については以下を参照されたい：
Landy, Ruesdisueli, Robinson及びRoss, Biochemistr
y, 13：2134〜2142(1974)；Kelly とSmith,J.Mol.Bio
l.,51：393〜409 (1970)；Roy とSmith,J.Mol.Biol.,8
1:427〜444 (1973)；Roy とSmith, J.Mol.Biol.81： 44
5〜459 (1973)；Smith とWilcox,J.Mol.Biol., 51:379
〜391(1970）。これらの記載内容は参考として本明細書
中に含めるものとする。
Landy, Ruesdisueli, Robinson及びRoss, Biochemistr
y, 13：2134〜2142(1974)；Kelly とSmith,J.Mol.Bio
l.,51：393〜409 (1970)；Roy とSmith,J.Mol.Biol.,8
1:427〜444 (1973)；Roy とSmith, J.Mol.Biol.81： 44
5〜459 (1973)；Smith とWilcox,J.Mol.Biol., 51:379
〜391(1970）。これらの記載内容は参考として本明細書
中に含めるものとする。
【００１７】この酵素をクローニングするための好まし
い方法は、Haemophilus influenzaeRc から得たＤＮＡ
を含有するライブラリーを形成し、Hinc II 修飾メチラ
ーゼに関してコードするＤＮＡを含有するクローンを単
離し、Hinc II 制限エンドヌクレアーゼ遺伝子をも含有
するクローンを同定するためにこれらの間でスクリーニ
ングすることより成る。
い方法は、Haemophilus influenzaeRc から得たＤＮＡ
を含有するライブラリーを形成し、Hinc II 修飾メチラ
ーゼに関してコードするＤＮＡを含有するクローンを単
離し、Hinc II 制限エンドヌクレアーゼ遺伝子をも含有
するクローンを同定するためにこれらの間でスクリーニ
ングすることより成る。
【００１８】
【発明の実施の形態】すなわち、Hinc II 制限及び修飾
遺伝子をクローニングし、それによって生じるクローン
から制限エンドヌクレアーゼHinc II を製造することが
できる。
遺伝子をクローニングし、それによって生じるクローン
から制限エンドヌクレアーゼHinc II を製造することが
できる。
【００１９】このアプローチは、エンドヌクレアーゼ選
択を用いることにより、発現されるHinc II 制限及びメ
チラーゼ遺伝子を含有するということに基づいてクロー
ンが選択されたという事実を利用する。このようなクロ
ーンは、Hinc II 制限エンドヌクレアーゼによるin vit
ro消化に耐性である。
択を用いることにより、発現されるHinc II 制限及びメ
チラーゼ遺伝子を含有するということに基づいてクロー
ンが選択されたという事実を利用する。このようなクロ
ーンは、Hinc II 制限エンドヌクレアーゼによるin vit
ro消化に耐性である。
【００２０】Hinc II 制限遺伝子及びメチラーゼ遺伝子
が好適にクローン化され、発現される本明細書記載の方
法は、以下の段階を包含する： (1) Haemophilus influenzae Rc 株のゲノムＤＮＡを精
製する。
が好適にクローン化され、発現される本明細書記載の方
法は、以下の段階を包含する： (1) Haemophilus influenzae Rc 株のゲノムＤＮＡを精
製する。
【００２１】(2) ゲノムＤＮＡをBgl II制限エンドヌク
レアーゼのような制限エンドヌクレアーゼを用いて十分
に消化する。
レアーゼのような制限エンドヌクレアーゼを用いて十分
に消化する。
【００２２】(3) その結果得られたＢgl II 断片を、 p
ＢＩＩＯＩ(ATCC 67901)のようなクローニングベクター
のＢgl II クローニング部位、又は pＵＣ19(ATCC 3725
4)もしくは pＢＲ322 （ATCC 37017) もしくは pＡＣＹ
Ｃ177(ATCC 37031）の BamＨＩ部位に連結し、その混合
物を用いてE.coli ＲＲ１細胞のmrr-株のような適切な
宿主細胞を形質転換する。
ＢＩＩＯＩ(ATCC 67901)のようなクローニングベクター
のＢgl II クローニング部位、又は pＵＣ19(ATCC 3725
4)もしくは pＢＲ322 （ATCC 37017) もしくは pＡＣＹ
Ｃ177(ATCC 37031）の BamＨＩ部位に連結し、その混合
物を用いてE.coli ＲＲ１細胞のmrr-株のような適切な
宿主細胞を形質転換する。
【００２３】(4) 形質転換混合物を、抗生物質アンピシ
リン、テトラサイクリン、又はクロラムフェニコールの
ような、形質転換細胞を選択する培地上にプレーティン
グする。インキュベーションした後、形質転換コロニー
を一緒に集めて単一培養物とし、即ち、細胞ライブラリ
ーを形成する。
リン、テトラサイクリン、又はクロラムフェニコールの
ような、形質転換細胞を選択する培地上にプレーティン
グする。インキュベーションした後、形質転換コロニー
を一緒に集めて単一培養物とし、即ち、細胞ライブラリ
ーを形成する。
【００２４】(5) 組換えプラスミドを細胞ライブラリー
から全部精製して、プラスミドライブラリーを作る。
から全部精製して、プラスミドライブラリーを作る。
【００２５】(6) 上記Watson等が記載したと同様の方法
によりHaemophilus influenzae Rc から調製したHinc I
I 制限エンドヌクレアーゼを用いてプラスミドライブラ
リーを完結するまで消化する。Hinc II 消化は非修飾メ
チラーゼ非含有クローンを特異的に破壊し、Hinc II メ
チラーゼクローンの相対的頻度を増大させる。
によりHaemophilus influenzae Rc から調製したHinc I
I 制限エンドヌクレアーゼを用いてプラスミドライブラ
リーを完結するまで消化する。Hinc II 消化は非修飾メ
チラーゼ非含有クローンを特異的に破壊し、Hinc II メ
チラーゼクローンの相対的頻度を増大させる。
【００２６】(7) 選択されたＤＮＡを E.coli ＲＲ１の
ような適切な宿主に形質転換し戻し、選択培地上にプレ
ーティングすることにより形質転換体を取り出す。コロ
ニーを取り上げ、Hinc II 修飾遺伝子の存在に関してそ
れらのＤＮＡを分析する、すなわちコロニーが保有する
プラスミドを精製し、Hinc II エンドヌクレアーゼと共
にインキュベートしてプラスミドが消化に耐性であるか
否かを調べる。全細胞ＤＮＡ（染色体及びプラスミドの
ＤＮＡ）も精製し、Hinc II 制限エンドヌクレアーゼと
共にインキュベートする。Hinc II 修飾遺伝子を保有す
るクローンのＤＮＡは十分に修飾されねばならず、さら
にプラスミドＤＮＡと全てのＤＮＡはともに実質的に消
化に耐性であるべきである。
ような適切な宿主に形質転換し戻し、選択培地上にプレ
ーティングすることにより形質転換体を取り出す。コロ
ニーを取り上げ、Hinc II 修飾遺伝子の存在に関してそ
れらのＤＮＡを分析する、すなわちコロニーが保有する
プラスミドを精製し、Hinc II エンドヌクレアーゼと共
にインキュベートしてプラスミドが消化に耐性であるか
否かを調べる。全細胞ＤＮＡ（染色体及びプラスミドの
ＤＮＡ）も精製し、Hinc II 制限エンドヌクレアーゼと
共にインキュベートする。Hinc II 修飾遺伝子を保有す
るクローンのＤＮＡは十分に修飾されねばならず、さら
にプラスミドＤＮＡと全てのＤＮＡはともに実質的に消
化に耐性であるべきである。
【００２７】(8) Hinc II 制限及び修飾遺伝子を保有す
る Haemophilus influenzae Rc 細胞からHinc II 制限エン
ドヌクレアーゼを産生させる。この細胞を、アンピシリ
ンを含有する富裕培地中に入れ、発酵槽内で増殖させ
る。
る Haemophilus influenzae Rc 細胞からHinc II 制限エン
ドヌクレアーゼを産生させる。この細胞を、アンピシリ
ンを含有する富裕培地中に入れ、発酵槽内で増殖させ
る。
【００２８】(9) 遠心分離して細胞を採集する。
【００２９】(10)細胞を超音波処理により破砕して、Hi
nc II 制限エンドヌクレアーゼ活性を含有する粗細胞抽
出物を得る。
nc II 制限エンドヌクレアーゼ活性を含有する粗細胞抽
出物を得る。
【００３０】(11) Hinc II制限エンドヌクレアーゼ活性
を含有する粗細胞抽出物を標準イオン交換及びアフィニ
ティークロマトグラフィ技術により精製する。
を含有する粗細胞抽出物を標準イオン交換及びアフィニ
ティークロマトグラフィ技術により精製する。
【００３１】(12)そのようにして精製したエンドヌクレ
アーゼはＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動上では
均質で、分子量27,000ダルトン、ラムダＤＮＡで力価測
定した場合、約 250,000単位／蛋白質１mgの比活性を有
している。
アーゼはＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動上では
均質で、分子量27,000ダルトン、ラムダＤＮＡで力価測
定した場合、約 250,000単位／蛋白質１mgの比活性を有
している。
【００３２】(13)そのエンドヌクレアーゼのアミノ末端
配列を得て、その蛋白質配列に基づいてＤＮＡオリゴプ
ローブを作製する。
配列を得て、その蛋白質配列に基づいてＤＮＡオリゴプ
ローブを作製する。
【００３３】(14)メチラーゼ並びにHaemophilus influe
nzae Rc ゲノムに対するエンドヌクレアーゼの位置をマ
ップ化する。
nzae Rc ゲノムに対するエンドヌクレアーゼの位置をマ
ップ化する。
【００３４】(15) Haemophilus influenzae RcゲノムＤ
ＮＡを、Hind III制限エンドヌクレアーゼのような制限
エンドヌクレアーゼを用いて十分に消化する。
ＮＡを、Hind III制限エンドヌクレアーゼのような制限
エンドヌクレアーゼを用いて十分に消化する。
【００３５】(16)その結果得られたHind III断片を、 p
ＢＩＩＨＩ．２のようなクローニングベクターのHind I
IIクローニング部位、又は pＵＣ19、 pＢＲ 322、もし
くは pＡＣＹＣ 177のHind III部位に連結し、その混合
物を用いて E.coli ＲＲ１細胞のような適切な宿主細胞
を形質転換する。
ＢＩＩＨＩ．２のようなクローニングベクターのHind I
IIクローニング部位、又は pＵＣ19、 pＢＲ 322、もし
くは pＡＣＹＣ 177のHind III部位に連結し、その混合
物を用いて E.coli ＲＲ１細胞のような適切な宿主細胞
を形質転換する。
【００３６】(17)形質転換混合物を、抗生物質アンピシ
リン、ストレプトマイシン、又はクロラムフェニコール
のような、形質転換細胞を選択する培地上にプレーティ
ングする。インキュベーション後、形質転換コロニーを
一緒に集めて単一培養物とし、細胞ライブラリーを形成
する。
リン、ストレプトマイシン、又はクロラムフェニコール
のような、形質転換細胞を選択する培地上にプレーティ
ングする。インキュベーション後、形質転換コロニーを
一緒に集めて単一培養物とし、細胞ライブラリーを形成
する。
【００３７】(18)組み換えプラスミドを細胞ライブラリ
ーから全部そっくり精製し、プラスミドライブラリーを
作る。
ーから全部そっくり精製し、プラスミドライブラリーを
作る。
【００３８】(19)プラスミドライブラリーを、上記 Wat
son 等が記載したと同様の方法によりHaemophilus infl
uenzae Rc から調製したHinc II 制限エンドヌクレアー
ゼを用いて完結するまで消化する。Hinc II 消化は未修
飾、メチラーゼ非含有クローンを特異的に破壊し、Hinc
II メチラーゼクローンの相対的頻度を増大させる。
son 等が記載したと同様の方法によりHaemophilus infl
uenzae Rc から調製したHinc II 制限エンドヌクレアー
ゼを用いて完結するまで消化する。Hinc II 消化は未修
飾、メチラーゼ非含有クローンを特異的に破壊し、Hinc
II メチラーゼクローンの相対的頻度を増大させる。
【００３９】(20)選択されたＤＮＡを E.coli ＲＲ１の
ような適切な宿主に形質転換し戻し、選択培地上にプレ
ーティングすることにより形質転換体を取り出す。コロ
ニーを摘み取り、Hinc II 修飾遺伝子の存在に関してそ
れらのＤＮＡを分析する、すなわちコロニーが保有する
プラスミドを精製し、Hinc II 制限エンドヌクレアーゼ
を用いてインキュベートして、プラスミドが消化に耐性
であるか否かを調べる。全細胞ＤＮＡ（染色体及びプラ
スミドのＤＮＡ）も精製し、Hinc II 制限エンドヌクレ
アーゼを用いてインキュベートする。Hinc II 修飾遺伝
子を保有するクローンのＤＮＡは十分に修飾されねばな
らないし、さらにプラスミドＤＮＡ及び全てのＤＮＡは
ともに実質的に消化に耐性でなければならない。
ような適切な宿主に形質転換し戻し、選択培地上にプレ
ーティングすることにより形質転換体を取り出す。コロ
ニーを摘み取り、Hinc II 修飾遺伝子の存在に関してそ
れらのＤＮＡを分析する、すなわちコロニーが保有する
プラスミドを精製し、Hinc II 制限エンドヌクレアーゼ
を用いてインキュベートして、プラスミドが消化に耐性
であるか否かを調べる。全細胞ＤＮＡ（染色体及びプラ
スミドのＤＮＡ）も精製し、Hinc II 制限エンドヌクレ
アーゼを用いてインキュベートする。Hinc II 修飾遺伝
子を保有するクローンのＤＮＡは十分に修飾されねばな
らないし、さらにプラスミドＤＮＡ及び全てのＤＮＡは
ともに実質的に消化に耐性でなければならない。
【００４０】(21) Hinc II制限エンドヌクレアーゼを保
有するクローンを、Hinc II メチラーゼ遺伝子を保有す
ることが確定されたクローンの粗抽出物を調製し、Hinc
II 制限エンドヌクレアーゼ活性に関して粗抽出物をア
ッセイすることにより、同定する。粗細胞抽出物の中の
Hinc II 活性レベルは、クローン p(pＢＩＩＨＩ．２）
Hinc II ＲＭ−8.0-Ａ１の細胞１ｇ当たり約1,000 単位
であると確定される。
有するクローンを、Hinc II メチラーゼ遺伝子を保有す
ることが確定されたクローンの粗抽出物を調製し、Hinc
II 制限エンドヌクレアーゼ活性に関して粗抽出物をア
ッセイすることにより、同定する。粗細胞抽出物の中の
Hinc II 活性レベルは、クローン p(pＢＩＩＨＩ．２）
Hinc II ＲＭ−8.0-Ａ１の細胞１ｇ当たり約1,000 単位
であると確定される。
【００４１】(22)メチラーゼ及びエンドヌクレアーゼ遺
伝子を含有するHind III断片を HindIII 開裂及び脱リ
ン酸化 pＵＣ19中にサブクローニングした。
伝子を含有するHind III断片を HindIII 開裂及び脱リ
ン酸化 pＵＣ19中にサブクローニングした。
【００４２】(23) Hinc II制限エンドヌクレアーゼ活性
に関して陽性である組み換えプラスミド p(pＵＣ19) Hi
nc II ＲＭ-5.7-4及び p(pＵＣ19) Hinc II ＲＭ-5.7-1
0 を含有するクローンは、 pＵＣ19のHind IIIクローニ
ング部位に挿入される単一の3.0kb Hind IIIＤＮＡ断片
を含有する。
に関して陽性である組み換えプラスミド p(pＵＣ19) Hi
nc II ＲＭ-5.7-4及び p(pＵＣ19) Hinc II ＲＭ-5.7-1
0 を含有するクローンは、 pＵＣ19のHind IIIクローニ
ング部位に挿入される単一の3.0kb Hind IIIＤＮＡ断片
を含有する。
【００４３】(24)種々の制限エンドヌクレアーゼに対す
る多数の制限エンドヌクレアーゼ部位をこのプラスミド
上でマップ化したが、それを第３図に示す。遺伝子の位
置は、欠失サブクローニング（deletion subcloning ）
と、プローブとしてＤＮＡオリゴマーを用いるSouthern
ハイブリダイゼーションによるマッピングとにより決定
した。
る多数の制限エンドヌクレアーゼ部位をこのプラスミド
上でマップ化したが、それを第３図に示す。遺伝子の位
置は、欠失サブクローニング（deletion subcloning ）
と、プローブとしてＤＮＡオリゴマーを用いるSouthern
ハイブリダイゼーションによるマッピングとにより決定
した。
【００４４】(25) Hinc II制限エンドヌクレアーゼをプ
ラスミド p(pＵＣ19) Hinc II ＲＭ-5.7-10上にHinc II
制限及び修飾遺伝子を保有する細胞から産生させる。
その細胞を発酵槽内で、アンピシリンを含む富裕培地中
で増殖させる。
ラスミド p(pＵＣ19) Hinc II ＲＭ-5.7-10上にHinc II
制限及び修飾遺伝子を保有する細胞から産生させる。
その細胞を発酵槽内で、アンピシリンを含む富裕培地中
で増殖させる。
【００４５】(26)遠心分離して細胞を採集する。
【００４６】(27)超音波処理により細胞を破砕させて、
Hinc II 制限エンドヌクレアーゼ活性を含有する粗細胞
抽出物を得る。
Hinc II 制限エンドヌクレアーゼ活性を含有する粗細胞
抽出物を得る。
【００４７】(28) Hinc II制限エンドヌクレアーゼ活性
を含有する粗細胞抽出物を標準イオン交換及びアフィニ
ティークロマトグラフィ技術により精製する。
を含有する粗細胞抽出物を標準イオン交換及びアフィニ
ティークロマトグラフィ技術により精製する。
【００４８】(29)そのようにして精製したエンドヌクレ
アーゼは、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動上では均
質であって、分子量は27,000ダルトン、ラムダＤＮＡで
力価測定すると蛋白質１mg当たり約250,000 単位の比活
性を示すことが判明している。
アーゼは、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動上では均
質であって、分子量は27,000ダルトン、ラムダＤＮＡで
力価測定すると蛋白質１mg当たり約250,000 単位の比活
性を示すことが判明している。
【００４９】概要を記した上記の段階は本発明を実行す
るための好ましい態様を示しているけれども、上記アプ
ローチが当業界に公知の技術に従って可変可能であるこ
とは当業者には明らかであろう。
るための好ましい態様を示しているけれども、上記アプ
ローチが当業界に公知の技術に従って可変可能であるこ
とは当業者には明らかであろう。
【００５０】なお、上記で説明した方法は、Hind II 修
飾−制限遺伝子のクローニングおよびHind II 制限エン
ドヌクレアーゼの製造にも同様に用いることができる
が、この場合、但し段階(1) のゲノムＤＮＡは Haemoph
ilus influenzae Rd株から得られ、また段階(15)ではCl
a Ｉ又はEcoRＩのような制限エンドヌクレアーゼを用い
てゲノムＤＮＡを消化するのがよい。すなわち、Hind I
I 制限エンドヌクレアーゼ遺伝子をクローニングする方
法は、以下の段階からなる。
飾−制限遺伝子のクローニングおよびHind II 制限エン
ドヌクレアーゼの製造にも同様に用いることができる
が、この場合、但し段階(1) のゲノムＤＮＡは Haemoph
ilus influenzae Rd株から得られ、また段階(15)ではCl
a Ｉ又はEcoRＩのような制限エンドヌクレアーゼを用い
てゲノムＤＮＡを消化するのがよい。すなわち、Hind I
I 制限エンドヌクレアーゼ遺伝子をクローニングする方
法は、以下の段階からなる。
【００５１】(a) Haemophilus influenzae Rd から得た
プラスミドＤＮＡからライブラリーを形成する； (b) Hind II 修飾遺伝子を含有するクローンを単離す
る； (c) 制限エンドヌクレアーゼ蛋白質を精製して、蛋白質
配列を得る； (d) ＤＮＡシーケンシングを通してエンドヌクレアーゼ
の方向を決定し、メチラーゼクローン内における該エン
ドヌクレアーゼの位置を定め、 Haemophilusinfluenzae
Rd ゲノム内におけるエンドヌクレアーゼの位置を定め
る； (e) ｂ〜ｄの段階で得られるデータに基づいてライブラ
リーを形成する； (f) Hind II 修飾及び制限遺伝子を含有するクローンを
単離する。
プラスミドＤＮＡからライブラリーを形成する； (b) Hind II 修飾遺伝子を含有するクローンを単離す
る； (c) 制限エンドヌクレアーゼ蛋白質を精製して、蛋白質
配列を得る； (d) ＤＮＡシーケンシングを通してエンドヌクレアーゼ
の方向を決定し、メチラーゼクローン内における該エン
ドヌクレアーゼの位置を定め、 Haemophilusinfluenzae
Rd ゲノム内におけるエンドヌクレアーゼの位置を定め
る； (e) ｂ〜ｄの段階で得られるデータに基づいてライブラ
リーを形成する； (f) Hind II 修飾及び制限遺伝子を含有するクローンを
単離する。
【００５２】
【実施例】以下の実施例を、現在実行するに好ましい本
発明の実施態様を説明するために示す。本実施例は説明
のためのものであり、本発明は、これらの実施例に限定
されるものではないと理解されたい。
発明の実施態様を説明するために示す。本実施例は説明
のためのものであり、本発明は、これらの実施例に限定
されるものではないと理解されたい。
【００５３】実施例１ Hinc II 制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニング (1) ゲノムＤＮＡ精製：約５ｇのHeamophilus influenz
ae Rc 細胞を解凍し、Corning プラスチックチューブ
（50ml）に入れた 0.1M Tris−ＨＣｌ，pH7.1, 0.1Ｍ
ＥＤＴＡ（25ml）に再懸濁した。上記緩衝液35mlにリゾ
チーム60mgを溶解した溶液を２本の50mlプラスチックチ
ューブに分け、等量（15ml）の細胞懸濁液を各々に加え
た。その溶液を37℃で15分間インキュベートした。20％
保存溶液からＳＤＳを加えて、ＳＤＳの最終濃度を１％
に調整した。プロティナーゼＫ（20mg／mlで保存） 200
μｌを加え、37℃で１時間インキュベートした。溶液
は、この時点では粘質性で且つ拡散性であるように見え
たが、透明ではなかった。チューブ（各１ml）に10％Ｓ
ＤＳ／８％サルコシル２mlを加え、55℃で２時間加熱し
た。サンプルは依然として粘質であったが、全体的に透
明ではなかった。サンプルをＴＥ（10mM Tris −ＨＣ
ｌ，pH 7.1，１mMＥＤＴＡ）（２ｌ）に対して、１回の
ＴＥ交換を含めて計16時間透析した。透析後、等量のＴ
Ｅ（pH 8.0）で希釈してＣｓＣｌ勾配液用に溶液（98m
l）を調製し、これを２つに分け、各々にＣｓＣｌ98.0
ｇと５mg／ml臭化エチジウム１mlを添加した。20本のチ
ューブを、Ｔｉ70ローター中で44,000rpm で48時間回転
させた。バンドを取り出し、水飽和イソブタノールで抽
出した。その溶液を前記と同じ緩衝液（４ｌ）に対して
透析し、次いでフェノール及びクロロホルムで抽出した
（各１回）。この溶液を再度透析してフェノールを除去
し、次いで電気泳動にかけた。
ae Rc 細胞を解凍し、Corning プラスチックチューブ
（50ml）に入れた 0.1M Tris−ＨＣｌ，pH7.1, 0.1Ｍ
ＥＤＴＡ（25ml）に再懸濁した。上記緩衝液35mlにリゾ
チーム60mgを溶解した溶液を２本の50mlプラスチックチ
ューブに分け、等量（15ml）の細胞懸濁液を各々に加え
た。その溶液を37℃で15分間インキュベートした。20％
保存溶液からＳＤＳを加えて、ＳＤＳの最終濃度を１％
に調整した。プロティナーゼＫ（20mg／mlで保存） 200
μｌを加え、37℃で１時間インキュベートした。溶液
は、この時点では粘質性で且つ拡散性であるように見え
たが、透明ではなかった。チューブ（各１ml）に10％Ｓ
ＤＳ／８％サルコシル２mlを加え、55℃で２時間加熱し
た。サンプルは依然として粘質であったが、全体的に透
明ではなかった。サンプルをＴＥ（10mM Tris −ＨＣ
ｌ，pH 7.1，１mMＥＤＴＡ）（２ｌ）に対して、１回の
ＴＥ交換を含めて計16時間透析した。透析後、等量のＴ
Ｅ（pH 8.0）で希釈してＣｓＣｌ勾配液用に溶液（98m
l）を調製し、これを２つに分け、各々にＣｓＣｌ98.0
ｇと５mg／ml臭化エチジウム１mlを添加した。20本のチ
ューブを、Ｔｉ70ローター中で44,000rpm で48時間回転
させた。バンドを取り出し、水飽和イソブタノールで抽
出した。その溶液を前記と同じ緩衝液（４ｌ）に対して
透析し、次いでフェノール及びクロロホルムで抽出した
（各１回）。この溶液を再度透析してフェノールを除去
し、次いで電気泳動にかけた。
【００５４】(2) 限定消化：精製ＤＮＡをＢgl II で切
断して、以下のような全体的消化を達成した。：10mMTr
is pH7.5，10mMＭｇＣｌ2 ，100mM ＮａＣｌ，10mMメル
カプトエタノール緩衝液に 100μｇ／mlで溶解したＤＮ
Ａ 300μｌを３本のチューブに分配した。そのチューブ
に50単位のＢgl II を加えた。そのチューブを37℃で１
時間インキュベートし、次いでフェノール／クロロホル
ムで抽出して、エタノール沈澱した。ペレットを10mMト
リス塩酸，１mMＥＤＴＡ，pH 8.0， 300μｌ中に再溶解
し、各10μｌをアガロースゲル電気泳動で分析した。
断して、以下のような全体的消化を達成した。：10mMTr
is pH7.5，10mMＭｇＣｌ2 ，100mM ＮａＣｌ，10mMメル
カプトエタノール緩衝液に 100μｇ／mlで溶解したＤＮ
Ａ 300μｌを３本のチューブに分配した。そのチューブ
に50単位のＢgl II を加えた。そのチューブを37℃で１
時間インキュベートし、次いでフェノール／クロロホル
ムで抽出して、エタノール沈澱した。ペレットを10mMト
リス塩酸，１mMＥＤＴＡ，pH 8.0， 300μｌ中に再溶解
し、各10μｌをアガロースゲル電気泳動で分析した。
【００５５】(3) 連結：断片化したＤＮＡを以下のよう
に pＢＩＩＯＩ（ＥcoＲＩ部位にＢglII リンカーを挿
入した pＢＲ 322）に連結した：10.0μg のＢgl II 消
化 Haemophilus influenzae Rc ＤＮＡ（100 μｌ）を
2.0 μg のＢgl II 開裂及び脱リン酸化 pＢＩＩＯＩ
（20.0μｌ）と混合して、エタノール沈澱した。ＤＮＡ
を12,000ｇで、４℃で15分間遠心分離し、70％エタノー
ル 100μｌで１回洗浄した。そのＤＮＡを99μｌの１×
連結緩衝液（50mM Tris, pH7.5, 10mM ＭｇＣｌ2，10m
M ＤＴＴ，0.5mM ＡＴＰ）に再懸濁し、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼ１μｌを加えて、その混合液を16℃で16時間イン
キュベートした。2.5 及び 5.0μｌのアリコートを用い
て、以下のように E.coli ＲＲ１株を形質転換した：各
アリコートを200μｌの氷冷コンピテント E.coli ＲＲ
１細胞と混合し、30分間氷上に放置した。42℃で２分間
ヒートショック後、細胞を１mlのLuria ブロス（Ｌ−ブ
ロス）で希釈して、37℃で１時間増殖させた。
に pＢＩＩＯＩ（ＥcoＲＩ部位にＢglII リンカーを挿
入した pＢＲ 322）に連結した：10.0μg のＢgl II 消
化 Haemophilus influenzae Rc ＤＮＡ（100 μｌ）を
2.0 μg のＢgl II 開裂及び脱リン酸化 pＢＩＩＯＩ
（20.0μｌ）と混合して、エタノール沈澱した。ＤＮＡ
を12,000ｇで、４℃で15分間遠心分離し、70％エタノー
ル 100μｌで１回洗浄した。そのＤＮＡを99μｌの１×
連結緩衝液（50mM Tris, pH7.5, 10mM ＭｇＣｌ2，10m
M ＤＴＴ，0.5mM ＡＴＰ）に再懸濁し、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼ１μｌを加えて、その混合液を16℃で16時間イン
キュベートした。2.5 及び 5.0μｌのアリコートを用い
て、以下のように E.coli ＲＲ１株を形質転換した：各
アリコートを200μｌの氷冷コンピテント E.coli ＲＲ
１細胞と混合し、30分間氷上に放置した。42℃で２分間
ヒートショック後、細胞を１mlのLuria ブロス（Ｌ−ブ
ロス）で希釈して、37℃で１時間増殖させた。
【００５６】(4) 一次細胞ライブラリー：形質転換細胞
培養物を遠心分離し、 250μｌ容量に再懸濁して、 100
μｇ／mlアンピシリンを含有する Luria−寒天（Ｌ−寒
天）平板上にプレーティングした。37℃で一晩インキュ
ベーションした後、平板を取り出して約5000コロニーを
抗生物質を含むＬＢ25ml中に掻き出した。プラスミドＤ
ＮＡを以下と同様にしてこれらの細胞から調製した、す
なわち細胞を遠心分離によりペレット化し、３ｇの細胞
ペーストを25mMトリス塩酸、10mMＥＤＴＡ、 pH8.0 及
び50mMグルコースより成る14ml液に再懸濁した。その懸
濁液にリゾチーム4.0 mg／mlを溶解して、25℃で５分間
インキュベートした。１％ドデシル硫酸ナトリウム及び
0.2NＮａＯＨのアリコート27mlを加え、その後その溶液
を混合して、０℃で５分間インキュベートした。氷冷３
Ｍ酢酸カリウム（pH 4.8）20mlを加えてゲノムＤＮＡを
沈澱させ、10秒間静かに攪拌し、５分間氷上に放置し
て、12,000×ｇで10分間遠心分離した。上澄を取り出し
て、等容量のフェノール／クロロホルム（１：１）で抽
出した。10,000×ｇで５分間遠心分離して各層に分離し
た。上層を取り出して等容量のクロロホルムで抽出し
た。10,000ｇで５分間遠心分離して層に分けた。上層を
取り出して、２容積のエタノールを加えて核酸を沈澱し
た。12,000×ｇで20分間遠心分離して沈澱物を採集し
た。そのペレットを70％エタノールで１回洗浄し、前記
と同様に再ペレット化した。そのペレットを真空乾燥し
て、８mlの10mMトリス塩酸，１mM ＥＤＴＡ，pH8.0 液
中に再懸濁した。 8.9ｇの塩化セシウムを加え、0.9 ml
の臭化エチジウム（５mg／ml）溶液を加えて、塩化セシ
ウム−臭化エチジウム平衡密度遠心分離用にＤＮＡ溶液
を調製した。そのＤＮＡ溶液を44,000rpm で48時間遠心
分離し、その結果生じたＤＮＡのプラスミドバンドを18
ｇ針付注射器で取り出した。臭化エチジウムは、等容量
のＣｓＣｌ−水飽和イソプロパノールを用いて抽出する
ことにより除去した。
培養物を遠心分離し、 250μｌ容量に再懸濁して、 100
μｇ／mlアンピシリンを含有する Luria−寒天（Ｌ−寒
天）平板上にプレーティングした。37℃で一晩インキュ
ベーションした後、平板を取り出して約5000コロニーを
抗生物質を含むＬＢ25ml中に掻き出した。プラスミドＤ
ＮＡを以下と同様にしてこれらの細胞から調製した、す
なわち細胞を遠心分離によりペレット化し、３ｇの細胞
ペーストを25mMトリス塩酸、10mMＥＤＴＡ、 pH8.0 及
び50mMグルコースより成る14ml液に再懸濁した。その懸
濁液にリゾチーム4.0 mg／mlを溶解して、25℃で５分間
インキュベートした。１％ドデシル硫酸ナトリウム及び
0.2NＮａＯＨのアリコート27mlを加え、その後その溶液
を混合して、０℃で５分間インキュベートした。氷冷３
Ｍ酢酸カリウム（pH 4.8）20mlを加えてゲノムＤＮＡを
沈澱させ、10秒間静かに攪拌し、５分間氷上に放置し
て、12,000×ｇで10分間遠心分離した。上澄を取り出し
て、等容量のフェノール／クロロホルム（１：１）で抽
出した。10,000×ｇで５分間遠心分離して各層に分離し
た。上層を取り出して等容量のクロロホルムで抽出し
た。10,000ｇで５分間遠心分離して層に分けた。上層を
取り出して、２容積のエタノールを加えて核酸を沈澱し
た。12,000×ｇで20分間遠心分離して沈澱物を採集し
た。そのペレットを70％エタノールで１回洗浄し、前記
と同様に再ペレット化した。そのペレットを真空乾燥し
て、８mlの10mMトリス塩酸，１mM ＥＤＴＡ，pH8.0 液
中に再懸濁した。 8.9ｇの塩化セシウムを加え、0.9 ml
の臭化エチジウム（５mg／ml）溶液を加えて、塩化セシ
ウム−臭化エチジウム平衡密度遠心分離用にＤＮＡ溶液
を調製した。そのＤＮＡ溶液を44,000rpm で48時間遠心
分離し、その結果生じたＤＮＡのプラスミドバンドを18
ｇ針付注射器で取り出した。臭化エチジウムは、等容量
のＣｓＣｌ−水飽和イソプロパノールを用いて抽出する
ことにより除去した。
【００５７】ＤＮＡは等容量のフェノール／クロロホル
ム（１：１）を用いて抽出し、エタノール沈澱した。そ
の結果得られたＤＮＡペレットを10mMトリス塩酸、１mM
ＥＤＴＡ，pH8.0 の液10mlに再懸濁した。
ム（１：１）を用いて抽出し、エタノール沈澱した。そ
の結果得られたＤＮＡペレットを10mMトリス塩酸、１mM
ＥＤＴＡ，pH8.0 の液10mlに再懸濁した。
【００５８】(5) 一次選択及び選択されたライブラリ
ー：２μｇ（30.0μｌ）のプラスミドライブラリーを60
μｌの制限エンドヌクレアーゼ消化緩衝液（10mM Tris
pH 7.5，10mM ＭｇＣｌ2 ，10mMメルカプトエタノー
ル,100mM ＮａＣｌ及び 100μｇのウシ血清アルブミ
ン）中に希釈した。 100単位（３μｌ）のHinc II 制限
エンドヌクレアーゼを加え、チューブを37℃で２時間イ
ンキュベートし、その時点で７Ｕ（１μｌ）の仔ウシ腸
ホスファターゼを加えて、その反応液をさらに30分間イ
ンキュベートした。この反応混合液のアリコート２μｌ
及び４μｌを氷冷コンピテント E.coli ＲＲ１細胞と混
合し、形質転換して、平板培地上に置き、一次ライブラ
リーの場合と同様に一晩増殖した。
ー：２μｇ（30.0μｌ）のプラスミドライブラリーを60
μｌの制限エンドヌクレアーゼ消化緩衝液（10mM Tris
pH 7.5，10mM ＭｇＣｌ2 ，10mMメルカプトエタノー
ル,100mM ＮａＣｌ及び 100μｇのウシ血清アルブミ
ン）中に希釈した。 100単位（３μｌ）のHinc II 制限
エンドヌクレアーゼを加え、チューブを37℃で２時間イ
ンキュベートし、その時点で７Ｕ（１μｌ）の仔ウシ腸
ホスファターゼを加えて、その反応液をさらに30分間イ
ンキュベートした。この反応混合液のアリコート２μｌ
及び４μｌを氷冷コンピテント E.coli ＲＲ１細胞と混
合し、形質転換して、平板培地上に置き、一次ライブラ
リーの場合と同様に一晩増殖した。
【００５９】(6) 個々の分析：上記形質転換により得ら
れたコロニーを取り上げて、アンピシリン及びテトラサ
イクリンを含むＬＢ寒天平板上に置いた。 ampR 及び t
etR であった18個のコロニーを10ml培養物中で増殖さ
せ、それらが保有するプラスミドを、BirnboimとDoly
（Nucleic Acids Res.7:1513(1979)）の方法から採用し
た以下に示すミニプレプ（miniprep）精製法により調製
した。
れたコロニーを取り上げて、アンピシリン及びテトラサ
イクリンを含むＬＢ寒天平板上に置いた。 ampR 及び t
etR であった18個のコロニーを10ml培養物中で増殖さ
せ、それらが保有するプラスミドを、BirnboimとDoly
（Nucleic Acids Res.7:1513(1979)）の方法から採用し
た以下に示すミニプレプ（miniprep）精製法により調製
した。
【００６０】ミニプレプ法：各培養物を以下の通りに処
理した： 1.5mlの一晩培養した培養物を 6,000×ｇで５
分間ペレット化した。その上清をデカントして除き、細
胞ペレットを１mg／mlのリゾチームを含有する25mM Tri
s,10mM ＥＤＴＡ，50mMグルコース，pH8.0 の 150μｌ
液中に再懸濁した。室温で５分後、0.2M ＮａＯＨ，１
％ＳＤＳを 200μｌ加え、そのチューブを振盪して細胞
を溶解し、次いで氷上に放置した。５分後、３Ｍ酢酸ナ
トリウム，pH4.8 を 150μｌ加え、振盪して、さらに５
分間氷上に放置した。生じた沈澱物を12,000×ｇで４℃
で10分間遠心した。その上清を取り出して、等容量のフ
ェノール／クロロホルム（１：１）で抽出した。10,000
×ｇで５分間遠心分離することにより各層に分離した。
その上清を 880μｌのエタノールを含有する遠心チュー
ブ中に注ぎ入れ、混合した。室温で10分後、その遠心チ
ューブを12,000×ｇで10分間回転し、沈澱した核酸をペ
レット化した。その上清を捨て、ペレットを１mlの70％
エタノール−水で再び洗浄して再ペレット化し、室温で
30分間真空乾燥した。一旦乾燥させた後、ペレットを、
20μｇ／mlのＲＮase を含む50μｌ溶液（10mM Tris,１
mM ＥＤＴＡ， pH8.0 ）中に再懸濁し、37℃で１時間
インキュベートして、ＲＮＡを消化した。
理した： 1.5mlの一晩培養した培養物を 6,000×ｇで５
分間ペレット化した。その上清をデカントして除き、細
胞ペレットを１mg／mlのリゾチームを含有する25mM Tri
s,10mM ＥＤＴＡ，50mMグルコース，pH8.0 の 150μｌ
液中に再懸濁した。室温で５分後、0.2M ＮａＯＨ，１
％ＳＤＳを 200μｌ加え、そのチューブを振盪して細胞
を溶解し、次いで氷上に放置した。５分後、３Ｍ酢酸ナ
トリウム，pH4.8 を 150μｌ加え、振盪して、さらに５
分間氷上に放置した。生じた沈澱物を12,000×ｇで４℃
で10分間遠心した。その上清を取り出して、等容量のフ
ェノール／クロロホルム（１：１）で抽出した。10,000
×ｇで５分間遠心分離することにより各層に分離した。
その上清を 880μｌのエタノールを含有する遠心チュー
ブ中に注ぎ入れ、混合した。室温で10分後、その遠心チ
ューブを12,000×ｇで10分間回転し、沈澱した核酸をペ
レット化した。その上清を捨て、ペレットを１mlの70％
エタノール−水で再び洗浄して再ペレット化し、室温で
30分間真空乾燥した。一旦乾燥させた後、ペレットを、
20μｇ／mlのＲＮase を含む50μｌ溶液（10mM Tris,１
mM ＥＤＴＡ， pH8.0 ）中に再懸濁し、37℃で１時間
インキュベートして、ＲＮＡを消化した。
【００６１】引き続いて、Hinc II 及びＢgl II を用い
て消化することにより、プラスミドミニプレプを分析し
た。
て消化することにより、プラスミドミニプレプを分析し
た。
【００６２】(7) メチラーゼ遺伝子クローン：分析した
プラスミドの10％は、Hinc II に耐性であり、また約6.
2kb の長さのＢgl II 断片を保有することが判明した。
その後、これらのプラスミドは、Hinc II 修飾メチラー
ゼ遺伝子のみを保有し、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子
を保有しないことが示された。観察されたプラスミドの
他の90％はHinc II に耐性でなく、擬似断片を含有して
いたか、あるいは再連結されたベクターであった。
プラスミドの10％は、Hinc II に耐性であり、また約6.
2kb の長さのＢgl II 断片を保有することが判明した。
その後、これらのプラスミドは、Hinc II 修飾メチラー
ゼ遺伝子のみを保有し、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子
を保有しないことが示された。観察されたプラスミドの
他の90％はHinc II に耐性でなく、擬似断片を含有して
いたか、あるいは再連結されたベクターであった。
【００６３】(8) 制限遺伝子クローン：Hinc II 修飾メ
チラーゼ遺伝子を保有するものとして上記（セクション
７）で同定されたクローンを、Hinc II 制限エンドヌク
レアーゼ遺伝子に関しても調べた。これは以下の通りに
実施した：一晩培養したものの残留部分を用いて、エン
ドヌクレアーゼ活性を調べた。これは以下の通りに実施
した： エンドヌクレアーゼアッセイ： 10×制限エンドヌクレアーゼ緩衝液：100mM Tris，pH7.
5 ，100mM ＭｇＣｌ2，100mM ２−メルカプトエタノー
ル，１Ｍ ＮａＣｌ。
チラーゼ遺伝子を保有するものとして上記（セクション
７）で同定されたクローンを、Hinc II 制限エンドヌク
レアーゼ遺伝子に関しても調べた。これは以下の通りに
実施した：一晩培養したものの残留部分を用いて、エン
ドヌクレアーゼ活性を調べた。これは以下の通りに実施
した： エンドヌクレアーゼアッセイ： 10×制限エンドヌクレアーゼ緩衝液：100mM Tris，pH7.
5 ，100mM ＭｇＣｌ2，100mM ２−メルカプトエタノー
ル，１Ｍ ＮａＣｌ。
【００６４】以下の通りに細胞抽出物を調製した：4,00
0rpmで５分間遠心分離することにより、１mlから細胞を
ペレット化した。上清を捨て、ペレットを１mlの超音波
処理用緩衝液（10mM Tris, pH7.5，100mM ＮａＣｌ，５
mM ＤＴＴ，0.1mM ＥＤＴＡ）中に再懸濁し、10秒間ず
つ２回静かに超音波処理して、細胞を破砕した。チュー
ブをミクロ遠心分離機内で４℃で10分間回転し、その上
清を細胞抽出物として用いた。１μｌ及び５μｌの抽出
物を、１×制限エンドヌクレアーゼ緩衝液50μｌに溶解
したラムダＤＮＡ１μｇを用いて、37℃で15分間インキ
ュベートした。試験したクローンはいずれもエンドヌク
レアーゼ活性を示さなかった。
0rpmで５分間遠心分離することにより、１mlから細胞を
ペレット化した。上清を捨て、ペレットを１mlの超音波
処理用緩衝液（10mM Tris, pH7.5，100mM ＮａＣｌ，５
mM ＤＴＴ，0.1mM ＥＤＴＡ）中に再懸濁し、10秒間ず
つ２回静かに超音波処理して、細胞を破砕した。チュー
ブをミクロ遠心分離機内で４℃で10分間回転し、その上
清を細胞抽出物として用いた。１μｌ及び５μｌの抽出
物を、１×制限エンドヌクレアーゼ緩衝液50μｌに溶解
したラムダＤＮＡ１μｇを用いて、37℃で15分間インキ
ュベートした。試験したクローンはいずれもエンドヌク
レアーゼ活性を示さなかった。
【００６５】(9) NEB#126 と呼ばれるHaemophilus infl
uenzae Rc から得たHinc II エンドヌクレアーゼを、発
酵槽内で、以下の成分より成るＴＲＹ−ＹＥブロス培地
中、37℃で増殖させた：トリプトン（10.0ｇ／ｌ）；酵
母菌抽出物（5.0 ｇ／ｌ）；ＮａＣｌ（2.0 ｇ／ｌ）；
Ｋ2 ＨＰＯ4 （4.4 ｇ／ｌ）；ブドウ糖（2.0 ｇ／
ｌ）；ウシのヘミン（10mg／ｌ）；ＮＡＤ；ＤＰＮ（2.
0 mg／ｌ）。遠心分離により細胞を集め、新鮮なものを
使用するために細胞ペーストを−70℃で保存する。
uenzae Rc から得たHinc II エンドヌクレアーゼを、発
酵槽内で、以下の成分より成るＴＲＹ−ＹＥブロス培地
中、37℃で増殖させた：トリプトン（10.0ｇ／ｌ）；酵
母菌抽出物（5.0 ｇ／ｌ）；ＮａＣｌ（2.0 ｇ／ｌ）；
Ｋ2 ＨＰＯ4 （4.4 ｇ／ｌ）；ブドウ糖（2.0 ｇ／
ｌ）；ウシのヘミン（10mg／ｌ）；ＮＡＤ；ＤＰＮ（2.
0 mg／ｌ）。遠心分離により細胞を集め、新鮮なものを
使用するために細胞ペーストを−70℃で保存する。
【００６６】(10)その後の全段階は、４℃で実施する。
【００６７】(11)細胞ペースト（ 200ｇ）を解凍し、細
胞を 400mlの超音波処理用緩衝液（20mM Ｋ2 ＰＯ4 ，
pH 7.3，0.1mM ＥＤＴＡ，10mM β−メルカプトエタノ
ール，0.1M ＮａＣｌ）中に再懸濁する。
胞を 400mlの超音波処理用緩衝液（20mM Ｋ2 ＰＯ4 ，
pH 7.3，0.1mM ＥＤＴＡ，10mM β−メルカプトエタノ
ール，0.1M ＮａＣｌ）中に再懸濁する。
【００６８】(12)細胞を超音波処理で破砕し（250 ワッ
トで２分間。氷上で５分間冷却。３回実施）、懸濁細胞
１ml当たり約50mgの可溶性蛋白質が放出された。
トで２分間。氷上で５分間冷却。３回実施）、懸濁細胞
１ml当たり約50mgの可溶性蛋白質が放出された。
【００６９】(13)不溶性細胞破片を21,000×ｇで20分間
遠心分離することにより除去する。
遠心分離することにより除去する。
【００７０】(14)その上清液を20mM ＫＨ2 ＰＯ4 ，pH
6.9，100mM ＮａＣｌ，及び10mM ２−メルカプトエタ
ノールで平衡化されたホスフォセルロースカラム（５×
5cm）（Whatman P −11）に載置する。そのカラムを２
倍カラム容量の上記緩衝液で洗浄する。カラムからの流
出物を単一フラスコ中に採集する。Hinc II エンドヌク
レアーゼはそのカラムに保持され、0.3 Ｍ〜0.6M Ｎａ
Ｃｌで溶出する。大半の活性画分をプールし、20mM Ｋ
2 ＰＯ4 ，pH7.3 ，0.1mM ＥＤＴＡ，10mM β−メルカ
プトエタノール，0.1M ＫＣｌに対して透析する。
6.9，100mM ＮａＣｌ，及び10mM ２−メルカプトエタ
ノールで平衡化されたホスフォセルロースカラム（５×
5cm）（Whatman P −11）に載置する。そのカラムを２
倍カラム容量の上記緩衝液で洗浄する。カラムからの流
出物を単一フラスコ中に採集する。Hinc II エンドヌク
レアーゼはそのカラムに保持され、0.3 Ｍ〜0.6M Ｎａ
Ｃｌで溶出する。大半の活性画分をプールし、20mM Ｋ
2 ＰＯ4 ，pH7.3 ，0.1mM ＥＤＴＡ，10mM β−メルカ
プトエタノール，0.1M ＫＣｌに対して透析する。
【００７１】(15)ホスフォセルロースカラムからのプー
ルを、20mM Ｋ2 ＰＯ4 ，pH7.4 ，0.1mM ＥＤＴＡ，10
mMβ−メルカプトエタノール，0.1M ＫＣｌで平衡化さ
れたヘリパン−セファロースＣＬ−６Ｂカラム（ 2.5×
2.5cm ）に載置し、２倍カラム容量の同一緩衝液で洗浄
する。0.1M〜1.0MのＫＣｌ（総容量 700ml）の直線的勾
配を展開し、カラムに適用する。10mlずつの画分を採集
する。その画分を、ラムダＤＮＡに対するHinc II 制限
エンドヌクレアーゼ活性の存在に関してアッセイする。
その活性画分をプールし、 100容量の緩衝液（10mM Ｋ
2 ＰＯ4 ，pH7.3，0.1mM ＥＤＴＡ，10mM β−メルカ
プトエタノール，0.1M ＫＣｌ）に対して透析する。
ルを、20mM Ｋ2 ＰＯ4 ，pH7.4 ，0.1mM ＥＤＴＡ，10
mMβ−メルカプトエタノール，0.1M ＫＣｌで平衡化さ
れたヘリパン−セファロースＣＬ−６Ｂカラム（ 2.5×
2.5cm ）に載置し、２倍カラム容量の同一緩衝液で洗浄
する。0.1M〜1.0MのＫＣｌ（総容量 700ml）の直線的勾
配を展開し、カラムに適用する。10mlずつの画分を採集
する。その画分を、ラムダＤＮＡに対するHinc II 制限
エンドヌクレアーゼ活性の存在に関してアッセイする。
その活性画分をプールし、 100容量の緩衝液（10mM Ｋ
2 ＰＯ4 ，pH7.3，0.1mM ＥＤＴＡ，10mM β−メルカ
プトエタノール，0.1M ＫＣｌ）に対して透析する。
【００７２】(16) Hinc II活性の透析プール（50ml）を
１ml Mono Q FPLC カラム（Pharmacia ）に載置し、緩
衝液Ｓ（20mM Ｋ2 ＰＯ4 ，pH6.9 ，10mM β−メルカ
プトエタノール，0.05M ＫＣｌ）で洗浄し、50mMから0.
10M までの直線勾配のＫＣｌ40mlをＳ緩衝液中で展開
し、カラムに適用する。１mlずつの画分を採集し、 Hin
cII制限エンドヌクレアーゼ活性の存在に関してアッセ
イする。
１ml Mono Q FPLC カラム（Pharmacia ）に載置し、緩
衝液Ｓ（20mM Ｋ2 ＰＯ4 ，pH6.9 ，10mM β−メルカ
プトエタノール，0.05M ＫＣｌ）で洗浄し、50mMから0.
10M までの直線勾配のＫＣｌ40mlをＳ緩衝液中で展開
し、カラムに適用する。１mlずつの画分を採集し、 Hin
cII制限エンドヌクレアーゼ活性の存在に関してアッセ
イする。
【００７３】(17)大部分のHinc II 活性を含有する中央
画分を１mlポリCat −Ａ FPLCカラム（Pharmacia ）に
載置し、緩衝液Ｓ（20mM Ｋ2 ＰＯ4 ，pH6.9 ，10mM
β−メルカプトエタノール，0.05M ＫＣｌ）で洗浄し、
50mMから0.10M までの直線勾配のＫＣｌ40mlをＳ緩衝液
中で展開し、カラムに適用する。１mlずつの画分を収集
し、Hinc II 制限エンドヌクレアーゼ活性の存在に関し
てアッセイする。最も活性の高い２つの画分は均質であ
る。エンドヌクレアーゼは、蛋白質１mg当たり約250,00
0単位の比活性を示し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル上での分子量は27,000ダルトンであった。
画分を１mlポリCat −Ａ FPLCカラム（Pharmacia ）に
載置し、緩衝液Ｓ（20mM Ｋ2 ＰＯ4 ，pH6.9 ，10mM
β−メルカプトエタノール，0.05M ＫＣｌ）で洗浄し、
50mMから0.10M までの直線勾配のＫＣｌ40mlをＳ緩衝液
中で展開し、カラムに適用する。１mlずつの画分を収集
し、Hinc II 制限エンドヌクレアーゼ活性の存在に関し
てアッセイする。最も活性の高い２つの画分は均質であ
る。エンドヌクレアーゼは、蛋白質１mg当たり約250,00
0単位の比活性を示し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル上での分子量は27,000ダルトンであった。
【００７４】(18)10μｇの均質Hinc II エンドヌクレア
ーゼをApplied Biosystemsモデル４７０Ａ気相蛋白質シ
ーケンサーに掛けてアミノ末端蛋白質配列決定を行っ
た。最初の24残基を分解した。その結果得られた配列を
以下に示す：XFIKPIXQDINXXLIGQKVKXXKX（蛋白質配列の
１文字コードの説明は表１に示した。）。
ーゼをApplied Biosystemsモデル４７０Ａ気相蛋白質シ
ーケンサーに掛けてアミノ末端蛋白質配列決定を行っ
た。最初の24残基を分解した。その結果得られた配列を
以下に示す：XFIKPIXQDINXXLIGQKVKXXKX（蛋白質配列の
１文字コードの説明は表１に示した。）。
【００７５】
【表１】
【００７６】(19)蛋白質配列に基づいて、以下の配列を
用いて14mer オリゴマーを作製した：５′ATH GGN CAR
AAA GT３′（Ｈ＝Ａ，Ｃ，又はＴ；Ｎ＝Ａ，Ｃ，Ｇ又は
Ｔ；Ｒ＝Ａ又はＧ）。
用いて14mer オリゴマーを作製した：５′ATH GGN CAR
AAA GT３′（Ｈ＝Ａ，Ｃ，又はＴ；Ｎ＝Ａ，Ｃ，Ｇ又は
Ｔ；Ｒ＝Ａ又はＧ）。
【００７７】これを用いて、 p（ pＢＩＩＯＩ）HincＭ
−10.5−１上のエンドヌクレアーゼのアミノ末端の位置
をマッピングした。このオリゴマーを用いて、蛋白質配
列を立証するＤＮＡ配列が得られたし、また以下の配列
を用いて作製される25−mer オリゴマーに特有の配列が
示された：５′ATG AGT TTC ATA AAA CCT ATT TAT C
３′。この25−mer オリゴマーを用いて、エンドヌクレ
アーゼの方向を決定する助けとなり、さらにエンドヌク
レアーゼのアミノ末端の位置及び p（ pＢＩＩＯＩ）Hi
ncＭ−10.5−１に存在するエンドヌクレアーゼ遺伝子部
分を明確にするＤＮＡ配列を得た。25−mer オリゴマー
を用いて、Haemophilus influenzae Rc ゲノムの種々の
制限断片にエンドヌクレアーゼ遺伝子をマッピングし
た。ベクターＤＮＡに対して作製された配列特異性オリ
ゴマー、及びメチラーゼ遺伝子内に位置することが公知
の欠失クローンを用いて、メチラーゼ遺伝子の方向が、
エンドヌクレアーゼ遺伝子の方向が決定されたのと同じ
方法で決定された。
−10.5−１上のエンドヌクレアーゼのアミノ末端の位置
をマッピングした。このオリゴマーを用いて、蛋白質配
列を立証するＤＮＡ配列が得られたし、また以下の配列
を用いて作製される25−mer オリゴマーに特有の配列が
示された：５′ATG AGT TTC ATA AAA CCT ATT TAT C
３′。この25−mer オリゴマーを用いて、エンドヌクレ
アーゼの方向を決定する助けとなり、さらにエンドヌク
レアーゼのアミノ末端の位置及び p（ pＢＩＩＯＩ）Hi
ncＭ−10.5−１に存在するエンドヌクレアーゼ遺伝子部
分を明確にするＤＮＡ配列を得た。25−mer オリゴマー
を用いて、Haemophilus influenzae Rc ゲノムの種々の
制限断片にエンドヌクレアーゼ遺伝子をマッピングし
た。ベクターＤＮＡに対して作製された配列特異性オリ
ゴマー、及びメチラーゼ遺伝子内に位置することが公知
の欠失クローンを用いて、メチラーゼ遺伝子の方向が、
エンドヌクレアーゼ遺伝子の方向が決定されたのと同じ
方法で決定された。
【００７８】(20)段階(18)で得られたデータに基づい
て、精製 Haemophilus influenzae RcゲノムＤＮＡ
（段階(1) 同様に調製される）を、以下の通りに、Hind
IIIを用いて限定消化した：10mM Tris,pH7.5,10mM Ｍ
ｇＣｌ2 ，100mM ＮａＣｌ，10mMメルカプトエタノール
緩衝液中に 100μｇ／mlの濃度で溶解したＤＮＡ溶液 3
00μｌを１本のチューブ中に分配した。そのチューブに
50単位のHind IIIを加えた。チューブを37℃で１時間イ
ンキュベートし、次いでフェノール／クロロホルムで抽
出して、エタノールで沈澱した。そのペレットを10mMト
リス塩酸，１mM ＥＤＴＡ，pH8.0 の 300μｌ液に再溶
解し、各10μｌをアガロースゲル電気泳動で分析した。
て、精製 Haemophilus influenzae RcゲノムＤＮＡ
（段階(1) 同様に調製される）を、以下の通りに、Hind
IIIを用いて限定消化した：10mM Tris,pH7.5,10mM Ｍ
ｇＣｌ2 ，100mM ＮａＣｌ，10mMメルカプトエタノール
緩衝液中に 100μｇ／mlの濃度で溶解したＤＮＡ溶液 3
00μｌを１本のチューブ中に分配した。そのチューブに
50単位のHind IIIを加えた。チューブを37℃で１時間イ
ンキュベートし、次いでフェノール／クロロホルムで抽
出して、エタノールで沈澱した。そのペレットを10mMト
リス塩酸，１mM ＥＤＴＡ，pH8.0 の 300μｌ液に再溶
解し、各10μｌをアガロースゲル電気泳動で分析した。
【００７９】(21)連結：断片化したＤＮＡを以下の通り
に pＢＩＩＨＩ．２（Ｐvu II 部位に挿入されたＨpaＩ
リンカーと、ＥcoＲＩ部位に挿入されたＢgl II リンカ
ーを有する pＮＯ1523）に連結した：10.0μｇのHind I
II消化Haemophilus influenzaeRc ＤＮＡ(100μｌ) を
2.0 μｇのHind III−開裂及び脱リン酸化 pＢＩＩＨ
Ｉ．２（20μｌ）と混合し、エタノールで沈澱した。そ
のＤＮＡを12,000ｇで、４℃で15分間遠心分離し、70％
エタノール 100μｌで１回洗浄した。そのＤＮＡを１×
連結緩衝液（50mM Tris, pH7.5,10mM ＭｇＣｌ2 ，10mM
ＤＴＴ，0.5mM ＡＴＰ）99μｌに再懸濁してＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ１μｌを加え、その混合液を１６℃で１６時
間インキュベートした。 2.5μｌ及び5.0 μｌのアリコ
ートを用いて、以下の通りに E.coli ＲＲ１株を形質転
換した：各アリコートを 200μｌの氷冷コンピテント
E.coli ＲＲ１細胞と混合し、氷上に30分間放置した。4
2℃での２分間ヒートショックした後、細胞を１mlのLur
ia ブロス（Ｌ−ブロス）で希釈し、37℃で１時間増殖
した。
に pＢＩＩＨＩ．２（Ｐvu II 部位に挿入されたＨpaＩ
リンカーと、ＥcoＲＩ部位に挿入されたＢgl II リンカ
ーを有する pＮＯ1523）に連結した：10.0μｇのHind I
II消化Haemophilus influenzaeRc ＤＮＡ(100μｌ) を
2.0 μｇのHind III−開裂及び脱リン酸化 pＢＩＩＨ
Ｉ．２（20μｌ）と混合し、エタノールで沈澱した。そ
のＤＮＡを12,000ｇで、４℃で15分間遠心分離し、70％
エタノール 100μｌで１回洗浄した。そのＤＮＡを１×
連結緩衝液（50mM Tris, pH7.5,10mM ＭｇＣｌ2 ，10mM
ＤＴＴ，0.5mM ＡＴＰ）99μｌに再懸濁してＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ１μｌを加え、その混合液を１６℃で１６時
間インキュベートした。 2.5μｌ及び5.0 μｌのアリコ
ートを用いて、以下の通りに E.coli ＲＲ１株を形質転
換した：各アリコートを 200μｌの氷冷コンピテント
E.coli ＲＲ１細胞と混合し、氷上に30分間放置した。4
2℃での２分間ヒートショックした後、細胞を１mlのLur
ia ブロス（Ｌ−ブロス）で希釈し、37℃で１時間増殖
した。
【００８０】(22)一次細胞ライブラリー：段階(4) にさ
らに１段階加えた方法で調製した：段階(18)から得られ
たデータに基づいて、配列特異性25−mer オリゴマー
（段階（19））を用いてライブラリーをプローブし、エ
ンドヌクレアーゼ及びメチラーゼ遺伝子を含有すると思
われる適当なサイズのHind III断片を探した。この断片
は一次細胞ライブラリー中に存在した。
らに１段階加えた方法で調製した：段階(18)から得られ
たデータに基づいて、配列特異性25−mer オリゴマー
（段階（19））を用いてライブラリーをプローブし、エ
ンドヌクレアーゼ及びメチラーゼ遺伝子を含有すると思
われる適当なサイズのHind III断片を探した。この断片
は一次細胞ライブラリー中に存在した。
【００８１】(23)一次選択及び選択されるライブラリ
ー：段階(5) と同様に調製した。
ー：段階(5) と同様に調製した。
【００８２】(24)個々の分析：上記形質転換から得られ
たコロニーを取り出し、アンピシリンを含むＬＢ寒天平
板上と、アンピシリン及びストレプトマイシンを含むＬ
Ｂ寒天平板上にプレーティングした。
たコロニーを取り出し、アンピシリンを含むＬＢ寒天平
板上と、アンピシリン及びストレプトマイシンを含むＬ
Ｂ寒天平板上にプレーティングした。
【００８３】ampR 及び strepR である18個のコロニー
を10mlの培養物中で増殖し、それらが保有するプラスミ
ドを、段階(6) に記載のミニプリープ精製法によって調
製した。続いてプラスミドミニプリープをHinc II 及び
Hind IIIで消化して分析した。
を10mlの培養物中で増殖し、それらが保有するプラスミ
ドを、段階(6) に記載のミニプリープ精製法によって調
製した。続いてプラスミドミニプリープをHinc II 及び
Hind IIIで消化して分析した。
【００８４】(25)メチラーゼ遺伝子クローン：分析した
プラスミドの27％はHinc II に耐性であり、また約3.0k
b の長さのHind III断片を保有することが判明した。こ
れらのプラスミドは、その後、Hinc II 修飾メチラーゼ
遺伝子及び制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の両方を保有
することが示された。これらのプラスミドも、各々、１
つ又はそれ以上の擬似断片を保有することが判明した。
観察されたプラスミドの他の63％はHinc II に耐性でな
く、また擬似断片を含有するかあるいは再連結されたベ
クターであった。
プラスミドの27％はHinc II に耐性であり、また約3.0k
b の長さのHind III断片を保有することが判明した。こ
れらのプラスミドは、その後、Hinc II 修飾メチラーゼ
遺伝子及び制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の両方を保有
することが示された。これらのプラスミドも、各々、１
つ又はそれ以上の擬似断片を保有することが判明した。
観察されたプラスミドの他の63％はHinc II に耐性でな
く、また擬似断片を含有するかあるいは再連結されたベ
クターであった。
【００８５】(26)制限遺伝子クローン：Hinc II 修飾メ
チラーゼ遺伝子を保有するものとして上記（階段(24)）
で同定されたクローンを、Hinc II 制限エンドヌクレア
ーゼ遺伝子に関しても調べた。これは、段階(8) に記載
の通りに実施した。調べたクローンはすべて、エンドヌ
クレアーゼ活性を有していた。
チラーゼ遺伝子を保有するものとして上記（階段(24)）
で同定されたクローンを、Hinc II 制限エンドヌクレア
ーゼ遺伝子に関しても調べた。これは、段階(8) に記載
の通りに実施した。調べたクローンはすべて、エンドヌ
クレアーゼ活性を有していた。
【００８６】(27)メチラーゼ陽性クローンはすべて、エ
ンドヌクレアーゼを含有することが判明した。これらの
クローンは、いずれかの方向に１グラムの湿潤細胞ペー
スト当たり約 1,000単位のHinc II 制限エンドヌクレア
ーゼを合成することが判明した。
ンドヌクレアーゼを含有することが判明した。これらの
クローンは、いずれかの方向に１グラムの湿潤細胞ペー
スト当たり約 1,000単位のHinc II 制限エンドヌクレア
ーゼを合成することが判明した。
【００８７】(28) p（ pＢＩＩＨＩ．２）Hinc II ＲＭ
−8.0 −Ａ１を用いて同一遺伝子系E.coli株を形質転換
し、表現型ＭcrＡ，ＭcrＢまたはmrr によって生じる潜
在的効果を探索した。このＲＭクローンはいかなる mrr
+ 株中にも形質転換できず、したがって増殖不可能であ
ることが知見された。
−8.0 −Ａ１を用いて同一遺伝子系E.coli株を形質転換
し、表現型ＭcrＡ，ＭcrＢまたはmrr によって生じる潜
在的効果を探索した。このＲＭクローンはいかなる mrr
+ 株中にも形質転換できず、したがって増殖不可能であ
ることが知見された。
【００８８】(29) p（ pＢＩＩＨＩ．２）Hinc II ＲＭ
−8.0 −Ａ１から得られる3.0kb のHind III断片を、以
下の方法で、ゲル調製（gel prep）し、Hind IIIで切断
され且つ脱リン酸化された pＵＣ19との連結反応に用い
た： 250ｎｇの2.7kb ゲル調製断片（20μｌ）を 100ｎ
ｇ（ 1μｌ）のHind III−切断及び脱リン酸化 pＵＣ１
９と混合し、エタノール沈澱した。そのＤＮＡを１２，
０００ｇで、４℃で15分間遠心分離し、70％エタノール
100μｌで１回洗浄した。ＤＮＡを１×連結緩衝液（50
mMTris, pH7,5, 10mM ＭｇＣｌ2 ，10mM ＤＴＴ，0.5
mM ＡＴＰ）10μｌに再懸濁して、１μｌのＴ４ ＤＮ
Ａリガーゼを加え、その混合液を16℃で16時間インキュ
ベートした。5.0 μｌのアリコートを用いて、以下の通
り E.coli ＲＲ１株を形質転換した：各アリコートを 2
00μｌの氷冷コンピテント E.coli ＲＲ１細胞と混合
し、氷上に30分間放置した。42℃で２分間ヒートショッ
クした後、細胞を１mlのLuria ブロス（Ｌ−ブロス）で
希釈し、37℃で１時間増殖した。形質転換細胞培養物を
遠心分離し、 250μｌ容量に再懸濁し、 100μｇ／mlの
アンピシリンを含む Luria−寒天（Ｌ−寒天）平板上に
プレーティングした。37℃で一晩インキュベーションし
た後、コロニーを摘み取ってアンピシリンを含むＬＢ寒
天上にプレーティングし、37℃で一晩インキュベートし
た。 ampR である18個のコロニーを10ml培養物中で培養
し、それらが保有するプラスミドを、段階(6) に記載の
ミニプレプ精製法によって調製した。引き続いて、プラ
スミドミニプレプを、Hinc II 及びHind IIIで消化して
分析した。
−8.0 −Ａ１から得られる3.0kb のHind III断片を、以
下の方法で、ゲル調製（gel prep）し、Hind IIIで切断
され且つ脱リン酸化された pＵＣ19との連結反応に用い
た： 250ｎｇの2.7kb ゲル調製断片（20μｌ）を 100ｎ
ｇ（ 1μｌ）のHind III−切断及び脱リン酸化 pＵＣ１
９と混合し、エタノール沈澱した。そのＤＮＡを１２，
０００ｇで、４℃で15分間遠心分離し、70％エタノール
100μｌで１回洗浄した。ＤＮＡを１×連結緩衝液（50
mMTris, pH7,5, 10mM ＭｇＣｌ2 ，10mM ＤＴＴ，0.5
mM ＡＴＰ）10μｌに再懸濁して、１μｌのＴ４ ＤＮ
Ａリガーゼを加え、その混合液を16℃で16時間インキュ
ベートした。5.0 μｌのアリコートを用いて、以下の通
り E.coli ＲＲ１株を形質転換した：各アリコートを 2
00μｌの氷冷コンピテント E.coli ＲＲ１細胞と混合
し、氷上に30分間放置した。42℃で２分間ヒートショッ
クした後、細胞を１mlのLuria ブロス（Ｌ−ブロス）で
希釈し、37℃で１時間増殖した。形質転換細胞培養物を
遠心分離し、 250μｌ容量に再懸濁し、 100μｇ／mlの
アンピシリンを含む Luria−寒天（Ｌ−寒天）平板上に
プレーティングした。37℃で一晩インキュベーションし
た後、コロニーを摘み取ってアンピシリンを含むＬＢ寒
天上にプレーティングし、37℃で一晩インキュベートし
た。 ampR である18個のコロニーを10ml培養物中で培養
し、それらが保有するプラスミドを、段階(6) に記載の
ミニプレプ精製法によって調製した。引き続いて、プラ
スミドミニプレプを、Hinc II 及びHind IIIで消化して
分析した。
【００８９】(30)メチラーゼ遺伝子クローン：分析した
プラスミドの50％以上がHinc II 消化に耐性であり、ま
た約3.0kb の長さのHind III断片を保有することが判明
した。これらのプラスミドは、その後、Hinc II 修飾メ
チラーゼ遺伝子及び制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の両
方を保有することが示された。残りのプラスミドは、再
連結された pＵＣ19であった。
プラスミドの50％以上がHinc II 消化に耐性であり、ま
た約3.0kb の長さのHind III断片を保有することが判明
した。これらのプラスミドは、その後、Hinc II 修飾メ
チラーゼ遺伝子及び制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の両
方を保有することが示された。残りのプラスミドは、再
連結された pＵＣ19であった。
【００９０】(31)制限遺伝子クローン：Hinc II 修飾メ
チラーゼ遺伝子を保有するものとして上記（段階(28)）
で同定されたクローンは、Hinc II 制限エンドヌクレア
ーゼ遺伝子に関しても調べた。これは、段階(8) に記載
の通りに実施した。試験したクローンはすべて、エンド
ヌクレアーゼ活性を示した。
チラーゼ遺伝子を保有するものとして上記（段階(28)）
で同定されたクローンは、Hinc II 制限エンドヌクレア
ーゼ遺伝子に関しても調べた。これは、段階(8) に記載
の通りに実施した。試験したクローンはすべて、エンド
ヌクレアーゼ活性を示した。
【００９１】(32)メチラーゼ陽性クローンはすべて、エ
ンドヌクレアーゼを含有することが判明した。これらの
クローンは、 p(pＵＣ19) Hinc II ＲＭ−5.7 −10（Ｎ
ＥＢ＃５２０）では方向Ａに湿潤細胞ペースト１ｇ当た
り約８０，０００単位のHinc II 制限エンドヌクレアー
ゼを合成し、 p(pＵＣ19) Hinc II ＲＭ−5.7 −４では
方向Ｂに湿潤細胞ペースト１ｇ当たり 2,000単位のHinc
II 制限エンドヌクレアーゼを合成することが判明し
た。
ンドヌクレアーゼを含有することが判明した。これらの
クローンは、 p(pＵＣ19) Hinc II ＲＭ−5.7 −10（Ｎ
ＥＢ＃５２０）では方向Ａに湿潤細胞ペースト１ｇ当た
り約８０，０００単位のHinc II 制限エンドヌクレアー
ゼを合成し、 p(pＵＣ19) Hinc II ＲＭ−5.7 −４では
方向Ｂに湿潤細胞ペースト１ｇ当たり 2,000単位のHinc
II 制限エンドヌクレアーゼを合成することが判明し
た。
【００９２】(33) Hinc II制限エンドヌクレアーゼ及び
メチラーゼをコードする遺伝子を保有する組換えプラス
ミド p(pＵＣ) Hinc II ＲＭ−10−5.7 （NEB#520 ）を
形質転換によりE.coliＲＲ１株中に移入した。段階(28)
におけると同様の同一遺伝子系株を形質転換するに際し
ては、 p(pＵＣ) Hinc II ＲＭ−10−5.7 （NEB#520 ）
はこれらの株中に形質転換可能であったが、しかし10ml
以上の液体培養物中では増殖不可能であった。
メチラーゼをコードする遺伝子を保有する組換えプラス
ミド p(pＵＣ) Hinc II ＲＭ−10−5.7 （NEB#520 ）を
形質転換によりE.coliＲＲ１株中に移入した。段階(28)
におけると同様の同一遺伝子系株を形質転換するに際し
ては、 p(pＵＣ) Hinc II ＲＭ−10−5.7 （NEB#520 ）
はこれらの株中に形質転換可能であったが、しかし10ml
以上の液体培養物中では増殖不可能であった。
【００９３】(34)段階 (9)〜(16)に記載の通り（ある変
更を加えて）、Hinc II エンドヌクレアーゼを調製し、
細胞を以下の成分より成るＬＢブロス培地中で培養し
た：10ｇ／ｌのカゼイン加水分解物；５ｇ／ｌの酵母菌
抽出物；10ｇ／ｌのＮａＣｌ；１ｇ／ｌの塩化マグネシ
ウム・６水和物；１ｇ／ｌのブドウ糖； 100mg／ｌのア
ンピシリン。pHはＮａＯＨで7.2 に調節する。精製され
たエンドヌクレアーゼは１mgの蛋白質につき約 250,000
単位の比活性を示すことが判明した。
更を加えて）、Hinc II エンドヌクレアーゼを調製し、
細胞を以下の成分より成るＬＢブロス培地中で培養し
た：10ｇ／ｌのカゼイン加水分解物；５ｇ／ｌの酵母菌
抽出物；10ｇ／ｌのＮａＣｌ；１ｇ／ｌの塩化マグネシ
ウム・６水和物；１ｇ／ｌのブドウ糖； 100mg／ｌのア
ンピシリン。pHはＮａＯＨで7.2 に調節する。精製され
たエンドヌクレアーゼは１mgの蛋白質につき約 250,000
単位の比活性を示すことが判明した。
【図１】この図は、Hinc II 制限エンドヌクレアーゼを
クローニングするための概要を示す。
クローニングするための概要を示す。
【図２】この図は、Hinc II 制限エンドヌクレアーゼを
製造するための概要を示す。
製造するための概要を示す。
【図３】この図は、Hinc II 制限エンドヌクレアーゼ及
び修飾メチラーゼをコードするHaemophilus influenzae
Rc から得た3.0kb Hind III断片の制限地図である。そ
の断片を pＢＩＩＨＩ．２（ATCC 67902）のHind III部
位中にクローン化して p（ pＢＩＩＨＩ．２）Hinc II
ＲＭ−8.0 −Ａ１を作製し、続いて pＵＣ19（ATCC 372
54）中にサブクローン化して p(pＵＣ19) Hinc II ＲＭ
−5.7 −４及び p(pＵＣ19) Hinc II ＲＭ−5.7 −10を
作った。
び修飾メチラーゼをコードするHaemophilus influenzae
Rc から得た3.0kb Hind III断片の制限地図である。そ
の断片を pＢＩＩＨＩ．２（ATCC 67902）のHind III部
位中にクローン化して p（ pＢＩＩＨＩ．２）Hinc II
ＲＭ−8.0 −Ａ１を作製し、続いて pＵＣ19（ATCC 372
54）中にサブクローン化して p(pＵＣ19) Hinc II ＲＭ
−5.7 −４及び p(pＵＣ19) Hinc II ＲＭ−5.7 −10を
作った。
【図４】この図は、 p(pＵＣ19) Hinc II ＲＭ−5.7 −
４及び p(pＵＣ19) Hinc II ＲＭ−5.7 −10（NEB#520
）を保有するE.coli ＲＲ１(ATCC 31343)の細胞抽出
物中のHinc II 制限エンドヌクレアーゼ活性を立証する
アガロースゲル電気泳動の写真である。
４及び p(pＵＣ19) Hinc II ＲＭ−5.7 −10（NEB#520
）を保有するE.coli ＲＲ１(ATCC 31343)の細胞抽出
物中のHinc II 制限エンドヌクレアーゼ活性を立証する
アガロースゲル電気泳動の写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 フイリス・エイ・リーズ アメリカ合衆国、マサチユーセツツ・ 02174、アーリントン、デイモン・パー ク・９
Claims (8)
- 【請求項１】 Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅ
ｎｚａｅ Ｒｃ由来の下記式のＤＮＡフラグメントの
５'−端からの少なくとも最初のＰｓｔＩ制限部位から
下記式のＤＮＡフラグメントの３’−端ＨｉｎｄＩＩＩ
制限部位まで延びているＤＮＡセグメントを有し、下記
式のＤＮＡフラグメントではない、 ＤＮＡ配列ＧＴＰｙ↓ＰｕＡＣを認識して矢印の場所に
おいて開裂するＨｉｎｃＩＩ制限エンドヌクレアーゼを
コードしている、ＤＮＡ分子。 【化１】 - 【請求項２】 上記ＤＮＡセグメントが上記ＤＮＡフラ
グメントの二つのＸｂａＩ制限部位のいずれか一方から
延びている請求項１に記載のＤＮＡ分子。 - 【請求項３】 上記ＤＮＡセグメントが上記ＤＮＡフラ
グメントのＮｄｅＩ制限部位から延びている請求項１に
記載のＤＮＡ分子。 - 【請求項４】 上記ＤＮＡセグメントが上記ＤＮＡフラ
グメントのＥｃｏＲＩ制限部位から延びている請求項１
に記載のＤＮＡ分子。 - 【請求項５】 上記ＤＮＡセグメントが、ＨｉｎｃＩＩ
制限エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子の読みとり
枠を変えないようにして、上記ＤＮＡフラグメントの
５'−端ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位から始まって最初のＰ
ｓｔＩ制限部位にて終わるＤＮＡ配列の少なくとも一つ
の塩基が置換され、上記ＤＮＡ配列に少なくとも一つの
塩基が付加され、および／または上記ＤＮＡ配列から少
なくとも一つの塩基が除去されることにより得られる、
修飾ＤＮＡである請求項１に記載のＤＮＡ分子。 - 【請求項６】 請求項１ないし５に記載のいずれかのＤ
ＮＡ分子が読みとり枠内に挿入されている組換えＤＮＡ
ベクター。 - 【請求項７】 請求項６に記載の組換えＤＮＡベクター
により形質転換された宿主。 - 【請求項８】 請求項７に記載の宿主を培養することを
有する、ＨｉｎｃＩＩ制限エンドヌクレアーゼを製造す
る方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/324,402 US5015581A (en) | 1989-03-15 | 1989-03-15 | Method for producing the Hinc II restriction endonuclease and methylase |
| US324402 | 1989-03-15 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2065542A Division JP2672683B2 (ja) | 1989-03-15 | 1990-03-15 | Ｈｉｎｃ▲ＩＩ▼制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1080284A JPH1080284A (ja) | 1998-03-31 |
| JP3156759B2 true JP3156759B2 (ja) | 2001-04-16 |
Family
ID=23263422
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2065542A Expired - Lifetime JP2672683B2 (ja) | 1989-03-15 | 1990-03-15 | Ｈｉｎｃ▲ＩＩ▼制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼの製造方法 |
| JP11991397A Expired - Lifetime JP3156759B2 (ja) | 1989-03-15 | 1997-05-09 | Ｈｉｎｃ ＩＩ制限エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡセグメント |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2065542A Expired - Lifetime JP2672683B2 (ja) | 1989-03-15 | 1990-03-15 | Ｈｉｎｃ▲ＩＩ▼制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼの製造方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5015581A (ja) |
| EP (1) | EP0388212B1 (ja) |
| JP (2) | JP2672683B2 (ja) |
| CA (1) | CA2012149C (ja) |
| DE (2) | DE69023789T2 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| US5298404A (en) * | 1989-10-13 | 1994-03-29 | New England Biolabs, Inc. | Method for producing the Hpa I restriction endonuclease and methylase |
| US5278060A (en) * | 1990-08-30 | 1994-01-11 | New England Biolabs, Inc. | Method for producing the Nla III restriction endonuclease and methylase |
| US5288696A (en) * | 1990-09-07 | 1994-02-22 | New England Biolabs, Inc. | Method for producing and cloning SacII restriction endonuclease and methylase |
| US5202248A (en) * | 1990-11-02 | 1993-04-13 | New England Biolabs, Inc. | Method for cloning and producing the nco i restriction endonuclease and methylase |
| US5192676A (en) * | 1991-02-05 | 1993-03-09 | New England Biolabs, Inc. | Type ii restriction endonuclease, asci, obtainable from arthrobacter species and a process for producing the same |
| US5200337A (en) * | 1991-10-25 | 1993-04-06 | New England Biolabs, Inc. | Type ii restriction endonuclease, apo i, obtainable from arthrobacter protophormiae and a process for producing the same |
| JP3400124B2 (ja) * | 1994-08-08 | 2003-04-28 | 株式会社日立製作所 | パストランジスタ型セレクタ回路及び論理回路 |
| US5731185A (en) * | 1995-07-21 | 1998-03-24 | New England Biolabs, Inc. | Isolated DNA encoding the hphi restriction endonuclease and related methods for producing the same |
| US5824529A (en) * | 1996-03-06 | 1998-10-20 | New England Biolabs, Inc. | Method for cloning and producing the PshAI restriction endonuclease |
| US8227231B2 (en) | 2005-08-04 | 2012-07-24 | New England Biolabs, Inc. | Restriction endonucleases, DNA encoding these endonucleases and methods for identifying new endonucleases with the same or varied specificity |
| CN109880841A (zh) * | 2018-12-31 | 2019-06-14 | 吴江近岸蛋白质科技有限公司 | 一种HindIII限制性核酸内切酶的制备方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IN166864B (ja) * | 1985-03-01 | 1990-07-28 | New England Biolabs Inc |
-
1989
- 1989-03-15 US US07/324,402 patent/US5015581A/en not_active Ceased
-
1990
- 1990-03-14 CA CA002012149A patent/CA2012149C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-15 EP EP90302817A patent/EP0388212B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-15 DE DE69023789T patent/DE69023789T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-15 DE DE90302817T patent/DE388212T1/de active Pending
- 1990-03-15 JP JP2065542A patent/JP2672683B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-01-12 US US08/003,277 patent/USRE35248E/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-05-09 JP JP11991397A patent/JP3156759B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0388212B1 (en) | 1995-11-29 |
| USRE35248E (en) | 1996-05-21 |
| JPH1080284A (ja) | 1998-03-31 |
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| CA2012149A1 (en) | 1990-09-15 |
| CA2012149C (en) | 1999-11-16 |
| US5015581A (en) | 1991-05-14 |
| DE69023789T2 (de) | 1996-08-08 |
| DE388212T1 (de) | 1994-02-03 |
| EP0388212A1 (en) | 1990-09-19 |
| DE69023789D1 (de) | 1996-01-11 |
| JPH0322978A (ja) | 1991-01-31 |
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