CN103866030A

CN103866030A - 大肠杆菌o157:h7的lamp检测引物及检测试剂盒

Info

Publication number: CN103866030A
Application number: CN201410130191.3A
Authority: CN
Inventors: 张雪寒; 汪伟; 何孔旺; 倪艳秀; 温立斌; 李彬; 周俊明; 王小敏
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2014-04-02
Filing date: 2014-04-02
Publication date: 2014-06-18
Anticipated expiration: 2034-04-02
Also published as: CN103866030B

Abstract

本发明涉及食品和生物领域检测，特别是涉及大肠杆菌O157:H7的LAMP检测引物及检测试剂盒。是一种运用4条特异性引物检测样品中大肠杆菌O157:H7的方法及试剂盒。其步骤为：步骤一，提取待检样品中的核苷酸；步骤二，利用所述LAMP检测试剂盒检测样品中核苷酸，判断样品中是否含有大肠杆菌O157:H7。本发明的试剂盒操作简便、结果直观，敏感性和特异性良好。<u/>

Description

大肠杆菌O157:H7的LAMP检测引物及检测试剂盒

一、技术领域

本发明涉及检测大肠杆菌O157:H7的LAMP引物及检测试剂盒，属于生物和食品检测领域。

二、背景技术

大肠杆菌（Escherichia coli, E.coli）O157:H7是重要的食源性病原菌，能够在全世界范围内引起动物、家禽和人类爆发感染，不仅关乎食品安全，而且与医疗和公共卫生问题密切相关。

现如今，许多报道尝试研制更特异的方法检测E.coli O157:H7。传统的培养鉴定技术使用选择性培养基或者显色平板检测E.coli O157:H7，但是这种方法费时，费力，准确性差。 PCR技术和定量PCR检测技术已经被广泛应用各检测领域，发挥着不可忽视的作用，但对仪器设备等要求较高，不适合快速和临床样品的检测。我们前期研究工作中，通过对已有E.coli O157:H7全基因组序列生物信息学，比对分析，发现新的阅读框编码鞭毛类基因，它唯一的存在于E.coli O157:H7基因组中，为适应更广泛领域检测的需要，有必要建立新型的检测技术。

环介导等温扩增技术（LAMP）是由日本学者T.Notomi发明的一种新型核酸扩增技术。该技术依赖于4条特异设计的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下可以高效、高特异性地扩增靶序列。近年来，国内外已经将该技术广泛应用于病原检测，如LAMP可以检测多种病原菌，例如沙门氏杆菌、李氏杆菌、大肠杆菌等。目前未见能够特异性和专一性检测大肠杆菌O157:H7 LAMP的报道。

本发明的大肠杆菌O157:H7 LAMP检测技术避免了现有检测手段存在的某些问题，相比较其他检测手段，建立的大肠杆菌O157:H7 LAMP方法具有敏感性高、特异性强、检测周期短、操作简单方便的特点。

三、发现内容

技术问题 本发明目的在于克服现有技术的不足，提供一种特异性检测大肠杆菌O157:H7 LAMP检测试剂盒及其检测方法。本发明的试剂盒使用方便，结果鉴定直观，检测敏感性和特异性高，并且易于大范围推广使用。

技术方案

本发明是通过以下技术方案实现的。

本发明设计一种大肠杆菌O157:H7 LAMP检测试剂盒，该试剂盒包括以下4条引物，所述引物序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

所述试剂盒包括反应液A和SYBR Green I，所述反应液A具体包括：每23 uL的反应体系包括10×ThermoPol Reaction Buffer（美国NEB公司）2.5 uL、2.5mM dNTPs 2 uL、1M 的Mg₂SO₄ 4 uL、8U/ uL Bst DNA酶（美国NEB公司） 1 uL、超纯水12.5 uL，以及如下的引物：

5 μM碱基序列如SEQ ID NO.1 和SEQ ID NO.2所示的引物各0.25 uL，50 μM碱基序列如SEQ ID NO.3 和SEQ ID NO.4所示的引物各0.25 uL。

本发明还涉及一种利用所述大肠杆菌O157:H7 LAMP检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

（1）待检模板的制备：

粪便或者食物10克，加入到90mL磷酸盐缓冲液中，37℃震荡2h后，取1mL加入到9mL心脑浸出液培养基中；如果待检样品为液体，则直接取1mL加入到9mL心脑浸出液培养基中；培养基中再加入100 uL 浓度为50mg/mL新生霉素，37℃继续培养18h，吸取1mL培养物，500 r离心15min，弃沉淀，吸取上清至新离心管，12000r离心10min，弃上清，取沉淀重悬于1/10体积双蒸水中，沸水浴10min，4℃12000转离心10min，吸取上清，即待检模板DNA。

（2）取2 uL提取的待检模板加入到所述的反应液A中，终体积为25 uL，混匀，置于64℃恒温50 min进行LAMP扩增；

（3）结果判定：取出上述扩增反应管，在其中加入1 uL20×SYBR Green I，如反应管中液体变为绿色，则说明样品中含有大肠杆菌O157:H7；如果颜色为橘黄色，则说明样品中不含有大肠杆菌O157:H7。

有益效果

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

（1）试剂盒使用便捷、结果判定直观、敏感性和特异性高，最低可以检测到1CFU/mL(g)。

（2）试剂盒检测不需要先进的仪器，一步就可以完成操作，减少污染的机会，能够较好的满足当前大肠杆菌O157H7检测的需求，用于进出口检疫、实验室和现场检测。

四、附图说明

图1：LAMP试剂盒检测结果图

管1：颜色为绿色，阳性扩增，表明样品中含有大肠杆菌O157H7；管2：颜色为橘黄色，阴性扩增，表明样品中不含有大肠杆菌O157:H7。

图2：LAMP试剂盒敏感性凝胶电泳结果图

图3：LAMP试剂盒特异性凝胶电泳结果图

五、具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应说明，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。下面实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆；实验手册（New York:Cold Spring Harber Laboratory Press,1989）中所述的条件，或者按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

（一）LAMP引物设计

根据GenBank登陆的大肠杆菌O157:H7 基因组序列，通过DNAstar 软件序列比对分析，获得大肠杆菌O157:H7 特异性保守序列SEQ ID NO:5。

通过LAMP引物设计软件（Primer Explore software, version 4.0）对该保守序列进行LAMP 引物设计，得到4条引物：

引物 F3的序列如SEQ ID NO:1所示；

引物 B3的序列如SEQ ID NO:2所示；

引物 FIP的序列如SEQ ID NO:3所示；

引物 BIP的序列如SEQ ID NO:4所示；

（二）LAMP反应体系的优化

LAMP 反应体系的优化通过内外引物浓度比例、反应温度和反应时间三个参数的变化来确定最优的反应体系：首先温度设定为65℃，反应时间设定为60min，设置不同的内外引物浓度比例（4: 1、6:1、8:1和10:1），反应结束后凝胶电泳观察结果，最佳的浓度比例为10:1。类似的方法可以确定最佳的反应温度和最佳反应条件分别为64℃和50 min。最终确定的最佳反应体系如下：内引物FIP和BIP 50 μM，外引物F3和B3 5μM，dNTPs 2.5 mM，Mg²⁺8 mM，8U Bst DNA酶，1×ThermoPol Reaction Buffer，超纯水12.5 uL，模板2uL。最佳反应条件64℃恒温50 min。

（三） LAMP检测程序

（1）配置反应液A：23 uL反应液A的组分及含量为：

10×ThermoPol Reaction Buffer（美国NEB公司）2.5 uL；

50 μM 引物 FIP 0.25 uL；50μM 引物 BIP 0.25 uL；

5 μM 引物 F3 0.25 uL； 5 μM 引物 B3 0.25 uL；

2.5mM dNTPs 2 uL；

1M 的Mg₂SO₄ 4 uL；

8U/ uL Bst DNA酶（美国NEB公司） 1 uL；

超纯水12.5 uL。

（2）待检模板的制备：粪便或者食物10克，加入到90mL磷酸盐缓冲液中，37℃震荡2h后，取1mL加入到9mL心脑浸出液培养基（杭州微生物试剂制品公司）中，培养基中再加入100 uL 浓度为50mg/mL新生霉素（Ameresco 进口分装），37℃继续培养18h，吸取1mL培养物，500 r离心15min，弃沉淀，吸取上清至新离心管，12000r离心10min，弃上清，取沉淀重悬于1/10体积双蒸水中，沸水浴10min，4℃12000转离心10min，吸取上清，即检测用模板DNA；

如果待检样品为液体，直接取1mL加入到9mL心脑浸出液培养基（杭州微生物试剂制品公司）中，培养基中再加入100 uL 浓度为50mg/mL新生霉素（Ameresco 进口分装），37℃继续培养18h，吸取1mL培养物，500 r离心15min，弃沉淀，吸取上清至新离心管，12000r离心10min，弃上清，取沉淀重悬于1/10体积双蒸水中，沸水浴10min，4℃12000转离心10min，吸取上清，即检测用模板DNA。

（3）取2 uL提取的待检模板加入到所述的反应液A中，终体积为25 uL，混匀，置于64℃恒温50 min进行LAMP扩增；

（四）结果判定

取出上述扩增反应管，在其中加入1 uL20×SYBR Green I，如反应管中液体变为绿色，则说明样品中含有大肠杆菌O157:H7；如果颜色为橘黄色，则说明样品中不含有大肠杆菌O157:H7。如图1所示，图1大肠杆菌O157:H7的LAMP检测体系最终反应液中加入加入20×SYBR Green I颜色变化，阳性反应颜色变为绿色（管1），阴性反应颜色变为橘黄色（管2）。

实施例2

LAMP检测体系敏感性分析，将上述引物检测模拟制备O157:H7阳性样品。

下面所有模拟制备O157:H7阳性样品都是经过免疫磁珠富集（Dynabeads anti-E. coli O157免疫磁珠，购自Invitrogen公司），显色培养基细菌分离（方法参照：牛源O157:H7的分离及毒力因子分析，中国兽医学报，2012，32(8):1148-1153。）证实为O157:H7阴性才可以选用。

2.1 污水样品制备：从养殖场采集污水，10mL/管，依次加入大肠杆菌O157:H7培养物，终浓度分别为10⁶ CFU/mL、10⁵ CFU/mL、10⁴ CFU/mL、10³ CFU/mL、10² CFU/mL、10 CFU/mL 和1CFU/mL。

2.2 牛肉样品制备：从超市购买牛肉泥样品200g，10g/份，分别加入到90mL磷酸盐缓冲液，再依次加入大肠杆菌O157:H7培养物，终细菌浓度分别为10⁶ CFU/g、10⁵ CFU/g、10⁴ CFU/g、10³ CFU/g、10² CFU/g、10 CFU/g 和1CFU/g。

2.3 待检模板的制备：

上述制备的阳性牛肉样品，取1mL加入到9mL心脑浸出液培养基（杭州微生物试剂制品公司）中，培养基中再加入100 uL 浓度为50mg/mL新生霉素（Ameresco 进口分装），37℃继续培养18h，吸取1mL培养物，500 r离心15min，弃沉淀，吸取上清至新离心管，12000r离心10min，弃上清，取沉淀重悬于1/10体积双蒸水中，沸水浴10min，4℃12000转离心10min，吸取上清，即检测用模板DNA。

取上述制备的阳性污水样品1mL，加入到9mL心脑浸出液培养基（杭州微生物试剂制品公司）中，培养基中再加入100 uL 浓度为50mg/mL新生霉素（Ameresco 进口分装），37℃继续培养18h，吸取1mL培养物，500 r离心15min，弃沉淀，吸取上清至新离心管，12000r离心10min，弃上清，取沉淀重悬于1/10体积双蒸水中，沸水浴10min，4℃12000r离心10min，吸取上清，即检测用模板DNA。

按照实施例1中所述最佳反应体系以及最佳反应时间和温度，进行LAMP检测。LAMP扩增结束后，将产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。结果显示LAMP最低检测限为1 CFU/g。如图2所示：LAMP试剂盒敏感性，1-7分别为10³ CFU/g、10² CFU/g、10 CFU/g、1 CFU/g、阴性对照和空白泳道；M为DL 2000。

实施例3

LAMP检测体系特异性分析

为验证LAMP检测体系的特异性，常规方法提取可能有潜在交叉反应的细菌核酸，分别以链球菌、沙门氏杆菌、巴氏杆菌、痢疾志贺菌、弗氏志贺菌2a（李丽，等。EHEC O157H7二重PCR的建立及应用。华北农学报，2011，26(6)：61。）的核酸为模板进行LAMP特异性检测。反应体系为25 uL，含有10×ThermoPol Reaction Buffer（美国NEB公司）2.5 uL、2.5mM dNTPs 2 uL、1M 的Mg₂SO₄ 4 uL、50 μM 引物 FIP 0.25 uL、50μM 引物 BIP 0.25 uL、5 μM 引物 F3 0.25 uL、 5 μM 引物 B3 0.25 uL、8U/ uL Bst DNA酶（美国NEB公司）1 uL、超纯水11.5 uL，模板3uL。反应条件：64℃ 恒温50min。结果显示该LAMP检测体系特异性良好，不能检测到其他非目标细菌核酸。如图3所示：LAMP试剂盒特异性，1-7分别为大肠杆菌O157:H7、链球菌、沙门氏杆菌、巴氏杆菌、痢疾志贺菌、弗氏志贺菌2a（李丽，等。EHEC O157H7二重PCR的建立及应用。华北农学报，2011，26(6)：61。）、阴性对照；M为DL 2000。

所述引物和扩增产物的序列为：

SEQ ID NO.1：5-gtgtcgtactactgcatca-3

SEQ ID NO.2：5-gctggttttacctaaagactct-3

SEQ ID NO.3：5-tcccagtaaacacgacacttttactagatggtattaatgttggggag-3

SEQ ID NO.4：5-atcttgtgatacgagcacggataatcgccattaccaaaaggc-3

SEQ ID NO:5：gtgtcgtactactgcatcattaaatattacagatggtattaatgttggggagattttagcgaatgaaacttcctttagtaaaagtgtcgtgtttactgggatatcttgtgatacgagcacggataaaatagtttataaaaatatccaaagtgattgggttgaagttgggccttttggtaatggcgaaaaattaaaggttaaaatagagtctttaggtaaaaccagc。

实施例4

LAMP试剂盒检测临床样品，包括以下步骤：

4.1样品收集：采集牛粪便20份，25-30g/份；集贸市场购买牛肉6份，各250g；蔬菜和水果批发市场，购买菠菜、豆芽、韭菜、荸荠和生菜，各250g，共30份。所有采集和购买样品储存在样品收集袋（南京助研公司）中，密封冷藏保存。

4.2待检模板的制备：从样品收集袋中取出粪便或者食物10克，加入到90mL磷酸盐缓冲液中，37℃震荡2h后，取1mL加入到9mL心脑浸出液培养基（杭州微生物试剂制品公司）中，培养基中再加入100 uL 浓度为50mg/mL新生霉素（Ameresco 进口分装），37℃继续培养18h，吸取1mL培养物，500 r离心15min，弃沉淀，吸取上清至新离心管，12000r离心10min，弃上清，取沉淀重悬于1/10体积双蒸水中，沸水浴10min，4℃12000r离心10min，吸取上清，即检测用模板DNA。

4.3 LAMP扩增：取2 uL提取的待检模板加入到反应液A中，终体积为25 uL，混匀。将反应液置于64℃恒温50 min进行LAMP扩增。

4.4结果判定：取出上述扩增反应管，在其中加入1 uL20×SYBR Green I，在日光下观察，如反应管中液体变为绿色，则说明样品中含有大肠杆菌O157:H7；如果颜色为橘黄色，则说明样品中不含有大肠杆菌O157:H7。上述所有样品共计56份，大肠杆菌O157:H7阳性8份，其中粪便阳性5份，荸荠阳性1份，菠菜阳性2份。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省农业科学院

<120> 大肠杆菌O157:H7的LAMP检测引物及检测试剂盒

<130> 0

<160> 5

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<221> 引物F3

<222> (1)..(19)

<223>

<400> 1

gtgtcgtact actgcatca 19

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<221> 引物B3

<222> (1)..(22)

<223>

<400> 2

gctggtttta cctaaagact ct 22

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<221> 引物FIP

<222> (1)..(47)

<223>

<400> 3

tcccagtaaa cacgacactt ttactagatg gtattaatgt tggggag 47

<210> 4

<211> 47

<212> DNA

<213> w

<220>

<221> 引物BIP

<222> (1)..(47)

<223>

<400> 4

tcccagtaaa cacgacactt ttactagatg gtattaatgt tggggag 47

<210> 5

<211> 226

<212> DNA

<213> q

<220>

<221> 扩增产物

<222> (1)..(226)

<223>

<400> 5

gtgtcgtact actgcatcat taaatattac agatggtatt aatgttgggg agattttagc 60

gaatgaaact tcctttagta aaagtgtcgt gtttactggg atatcttgtg atacgagcac 120

ggataaaata gtttataaaa atatccaaag tgattgggtt gaagttgggc cttttggtaa 180

tggcgaaaaa ttaaaggtta aaatagagtc tttaggtaaa accagc 226

Claims

1.大肠杆菌O157:H7的LAMP检测引物，所述的引物碱基序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示：

SEQ ID NO.1：5-gtgtcgtactactgcatca-3

SEQ ID NO.2：5-gctggttttacctaaagactct-3

SEQ ID NO.3：5-tcccagtaaacacgacacttttactagatggtattaatgttggggag-3

SEQ ID NO.4：5-atcttgtgatacgagcacggataatcgccattaccaaaaggc-3

所述的引物检测大肠杆菌O157:H7扩增产物为226bp。

2.含有权利要求1所述引物的检测大肠杆菌O157:H7的试剂盒，其特征是，试剂盒包括反应液A和SYBR Green I，所述反应液A具体包括：

每23 uL的反应体系包括10×ThermoPol Reaction Buffer2.5 uL、2.5mM dNTPs 2 uL、1M 的Mg₂SO₄ 4 uL、8U/ uL Bst DNA酶1 uL、超纯水12.5 uL，以及如下的引物：

5 μM碱基序列如SEQ ID NO.1 和SEQ ID NO.2所示的引物各0.25 uL；

50 μM碱基序列如SEQ ID NO.3 和SEQ ID NO.4所示的引物各0.25 uL。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其用于检测大肠杆菌O157:H7方法，包括以下步骤：

（1）待检模板的制备：粪便或者食物10克，加入到90mL磷酸盐缓冲液中，37℃震荡2h后，取1mL加入到9mL心脑浸出液培养基中；如果待检样品为液体，则直接取1mL加入到9mL心脑浸出液培养基中；培养基中再加入100 uL 浓度为50mg/mL新生霉素，37℃继续培养18h，吸取1mL培养物，500 r离心15min，弃沉淀，吸取上清至新离心管，12000r离心10min，弃上清，取沉淀重悬于1/10体积双蒸水中，沸水浴10min，4℃12000转离心10min，吸取上清，即待检模板DNA;

（2）取2 uL提取的待检模板加入到权利要求2所述的反应液A中，终体积为25 uL，混匀，置于64℃恒温50 min进行LAMP扩增；

（3）结果判定：取出上述扩增反应管，在其中加入1 uL20×SYBR Green I，在日光下观察，如反应管中液体变为绿色，则说明样品中含有大肠杆菌O157:H7；如果颜色为橘黄色，则说明样品中不含有大肠杆菌O157:H7。