CN104673920A - 加工食品中核桃植物源性成分鉴别用hda引物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种加工食品中核桃植物源性成分鉴别用HDA引物，其序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。利用上述HDA引物鉴别加工食品中核桃植物源性成分的方法，包括如下步骤：A、食品中DNA的提取；B、引物设计，直接采用上述两条引物；C、HDA反应体系的建立；D、恒温扩增；E、结果检测：琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，利用凝胶成像系统成像分析结果。利用本发明的引物进行相关检测，无论检测准度、精度或专一度都十分理想。

Description

加工食品中核桃植物源性成分鉴别用HDA引物及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种用于加工食品中核桃植物源性成分鉴别的HDA引物及其应用。
背景技术
当前核桃加工食品及饮品增长迅速，受到广大消费者的欢迎。随之而来的问题是，在核桃制产品的制备过程中存在大量的不规范操作，使得所得终产品中核桃源成分的有无及其含量无法确定，导致核桃食品/饮品的质量无法保障。
与此同时，随着核酸扩增技术的发展和应用，以核酸等温扩增技术为基础的检测技术近年来得到了迅猛的发展。多种机制的等温技术不仅诞生，而且有些技术已经相当成熟，完成了从实验室到实际应用的过渡，正逐步在分子生物学、医学、法学等领域得到广泛的运用。特别是在现场快速检测技术方面，核酸等温扩增技术显示了其突出的优越性。更为重要的是，核酸等温扩增技术由于不需要温度变化的时间过程且摆脱了对精良仪器设备的依赖，使病原体的检测实现了快速、简便和高通量。在实际操作和仪器要求方面，这些等温技术都比PCR技术更为简单和廉价，从而更容易被开发成现场检测的应用产品。因此，等温扩增技术是核酸扩增技术的发展方向，具有广阔的应用前景。
依赖解旋酶DNA等温扩增技术(Helicase-Dependent isothermalDNA Amplification，简称HDA)是由美国NEB公司研究人员Vincent等于2004年发明一种新型核酸等温扩增技术。该技术模拟体内DAN在恒温下复制的自然过程，在恒温条件下利用生物复制系统的关键组分实现DNA的体外扩增。主要是利用解旋酶在恒温下解开DNA双链，同时DNA单链结合蛋白(SSB)稳定解开的单链为引物提供结合模板，然后由DNA聚合酶催化合成互补链。新合成的双链在解旋酶的作用下又形成单链，并作为下一轮合成的模板进入循环扩增反应，最终实现靶序列的指数增长。
HDA技术的优点在于：等温扩增，在一个恒定温度就能完成扩增反应，不需要像PCR那样循环的温度变化；原理简单，HDA技术模拟自然界DNA的合成方式，原理清晰易懂；操作简便，HDA对引物的设计与PCR相似，不需要复杂的引物设计。对于其他组分也不需要做任何特殊处理，只需要一个恒温装置即可进行反应；设备简单，HDA不需要复杂的设备，只需要一个简单的恒温器，如果选用室温可以进行反应的酶，甚至不需要恒温器就可进行反应。因此，HDA技术具有广阔的应用前景。
目前尚未见利用HDA法检测核桃植物源成分含量的报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种加工食品中核桃植物源性成分鉴别用HDA引物及其应用，利用该引物进行相关检测，无论检测准度、精度或专一度都十分理想。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
加工食品中核桃植物源性成分鉴别用HDA引物，所述HDA引物为：上游引物：如SEQ ID NO：1所示；下游引物：如SEQ ID NO：2所示。
利用上述HDA引物鉴别加工食品中核桃植物源性成分的方法，该方法包括如下步骤：
A、食品中DNA的提取：取待测食品样品，采用试剂盒提取其中的DNA，保存备用；
B、引物设计：引物对于检测结果的准度、精度、专一度起决定作用，直接采用上述两条引物；
C、HDA反应体系的建立：HDA反应体系包括：5μL 10×缓冲液，0.04μmol dNTPs，0.16μmol ATP，10U Bst ploymerase，0.10-0.30μg UvrD helicase，1.0-5.0μg T4gp32或1.0-6.0μg RecA蛋白，25μM海藻糖，2μL模板食品DNA，上游引物和下游引物各20pmol，用ddH2O补至50μL；
D、恒温扩增：将反应体系放入60-70℃恒温金属浴中恒温扩增1-3h；
E、结果检测：琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，利用凝胶成像系统成像分析结果。
作为上述检测方法的一种优选技术方案，步骤A中，食品中DNA提取的具体操作方法为：如果操作对象为固体样品，则经液氮研磨成粉末后取0.1g，如果操作对象是液体样品，则经冷冻干燥后取粉末0.1g；所得样品粉末加入1.5mL离心管中，加入600μl 65℃预热的BufferPCB和12μlβ-巯基乙醇，震荡混匀，置于65℃水浴25min，间或混匀，加入等体积的氯仿，充分混匀，12,000rpm离心5min，吸取上层水相至一个干净的1.5ml的离心管中，加入等体积BufferBD，颠倒混匀3-5次，再加等体积的无水乙醇，充分混匀后用移液器将其全部加入到Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒的吸附柱中，室温静置2min，10,000rpm离心1min，倒掉收集管中废液，将吸附柱放回收集管中，加入500μlPWSolution，10,000rpm离心1min，倒掉收集管中废液，将吸附柱放回收集管中，加入500μl WashSolution，10,000rpm，离心1min，倒掉收集管中废液，将吸附柱放回收集管中，12,000rpm离心2min，取出吸附柱，放入一个新的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入50μlTEBuffer，静置3min，12,000rpm离心2min，得到的DNA溶液置于-20℃保存或直接用于后续步骤。
作为上述检测方法的一种优选技术方案，步骤C中，所述10×缓冲液包括100mM二硫苏糖醇、350mM Tris-HAc、100mM MgSO4和1mg/mL BSA。
作为上述检测方法的一种优选技术方案，步骤C中，所述反应体系中还包括10U的Phi29嗜温聚合酶。
作为上述检测方法的一种优选技术方案，：步骤C中，所述UvrDhelicase的含量为0.15μg。
作为上述检测方法的一种优选技术方案，步骤C中，所述T4gp32的含量为4.5μg，或者RecA蛋白的含量为3.0μg。
作为上述检测方法的一种优选技术方案，步骤D中，将反应体系放入65℃恒温金属浴中恒温扩增2h。
作为上述检测方法的一种优选技术方案，步骤E中，吸取5μL扩增产物进行1-2％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为80-120V，80-100mA，电泳时间40-50min，置市售凝胶成像系统进行结果分析，检测产物。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明是一种简便、快速的检测方法，操作简单，覆盖面广，能应用在检验的一线，能够准确、快速检测出待测食品是否含有核桃植物源成分，具有准度高、精度好、专一性强的特点，具体试验数据见实施例6-7。本发明的方法可节约大量的人力物力，具有重大的实际应用价值。
附图说明
图1为实施例6所得电泳图谱，其中，泳道1：100bp laddermarker，泳道2：0.00001％样品，泳道3：0.0001％样品，泳道4：0.001％样品，泳道5：0.01％样品，泳道6：0.1％样品，泳道7：1％样品，泳道8：10％样品；可见，本发明所设计引物的检出精度为0.0001％，即每百克样品中含有0.0001g核桃即可检出。
图2为实施例7所得电泳图谱，其中，泳道1：100bp laddermarker，泳道2：核桃，泳道3：苜蓿样品，泳道4：木薯，泳道5：红薯，泳道6：马铃薯。可见，核桃样品被有效的扩增出210bp左右长度的目的片段，电泳条带清晰，无非特异性扩增，而其他4组样品均未产生电泳条带，说明没有基因扩增；可见本发明所设计引物的检出专一度优良。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。本发明各实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。并且各实施例中所用的材料及试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明各实施例中部分材料为：DNA Marker，ATP，dNTPs，均购自大连宝生物工程公司；海藻糖购自Sigma公司；大肠杆菌UvrD解旋酶购自上海富众生物科学有限公司；Bst polymerase、MutLprotein、T4gp32均购自New England公司；引物(正向引物、反向引物)由大连宝生物工程公司合成；Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒购自生物工程(上海)有限公司。
本发明各实施例中部分仪器为：金属浴为上海东升仪器有限公司生产的6400型恒温金属浴，电泳仪为北京市六一厂生产DXY-33A型电泳仪，凝胶成像系统为UVP GelDoc-IT凝胶成像系统，超净工作台为苏州净化集团产品、高速离心机为Thermo公司生产、高压灭菌锅为上海博迅公司生产、恒温培养箱为上海博迅公司生产、紫外分光光度计、SK-1型快速混匀器、电热恒温、水浴锅、电子分析天平、显微镜、pH计、移液枪及其它辅助设备均为国内生产厂家生产。
实施例1：食品中DNA的提取。
食品中DNA提取的具体操作方法为：如果操作对象为固体样品，则经液氮研磨成粉末后取0.1g，如果操作对象是液体样品，则经冷冻干燥后取粉末0.1g；所得样品粉末加入1.5mL离心管中，加入600μl 65℃预热的BufferPCB和12μl β-巯基乙醇，震荡混匀，置于65℃水浴25min，间或混匀，加入等体积的氯仿，充分混匀，12,000rpm离心5min，吸取上层水相至一个干净的1.5ml的离心管中，加入等体积BufferBD，颠倒混匀3-5次，再加等体积的无水乙醇，充分混匀后用移液器将其全部加入到Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒的吸附柱中，室温静置2min，10,000rpm离心1min，倒掉收集管中废液，将吸附柱放回收集管中，加入500μlPWSolution，10,000rpm离心1min，倒掉收集管中废液，将吸附柱放回收集管中，加入500μl WashSolution，10,000rpm，离心1min，倒掉收集管中废液，将吸附柱放回收集管中，12,000rpm离心2min，取出吸附柱，放入一个新的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入50μlTEBuffer，静置3min，12,000rpm离心2min，得到的DNA溶液置于-20℃保存或直接用于后续步骤。
实施例2：引物设计。
引物的设计对于检测结果的准度、精度、专一度起决定作用。首先筛选出几十条核桃基因组中保守性极强的特异性基因片段，以其作为引物设计靶标序列，通过反复的设计、比对、分析、验证和修改，最终最终确定了最优的检测引物序列，如下表所示：
Primer name Len Sequence(5’→3’)
上游引物 26 ACCTCTGCGATCGGCGATTAGCCTGG(SEQ ID NO：1)
下游引物 26 CCTGATCAATGTCCGGAGCATGCTCA(SEQ ID NO：2)
实施例3：HDA反应体系的建立。
HDA反应体系包括：5μL 10×缓冲液，0.04μmol dNTPs，0.16μmol ATP，10U Bst ploymerase，0.10-0.30μg UvrD helicase，1.0-5.0μg T4gp32或1.0-6.0μg RecA蛋白，25μM海藻糖，2μL模板食品DNA，上游引物和下游引物各20pmol，10U的Phi29嗜温聚合酶；用ddH2O补至50μL；经梯度试验验证，其中，UvrD helicase的含量为0.15μg电泳条带最为清晰；T4gp32的含量为4.5μg，或者RecA蛋白的含量为3.0μg时电泳条带最为清晰。
实施例4：恒温扩增。
将反应体系放入65℃恒温金属浴中恒温扩增2h。
实施例5：结果检测。
吸取5μL扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为90V，80mA，电泳时间45min，置UVP GelDoc-IT凝胶成像系统进行结果分析，检测产物。
实施例6：本发明所设计引物的检出精度试验。
利用生核桃和纯化小麦淀粉制备梯度待测样品7组，其中生核桃的含量(按重量计)分别为：10％、1％、0.1％、0.01％、0.001％、0.0001％、0.00001％。
按照实施例1-5的方法进行检测，所得电泳图谱如附图1所示。其中，泳道1：100bp ladder marker，泳道2：0.00001％样品，泳道3：0.0001％样品，泳道4：0.001％样品，泳道5：0.01％样品，泳道6：0.1％样品，泳道7：1％样品，泳道8：10％样品。
从图1可见，本发明所设计引物的检出精度为0.0001％，即每百克样品中含有0.0001g核桃即可检出。
实施例7：本发明所设计引物的检出专一度试验。
利用核桃、苜蓿、木薯、红薯、马铃薯分别与纯化小麦淀粉制备5组待测样品，其中核桃、苜蓿、木薯、红薯、马铃薯的含量(按重量计)均为1％。
按照实施例1-6的方法进行检测，所得电泳图谱如附图2所示。其中，泳道1：100bp ladder marker，泳道2：核桃，泳道3：苜蓿样品，泳道4：木薯，泳道5：红薯，泳道6：马铃薯。
从图2可见，核桃样品被有效的扩增出210bp左右长度的目的片段，而且电泳条带清晰，无非特异性扩增；而其他4组样品均未产生电泳条带，说明没有基因扩增。可见本发明所设计引物的检出专一度优良。
上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一限制条件。

Claims (9)

1.加工食品中核桃植物源性成分鉴别用HDA引物，其特征在于：所述HDA引物为：
上游引物：如SEQ ID NO：1所示；
下游引物：如SEQ ID NO：2所示。
2.利用权利要求1所述的HDA引物鉴别加工食品中核桃植物源性成分的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
A、食品中DNA的提取：取待测食品样品，采用试剂盒提取其中的DNA，保存备用；
B、引物设计：引物对于检测结果的准度、精度、专一度起决定作用，直接采用权利要求1记载的引物；
C、HDA反应体系的建立：HDA反应体系包括：5μL 10×缓冲液，0.04μmol dNTPs，0.16μmol ATP，10U Bst ploymerase，0.10-0.30μg UvrD helicase，1.0-5.0μg T4 gp32或1.0-6.0μg RecA蛋白，25μM海藻糖，2μL模板食品DNA，上游引物和下游引物各20pmol，用ddH2O补至50μL；
D、恒温扩增：将反应体系放入60-70℃恒温金属浴中恒温扩增1-3h；
E、结果检测：琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，利用凝胶成像系统成像分析结果。
3.根据权利要求2所述的鉴别加工食品中核桃植物源性成分的方法，其特征在于：步骤A中，食品中DNA提取的具体操作方法为：如果操作对象为固体样品，则经液氮研磨成粉末后取0.1g，如果操作对象是液体样品，则经冷冻干燥后取粉末0.1g；所得样品粉末加入1.5mL离心管中，加入600μl 65℃预热的BufferPCB和12μlβ-巯基乙醇，震荡混匀，置于65℃水浴25min，间或混匀，加入等体积的氯仿，充分混匀，12,000rpm离心5min，吸取上层水相至一个干净的1.5ml的离心管中，加入等体积BufferBD，颠倒混匀3-5次，再加等体积的无水乙醇，充分混匀后用移液器将其全部加入到Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒的吸附柱中，室温静置2min，10,000rpm离心1min，倒掉收集管中废液，将吸附柱放回收集管中，加入500μlPWSolution，10,000rpm离心1min，倒掉收集管中废液，将吸附柱放回收集管中，加入500μl WashSolution，10,000rpm，离心1min，倒掉收集管中废液，将吸附柱放回收集管中，12,000rpm离心2min，取出吸附柱，放入一个新的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入50μlTEBuffer，静置3min，12,000rpm离心2min，得到的DNA溶液置于-20℃保存或直接用于后续步骤。
4.根据权利要求2所述的鉴别加工食品中核桃植物源性成分的方法，其特征在于：步骤C中，所述10×缓冲液包括100mM二硫苏糖醇、350mM Tris-HAc、100mM MgSO4和1mg/mL BSA。
5.根据权利要求2所述的鉴别加工食品中核桃植物源性成分的方法，其特征在于：步骤C中，所述反应体系中还包括10U的Phi29嗜温聚合酶。
6.根据权利要求2所述的鉴别加工食品中核桃植物源性成分的方法，其特征在于：步骤C中，所述UvrD helicase的含量为0.15μg。
7.根据权利要求2所述的鉴别加工食品中核桃植物源性成分的方法，其特征在于：步骤C中，所述T4gp32的含量为4.5μg，或者RecA蛋白的含量为3.0μg。
8.根据权利要求2所述的鉴别加工食品中核桃植物源性成分的方法，其特征在于：步骤D中，将反应体系放入65℃恒温金属浴中恒温扩增2h。
9.根据权利要求2所述的鉴别加工食品中核桃植物源性成分的方法，其特征在于：步骤E中，吸取5μL扩增产物进行1-2％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为80-120V，80-100mA，电泳时间40-50min，置市售凝胶成像系统进行结果分析，检测产物。
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