CN109880841A - 一种HindIII限制性核酸内切酶的制备方法 - Google Patents

一种HindIII限制性核酸内切酶的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109880841A
CN109880841A CN201811651453.5A CN201811651453A CN109880841A CN 109880841 A CN109880841 A CN 109880841A CN 201811651453 A CN201811651453 A CN 201811651453A CN 109880841 A CN109880841 A CN 109880841A
Authority
CN
China
Prior art keywords
restriction endonuclease
hindiii restriction
preparation
hindiii
nacl
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201811651453.5A
Other languages
English (en)
Inventor
徐志豪
郑实
崔利兰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
WUJIANG NOVOPROTEIN TECHNOLOGY Co Ltd
Original Assignee
WUJIANG NOVOPROTEIN TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by WUJIANG NOVOPROTEIN TECHNOLOGY Co Ltd filed Critical WUJIANG NOVOPROTEIN TECHNOLOGY Co Ltd
Priority to CN201811651453.5A priority Critical patent/CN109880841A/zh
Publication of CN109880841A publication Critical patent/CN109880841A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一种HindIII限制性核酸内切酶的制备方法,该方法构建HindIII限制性核酸内切酶的原核表达载体,转入工程菌中,经培养后,获得表达菌株,然后进行表达和纯化。本发明开发了HindIII限制性核酸内切酶的制备方法。本发明通过构建HindIII限制性核酸内切酶的原核表达载体,转入工程菌中,经培养后,获得表达菌株,然后进行表达纯化获得HindIII限制性核酸内切酶。本发明相较常规的制备方法,本发明采用的重组蛋白表达制备方法具有制备周期短、纯化过程简便、产量高等特点。使用本方法制备出的HindIII限制酶,其生理活性高且稳定。

Description

一种HindIII限制性核酸内切酶的制备方法
技术领域
本发明属于分子生物学和细胞工程领域,特别涉及限制性核酸内切酶制备。
背景技术
限制性核酸内切酶是可以识别并附着特定的脱氧核苷酸序列,并在每条链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶,简称限制酶。根据限制酶的结构,辅因子的需求切位与作用方式,可将限制酶分为三种类型,分别是第一型(TypeI)、第二型(Type II)及第三型(Type III)。HindIII限制酶就属于第二型限制酶,只具有识别切割的作用,修饰作用由其他酶进行。识别位点是:AAGCTT,切割后的片段具有黏性末端,是遗传工程上,实用性较高的限制酶种类。常规的制备方法为从细菌中分离提纯出HindIII限制酶周期长不够稳定。
发明内容
为了解决上述现有各种方法的不足,本发明其中一方面开发了HindIII限制性核酸内切酶的制备方法。本发明通过构建HindIII限制性核酸内切酶的原核表达载体,转入工程菌中,经培养后,获得表达菌株,然后进行表达纯化获得HindIII限制性核酸内切酶。
本发明相较常规的制备方法,本发明采用的重组蛋白表达制备方法具有制备周期短、纯化过程简便、产量高等特点。使用本方法制备出的HindIII限制酶,其生理活性高且稳定。
本发明的其中一方面提供了一种HindIII限制性核酸内切酶的制备方法,HindIII限制性核酸内切酶的制备方法构建HindIII限制性核酸内切酶的原核表达载体,转入工程菌中,经培养后,获得表达菌株,然后进行表达和纯化。
本发明的其中一方面提供了一种HindIII限制性核酸内切酶的制备方法,上述表达步骤如下:
步骤1,将获得的菌种1:100接种到LB培养基中,37℃,250rmp震荡培养到OD600=0.6时,加入1mM IPTG诱导表达,并低温诱导表达,离心收菌;
步骤2破菌,菌体总量与破菌缓冲液1∶10混合,超声破菌,12k转离心30min收集上清。
本发明的其中一方面提供了一种HindIII限制性核酸内切酶的制备方法,所述破菌缓冲液为20mM Tris、250mM NaCl和10mM咪唑混合溶液pH8.0。
本发明的其中一方面提供了一种HindIII限制性核酸内切酶的制备方法,所述纯化的方法为镍柱纯化。
本发明的其中一方面提供了一种HindIII限制性核酸内切酶的制备方法,所述纯化步骤如下:
步骤3.1第一步平衡:用平衡缓冲液(20mM Tris-HCl,pH8.0,250mM NaCl,10mM咪唑)平衡柱子,直至pH达到8.0,紫外检测读数稳定,检测调零后可以上样,所述样品为步骤2收集的上清。
步骤3.2第二步上样:样品应保持澄清,如发现沉淀浑浊则需要离心,收集流出。
步骤3.3第三步平衡:上样结束,用平衡缓冲液平衡层析柱,直到紫外检测读数回到基线或相对稳定。
步骤3.4第四步预洗:用预洗缓冲液(20mM Tris-HCl,pH8.0,250mM NaCl,50mM咪唑)预洗,收集洗脱组分。
步骤3.5第五步洗脱:用洗脱液(20mM Tris-HCl,pH8.0,250mM NaCl,100mM咪唑)洗脱目标蛋白,收集洗脱组分。
步骤3.6第六步洗柱:用洗柱缓冲液(20mM Tris-HCl,pH8.0,250mM NaCl,250mM咪唑)冲洗层析柱,收集洗脱组分。
本发明的其中一方面提供了一种HindIII限制性核酸内切酶的制备方法,使用SDS-PAGE检测确定所述纯化步骤中分步洗脱收集到的组分哪个为需要的HindIII限制性核酸内切酶。
本发明的其中一方面提供了一种HindIII限制性核酸内切酶的制备方法,构建HindIII限制性核酸内切酶的原核表达载体的目的基因为hindIIIR,所述目的基因序列如SEQ No.1。
本发明的其中一方面提供了一种HindIII限制性核酸内切酶,构建HindIII限制性核酸由上述任意一种HindIII限制性核酸内切酶的制备方法制得。
本发明的其中一方面提供了一种HindIII限制性核酸内切酶工程菌,该工程菌包含HindIII限制性核酸内切酶的原核表达载体,上述HindIII限制性核酸内切酶的原核表达载体的目的基因为hindIIIR,目的基因序列如SEQ No.1。
附图说明
图1、为本发明其一个实施例中电泳图;
图2、为本发明另一个实施例中电泳图。
具体实施方式
下述的实施例是为了进一步说明本发明的一些优选实施例,并非全部实施例。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例,都属于本发明的权利保护范围。下面将结合附图对本发明作进一步的说明。
实施例1:HindIII限制性核酸内切酶的制备
构建HindIII限制性核酸内切酶的原核表达载体,转入工程菌中,经培养后,获得表达菌株:
1.通过基因合成将目的基因hindIIIR(SEQ No.1:5’-ATGAAGAAAAGTGCGTTAGAGAAATTATTATCACTGATAGAAAATTTAACTAATCAAGAATTTAAACAGGCAACTAATAGTTTAATCTCATTTATTTATAAATTGAATAGAAATGAGGTTATTGAATTGGTTAGATCTATTGGAATACTTCCTGAGGCAATAAAACCAAGTTCTACACAAGAGAAATTATTCTCAAAAGCAGGAGATATTGTATTAGCTAAAGCTTTTCAATTACTTAATCTGAACTCAAAACCATTAGAACAGAGAGGTAATGCTGGAGATGTGATAGCACTCTCTAAAGAATTTAATTACGGCTTAGTTGCTGATGCTAAATCTTTTCGACTTAGTCGTACTGCTAAAAATCAAAAAGATTTTAAAGTAAAAGCGTTAAGTGAATGGCGAGAAGATAAGGATTATGCAGTATTAACAGCACCATTTTTTCAATATCCTACAACTAAAAGTCAAATTTTTAAGCAATCGTTAGATGAAAATGTTTTGTTATTTAGTTGGGAACATTTAGCTATATTATTACAGTTAGATTTAGAGGAAACTAATATTTTTTCTTTTGAGCAATTATGGAACTTTCCCAAAAAGCAAAGTAAAAAAACATCTGTATCTGATGCTGAAAATAATTTTATGAGAGATTTTAATAAATACTTTATGGATTTATTTAAAATAGATAAAGATACTTTAAATCAACTTCTTCAAAAAGAGATCAATTTTATTGAAGAAAGATCCTTGATAGAAAAGGAATATTGGAAAAAACAAATAAATATTATAAAAAATTTTACAAGAGAAGAAGCCATAGAAGCATTATTGAAAGATATAAATATGTCTTCAAAAATAGAAACTATTGATAGTTTTATTAAAGGGATAAAAAGTAATGATAGACTGTATTTATAA-3’)构建到商业化表达载体pET28a(+)中,获得重组质粒pET28a(+)-HindIIIR。
2.通过热激转化法将重组质粒转入BL21(DE3)菌株中。
3.加入500ul灭过菌的无抗培养基于37℃摇床250rmp培养1h,使抗性基因表达,菌体复苏。
4.培养后,取30ul培养液加200ul无抗LB,混匀涂带有抗生素的固体培养基平板,随后将平板倒置放于37℃培养箱培养12h以上。
5.在表达菌株平板上挑4个单克隆,置于含3ml带抗性LB培养基试管中,37℃摇床培养3h-4h。
6.培养至OD=0.5左右的时候,每管试管中取出700ul菌液+300ul 80%甘油保存菌种。
获得表达菌株后进行表达纯化:
7.将获得的菌种1:100接种到LB培养基中,37℃,250rmp震荡培养到OD600=0.6时,加入1mM IPTG诱导表达,为了提高蛋白可溶性表达的比例,同时将培养温度降至20℃,低温诱导表达过夜(16h),5k转离心收菌。
8.破菌∶菌体总量与破菌缓冲液(20mM Tris,250mM NaCl,10mM咪唑,pH8.0)1∶10混合,即1g菌体加入10ml缓冲液,超声破菌。12k转离心30min收集上清,过Ni柱纯化。
9.Ni柱纯化:
9.1第一步平衡:用平衡缓冲液(20mM Tris-HCl,pH8.0,250mM NaCl,10mM咪唑)平衡柱子,缓冲液及样品中不可有EDTA,Arg等物质,直至pH达到8.0,紫外检测读数稳定,一般为5~10个柱体积,检测调零后可以上样。
9.2第二步上样:样品应保持澄清,如发现沉淀浑浊则需要离心,收集流出。
9.3第三步平衡:上样结束,用平衡缓冲液平衡层析柱,直到紫外检测读数回到基线或相对稳定。
9.4第四步预洗:用预洗缓冲液(20mM Tris-HCl,pH8.0,250mM NaCl,50mM咪唑)预洗,收集洗脱组分。
9.5第五步洗脱:用洗脱液(20mM Tris-HCl,pH8.0,250mM NaCl,100mM咪唑)洗脱目标蛋白,收集洗脱组分。
9.6第六步洗柱:用洗柱缓冲液(20mM Tris-HCl,pH8.0,250mM NaCl,250mM咪唑)冲洗层析柱,收集洗脱组分。
9.7第七步洗柱:用洗柱缓冲液(20mM Tris-HCl,pH8.0,250mM NaCl,500mM咪唑)冲洗层析柱,收集洗脱组分。
10.分步洗脱,分步收集各个洗脱组分。依据SDS-PAGE检测结果确定第六步洗脱收集到的组分为最终所需要的样品。
最后得到我们所需的HindIII限制性核酸内切酶(如图1所示):
图1中泳道MK:Molecular weight marker;泳道1:Final product(3μg,reduced);泳道2:Final product(3μg,non-reduced)。
酶储存溶液:10mM Tris-HCl,300mM NaCl,0.1mM EDTA,1mM DTT,0.5mg/ml BSA,50%glycerol,pH7.4。
10×HindIII Buffer:50mM NaCl,10mM Tris-HCl,10mM MgCl2,100μg/ml BSA,pH7.9。
实施例2:HindIII限制性核酸内切酶的活性检测
20μl酶切体系中,以5U/μl Hind III进行5倍梯度稀释,对λDNA进行酶切。酶切反应后的电泳图如图2所示:
其中反应体系如下:
37℃,反应1h
75℃,20min,失活
结果如图2所示:泳道1:0.12U;泳道2:0.6U;泳道3:3U;泳道4:15U;泳道M:DNALadder 200。
上述的实施例是为了进一步说明本发明的一些优选实施例,并非全部实施例。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例,都属于本发明的权利保护范围。
序列表
<110> 吴江近岸蛋白质科技有限公司
<120> 一种HindIII限制性核酸内切酶的制备方法
<130> 2018
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 903
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221>
<223> 人工设计
<400> 1
atgaagaaaa gtgcgttaga gaaattatta tcactgatag aaaatttaac taatcaagaa 60
tttaaacagg caactaatag tttaatctca tttatttata aattgaatag aaatgaggtt 120
attgaattgg ttagatctat tggaatactt cctgaggcaa taaaaccaag ttctacacaa 180
gagaaattat tctcaaaagc aggagatatt gtattagcta aagcttttca attacttaat 240
ctgaactcaa aaccattaga acagagaggt aatgctggag atgtgatagc actctctaaa 300
gaatttaatt acggcttagt tgctgatgct aaatcttttc gacttagtcg tactgctaaa 360
aatcaaaaag attttaaagt aaaagcgtta agtgaatggc gagaagataa ggattatgca 420
gtattaacag caccattttt tcaatatcct acaactaaaa gtcaaatttt taagcaatcg 480
ttagatgaaa atgttttgtt atttagttgg gaacatttag ctatattatt acagttagat 540
ttagaggaaa ctaatatttt ttcttttgag caattatgga actttcccaa aaagcaaagt 600
aaaaaaacat ctgtatctga tgctgaaaat aattttatga gagattttaa taaatacttt 660
atggatttat ttaaaataga taaagatact ttaaatcaac ttcttcaaaa agagatcaat 720
tttattgaag aaagatcctt gatagaaaag gaatattgga aaaaacaaat aaatattata 780
aaaaatttta caagagaaga agccatagaa gcattattga aagatataaa tatgtcttca 840
aaaatagaaa ctattgatag ttttattaaa gggataaaaa gtaatgatag actgtattta 900
taa 903

Claims (9)

1.一种HindIII限制性核酸内切酶的制备方法,其特征在于,所述HindIII限制性核酸内切酶的制备方法构建HindIII限制性核酸内切酶的原核表达载体,转入工程菌中,经培养后,获得表达菌株,然后进行表达和纯化。
2.根据权利要求1所述的一种HindIII限制性核酸内切酶的制备方法,其特征在于,所述表达步骤如下:
步骤1,将获得的菌种1:100接种到LB培养基中,37℃,250rmp震荡培养到OD600=0.6时,加入1mM IPTG诱导表达,并低温诱导表达,离心收菌;
步骤2破菌,菌体总量与破菌缓冲液1∶10混合,超声破菌,12k转离心30min收集上清。
3.根据权利要求2所述的一种HindIII限制性核酸内切酶的制备方法,其特征在于,所述破菌缓冲液为20mM Tris、250mM NaCl和10mM咪唑混合溶液pH8.0。
4.根据权利要求3所述的一种HindIII限制性核酸内切酶的制备方法,其特征在于,所述纯化的方法为镍柱纯化。
5.根据权利要求4所述的一种HindIII限制性核酸内切酶的制备方法,其特征在于,所述纯化步骤如下:
步骤3.1第一步平衡:用平衡缓冲液(20mM Tris-HCl,pH8.0,250mM NaCl,10mM咪唑)平衡柱子,直至pH达到8.0,紫外检测读数稳定,检测调零后可以上样,所述样品为步骤2收集的上清。
步骤3.2第二步上样:样品应保持澄清,如发现沉淀浑浊则需要离心,收集流出。
步骤3.3第三步平衡:上样结束,用平衡缓冲液平衡层析柱,直到紫外检测读数回到基线或相对稳定。
步骤3.4第四步预洗:用预洗缓冲液(20mM Tris-HCl,pH8.0,250mM NaCl,50mM咪唑)预洗,收集洗脱组分。
步骤3.5第五步洗脱:用洗脱液(20mM Tris-HCl,pH8.0,250mM NaCl,100mM咪唑)洗脱目标蛋白,收集洗脱组分。
步骤3.6第六步洗柱:用洗柱缓冲液(20mM Tris-HCl,pH8.0,250mM NaCl,250mM咪唑)冲洗层析柱,收集洗脱组分。
6.根据权利要求4所述的一种HindIII限制性核酸内切酶的制备方法,其特征在于,使用SDS-PAGE检测确定所述纯化步骤中分步洗脱收集到的组分哪个为需要的HindIII限制性核酸内切酶。
7.根据权利要求1所述的一种HindIII限制性核酸内切酶的制备方法,其特征在于,所述构建HindIII限制性核酸内切酶的原核表达载体的目的基因为hindIIIR,所述目的基因序列如SEQNo.1。
8.一种HindIII限制性核酸内切酶,其特征在于,所述构建HindIII限制性核酸由所述权利要求1~7任意一种方法制得。
9.一种HindIII限制性核酸内切酶工程菌,其特征在于,所述工程菌包含HindIII限制性核酸内切酶的原核表达载体,所述HindIII限制性核酸内切酶的原核表达载体的目的基因为hindIIIR,所述目的基因序列如SEQNo.1。
CN201811651453.5A 2018-12-31 2018-12-31 一种HindIII限制性核酸内切酶的制备方法 Pending CN109880841A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811651453.5A CN109880841A (zh) 2018-12-31 2018-12-31 一种HindIII限制性核酸内切酶的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811651453.5A CN109880841A (zh) 2018-12-31 2018-12-31 一种HindIII限制性核酸内切酶的制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109880841A true CN109880841A (zh) 2019-06-14

Family

ID=66925436

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811651453.5A Pending CN109880841A (zh) 2018-12-31 2018-12-31 一种HindIII限制性核酸内切酶的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109880841A (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0216979A (ja) * 1987-12-21 1990-01-19 New England Biolabs Inc XbaI制限エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼの製造方法
US5015581A (en) * 1989-03-15 1991-05-14 New England Biolabs, Inc. Method for producing the Hinc II restriction endonuclease and methylase
DE321270T1 (de) * 1987-12-17 1994-03-03 New England Biolabs Inc Verfahren zur Herstellung von HhaI-Restriktionsendonuklease und -methylase.
EP1350849A2 (en) * 2002-03-26 2003-10-08 New England Biolabs, Inc. Method for cloning and expression of BsaI restriction endonuclease and Bsal methylase in E. coli
CN107058260A (zh) * 2017-01-17 2017-08-18 淮海工学院 一种高效重组表达限制性内切酶的方法
CN107267545A (zh) * 2017-07-26 2017-10-20 通用生物系统(安徽)有限公司 重组Bsa I限制性内切酶的制备方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE321270T1 (de) * 1987-12-17 1994-03-03 New England Biolabs Inc Verfahren zur Herstellung von HhaI-Restriktionsendonuklease und -methylase.
JPH0216979A (ja) * 1987-12-21 1990-01-19 New England Biolabs Inc XbaI制限エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼの製造方法
US5015581A (en) * 1989-03-15 1991-05-14 New England Biolabs, Inc. Method for producing the Hinc II restriction endonuclease and methylase
EP1350849A2 (en) * 2002-03-26 2003-10-08 New England Biolabs, Inc. Method for cloning and expression of BsaI restriction endonuclease and Bsal methylase in E. coli
CN107058260A (zh) * 2017-01-17 2017-08-18 淮海工学院 一种高效重组表达限制性内切酶的方法
CN107267545A (zh) * 2017-07-26 2017-10-20 通用生物系统(安徽)有限公司 重组Bsa I限制性内切酶的制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
无: "Synthetic construct HindIII (hindIII), TetRD1 (tetRD1), and CAT (cat) genes, complete cds", 《NCBI》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102839165A (zh) 基因突变型重组蛋白酶k及其工业化生产方法
CN103014047B (zh) 一种具有天然活性的重组人胱抑素c蛋白及其制备方法
CN105039278A (zh) 突变型Taq DNA聚合酶及其制备方法和应用
CN101591664A (zh) 一种高对映体选择性环氧化物水解酶及其编码的基因
CN104232611B (zh) 一种重组布氏白僵菌蛋白酶k及其工业化生产与纯化方法
CN102964435B (zh) 截短型溶血链球菌溶菌素o及利用其的检测试剂盒
CN106011100A (zh) 一种Pfu DNA聚合酶及其制备方法
CN104673809B (zh) 一种苹果酸脱氢酶基因及其重组表达载体
CN108642073A (zh) 一种梨PbrRALF2蛋白质的体外表达及其多克隆抗体的制备方法
CN105296509B (zh) 一种苹果酸脱氢酶基因rkmdh2及其重组表达载体
CN105039370A (zh) 用于生物合成白藜芦醇的融合基因、表达载体及制备方法
CN109880841A (zh) 一种HindIII限制性核酸内切酶的制备方法
CN104673817B (zh) 一种脂肪酶的原核表达及应用和固定化方法
CN103966244A (zh) 一种编码dna聚合酶的dna及其编码的酶、应用和制备方法
CN103436552A (zh) 一种人源annexin A2的生产方法及其应用
CN102898512B (zh) 一种重组菌丝霉素及其制备方法和用途
CN110819609B (zh) 一种热稳定性提高的突变脂肪酶及其制备方法与应用
CN107236047A (zh) 重组小反刍兽疫病毒h‑f融合蛋白的可溶性表达方法
Soppa et al. The TATA‐Box‐Binding Protein (TBP) of Halobacterium Salinarum: Cloning of the tbp Gene, Heterologous Production of TBP and Folding of TBP into a Native Conformation
CN105349536A (zh) 一种烟草病程相关蛋白pr10基因的特异性pcr引物及其应用
CN108642024A (zh) 一种ck-mb的表达纯化方法
CN101979589A (zh) 类单胺氧化酶C类脱水酶MaoC基因克隆及蛋白的制备方法及其应用
CN112111470A (zh) 一种R-环结合蛋白GST-His6-1/2×HBD及全基因组R-环的检测方法
CN109750021A (zh) 一种扇贝类胡萝卜素氧化裂解酶基因及其应用
CN109295163A (zh) 一种通用长片段染色体步移的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190614