CN106011100A - 一种Pfu DNA聚合酶及其制备方法 - Google Patents

一种Pfu DNA聚合酶及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种Pfu DNA聚合酶及其制备方法，该方法包括构建Fast Pfu DNA聚合酶的原核构建获得表达菌株的步骤，将菌株接种到培养基中，经诱导表达后，收集菌体；菌体经破菌、纯化后，得到所述Fast Pfu DNA聚合酶。本发明采用分子进化技术对普通Pfu酶进行改造，制备新型的Fast Pfu聚合酶，具有快速、高灵敏度、抗干扰能力强等特点，是新一代的高保真DNA聚合酶。

Description

一种Pfu DNA聚合酶及其制备方法
技术领域
本发明属于分子生物学试剂领域，特别是制备Fast Pfu DNA聚合酶的方法。
背景技术
Pfu DNA聚合酶(Pfu DNA polymerase)，又称Pfu聚合酶，或Pfu酶，是在嗜热的古核生物火球菌属内发现的，一类能在活体内进行DNA复制的酶，该酶含有2个蛋白亚基(P45和P50)，为多聚体，分子量约为90kDa，该酶同时具有5'-3'聚合酶活性和3'-5'外切核酸酶活性。因此在聚合反应中可纠正错误掺入的碱基，保真性极高。体外实验中，在聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)中，使用Pfu聚合酶可以快速，高保真的扩增DNA片段。然而Pfu酶扩增灵敏度不高，延伸速度缓慢(1kb/分钟)给众多的使用者带来了不便，影响了Pfu酶的应用推广。
有鉴于上述的缺陷，本设计人，积极加以研究创新，以期创设一种Pfu DNA聚合酶及其制备方法，使其更具有产业上的利用价值。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种Pfu DNA聚合酶及其制备方法。
本发明的一种Pfu DNA聚合酶的制备方法，包括构建Fast Pfu DNA聚合酶的表达载体并获得表达菌株的步骤。
进一步的，所述表达载体为原核表达载体。
进一步的，所述表达载体转化工程菌获得表达菌株。
进一步的，Pfu DNA聚合酶的制备方法包括以下步骤：
(1)合成引物Pr-1和Pr-2，以全基因合成Fast Pfu DNA聚合酶的 DNA序列为模板，用对应的引物PCR获得的产物Nde1和Xho1双酶切后连接到用相同的酶酶切好的表达载体上，转化DH5a，测序获得正确的阳性表达质粒，然后这种质粒转化表达工程菌，获得表达菌株，其中引物序列如下所示：
Pr-1：ATGATTTTAG ATGTGGAT；
Pr-2：TCGAGCTAGGATTTTTTAATGTT；
(2)将步骤(1)中获得的菌株接种到37℃的LB培养基中，250rmp震荡培养到OD600＝0.6时，加入诱导剂，经诱导表达后，为了提高蛋白可溶性表达的比例，同时将培养温度降至20℃，低温诱导表达过夜(16h)，5k转离心收集菌体；
(3)步骤(2)中的菌体经破菌、纯化后，得到所述Fast Pfu DNA聚合酶。
进一步的，所述原核表达载体为pET30a、或pBAD/His。
进一步的，所述工程菌为BL21(DE3)、Origami 2(DE3)或Rosetta(DE3)。
进一步的，步骤(2)中，用于诱导表达的诱导剂为IPTG或L-阿拉伯糖，其中优选1mM的IPTG。
进一步的，步骤(3)中，用于破菌的破菌缓冲液为Tis-Hcl或PBS，优选20mM Tris，250mMNaCl，pH8.0。
全基因合成Fast Pfu DNA聚合酶的DNA序列，PCR获得具有连接位点的产物，连接到pET30a载体上，转化DH5a，测序获得正确的阳性表达质粒：pET30a-Fast Pfu；转化入BL21(DE3)，获得表达菌株。
本发明的一种Fast Pfu DNA聚合酶，具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的DNA分子具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，该新型聚合酶具有快速、高灵敏度、抗干扰能力强等特点，是新一代的高保真DNA聚合酶。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
本发明采用分子进化技术对普通Pfu酶进行改造，制备新型的Fast Pfu聚合酶，具有快速、高灵敏度、抗干扰能力强等特点，是新一代的高保真DNA聚合酶；使用Fast Pfu聚合酶能获得更理想的扩增结果，并大幅度缩短扩增反应时间，其保真度高于Pfu酶，是普通Taq酶的50倍；Fast Pfu聚合酶扩增速度为普通Pfu酶的数倍，72℃保温30秒可延伸1kb以上，扩增长度可达20kb，能高效扩增≤6kb片段；灵敏度高，可从0.05ng人基因组DNA模板中扩增出1.2kb特定基因片段。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1是本发明中实施例一得到的Fast Pfu DNA聚合酶电泳图；
图2是本发明中实施例二得到的Fast Pfu DNA聚合酶电泳图；
图3是本发明中实施例一得到的Fast Pfu DNA聚合酶进行灵敏度检测电泳结果图；
图4是本发明中实施例一得到的Fast Pfu DNA聚合酶进行扩增大片段测试电泳结果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实例一：Fast Pfu DNA聚合酶的制备
(1)Fast Pfu DNA聚合酶表达菌株的获得：全基因合成Fast Pfu DNA聚合酶的DNA序列(SEQ ID NO:1)，合成引物Pr-1和Pr-2，以合成好的基因为模板，用对应的引物，通过PCR获得的产物Nde1和Xho1双酶切后连接到用相同的酶酶切好的pET30a载体上，转化DH5a，测序获得正确的阳性表达质粒：pET30a-Fast Pfu；然后这种 质粒转化BL21(DE3)，获得表达菌株；其中引物序列如下所示：
Pr-1：ATGATTTTAGATGTGGAT；
Pr-2：TCGAGCTAGGATTTTTTAATGTT；
(2)将步骤(1)中获得的菌株按1:100的比例接种到37℃的LB培养基中，250rmp震荡培养到OD600＝0.6时，加入诱导剂1mM的IPTG，为了提高蛋白可溶性表达的比例，同时将培养温度降至20℃，低温诱导表达过夜(16h)，5k转离心收集菌体；
(3)菌体质量与破菌缓冲液体积(50mM Tis-Hcl，pH 8.0，500mM NaCl)按1:10混合，即1g菌体加入10ml缓冲液，超声破菌，12k转离心30min收集上清液，过Ni柱纯化，如下：
(3.1)平衡：用平衡缓冲液(20mM Tris-HCl，pH8.0，500mMNaCl，20mM咪唑)平衡柱子，平衡缓冲液及样品中不可有EDTA、Arg等物质，直至pH达到8.0，紫外检测读数稳定，一般为5-10个柱体积，检测调零后上样；
(3.2)上样：样品应保持澄清，如发现沉淀浑浊则需要离心，收集流出；
(3.3)平衡：上样结束，用平衡缓冲液平衡层析柱，直到紫外检测读数回到基线或相对稳定；
(3.4)预洗：用预洗缓冲液(20mM Tris-HCl，pH8.0，500mMNaCl，50mM咪唑)预洗，收集洗脱组分；
(3.5)洗脱：用洗脱液(20mM Tris-HCl，pH8.0，500mMNaCl，200mM咪唑)洗脱目标蛋白，收集洗脱组分；
(3.6)洗柱：用洗柱缓冲液(20mM Tris-HCl，pH8.0，500mMNaCl，500mM咪唑)冲洗层析柱，收集洗脱组分；
(4)为了去除蛋白中微量的但会影响后期实验的宿主残留DNA或质粒DNA，这部分样品会再经过阴离子柱纯化(Q Sepharose Fast Flow)，具体步骤如下：
(4.1)平衡：用缓冲液(20mM Tris-HCl，pH8.0)平衡柱子，直至pH达到8.0，紫外检测读数稳定，一般为5-10个柱体积，检测调零后上样；
(4.2)上样：样品应保持澄清，如发现沉淀浑浊则需要离心，样品中离子强度不宜超过5ms/cm，收集流出；
(4.3)平衡：上样结束，用平衡液平衡层析柱，直到紫外检测读数回到基线或相对稳定；
(4.4)洗脱：用不同盐浓度：
20mM Tris-HCl，pH8.0，50mMNaCl；
20mMTris-HCl，pH8.0，100mMNaCl；
20mMTris-HCl，pH8.0，200mMNaCl；
20mM Tris-HCl，pH8.0，300mMNaCl；
20mM Tris-HCl，pH8.0，500mMNaCl；
(5)分步洗脱，分步收集各个洗脱组分，因为残留DNA一般在高盐组分中，所以收集低盐洗脱的蛋白质样品，得到目标产物Fast Pfu DNA聚合酶，如图1所示，泳道MK：分子量标记；泳道1：蛋白产品(3μg，洗脱后)；泳道2：蛋白产品(3μg，未洗脱)，其中，Fast Pfu DNA聚合酶储存溶液：20mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM DTT，0.1mM EDTA，100mMKCl，0.5％(v/v)Nonidet P40，0.5％(v/v)Tween20and 50％(v/v)甘油。
实例二：Fast Pfu DNA聚合酶的制备
本实施例的步骤和实例一相同，其区别在于：步骤(2)中，将菌株按1:20接种到LB培养基中；步骤(3)中，菌体质量与破菌缓冲液体积(50mM Tis-Hcl，pH 8.0，500mM NaCl)按1:5混合，即1g菌体加入5ml破菌缓冲液；得到的目标产物Fast Pfu DNA聚合酶，如图2所示，如图所示：我们能够得到与理论分子量大小相符的目的蛋白。
对实施例一得到的Fast Pfu DNA聚合酶进行灵敏度检测，如下：
在50μl扩增体系中，分别以50ng-0.05ng人基因组DNA为模板，对特定基因片段(1.2kb)进行的扩增。
其中反应体系如下：
5×FastPfu Buffer(含Mg2+)10μl；上游引物0.2-1.0μM(终浓度)；下游引物0.2-1.0μM(终浓度)；dNTPs(各10mM)1μl；模板0.05ng-50ng(基因组)；Fast Pfu DNA聚合酶0.25μl(1.25U)；ddH2至50μl。
PCR程序如下：30次循环：94℃，90秒；94℃，20秒；60℃，20秒；72℃，1kb/30秒；72℃，300秒；4℃，保温。
扩增后的电泳图如图3所示：泳道1：50ng；泳道2：5ng；泳道3：0.5ng；泳道4：0.05ng；泳道M：DNA Ladder 200。
对实施例一得到的Fast Pfu DNA聚合酶进行扩增大片段测试，如下：
在50μl扩增体系中，λDNA为模板，扩增1kb-20kb片段。
其中反应体系如下：
5×Fast Pfu Buffer(含Mg2+)10μl；上游引物0.2-1.0μM(终浓度)；下游引物0.2-1.0μM(终浓度)；dNTPs(各10mM)1μl；模板50ng；Fast Pfu DNA聚合酶0.25μl(1.25U)；ddH2O至50μl。
PCR程序如下：30次循环：94℃，300秒；94℃，20秒；68℃，1kb/30秒；72℃，300秒；4℃，保温。
扩增后的电泳图如图4所示：泳道1：1kb；泳道2：2kb；泳道3：4kb；泳道4：6kb；泳道5：8kb；泳道6：10kb；泳道7：12kb；泳道8：20kb；泳道M：λ/Hind III DNA Marker。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种FastPfu DNA聚合酶的制备方法，其特征在于：包括构建FastPfu DNA聚合酶的序列改造和并获得表达菌株的步骤，Fast Pfu DNA聚合酶具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的DNA分子具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述表达序列为DNA结合蛋白和Pfu蛋白融合。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述表达载体为原核表达载体。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述表达载体转化工程菌获得表达菌株。
5.根据1至4任一权利要求所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)合成引物Pr-1和Pr-2，以全基因合成Fast Pfu DNA聚合酶的DNA序列为模板，用对应的引物PCR获得的产物Nde1和Xho1双酶切后连接到用相同的酶切好的表达载体上，转化DH5a，测序获得正确的阳性表达质粒，然后这种质粒转化表达工程菌，获得表达菌株；其中引物序列如下所示：
Pr-1：ATGATTTTAG ATGTGGAT；
Pr-2：TCGAGCTAGGATTTTTTAATGTT；
(2)将步骤(1)中获得的菌株接种到培养基中，经诱导表达后，收集菌体；
(3)步骤(2)中的菌体经破菌、纯化后，得到所述Fast Pfu DNA聚合酶。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述原核表达载体为pET-30a或pBAD/His。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述工程菌为BL21(DE3)、Origami 2(DE3)或Rosetta(DE3)。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，用于诱导表达的诱导剂为IPTG或L-阿拉伯糖。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，用于破菌的破菌缓冲液为Tis-Hcl或PBS。
10.一种Fast Pfu DNA聚合酶，其特征在于：由权利要求1至8任一制备方法得到，具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，编码SEQID NO:1所示的氨基酸序列的DNA分子具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
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