CN106868157B - 一种金黄色葡萄球菌的检测方法及检测试剂盒 - Google Patents

一种金黄色葡萄球菌的检测方法及检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种金黄色葡萄球菌的检测方法及检测试剂盒。以金黄色葡萄球菌特异性的核酸适体为分子识别元件,在金黄色葡萄球菌作用下打开茎环结构DNA,进一步与胶体金纳米颗粒上的核酸相互作用,形成部分双链DNA,在核酸内切酶的作用下切割胶体金上的核酸序列,使荧光标记的一端掉落远离胶体金,从而使淬灭的荧光恢复,达到检测效果。由于工具酶的作用,可不断放大检测信号,检测方法具有较高的灵敏度,其检测限位5 cfu/mL。该检测方法具有很好的特异性,常见的其他菌对检测不产生影响。整个检测过程可在室温下完成反应,具有操作简单、经济便宜等优点,无需对菌进行裂解,可直接检测活菌。

Description

一种金黄色葡萄球菌的检测方法及检测试剂盒
技术领域
本发明属于病源微生物分析检测领域,具体涉及一种金黄色葡萄球菌的检测方法及检测试剂盒。
背景技术
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种重要的人畜共患致病菌,广泛分布自然界,由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒是个世界性卫生问题,易导致肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等临床症状。
金黄色葡萄球菌作为一种重要的食源性致病菌亦是进出口动物性食品必检微生物。传统检测方法主要包括,包括分离培养和理化鉴定、血浆凝固酶试验和毒素检测试验等,检测时间较长,一般需要3-5天,且灵敏性差。PCR技术也已用于金黄色葡萄球菌的检测,但需要较高的实验条件,昂贵的仪器设备和操作专业人员,且检测过程相对复杂,检测成本较高,基层单位难以开展。并且需要对菌进行裂解才能检测,无法用于活菌的直接检测大大限制了这些技术的应用。
因此,迫切需要建立一种简单、快速、准确的金黄色葡萄球菌活菌检测方法,这对于预防和控制金黄色葡萄球菌的感染,增强食品安全性和保障人体健康具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种金黄色葡萄球菌的检测方法及检测试剂盒。
本发明所采取的技术方案是:
一种金黄色葡萄球菌的检测试剂盒,包括杂交缓冲液、核酸内切酶、猝灭荧光的纳米颗粒和下列核酸序列:
核酸序列H1:依次具有A、B、C区域,其中A区域为金黄色葡萄球菌的核酸适体,C与A部分互补形成茎环结构的茎部分,A与C不互补的序列凸起于茎环结构外侧,B构成茎环结构的环部分,B中包含一段与H2的核酸内切酶识别位点互补配对的核酸序列;
核酸序列H2:具有茎环结构,H2的一端修饰基团,固定在能猝灭荧光的纳米颗粒上,另一端修饰相应的荧光基团;H2的环结构上包含有一段核酸内切酶的识别位点序列,与H1的B区域的相应序列互补。
优选的,H1的A区域的核酸序列为:
5'-GCGCCCTCTCACGTGGCACTCAGAGTGCCGGAAGTTCTGCGTTAT-3'。
优选的,B区域的碱基数为7-15个,更优选为11个。
优选的,C区域的碱基数6-10个,更优选为8个。
优选的,H2的环结构的碱基数为7-18个,更优选为15个。
优选的,H2的茎部分的碱基数为5-9个,更优选为6个。
优选的,核酸内切酶对应特定的识别序列,通过结合识别序列,对识别序列进行切割;具体包括Nt.BbvCI、Bmtl、BseYI 、BstUI 。
优选的,当核酸内切酶为Nt.BbvCI时,H2的环结构上包含有一段5'-CCTCAGC-3'的核酸内切酶识别位点序列,H1的B区域中包含一段与之互补的5'-GCTGAGG-3'序列。
优选的,当核酸内切酶为Bmtl时,H2的环结构上包含有一段5'-GCTAGC-3'核酸内切酶识别位点序列,H1的B区域中包含一段与之互补的5'-GCTAGC-3'序列。
优选的,能猝灭荧光的纳米颗粒包括金纳米颗粒、石墨烯纳米颗粒、碳纳米管、银纳米颗粒,所述作为固定材料的纳米颗粒直接与H2的修饰基团结合,或是通过纳米颗粒上修饰对应的基团与H2的修饰基团结合。
优选的,H2的一端修饰巯基,固定在金纳米颗粒上;或H2的一端修饰羟基,固定在修饰了羧基的纳米颗粒上;或H2的一端修饰了生物素,固定在修饰了SA的纳米颗粒上。
优选的,荧光基团为FAM、Cy3、Cy5。
优选的,杂交缓冲液为10 mM Tris-HCl,pH为7.9,含有50 mM NaCl,10 mM MgCl2以及100 ug/ml BSA。
优选的,所述检测试剂盒,其特征在于:所述检测试剂盒包括核酸内切酶Nt.BbvCI和下列核酸序列:
核酸序列H1:
5'-GCGCCCTCTCACGTGGCACTCAGAGTGCCGGAAGTTCTGCGTTAT-GTGCTGAGGAT-ATAACGCA-3'(SEQ ID NO:1);
核酸序列H2: 5'-GCTACGTGATCCTCAGCACACCGTAGC-3'(SEQ ID NO:2)。
一种金黄色葡萄球菌的检测方法,包括下列步骤:
(1)先用杂交缓冲液分别溶解核酸H1和H2,1μM的H2固定在纳米颗粒表面;(H2用杂交缓冲液溶解后,加入纳米颗粒如胶体金,便可以完成固定;而且多个H2可以固定在同一个胶体金上);
(2)在500 nM的H1中加入待测溶液,充分混匀,室温反应30分钟;然后加入到步骤(1)中的H2溶液中,充分混匀,室温反应30分钟;
(3)加入25 U的核酸内切酶如Nt.BbvCI,充分混匀,室温反应90分钟;12000 rpm离心后保留上清,用于荧光检测,激发峰为495 nm,发射峰为525 nm;根据荧光发射光强度与金黄色葡萄球菌浓度呈正相关来判断结果;
其中,杂交缓冲液、核酸内切酶和核酸序列H1和H2如上述任一项所述。
本发明方法的反应原理如下(见图1):
(1)茎环结构 H1上的A序列是金黄色葡萄球菌的核酸适体,能与金黄色葡萄球菌特异性结合,随后打开茎环结构H1,使B暴露出来。B中包含一段与H2的核酸内切酶识别位点互补配对的核酸序列。C与部分A互补。
(2)茎环结构H2的一端修饰巯基,固定在纳米颗粒(如胶体金)上,另一端修饰荧光基团。由于荧光基团靠近胶体金,会发生荧光能量转移,淬灭荧光,此时体系只有很低的背景荧光。胶体金可以用其他纳米材料替换,只要能淬灭荧光即可,包括石墨烯、碳纳米管、银纳米颗粒等。
H2的环结构上含有核酸内切酶的识别切割位点,环的碱基数为7-18个,优选的为15个。茎部分的碱基数为5-9个,优选的为6个。
(3)步骤(1)暴露后的H1加入到步骤(2)中,H1的B能与H2的环结构互补,形成双链DNA。加入核酸内切酶(Nt.BbvCI)后, 可识别双链DNA中的酶切位点,把H2切割成两部分。也可以用其他的核酸内切酶(例如:Bmtl),只要替换对应的识别序列,也能完成检测。
(4)H2含荧光基团的一端掉落,远离胶体金,荧光能量转移消失恢复荧光。同时H1会释放掉落,进入下一轮循环,不断与H2相互作用,并进一步在酶的作用下发生切割反应,不断使荧光基团远离胶体金,最后大量恢复荧光。荧光强度与金黄色葡萄球菌的浓度呈正相关,从而达到检测目的。
本发明的有益效果是:
(1)可检测金黄色葡萄球菌活菌,无需对菌就行裂解提取,操作简单,检测快速;
(2)只需使用一种工具酶完成信号扩增,无需使用多种酶;
(3)可在室温下完成反应,灵敏度高、选择性好。
附图说明
图1为本发明所述的检测方法的原理图;
图2为对不同浓度的金黄色葡萄球菌的结果图;
图3为特异性实验结果图。
具体实施方式
一种金黄色葡萄球菌的检测试剂盒,包括杂交缓冲液、核酸内切酶、猝灭荧光的纳米颗粒和下列核酸序列:
核酸序列H1:依次具有A、B、C区域,其中A区域为金黄色葡萄球菌的核酸适体,C与A部分互补形成茎环结构的茎部分,A与C不互补的序列凸起于茎环结构外侧,B构成茎环结构的环部分,B中包含一段与H2的核酸内切酶识别位点互补配对的核酸序列;
核酸序列H2:具有茎环结构,H2的一端修饰基团,固定在能猝灭荧光的纳米颗粒上,另一端修饰相应的荧光基团;H2的环结构上包含有一段核酸内切酶的识别位点序列,与H1的B区域的相应序列互补。
优选的,H1的A区域的核酸序列为:
5'-GCGCCCTCTCACGTGGCACTCAGAGTGCCGGAAGTTCTGCGTTAT-3'。
优选的,B区域的碱基数为7-15个,更优选为11个。
优选的,C区域的碱基数6-10个,更优选为8个。
优选的,H2的环结构的碱基数为7-18个,更优选为15个。
优选的,H2的茎部分的碱基数为5-9个,更优选为6个。
优选的,核酸内切酶对应特定的识别序列,通过结合识别序列,对识别序列进行切割;具体包括Nt.BbvCI、Bmtl、BseYI 、BstUI 。
优选的,当核酸内切酶为Nt.BbvCI时,H2的环结构上包含有一段5'-CCTCAGC-3'的核酸内切酶识别位点序列,H1的B区域中包含一段与之互补的5'-GCTGAGG-3'序列。
优选的,当核酸内切酶为Bmtl时,H2的环结构上包含有一段5'-GCTAGC-3'核酸内切酶识别位点序列,H1的B区域中包含一段与之互补的5'-GCTAGC-3'序列。
优选的,能猝灭荧光的纳米颗粒包括金纳米颗粒、石墨烯纳米颗粒、碳纳米管、银纳米颗粒,所述作为固定材料的纳米颗粒直接与H2的修饰基团结合,或是通过纳米颗粒上修饰对应的基团与H2的修饰基团结合。
优选的,H2的一端修饰巯基,固定在金纳米颗粒上;或H2的一端修饰羟基,固定在修饰了羧基的纳米颗粒上;或H2的一端修饰了生物素,固定在修饰了SA的纳米颗粒上。
优选的,荧光基团为FAM、Cy3、Cy5。
优选的,杂交缓冲液为10 mM Tris-HCl,pH为7.9,含有50 mM NaCl,10 mM MgCl2以及100 ug/ml BSA。
优选的,所述检测试剂盒,其特征在于:所述检测试剂盒包括核酸内切酶Nt.BbvCI和下列核酸序列:
核酸序列H1:
5'-GCGCCCTCTCACGTGGCACTCAGAGTGCCGGAAGTTCTGCGTTAT-GTGCTGAGGAT-ATAACGCA-3'(SEQ ID NO:1);
核酸序列H2: 5'-GCTACGTGATCCTCAGCACACCGTAGC-3'(SEQ ID NO:2)。
一种金黄色葡萄球菌的检测方法,包括下列步骤:
(1)先用杂交缓冲液分别溶解核酸H1和H2,1μM的H2固定在纳米颗粒表面;(H2用杂交缓冲液溶解后,加入纳米颗粒如胶体金,便可以完成固定;而且多个H2可以固定在同一个胶体金上);
(2)在500 nM的H1中加入待测溶液,充分混匀,室温反应30分钟;然后加入到步骤(1)中的H2溶液中,充分混匀,室温反应30分钟;
(3)加入25 U的核酸内切酶如Nt.BbvCI,充分混匀,室温反应90分钟;12000 rpm离心后保留上清,用于荧光检测,激发峰为495 nm,发射峰为525 nm;根据荧光发射光强度与金黄色葡萄球菌浓度呈正相关来判断结果;
其中,杂交缓冲液、核酸内切酶和核酸序列H1和H2如上述任一项所述。
本发明方法的反应原理如下(见图1):
(1)茎环结构 H1上的A序列是金黄色葡萄球菌的核酸适体,能与金黄色葡萄球菌特异性结合,随后打开茎环结构H1,使B暴露出来。B中包含一段与H2的核酸内切酶识别位点互补配对的核酸序列。C与部分A互补。
(2)茎环结构H2的一端修饰巯基,固定在纳米颗粒(如胶体金)上,另一端修饰荧光基团。由于荧光基团靠近胶体金,会发生荧光能量转移,淬灭荧光,此时体系只有很低的背景荧光。胶体金可以用其他纳米材料替换,只要能淬灭荧光即可,包括石墨烯、碳纳米管、银纳米颗粒等。
H2的环结构上含有核酸内切酶的识别切割位点,环的碱基数为7-18个,优选的为15个。茎部分的碱基数为5-9个,优选的为6个。
(3)步骤(1)暴露后的H1加入到步骤(2)中,H1的B能与H2的环结构互补,形成双链DNA。加入核酸内切酶(Nt.BbvCI)后, 可识别双链DNA中的酶切位点,把H2切割成两部分。也可以用其他的核酸内切酶(例如:Bmtl),只要替换对应的识别序列,也能完成检测。
(4)H2含荧光基团的一端掉落,远离胶体金,荧光能量转移消失恢复荧光。同时H1会释放掉落,进入下一轮循环,不断与H2相互作用,并进一步在酶的作用下发生切割反应,不断使荧光基团远离胶体金,最后大量恢复荧光。荧光强度与金黄色葡萄球菌的浓度呈正相关,从而达到检测目的。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明,但并不局限于此。
实施例1
一种金黄色葡萄球菌的检测方法,按照如下步骤进行:
(1)先用Tris-HCl缓冲液(10 mM,pH为7.9,含有50 mM NaCl,10 mM MgCl2以及100μg/ml BSA)分别溶解核酸H1和H2。1μM的H2固定在胶体金纳米颗粒表面(H2用杂交缓冲液溶解后,加入胶体金,便可以完成固定;而且多个H2可以固定在同一个胶体金上)。
(2)在500 nM的H1中加入不同浓度的金黄色葡萄球菌,充分混匀,室温反应30分钟。然后加入到步骤(1)中的胶体金溶液中,充分混匀,室温反应30分钟。
(3)加入25 U的核酸内切酶Nt.BbvCI,充分混匀,室温反应90分钟。12000 rpm离心后保留上清,用于荧光检测,激发峰为495 nm,发射峰为525 nm。荧光发射光强度与金黄色葡萄球菌浓度呈正相关。
实施例2
一种金黄色葡萄球菌检测试剂盒包括以下成分:
(1)核酸序列H1和H2以及相应的修饰基团如下:
H1:5'-GCGCCCTCTCACGTGGCACTCAGAGTGCCGGAAGTTCTGCGTTAT(A)-GTGCTGAGGAT(B)-ATAACGCA(C)-3' (SEQ ID NO:1);
H2: 5'-SH-GCTACGTGATCC↓TCAGCACACCGTAGC-FAM3' (箭头表示切割位点)(SEQID NO:2);
(2)胶体金纳米颗粒;
(3)核酸内切酶Nt.BbvCI;
(4)缓冲液(10 mM Tris-HCl,pH为7.9,含有50 mM NaCl,10 mM MgCl2以及100μg/ml BSA)。
实施例3
对不同浓度金黄色葡萄球菌的检测:
配制金黄色葡萄球菌标准溶液,浓度分别为1x101 cfu/mL、 1x102 cfu/mL、1x103cfu/mL、1x104 cfu/mL、1x105cfu/mL、1x106 cfu/mL 4℃保存。将不同浓度的金黄色葡萄球菌溶液分别加到实施例1中所述的反应体系中,充分反应后检测荧光强度,如图2所示,随着金黄色葡萄球菌浓度的增加,对应的荧光强度逐渐增强,当金黄色葡萄球菌浓度超过1x105cfu/mL时,逐渐达到饱和。以金黄色葡萄球菌浓度的对数(lgC)为横坐标,荧光强度为纵坐标,绘制标准曲线,二者具有很好的线性关系,线性范围是从 1x101 cfu/mL 到1x105cfu/mL,线性方程是:F = 14 lgC -15 (R2 =0.995)(F为荧光强度,C为金黄色葡萄球菌浓度),按照3倍信噪比标准(3S/N),检测限为 5 cfu/mL。
实施例4
特异性实验:
配制浓度为1x103 cfu/mL的不同菌溶液,分别是沙门氏菌、大肠杆菌、地杆菌、志贺氏菌、溶血性链球菌、布鲁氏杆菌。将1x103 cfu/mL的不同菌溶液和1x102 cfu/mL金黄色葡萄球菌溶液分别加到实施例1中所述的反应体系中,充分反应后检测荧光强度,如图3所示,1x103 cfu/mL的沙门氏菌、大肠杆菌、地杆菌、志贺氏菌、溶血性链球菌、布鲁氏杆菌的荧光强度与空白样品相比,变化不大,对检测不产生影响。只有当加入金黄色葡萄球菌溶液才会使荧光强度明显增加,这证明该方法对金黄色葡萄球菌的检测具有很好的特异性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东省生态环境技术研究所
<120> 一种金黄色葡萄球菌的检测方法及检测试剂盒
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcgccctctc acgtggcact cagagtgccg gaagttctgc gttatgtgct gaggatataa 60
cgca 64
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gctacgtgat cctcagcaca ccgtagc 27

Claims (10)

1.一种金黄色葡萄球菌的检测试剂盒,其特征在于,包括杂交缓冲液、识别双链切割单链的核酸内切酶、猝灭荧光的纳米颗粒和下列核酸序列:
核酸序列H1:依次具有A、B、C区域,其中A区域为金黄色葡萄球菌的核酸适体,C与A部分互补形成茎环结构的茎部分,A与C不互补的序列凸起于茎环结构外侧,B构成茎环结构的环部分,B中包含一段与H2的核酸内切酶识别位点互补配对的核酸序列;
核酸序列H2:具有茎环结构,H2的一端修饰基团,固定在能猝灭荧光的纳米颗粒上,另一端修饰相应的荧光基团;H2的环结构上包含有一段核酸内切酶的识别位点序列,与H1的B区域的相应序列互补。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒,其特征在于:H1的A区域的核酸序列为5'-GCGCCCTCTCACGTGGCACTCAGAGTGCCGGAAGTTCTGCGTTAT-3'。
3.根据权利要求1所述的检测试剂盒,其特征在于:核酸内切酶选自Nt.BbvCI、Bmtl、BseYI 、BstUI 。
4.根据权利要求1所述的检测试剂盒,其特征在于:当核酸内切酶为Nt.BbvCI时,H2的环结构上包含有一段5'-CCTCAGC-3'的核酸内切酶识别位点序列,H1的B区域中包含一段与之互补的5'-GCTGAGG-3'序列。
5.根据权利要求1所述的检测试剂盒,其特征在于:当核酸内切酶为Bmtl时,H2的环结构上包含有一段5'-GCTAGC-3'核酸内切酶识别位点序列,H1的B区域中包含一段与之互补的5'-GCTAGC-3'序列。
6.根据权利要求1所述的检测试剂盒,其特征在于:能猝灭荧光的纳米颗粒包括金纳米颗粒、石墨烯纳米颗粒、碳纳米管、银纳米颗粒,所述作为固定材料的纳米颗粒直接与H2的修饰基团结合,或是通过纳米颗粒上修饰对应的基团与H2的修饰基团结合。
7.根据权利要求6所述的检测试剂盒,其特征在于:H2的一端修饰巯基,固定在金纳米颗粒上;或H2的一端修饰羟基,固定在修饰了羧基的纳米颗粒上;或H2的一端修饰了生物素,固定在修饰了SA的纳米颗粒上。
8.根据权利要求1所述的检测试剂盒,其特征在于:荧光基团为FAM、Cy3、Cy5。
9.根据权利要求1所述的检测试剂盒,其特征在于:所述检测试剂盒包括核酸内切酶Nt.BbvCI和下列核酸序列:
核酸序列H1:
5'-GCGCCCTCTCACGTGGCACTCAGAGTGCCGGAAGTTCTGCGTTAT-GTGCTGAGGAT-ATAACGCA-3';
核酸序列H2: 5'-GCTACGTGATCCTCAGCACACCGTAGC-3'。
10.一种金黄色葡萄球菌的检测方法,所述检测方法不用于诊断目的,其特征在于,包括下列步骤:
(1)先用杂交缓冲液分别溶解核酸H1和H2,1μM的H2固定在纳米颗粒表面;
(2)在500 nM的H1中加入待测溶液,充分混匀,室温反应30分钟;然后加入到步骤(1)中的H2溶液中,充分混匀,室温反应30分钟;
(3)加入25 U的识别双链切割单链的核酸内切酶,充分混匀,室温反应90分钟;12000rpm离心后保留上清,用于荧光检测,激发峰为495 nm,发射峰为525 nm;根据荧光发射光强度与金黄色葡萄球菌浓度呈正相关来判断结果;
其中,杂交缓冲液、识别双链切割单链的核酸内切酶和核酸序列H1和H2如权利要求1~9任一项所述。
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