CN114015748B - 一种基于级联放大快速定量检测阪崎肠杆菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明构建了一种基于级联放大快速定量检测阪崎肠杆菌的生物传感器。该传感器通过磁富集、抗体‑核酸适体识别、EXPAR和DNAzyme信号积累实现阪崎肠杆菌的四重级联放大。首先，制备免疫磁珠用于磁富集；其次，磁分离从复杂基质中直接捕获靶标，随后添加核酸适体形成了抗体‑靶标‑融合核酸适体的免疫三明治夹心结构，保证传感器的高特异性；再次，通过EXPAR实现信号的指数放大；最后，通过产物中的富G序列形成类酶活性的四链体，催化显色信号输出。本方法具有高灵敏度、高特异性，快速简便，在2 h内即可实现对阪崎肠杆菌的定量检测，整个过程免提取，结果可视化，有效解决了传感器制备复杂、测定时间长的难题。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种利用级联放大快速定量检测阪崎肠杆菌的方法。
背景技术
阪崎肠杆菌（Cronobacter spp.）是一种主要存在于奶粉中的条件性致病菌，可以引起婴幼儿脑膜炎、坏死性小肠结肠炎、败血症等疾病，十分不利于婴幼儿的健康生长。此外，具有低免疫力，尤其是老年人也可能被感染。在某些情况下，由阪崎肠杆菌引发疾病而导致的死亡率可达40%~80%。因此需要开发一种快速检测阪崎肠杆菌的方法。
目前，对于阪崎肠杆菌的检测主要有传统微生物培养法、免疫学检测法、现代分子生物技术检测法等。本发明构建了一种利用级联放大定量检测阪崎肠杆菌的新型生物传感器。（1）整个反应在均相体系中完成，避免了界面反应存在的不稳定因素；（2）该传感体系中的缓冲溶液可同时兼顾抗体和核酸适体的生物学活性以及保证指数扩增（EXPAR）反应和DNAzyme信号转换的顺利进行；（3）通过巧妙设计融合核酸适体，使识别与扩增一体化成为可能，最终信号成功可视化输出；（4）包含有四重级联放大：磁富集、抗体-核酸适体识别、EXPAR和DNAzyme信号积累。首先，通过EDC/NHS法成功制备了免疫磁珠，当靶标存在时，通过磁分离可直接从复杂基质中捕获靶标，随后添加核酸适体形成了抗体-靶标-融合核酸适体的免疫三明治夹心结构，这保证了传感器的高特异性。此外，由于每个靶标可以捕获多个适体，并且每个适体都可以触发EXPAR，其模板含有G四链体的反义序列，因此产物中包含有富G序列，最终通过3,3,5,5-四甲基联苯胺（TMB）催化显色即可实现信号输出。最终输出的信号被呈指数放大。其中EXPAR是在55℃ 20~30 min内，即可达到>106倍的指数核酸扩增方法。本申请将EXPAR与双抗夹心模式联用，在保证高特异性的同时极大地提高了灵敏度，且检测时间较短，可以实现快速检测。本方法具有高灵敏度、高特异性，且快速简便，在2 h内即可实现对阪崎肠杆菌的定量检测，并且整个过程免提取，结果可视化，有效解决了传感器制备复杂、测定时间长的难题。
相较于CN109975378A专利，本申请主要解决了电化学生物传感器本身存在稳定性不足、装置依赖、不利于现场检测的局限性，并且通过巧妙设计融合核酸适体，实现均相体系四重级联放大的可视化检测。相较于CN106841603B和CN109762825B构建的双抗夹心模式传感，本申请最大的优势是添加核酸适体形成了抗体-靶标-融合核酸适体的免疫三明治夹心结构，并将融合核酸适体利用核酸扩增技术进行信号放大，使识别、扩增一体化成为可能，通过DNAyzme实现信号输出。基于抗体-核酸适体免疫夹心辅助EXPAR级联放大实现乳制品中阪崎肠杆菌的可视化检测方法还未见报道。
发明内容
本发明提供了一种基于抗体-核酸适体免疫夹心辅助EXPAR级联放大的快速、灵敏检测阪崎肠杆菌的生物传感新方法。本发明具有快速、超灵敏、可视化、可通用化的优点。鉴于此，本申请提供以下技术方案：
本申请提供一种基于级联放大快速定量检测阪崎肠杆菌的新型生物传感器，主要包括：（1）磁富集；（2）抗体-核酸适体识别；（3）EXPAR体系；（4）脱氧核酶信号积累；
所述磁富集是指从复杂基质中直接捕获靶标；
具体的，采用免疫磁珠用于磁富集，实现从复杂基质中直接捕获靶标；免疫磁珠是将靶标的特异性抗体通过EDC/NHS的方法偶联在磁珠表面，其偶联液包括：0.05~0.2 M 磷酸钠，0.15~0.3M NaCl，1~5 mM 谷胱甘肽，pH 6~8。
所述抗体-核酸适体识别是指在缓冲液中形成抗体-靶标-融合核酸适体的免疫三明治夹心结构；
所述融合核酸适体的5’端是与靶标特异性结合的核酸适体，3’端是可以作为EXPAR扩增的核酸模板；
所述融合核酸适体序列为：5'-GTGGTCGGGGTGGTGGGTGGGAGGGCGACTTCATCTGCGCTTATACAACCTACTACCTCATTCAGACTCTTCCCTCCCTCCCTCCCAG-PO4-3', 如SEQ ID NO.2所示。
所述缓冲溶液可以满足抗体-核酸适体双抗夹心结构的高效识别；
所述缓冲液包括：40~60 mM Tris-HCl，10~20 mM NaCl，3~7 mM MgCl2，2~8 mMKCl，1~5 mM 谷胱甘肽，pH 6~8。
具体的，50 mM Tris-HCl，15 mM NaCl，5 mM MgCl2，5 mM KCl，2 mM 谷胱甘肽，pH7.5。
所述EXPAR体系是在融合核酸适体识别靶标的基础上进行等温指数扩增；EXPAR体系包括抗体-靶标-融合核酸适体的免疫三明治夹心结构、dNTPs、互补序列（cDNA）、Bst.2.0 DNA 聚合酶及其Thermpol Reaction Buffer、Nt.BstNBI切割酶、NEB 3.1缓冲液和ddH2O。
所述脱氧核酶信号转换是等温扩增产物形成具有类酶活性的结构，实现靶标的可视化信号检测；
具体的，脱氧核酶信号转换是等温扩增产物形成具有类酶活性的G四链体结构，类过氧化物酶活性催化TMB，实现靶标的可视化信号检测。
该生物传感器在食品安全的阪崎肠杆菌检测试剂盒或检测试剂中的应用。
另一方面，本申请提供一种抗体-靶标-融合核酸适体的免疫三明治夹心结构，具体的该结构是由靶标与特异性抗体和融合核酸适体构成免疫三明治夹心结构；
所述融合核酸适体的5’端是与靶标特异性结合的核酸适体，3’端是可以作为EXPAR扩增的核酸模板；
所述融合核酸适体序列为：5'-GTGGTCGGGGTGGTGGGTGGGAGGGCGACTTCATCTGCGCTTATACAACCTACTACCTCATTCAGACTCTTCCCTCCCTCCCTCCCAG-PO4-3', 如SEQ ID NO.2所示。
免疫三明治夹心结构以及融合核酸适体在食品安全阪崎肠杆菌检测中的应用。
最后，利用该策略成功实现了牛奶中阪崎肠杆菌的检测，与传统培养法得出的结果一致，检测限达到10 CFU/g。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
1．本方法与传统的检测方法相比，超灵敏、高特异，且快速简便，在2 h内即可实现对阪崎肠杆菌的定量检测，并且整个过程免提取，结果可视化，完全满足现场检测的需求。
2．本发明中的传感策略共包含有四重级联放大：磁富集、抗体-核酸适体识别、EXPAR和脱氧核酶信号积累，这对灵敏度和特异性提供了双重保障。
3．本发明利用抗体-靶标-融合核酸适体组成的免疫三明治结构保证了传感器的特异性。
4．构建免疫磁珠时适当加入谷胱甘肽，相当于在磁珠表面加入保护液，保持了较高的生物活性，也使得修饰密度结合更紧密。
5．由于适配体3’端加有EXPAR模板，因此触发了有效的级联扩增，富G序列反应产物中的直接形成保证了级联放大的简单性。
6．通过使用靶标对应的具有高亲和力的核酸适体，并将其改造为融合核酸适体，一旦碱基错配则无法输出有效信号，极大保证了传感系统的特异性，可以将该方法推广到其他危险因子及其标志物的检测中，有效解决了传感器制备复杂、特异性及灵敏度差的难题。
7．本发明中样品无需提取靶标基因组，前处理简单，无需大型仪器，易于操作，满足现场检测的需求。
8．本发明建立的方法对纯培养中的阪崎肠杆菌在2 CFU/mL~103 CFU/mL的范围内具有良好线性关系，相关系数为R2=0.9921，检出限为2 CFU/mL；在奶粉基质中最低可检出10 CFU/g的阪崎肠杆菌，线性范围为10 CFU/g~103 CFU/g，相关系数R2=0.9859。
附图说明
图1为本发明所建方法快速检测阪崎肠杆菌原理图。
图2为利用DLS对免疫磁珠的表征结果图。
图3为该方法的可行性验证结果图。
图4为谷胱甘肽对磁珠密度影响的结果图。
图5为EXPAR反应时间优化结果图。
图6为Nt.BstNBI切割酶浓度优化结果图。
图7为Bst. DNA聚合酶浓度优化结果图。
图8为Hemin孵育时间优化结果图。
图9为Hemin浓度优化结果图。
图10为纯培养条件下不同阪崎肠杆菌浓度与吸光值变化量的线性关系及其对应比色结果图。
图11为方法特异性结果。
图12为奶粉基质中不同阪崎肠杆菌浓度与吸光值变化量的线性关系及其对应比色结果图。
具体实施方式
本发明公开了一种阪崎肠杆菌定量检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
实施例1 快速检测阪崎肠杆菌方法的原理
快速定量可视化检测阪崎肠杆菌的原理如图1所示，首先，用经典EDC/NHS法构建免疫磁珠，即将磁珠上偶联抗体；当靶标存在时，抗体可以作为捕获识别元件，随后加入融合核酸适体（IAPT），此时可形成高特异性的三明治夹心结构。此外，由于融合核酸适体含有EXPAR的扩增模板，Nt.BstNBI切割酶识别位点和富含G的反义序列，因此在Bst. DNA聚合酶的作用下可以触发EXPAR，产物含有大量的富G序列；该序列与Hemin组合形成G4/HeminDNAzyme，催化H2O2将无色的TMB氧化为蓝色，最终可以通过颜色或吸光度差异来评估实验结果。实验中用到的核酸序列如表1所示。
表1 实验中的引物序列
注：斜体为APT序列，下划线为cDNA的互补序列，粗体为富G序列的反义序列。
实施例2 免疫磁珠构建及相关表征
将羧基磁珠用500 μL反应缓冲液（0.05 M 2(N-吗啡啉)乙磺酸，0.5 M NaCl，pH=6.0）反复清洗磁分离三遍后利用经典EDC/NHS法将磁珠活化。随后加入200 μL偶联液（0.1M 磷酸钠，0.15 M NaCl，pH=7.5）清洗三次活化后的磁珠，分离后去除上清。将0.5 mg抗体溶于0.5 mL偶联液中作为储备液，按照磁珠：抗体=10:1的比例向磁珠中加入抗体，室温震荡偶联2 h后进行磁分离去除上清，然后加入 200 μL封闭液（偶联液中加1 M 甘氨酸，pH=8.5），室温振荡30 min，封闭未反应的活化基团，最后用保存液定容到工作浓度于4℃保存。
为了确保本发明设计的可行性，利用DLS对免疫磁珠的成功制备进行了验证，如图2所示，在偶联抗体后，免疫磁珠的粒径变大（由300 nm变化到420 nm），这表明在抗体成功的偶联到了磁珠上。同时zeta电位值的变化表明，偶联前后磁珠表面上的电荷也发生了变化，在一定程度上再次验证了偶联成功。
实施例3 阪崎肠杆菌检测的可行性
在构建完成免疫夹心结构后进行了EXPAR反应，具体的EXPAR反应体系表2所示。为了验证利用级联放大检测阪崎肠杆菌方法的可行性，首先通过凝胶电泳验证了EXPAR扩增的发生。
表2 EXPAR反应体系
结果如图3A所示，泳道1中的清晰条带代表了IAPT而cDNA（泳道2）由于是短单链而未出现明显条带。泳道3表示IAPT和cDNA的杂交结果，与泳道1相比，其迁移率减小，表明两者成功杂交。只有当IAPT、cDNA，Bst. DNA聚合酶，Nt.BstNBI切割酶和dNTP共同存在时，才会出现泳道8的特征性条带，这表明有短DNA片段的产生（即富G序列），若缺乏IAPT（泳道4）、Bst. DNA聚合酶（泳道5）、Nt.BstNBI切割酶（泳道6）或者cDNA（泳道7）任一组分均不会产生特征条带，值得注意的是泳道7的条带较为模糊，这可能是发生了非特异性扩增。
随后为了验证EXPAR产物作为信号输出的可能性，通过控制不同的反应条件，记录反应溶液的光谱响应和相应颜色，如图3B所示。作为一种过氧化物模拟酶，Hemin可以在H2O2存在下催化TMB以产生蓝色产物，具体的显色体系见表3。加入H2SO4后，反应终止溶液呈现黄色，在450 nm处显示特征吸收峰（样品1）。当加入不同的浓度的阪崎肠杆菌时，溶液的颜色随着浓度的增加而逐渐加深，而450 nm的吸光度值逐渐变高（样品2~5）。这归因于靶标的存在触发了EXPAR，随后产生大量G四链体序列，其与Hemin的孵育形成了G四链体 / HeminDNAzyme，这增强了TMB催化活性，导致底物被更彻底的催化。此外，还研究了溶液中G-四链体（样品6）和Hemin（样品7）对基质TMB氧化的影响。结果表明，它们的吸收光谱几乎重叠，在450 nm处没有明显的吸收峰，表明其他物质对催化结果没有影响。这些结果为生物传感器设计的成功提供了直接证据，表明该方法可以在免疫分析中实现显著的信号放大。
表3 显色反应体系
实施例4 快速检测阪崎肠杆菌方法的条件优化
随后，对制备免疫磁珠时是否加入谷胱甘肽进行效果评估，EXPAR反应条件分别进行反应时间在0~40 min范围内、Nt. BstNBI切割酶浓度在0~1 U/L范围内、Bst. DNA聚合酶浓度在0~0.1 U/μL范围内的优化以及TMB显色条件分别进行Hemin孵育时间在0~30 min范围内和Hemin浓度在0~60 μM范围内的优化实验。
1.免疫磁珠偶联缓冲液成分优化
将羧基磁珠用500 μL反应缓冲液（0.05 M 2(N-吗啡啉)乙磺酸，0.5 M NaCl，pH=6.0）反复清洗磁分离三遍后利用经典EDC/NHS法将磁珠活化。随后加入200 μL偶联液（0.1M 磷酸钠，0.15 M NaCl，pH=7.5），作为对照，实验组另加入2 M谷胱甘肽，清洗三次活化后的磁珠，分离后去除上清。将0.5 mg抗体溶于0.5 mL偶联液中作为储备液，按照磁珠：抗体=10:1的比例向磁珠中加入抗体，室温震荡偶联2 h后进行磁分离去除上清，然后加入 200 μL封闭液（偶联液中加1 M 甘氨酸，pH=8.5），室温振荡30 min，封闭未反应的活化基团后用保存液定容。将制备好的免疫磁珠中添加0.3 μM的IAPT完全反应30 min后使其充分形成三明治结构，之后进行三次磁分离以除去未结合的IAPT。接下来进行EXPAR扩增实验，将扩增产物进行TMB显色反应并在450 nm波长处检测其吸光值，计为A，空白将靶标溶液替换成无菌水，测得荧光值记为A0，吸光值变化量为△A=(A-A0)。图4结果表明，起初随着靶标浓度的增加，实验组和对照组的吸光值变化基本保持一致，当达到一定浓度后对照组的吸光值不再发生明显变化而实验组在更高浓度时趋于平缓，这说明加入谷胱甘肽后磁珠偶联的抗体丰度更高，这可能是因为谷胱甘肽本身作为抗氧化剂对抗体具有保护作用，在一定程度上提高了磁珠和抗体的偶联密度，也为抗体-核酸适体的稳定结合提供了良好环境，因此加入谷胱甘肽使得羧基磁珠具有了更好的性能。
2. EXPAR反应时间优化
前期制备免疫磁珠的过程与上述操作相同。进行EXPAR扩增实验时，反应体系为100 μL，其中包含dNTPs（4 μL, 10 mM），Bst. DNA聚合酶（0.75 μL，8 U/μL），Thermpol反应缓冲液（15 μL，10×），Nt. BstNBI（6 μL,10 U/μL），NEB 3.1缓冲液（7.5 μL，10×）和ddH2O。充分混合后在55℃下孵育0~40 min，95℃灭活5 min，4℃保存5 min，最后将每间隔10 min的反应产物进行TMB显色反应并在450 nm波长处检测其吸光值。结果表明，随着反应时间的增加，吸光值逐渐增大，在30 min时吸光值稳定，不再发生变化，这可能是由于反应体系中各物质已消耗完毕，体系中G-四链体含量达到饱和。因此，选择30 min作为最优的EXPAR反应时间(图5)。
3. Nt. BstNBI切割酶浓度优化
前期制备免疫磁珠的过程与上述操作相同，进行EXPAR实验时，Nt. BstNBI切割酶终浓度为0~1.0 U/μL，其余组分与优化反应时间时浓度保持一致。图6结果表明，当Nt. BstNBI切割酶浓度达到0.6 U/μL时，吸光值达到最大，不再发生明显变化，此时酶浓度处于饱和状态，故最佳Nt. BstNBI切割酶浓度为0.6 U/μL。
4. Bst. DNA聚合酶浓度优化
前期制备免疫磁珠的过程与上述操作相同，进行EXPAR实验时，Nt. BstNBI切割酶浓度为0.6 U/μL ，Bst. DNA聚合酶终浓度为0~0.1 U/μL，其余组分与优化反应时间时浓度保持一致。图7结果表明，当Bst. DNA聚合酶浓度达到0.06 U/μL时，吸光值达到最大，随着浓度的继续增大，吸光值有减小的趋势，这可能是由于聚合酶浓度过高时，其聚合速度大于切割速度而导致了非特异性扩增的发生，故最佳Bst. DNA聚合酶浓度为0.06 U/μL。
5. Hemin孵育时间优化
选择EXPAR的最佳优化条件进行扩增后，取扩增产物10 μL进行TMB显色实验后通过酶标仪测定其吸光值，Hemin的孵育时间在0~30 min范围内。如图8所示，在孵育时间为20min时吸光值达到最大，说明在较短时间内Hemin与G四链体已经达到了充分的反应，为节省时间成本，选择20 min为Hemin的最佳孵育时间。
6. Hemin浓度优化
选择EXPAR的最佳优化条件进行扩增后，将反应产物与0~60 μM 的Hemin孵育20min，利用TMB显色后通过酶标仪进行光谱分析，结果表明：随着Hemin浓度的增加，吸光值逐渐增加，说明Hemin浓度在一定程度上有助于提高显色效率，在达到40 μM时吸光值基本保持不变，因此最佳Hemin浓度为40 μM（图9）。
通过评估免疫磁珠加入谷胱甘肽的效果以及对EXPAR反应时间、Nt. BstNBI切割酶浓度、Bst. DNA聚合酶浓度和Hemin孵育时间和Hemin浓度的优化实验，得到制备免疫磁珠时需要添加谷胱甘肽，最佳EXPAR反应时间为30 min，Nt. BstNBI切割酶浓度为0.6 U/μL，Bst. DNA聚合酶浓度为0.06 U/μL，Hemin孵育时间为20 min，Hemin浓度为40 μM。
实施例5 纯培养条件下快速阪崎肠杆菌方法的灵敏度
将阪崎肠杆菌菌液以五倍梯度稀释各取50 μL用于制备三明治夹心结构，在进行EXPAR扩增后取10 μL产物进行显色反应，在450 nm波长下测定其吸光值，记为A，空白将菌溶液替换成无菌水，测得荧光值记为A0，将吸光值变化量为△A=(A-A0)与阪崎肠杆菌对数浓度做线性回归分析，见图10，检出限可达到2 CFU/mL。
实施例6 快速检测阪崎肠杆菌方法的特异性
为了评估所提出方法的特异性，选择可能存在于奶粉中的四种常见的致病微生物（单增李斯特菌，金黄色葡萄球菌，大肠杆菌和沙门氏菌）作为阴性参考，在450 nm波长下测定其吸光值，记为A，空白将菌液换成无菌水，测得吸光值记为A0，吸光值变化量为△A=(A-A0)。结果表明只有阪崎肠杆菌可以在A450产生高吸光值。即使非靶物质浓度较高时，它们所产生的信号也相对较弱，表明该方法对阪崎肠杆菌具有高特异性，结果如图11。
实施例8 奶粉中阪崎肠杆菌的快速测定
将上述优化的实验方法应用于奶粉基质中阪崎肠杆菌的测定。样品测定采用加标回收方法进行，将奶粉用无菌水按1:10稀释后进行巴氏杀菌，得奶粉基质为对照组。制备奶粉阳性添加样时，需在杀菌后的奶粉基质中加入已知浓度的阪崎肠杆菌菌液，得奶粉阳性液为样品实验组。与上述测定条件一致，读取其在450 nm波长下的吸光度值，结果如图12所示，其检测限可达10 CFU/g，计算加标回收率和相对标准偏差，加标回收率为91.7%~120%，相对标准偏差（RSD）为1.3%~2.12%，与此同时比较传统培养法的计数结果，可以看出两种方法检测结果相近，表明该方法对于实际检测具有良好的应用前景，结果如表4所示。
表4 加标回收率测定
*在最佳条件下三个平行实验的平均值
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种基于级联放大快速定量检测阪崎肠杆菌的方法
<130> S010220104002Y
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtggtcgggg tggtgggtgg gagggcgact tcatctgcgc 40
<210> 2
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtggtcgggg tggtgggtgg gagggcgact tcatctgcgc ttatacaacc tactacctca 60
ttcagactct tccctccctc cctcccag 88
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgaggtagta ggttgtat 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctgggaggga gggaggga 18
Claims (7)
1.一种基于级联放大的非疾病诊断阪崎肠杆菌的快速定量检测方法，其特征在于，所述方法包括：（1）磁富集；（2）抗体-核酸适体识别；（3）EXPAR体系；（4）脱氧核酶信号转换；
所述磁富集是指从复杂基质中直接捕获靶标；
所述抗体-核酸适体识别是指在缓冲液中形成抗体-靶标-融合核酸适体的免疫三明治夹心结构；
所述融合核酸适体的5’端是与靶标特异性结合的适体，3’端是EXPAR扩增的核酸模板；
所述融合核酸适体序列为：5'-GTGGTCGGGGTGGTGGGTGGGAGGGCGACTTCATCTGCGCTTATACAACCTACTACCTCATTCAGACTCTTCCCTCCCTCCCTCCCAG-PO4-3', 如SEQ ID NO.2所示；
所述缓冲液包括：40~60 mM Tris-HCl，10~20 mM NaCl，3~7 mM MgCl2，2~8 mM KCl，1~5mM 谷胱甘肽，pH 6~8；
所述EXPAR体系是在融合核酸适体识别靶标的基础上进行等温指数扩增；
所述脱氧核酶信号转换是等温扩增产物形成具有类酶活性的结构，实现靶标的可视化信号检测。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述磁富集是采用免疫磁珠从复杂基质中直接捕获靶标；
所述免疫磁珠是将靶标的特异性抗体通过EDC/NHS的方法偶联在磁珠表面，其偶联液包括：0.05~0.2 M 磷酸钠，0.15~0.3M NaCl，1~5 mM 谷胱甘肽，pH 6~8。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，EXPAR体系包括抗体-靶标-融合核酸适体的免疫三明治夹心结构、dNTPs、互补序列cDNA、Bst. 2.0 DNA 聚合酶及其ThermpolReaction Buffer、Nt.BstNBI切割酶、NEB 3.1缓冲液和ddH2O。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述脱氧核酶信号转换是等温扩增产物形成具有类酶活性的G四链体结构，实现靶标的可视化信号检测。
5.一种抗体-靶标-融合核酸适体的免疫三明治夹心结构，其特征在于，靶标与特异性抗体和融合核酸适体构成免疫三明治夹心结构；
所述融合核酸适体的5’端是与靶标特异性结合的适体，3’端是EXPAR扩增的核酸模板；
所述融合核酸适体序列为：5'-GTGGTCGGGGTGGTGGGTGGGAGGGCGACTTCATCTGCGCTTATACAACCTACTACCTCATTCAGACTCTTCCCTCCCTCCCTCCCAG-PO4-3', 如SEQ ID NO.2所示；
所述靶标为阪崎肠杆菌。
6.如权利要求5中所述的融合核酸适体在食品安全阪崎肠杆菌检测中的应用。
7.如权利要求1-4任一所述的检测方法在食品安全的阪崎肠杆菌检测中的应用。
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