CN109652574A - 大肠杆菌o157:h7的cpa引物及试剂盒和检测方法 - Google Patents

大肠杆菌o157:h7的cpa引物及试剂盒和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种大肠杆菌O157:H7的CPA引物及其检测试剂盒和检测方法，该针对靶点rfbE设计的CPA引物包括剥离引物4s、5a，交叉扩增引物2a1s，以及特异引物2a、3a；其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.5所示。本发明中所提供的针对E.coliO157:H7特异性靶序列rfbE及stx1所设计的交叉引物恒温扩增反应检测鉴定体系，解决现有技术方法所需周期长，灵敏度低，成本高，现场应用困难等缺陷。通过选择目标菌株的特异性序列rfbE及stx1的保守区域，设计一对剥离引物、交叉引物和特异引物构建交叉引物恒温扩增反应体系，并在60分钟左右获得检测结果以缩短传统大肠杆菌检测的周期。

Description

大肠杆菌O157:H7的CPA引物及试剂盒和检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种大肠杆菌O157:H7的CPA引物及其检测试剂盒和检测方法。
背景技术
目前微生物的检测鉴定方法主要分为培养鉴定法、免疫检测法及核酸检测。培养鉴定法及免疫检测法操作繁琐、实验周期长，对实验人员专业水平要求高。
交叉引物恒温扩增(Crossing Priming Amplification,CPA)技术与其他核酸扩增技术相比，可以在等温条件下快速、高效、特异地扩增靶序列，且操作简便，不需要精准的变温设备，成本较低，在食源性微生物检测领域显示出广阔的发展前景。但该反应引物设计难度较高，需要在有限的产物长度中设计五条引物，且避免五条引物自身发生非特异性扩增而影响结果，因此引物的设计尤为重要。
Escherichia coli O157:H7是肠出血大肠杆菌最重要的血清型，是一种人畜共患的肠道致病菌，主要通过污染的动物源性食品感染人类，如生的或绞碎的肉制品、生牛奶和受污染的蔬菜和芽菜向人类传播，感染人体后表现为相应的临床症状。轻度感染可引起腹部绞痛和腹泻，发烧和呕吐也可能出现。重度感染则表现为出血性结肠炎，溶血性尿毒综合征。
目前由E.coli O157:H7感染引起的食源性疾病已经成为世界性的卫生问题。而在E.coli O157:H7中存在部分可以产志贺毒素I型的大肠杆菌。若发生感染可导致人类出现腹泻、出血性结肠炎等一些胃肠道疾病。志贺毒素I型在肠腔产生后，可穿过上皮细胞进入血循环，引起特定靶组织的血管损伤，如脑、肾血管损伤。产志贺毒素大肠杆菌具有强烈的致病性和致死性等特点，严重威胁人类的生命健康，已成为世界性的公共卫生问题。
中国专利申请CN 108796098A公开了一种PSR等温扩增反应检测大肠杆菌志贺毒素的引物、试剂盒及其方法，该专利针对志贺毒素特异性靶序列stx2设计了PSR反应的引物用于检测。
中国专利申请CN 108796099A公开了一种大肠杆菌O157:H7的PSR检测引物、试剂盒及其检测方法，该专利针对大肠杆菌O157:H7的特异性靶序列rfbE设计了PSR反应的引物用于检测。
以上专利中的反应灵敏度最小单位为pg/μL，灵敏度不够高，限制了适用范围。
发明内容
为了克服PSR反应检测灵敏度低的问题，本发明的首要目的在于一种大肠杆菌O157:H7的CPA引物，其灵敏度达到了fg/μL，是PSR反应灵敏度的100～1000倍，能够解决现有技术灵敏度较低的问题。
本发明的另一目的在于提供一种大肠杆菌O157:H7的CPA检测试剂盒。
本发明的再一目的在于提供一种大肠杆菌O157:H7的CPA检测方法，该方法具有灵敏度高、特异性好，操作简便快速，结果准确可靠，检测成本低，适合现场检测应用的特点。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种大肠杆菌O157:H7的CPA检测引物，是针对其靶点rfbE设计的，包括剥离引物4s、5a，交叉扩增引物2a1s，以及特异引物2a、3a；其核苷酸序列分别如下所示：
靶点rfbE剥离引物4s：5’-aggaccgcagaggaaaga-3’(SEQ ID NO.1)；
靶点rfbE剥离引物5a：5’-tccacgccaaccaagatc-3’(SEQ ID NO.2)；
靶点rfbE交叉引物2a1s：5’-agtacattggcatcgtgtcagataaactcatcgaaaca-3’(SEQID NO.3)；
靶点rfbE特异引物2a：5’-agtacattggcatcgtgt-3’(SEQ ID NO.4)；
靶点rfbE特异引物3a：5’-ggcatcgtgtggacagggt-3’(SEQ ID NO.5)。
一种大肠杆菌志贺毒素I型的CPA检测引物，是针对其靶点stx1设计的，包括剥离引物4s、5a，交叉扩增引物2a1s，以及特异引物2a、3a；其核苷酸序列分别如下所示：
靶点stx1剥离引物4s：5’-agttgatgtcagagggatag-3’(SEQ ID NO.6)；
靶点stx1剥离引物5a：5’-cgctgttgtacctggaaa-3’(SEQ ID NO.7)；
靶点stx1交叉引物2a1s：5’-atcagcaaagcgataaaactacggcttattgttgaa-3’(SEQID NO.8)；
靶点stx1特异引物2a：5’-atcagcaaagcgataaaa-3’(SEQ ID NO.9)；
靶点stx1特异引物3a：5’-cctgttaacaaatcctgtcac-3’(SEQ ID NO.10)。
一种大肠杆菌O157:H7的CPA检测试剂盒，包括上述的大肠杆菌O157:H7的CPA检测引物和/或大肠杆菌志贺毒素I型的CPA检测引物；
所述试剂盒中，各CPA检测引物的浓度优选10μM；
所述的试剂盒还包括如下组分：
A、2×反应缓冲液：40.0mM的Tris-HCl，20.0mM的硫酸铵，20.0mM的氯化钾，16.0mM的硫酸镁，0.2％(v/v)的Tween 20，1.4M的甜菜碱，10.0mM的dNTPs(each)；
B、Bst DNA聚合酶；
C、钙黄绿素和氯化锰的混合溶液；
组分B中所述的Bst DNA聚合酶优选浓度为8U/μL的Bst DNA聚合酶水溶液。
组分C中所述的钙黄绿素和氯化锰的混合溶液通过如下方法制备得到：
(i)将钙黄绿素溶于二甲基亚砜(DMSO)中，配制50μM的钙黄绿素溶液；将氯化锰溶于水中，配制1mM的氯化锰水溶液；
(ii)取25μL 50μM的钙黄绿素溶液与10μL1mM的氯化锰水溶液混合均匀，得到钙黄绿素和氯化锰的混合溶液(钙黄绿素溶液与氯化锰溶液的浓度比为1:8)。
一种大肠杆菌O157:H7的CPA检测方法，包括如下步骤：
(1)提取待检样品的细菌DNA作为模板DNA，并控制模板DNA水溶液的OD260/OD280值为1.8～2.0；
(2)分别建立检测rfbE和/或stx1的交叉引物恒温扩增反应体系，于63℃水浴中保温至少60分钟进行交叉引物恒温扩增反应，待反应完成后于80℃水浴中保温2分钟终止反应；
其中，交叉引物恒温扩增反应体系为：2×反应缓冲液12.5μL，10μM的剥离引物4s和10μM的剥离引物5a各1.5μL，10μM的交叉引物2a1s 2.5μL，10μM的特异引物2a和10μM的特异引物3a各1.25μL，DNA模板1.0μL，8U/μL的Bst DNA聚合酶1.0μL，加去核酸水补足至25μL；最后加入1μL的钙黄绿素与氯化锰的混合溶液；
(3)针对靶点rfbE的检测，终止反应后肉眼观察反应体系的颜色，如颜色为黄色，说明待检样品中不含有大肠杆菌O157:H7；如颜色变为绿色，说明待检样品中含有大肠杆菌O157:H7；
(4)针对靶点stx1的检测，终止反应后对扩增产物做琼脂糖凝胶电泳，呈现梯形条带的含有大肠杆菌志贺毒素I型，无扩增条带的不含有大肠杆菌志贺毒素I型。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明中所提供的针对E.coliO157:H7特异性靶序列rfbE及stx1所设计的交叉引物恒温扩增反应检测鉴定体系，解决现有技术方法所需周期长，灵敏度低，成本高，现场应用困难等缺陷。通过选择目标菌株的特异性序列rfbE及stx1的保守区域，设计一对剥离引物、交叉引物和特异引物构建交叉引物恒温扩增反应体系，并在60分钟左右获得检测结果以缩短传统大肠杆菌检测的周期。
(2)目前，有文献报道采用交叉引物恒温扩增反应技术检测大肠杆菌O157:H7,但是检测灵敏度不高，相较于普通PCR没有体现交叉引物恒温扩增技术灵敏度方面显著的优越性。而本发明可以降低出现假阳性结果的概率，同时确保检测的可靠性、特异性和高灵敏度。这对于提高重大群体疾病诊断率，早期的疾病诊断具有非常重要的意义。
(3)本发明在恒温条件下扩增，不会因温度的改变而造成时间损失，耗时短，此外，该技术不需要特殊、昂贵的仪器和试剂，扩增产物不需要凝胶电泳，直接用荧光染料显色可凭肉眼判断结果，操作简便快捷，检测成本较低。本发明的试剂盒及方法特别适用中小型单位及现场检测。
附图说明
图1为交叉引物恒温扩增反应技术检测E.coliO157:H7的凝胶电泳结果及显色结果图；其中，图A为交叉引物恒温扩增检测E.coliO157:H7的凝胶电泳结果(泳道1为大肠杆菌O157:H7ATCC43895，泳道2为大肠杆菌O157:H7ATCC43894，泳道3为大肠杆菌O157:H7E019，泳道4为大肠杆菌O157:H7E043，泳道5为大肠杆菌O157:H7E044，NG为空白对照)；图B为交叉引物恒温扩增反应技术检测E.coliO157:H7的显色结果(1为大肠杆菌O157:H7ATCC43895，2为大肠杆菌O157:H7ATCC43894，3为大肠杆菌O157:H7E019，4为大肠杆菌O157:H7E043，5为大肠杆菌O157:H7E044，NG为空白对照)。
图2为交叉恒温扩增反应检测大肠杆菌O157:H7的最适扩增时间试验的凝胶电泳结果图；其中，泳道1为扩增时间10分钟，泳道2为扩增时间20分钟，泳道3为扩增时间30分钟，泳道4为扩增时间40分钟，泳道5为扩增时间50分钟，泳道6为扩增时间60分钟，泳道7为扩增时间70分钟，泳道8为扩增时间80分钟，NG为空白对照。
图3为检测靶点rfbE特异性的实验结果图；其中，1：大肠杆菌O157:H7ATCC43895，2：大肠杆菌O157:H7ATCC43894，3：大肠杆菌O157:H7E019，4：大肠杆菌O157:H7E043；5：大肠杆菌O157:H7E044；6：沙门氏菌ATCC29629；7：沙门氏菌ATCC19585；8：沙门氏菌ATCC14028；9：沙门氏菌ATCC13076；10：单增李斯特菌ATCC19116；11：单增李斯特菌ATCC19114，12：单增李斯特菌ATCC19115；13：单增李斯特菌ATCC15313；14：单增李斯特菌ATCC19113；15：铜绿假单胞菌ATCC27853；16：金黄色葡萄球菌ATCC27664；17：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌NCTC10442；18：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌N315；19：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌85/2082；20：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌CA05；21：副溶血性弧菌ATCC17802；22：副溶血性弧菌ATCC27969；23：干酪乳杆菌BM-LC14617；24：阴性对照。
图4为检测靶点rfbE灵敏度实验结果图，图A为交叉恒温扩增反应检测大肠杆菌O157:H7的灵敏度试验的结果图，图B为PCR扩增反应检测大肠杆菌O157:H7的灵敏度试验；其中，1为3.28ng/μL；2为328pg/μL；3为32.8pg/μL；4为3.28pg/μL；5为328fg/μL；6为32.8fg/μL；7为3.28fg/μL；8为328ag/μL；NG为阴性对照。
图5为交叉引物恒温扩增反应技术检测大肠杆菌志贺毒素I型的凝胶电泳结果；其中，图A为根据靶点stx1所设计的第一套引物的电泳结果，图B为根据靶点stx1所设计的第二套引物的电泳结果(泳道1为大肠杆菌O157:H7ATCC43895，泳道2为大肠杆菌O157:H7ATCC43894，泳道3为大肠杆菌O157:H7E019,泳道4为大肠杆菌O157:H7E043,泳道5为大肠杆菌O157:H7E044，NG为空白对照)。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
基于交叉引物恒温扩增反应技术检测大肠杆菌O157:H7的方法，包括以下步骤：
1、基于交叉引物恒温扩增反应技术检测病原微生物的方法，本实施例以大肠杆菌O157:H7为例，其使用试剂如下：
a.浓度各为10μM的剥离引物4s、5a，交叉扩增引物2a1s，以及特异引物2a、3a，引物序列如前文SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.5所示；
b.2×反应储液：由浓度为40.0mM的Tris-HCl，20.0mM的硫酸铵，20.0mM的氯化钾，16.0mM的硫酸镁，0.2％(v/v)的Tween 20，1.4M的甜菜碱，10.0mM的dNTPs(each)组成；
c.浓度为8U/μL的Bst DNA聚合酶(大片段，NEB公司)水溶液；
d.钙黄绿素和氯化锰的混合溶液：先配制浓度为50μM的钙黄绿素溶液(二甲基亚砜溶解)；然后取25μL 50μM的钙黄绿素溶液，与10μL1mM的氯化锰水溶液混合均匀(钙黄绿素溶液与氯化锰溶液的浓度比为1:8)。
2、使用上述试剂利用交叉引物恒温扩增反应技术检测大肠杆菌O157:H7，包括如下步骤：
(1)提取待检样品的细菌DNA作为模板DNA：
本实施例同时设置实验组和空白对照组，其中实验组为五株E.coli O157:H7，分别是大肠杆菌O157:H7ATCC43895，大肠杆菌O157:H7ATCC43894，大肠杆菌O157:H7E019,大肠杆菌O157:H7E043,大肠杆菌O157:H7E044；所有菌株均可由公开途径获得；
采用DNA提取试剂盒(广东东盛生物科技有限公司)提取各组细菌DNA，按照试剂盒说明书操作，实验组所得细菌DNA水溶液的OD260/OD280的值(260nm和280nm下吸光光度比值)为1.8。
(2)建立检测rfbE的交叉引物恒温扩增反应：
在反应管中配制总体积为26μL的交叉引物恒温扩增反应体系：加入2×反应储液12.5μL，4s与5a等体积混合引物混合液3.0μL，交叉引物2a1s 2.5μL，特异引物2a与3a等体积混合液2.5μL，Bst DNA聚合酶1μL，DNA模板1.0μL，用去核酸水补充体积至25μL，最后加入上述浓度的钙黄绿素及氯化锰混合液水溶液1μL，混匀即可。此时各物质浓度为：Tris-HCl20.0mM，硫酸铵10.0mM，氯化钾10.0mM，硫酸镁8.0mM，Tween 20 0.1％(v/v)，甜菜碱0.7M，dNTPs(each)1.4mM，Bst DNA聚合酶8U，剥离引物4s、5a各0.6μM，交叉引物2a1s 1.0μM，特异引物2a及3a各0.5μM。将反应管置于63℃水浴中保温反应60分钟，再于80℃水浴中保温2分钟终止反应。
(3)显色检测：
待反应结束后，用肉眼观察颜色变化。
结果如图1所示，结果显示：空白对照组的颜色为黄色，说明不含有E.coli O157:H7菌；实验组的颜色变为绿色，说明含有E.coli O157:H7菌，随后对扩增产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳，阳性组呈现梯形条带，阴性组无扩增条带，与预期结果一致。
实施例2
交叉恒温扩增反应检测大肠杆菌O157:H7的最适扩增时间试验，包括以下步骤：
按照实施例1反应体系构建交叉恒温扩增方法，分别进行10分钟，20分钟，30分钟，40分钟，50分钟，60分钟，70分钟，80分钟，90分钟的不同扩增时间试验，以确定最适的扩增时间。
按照实施例1构建反应体系，无菌水作空白对照，并对扩增产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳。
结果如图2所示，反应时间为40分钟至90分钟时均出现了梯状条带，而60分钟至90分钟的梯状条带无显著差别，所以可将交叉引物恒温扩增反应时间减少为60分钟，能够实现最短的扩增时间和最佳的扩增效果。
实施例3
交叉恒温扩增反应检测大肠杆菌O157:H7特异性试验，包括以下步骤：
将大肠杆菌O157:H7ATCC43895与非大肠杆菌的基因组DNA按照实施例1中的反应体系和条件建立交叉恒温扩增反应检测方法，进行特异性试验；
其中，非大肠杆菌为：沙门氏菌ATCC29629；沙门氏菌ATCC19585；沙门氏菌ATCC14028；沙门氏菌ATCC13076；单增李斯特菌ATCC19116；单增李斯特菌ATCC19114；单增李斯特菌ATCC19115；单增李斯特菌ATCC15313；单增李斯特菌ATCC19113；铜绿假单胞菌ATCC27853；金黄色葡萄球菌ATCC27664；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌NCTC10442；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌N315；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌85/2082；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌CA05；副溶血性弧菌ATCC17802；副溶血性弧菌ATCC27969；干酪乳杆菌BM-LC14617。
设置大肠杆菌O157:H7基因组为阳性对照，去核酸水为阴性对照。对扩增产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示，加入大肠杆菌基因组的反应体系呈现梯形条带，阴性组无扩增条带，与预期结果一致。
如此表明，基于交叉引物恒温扩增反应检测E.coliO157:H7的引物具有较高的特异性。
实施例4
交叉恒温扩增反应和PCR扩增反应检测大肠杆菌O157:H7的灵敏度对比试验，包括以下步骤：
1.交叉恒温扩增反应检测大肠杆菌O157:H7的灵敏度试验
将大肠杆菌O157:H7的基因组进行10倍浓度梯度稀释，分别为3.28ng/μL；328pg/μL；32.8pg/μL；3.28pg/μL；328fg/μL；32.8fg/μL；3.28fg/μL；328ag/μL，同时设置阴性对照(去核酸水)，按照实施例1中的反应体系构建交叉恒温扩增方法并对扩增产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳，以确定检测方法的灵敏度。
2.PCR扩增反应检测大肠杆菌O157:H7的灵敏度试验
(1)基于PCR扩增反应技术检测病原微生物的方法，本实施例以大肠杆菌O157:H7为例，其使用试剂如下：
a.浓度各为10μM的剥离引物4s、5a，引物序列如前文SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示；
b.2×Taq PCR MasterMix；
(2)建立检测rfbE的PCR扩增反应：
在反应管中配制总体积为25μL的交叉引物恒温扩增反应体系：加入2×Taq PCRMasterMix 12.5μL，4s与5a等体积混合引物混合液3.0μL，DNA模板2.0μL，用去核酸水补充体积至25μL。将反应管置于PCR仪中进行扩增。
(3)将大肠杆菌O157:H7的基因组进行10倍浓度梯度稀释，分别为3.28ng/μL；328pg/μL；32.8pg/μL；3.28pg/μL；328fg/μL；32.8fg/μL；3.28fg/μL；328ag/μL，同时设置阴性对照(去核酸水)。按照实施例4中的PCR扩增反应体系构建PCR扩增方法并对扩增产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳，以确定检测方法的灵敏度。阳性组呈现单一条带，阴性组无扩增条带，与预期结果一致。
结果如图4所示，图A为交叉恒温扩增反应检测大肠杆菌O157:H7的灵敏度试验的结果图，图B为PCR扩增反应检测大肠杆菌O157:H7的灵敏度试验。从图A中可以看出，样品中大肠杆菌DNA的浓度高于3.28fg/μL的均出现了梯形条带，呈现阳性结果。而图B中，当样品中大肠杆菌DNA的浓度高于32.8pg/μL时才出现了单一条带。
结果表明：建立的E.coli O157:H7交叉恒温扩增反应方法可检测样品中3.28fg/μL反应的大肠杆菌DNA，其灵敏度是PCR扩增反应检测的10000倍。
实施例5
交叉恒温扩增反应检测大肠杆菌志贺毒素I型的引物筛选，包括以下步骤：
1.根据CPA扩增反应原理，使用PrimerPremier软件针对stx1靶点分别设计的两组引物，引物序列如下(5’-3’)：
靶点stx1-1剥离引物4s：5’-agttgatgtcagagggatag-3’(SEQ ID NO.6)；
靶点stx1-1剥离引物5a：5’-cgctgttgtacctggaaa-3’(SEQ ID NO.7)；
靶点stx1-1交叉引物2a1s：5’-atcagcaaagcgataaaa ctacggcttattgttgaa-3’(SEQ ID NO.8)；
靶点stx1-1特异引物2a：5’-atcagcaaagcgataaaa-3’(SEQ ID NO.9)。
靶点stx1-1特异引物3a：5’-cctgttaacaaatcctgtcac-3’(SEQ ID NO.10)
靶点stx1-2剥离引物4s：5’-gagcgatgttacggtttg-3’(SEQ ID NO.11)；
靶点stx1-2剥离引物5a：5’-caggcaggacactactcaa-3’(SEQ ID NO.12)；
靶点stx1-2交叉引物2a1s：5’-caacatcttcagcagtcatggggatttcgtacaacac-3’(SEQ ID NO.13)；
靶点stx1-2特异引物2a：5’-caacatcttcagcagtcat-3’(SEQ ID NO.14)。
靶点stx1-2特异引物3a：5’-gaacgcccactgagatcatcc-3’(SEQ ID NO.15)。
2、将大肠杆菌O157:H7ATCC43895，大肠杆菌O157:H7E019，大肠杆菌O157:H7E020，大肠杆菌O157:H7E043，大肠杆菌O157:H7E044的基因组按照实施例1中的反应体系和条件建立交叉恒温扩增反应检测方法，进行大肠杆菌志贺毒素I型的检测，去核酸水为阴性对照。对扩增产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳。
结果如图5所示，图A为根据靶点stx1所设计的第一套引物的电泳结果，图B为根据靶点stx1所设计的第二套引物的电泳结果。靶点stx1所设计的第一套引物中的空白对照组无明显梯状条带，而第二套引物的空白对照组出现了明显的梯状条带，说明第一套引物的质量更高，能够有效减少交叉引物恒温扩增反应中假阳性的产生。
结论：从上述实验结果可以看出，交叉恒温扩增反应扩增方法与常规PCR和荧光PCR具有如下优点：
操作和鉴定简便快捷：常规PCR整个过程在2～4个小时才能出结果，荧光定量PCR需要2～3小时，本发明所提供的检测方法在60分钟就可出现阳性结果。其次对仪器要求低，仅需要一个普通水浴锅，并可以通过荧光染料直接观测检测结果，省去了传统的电泳检测步骤。在快速检测及现场检测的实践中有广泛的应用前景。
特异性强：仅通过是否扩增就可判断目的基因的存在与否，从而完成了细菌的定性检测。
灵敏度高:针对大肠杆菌O157:H7rfbE的检测限为3.28fg/μL，是常规PCR反应10000倍左右，具有较高的灵敏度。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 大肠杆菌O157:H7的CPA引物及试剂盒和检测方法
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶点rfbE剥离引物4s
<400> 1
aggaccgcag aggaaaga 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶点rfbE剥离引物5a
<400> 2
tccacgccaa ccaagatc 18
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶点rfbE交叉引物2a1s
<400> 3
agtacattgg catcgtgtca gataaactca tcgaaaca 38
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶点rfbE特异引物2a
<400> 4
agtacattgg catcgtgt 18
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶点rfbE特异引物3a
<400> 5
ggcatcgtgt ggacagggt 19
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶点stx1剥离引物4s
<400> 6
agttgatgtc agagggatag 20
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶点stx1剥离引物5a
<400> 7
cgctgttgta cctggaaa 18
<210> 8
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶点stx1交叉引物2a1s
<400> 8
atcagcaaag cgataaaact acggcttatt gttgaa 36
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶点stx1特异引物2a
<400> 9
atcagcaaag cgataaaa 18
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶点stx1特异引物3a
<400> 10
cctgttaaca aatcctgtca c 21
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶点stx1-2剥离引物4s
<400> 11
gagcgatgtt acggtttg 18
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶点stx1-2剥离引物5a
<400> 12
caggcaggac actactcaa 19
<210> 13
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶点stx1-2交叉引物2a1s
<400> 13
caacatcttc agcagtcatg gggatttcgt acaacac 37
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶点stx1-2特异引物2a
<400> 14
caacatcttc agcagtcat 19
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶点stx1-2特异引物3a
<400> 15
gaacgcccac tgagatcatc c 21

Claims (9)

1.一种大肠杆菌O157:H7的CPA检测引物，其特征在于：是针对靶点rfbE设计的，包括剥离引物4s、5a，交叉扩增引物2a1s，以及特异引物2a、3a；其核苷酸序列分别如下所示：
靶点rfbE剥离引物4s：5’-aggaccgcagaggaaaga-3’(SEQ ID NO.1)；
靶点rfbE剥离引物5a：5’-tccacgccaaccaagatc-3’(SEQ ID NO.2)；
靶点rfbE交叉引物2a1s：5’-agtacattggcatcgtgtcagataaactcatcgaaaca-3’(SEQ IDNO.3)；
靶点rfbE特异引物2a：5’-agtacattggcatcgtgt-3’(SEQ ID NO.4)；
靶点rfbE特异引物3a：5’-ggcatcgtgtggacagggt-3’(SEQ ID NO.5)。
2.一种大肠杆菌志贺毒素I型的CPA检测引物，其特征在于：是针对靶点stx1设计的，包括剥离引物4s、5a，交叉扩增引物2a1s，以及特异引物2a、3a；其核苷酸序列分别如下所示：
靶点stx1剥离引物4s：5’-agttgatgtcagagggatag-3’(SEQ ID NO.6)；
靶点stx1剥离引物5a：5’-cgctgttgtacctggaaa-3’(SEQ ID NO.7)；
靶点stx1交叉引物2a1s：5’-atcagcaaagcgataaaactacggcttattgttgaa-3’(SEQ IDNO.8)；
靶点stx1特异引物2a：5’-atcagcaaagcgataaaa-3’(SEQ ID NO.9)；
靶点stx1特异引物3a：5’-cctgttaacaaatcctgtcac-3’(SEQ ID NO.10)。
3.一种大肠杆菌O157:H7的CPA检测试剂盒，其特征在于包括权利要求1所述的CPA检测引物和/或权利要求2所述的CPA检测引物。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：各CPA检测引物的浓度为10μM。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于还包括如下组分：
A、2×反应缓冲液：40.0mM的Tris-HCl，20.0mM的硫酸铵，20.0mM的氯化钾，16.0mM的硫酸镁，0.2％(v/v)的Tween 20，1.4M的甜菜碱，10.0mM的dNTPs；
B、Bst DNA聚合酶；
C、钙黄绿素和氯化锰的混合溶液。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：组分B中所述的Bst DNA聚合酶是浓度为8U/μL的Bst DNA聚合酶水溶液。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：组分C中所述的钙黄绿素和氯化锰的混合溶液通过如下方法制备得到：
(i)将钙黄绿素溶于二甲基亚砜中，配制50μM的钙黄绿素溶液；将氯化锰溶于水中，配制1mM的氯化锰水溶液；
(ii)取25μL 50μM的钙黄绿素溶液与10μL1mM的氯化锰水溶液混合均匀，得到钙黄绿素和氯化锰的混合溶液。
8.一种大肠杆菌O157:H7的CPA检测方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)提取待检样品的细菌DNA作为模板DNA，并控制模板DNA水溶液的OD260/OD280值为1.8～2.0；
(2)分别建立检测rfbE和/或stx1的交叉引物恒温扩增反应体系，于63℃水浴中保温至少60分钟进行交叉引物恒温扩增反应，待反应完成后于80℃水浴中保温2分钟终止反应；
(3)针对靶点rfbE的检测，终止反应后肉眼观察反应体系的颜色，如颜色为黄色，说明待检样品中不含有大肠杆菌O157:H7；如颜色变为绿色，说明待检样品中含有大肠杆菌O157:H7；
(4)针对靶点stx1的检测，终止反应后对扩增产物做琼脂糖凝胶电泳，呈现梯形条带的含有大肠杆菌志贺毒素I型，无扩增条带的不含有大肠杆菌志贺毒素I型。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于：步骤(2)所述的交叉引物恒温扩增反应体系为：2×反应缓冲液12.5μL，10μM的剥离引物4s和10μM的剥离引物5a各1.5μL，10μM的交叉引物2a1s 2.5μL，10μM的特异引物2a和10μM的特异引物3a各1.25μL，DNA模板1.0μL，8U/μL的Bst DNA聚合酶1.0μL，加去核酸水补足至25μL；最后加入1μL的钙黄绿素与氯化锰的混合溶液。
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