CN107488720A - 用于检测饲料中大肠杆菌o157的引物组及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于检测饲料中大肠杆菌O157的引物组，包括内引物FIP、内引物BIP、外引物F3、外引物B3和环引物LB。采用该引物组用于检测饲料中的大肠杆菌O157，其步骤包括大肠杆菌O157培养、DNA提取、环介导等温扩增反应、结果观察。试验证明，本发明引物组对产气肠杆菌、大肠埃希氏菌、肠炎沙门氏菌无特异性表达，针对大肠杆菌O157有明显表达，特异性高；采用本发明环介导等温扩增检测方法检测饲料，检测结果非常精确，对饲料中大肠杆菌O157检出限为2CFU/25g。此外，采用本发明检测饲料还具有检测速度快、操作方便等优势。

Description

用于检测饲料中大肠杆菌O157的引物组及其检测方法

技术领域

本发明涉及一种肠细菌的检测方法，具体是基于环介导等温扩增技术的用于检测饲料中大肠杆菌O157的引物组及其检测方法。

背景技术

大肠杆菌O157，埃希氏菌属，革兰氏染色阴性，动力试验呈阳性。大肠杆菌O157是一种可引起人、动物肠道出血性腹泻、肠炎等症状的肠细菌，又称之为肠出血性大肠杆菌，以O157:H7血清型为代表菌株。大肠杆菌O157一般通过饮水、食物、排泄物、密切接触等途径传播疾病，病情严重者，可危及生命，食品卫生主管部门已将大肠杆菌O157列为常规检测项目。

目前，大肠杆菌O157的检测方法包括常规法(细菌培养、分离、鉴定)、金标试纸法、单克隆酶联免疫分析筛选方法、动酶联荧光免疫检测系统(VIDAS)筛选法、显色培养基法、DNA探针技术、PCR法/荧光PCR法。其中，常规法检测存在耗时长，培养基、操作步骤或培养条件在不同实验室差别较大等缺点，检测结果可能不一致或出现假阴/阳性；PCR法/荧光PCR法，操作过程复杂，且对样品、仪器设备、实验室条件以及实验人员的技术要求高，检测成本高，难以在基层推广应用。

基于此，日本学者Notomi在Nucleic Acids Res杂志(2000年)上公开了一种新的基因诊断技术—环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification)，用于各种病毒、细菌、寄生虫等引起的疾病检测，食品、化妆品的安全检查与诊断。环介导等温扩增技术具有高特异性、高灵敏度等优点，操作过程简单，对仪器设备要求低，一台水浴锅或恒温箱就能实现反应，检测结果可通过肉眼观察白色浑浊或绿色荧光来判断，简便快捷，适合基层快速诊断。目前，有文献报道采用环介导等温扩增技术检测大肠杆菌O157:H7，但是检测灵敏度不高，相较于普通PCR没有体现环介导等温扩增技术灵敏度方面显著的优越性。

例如，CN106676173A公开的一种检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的LAMP检测方法，先提取待测样品DNA；然后配制LAMP检测反应体系，反应体系包括引物内引物对FIP和BIP和外引物对F3和B3(SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4)；再以步骤1中提取的DNA为模版进行LAMP扩增反应，用实时浊度法鉴定扩增结果。采用该方法对EHEC O157:H7定性检测灵敏度为3.45×10⁴CFU/mL，仅仅略优于一般PCR检测方法。因此，有必要基于环介导等温扩增技术开发一种检测大肠杆菌O157的新方法。

此外，本领域技术人员知晓，利用环介导等温扩增技术检测病菌，其特征是针对靶基因上的六个区域设计四条引物，利用链置换型DNA聚合酶在恒温条件下进行扩增反应。而引物序列直接影响检测灵敏度和检测结果，引物设计属于一大技术难点，引物设计不合理，甚至可能会导致基因不适于环介导等温扩增方法。另外，引物设计需要考虑Tm值、引物末端的稳定性、GC含量、二级结构以及引物之间的距离，现有环介导等温扩增试验，为防止GC含量直接影响DNA的结合度和扩增效果，GC含量通常为50-60％，且F2/B2、F3/B3、LF/LB的3’末端和F1c/B1c的5’末端作为DNA合成的起点必需有一定的稳定性，自由能应该≤-4kcal/mol。本领域技术人员还知晓，检测灵敏度是衡量检测方法和仪器的重要指标，而现有环介导等温扩增技术的灵敏度检出限为100CFU/mL，要在此基础上将检测灵敏度进一步提高存在非常多的技术难点。即便如此，发明人依然尝试设计新的引物组，以尽可能提高检测灵敏度。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的是基于环介导等温扩增技术，提供一种用于检测饲料中大肠杆菌O157的引物组，本发明的另一目的是利用该引物组检测饲料中大肠杆菌O157的检测方法，以解决现有环介导等温扩增技术在检测饲料中大肠杆菌O157过程中存在的灵敏度低的技术问题。

本发明采用大肠杆菌O157：H7的特异基因rfbE作为靶基因，针对rfbE基因的保守区设计4-5条特定的环介导等温扩增引物，结合大肠杆菌O157：H7的基因组DNA，建立特定的环介导等温扩增引物的检测反应体系，并根据荧光染料显色情况进行结果判断,从而显著的提高了检测饲料中大肠杆菌O157的灵敏度。

除特殊说明外，本发明所述试剂、菌株均为本领域普通技术人员知晓的市售产品，所述百分比为质量百分比，所述试验方法均为常规实验方法，本领域技术人员根据本发明记载的内容能够直接实现本发明目的。

本发明的目的是这样实现的：

一种用于检测饲料中大肠杆菌O157的引物组，包括内引物FIP、内引物BIP、外引物F3和外引物B3，具体引物基因序列如下：

上述引物组稳定性、特异性、扩增性能好，综合性能优异，将其用于检测饲料中大肠杆菌O157，检测灵敏度非常高，检出限可达到4CFU/25g。

为进一步提高本发明检测方法的扩增效率、特异性和灵敏度，上述用于检测饲料中大肠杆菌O157的引物组好包括环引物LB；优选地，上述用于检测饲料中大肠杆菌O157的引物组是由内引物FIP、内引物BIP、外引物F3、外引物B3和环引物LB组成，具体引物基因序列如下：

基于环介导等温扩增技术，采用上述引物组用于检测饲料中大肠杆菌O157的检测方法，包括大肠杆菌O157培养、DNA提取、环介导等温扩增反应、结果观察步骤，具体为：

步骤1，大肠杆菌O157培养：对确证无大肠杆菌O157的配合饲料，人工引入大肠杆菌O157，加入肉汤后置于无菌恒温环境中培养，得到增菌液；

步骤2，DNA提取：先将前述所得增菌液离心处理后去掉上清液，然后用重蒸水洗涤、沉淀得到菌悬液，再将所得菌悬液煮沸后进行离心处理，去掉上清液，得到模板DNA；

步骤3，环介导等温扩增反应：将包含反应液、聚合酶、引物组和模板DNA的反应体系加入PCR管中，同时将显色液加在PCR管盖中间，并置于水浴锅或金属浴中反应30-60min；

步骤4，结果观察。

根据本发明的一个优选实施方案，通过特定浓度的引物组来进一步提高检测灵敏度，上述引物组中内引物(FIP)浓度为1.5-2μL，内引物(BIP)浓度为1.5-2μL，外引物(F3)浓度为0.2-0.25μL，外引物(B3)浓度为0.2-0.25μL。

根据本发明的另一个更优选实施方案，通过特定浓度的反应体系来更进一步提高检测灵敏度，上述环介导等温扩增反应为：在PCR管中加入反应液RM(2×)12.5μL、内引物(FIP)1.5-2μL、内引物(BIP)1.5-2μL、外引物(F3)0.2-0.25μL、外引物(B3)0.2-0.25μL、环引物(LB)0.8-1μL、Bst聚合酶0.8-1μL、模板DNA1-2μL，重蒸水补足25μL，混匀后得到反应体系，然后加入密封液20μl，同时将0.8-1μL显色液加在PCR管盖中间，并置于水浴锅或金属浴中反应30-60min；

本发明具如下有益效果：

针对靶基因GC含量较低，容易出现非特异扩增的特点，本发明在设计环介导等温扩增引物时统筹兼顾引物末端稳定性，引物Tm值，二级结构、引物位置等影响引物质量的因素，使引物组的综合性能最优。

本发明采用4-5条特定的环介导等温扩增引物，结合大肠杆菌O157的基因组DNA，建立特定的环介导等温扩增引物的检测反应体系，并根据荧光染料显色情况进行结果判断,显著的提高了检测灵敏度，且针对大肠杆菌O157进行检测，H型血清不分型。试验证明，本发明针对大肠杆菌O157的检测灵敏度为3.6×10¹CFU/mL，相比于CN106676173A中方法对EHEC O157：H7定性检测灵敏度(3.45×10⁴CFU/mL)，本发明灵敏度比其灵敏度要高3个数量级。

采用本发明特定的环介导等温扩增引物，建立的环介导等温扩增检测方法检测大肠杆菌O157的灵敏度为3.6×10¹CFU/mL，建立的普通PCR方法检测灵敏度为3.6×10³CFU/mL，即本发明环介导等温扩增检测方法检测大肠杆菌O157的灵敏度是普通PCR方法检测灵敏度的100倍；而CN106676173A中，采用其引物建立的EHEC O157：H7LAMP检测方法，检测灵敏度为3.45×10⁴CFU/mL，采用其引物建立的PCR检测方法，检测灵敏度为3.45×10⁵CFU/mL，即CN106676173A中LAMP检测灵敏度仅为一般PCR检测方法的10倍。可见，采用本发明特定的环介导等温扩增引物检测大肠杆菌O157，检测灵敏度非常高；即使采用本发明特定的引物组，结合普通PCR方法进行大肠杆菌O157的检测，检出限可达到4CFU/25g，具有明显优势。

本发明环介导等温扩增检测方法对产气肠杆菌、大肠埃希氏菌、肠炎沙门氏菌无特异性表达，针对大肠杆菌O157有明显表达，表明其特异性高。采用本发明环介导等温扩增检测方法检测饲料，检测结果非常精确，试验表明，对饲料中大肠杆菌O157检出限为2CFU/25g。此外，采用本发明检测饲料还具有检测速度快、操作方便等优势。

附图说明

图1：本发明中引物验证试验(显色情况)，添加环引物、不添加环引物组均显绿色；

图2：本发明中引物验证试验(电泳图)，添加环引物、不添加环引物组均具有特异性条带，但添加环引物LAMP反应梯形条带更亮、扩增产物更多，说明环引物可提高扩增效率；

图3：本发明中引物特异性试验(显色情况)，管1-9分别为产气肠杆菌ATCC13048、大肠埃希氏菌ATCC8739、大肠埃希氏菌ATCC25922、大肠埃希氏菌ATCC8099、肠炎沙门氏菌CMCC(B)50335、实验室保存沙门氏菌SL17SJ0060、大肠杆菌O157：H7:H7NCTC12900、大肠杆菌O157：H7:H7CICC21530、阴性对照，只有大肠杆菌O157：H7:H7反应液组(管7、8)呈现绿色；

图4：本发明中引物特异性试验(电泳图)，只有大肠杆菌O157：H7:H7反应液组(编号7、8)具有特异性条带；

图5：本发明中引物敏感性试验(显色情况)，前五组(浓度3.6×101CFU/g-3.6×105CFU/g)反应液显示绿色；

图6：本发明中引物敏感性试验(电泳图)，前五组(浓度3.6×101CFU/g-3.6×105CFU/g)具有特异性条带；

图7：本发明中引物敏感性试验(普通PCR电泳图)，前三组(浓度3.6×103CFU/g-3.6×105CFU/g)具有特异性条带；

图8：本发明实施例1中，饲料中大肠杆菌O157：H7检测结果(显色情况)，前七组(浓度14CFU/25g-2CFU/25g)扩增液均呈现绿色；

图9：本发明实施例1中，饲料中大肠杆菌O157：H7检测结果(电泳图)，前七组(浓度14CFU/25g-2CFU/25g)具有特异性条带；

图10：本发明实施例1中，饲料中大肠杆菌O157：H7检测流程；

图11：本发明实施例2中，饲料中大肠杆菌O157：H7检测结果。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行详细描述，在此指出以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术熟练人员可以根据上述发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。

试验用菌种及来源，详见表1：

表1试验用菌种及来源

引物设计

根据大肠杆菌O157：H7的O抗原特异基因rfbE序列(Genbank S83460)，用在线LAMP引物设计软件Primer Explorer 5.0设计引物，详见表2；

表2引物筛选

综合考虑到引物末端稳定性、热量值、GC含量、Tm值、二级结构和引物位置等因素，最终确定表3中特异性引物。

表3环介导等温扩增试验用引物组

环介导等温扩增检测标准

DNA提取

将保存的大肠杆菌O157：H7:H7(编号NCTC12900、CICC21530)冻干粉复苏涂布于营养琼脂平板上，35℃～37℃恒温培养箱内培养20h，传代两次。取传代培养的单菌落接种于灭菌的新鲜营养肉汤中，置于35℃～37℃恒温培养箱内培养20h，得到增菌液。取1mL增菌液，7000g离心1min，去掉上清液后先用重蒸水洗涤沉淀两次，再用100μL重蒸水悬浮沉淀，得到菌悬液；将所得菌悬液置于沸水中煮沸10min，7000g离心1min，去掉上清液，于-20℃环境中可保存3个月备用。

环介导等温扩增反应

扩增反应仪器：DNA扩增试剂盒(购自广州迪澳生物科技有限公司)；

采用引物组A建立25μL反应体系：反应液RM(2×)12.5μL、内引物FIP和内引物BIP均为0.25μL、外引物F3和外引物B3均为0.25μL、环引物(LB)1μL、模板DNA2μL、Bst聚合酶1μL，余量为重蒸水；

采用引物组B建立25μL反应体系：反应液RM(2×)12.5μL、内引物FIP和内引物BIP均为0.25μL、外引物F3和外引物B3均为0.25μL、模板DNA2μL、Bst聚合酶1μL，余量为重蒸水；

操作方法：反应体系个试剂混匀后，加入20μl密封液，混匀离心，将1μl的显色液滴在PCR管盖中间，盖紧管盖后在63℃水浴锅或金属浴中反应30-60min，得到反应液(PCR产物)。颠倒PCR管5次，使反应液与显色液充分混匀，观察反应液颜色。另取PCR产物5μL与1μL6×loddingbuffer(含溴酚兰、二甲苯青和甘油的上样缓冲液，购自大连(宝)生物科技有限公司)混匀，配置2％(质量体积分数)琼脂糖凝胶进行电泳，观察结果。应当注意的是需小心操作，以防显色液坠入反应混合液中。

引物验证试验

试验设计：设计3个试验组，分别为：添加环引物组(引物组A)，反应体系由反应液RM(2×)12.5μL、Bst聚合酶1μL、内引物(FIP)0.25μL、内引物(BIP)0.25μL、外引物(F3)0.25μL、外引物(B3)0.25μL、环引物(LB)1μL、重蒸水7.5μL、模板DNA2μL组成；不添加环引物组(引物组B)反应体系由反应液RM(2×)12.5μL、Bst聚合酶1μL、内引物FIP为0.25μL、内引物BIP为0.25μL、外引物F3为0.25μL、外引物B3为0.25μL、重蒸水8.5μL和模板DNA2μL组成；阴性对照组。按照前述3个试验组配制反应体系，分别置于恒温水浴锅进行扩增检测，反应液显色情况结果见图1；按照前述3个试验组配制反应体系，分别进行琼脂电泳检测，泳道M：DNAmarker2000，结果见图2。

结果分析：由图1、图2可知，添加环引物组与不添加环引物组的反应体系经环介导等温扩增反应后的反应液均显绿色，其电泳图呈现典型梯形条带，而阴性对照组既不显绿色，也无特异性条带。此外，从电泳图(图2)还可以看出，添加环引物组反应梯形条带更亮、扩增产物更多。可见，本发明环引物可提高扩增效率，提高反应特异性。

引物特异性试验

选用表1选取菌种，采用引物组A并参照前述环介导等温扩增检测标准进行环介导等温扩增试验，反应结束后观察反应液显色情况，结果见图3；取表1中菌种，按照常规方法进行琼脂电泳检测，泳道M：DNAmarker2000，结果见图4。

结果分析：由图3、图4可知，结果显示只有管7、管8两株大肠杆菌O157：H7:H7的反应液呈现绿色且电泳呈现梯形条带，其余均为阴性。可见，本发明引物对产气肠杆菌、大肠埃希氏菌、肠炎沙门氏菌无特异性表达，对大肠杆菌O157：H7:H7有明显表达。

引物敏感性试验

试验设计：取大肠杆菌O157：H7(编号NCTC12900、CICC21530)冻干粉复苏涂布于营养琼脂平板上，36℃±1℃恒温培养箱内培养20h，传代两次；取传代培养的单菌落接种于灭菌的新鲜营养肉汤中，置于36℃±1℃恒温培养箱内培养20h，得到增菌液。采用平板计数法确定所得增菌液原始浓度为3.6×10⁸CFU/g，将前述增菌液10倍递增稀释成终浓度为3.6×10⁷CFU/g、3.6×10⁶CFU/g、3.6×10⁵CFU/g、3.6×10⁴CFU/g、3.6×10³CFU/g、3.6×10²CFU/g、3.6×10¹CFU/g、3.6CFU/g、0.36CFU/g的增菌液。取终浓度为3.6×10⁵CFU/g、3.6×10⁴CFU/g、3.6×10³CFU/g、3.6×10²CFU/g、3.6×10¹CFU/g、3.6CFU/g、0.36CFU/g的增菌液1mL提取模板DNA，结合引物组A分别进行环介导等温扩增试验和普通PCR扩增试验，结果见图5、图6和图7。

结果分析：由图5、图6可知，结果显示在浓度为3.6×10¹CFU/g-3.6×10⁵CFU/g的反应液显绿色，电泳呈现梯形条带，浓度为3.6CFU/g、0.36CFU/g的反应液和阴性对照组均显示橙色，电泳均未呈现梯形条带。由图7可知，普通PCR扩增试验中，浓度为3.6×10³CFU/g-3.6×10⁵CFU/g的反应液，电泳时出现特异性条带，浓度为3.6×10²CFU/g、3.6×10¹CFU/g、3.6CFU/g、3.6CFU/g的反应液和阴性对照组未出现特异性条带。可见，采用环介导等温扩增方法检测大肠杆菌O157：H7的灵敏度(3.6×101CFU/g)比普通PCR方法检测灵敏度(3.6×103CFU/g)高100倍；即使采用本发明特定的引物组A，结合普通PCR方法进行大肠杆菌O157：H7的检测，检测灵敏度可达到3.6×10³CFU/g，相比于现有其他引物组，具有明显优势。

实施例1

饲料中大肠杆菌O157：H7检测，检测流程如图10所示，具体为：

大肠杆菌O157：H7培养：先将确证无大肠杆菌O157：H7的浓缩饲料500g与猪骨粉500g混合。称取8份25g样品人工引入大肠杆菌O157：H7，引入量分别为2CFU/25g、4CFU/25g、6CFU/25g、8CFU/25g、10CFU/25g、12CFU/25g、14CFU/25g，然后将引入大肠杆菌O157：H7的样品分别加入装有225mL改良EC肉汤(购自广东环凯)的无菌均质袋内，置于36℃±1℃恒温培养箱内培养18h，得到增菌液；

DNA提取：取前述1mL增菌液7000g离心处理1min后去掉上清液，然后用重蒸水洗涤沉淀两次，用100μL重蒸水悬浮沉淀，得到菌悬液，再将所得菌悬液于沸水中煮沸10min，7000g离心1min，去掉上清液，得到模板DNA；

环介导等温扩增反应：将反应液RM(2×)12.5μL、内引物(FIP)0.25μL、内引物(BIP)0.25μL、外引物(F3)0.25μL、外引物(B3)0.25μL、环引物(LB)1μL、Bst聚合酶1μL、重蒸水7.5μL与模板DNA2μL混匀后加入PCR管中，然后加入密封液20μl，混匀后得到反应体系，然后将显色液加在PCR管盖中间，并置于63℃水浴锅中反应50min，颠倒PCR管5次，使反应混合液与显色液充分混匀，观察结果；

结果观察：环介导等温扩增反应结束后观察反应产物颜色，结果见图8；另取产物5μL与1μL 6×loddingbuffer混匀，配置2％琼脂糖凝胶进行电泳，观察结果，结果见图9。

结果分析：由图8、图9可知，除1CFU/25g组外，2CFU/25g组、4CFU/25g组、6CFU/25g组、8CFU/25g组、10CFU/25g组、12CFU/25g组和14CFU/25g组环介导等温扩增反应液均呈现绿色，且电泳呈现梯形条带，可见本实施例对饲料中大肠杆菌O157：H7的检出限为2CFU/25g。

实施例2

参照实施例1中步骤培养大肠杆菌O157：H7，得增菌液，并按照下述方法进行普通PCR扩增试验。

普通PCR扩增反应：在PCR管中加入5×taq DNA聚合酶缓冲液10μL、dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸)混合液1μL、MgCl₂ 6μL、内引物(FIP)2μL、内引物(BIP)2μL、外引物(F3)2μL、外引物(B3)2μL、模板DNA 2μL、taq DNA聚合酶0.25μL，余量加重蒸水补足50μL得到反应体系。将PCR管放置到PCR仪中，按以下条件进行反应：先95℃变性2min；然后95℃，30s；57℃，30s；72℃，30s，如此35次循环操作；再72℃延伸5min。反应结束后，2％琼脂糖凝胶电泳观察结果，结果见图11，产物应为208bp。

结果分析：由图11可知，除1CFU/25g组、2CFU/25g组和4CFU/25g组外，6CFU/25g组、8CFU/25g组、10CFU/25g组、12CFU/25g组和14CFU/25g组普通PCR扩增反应液电泳呈现梯形条带，可见本发明引物组A进行普通PCR扩增试验对饲料中大肠杆菌O157：H7的检出限为4CFU/25g，具有明显优势。

实施例3-6

参照实施例1，检测饲料中大肠杆菌O157：H7。其中，环介导等温扩增反应体系各组分浓度按表4选择；

表4实施例3-6中反应体系各组分浓度

实施例7-8

参照实施例2，检测饲料中大肠杆菌O157：H7。其中，普通PCR扩增反应各组分的浓度按表5选择；

表5实施例7-8中反应体系各组分浓度

根据实施例3-6进行环介导等温扩增试验，根据实施例7-8进行普通PCR扩增试验，结果表明，其检测灵敏度非常高，检出限均可达到4CFU/25g。

上述具体实施方式以大肠杆菌O157:H7为试验菌株，由于本发明是针对大肠杆菌O157的O抗原基因设计的引物，且大肠杆菌O157:H7血清型为大肠杆菌O157的代表菌株，另外，通过检测大肠杆菌O157:H7来判断大肠杆菌O157也符合国家标准。因此，本发明试验结果适用于大肠杆菌O157。

考虑到检测途径、成本以及检测结果等方面，本发明基于普通PCR扩增方法，采用上述引物组检测饲料中大肠杆菌O157的检测方法也具有明显优势。

采用本发明所述引物组，还可用于制备成用于检测大肠杆菌的试剂盒。

序列表

<110> 重庆市动物疫病预防控制中心

<120> 用于检测饲料中大肠杆菌O157的引物组及其检测方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成引物()

<400> 1

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成引物()

<400> 2

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工合成引物()

<400> 3

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工合成引物()

<400> 4

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成引物()

<400> 5

Claims (8)

1.一种用于检测饲料中大肠杆菌O157的引物组，包括内引物FIP、内引物BIP、外引物F3和外引物B3，其特征在于：所述内引物FIP的基因序列为SEQ ID NO.1，所述内引物BIP的基因序列为SEQ ID NO.2，所述外引物F3的基因序列为SEQ ID NO.3，所述外引物B3的基因序列为SEQ ID NO.4。

2.根据权利要求1所述的用于检测饲料中大肠杆菌O157的引物组，其特征在于：所述引物组中还包括环引物LB。

3.根据权利要求1所述的用于检测饲料中大肠杆菌O157的引物组，其特征在于：所述引物组由所述内引物FIP、所述内引物BIP、所述外引物F3、所述外引物B3和环引物LB组成，且所述环引物LB的基因序列为SEQ ID NO.5。

4.如权利要求1-3任一项所述的引物组用于检测饲料中大肠杆菌O157的检测方法，其特征在于具体步骤如下：

步骤1，大肠杆菌O157培养：对确证无大肠杆菌O157的配合饲料，人工引入大肠杆菌O157，加入肉汤后置于无菌恒温环境中培养，得到增菌液；

步骤2，DNA提取：先将前述所得增菌液离心处理后去掉上清液，然后用重蒸水洗涤、沉淀得到菌悬液，再将所得菌悬液煮沸后进行离心处理，去掉上清液，得到模板DNA；

步骤3，环介导等温扩增反应：将包含反应液、聚合酶、引物组和模板DNA的反应体系加入PCR管中，同时将显色液加在PCR管盖中间，并置于水浴锅或金属浴中反应30-60min；

步骤4，结果观察。

5.根据权利要求4所述的引物组用于检测饲料中大肠杆菌O157的检测方法，其特征在于：所述引物组中内引物(FIP)浓度为1.5-2μL，内引物(BIP)浓度为1.5-2μL，外引物(F3)浓度为0.2-0.25μL，外引物(B3)浓度为0.2-0.25μL。

6.根据权利要求4所述的引物组用于检测饲料中大肠杆菌O157的检测方法，其特征在于：，所述环介导等温扩增反应为：在PCR管中加入反应液RM(2×)12.5μL、内引物(FIP)1.5-2μL、内引物(BIP)1.5-2μL、外引物(F3)0.2-0.25μL、外引物(B3)0.2-0.25μL、环引物(LB)0.8-1μL、Bst聚合酶0.8-1μL、模板DNA 1-2μL，重蒸水补足25μL，混匀后得到反应体系，然后加入密封液20μl，同时将0.8-1μL显色液加在PCR管盖中间，并置于水浴锅或金属浴中反应30-60min。

7.如权利要求1-3任一项所述的引物组在普通PCR扩增检测大肠杆菌O157中的应用。

8.如权利要求1-3任一项所述的引物组在大肠杆菌O157检测试剂盒中的应用。