CN107817228A - 对E.coli O157:H7免酶及免荧光标记的检测方法 - Google Patents

对E.coli O157:H7免酶及免荧光标记的检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107817228A
CN107817228A CN201710522391.7A CN201710522391A CN107817228A CN 107817228 A CN107817228 A CN 107817228A CN 201710522391 A CN201710522391 A CN 201710522391A CN 107817228 A CN107817228 A CN 107817228A
Authority
CN
China
Prior art keywords
aptamer
seq
coli
detection
ghp1
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201710522391.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107817228B (zh
Inventor
邹立扣
陈姝娟
付珍珍
余华
严玉宝
刘书亮
周康
敖晓琳
何利
杨勇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SICHUAN ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU OF PRC
Sichuan Agricultural University
Original Assignee
SICHUAN ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU OF PRC
Sichuan Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SICHUAN ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU OF PRC, Sichuan Agricultural University filed Critical SICHUAN ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU OF PRC
Priority to CN201710522391.7A priority Critical patent/CN107817228B/zh
Publication of CN107817228A publication Critical patent/CN107817228A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107817228B publication Critical patent/CN107817228B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

本发明提供了一种对E.coli O157:H7进行免酶及免荧光标记的检测方法，其包括如下步骤：将IS与适配子杂化，所述IS的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述适配子的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；将所得物置于缓冲液中，加入E.coli O157:H7，于37℃下反应30min；加入GHP1和GHP2，于37℃孵育100min；所述GHP1的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述GHP2的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；加入NMM，于37℃下孵育30min；对所得物进行荧光强度检测。

Description

对E.coli O157:H7免酶及免荧光标记的检测方法
技术领域
本发明属于细菌检测技术领域，具体涉及一种对Escherichia coli O157:H7进行免酶及免荧光标记的检测方法。
背景技术
Escherichia coli O157:H7是常见的致病菌，对其进行检测是本领域的重点研究课题之一。一些较为传统的检测方法虽然实现了对Escherichia coli O157:H7的精确检测，但这些方法通常耗时较长，短则2-3天，长则超过1个星期。
近些年来，PCR、qPCR、ELASA和LAMP等技术相继在细菌的检测领域得到的应用。虽然上述方法节省了检测时间，不过也存在着不少缺点，如操作复杂、设备昂贵和试剂不宜储存等，更为重要的是，这些技术的检测精度通常较低且难以进行专一性的检测而无法将不同的细菌区分开来。
另外，现有的检测技术中，大多还需要荧光标记、或者需进行修饰亦或者需要加入酶等，这些都增大了检测成本。
综上所述，本领域亟需一种对Escherichia coli O157:H7进行免酶及免荧光标记的检测方法，该方法需有高度的精确性和专一性。
发明内容
针对现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种对Escherichia coli O157:H7进行免酶及免荧光标记的检测方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将IS与适配子杂化，所述IS的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述适配子的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
(2)将步骤(1)所得物置于缓冲液中，加入Escherichia coli O157:H7，于37℃下反应30min；
(3)向步骤(2)所得物加入GHP1和GHP2，于37℃孵育100min；所述GHP1的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述GHP2的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
(4)向步骤(3)所得物加入NMM，于37℃下孵育30min；所述NMM为N-甲基中卟啉(N-methyl mesoporphyrin IX)；
(5)对步骤(4)所得物进行荧光强度检测；
优选的，步骤(1)所述杂化的条件为：于80～90℃，处理40-55min。。
所述IS和适配子在使用前于90℃下处理5分钟，之后缓慢冷却至室温。
作为本发明的一个优选方案，所述IS的浓度为3μM。
作为本发明的一个优选方案，所述适配子的浓度为3μM。
作为本发明的一个优选方案，所述GHP1的浓度为3μM。
作为本发明的一个优选方案，所述GHP2的浓度为3μM。
作为本发明的一个优选方案，所述NMM的浓度为15μM。
可选的，步骤(5)中，进行检测时，激发波长为399nm，发射波长为580nm。
作为本发明的一个优选方案，所述缓冲液的配方为：50mM Tris-HCl、5mM KCl、100mM NaCl、1mM MgCl2,pH 7.4。
作为本发明的一个优选方案，步骤(5)中，检测波长为609nm。
本发明先将IS与适配子进行杂化，在检测过程中，当不存在Es cherichia coliO157:H7时，检测体系中不会出现自由的IS，而GHP1和GHP2则保持相当稳定的发卡结构，NMM荧光染料无法与G-qu adruplex形成序列结合，从而导致所检测到的荧光信号很低；当加入Escherichia coli O157:H7后，适配子更倾向与Escherichia coli O157:H7形成细菌/适配子复合物，从而将IS释放出来，这是由于相对于IS而言，Escherichia coli O157:H7与本发明所述的适配子的亲和度更高。释放出来的IS将与GHP1杂化并将其发卡结构打开，并形成与GHP2置换链的立足点。在展开的GHP1和GHP2的杂化过程中，IS通过立足点链置换机制而被释放出。最为重要的是，释放出的IS将再次参与与GHP1的杂化反应过程并引发立足点链置换反应循环，从而在两端形成G-四重折叠结构。最后，G-四重折叠结构与荧光染料NMM结合并产生针对E.coli O157:H7的大量密集的荧光信号。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
1、本发明方法在检测E.coli O157:H7时无需荧光标记、无需对反应物或细菌进行修饰、无需酶也无需进行DNA的提取。
2、本发明在对E.coli O157:H7进行检测时，最低检出限可达60～70CFU/mL，检测的线性范围为102～107CFU/mL；
3、本发明对E.coli O157:H7活菌具有高度专一性，可排除其它大肠杆菌和E.coliO157:H7死菌的干扰。
附图说明
图1为在不同检测条件下的荧光强度光谱图，其中，a为检测体系中仅含有NMM，b为含有适配子/IS杂化物和NMM，c为检测体系中含有适配子/IS杂化物、E.coli O157:H7和NMM，d为检测体系中含有E.coli O157:H7和NMM、GHP1和GHP2，e为检测体系中含有适配子/IS杂化物、NMM、GHP1和GHP2，f为检测体系中含有适配子/IS杂化物、E.coli O157:H7、NMM、GHP1和GHP2；
图2为本发明检测E.coli O157:H7的结果图；
图3为针对不同细菌的检测结果图，其中，a为E.coli O157:H7，b为高温灭活的E.coli O157:H7，c为Enteroaggragtive E.coli，d为E nteroinvasive E.Coli，e为Enteropathogenic E.coli，f为S.aureus,g为S.typhimurium,，h为空白组；a的细菌浓度为105CFU/mL，其余组为106CFU/mL。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
(1)将IS与适配子杂化(杂化的条件为：于80～90℃，处理40-55min)，所述IS的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述适配子的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
(2)将步骤(1)所得物置于缓冲液中，加入Escherichia coli O157:H7，于37℃下反应30min；
(3)向步骤(2)所得物加入GHP1和GHP2，于37℃孵育100min；所述GHP1的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述GHP2的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
(4)向步骤(3)所得物加入NMM，于37℃下孵育30min；所述NMM为N-甲基中卟啉(N-methyl mesoporphyrin IX)；
(5)对步骤(4)所得物进行荧光强度检测。
所述IS和适配子在使用前于90℃下处理5分钟，之后缓慢冷却至室温。
所述IS的浓度为3μM。
所述适配子的浓度为3μM。
所述GHP1的浓度为3μM。
所述GHP2的浓度为3μM。
所述NMM的浓度为15μM。
在本实施例中，采用3001酶标仪(美国Themo Fisher公司)进行检测，激发波长为399nm，发射波长为580nm。激发波长和发射波长的宽度范围均为10nm，收集的发射光谱范围为580nm至650nm。检测Escherichia coli O157:H7的荧光强度的波长为609nm。
NMM储存液(5mM)利用DMSO进行配置并于-20℃下避光储存。
如图1所示，NMM组(a)、aptamer/IS与NMM组(b)几乎为直线，这表明NMM与IS和适配子不反应，所以不产生信号。当缺失本发明任一主要物质时，如图中c、d和e所示，荧光信号很弱；与c相比，d具有相对较强的荧光强度，这表明GHP1与GHP2反应生成了少量的G-四重折叠结构。同时，e中相对稍高的荧光强度表明适配子/IS杂化物与GHP1和GHP2反应更强以致产生更多的G-四重折叠结构。如图f所示，Escherichia coli O157:H7的加入释放了IS，随后形成了大量了G-四重折叠结构。
本发明在检测Escherichia coli O157:H7时，最低检出限为66C FU/mL，检测的线性范围为102～107CFU/mL(R2＝0.995)。相对于与现有技术而言，本发明具有更宽的检测范围。
如图3所示，本发明对于Escherichia coli O157:H7(105CFU/mL)的检测荧光强度显著的高于包括死Escherichia coli O157:H7在内的其它细菌(106CFU/mL)，更为重要的是在检测这些“其它细菌”时，所得荧光强度几乎是可以忽略的。因此，本发明对于Escherichia coli O157:H7具有高度的专一性，并能排除其它菌的干扰。
如表1所示，本发明在检测Escherichia coli O157:H7时，具有优秀的回收率。
表1
a同一天进行3次重复实验；
b连续6天分别进行实验。
SEQUENCE LISTING
序列表
<110> 四川农业大学
<120> 对E coli O157:H7 免酶及免荧光标记的检测方法
<130> 2017
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccgtcacacc tgcgtccgga aa 22
<210> 2
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tttccggacg tcaagacgat ttgtactaca tcccaggtgt gacgg 45
<210> 3
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gggtttttcc ggacgcaggt gtgacggtag cgtccggaaa ccgtcacacc tgcgggcggg 60
taggg 65
<210> 4
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gggttgcagg tgtgacggtt tccggacgct accgtcacac ctgcgtccgg aaagggcggg 60
taggg 65

Claims (10)

1.一种对Escherichia coli O157:H7进行无酶及无标签化的检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将IS与适配子杂化，所述IS的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述适配子的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
(2)将步骤(1)所得物置于缓冲液中，加入Escherichia coli O157:H7，于37℃下反应30min；
(3)向步骤(2)所得物加入GHP1和GHP2，于37℃孵育100min；所述GHP1的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述GHP2的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
(4)向步骤(3)所得物加入NMM，于37℃下孵育30min；所述NMM为N-甲基中卟啉(N-methyl mesoporphyrin IX)；
(5)对步骤(4)所得物进行荧光强度检测；
优选的，步骤(1)所述杂化的条件为：于80～90℃，处理40-55min。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述IS和适配子在使用前于90℃下处理5分钟，之后缓慢冷却至室温。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述IS的浓度为3μM。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述适配子的浓度为3μM。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述GHP1的浓度为3μM。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述GHP2的浓度为3μM。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述NMM的浓度为15μM。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，进行检测时，激发波长为399nm，发射波长为580nm。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缓冲液的配方为：50mM Tris-HCl、5mMKCl、100mM NaCl、1mM MgCl2,pH 7.4。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，检测波长为609nm。
CN201710522391.7A 2017-06-30 2017-06-30 对E.coli O157:H7免酶及免荧光标记的检测方法 Active CN107817228B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710522391.7A CN107817228B (zh) 2017-06-30 2017-06-30 对E.coli O157:H7免酶及免荧光标记的检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710522391.7A CN107817228B (zh) 2017-06-30 2017-06-30 对E.coli O157:H7免酶及免荧光标记的检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107817228A true CN107817228A (zh) 2018-03-20
CN107817228B CN107817228B (zh) 2022-06-14

Family

ID=61601528

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710522391.7A Active CN107817228B (zh) 2017-06-30 2017-06-30 对E.coli O157:H7免酶及免荧光标记的检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107817228B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110100829A (zh) * 2019-04-30 2019-08-09 华中农业大学 N-甲基卟啉二丙酸ix在抗植物病毒中的应用

Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090214425A1 (en) * 2008-02-21 2009-08-27 New York University Tumor therapy with replication competent sindbis viral vectors
WO2009104075A2 (en) * 2008-02-21 2009-08-27 Otc Biotechnologies, Llc Methods of producing homogeneous plastic-adherent aptamer-magnetic bead-fluorophore and other sandwich assays
CN101935703A (zh) * 2010-08-27 2011-01-05 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 肠出血性大肠杆菌o157:h7多色量子点快速检测试剂盒及其检测方法
CN102268480A (zh) * 2011-07-20 2011-12-07 四川农业大学 肠出血性大肠杆菌的主要血清型o157核酸筛查方法
CN102952783A (zh) * 2011-08-18 2013-03-06 广西医科大学 新城疫病毒ndv py毒株及其应用
WO2013081202A1 (ko) * 2011-11-29 2013-06-06 삼성테크윈 주식회사 Ｅ. ｃｏｌｉ Ｏ157:Ｈ7 종 검출용 올리고뉴클레오티드 및 그의 용도
CN103215272A (zh) * 2013-04-25 2013-07-24 广州弗赛生物科技有限公司 大肠杆菌o157:h7核酸适体及其应用方法
CN103866034A (zh) * 2014-04-02 2014-06-18 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 一种胃液中幽门螺杆菌多重实时荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法
US20140248710A1 (en) * 2005-06-06 2014-09-04 Mediomics Llc Three-component biosensors for detecting macromolecules and other analytes
US20140303012A1 (en) * 2011-08-30 2014-10-09 The Board Of Trustees Of Michigan State University Extraction and detection of pathogens using carbohydrate-functionalized biosensors
US20140349873A1 (en) * 2006-05-12 2014-11-27 John Bruno Methods of Producing Competitive Aptamer FRET Reagents and Assays
CN104815324A (zh) * 2007-04-04 2015-08-05 传染性疾病研究院 包含结核分枝杆菌多肽及其融合的免疫原性组合物

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140248710A1 (en) * 2005-06-06 2014-09-04 Mediomics Llc Three-component biosensors for detecting macromolecules and other analytes
US20140349873A1 (en) * 2006-05-12 2014-11-27 John Bruno Methods of Producing Competitive Aptamer FRET Reagents and Assays
CN104815324A (zh) * 2007-04-04 2015-08-05 传染性疾病研究院 包含结核分枝杆菌多肽及其融合的免疫原性组合物
US20090214425A1 (en) * 2008-02-21 2009-08-27 New York University Tumor therapy with replication competent sindbis viral vectors
WO2009104075A2 (en) * 2008-02-21 2009-08-27 Otc Biotechnologies, Llc Methods of producing homogeneous plastic-adherent aptamer-magnetic bead-fluorophore and other sandwich assays
CN101935703A (zh) * 2010-08-27 2011-01-05 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 肠出血性大肠杆菌o157:h7多色量子点快速检测试剂盒及其检测方法
CN102268480A (zh) * 2011-07-20 2011-12-07 四川农业大学 肠出血性大肠杆菌的主要血清型o157核酸筛查方法
CN102952783A (zh) * 2011-08-18 2013-03-06 广西医科大学 新城疫病毒ndv py毒株及其应用
US20140303012A1 (en) * 2011-08-30 2014-10-09 The Board Of Trustees Of Michigan State University Extraction and detection of pathogens using carbohydrate-functionalized biosensors
WO2013081202A1 (ko) * 2011-11-29 2013-06-06 삼성테크윈 주식회사 Ｅ. ｃｏｌｉ Ｏ157:Ｈ7 종 검출용 올리고뉴클레오티드 및 그의 용도
CN103215272A (zh) * 2013-04-25 2013-07-24 广州弗赛生物科技有限公司 大肠杆菌o157:h7核酸适体及其应用方法
CN103866034A (zh) * 2014-04-02 2014-06-18 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 一种胃液中幽门螺杆菌多重实时荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FU, Z 等: ""Rapid detection of Escherichia coli O157 : H7 by immunomagnetic separation and real-time PCR"", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF FOOD MICROBIOLOGY》 *
WENHE WU 等: ""An Aptamer-Based Biosensor for Colorimetric Detection of Escherichia coli O157:H7"", 《PLOS ONE》 *
王明华 等: ""大肠杆菌O157∶H7紧密黏附素空间结构建模研究"", 《计算机与应用化学》 *
许蕊等: "基于全菌消减SELEX技术的体外筛选大肠埃希菌O157:H7适配体研究", 《环境与健康杂志》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110100829A (zh) * 2019-04-30 2019-08-09 华中农业大学 N-甲基卟啉二丙酸ix在抗植物病毒中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN107817228B (zh) 2022-06-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kubota CARD-FISH for environmental microorganisms: technical advancement and future applications
Ben-Dov et al. Quantification of sulfate-reducing bacteria in industrial wastewater, by real-time polymerase chain reaction (PCR) using dsrA and apsA genes
Zheng et al. DNA-templated fluorescent silver nanoclusters for sensitive detection of pathogenic bacteria based on MNP-DNAzyme-AChE complex
CN111321234B (zh) 一种基于CRISPR-Cas13a系统检测微生物的方法及应用
CN107190063B (zh) 一种等温快速扩增检测食品中致病菌的方法
FR2627508A1 (fr) Procede pour l&#39;integration d&#39;un gene choisi sur le chromosome d&#39;une bacterie et bacterie obtenue par ledit procede
CN102382879B (zh) 荧光假单胞菌lamp检测试剂及试剂盒
CN101671746A (zh) 一种检测a群轮状病毒的试剂盒和寡核苷酸序列
Zeng et al. Regulatory mechanisms of exoribonuclease PNPase and regulatory small RNA on T3SS of Dickeya dadantii
CN106191214A (zh) 一种多色荧光熔解曲线pcr检测方法
Scuderi et al. Development of a simplified NASBA protocol for detecting viable cells of the citrus pathogen Xanthomonas citri subsp. citri under different treatments
CN114921576A (zh) 一种检测牛结核分枝杆菌的试剂、试剂盒及检测方法
CN107817228A (zh) 对E.coli O157:H7免酶及免荧光标记的检测方法
CN108424973B (zh) 一种用于rna恒温扩增检测克罗诺杆菌的引物探针、试剂盒及检测方法
CN102719542A (zh) 霍乱弧菌(vc)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒
Owttrim RNA helicases in cyanobacteria: biochemical and molecular approaches
CN109207615A (zh) 一种免标记荧光检测金黄色葡萄球菌mecA基因的方法及检测试剂盒
Kim et al. Specific detection of Cronobacter sakazakii in powdered infant formula using ssDNA aptamer
CN108004334B (zh) 检测饮用水中四种致病菌的四重荧光pcr引物组、探针组、试剂盒及方法
CN113528563B (zh) 一种利用爆炸物分子降解基因合成可视化生物感应器的制备方法及其应用
CN110512010B (zh) 一种检测大肠杆菌rRNA转录速率的试剂盒及方法
CN103571942A (zh) 一种副溶血弧菌vp核酸恒温扩增方法
CN104388578B (zh) 利用交叉引物和双探针恒温扩增检测nos终止子的方法
CA2992809A1 (en) Diagnostic kits
CN112280906A (zh) 一种用于南芥菜花叶病毒及菜豆荚斑驳病毒检测的dpo-pcr引物对及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant