CN111057671A - 一种鸡白痢沙门菌单基因无痕敲除减毒株及其制备方法和应用 - Google Patents

一种鸡白痢沙门菌单基因无痕敲除减毒株及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于禽沙门菌病的防治领域，具体涉及一种鸡白痢沙门菌单基因无痕敲除减毒株及其制备方法和应用。通过同源重组技术无痕敲除rfbE基因，无任何外源的碱基残留，构建DIVA减毒沙门菌疫苗，通过动物试验发现，所述DIVA减毒沙门菌疫苗，不仅可以运用PAT方法区分疫苗免疫动物和野生菌感染动物，而且可以对强毒力鸡白痢沙门菌提供良好的保护作用，有效清除强毒力菌株感染。接种本发明鸡白痢沙门菌减毒活疫苗后，所述疫苗具有良好的免疫原性，对雏鸡可提供坚实的免疫保护效果。疫苗株毒力显著降低，在宿主体内定殖时间明显缩短，接种后鸡只无不良反应，通过玻板凝集试验即可快速地区分疫苗接种鸡与自然感染鸡。

Description

一种鸡白痢沙门菌单基因无痕敲除减毒株及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于禽沙门菌病的防治领域，具体涉及一种鸡白痢沙门菌单基因无痕敲除减毒株及其制备方法和应用。
背景技术
沙门菌是一种重要的病原菌，能够感染人和动物，严重威胁人和动物健康，是研究较为广泛和深入的细菌之一。鸡白痢沙门菌是沙门菌属中的一种沙门菌，该沙门菌主要感染禽类，是一种宿主专嗜性病原菌，主要侵害20日龄以内的雏鸡，雏鸡感染后表现出典型的白色下痢症状，呈高发病率和高死亡率。成年鸡感染呈现隐形带菌，长期携带和间歇排菌，无明显临床症状。该沙门菌既可水平传播，造成群体感染，又可通过卵巢垂直经蛋传播给子代，使得该菌能够在养鸡场反复存在，难以清除。因此，鸡白痢沙门菌对养鸡场造成的严重危害，引起巨大的经济损失。该沙门菌在全世界都受重视，在发达国家已经通过措施被净化，但是最近在发达国家又有多起鸡白痢沙门菌病再次发生的报道。而在发展中国家仍然是关注的主要疾病，还没有被净化。
国内常采用抗生素药物控制法，造成了细菌耐药性和药物残留等一系列问题，导致超级耐药细菌的出现，严重威胁人类的健康，因此WHO呼吁各国政府限制抗生素的使用。我国政府响应WHO呼吁，在我国境内执行限制使用抗生素的“限抗令”。
疫苗使用也是预防该沙门菌的措施之一，许多国家逐渐转向使用疫苗预防来控制沙门菌，取得了很好的效果。近年来，利用基因工程技术将强毒株毒力相关基因敲除构建的新型减毒沙门菌用作疫苗的研究备受关注，新型减毒活疫苗安全性好、不易返祖；在减毒的同时不丧失免疫原性，并且可在免疫期内于免疫动物体内繁殖，能刺激机体产生全面的系统免疫反应和局部免疫反应，可对病原体的多种抗原产生免疫应答；免疫力坚实，免疫期长，比灭活疫苗和亚单位疫苗在预防控制鸡沙门菌的感染方面更有优势，因而是较为理想的疫苗。
在养鸡场，对该沙门菌的检测普遍使用玻板凝集试验(PAT)进行检测，该方法简单方便快捷廉价等优点，但该方法无法区分血清中的抗体是常规疫苗免疫所致还是野生菌感染所致，因此需要一种DIVA(Differentiation of Infected and Vaccinated Animals)疫苗，配合PAT检测，从而实现养鸡场鸡白痢沙门菌的净化。
发明内容
鉴于以上现有技术的情况，本发明的目的在于提供一种鸡白痢沙门菌单基因无痕敲除减毒株及其制备方法和应用。所述减毒株在宿主体内定殖时间明显缩短，接种后鸡只无不良反应，对强毒力鸡白痢沙门菌提供良好的保护作用，可有效清除强毒力菌株感染。
为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种鸡白痢沙门菌单基因无痕敲除减毒株，所述减毒株为rfbE基因不表达的鸡白痢沙门菌。
进一步的，所述减毒株为采用自杀质粒同源重组的方法将rfbE基因无痕敲除的鸡白痢沙门菌。
进一步的，所述rfbE基因序列如SEQ ID NO：2所示。
进一步地，所述减毒株还可经过其他基因改造。
所述的其他基因改造是指除rfbE基因敲除以外的基因改造。所述其他基因改造可以是单个目标基因的改造或者为多个感兴趣目标基因的改造。感兴趣目标基因并不特指，可以根据研究需要设定并改造。例如，可以是一个、两个、三个以上目标基因的改造。理论上可以不断对其进行基因改造，对于目标基因的改造数量可以按照需要操作，没有特别限制。
基因改造具体是指通过生物或化学或物理的手段使基因相比改造前在结构上发生变化。这种变化主要是指碱基对组成的变化，包括但不限于一个或多个碱基对的替换、增添、缺失引起的改变。所述基因改造包括但不限于目标基因的敲入、目标基因的敲除等。目标基因的敲入、目标基因的敲除可以采用基因打靶、同源重组等技术来完成。
本发明的第二方面，提供一种鸡白痢沙门菌单基因无痕敲除减毒株构建方法，包括以下步骤：将野生型鸡白痢沙门菌中的rfbE基因无痕敲除。
进一步的，所述基因敲除方法为采用同源重组的无痕敲除方法。
进一步的，包括以下步骤：
野生型鸡白痢沙门菌的rfbE基因上下游同源片段扩增与纯化；
将pGMB 152质粒与野生型鸡白痢沙门菌的rfbE基因上下游同源片段连接；
将rfbE基因重组片段电转入χ7213感受态中并筛选阳性重组菌；
将筛选得到的阳性重组菌与野生型鸡白痢沙门菌接合转移，并筛选阳性重组菌，得到鸡白痢沙门菌单基因无痕敲除减毒株。
可以采用现有的基因编辑方法敲除所述rfbE基因。优选地，可采用同源重组的方法敲除rfbE基因。在优选的实施例中，采用自杀质粒同源重组的方法敲除rfbE基因。还可采用其他方法实现基因敲除，并不限于实施例所列举的方式。
基于rfbE基因的敲除，rfbE基因的完整序列或部分序列从染色体DNA中去除。
本发明的第三方面，提供所述鸡白痢沙门菌单基因无痕敲除减毒株在制备沙门菌活疫苗中的用途。
进一步的，所述沙门菌为鸡白痢沙门菌。
本发明的第四方面，提供所述鸡白痢沙门菌单基因无痕敲除减毒株在制备沙门菌感染治疗药物中的用途。
本发明提供了rfbE基因作为靶基因在筛选鸡白痢沙门菌感染治疗药物中的用途。本发明所述鸡白痢沙门菌感染治疗药物为以rfbE基因为治疗靶基因，使rfbE基因敲除、不表达的药物或者以rfbE基因表达的蛋白为拮抗对象的药物；或者以rfbE基因和其他基因共同作为靶基因加以沉默的药物。以rfbE基因为靶点，筛选使这两个基因不表达的药物，用于使鸡白痢沙门菌毒性减弱，以治疗鸡白痢沙门菌感染。例如，该鸡白痢沙门菌感染治疗药物可以通过RNA干扰或者基因重组的方法使rfbE基因敲除或不表达；或者通过制备rfbE蛋白拮抗剂，使rfbE基因表达的蛋白不发挥作用。
本发明的第五方面，提供一种鸡白痢沙门菌活疫苗，所述疫苗含有如权利要求1～3任一权利要求所述的鸡白痢沙门菌单基因无痕敲除减毒株。
进一步的，所述鸡白痢沙门菌活疫苗中还含有佐剂。
鸡白痢沙门菌为现有技术，具体信息为：Accession:NC_021984.1；GI:529218781。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明旨研制了一种单基因无痕敲除的鸡白痢沙门菌减毒株，本发明通过动物试验发现，所述突变株毒力显著降低，在宿主体内定殖时间明显缩短，接种后鸡只无不良反应，对强毒力鸡白痢沙门菌提供良好的保护作用，可有效清除强毒力菌株感染。
进一步的，采用所述减毒株做制备的鸡白痢沙门菌活疫苗，其毒力相对于野生型鸡白痢沙门菌显著降低，表现在其对3日龄海兰白雏鸡的致死剂量明显提高。接种本发明鸡白痢沙门菌减毒活疫苗后，宿主不产生针对O-抗原的抗体，通过鸡白痢鸡伤寒多价检测抗原，可有效的应用玻板凝集试验对免疫接种鸡和自然感染鸡予以区分。所述疫苗具有良好的免疫原性，对雏鸡可提供坚实的免疫保护效果，并且可以通过玻板凝集试验快速地区分疫苗接种鸡与自然感染鸡。亦即，所述疫苗具有区分免疫接种鸡和自然感染鸡的功能，通过玻板凝集试验即可加以区别，疫苗应用不影响鸡白痢阳性鸡检疫淘汰制度的实施。
附图说明
图1：rfbE同源臂PCR扩增结果，M：DL2000 DNA marker；1：上游同源重组片段；2：下游同源重组片段。
图2：质粒pGMB152的图谱。
图3：是rfbE同源臂连接片段的PCR扩增结果，M：DL2000 DNA marker；1：同源重组连接片段。
图4：pGMB152引物验证PCR结果，M：DL2000 DNA marker；1：转化子pGMB152-F/R引物验证；2：pGMB152质粒阳性对照。
图5：rfbE-NYZ-F/R引物验证图，M：DL2000 DNA marker；1：转化子rfbE-NYZ-F/R引物验证；2：S06004(WT)阳性对照。
图6：细菌在肝脏中的持续带菌情况。
图7：细菌在脾脏中的持续带菌情况。
图8：免疫试验结果。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。
实施例1
鸡白痢沙门菌S06004ΔrfbE的构建
野生型鸡白痢沙门菌S06004来源：江苏省人兽共患病学重点实验室保存
野生型鸡白痢沙门菌S06004的鉴定：
1.1细菌鉴定
1.1.1染色镜检：
革兰氏法染色后，普通光学显微镜下观察菌体形态、测量细菌大小。革兰氏染色结果显示镜检可观察到散在排列的红的短小直杆菌，大小约为1μm×4μm。
1.1.2生化试验
挑取纯培养的单菌落，以革兰氏阴性生化鉴定卡鉴定其生化特性。细菌可发酵葡萄糖、甘露糖，不发酵麦芽糖、蔗糖、尿素酶，不产生硫化氢。
2.鸡白痢沙门菌S06004ΔrfbE突变株的筛选与鉴定
2.1鸡白痢沙门菌S06004ΔrfbE的构建
2.1.1引物
根据GeneBank上已发表的沙门菌基因组序列，野生型鸡白痢沙门菌S06004的rfbE基因的阅读框序列如SEQ ID NO：1所示。用引物设计软件Primer 5.0设计出特异性的rfbE上下游序列引物，以及验证引物，引物见表1。
表1引物及其序列
Figure BDA0002302858320000061
2.1.2 rfbE上下游同源片段的扩增与纯化
以S06004基因组作为模板，表1中的引物进行PCR扩增，扩增反应体系如下表2所示。
表2同源片段PCR扩增体系
Figure BDA0002302858320000071
PCR反应条件如下：98℃5min；98℃10sec，60℃15sec，72℃50sec，30cycles；72℃10min。反应结束后，用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，利用TaKaRa MiniBEST AgaroseGel DNA Extraction Kit Ver.4.0试剂盒回收662bp(上游片段)和901bp(下游片段)的PCR产物，回收产物于-20℃保存。rfbE上下游同源片段的PCR扩增结果如图1所示。
2.1.3 pGMB 152质粒酶切片段的回收
pGMB 152质粒(图谱如图2所示)酶切反应体系如下表3所示。
表3 pGMB152酶切体系
Figure BDA0002302858320000072
pGMB 152质粒按体系37℃酶切2h，2次酶切，通过试剂盒回收，回收产物于-20℃保存。
2.1.4质粒与目的片段的连接
pGMB 152质粒与S06004的上下游同源片段，通过一步法进行连接，连接体系如下表4所示。
表4同源片段连接体系
Figure BDA0002302858320000081
2.1.5 E.coliχ7213感受态细胞的制备
使用生工的超级感受态试剂盒(B529303)制备E.coli.χ7213感受态，将E.coli.χ7213接种于4mL(含DAP)的LB肉汤中，180rpm，37℃过夜摇振培养。E.coli.χ7213按1：50取1ml于50ml的BT Media中，220rpm，37℃摇振培养，至OD600nm为0.5～0.6。将E.coli.χ7213转移至50mL离心管中，冰上静置5-10min，4℃，4800rpm，5min。小心弃上清，用16mL预冷的的BTBuffer A轻轻柔重悬，冰上静置10-15min，4℃，4800rpm，5min。用4mL预冷的BT Buffer B轻柔充分重悬菌体，100μL/管分装至1.5mL离心管中，-70℃保存。
2.1.6 rfbE基因重组片段电转化及阳性重组菌的筛选
将rfbE基因重组片段电转入E.coli.χ7213感受态中。将基因重组片段与100μL感受态细胞混合，冰浴30min，转移入电击杯中后，在电压1.8KV的参数下电击。电击完成后立即将37℃预热的SOC加入电击杯中，用移液枪吹打均匀，吸入1.5mL离心管中，于37℃，180rpm摇床内振荡培养2h。培养完成后，涂布于含Amp、Sm和DAP的LB固体培养基上，37℃过夜培养。用rfbE-up-F，rfbE-down-R引物进行PCR验证，如图3所示。
2.1.7 rfbE(χ7213-pGMB 152)与S06004的接合转移及阳性重组菌的筛选
将上一步筛选正确的菌落接种于4mL(含Amp、Sm和DAP)的LB肉汤中，将S06004接种于4mL(含Nal)的LB肉汤中，180rpm，37℃过夜摇振培养。rfbE(χ7213)与S06004按4：1比例混匀，分装至1.5mL离心管中，4500rpm，5min离心。加入1ml的PBS重悬，4500rpm，5min离心。加入1ml的LB重悬，4500rpm，5min离心。加入200μl的LB重悬，滴于滤膜中央(置于含DAP的LB培养基上)，30℃培养24h-36h。用1ml的PBS将滤膜上的菌苔洗脱，稀释到合适的浓度进行涂板(含Amp和Sm)。此时会出现蓝白斑，挑取蓝色的单菌落接种于4mL的LB肉汤(不含NaCl，含10％蔗糖)中进行传代，180rpm，37℃过夜摇振培养。将菌液离心稀释，涂布于LB培养基上(含Nal)。用pGMB152引物进行PCR鉴定白色单菌落，如图4所示。鉴定正确的菌落持续传代，直至pGMB 152质粒脱干净，无蓝色单菌落出现，并通过rfbE-NYZ-F/R进行验证，如图5验证正确所示的菌落即为所述的S06004ΔrfbE。
实施例2鸡白痢沙门菌ΔS06004(rfbE)的安全型试验
安全性试验：3日龄海兰白雏鸡的致死率试验
将实施例1制备的S06004ΔrfbE疫苗株与野生株S06004的毒力比较。
细菌的培养：细菌在LB平板上37℃静置培养24h，挑取1个饱满单菌落在LB平板上全板划线，37℃静置培养24h，用灭菌PBS将LB平板上的细菌刮下，同时调整细菌浓度，分别以不同的剂量肌肉注射3日龄雏鸡。S06004野生株和S06004ΔrfbE的注射剂量为1.0×105CFU、1.0×106CFU、1.0×107CFU、1.0×108CFU、1.0×109CFU、1.0×1010CFU，10羽/组，同时设立注射PBS的空白对照组。连续观察2周并统计死亡情况，统计死亡率。实验结果表明，ΔS06004(rfbE)疫苗株的毒力显著降低(表5)。
表5：野生株S06004和疫苗株对3日龄海兰白品系雏鸡的致死率
Figure BDA0002302858320000101
实施例3鸡白痢沙门菌S06004ΔrfbE在宿主体内的定殖试验
将S06004ΔrfbE以肌肉注射方式感染3日龄雏鸡，肌注剂量为1.0×107CFU/羽，设立100μL PBS的空白对照组。
分别在感染后3d，7d，10d，14d，21d剖杀试验鸡，3羽/组，无菌取其部分脾脏、肝脏，细菌计数。鸡肝脏中细菌数变化见图6，鸡脾脏中细菌数变化见图7。
实施例4鸡白痢沙门菌S06004ΔrfbE的免疫保护试验
免疫原性试验：IgG抗体检测
分别在感染后1d，3d，7d，10d，14d，21d，收集减毒株S06004ΔrfbE、野生组和PBS对照组的血清，3羽/组，进行间接ELISA检测IgG抗体。具体方法参见文献：徐步，高明燕，龚建森，吕晓娟，单艳菊，刘学贤，采用全菌抗原干燥包被法ELISA检测禽霍乱血清抗体的研究[J].中国家禽,2009,31(5):31-33。
结果如图8显示：免疫后第一周即可刺激机体产生IgG抗体，并持续升高，在第三周达到高峰。
保护效力试验：
在感染后14d攻毒，攻毒途径为肌肉注射，攻毒剂量为2.0×109CFU/羽，10羽/组，同时需设立相对应的未免疫攻毒组和健康对照组，观察2周统计鸡只死亡数量，结果见表6。
表6：鸡白痢沙门菌疫苗株的免疫保护效力
Figure BDA0002302858320000111
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种鸡白痢沙门菌单基因无痕敲除减毒株及其制备方法和应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1017
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaagcttt taattaccgg tggatgtggc tttcttggga gtaatcttgc ctcctttgct 60
ttaagtcaag ggattgattt aattgtattc gataatctat cacgtaaagg tgcaacagat 120
aatttacatt ggttatcctc cttaggaaac tttgagtttg tacatggtga tattcgcaac 180
aaaaatgatg ttacaagatt aataactaag tatatgcctg atagctgttt tcatcttgca 240
ggtcaagtgg caatgactac atctattgac aatccttgta tggattttga aattaatgta 300
ggtggaactt taaatttact tgaggcagta cggcagtata attcaaattg taatataatt 360
tattcatcaa caaataaagt atacggcgat cttgagcaat ataaatacaa tgaaacagaa 420
actagatata cttgtataga taagcctaat ggatatgatg agagcacaca attagatttc 480
cactcaccat atggttgttc aaaaggtgct gcagatcaat acatgcttga ttatgcaagg 540
atttttggtt tgaatacagt ggtgttcagg cattcatcaa tgtatggtgg gagacagttt 600
gctacttatg atcaaggctg ggtaggttgg ttttgtcaaa aagcggttga aattaaaaat 660
ggtattaaca aacccttcac tatttctggt aatggtaagc aagttaggga tgttttgcat 720
gctgaagata tgatttcgtt atatttcact gccttggcaa atgtatcaaa aattaggggg 780
aacgctttta atattggtgg taccattgtc aacagcctat cattacttga attattcaaa 840
ttgcttgaag attattgcaa cattgatatg aggttcacta atttaccagt aagggaaagt 900
gatcagcgtg tttttgttgc agatattaaa aaaatcacta atgcaattga ctggagcccg 960
aaagtctcgg caaaagatgg tgtccagaaa atgtatgatt ggactagttc tatatga 1017
<210> 2
<211> 905
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
taatcttgcc tcctttgctt taagtcaagg gattgattta attgtattcg ataatctatc 60
acgtaaaggt gcaacagata atttacattg gttatcctcc ttaggaaact ttgagtttgt 120
acatggtgat attcgcaaca aaaatgatgt tacaagatta ataactaagt atatgcctga 180
tagctgtttt catcttgcag gtcaagtggc aatgactaca tctattgaca atccttgtat 240
ggattttgaa attaatgtag gtggaacttt aaatttactt gaggcagtac ggcagtataa 300
ttcaaattgt aatataattt attcatcaac aaataaagta tacggcgatc ttgagcaata 360
taaatacaat gaaacagaaa ctagatatac ttgtatagat aagcctaatg gatatgatga 420
gagcacacaa ttagatttcc actcaccata tggttgttca aaaggtgctg cagatcaata 480
catgcttgat tatgcaagga tttttggttt gaatacagtg gtgttcaggc attcatcaat 540
gtatggtggg agacagtttg ctacttatga tcaaggctgg gtaggttggt tttgtcaaaa 600
agcggttgaa attaaaaatg gtattaacaa acccttcact atttctggta atggtaagca 660
agttagggat gttttgcatg ctgaagatat gatttcgtta tatttcactg ccttggcaaa 720
tgtatcaaaa attaggggga acgcttttaa tattggtggt accattgtca acagcctatc 780
attacttgaa ttattcaaat tgcttgaaga ttattgcaac attgatatga ggttcactaa 840
tttaccagta agggaaagtg atcagcgtgt ttttgttgca gatattaaaa aaatcactaa 900
tgcaa 905
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccccccctgc aggtcgactt ccaccctaac agttccgc 38
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tggatgtggc tttcttggga gttgactgga gcccgaaagt c 41
<210> 5
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gactttcggg ctccagtcaa ctcccaagaa agccacatcc a 41
<210> 6
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cttatcgata ccgtcgacaa tgggagcgtt tgggttcc 38
<210> 7
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gactttcggg ctccagtcaa 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tcttgcaggt caagtggcaa 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cgtggaggcc atcaaaccac 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cgcgaaataa acgaccggga 20

Claims (10)

1.一种鸡白痢沙门菌单基因无痕敲除减毒株，其特征在于，所述减毒株为rfbE基因不表达的鸡白痢沙门菌，无任何外源碱基残留。
2.根据权利要求1所述的鸡白痢沙门菌单基因无痕敲除减毒株，其特征在于，所述减毒株为采用自杀质粒同源重组的方法将rfbE基因无痕敲除的鸡白痢沙门菌。
3.据权利要求2所述的鸡白痢沙门菌单基因无痕敲除减毒株，其特征在于，所述rfbE基因序列如SEQ ID NO：2所示。
4.一种鸡白痢沙门菌单基因无痕敲除减毒株构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将野生型鸡白痢沙门菌中的rfbE基因无痕敲除。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述基因敲除方法为采用同源重组的无痕敲除方法。
6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
野生型鸡白痢沙门菌的rfbE基因上下游同源片段扩增与纯化；
将pGMB 152质粒与野生型鸡白痢沙门菌的rfbE基因上下游同源片段连接；
将rfbE基因重组片段电转入χ7213感受态中并筛选阳性重组菌；
将筛选得到的阳性重组菌与野生型鸡白痢沙门菌接合转移，并筛选阳性重组菌，得到鸡白痢沙门菌单基因无痕敲除减毒株。
7.权利要求1～3任一权利要求所述鸡白痢沙门菌单基因无痕敲除减毒株在制备沙门菌活疫苗中的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述沙门菌为鸡白痢沙门菌。
9.权利要求1～3任一权利要求所述鸡白痢沙门菌单基因无痕敲除减毒株在制备沙门菌感染治疗药物中的用途。
10.一种鸡白痢沙门菌活疫苗，其特征在于，所述疫苗含有如权利要求1～3任一权利要求所述的鸡白痢沙门菌单基因无痕敲除减毒株。
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