CN109207615A - 一种免标记荧光检测金黄色葡萄球菌mecA基因的方法及检测试剂盒 - Google Patents

一种免标记荧光检测金黄色葡萄球菌mecA基因的方法及检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种免标记荧光检测金黄色葡萄球菌mecA基因的方法及检测试剂盒，属于分析检测领域。本发明是以发夹探针HP结合核酸外切酶Exo III辅助目标信号级联再循环扩增策略。以G‑quadruplex为信号报告分子，可现实免标记检测金黄色葡萄球菌mecA基因，简化了操作，降低了成本。整个检测过程响应迅速，简单、免标记，且灵敏度高，无需专业训练即可掌握操作流程，便于快速推广使用。本发明所述的检测方法和检测试剂盒，对环境或食品中金黄色葡萄球菌的快速检测具有重要意义。

Description

一种免标记荧光检测金黄色葡萄球菌mecA基因的方法及检测 试剂盒
技术领域
本发明属于分析检测领域，具体涉及一种免标记荧光检测金黄色葡萄球菌mecA基因的方法及检测试剂盒。
背景技术
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是造成人和动物感染的最主要致病菌，普遍存在于环境和食品中。即使在低浓度下，金黄色葡萄球菌也可危及人与动物的生命健康，比如会引起急性肺炎、败血症、中毒性休克等疾病。
目前，常规的金黄色葡萄球菌检测方法主要有微阵列，聚合酶链式反应，高通量测序和表面等离子共振等方法。这些方法需要对待测样品进行分离富集，操作繁琐和费时，不利于快速现场检测。近年来，利用生物传感器检测致病菌的方法备受关注，已建立荧光、电化学以及比色法等分析技术，但大多需要进行标记，因而限制了这些技术的广泛应用。
因此，迫切需要构建一种新型检测技术用于金黄色葡萄球菌的检测，使检测过程具有快速、简单、免标记和灵敏度高等特点，从而降低成本，易于推广。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，利用发夹探针(HP)和核酸外切酶(ExoIII)辅助的目标信号级联循环扩增策略，构建了一种免标记荧光检测金黄色葡萄球菌的方法及检测试剂盒。
本发明所采取的技术方案是：
一种免标记荧光检测金黄色葡萄球菌的检测试剂盒，包括发夹探针HP、缓冲溶液、N-甲基卟啉二丙酸IX(NMM)和核酸外切酶Exo III，其中发夹探针HP既包含识别原件又包含信号报告原件。发夹探针HP从5'端开始依次为I、II、III和IV区域，其中I区5'端为G-quadruplex序列；II区构成发夹探针茎环结构的环；I区中G-quadruplex序列以外的序列加上II区序列这一段区域与mecA基因序列相同，形成mecA基因类似物，而G-quadruplex序列充当信号报告因子；III区与I区完全互补，共同构成发夹探针茎环结构的茎；IV为3'端凸起，通过碱基互补识别mecA基因。本发明试剂盒中添加了Exo III，为了防止发夹探针HP被酶切，所以需要在发夹探针HP的3'端连接数个保护性碱基，使其形成3'端突出末端，即IV区。IV区序列与mecA基因的部分序列互补配对。
优选的，发夹探针HP中I区包含23-27个碱基，II区包含7-9个碱基，III区包含15-27个碱基，IV区包含9-13个碱基。
优选的，发夹探针HP的I区序列为：GGGTAGGGCGGGTTGGGATTGGGATCA(SEQ IDNO：1)。
优选的，发夹探针HP的II区序列为：TAGCGTCAT(SEQ ID NO：2)。
优选的，I与III区序列完全互补。将G-quadruplex紧紧绑住，降低背景信号。
优选的，发夹探针HP的III区序列为：TGATCCCAATCCCAACCCGCCCTACCC(SEQ IDNO：3)。
优选的，发夹探针HP的IV区序列为CTATGATCCCAAT(SEQ ID NO：4)。
优选的，发夹探针HP的序列如下所示：
HP:5'-GGGTAGGGCGGGTTGGGATTGGGATCA(I区)-TAGCGTCAT(II区)-TGATCCCA
ATCCCAACCCGCCCTACCC(III区)-CTATGATCCCAAT(IV区)-3'(SEQ ID NO：5)。
优选的，缓冲溶液包括Tris-HCl缓冲溶液，pH＝7.0-7.5。
优选的，缓冲溶液为20mM Tris-HCl缓冲溶液，其中含有100mM NaCl，10mM MgCl2，15mM KCl，pH＝7.4。此处，缓冲溶液是模拟生理条件，有利于碱基配对。缓冲液的成分、种类和pH可以适应性调整。
优选的，缓冲溶液还包括1×NEBuffer缓冲液，作为Exo III酶切缓冲液。
本发明的反应原理如下：
当存在mecA基因时，发夹探针IV区与mecA基因通过碱基互补结合，使发夹探针HP的3’端IV区形成双链DNA的平末端。接着Exo III从发夹探针HP的3’端逐渐酶切双链DNA，最后切至II区，释放出含有G-quadruplex、mecA基因类似物(I和II区)和mecA基因。随后mecA基因类似物的I和II区同样与发夹探针HP的IV区结合引发类似mecA基因的反应过程。最后，在mecA基因和mecA基因类似物的不断循环下，释放出大量的G-quadruplex。不断产生的G-quadruplex与荧光染料NMM结合(λex＝399nm，λem＝610nm；λex为激发光波长，λem为发射光波长峰值)，产生明显的荧光变化。根据释放的G-quadruplex/NMM复合物浓度与荧光强度成线性关系(λex＝399nm，λem＝610nm)，从而达到检测金黄色葡萄球菌mecA基因的目的。因为mecA gene是金黄色葡萄球菌的一段致病基因，只存在于金黄色葡萄球菌中，所以可以通过检测mecA gene达到检测金黄色葡萄球菌的目的。
在最佳条件下，该方法的线性范围从10fM到10nM，检测限为2.4fM。该方法还对其他可能的干扰核酸表现出显著的选择性。牛奶实际样品分析金黄色葡萄球菌mecA基因的结果表明，该方法具有较好的精密度和准确度。
一种免标记荧光检测金黄色葡萄球菌的方法，包括以下步骤：
(1)将发夹探针HP溶解于缓冲溶液中，90-95℃加热5-10分钟，冷却至室温；
(2)将待测溶液加入到含有发夹探针HP和Exo III的缓冲溶液，室温下反应；再加入N-甲基卟啉二丙酸IX荧光染料，室温下反应；在激发波长为399nm，发射波长为610nm的条件下，测定上述体系的荧光强度；根据释放的G-quadruplex/NMM复合物浓度与荧光强度成线性关系(λex＝399nm，λem＝610nm)，从而达到检测金黄色葡萄球菌mecA基因的目的。
其中，发夹探针HP、缓冲体系、N-甲基卟啉二丙酸IX和核酸外切酶Exo III如上述任一项所述。
当mecA基因不存在时，体系的荧光强度没有变化；当有mecA基因存在时，体系中发夹探针HP与mecA基因结合导致该复合物被Exo III酶切。在酶切的作用下，发夹探针HP释放出mecA基因和mecA基因类似物。释放的mecA基因和mecA基因类似物不断与发夹探针HP结合，持续释放出G-quadruplex。根据释放的G-quadruplex/NMM复合物浓度与荧光强度成线性关系(λex＝399nm,λem＝610nm)，从而达到检测金黄色葡萄球菌mecA基因的目的。因为mecA gene是金黄色葡萄球菌的一段致病基因，只存在于金黄色葡萄球菌中，所以可以通过检测mecA gene达到检测金黄色葡萄球菌的目的。本发明所述的检测方法的原理图见图1。
本发明的有益效果是：
本发明是以发夹探针HP结合核酸外切酶(Exo III)辅助目标信号级联再循环扩增策略。以G-quadruplex为信号报告分子，可现实免标记检测金黄色葡萄球菌mecA基因，简化了操作，降低了成本。整个检测过程响应迅速，简单、免标记，且灵敏度高，无需专业训练即可掌握操作流程，便于快速推广使用。
本发明所述的检测方法和检测试剂盒，对环境或食品中金黄色葡萄球菌的快速检测具有重要意义。
附图说明
图1为本发明所述的检测方法的原理图；
图2为对不同浓度的金黄色葡萄球菌mecA基因检测的结果图；
图3为特异性实验结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但不局限于此。
实施例1
一种免标记荧光检测金黄色葡萄球菌的检测试剂盒，包括下列成分：
(1)发夹探针HP，序列如下：
HP:5'-GGGTAGGGCGGGTTGGGATTGGGATCA(I区)-TAGCGTCAT(II区)-TGATCCCAATCCCAACCCGCCCTACCC(III区)-CTATGATCCCAAT(IV区)-3'(SEQ ID NO：5)；
(2)Exo III及1×NEBuffer缓冲液；
(3)20mM Tris-HCl缓冲溶液，其中含有100mM NaCl，10mM MgCl2，15mM KCl，pH＝7.4。
一种免标记荧光检测金黄色葡萄球菌的方法按照如下步骤进行：
(1)发夹探针HP的形成。将浓度为10μM的发夹探针HP，置于90℃水浴锅中加热10分钟，随后缓慢冷却至室温；
(2)金黄色葡萄球菌mecA基因的检测。首先将2μL待测溶液加入到含有300nM发夹探针HP和37.5U Exo III的38μL Tris-HCl缓冲溶液，室温下反应30分钟；再加入500nMNMM荧光染料，室温下接着反应30分钟；最后把反应体系稀释到200μL(本实验室荧光仪器所要求，本领域技术人员可以适应性调整)。根据释放的G-quadruplex/NMM复合物浓度与荧光强度成线性关系(λex＝399nm，λem＝610nm)，从而达到检测金黄色葡萄球菌mecA基因的目的。因为mecA gene是金黄色葡萄球菌的一段致病基因，只存在于金黄色葡萄球菌中，所以可以通过检测mecA gene达到检测金黄色葡萄球菌的目的。本发明所述的检测方法的原理图见图1。
实施例2
对不同浓度金黄色葡萄球菌mecA基因的检测：
配制金黄色葡萄球菌mecA基因标准溶液，浓度分别为0、10fM、102fM、103fM、104fM、105fM、106fM、107fM、108fM和109fM，4℃保存。
将不同浓度的mecA基因溶液分别加到实施例1中所述的反应体系中，充分反应后观察体系荧光强度变化，结果如图2(图2A：在λex＝399nm条件下，不同mecA基因浓度所对应的发射光波谱图；图2B：在λex＝399nm条件下，λem＝610nm得到的荧光标准曲线图；)所示，10fM的mecA基因可产生明显的荧光变化，说明其检测限<10fM。随着mecA基因浓度增加，荧光强度也增加，并逐渐趋于饱和。
实施例3
特异性实验：
配制10nM不同核酸的标准溶液，它们分别是M1，M2，M3和NC。
M1:5’-ATTGGGATGATAGCGTCATT-3’(SEQ ID NO：6)，
M2:5’-ATTGGGATGATACCGTCATT-3’(SEQ ID NO：7)；
M3:5’-ATTGCGATGATACCGTCATT-3’(SEQ ID NO：8)；
NC:5’-TGCCGCTCATCCGCCACATA-3’(SEQ ID NO：9)。
其中下划线字母代表错配碱基。
将10nM的不同干扰物标准溶液和10nM mecA基因溶液分别加入到实施例1中所述的反应体系中，充分反应后观察体系荧光变化，结果如图3所示，10nM的M1、M2、M3和NC荧光强度均远远低于10nM的mecA基因，其中M1体系和M2的荧光强度分别为mecA基因的32％和1％。M3体系和NC的荧光强度与空白组一样。这证明该方法对mecA基因的检测具有较好的特异性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东省生态环境技术研究所
<120> 一种免标记荧光检测金黄色葡萄球菌mecA基因的方法及检测试剂盒
<130>
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gggtagggcg ggttgggatt gggatca 27
<210> 2
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tagcgtcat 9
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgatcccaat cccaacccgc cctaccc 27
<210> 4
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ctatgatccc aat 13
<210> 5
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gggtagggcg ggttgggatt gggatcatag cgtcattgat cccaatccca acccgcccta 60
cccctatgat cccaat 76
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
attgggatga tagcgtcatt 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
attgggatga taccgtcatt 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
attgcgatga taccgtcatt 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tgccgctcat ccgccacata 20

Claims (8)

1.一种免标记荧光检测金黄色葡萄球菌的检测试剂盒，其特征在于：包括发夹探针HP、缓冲溶液、N-甲基卟啉二丙酸IX和核酸外切酶Exo III；其中发夹探针HP从5'端开始依次为I、II、III和IV区域，其中I区5'端为G-quadruplex序列；II区构成发夹探针茎环结构的环；I区中G-quadruplex序列以外的序列加上II区序列这一段区域与mecA基因序列相同；III区与I区完全互补，共同构成发夹探针茎环结构的茎；IV为3'端凸起，通过碱基互补识别mecA基因。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：发夹探针HP中I区包含23-27个碱基，II区包含7-9个碱基，III区包含15-27个碱基，IV区包含9-13个碱基。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：发夹探针HP的I区序列为：GGGTAGGGCGGGTTGGGATTGGGATCA。
4.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：发夹探针HP的II区序列为：TAGCGTCAT。
5.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：发夹探针HP的IV区序列为CTATGATCCCAAT。
6.根据权利要求1-5任一项所述的检测试剂盒，其特征在于：发夹探针HP的序列如下所示：HP:5'-GGGTAGGGCGGGTTGGGATTGGGATCATAGCGTCATTGATCCCAATCCCAACCCGCCCTACCCCTATGATCCCAAT-3'。
7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于：缓冲溶液包括Tris-HCl缓冲溶液，pH＝7.0-7.5。
8.一种免标记荧光检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，包括下列步骤：
(1)将发夹探针HP溶解于缓冲溶液中，90-95℃加热5-10分钟，冷却至室温；
(2)将待测溶液加入到含有发夹探针HP和Exo III的缓冲溶液，室温下反应；再加入N-甲基卟啉二丙酸IX荧光染料，室温下反应；在激发波长为399nm，发射波长为610nm的条件下，测定上述体系的荧光强度；
其中，发夹探针HP、缓冲体系、N-甲基卟啉二丙酸IX和核酸外切酶Exo III如权利要求1-7任一项所述。
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