CN108950029A - 大肠杆菌o157的多重pcr检测引物及检测方法 - Google Patents

大肠杆菌o157的多重pcr检测引物及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及大肠杆菌O157的多重PCR检测引物及检测方法。多重PCR检测引物包括3对引物，分别扩增O157的rfbE、fliC、stx1基因，序列详见序列表所示。使用上述检测引物对大肠杆菌O157DNA进行多重PCR检测，设置阳性对照和阴性对照、空白对照，所述PCR扩增条件为94℃变性5min，然后94℃预变性30s，48‑52℃退火45s，72℃延长45s，共扩增循环30‑35个循环，最后72℃延伸5min。本发明的大肠杆菌O157检测引物、检测方法具有特异、灵敏的优点，可以实现对大肠杆菌O157的精准鉴定。

Description

大肠杆菌O157的多重PCR检测引物及检测方法
技术领域
本发明涉及微生物分子生物学检测技术，特别是涉及大肠杆菌O157的多重PCR检测引物及检测方法。
背景技术
大肠杆菌(Escherichia coli)是Escherich在1885年发现的，在相当长的一段时间内，一直被当作正常肠道菌群的组成部分，认为是非致病菌，直到20世纪中叶，才认识到一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有病原性，尤其对婴儿和幼畜禽，常引起严重腹泻和败血症。
大肠杆菌的抗原成分复杂，可分为菌体抗原(O)、鞭毛抗原(H)和表面抗原(K)。根据O抗原的不同，可将大肠杆菌分为150多个血清型，其中16个血清型为致病性大肠杆菌，常引起流行性婴儿腹泻和成人肋膜炎。大肠杆菌的血清型众多，鉴别困难。
根据不同的生物学特性，将致病性大肠杆菌分为肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)、大肠杆菌(EHEC)、肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠聚集性大肠杆菌(EAEC)、肠外致病性大肠杆菌等(EXEC)等。
大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC)是一类对人类致病的大肠杆菌，以引起肠道出血为特点，症状包括腹痛、血性腹泻、败血症、严重胃肠炎等，严重者可并发溶血性尿毒综合症，引起急性肾衰竭、溶血性贫血和血小板减少甚至死亡。大肠杆菌也被称为产志贺毒素大肠杆菌或产志贺样毒素大肠杆菌。潜伏期为1-10日，通常为48-72小时。EHEC是重要的人畜共患性和食源性致病菌。EHEC感染或人食用了被污染的食品而发病，被WHO列为四大食源性致病菌之一，公共卫生和食品安全意义重大。美国CDC调查表明，每年约有70000人感染大肠杆菌病例。EHEC主要寄生在牛、羊等家畜和其它反刍动物体内。人主要通过食用被人畜粪便污染的食物，如烹煮不彻底的肉馅制品或未经消毒的牛奶、受粪便污染的水和蔬菜等被感染。
EHEC是大肠杆菌的一个亚型，以O抗原分型，EHEC可分为O157、O26、O111、O104等血清型。O157：H7主要见于婴幼儿，以爆发流行性为主，美国在1982、1984、1993年曾三次发生O157:H7的爆发性流行。日本曾在1996年爆发过波及9000多人的大流行。2011年爆发于德国席卷欧洲的大肠杆菌O104:H4疫情导致约3000人发病，数十人死亡。
大肠杆菌的毒力因子有菌毛(黏附素)、内毒素、荚膜、外毒素等，外毒素有志贺毒素、肠毒素(包括耐热毒素LT和不耐热毒素LT)等。O157的主要毒力因子有黏附因子(菌毛、外膜蛋白、紧密素等)、肠毒素(志贺毒素STX、溶血素、Ⅲ型分泌系统)等。
对细菌鉴定方法有微生物分离培养法、形态观察法、生化反应、免疫学方法、分子生物学方法等。传统的微生物分离培养要经过增菌培养、选择培养、鉴别培养等步骤，操作繁琐，耗时长，一般需要5-15天的培养鉴定时间，不能满足食源性微生物快速检测的需求。生化特性鉴定法和血清学鉴定法是基于表型特征进行鉴定的，但这些方法鉴定能力有限，区分度差，常因表型发生变异而导致鉴定失败，因此依据表型特征往往不能准确鉴定微生物，尤其是对血清型众多的大肠杆菌。如已发现山梨醇发酵阳性和β-葡糖醛酸糖苷酶活性阳性的大肠杆菌O157菌株，因此，不能通过不发酵山梨醇、缺乏β-葡糖醛酸糖苷酶活性的特征来特异鉴定大肠杆菌O157菌株。此外，沙门氏菌的N群、小肠结肠炎耶尔森氏菌等菌的菌体抗原也能与O157菌体抗原的抗体发生交叉反应，因此，也不能通过鉴定O157菌体抗原来特异鉴定大肠杆菌O157菌株。
分子生物学检测法是基于核酸检测的方法，具有特异、灵敏等优点，能准确鉴定微生物的种属关系，在微生物的分类鉴定中应用广泛。该类方法又以PCR、多重PCR、荧光定量PCR、基因芯片等检测技术应用较广泛。
已公开的检测EHEC O157:H7的方法很多，包括PCR、荧光PCR等。这些方法均基于O157的志贺样毒素基因、溶血素基因hly和eae基因等。但许多非O157血清型的EHEC，如O26、O111、O91、O103、O146等血清型的大肠杆菌以及志贺氏菌、霍乱弧菌、枸橼酸杆菌等的部分菌株也具有志贺样毒素基因，因此，单纯使用一对志贺样毒素基因引物检测无法区分这些菌株与EPEC及EHEC的不同血清型。EPEC和EHEC的eae基因有高度的同源性。EHEC O26、O111等也有溶血素基因hly，同样可以引起出血性肠炎和溶血性尿毒综合征，因此对eae、hly基因的鉴定也不能特异检测大肠杆菌O157:H7菌株。O157大肠杆菌具有多种鞭毛抗原，而许多非O157血清型菌株，尤其是大肠杆菌O55:H7菌株也有H7鞭毛基因fliC，因此fliC基因检测只能作为辅助检测手段用于大肠杆菌O157:H7菌株的鉴定。
到目前为止还没有出现关于运用三重PCR鉴定EHEC O157:H7菌株的报道。
与现有的O157的PCR检测法比较，本发明使用三重PCR通过一次扩增O157的stx1、rfbE、fliC三个携带率最高的毒力基因，检测特异性比常规的检测其中一种或二种基因的PCR方法高，可用于O157的精准鉴定，不会发生错检和漏检的情况。
发明内容
为解决上述背景技术中提到的大肠杆菌O157的鉴定耗时长、特异性差、灵敏度低等问题，本发明提供了一种检测灵敏度高的O157的多重PCR检测引物及检测方法。
本发明是通过以下方式实现的：
大肠杆菌O157的多重PCR检测引物及检测方法，其特征在于包括3对引物，引物序列如下：
rfbE上游引物F1：5’-CGTAAGAGGGACCGTAGA-3’(SEQ ID No.1)，
rfbE下游引物F2：5’-TGGCTGGATTATCGTTTG-3’(SEQ ID No.2)，
fliC上游引物F3：5’-GCTGTCGAGTTCTATCGAG-3’(SEQ ID No.3)，
fliC下游引物F4：5’-GTGACTTTATCGCCATTCC-3’(SEQ ID No.4)，
stx1上游引物F5：5’-ACGAGGGCTTGATGTCTA-3’(SEQ ID No.5)，
stx1下游引物F6：5’-GTAAGGCTTCTGCTGTGA-3’(SEQ ID No.6)，
设计多重PCR引物时应尽量避免引物二聚体、发卡结构的形成。上述引物是大肠杆菌O157的rfbE、fliC、stx1基因的保守区，所以引物能够识别所有的O157的rfbE、fliC、stx基因，因而能检测所有的大肠杆菌O157。
大肠杆菌O157的多重PCR检测方法，其特征在于每25μLPCR反应体系中含有以下组分：10×PCRbuffer 2.5ul，25mmol/LMgCl20.25-1.5μL，Taq DNA聚合酶1.25U，2.5mmol/LdNTPs2ul，DNA模版1-2ul，上下游引物各0.5-1ul，灭菌双蒸水补足体积至25ul。设阳性对照、阴性对照和空白对照(蒸馏水)。将上述PCR反应液添加到反应管中，置PCR仪中进行扩增，扩增程序为94℃变性5min，然后94℃预变性30s，48-52℃退火30s，72℃延长45s，共扩增循环30-35个循环，最后72℃延伸5min。反应结束后取PCR产物，在1-2％的琼脂糖凝胶上电泳，电泳结束后将凝胶置紫外成像仪中观察结果。
结果判定标准：利用本发明所述的引物及检测方法对菌液进行多重PCR检测，如果在琼脂糖凝胶电泳后的紫外成像时观察到三个条带，大小分别为350、570、620bp左右，可判定该菌为大肠杆菌O157；如果未出现大小为350、570、620bp左右的三个条带，则判定该菌不是大肠杆菌O157。
本发明的有益效果：与大肠杆菌O157的一重、二重PCR检测法相比，本发明提供的大肠杆菌O157的三重PCR检测引物及检测方法。在特异性、灵敏度上明显提高，能够检测出绝大多数大肠杆菌O157，不会发生误诊、漏诊现象。本试剂盒可应用于食品中携带大肠杆菌O157的检测。
附图说明
图1大肠杆菌O157的多重PCR检测的特异性验证结果。Stx1、flic、rfbE引物分别只能扩增出stx1、flic、rfbE基因，PCR扩增出的目的片段大小分别为350、620、570bp，不能扩增出其它基因的片段，表明这三种引物的特异性均很好。
图2大肠杆菌O157的多重PCR灵敏度验证结果。泳道1-5中的DNA模板依次为大肠杆菌O157(ATCC 35150)的基因组DNA，自左至右浓度分别为46、4.6、0.46、0.046、0.0046ng/ul。多重PCR检测O157的灵敏度达4.6ng/ul。
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明的有关内容。
实施例1：O157PCR检测引物的设计、合成
引物是在Genbank中查找大肠杆菌O157的stx1、flic、rfbE基因的序列，用CLUSTAL、DNAMAN等生物学软件进行基因序列的比对、分析，找到各靶基因的保守区序列，以保守区序列作为PCR扩增区域，使用Primers Premier、Oligo等生物学软件设计引物，在线BLAST验证引物的特异性和可行性，并按照本领域常规的方法合成。
引物序列为：
rfbE上游引物F1：5’-CGTAAGAGGGACCGTAGA-3’(SEQ ID No.1)，
rfbE下游引物F2：5’-TGGCTGGATTATCGTTTG-3’(SEQ ID No.2)，
fliC上游引物F3：5’-GCTGTCGAGTTCTATCGAG-3’(SEQ ID No.3)，
fliC下游引物F4：5’-GTGACTTTATCGCCATTCC-3’(SEQ ID No.4)，
stx1上游引物F5：5’-ACGAGGGCTTGATGTCTA-3’(SEQ ID No.5)，
stx1下游引物F6：5’-GTAAGGCTTCTGCTGTGA-3’(SEQ ID No.6)，
扩增的stx、flic、rfbE基因的目的片段大小分别约为350、620、570bp。
实施例2：O157PCR检测退火温度优化
1.大肠杆菌O157的DNA提取
采用煮沸法法裂解大肠杆菌O157(ATCC35150)，采用酚-氯仿-异戊醇试剂抽提细菌DNA。具体步骤为：取O157菌液1ml，于1.5ml的离心管内，置水浴锅中煮沸10分钟。10000r/min离心5min，取上清液，分别加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，然后轻微混匀，在室温条件下放置5-10min后，12000rpm离心10min。重复抽提2-3次。吸取上清液，加入等体积的无水乙醇，在低温条件下放置30min，然后12000r/min离心10min，留沉淀。用预冷的70％乙醇洗涤DNA，除去多余的杂质。12000r/min离心10min，轻轻倒掉上层液体，在超净工作台上进行风干，用20-50ul双蒸水或TE缓冲液重溶DNA，-20℃保存备用。
2.PCR检测步骤
PCR反应体系为25ul。每25μL PCR反应体系中含有以下组分：10×PCRbuffer2.5ul，25mmol/LMgCl20.25-1.5μL，Taq DNA聚合酶1.25U，2.5mmol/L dNTPs 2ul，DNA模版1-2ul，上下游引物各0.5-1ul，灭菌双蒸水补足体积至25ul。设阳性对照、阴性对照和空白对照(蒸馏水)。
PCR反应程序为：94℃变性5min，然后94℃预变性30s，48-52℃退火30s，72℃延长45s，共扩增循环30-35个循环，最后72℃延伸5min。最佳退火温度筛选采用温度梯度PCR，温度范围设置为48-52℃，间隔1℃，比较不同退火温度对PCR反应结果的影响。
本申请实施例中实际使用的Taq DNA聚合酶购自TaKaRa。
本申请实施例中实际使用PCR仪进行PCR反应。
3.结果判定
电泳结束，将PCR反应产物在1-2％琼脂糖凝胶上电泳，电泳结束，将凝胶置紫外成像仪中观察有无条带及条带大小，来判定PCR扩增是否成功。如果有条带且大小与目的条带的大小一致，则判定检测结果为阳性；如果无条带，则判定检测结果为阴性。详见附图1。
实验结果发现，在退火温度设置为48-52℃时，采用本发明所述的引物和PCR检测方法，均能扩增出大肠杆菌O157的三个目的基因条带，说明退火温度对本发明的检测影响小。
实施例3：引物比例对多重PCR检测的影响
大肠杆菌O157的DNA提取、PCR反应体系和扩增程序参照实施例2。在PCR反应体系中只变换引物对的比例一个变量，每对引物内的上下游引物的摩尔比为1:1，stx1、flic、rfbE的引物对之间的摩尔比分别设置为1:1:1、1:2:1、2:3:1，研究引物对大肠杆菌O157的多重PCR检测的影响。
实验结果发现，stx1、flic、rfbE的引物对之间的摩尔比为1:2:1、2:3:1时三个条带的亮度优于摩尔比为1:1:1时，说明这三对引物对各自靶基因的扩增效率不同。
实施例4：镁离子浓度对多重PCR检测的影响
大肠杆菌O157的DNA提取、PCR反应体系和扩增程序参照实施例2。在PCR反应体系中只变换镁离子浓度一个变量，在25μL的PCR反应体系中分别添加25mmol/L的MgCl2的体积为0、0.5、1、1.5μL，研究镁离子浓度对大肠杆菌O157的多重PCR检测的影响。
实验结果发现，镁离子浓度对大肠杆菌O157的多重PCR检测的影响较大，在25μL的PCR反应体系中分别添加25mmol/L的MgCl2的体积为1μL时PCR扩增效果最好，三个条带都清晰可辨。
实施例5：循环数对多重PCR检测的影响
大肠杆菌O157的DNA提取、PCR反应体系和扩增程序参照实施例2。在PCR检测时只变换扩增循环数一个变量，将PCR反应程序中的循环数分别设置为25、30、35，研究循环数对大肠杆菌O157的多重PCR检测的影响。
实验结果发现，扩增循环数对大肠杆菌O157的多重PCR检测的影响较大，在PCR反应扩增循环数为30和35时的PCR扩增效果好于25个循环，三个条带都清晰可辨，粗细相当。
实施例6：多重PCR检测O157的特异性验证
用本发明所述的多重PCR引物及检测方法对本实验室保存的各种细菌进行特异性验证，革兰氏阴性菌的DNA提取、PCR反应体系和扩增程序参照实施例2。革兰氏阳性菌的DNA提取参照分子克隆手册中的操作步骤，采用溶菌酶和蛋白酶K或CTAB等传统制备方法提取。本实验室保存的实验菌有单增李斯特菌分离菌、肠炎沙门氏菌、大肠埃希氏菌(O1、O2、O78、O16、O9、O10、O104、O157、O111、O126等血清型)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)、大肠杆菌(EHEC)、肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠聚集性大肠杆菌(EAEC)、志贺菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、阪崎肠杆菌、马兽疫链球菌、猪链球菌等，每种菌都有多个分离株，提取各种细菌的DNA，进行多重PCR检测，设阳性对照(大肠杆菌O157的ATCC35150株的DNA)、空白对照组。检测结果表明只有大肠杆菌O157检测阳性，而其它种类的细菌DNA样品检测结果均为阴性，表明本发明的检测引物及检测方法的特异性强，不受其它菌株的干扰。
实施例7：多重PCR检测O157的灵敏度验证
用微量分光光度计测定大肠杆菌O157(ATCC35150株)的DNA模板的浓度，将阳性DNA的浓度进行倍比稀释，然后取各梯度浓度的阳性DNA模板进行反应。反应体系和反应程序参照实施例2，研究本发明所述的引物的检测灵敏度。
PCR检测结果表明本发明的PCR引物及其检测方法能够检测到的大肠杆菌O157的最低DNA浓度为2ng/μL。
上述实施例的实验结果表明，本发明提供的大肠杆菌O157的多重PCR引物及其检测方法的特异性强、灵敏度高，能够实现对大肠杆菌O157的准确鉴定。
序列表
<110> 齐鲁工业大学
<120> 大肠杆菌O157的多重PCR检测引物及检测方法
<130> 0
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli人工序列)
<400> 1
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli人工序列)
<400> 2
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli人工序列)
<400> 3
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli人工序列)
<400> 4
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli人工序列)
<400> 5
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli人工序列)
<400> 6

Claims (3)

1.大肠杆菌O157的多重PCR检测引物及检测方法，其特征在于包括3对引物，引物序列如下：
rfbE上游引物F1：5’-CGTAAGAGGGACCGTAGA-3’(SEQ ID No.1)，
rfbE下游引物F2：5’-TGGCTGGATTATCGTTTG-3’(SEQ ID No.2)，
fliC上游引物F3：5’-GCTGTCGAGTTCTATCGAG-3’(SEQ ID No.3)，
fliC下游引物F4：5’-GTGACTTTATCGCCATTCC-3’(SEQ ID No.4)，
stx1上游引物F5：5’-ACGAGGGCTTGATGTCTA-3’(SEQ ID No.5)，
stx1下游引物F6：5’-GTAAGGCTTCTGCTGTGA-3’(SEQ ID No.6)。
2.根据权利要求1所述的多重PCR检测方法，其特征在于每25μL PCR反应体系中含有以下组分：10×PCRbuffer 2.5ul，25mmol/LMgCl20.25-1.5μL，Taq DNA聚合酶1.25U，2.5mmol/L dNTPs 2ul，DNA模版1-2ul，上下游引物各0.5-1ul，灭菌双蒸水补足体积至25ul，设阳性对照、阴性对照和空白对照(蒸馏水)，将上述PCR反应液添加到反应管中，置PCR仪中进行扩增，扩增程序为94℃变性5min，然后94℃预变性30s，48-52℃退火30s，72℃延长45s，共扩增30-35个循环，最后72℃延伸5min，反应结束后取PCR产物，在1-2％的琼脂糖凝胶上电泳，电泳结束后将凝胶置紫外成像仪中观察结果。
3.根据权利要求1所述的检测引物和检测方法，其特征在于在检测临床样品里存在的大肠杆菌O157中的应用。
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