CN102268480A - 肠出血性大肠杆菌的主要血清型o157核酸筛查方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于环介导等温扩增技术的肠出血性大肠杆菌的主要血清型O157核酸筛查方法。利用环介导等温扩增(LAMP)技术来进行，通过使用特异性引物，利用LAMP技术平台扩增靶基因的特定区域，在阳性和阴性对照和内对照检测体系的辅助下，从分子水平对肠出血性大肠杆菌的主要血清型O157进行核酸筛查。本发明的方法具有简便、经济、快速、灵敏和特异的特点，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于疫病检验领域，具体涉及一种基于环介导等温扩增技术的肠出血性大肠杆菌的主要血清型O157核酸筛查方法。主要应用于肠出血性大肠杆菌主要血清型O157的核酸检测。
背景技术
肠出血性大肠杆菌(EHEC)是大肠杆菌的一个亚型，EHEC分为157、26、111等血清型，主要致病菌株为O157:H7，可引起感染性腹泻，因能引起人类的出血性肠炎而得名。2011年5月，德国爆发肠出血性大肠杆菌病。据罗伯特·科赫研究所6月28日公布的最新疫情通报，德国一个多月来肠出血性大肠杆菌感染病例累计达3901例，截至27日，死亡患者已达47人。报告还指出，本次德国疫情与以往产志贺毒素大肠杆菌造成的疫情不同，其特点为：一、感染病例中溶血性尿毒综合征重症病例所占比例达25％，远高于以往疫情；二、溶血性尿毒综合征病例中成人患者约占89％，且多数是女性。而以往产志贺毒素大肠杆菌感染者多数是儿童，且没有明显性别差异；三、以往疫情致病菌大多数是血清型O157型大肠杆菌，这次则是O104型；四、本次感染的潜伏期平均为8天，以往是3到4天。
自1982年美国首次发现因大肠杆菌O157:H7致病菌引起的食物中毒以来，肠出血性大肠杆菌O157:H7疫情开始逐渐扩散和蔓延，相继在英国、加拿大、日本、澳大利亚、南非等多个国家引起发病。1989年美国密苏里州240余人因饮用水感染，死亡4人，1995年美国西海滨因“汉堡包”造成700余人发病，4人死亡。1992年南非由于饮水和粮食不卫生造成上千人发病。日本，于1984年首次出现该病感染，1990～1995年共发生8起由该菌引起的中毒事件，1996年5～8月间，日本包括冈山、广岛、名古屋、神户、东京等在内的30多个都、府、县的小学、保育学校及幼儿园中多次发生集体食物中毒，发病人数达到9000人以上，以致上百所小学停课、幼儿园关门。我国在1987年就发现由此菌引起的散在感染，近年来已陆续有十多个省份在食品、家禽、家畜、昆虫和腹泻病患者中检出该致病菌。美国，于2006年9月中旬爆发“毒菠菜”事件，10月26，洛杉矶电，美国加利福尼亚州卫生官员26日说，调查表明，“毒菠菜”污染事件可能是因为野猪将大肠杆菌带到了菠菜田里。加州卫生服务部的调查人员于当天晚间召开新闻发布会说，自9月中旬以来，已有204人因食用加州东部萨利纳斯谷地生产的“毒菠菜”而患病，其中3人死亡。迄今美国有26个州发现食用“毒菠菜”的患者，加拿大也有一个省被殃及。
大肠杆菌通常存在于动物的肠内，并通过粪便物传播。未煮过的农产品、未消毒的原料奶、未经高温灭菌的果汁以及被污染的水和肉类中，都容易寄生这种细菌，但并非每种大肠杆菌都会致病。O157:H7感染包括无症状感染，轻度腹泻，出血性结肠炎及其并发症。感染O157:H7后潜伏期一般为3～4天，长者达10天，临床症状轻重不一，轻者无症状或仅有轻度腹泻。及上呼吸道症状，大多在5～10天内痊愈，典型病例表现为突然发生的剧烈腹痛和非血性腹泻，数天后出现血性腹泻，无粪质，不发热或仅有轻度发热，血白细胞计数增多，感染7天后，可发生严重的溶血性尿素综合症(HUS)，发生率约3％～10％，暴发流行时比例稍低，HUS表现为在腹痛、腹泻症状好转后突然出现溶血性贫血症状(如酱油尿，进行性贫血，黄疸等)、肾功能衰竭症状(水肿、少尿或无尿，尿毒症状，高血钾等)和出血症状(便血、呕血、硬脑膜下出血或视网膜出血，皮肤伤亡斑少见)。由于HUS存在广泛的微血管血栓形成，可导致多脏器多系统损害如脑、心血管系统、肝、胰等，30％病例可发生脑功能不全，(如各种意识障碍，活动障碍和肌张力异常)40％病例有轻而短暂的肝损害。心血管系统受损可表现为高血压，急性期绝大多数有轻度可逆性、易控制的高血压，与肾素活性相关性不大，循环内皮素可能起重要作用。并发HUS的病死率较高，早期达30％～50％，近年来由于诊断、治疗水平的提高死亡率大大下降。另一严重的并发症是栓塞性血小板减少性紫癜(TTP)，临床表现与HUS相似，但神经系统症状较多而肾脏损害较少，TTP死亡率亦可高达30％～50％.
目前肠出血性大肠杆菌的主要血清型O157的检测方法主要是微生物培养鉴定及多重PCR检测技术。(1)大肠杆菌培养，结果可信度高，并能做细菌药敏试验，但需时过长，应用受到限制，同时由于肠出血性大肠杆菌主要血清型O157菌株多为烈性人兽共患传染病菌，对实验室安全要求较高，不利于肠出血性大肠杆菌主要血清型O157的普遍筛选。(2)聚合酶链反应(PCR)，特异性较差，优点是敏感度可达98％～100％，但是其需要PCR扩增仪、凝胶电泳等相关昂贵设备，不利于现场快速测定。
21世纪初，Notomi T等开发了一种新颖的恒温核酸扩增理论，即所谓的环介导等温扩增法(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)，其特点是针对靶基因的8个区域设计6种特异引物，利用一种链置换Bst DNA聚合酶在恒温条件(65℃左右)保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应，短时间扩增效率可达到109-1010个拷贝。直接靠扩增副产物焦磷酸镁沉淀的浊度或显色反应进行判断是否发生反应。该方法不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程，LAMP法具有高特异性、高效性、快速、廉价(不需要特定的贵重检测设备，只需要简单结构的恒温箱)、易检测(直接进行目测判断)等特点。
发明内容
本发明提供一种基于环介导等温扩增技术的肠出血性大肠杆菌主要血清型O157核酸筛查方法，LAMP检测技术的检测高于常规检测法100-200倍，有力地解决了传统的微生物培养鉴定方法检出率较低的问题；另外由于经典聚合酶链反应(PCR)扩增技术对仪器设备要求较高(如PCR扩增仪，琼脂凝胶电泳系统等)、技术较为复杂，不利于其在基层医疗防疫、检验检疫机构的普遍应用，而LAMP检测技术只需要简单机构的恒温箱，检测时间短(0.5-1.0小时)、特异性高(针对靶基因的8个区域设计6种特异引物)等特点，可以使用基因扩增技术在现场监测中广泛使用。
本发明是这样实现的：
一种肠出血性大肠杆菌主要血清型O157核酸筛查方法，通过使用特异性引物，利用环介导等温扩增技术体系扩增靶基因的特定区域，在设置阳性和阴性对照的情况下，从分子水平对肠出血性大肠杆菌的主要血清型O157进行核酸筛查；所述特异性引物为：
| 引物 | 类别 | 序列组成 |
| F3 | 前外引物 | 5’-CACACTTATTGGATGGTCTCA-3’ |
| B3 | 后外引物 | 5’-TAGGCTGGGGAAACTAGG-3’ |
| FIP | 前内引物 | 5’-GGCCTTGTTTCGATGAGTTTATCTGTTTTCTAACTAGGACCGCAGAGG-3’ |
| BIP | 后内引物 | 5’-CTGTCCACACGATGCCAATGTTTTTAATTAATTCCACGCCAACC-3’ |
| LoopF | 环状引物 | 5’-CAAGGTGATTCCTTAATTCCTCTCT-3’ |
| LoopB | 环状引物 | 5’-GCACCCTATAGCTGAGGATCT-3’ |
。
所述的肠出血性大肠杆菌的主要血清型O157核酸筛查方法，利用环介导等温扩增技术扩增肠出血性大肠杆菌的主要血清型O157的特定靶核酸序列区域。
所述的肠出血性大肠杆菌的主要血清型O157核酸筛查方法，所述的阴阳性对照检测体系中，阳性对照质控菌株购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，ATTCC编号700728，阳性对照质控品为利用天根基因提取试剂盒提取的大肠杆菌O157的基因，阴性对照质控品为不相同于扩增细菌靶基因的DNA，并使用电泳分析、沉淀分析或SYBRGreen I荧光染料显色法同时检测阴阳对照和肠出血性大肠杆菌的主要血清型O157靶基因扩增产物。
所述的肠出血性大肠杆菌的主要血清型O157核酸筛查方法，针对肠出血性大肠杆菌的主要血清型O157中的genbank登录号为S83460的rfbE基因设计环介导等温扩增特异性引物。
所述的肠出血性大肠杆菌的主要血清型O157核酸筛查方法，所用的环介导等温扩增反应体系是：2x U-LAMP Mix 10ul，其组成成分：40mM Tris-HCl、pH8.8、20mM KCl、20mM(NH4)2SO4、10mM MgSO4、0.2％Triton X-100、2.4mM dNTP、1.6M甜菜碱；所述引物混合物2ul，其终浓度组成为：F3为0.2umol/L，B3为0.2umol/L，FIP为1.6umol/L，BIP为1.6umol/L，LF为0.8umol/L，LB为0.8umol/L；模板DNA 1ul、BSt聚合酶1.5ul、补超纯水至20ul；反应程序：63℃30分钟→80℃3分钟→10℃保存。
本发明具有严格的鉴别筛查体系，以保证检测结果的准确性。该鉴别筛查诊断系统由阳性和阴性质控品，内对照质控品以及相关扩增和检测体系组成。
本发明中鉴别筛查诊断系统的阳性和阴性质控品是每批实验检测结果是否有效的重要标志。对于每批实验，必须引入一个阴性质控品的检测，以保证反应体系不会出现假阳性结果；对于每批实验，必须引入一个肠出血性大肠杆菌主要血清型O157阳性质控品的检测，以保证反应体系不会出现假阴性反应。针对肠出血性大肠杆菌主要血清型O157的阳性质控品是利用天根基因提取试剂盒提取的大肠杆菌O157的基因。
本发明的有益效果是：该方法具有扩增效率高、检测设备要求简单、对操作人员技术要求低等特点，适合基层卫生机构、食品加工企业、检验检疫机构现场检验大规模使用。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
实施例1
核酸提取：首先将大肠杆菌O157菌液接种于营养琼脂斜面上，再将生长出来的细菌接种于乳糖肉汤(LB)，37℃培养18h。取培养后的大肠杆菌O1571mL于12000r/min离心5min；沉淀用0.8mL 1xTE(100mmol/LTris-Cl，10mmol/L EDTA，pH8.0)洗涤，12000r/min离心5min，弃上清，沉淀加入100ul无菌水，混匀后，于100℃沸水浴10min，立即冰浴5min，12000r/min离心10min，上清液即为DNA模板。
所有引物按照LAMP引物设计原则，利用NCBI数据库寻找肠出血性大肠杆菌主要血清型O157的LAMP基因序列。利用软件选取其特异性序列，利用Primer Explorer IV软件进行进一步分析，设计一套6种引物，引物由上海英骏生物技术公司合成。肠出血性大肠杆菌主要血清型O157的核酸特异性引物序列、LAMP反应体系及反应程序如下：
表1针对编码O157:H7脂多糖的rfbE基因
(GeneBank S83460)的LAMP反应引物序列组成
| 引物 | 类别 | 序列组成 |
| F3(SEQ ID NO：1) | 前外引物 | 5’-CACACTTATTGGATGGTCTCA-3’ |
| B3(SEQ ID NO：2) | 后外引物 | 5’-TAGGCTGGGGAAACTAGG-3’ |
| FIP(SEQ ID NO：3) | 前内引物 | 5’-GGCCTTGTTTCGATGAGTTTATCTGTTTTCTAACTAGGACCGCAGAGG-3’ |
| BIP(SEQ ID NO：4) | 后内引物 | 5’-CTGTCCACACGATGCCAATGTTTTTAATTAATTCCACGCCAACC-3’ |
| LoopF(SEQ ID NO：5) | 环状引物 | 5’-CAAGGTGATTCCTTAATTCCTCTCT-3’ |
| LoopB(SEQ ID NO：6) | 环状引物 | 5’-GCACCCTATAGCTGAGGATCT-3’ |
引物情况说明：
本发明方法针对大肠杆菌O157，基于rfbE基因设计引物，前外引物F3(CACACTTATTGGATGGTCTCA)从第945位至965位，后外引物B3(TAGGCTGGGGAAACTAGG)从1134位至1151位，整个6种引物序列设计的范围即从第945位-第1151位。
反应体系：2x U-LAMP Mix 10ul，其组成成分：40mM Tris-HCl、pH8.8、20mM KCl、20mM(NH4)2SO4、10mM MgSO4、0.2％Triton X-100、2.4mM dNTP、1.6M甜菜碱；引物混合物2ul，其终浓度组成为：其终浓度组成为：F3为0.2umol/L，B3为0.2umol/L，FIP为1.6umol/L，BIP为1.6umol/L，LF为0.8umol/L，LB为0.8umol/L；模板DNA1ul、BSt聚合酶1.5ul、补超纯水至20ul。
特定反应程序：63℃30分钟→80℃3分钟→10℃保存。
检测：LAMP扩增产物取5ul混入1ul 6xloading buffer，在2％的琼脂糖凝胶上进行电泳分析，10000r/min离心数秒钟进行沉淀分析，同时也可在LAMP扩增的每个管中加入1.0ul SYBR Green I荧光染料混匀，观察产物的颜色变化。
LAMP反应：准备上述反应体系，将反应体系混匀，分装到0.2ml的3个PCR反应管中，编号分别为管1，管2，管3，每管19ul，其中每管含有2x U-LAMP Mix 10ul，RNase-free水5.5ul，引物2.0ul，BSt聚合酶1.5ul。然后在管1中加入核酸提取步骤抽提的模板1ul，管2加入阳性对照品1ul，管3加入阴性对照品1ul(阳性对照质控菌株购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，ATTCC编号700728，阳性对照质控品为利用天根基因提取试剂盒提取的大肠杆菌O157的基因)，分别作为阳性对照、阴性对照，离心数秒混合均匀，放入恒温水浴箱。设定反应条件：63℃30min，80℃3min终止反应。将反应产物离心数秒，进行沉淀分析，后加入1ul 20xSYBR Green I荧光染料显色观察。
结果判定：本发明扩增产物的检测采用浊度法。在Mg2+作用下，LAMP扩增产生的长链核酸分子能相互交联成絮状沉淀，且沉淀的量随扩增产物的增加而增加。因而实验结果的判定可采用如下方法：
定性观察：反应结束后将产物离心数秒进行沉淀分析，肉眼观察结果，可见管1，管2底部有白色沉淀产生，表示发生了反应；管3产物样品澄清，表示反应没有进行；然后分别向管1，管2，管3，加入1ul 20x SYBR Green I荧光染料，混匀后静置3-5分钟，将反应管置于紫外透射仪中观察，结果管1，管2显示为绿色，说明发生了反应；管3保持橙色不变，说明反应并未进行。反应结果说明该LAMP方法能够检测到肠出血性大肠杆菌O157的基因。
实施例2
关于LAMP方法与PCR方法的敏感性对比一：
大肠杆菌O157基因组DNA的提取：首先将大肠杆菌O157菌液接种于营养琼脂斜面上，再将生长出来的细菌接种于乳糖肉汤(LB)，37℃培养18h。按照天根生化科技(北京)有限公司的细菌基因组提取试剂盒说明，提取大肠杆菌O157基因组DNA。
1.运用核酸蛋白检测仪，检测出所提取的大肠杆菌O157基因组DNA浓度为2.1032ug/ml(即2.1032ng/ul)。
通过梯度稀释的方法得到不同浓度的大肠杆菌O157基因组DNA(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-72.1032ng/ul)，作为下一步骤的反应模板。
LAMP反应和PCR反应
LAMP反应体系组成(引物由上海英骏生物技术公司合成)：
2x U-LAMP Mix 10ul，其组成成分：40mM Tris-HCl、pH8.8、20mM KCl、20mM(NH4)2SO4、10mM MgSO4、0.2％Triton X-100、2.4mM dNTP、1.6M甜菜碱；引物混合物2ul，其终浓度组成为：F3为0.2umol/L，B3为0.2umol/L，FIP为1.6umol/L，BIP为1.6umol/L，LF为0.8umol/L，LB为0.8umol/L；模板DNA 1ul、BSt聚合酶1.5ul、补超纯水至20ul，混匀。
反应混合液在63℃反应30min，然后80℃3min以终止反应，各取5ul混入1ul6xloading buffer进行凝胶电泳，观察结果。
PCR反应体系
2x PCR Mix 10ul；引物2ul，其终浓度组成为：上游引物(F3)为0.5umol/L，下游引物(B3)为0.5umol/L；模板DNA 2ul，补超纯水至20ul，混匀。扩增反应程序：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min。后取8ul进行凝胶电泳，观察结果。
同时，两个反应体系均引入了阳性质控和阴性质控，保证实验的准确性，结果LAMP检测的极限为2.1032fg/反应，PCR检测的极限为4.2064x102fg/反应。
关于LAMP方法与PCR方法的敏感性对比二：
1.依据GB 4789.2-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》计算出标准管大肠杆菌O157菌的浓度为2.20x108cfu/ml。
2.通过梯度稀释的方法得到不同浓度的大肠杆菌O157菌(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-72.20x108cfu/ml)
3.大肠杆菌O157基因组DNA的提取，按照天根生化科技(北京)有限公司的细菌基因组提取试剂盒说明，提取经稀释后每一个梯度的大肠杆菌O157基因组DNA，作为下一步骤的反应模板。
4.LAMP反应和PCR反应
LAMP反应体系组成(引物由上海英骏生物技术公司合成)：
2x U-LAMP Mix 10ul，其组成成分：40mM Tris-HCl、pH8.8、20mM KCl、20mM(NH4)2SO4、10mM MgSO4、0.2％Triton X-100、2.4mM dNTP、1.6M甜菜碱；引物混合物2ul，其终浓度组成为：F3为0.2umol/L，B3为0.2umol/L，FIP为1.6umol/L，BIP为1.6umol/L，LF为0.8umol/L，LB为0.8umol/L；模板DNA 1ul、BSt聚合酶1.5ul、补超纯水至20ul，混匀。
反应混合液在63℃反应30min，然后80℃3min以终止反应，各取5ul混入1ul6xloading buffer进行凝胶电泳，观察结果。
PCR反应体系
2x PCR Mix 10ul；引物2ul，其终浓度组成为：上游引物(F3)为0.5umol/L，下游引物(B3)为0.5umol/L；模板DNA 2ul，补超纯水至20ul，混匀。扩增反应程序：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min。后取8ul进行凝胶电泳，观察结果
同时，两个反应体系均引入了阳性质控和阴性质控，保证实验的准确性，结果LAMP检测的极限为2.20x102cfu/ml，为PCR检测的极限的200倍。
本发明的LAMP检测技术的灵敏性高于常规PCR(所用上下游引物为LAMP法的前后外引物，即F3，B3)检测法200倍，能够检测的目的DNA的极限达到2.1032fg/反应，同时通过细菌计数法测算，并运用试剂盒抽提大肠杆菌O157DNA，计算出该方法能够检测的大肠杆菌O157菌的极限为2.2x102cfu/ml。
实施例3
关于特异性：
1.基因组DNA的提取：
按照天根生化科技(北京)有限公司的细菌基因组提取试剂盒说明，提取大肠杆菌O157，鸭疫里氏杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O46、沙门氏菌基因组DNA。
2.LAMP反应体系组成(引物由上海英骏生物技术公司合成)：
2x U-LAMP Mix 10ul，其组成成分：40mM Tris-HCl、pH8.8、20mM KCl、20mM(NH4)2SO4、10mM MgSO4、0.2％Triton X-100、2.4mM dNTP、1.6M甜菜碱；引物混合物2ul，其终浓度组成为：F3为0.2umol/L，B3为0.2umol/L，FIP为1.6umol/L，BIP为1.6umol/L，LF为0.8umol/L，LB为0.8umol/L；模板DNA 1ul、BSt聚合酶1.5ul、补超纯水至20ul，混匀。
反应混合液在63℃反应30min，然后80℃3min以终止反应，各取5ul混入1ul6xloading buffer进行凝胶电泳。
同时，反应体系引入了阳性质控和阴性质控，确保实验的准确性，结果只有大肠杆菌O157和阳性质控出现梯形条带，其余样品均显示为阴性，体现了良好的特异性。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (5)
1.一种肠出血性大肠杆菌主要血清型O157核酸筛查方法，其特征在于，通过使用特异性引物，利用环介导等温扩增技术体系扩增靶基因的特定区域，在设置阳性和阴性对照的情况下，从分子水平对肠出血性大肠杆菌的主要血清型O157进行核酸筛查；所述特异性引物为：
2.根据权利要求1所述的肠出血性大肠杆菌的主要血清型O157核酸筛查方法，其特征在于，利用环介导等温扩增技术扩增肠出血性大肠杆菌的主要血清型O157的特定靶核酸序列区域。
3.根据权利要求1所述肠出血性大肠杆菌的主要血清型O157核酸筛查方法，其特征在于，所述的阴阳性对照检测体系中，阳性对照质控菌株购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，ATTCC编号700728，阳性对照质控品为利用天根基因提取试剂盒提取的大肠杆菌O157的基因，阴性对照质控品为不相同于扩增细菌靶基因的DNA，并使用电泳分析、沉淀分析或SYBR Green I荧光染料显色法同时检测阴阳对照和肠出血性大肠杆菌的主要血清型O157靶基因扩增产物。
4.根据权利要求1所述的肠出血性大肠杆菌的主要血清型O157核酸筛查方法，针对肠出血性大肠杆菌的主要血清型O157中的genbank登录号为S83460的rfbE基因设计环介导等温扩增特异性引物。
5.根据权利要求1所述肠出血性大肠杆菌的主要血清型O157核酸筛查方法，其特征在于，所用的环介导等温扩增反应体系是：2x U-LAMP Mix 10ul，其组成成分：40mM Tris-HCl、pH8.8、20mM KCl、20m M(NH4)2SO4、10mM MgSO4、0.2％Triton X-100、2.4mM dNTP、1.6M甜菜碱；所述引物混合物2ul，其终浓度组成为：F3为0.2umol/L，B3为0.2umol/L，FIP为1.6umol/L，BIP为1.6umol/L，LF为0.8umol/L，LB为0.8umol/L；模板DNA 1ul、BSt聚合酶1.5ul、补超纯水至20ul；反应程序：63℃30分钟→80℃3分钟→10℃保存。
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