CN104962608A - 一种基于双淬灭基团核酸自组装技术的双酚a检测方法及检测试剂盒 - Google Patents

一种基于双淬灭基团核酸自组装技术的双酚a检测方法及检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于双淬灭基团核酸自组装技术的双酚A检测方法及检测试剂盒。设计了2种茎环结构DNA，其中一个修饰荧光基团，另外一个修饰两个淬灭基团，在有双酚A存在的情况下，2种茎环结构DNA可不断开环杂交，从而使荧光基团和淬灭基团靠近，发生荧光能量转移，从而把荧光淬灭。本发明检测方法的信号扩增源于两个茎环DNA的不断开环互补，无需使用任何蛋白酶，操作简单，可在室温下完成反应，灵敏度高、选择性好。在其中一个茎环结构DNA上同时有2个淬灭基团，可更有效地淬灭另一茎环结构DNA上的荧光基团，从而有效地减少了荧光背景，极大地提高了检测灵敏度，检测限为0.4pM。

Description

一种基于双淬灭基团核酸自组装技术的双酚A检测方法及检测试剂盒
技术领域
本发明属于环境分析化学领域，涉及一种基于双淬灭基团核酸自组装技术的双酚A的检测方法及检测试剂盒。
背景技术
双酚A(Bisphenol A，BPA)广泛用于合成环养树脂，聚碳酸酯等多种高分子材料，随着现代包装业的快速发展，大量双酚A通过各种途径进入生态环境中，严重影响环境安全和人体健康。双酚A具有富集性，难以降解性，即使极低的浓度也会对内分泌系统、免疫系统、生殖系统产生一系列的不良影响，并与一系列癌症的发生密切相关。因此，对双酚A的检测具有重要意义。传统的双酚A检测技术主要有高效液相色谱法、气相色谱法、质谱法以及酶联免疫法等，这些技术需要繁琐的样品前处理和昂贵的仪器，检测成本高、费时耗力，难以广泛推广。而且传统的荧光检测法背景值较高，灵敏度较低，难以用于痕量污染物的检测。
发明内容
为了解决现有技术所存在的不足，本发明设计一种双淬灭基团核酸自组装技术的双酚A的检测方法，并研制检测试剂盒。
本发明所采取的技术方案是：
一种基于双淬灭基团核酸自组装技术的双酚A检测试剂盒，其包括以下组分：
(1)DNA1：由双酚A的核酸适体的5'端或3'端延伸至少24个碱基所形成，从5’至3’依次包括b*区域、a*区域和双酚A核酸适体区域；
(2)DNA2：DNA2与DNA1的a*区域和部分双酚A核酸适体区域互补；
(3)DNA H1：DNA H1上修饰有荧光基团，从5’至3’依次包括a、b、c和b*区域，b和b*区域互补形成茎环结构；
(4)DNA H2：DNA H2上修饰有荧光淬灭基团，从5’至3’依次包括b*、a*、b和c*区域，b和b*区域互补形成茎环结构；
以上DNA分子中，a、b、c区域分别与a*、b*、c*区域互补，DNA H2的c*和b区域分别与DNA H 1上的c和b*区域互补形成双链，从而使得DNA H1和DNA H2两个茎环结构打开，打开后的DNA H2中的荧光淬灭基团靠近DNA H1的荧光基团，从而把荧光淬灭。
作为优选的，所述DNA分子中，a区域的碱基数为6-9个，b区域的碱基数为12-24个，c区域的碱基数为6-9个。
作为优选的，所述DNA2中至少有9个碱基与DNA1中的双酚A核酸适体区域互补。
作为优选的，所述DNA H1的b区域末端修饰荧光信号；DNA H2的3’和5’末端修饰荧光淬灭基团。
作为优选的，所述双酚A的核酸适体的序列为：
5'-CCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCATCACGGGTTCGCACCA-3'。
进一步优选的，各DNA分子的序列如下所示：
DNA1的序列为：
5'-AGTCTAGGATTCGGCGTGGGTTAACCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCATCACGGGTTCGCACCA-3'(SEQ ID NO.1)；
DNA2的序列为：
5'-CTGACCACCCACCGGTTAACC-3'(SEQ ID NO.2)；
DNA H1的序列为：
5'-TTAACCCACGCCGAATCCTAGACTCAAAGTAGTCTAGGATTCGGCGTG-3'(SEQ IDNO.3)；
DNA H2的序列为：
5'-TTAACCCACGCCGAATCCTAGACTCAAAGTAGTCTAGGATTCGGCGTG-3'(SEQ IDNO.4)。
一种基于双淬灭基团核酸自组装技术的双酚A检测方法，包括如下步骤：
(1)将DNA1、DNA2分散于缓冲液中进行杂交反应；
(2)将待检样品加入步骤(1)的混合溶液中，室温反应10-60分钟；
(3)加入DNA H1和DNA H2，室温反应10-60分钟；
(4)检测反应体系的荧光强度，根据建立的标准曲线计算待检样品中双酚A的浓度；
其中，DNA1、DNA 2、DNA H1和DNA H2的序列组成如上任意一项所示。
作为优选的，步骤(1)所述缓冲液为20mMTric-HCl缓冲液，pH 7.4，含有100mMNaCl以及10mMMgCl2。
作为优选的，步骤(4)检测反应体系荧光强度的条件为：激发光490nm，发射峰530nm。
双酚A核酸适体，其为如下核苷酸序列所示DNA分子或者是与其互补的核苷酸序列所示的DNA分子：
5'-CCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCATCACGGGTTCGCACCA-3'(SEQ ID NO.5)。
本发明的有益效果是：
本发明检测方法的信号扩增源于两个茎环DNA的不断开环互补，无需使用任何蛋白酶，操作简单，可在室温下完成反应，灵敏度高、选择性好。在其中一个茎环结构DNA上同时有2个淬灭基团，可更有效地淬灭另一茎环结构DNA上的荧光基团，从而有效地减少了荧光背景，极大地提高了检测灵敏度，检测限为0.4pM。
附图说明
图1为本发明所述的检测方法的原理图；
图2为对不同浓度的双酚A测的结果图；
图3为特异性实验结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1
一种基于双淬灭基团核酸自组装技术的双酚A检测试剂盒，包括以下组分：
(1)DNA1，双酚A的核酸适体的5'端或3'端延伸，形成DNA1，其包括b*区域、a*区域和双酚A核酸适体区域，序列如下所示：
b*a*双酚A的核酸适体
5'-AGTCTAGGATTCGGCGTG--GGTTAA--CCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCATCACGGGTTCGCACCA-3'(SEQ ID NO.1)；
(2)DNA2，DNA2与DNA1的a*区域和部分双酚A核酸适体区域互补，序列如下所示：
a
5'-CTGACCACCCACCGG--TTAACC-3'(SEQ ID NO.2)；
(3)DNA H1，5'端第24个碱基T修饰荧光基团FAM，序列如下所示：
a              b              c             b*
5'-TTAACC--CACGCCGAATCCTAGACT--CAAAGT--AGTCTAGGATTCGGCGTG-3'(SEQ ID NO.3)；
其包括a、b、c和b*区域，b和b*区域互补形成茎环结构。
(4)DNA H2，5'和3'都修饰淬灭基团Dabcyl，序列如下所示：
b*            a*             b             c*
5'-AGTCTAGGATTCGGCGTG--GGTTAA--CACGCCGAATCCTAGACT--ACTTTG-3'(SEQ ID NO.4)
其包括b*、a*、b和c*区域，b和b*区域互补形成茎环结构，DNA H2的c*和b区域分别与DNA H 1上的c和b*区域互补。
(5)20mMTric-HCl缓冲液(pH 7.4，含有100mMNaCl以及10mMMgCl2)。
本试剂盒的工作原理为：
1)将DNA1和DNA2在缓冲体系中反应一段时间，形成DNA1-DNA2复合物，在DNA1-DNA2复合物中，DNA1中的a*区域被DNA2封闭。
2)将待检样品加入到DNA1-DNA2反应体系中，如果样品中含有双酚A将与核酸适体相互作用，从而把DNA2置换下来，使DNA1中的a*区域暴露出来。
3)加入DNA H1和DNA H2，DNA1中a*和b*区域与DNA H1中的a和b区域互补杂交，从而把DNA H1的茎环结构打开；打开后的DNA H1上的c和b*区域与DNA H2中的c*和b区域互补杂交，从而会把DNA H2茎环结构打开；打开后的DNA H2上的a*和b*区域又会与DNA H1上的a和b区域互补杂交，从而使者两个茎环结构DNA不断重复打开。打开后的DNA H2中的两个淬灭基团会靠近DNA H1的荧光基团，从而把荧光淬灭，荧光强度下降，从而达到检测双酚A的目的。
实施例2
一种基于双淬灭基团核酸自组装技术的双酚A检测方法，包括如下步骤：
(1)所有DNA都分别用20mMTric-HCl缓冲液溶解，100nM的DNA1与400nM的DNA2在Tric-HCl缓冲液中杂交反应20分钟，形成DNA1-DNA2复合物；
(2)将待检样品加入到DNA1-DNA2复合物，室温反应45分钟；
(3)加入1mM的DNA H1和1mM的DNA H2，室温反应60分钟，然后记录体系的荧光强度，激发光是490nm，发射峰是530nm，根据已建立的标准曲线计算待检样品中双酚A的浓度。
实施例3
对不同浓度双酚A的检测：
配制双酚A标准溶液，浓度分别为1pM、10pM、100pM、1nM、10nM和100nM，室温保存。
将不同浓度的双酚A溶液分别加到实施例1中所述的反应体系中，充分反应后检测荧光强度，如图2所示，随着双酚A浓度的增加，荧光强度下降，当双酚A浓度超过10nM时，逐渐达到饱和。以双酚A浓度的对数(lgC)为横坐标，荧光强度比值(F0/F)为纵坐标，绘制标准曲线，二者具有很好的线性关系，线性范围是从1pM到10nM，线性方程是：F0/F＝1.49lgC+0.54(R＝0.945)，(F0：初始荧光强度；F：不同浓度双酚A对应的荧光强度；C：双酚A浓度)，按照3倍信噪比标准(3S/N)，检测限为0.4pM。
实施例4
特异性实验：
配制浓度为100nM的不同干扰物标准溶液，分别是双酚B、雌三醇、17β-雌二醇、孕酮、西维因、洁霉素以及丝裂霉素。
将100nM的不同干扰物标准溶液和1nM双酚A标准溶液分别加到实施例1中所述的反应体系中，充分反应后检测荧光强度，如图3所示，100nM的双酚B、雌三醇、17β-雌二醇、孕酮、西维因、洁霉素以及丝裂霉素的荧光强度几乎没有变化，与空白类似，对检测不产生影响。只有当加入双酚A才会使荧光强度急剧下降，这证明该方法对双酚A的检测具有很好的特异性。
以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。
<110>  广东省生态环境与土壤研究所
 
<120>  一种基于双淬灭基团核酸自组装技术的双酚A检测方法及检测试剂盒
 
<130> 
 
<160>  5    
 
<170>  PatentIn version 3.5
 
<210>  1
<211>  87
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  1
agtctaggat tcggcgtggg ttaaccggtg ggtggtcagg tgggatagcg ttccgcgtat       60
 
ggcccagcgc atcacgggtt cgcacca                                           87
 
 
<210>  2
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  2
ctgaccaccc accggttaac c                                                 21
 
 
<210>  3
<211>  48
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  3
ttaacccacg ccgaatccta gactcaaagt agtctaggat tcggcgtg                    48
 
 
<210>  4
<211>  48
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  4
ttaacccacg ccgaatccta gactcaaagt agtctaggat tcggcgtg                    48
 
 
<210>  5
<211>  63
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  5
ccggtgggtg gtcaggtggg atagcgttcc gcgtatggcc cagcgcatca cgggttcgca       60
 
cca                                                                     63

Claims (10)

1.一种基于双淬灭基团核酸自组装技术的双酚A检测试剂盒，其包括以下组分：
（1）DNA1：由双酚A的核酸适体的5'端或3'端延伸至少24个碱基所形成，从5’至3’依次包括b*区域、a*区域和双酚A核酸适体区域；
（2）DNA2：DNA2与DNA1的a*区域和部分双酚A核酸适体区域互补；
（3）DNA H1：DNA H1上修饰有荧光基团，从5’至3’依次包括a、b、c和b*区域，b和b*区域互补形成茎环结构；
（4）DNA H2：DNA H2上修饰有荧光淬灭基团，从5’至3’依次包括b*、a*、b和c*区域，b和b*区域互补形成茎环结构；
以上DNA分子中，a、b、c区域分别与a*、b*、c*区域互补，DNA H2的c*和b区域分别与DNA H 1上的c和b*区域互补形成双链，从而使得DNA H1和DNA H2两个茎环结构打开，打开后的DNA H2中的荧光淬灭基团靠近DNA H1的荧光基团，从而把荧光淬灭。
2.根据权利要求1所述的双酚A检测试剂盒，其特征在于，所述DNA分子中， a区域的碱基数为6-9个，b区域的碱基数为12-24个，c区域的碱基数为6-9个。
3.根据权利要求1所述的双酚A检测试剂盒，其特征在于，所述DNA2中至少有9个碱基与DNA1中的双酚A核酸适体区域互补。
4.根据权利要求1所述的双酚A检测试剂盒，其特征在于，所述DNA H1的b区域末端修饰荧光信号；DNA H2的3’和5’末端修饰荧光淬灭基团。
5.根据权利要求1所述的双酚A检测试剂盒，其特征在于，所述双酚A的核酸适体的序列为：5'-CCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCATCACGGGTTCGCACCA-3'。
6.根据权利要求1-5任一项所述的双酚A检测试剂盒，其特征在于：
DNA1的序列为：
5'-AGTCTAGGATTCGGCGTGGGTTAACCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCATCACGGGTTCGCACCA-3'；
DNA2的序列为：
5'-CTGACCACCCACCGGTTAACC-3'；
DNA H1的序列为：
5'-TTAACCCACGCCGAATCCTAGACTCAAAGTAGTCTAGGATTCGGCGTG-3'；
DNA H2的序列为：
5'-TTAACCCACGCCGAATCCTAGACTCAAAGTAGTCTAGGATTCGGCGTG-3'。
7.一种基于双淬灭基团核酸自组装技术的双酚A检测方法，包括如下步骤：
（1）将DNA1、DNA2分散于缓冲液中进行杂交反应；
（2）将待检样品加入步骤（1）的混合溶液中，室温反应10-60分钟；
（3）加入DNA H1和DNA H2，室温反应10-60分钟；
（4）检测反应体系的荧光强度，根据建立的标准曲线计算待检样品中双酚A的浓度；
其中，DNA1、DNA 2、DNA H1和DNA H2的序列组成如权利要求1～6任意一项所示。
8.根据权利要求7所述的双酚A检测方法，其特征在于，步骤（1）所述缓冲液为20 mMTric-HCl缓冲液，pH 7.4，含有100 mMNaCl以及10 mMMgCl2。
9.根据权利要求7所述的双酚A检测方法，其特征在于，步骤（4）检测反应体系荧光强度的条件为：激发光490 nm，发射峰530 nm。
10.双酚A核酸适体，其为如下核苷酸序列所示DNA分子或者是与其互补的核苷酸序列所示的DNA分子：
5'-CCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCATCACGGGTTCGCACCA-3'。
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