CN107643401A - 一种双酚a的检测方法及检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种双酚A的检测方法及检测试剂盒，属于环境污染物快速检测领域。本发明以双酚A单抗以及双酚A核酸适体为分子识别元件实现双识别，从而提高检测特异性，降低检测交叉反应，进一步通过DNA支点介导的链置换反应，释放具有催化活性的G四聚体核酸序列，形成的G四聚体具有类似辣根过氧化物酶催化活性，可催化使无色底物变成蓝色，双酚A浓度与蓝色变化成正相关，从而可以判断检测体系中的双酚A浓度。本发明灵敏度高，特异性好，常见的其他干扰物对检测不产生影响。检测过程无需检测仪器，结果直接肉眼可见，具有操作简单，成本低廉，响应迅速等优点，可用于不同样品中双酚A含量的快速检测。

Description

一种双酚A的检测方法及检测试剂盒

技术领域

本发明属于环境污染物快速检测领域，具体涉及一种双酚A的检测方法及检测试剂盒。

背景技术

双酚A(Bisphenol A，BPA)常被用来合成聚碳酸酯(PC)和环氧树脂等材料，是制造塑料(奶)瓶、幼儿用的吸口杯、食品和饮料(奶粉)罐内侧涂层等的主要原料。BPA具有很强的致癌性，常导致内分泌失调，诱发性早熟，威胁着胎儿和儿童的健康。传统的BPA检测主要依赖质谱色谱技术，包括HPLC、GC、HPLC-MS/MS等，虽然这些技术具有较高的灵敏度，当往往需要繁琐的样品前处理以及昂贵的检测仪器，难以用于现场快速检测，因此，迫切需要研制一种能用于BPA快速检测新技术，尤其是能实现检测结果直接肉眼可见具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种双酚A的检测方法及检测试剂盒，涉及抗体与核酸适体双识别，结合G四聚体，用于双酚A的可视化快速检测。

本发明所采取的技术方案是：

一种双酚A的检测试剂盒，包括缓冲液、氯高铁血红素、固定有双酚A单抗的磁珠、核酸DNA1和DNA茎环结构H1，其中：

核酸DNA1包括a区域和b区域；a是双酚A的核酸适体序列；

DNA茎环结构H1依次具有c区域、d区域和e区域；其中e区域是G四聚体序列，且e区域的部分核酸序列与d区域核酸序列互补配对形成茎环结构的茎部分，e区域的剩余核酸序列形成茎环结构的环部分，c区域的核酸序列凸出在茎环结构外侧；

DNA1的b区域和H1的c区域和d区域的核酸序列互补配对。

优选的，核酸DNA1中a区域的序列为：

5'-CCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCATCACGGGTTC GCACCA-3'(SEQ ID NO：1)。

优选的，DNA茎环结构H1中e区域的序列(G四聚体序列)包含有四组GGG序列，各组GGG序列中间隔1-3个非G碱基。

优选的，DNA茎环结构H1中e区域的序列为：5'-GGGTAGGGCGGGTTGGG-3'(SEQ IDNO：2)。

优选的，c区域的碱基数为5-8个，更优选为6个。

优选的，核酸DNA1的序列为:

5'-CCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCATCACGGGTTC GCACCA-GTTGGGTCGAGT-3'(SEQ ID NO：3)。

优选的，DNA茎环结构H1的序列为：5'-

ACTCGA-CCCAAC-GGGTAGGGCGGGTTGGG-3'(SEQ ID NO：4)。

优选的，双酚A单抗上修饰有一定基团，使双酚A单抗能结合固定在磁珠上；或可采用其他方法固定。

优选的，缓冲液包括反应缓冲液和显色缓冲液。

优选的，反应缓冲液为Tris-HCl缓冲液，pH7.4，含有100mM NaCl以及25mM KCl。

优选的，显色缓冲液，包含有26.6mM柠檬酸，51.4mM磷酸氢二钠，25mM KCl，10L0.5％的TMB，20L 30％的H₂O₂，pH为5.0。

优选的，试剂盒还包括磁性部件，如磁铁。

一种双酚A的检测方法，包括下列步骤：

在反应缓冲液中加入固定有双酚A单抗的磁珠，以及待测样品充分反应；

加入适量的DNA1，充分反应，磁珠分离后去除多余的DNA1；

加入适量的H1，充分反应；

加入氯高铁血红素，充分反应；

取上述反应液，加入到显色缓冲液中，通过溶液的颜色变化来判断结果；

其中固定有双酚A单抗的磁珠、核酸DNA1、茎环结构H1、反应缓冲液和显色缓冲液如上任一项所述。

本发明技术的核心点在于：

1、抗体与核酸适体双识别。即磁珠上修饰抗体可与双酚A识别，同时DNA1中的核酸适体也会与双酚A识别。

2、双识别后，有DNA序列能够打开茎环结构核酸，释放封闭的G四聚体序列。也即，抗体识别和核酸适体识别相接合。在本发明中，只用仅抗体识别，无法完成后面的检测。如果只是用单抗单识别，一些结构类似物，像双酚B、双酚C会产生非特异结合，因为抗体能与这些结构类似物非特异结合。而双酚A的核酸适体具有更高的特异性，甚至能区分微小结构差异，不会与双酚B、双酚C等产生非特异性结合。

3、以H1中的c部分为DNA支点介导的链置换反应。

本发明的有益效果是：

(1)采用双酚A单抗以及核适体进行双识别双酚A，大大提高了检测的特异性，有效地避免了交叉反应。

(2)以核酸G四聚体为信号报告分子，检测结果直接肉眼可见，无需检测仪器。整个检测过程响应迅速，无需专业训练即可掌握操作流程，便于快速推广使用。

附图说明

图1为为双酚A检测原理示意图；

图2为不同浓度的双酚A的检测结果；

图3为特异性实验结果。

具体实施方式

本发明的反应原理如下：

一种双酚A的检测方法，包括以下步骤：(图1所示)

(1)双酚A单抗固定在磁珠上，磁珠分离后去除多余的单抗，加入待检测物双酚A。

(2)单抗捕获双酚A，加入核酸DNA1，DNA1包含两部分，分别是a和b，其中a是双酚A的核酸适体，b是后续启动序列；DNA1的a部分进一步与BPA结合，磁珠分离后去除多余的DNA1。

(3)加入茎环结构的核酸H1，在H1中包含三部分，分别是c、d以及e；其中c可作为DNA置换反应的支点，d部分处于H1的茎部分，e部分是G四聚体序列。没有打开的H1中e处于封闭状态，没有催化活性。

(4)以H1中的c部分为DNA链置换反应的支点，DNA1中的b部分与H1的c以及d部分互补，从而打开H1，使H1的e部分暴露出来。

(5)加入氯高铁血红素(Hemin)后，e部分会形成具有催化活性的G四聚体结构。它们能催化氧化TMB-H₂O₂(四甲基联苯胺-双氧水)检测体系，产生蓝色的底物，结果肉眼可见，从而达到检测双酚A的目的。没有双酚A时，体系是无色的。

下面通过具体实施例对本发明进一步阐述，但不限于此。

实施例1

一种双酚A的检测试剂盒，包括以下成分：

(1)核酸DNA1、H1，序列如下：

DNA1:5'-CCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCATCACGGGTTCGCACCA(a)-GTTGGGTCGAGT(b)-3'(SEQ ID NO：3)；

H1:5'-ACTCGA(c)-CCCAAC(d)-GGGTAGGGCGGGTTGGG(e)-3'(SEQ ID NO：4)；

(2)生物素修饰的双酚A单抗；

(3)链霉亲和素修饰的磁珠溶液；

(4)磁铁；

(5)双酚A标准溶液；

(6)20mM Tris-HCl缓冲液，pH7.4，含有100mM NaCl以及25mM KCl；

(7)氯高铁血红素溶液；

(8)显色缓冲液，包含有26.6mM柠檬酸，51.4mM磷酸氢二钠，25mM KCl，10μL 0.5％的TMB，20μL 30％的H₂O₂，pH＝5.0。

实施例2

一种双酚A的检测方法，按照如下步骤进行：

(1)2mg/mL生物素修饰的双酚A单抗用20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4，含有100mMNaCl以及25mM KCl)充分溶解，加入到1.5mg/mL链霉亲和素修饰的磁珠溶液中，充分混匀，室温反应30分钟，磁珠分离后去除多余的抗体。

(2)加入不同浓度的双酚A或待测溶液，充分混匀，室温反应40分钟。

(3)加入200nM的DNA1，充分混匀，室温反应30分钟，磁珠分离后去除多余的DNA1。

(4)加入300nM的H1，充分混匀，室温反应40分钟。

(5)加入0.5M的hemin溶液(氯高铁血红素)，充分混匀，室温反应30分钟。

(6)取出步骤(5)中的50L反应液，加入到950L显色缓冲液中(含有26.6mM柠檬酸，51.4mM磷酸氢二钠，25mM KCl，10L 0.5％的TMB，20L 30％的H₂O₂，pH＝5.0)，室温反应15分钟，观察颜色变化。当有双酚A时，溶液变蓝，当没有双酚A时，溶液无色。

其中固定有双酚A单抗的磁珠、核酸DNA1、茎环结构H1、反应缓冲液和显色缓冲液如上实施例1所述。

实施例3

对不同浓度双酚A的检测：

配制双酚A标准溶液，浓度分别为0.1nM、1nM、10nM、50nM、100nM、250nM。

将不同浓度双酚A溶液分别加到实施例2中所述的反应体系中，充分反应后观察实验结果，如图2所示，0.1nM的双酚A可产生明显的蓝色变化，说明其检测限为0.1nM。随着双酚A浓度增加，颜色也增加，并逐渐趋于饱和。

实施例4

特异性实验：

配制50nM的对照物溶液，它们分别是雌二醇、雌三醇、双酚B、双酚C、莠去津、己烯雌酚。

将50nM的对照物溶液和50nM的双酚A溶液分别加到实施例2中所述的反应体系中，充分反应后观察颜色变化，如图3所示，50nM的雌二醇、雌三醇、双酚B、双酚C、莠去津、己烯雌酚没有产生颜色变化，对检测不产生影响。只有当加入双酚A溶液后才会产生蓝色，这证明该方法对双酚A的检测具有很好的特异性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东省生态环境技术研究所

<120> 一种双酚A的检测方法及检测试剂盒

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ccggtgggtg gtcaggtggg atagcgttcc gcgtatggcc cagcgcatca cgggttcgca 60

cca 63

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gggtagggcg ggttggg 17

<210> 3

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccggtgggtg gtcaggtggg atagcgttcc gcgtatggcc cagcgcatca cgggttcgca 60

ccagttgggt cgagt 75

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

actcgaccca acgggtaggg cgggttggg 29

Claims (10)

1.一种双酚A的检测试剂盒，其特征在于：包括缓冲液、氯高铁血红素、固定有双酚A单抗的磁珠、核酸DNA1和DNA茎环结构H1，其中：

核酸DNA1包括a区域和b区域；a是双酚A的核酸适体序列；

DNA茎环结构H1依次具有c区域、d区域和e区域；其中e区域是G四聚体序列，且e区域的部分核酸序列与d区域核酸序列互补配对形成茎环结构的茎部分，e区域的剩余核酸序列形成茎环结构的环部分，c区域的核酸序列凸出在茎环结构外侧；

DNA1的b区域和H1的c区域和d区域的核酸序列互补配对。

2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：核酸DNA1中a区域的序列为：

5'-CCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCATCACGGGTTCGCACCA-3'。

3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：DNA茎环结构H1中e区域的序列包含有四组GGG序列，各组GGG序列中间隔1-3个非G碱基。

4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于：DNA茎环结构H1中e区域的序列为：

5'-GGGTAGGGCGGGTTGGG-3'。

5.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：c区域的碱基数为5-8个。

6.根据权利要求1或2所述的检测试剂盒，其特征在于：DNA1的序列为:

5'-CCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCATCACGGGTTCGCACCA-GTTGGGTCGAGT-3'。

7.根据权利要求1-5任一项所述的检测试剂盒，其特征在于：DNA茎环结构H1的序列为：

5'-ACTCGA-CCCAAC-GGGTAGGGCGGGTTGGG-3'。

8.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：缓冲液包括反应缓冲液和显色缓冲液，反应缓冲液为Tris-HCl缓冲液，pH7.4，含有100mM NaCl以及25mM KCl。

9.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：缓冲液包括反应缓冲液和显色缓冲液，显色缓冲液，包含有26.6mM柠檬酸，51.4mM磷酸氢二钠，25mM KCl，10L 0.5％的TMB，20L30％的H₂O₂，pH为5.0。

10.一种双酚A的检测方法，其特征在于，包括下列步骤：

在反应缓冲液中加入固定有双酚A单抗的磁珠，以及待测样品充分反应；

加入适量的DNA1，充分反应，磁珠分离后去除多余的DNA1；

加入适量的H1，充分反应；

加入氯高铁血红素，充分反应；

取上述反应液，加入到显色缓冲液中，通过溶液的颜色变化来判断结果；

其中固定有双酚A单抗的磁珠、核酸DNA1、茎环结构H1、反应缓冲液和显色缓冲液如权利要求1-9任一项所述。