CN109791157A - 使用具有条形码化的寡核苷酸序列的试剂测量蛋白质表达 - Google Patents

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Abstract

本文披露的一些实施例提供了多个组合物，这些组合物各自包括与寡核苷酸缀合的蛋白质结合试剂。该寡核苷酸包括与该蛋白质结合试剂缀合的该蛋白质结合试剂的独特标识，并且该蛋白质结合试剂能够特异性结合蛋白质靶。进一步披露了用于定量分析样品中多个蛋白质靶以及用于同时定量分析样品中蛋白质和核酸靶的方法和试剂盒。本文还披露了用于制备经标记的生物分子试剂的系统和方法，该经标记的生物分子试剂包括经标记的生物分子剂，该经标记的生物分子剂包括与寡核苷酸缀合的蛋白质结合试剂。

Description

使用具有条形码化的寡核苷酸序列的试剂测量蛋白质表达
相关申请的交叉引用
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求于2016年9月26日提交的美国临时专利号62/399,795、2017年2月27日提交美国临时专利号62/464279、和2017年6月6日提交的美国临时专利号62/515,952的优先权，这些相关申请中每个申请的内容在此通过引用以其全文明确地并入本文中。
序列表的引用
本申请是连同电子格式的序列表一起提交的。序列表被提供为题为Sequence_Listing_BDCRI_025A.txt的文件，创建于2017年9月24日，大小是2,988个字节。将电子格式的序列表的信息通过引用以其全文并入本文。
背景
技术领域
本披露总体上涉及分子生物学，并更具体地涉及蛋白质表达和基因表达的同时测量。
相关技术说明
当前技术允许以大量平行方式(例如，>10,000个细胞)通过将细胞特异性寡核苷酸条形码附着于来自单个细胞的聚(A)mRNA分子测量单个细胞的基因表达，因为这些细胞中的每一个与皮升微孔中条形码化的试剂珠共定位。其他可用的技术允许一次测量96至384个单个细胞的基因表达。可以通过首先用荧光抗体标记细胞并通过流式分选仪分选细胞(例如，BD FACSseq仪)实现索引分选。FACSseq是一种经济实惠的流式分选仪，允许进行一次参数分选。对于想要检查多种蛋白质表达的研究人员来说，他们将需要更复杂的多色流式分选仪。
存在对能够定量分析蛋白质表达的方法和系统以及允许同时测量细胞中蛋白质表达和基因表达的方法和系统的需要。
发明内容
本文披露的一些实施例提供多个组合物，其各自包括与寡核苷酸缀合的蛋白质结合试剂，其中该寡核苷酸包括与该蛋白质结合试剂缀合的该蛋白质结合试剂的独特标识，并且该蛋白质结合试剂能够特异性结合蛋白质靶。在一些实施例中，独特标识包括长度为25-45个核苷酸的核苷酸序列。在一些实施例中，独特标识选自独特标识的多元组。在一些实施例中，独特标识的多元组包括至少100种不同的独特标识。在一些实施例中，独特标识的多元组包括至少1,000种不同的独特标识。在一些实施例中，独特标识的多元组包括至少10,000种不同的独特标识。在一些实施例中，多个组合物包括多个抗体、多个适配子、或其组合。在一些实施例中，寡核苷酸通过接头与蛋白质结合试剂缀合。在一些实施例中，该接头包括化学基团。在一些实施例中，该寡核苷酸包括接头。在一些实施例中，该化学基团可逆地附接至蛋白质结合试剂。在一些实施例中，该化学基团选自下组，该组由以下组成：UV可光解基团、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、及其任何组合。在一些实施例中，该独特标识与样品的基因组序列不同源。在一些实施例中，该样品是单个细胞、多个细胞、组织、肿瘤样品、或其任何组合。在一些实施例中，该样品是哺乳动物样品、细菌样品、病毒样品、酵母样品、真菌样品、或其任何组合。在一些实施例中，寡核苷酸包括条形码序列(例如，分子标记序列)、聚(A)尾、或其组合。在一些实施例中，多个组合物包括至少100种不同的蛋白质结合试剂。在一些实施例中，多个组合物包括至少100种不同的蛋白质结合试剂。在一些实施例中，多个组合物包括至少1,000种不同的蛋白质结合试剂。在一些实施例中，多个组合物包括至少10,000种不同的蛋白质结合试剂。在一些实施例中，每种蛋白质结合试剂与一个或多个寡核苷酸缀合，这些寡核苷酸包括选自一组至少10种不同的条形码序列中的至少一种条形码序列。在一些实施例中，每种蛋白质结合试剂与一个或多个寡核苷酸缀合，这些寡核苷酸包括选自一组至少100种不同的条形码序列中的至少一种条形码序列。在一些实施例中，每种蛋白质结合试剂与一个或多个寡核苷酸缀合，这些寡核苷酸包括选自一组至少1,000种不同的条形码序列中的至少一种条形码序列。多个组合物可以进一步包括不与寡核苷酸缀合的第二蛋白质结合试剂。蛋白质结合试剂和第二蛋白质结合试剂可以是相同的。在一些实施例中，多个组合物能够特异性结合多个蛋白质靶。在一些实施例中，该多个蛋白质靶包括细胞表面蛋白质、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、抗体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、或其任何组合。在一些实施例中，多个蛋白质靶包括10-400种不同的蛋白质靶。
本文披露的一些实施例提供了对样品中多个蛋白质靶进行定量分析的方法，该方法包括：提供包括多个蛋白质靶的样品；提供多个组合物，每个组合物包括与寡核苷酸缀合的蛋白质结合试剂，其中该寡核苷酸包括与该蛋白质结合试剂缀合的该蛋白质结合试剂的独特标识，并且该蛋白质结合试剂能够特异性结合该多个蛋白质靶中的至少一个；将该多个组合物与样品接触用于与该多个蛋白质靶特异性结合；去除未结合的组合物；提供多个寡核苷酸探针，其中该多个寡核苷酸探针中的每个包括靶结合区和条形码序列(例如，分子标记序列)，其中该条形码序列来自独特条形码序列的多元组；使该多个寡核苷酸探针与该多个组合物的寡核苷酸接触；延伸与这些寡核苷酸杂交的寡核苷酸探针以产生多个经标记的核酸，其中每个经标记的核酸包括独特标识和条形码序列；并确定针对每种独特标识的独特条形码序列的数量，凭此确定样品中每种蛋白质靶的数量。在一些实施例中，独特标识包括长度为25-45个核苷酸的核苷酸序列。在一些实施例中，独特标识选自独特标识的多元组。在一些实施例中，独特标识的多元组包括至少100种不同的独特标识。在一些实施例中，独特标识的多元组包括至少1,000种不同的独特标识。在一些实施例中，独特标识的多元组包括至少10,000种不同的独特标识。在一些实施例中，多个组合物包括多个抗体、多个适配子、或其组合。在一些实施例中，寡核苷酸通过接头与蛋白质结合试剂缀合。在一些实施例中，该接头包括化学基团。在一些实施例中，该寡核苷酸包括接头。在一些实施例中，该化学基团可逆地附接至蛋白质结合试剂。在一些实施例中，该化学基团选自下组，该组由以下组成：UV可光解基团、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、及其任何组合。在一些实施例中，样品包括单个细胞。在一些实施例中，多个蛋白质靶在单个细胞的表面表达。在一些实施例中，去除未结合的组合物包括用洗涤缓冲液洗涤单个细胞。在一些实施例中，这些方法包括裂解单个细胞。在一些实施例中，这些方法包括从蛋白质结合试剂中分离寡核苷酸。在一些实施例中，通过UV光解、化学处理(二硫苏糖醇)、加热、酶处理、或其任何组合将寡核苷酸从蛋白质结合试剂中分离。在一些实施例中，寡核苷酸探针中的每一个包括细胞标记、通用引物的结合位点、或其任何组合。在一些实施例中，靶结合区包括聚(dT)。在一些实施例中，多个寡核苷酸探针被固定在固体支持物上。在一些实施例中，固体支持物是珠。在一些实施例中，这些方法进一步包括扩增多个经标记的核酸以产生多个扩增子。在一些实施例中，扩增包括对条形码序列的至少一部分和独特标识的至少一部分进行PCR扩增。在一些实施例中，独特条形码序列的多元组包括至少100个独特条形码序列。在一些实施例中，独特条形码序列的多元组包括至少1,000个独特条形码序列。在一些实施例中，独特条形码序列的多元组包括至少10,000个独特条形码序列。多个组合物可以进一步包括不与寡核苷酸缀合的第二蛋白质结合试剂。蛋白质结合试剂和第二蛋白质结合试剂可以是相同的。在一些实施例中，这些方法进一步包括对多个扩增子进行测序。在一些实施例中，测序包括对条形码序列的至少一部分和独特标识的至少一部分进行测序。
本文披露的一些实施例提供了对样品中多个蛋白质靶和多个核酸靶分子进行同时定量分析的方法，该方法包括：提供包括多个蛋白质靶和多个核酸靶分子的样品；提供多个组合物，每个组合物包括与寡核苷酸缀合的蛋白质结合试剂，其中该寡核苷酸包括与该蛋白质结合试剂缀合的该蛋白质结合试剂的独特标识，并且该蛋白质结合试剂能够特异性结合该多个蛋白质靶中的至少一个；将该多个组合物与样品接触用于与该多个蛋白质靶特异性结合；去除未结合的组合物；提供多个寡核苷酸探针，其中该多个寡核苷酸探针中的每个包括靶结合区和条形码序列(例如，分子标记序列)，其中该条形码序列来自独特条形码序列的多元组；使该多个寡核苷酸探针与这些组合物的寡核苷酸和该多个核酸靶分子接触用于杂交；延伸与这些寡核苷酸和核酸靶分子杂交的寡核苷酸探针以产生多个经标记的核酸，其中每个经标记的核酸包括独特标识或核酸靶分子，以及条形码序列；并确定针对每种独特标识和每种核酸靶分子的独特条形码序列的数量，凭此确定样品中每种蛋白质靶和每种核酸靶分子的数量。在一些实施例中，独特标识包括长度为25-45个核苷酸的核苷酸序列。在一些实施例中，独特标识选自独特标识的多元组。在一些实施例中，独特标识的多元组包括至少100种不同的独特标识。在一些实施例中，独特标识的多元组包括至少1,000种不同的独特标识。在一些实施例中，独特标识的多元组包括至少10,000种不同的独特标识。在一些实施例中，多个组合物包括多个抗体、多个适配子、或其组合。在一些实施例中，寡核苷酸通过接头与蛋白质结合试剂缀合。在一些实施例中，该接头包括化学基团。在一些实施例中，该寡核苷酸包括接头。在一些实施例中，该化学基团可逆地附接至蛋白质结合试剂。在一些实施例中，该化学基团选自下组，该组由以下组成：UV可光解基团、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、及其任何组合。在一些实施例中，样品包括单个细胞。在一些实施例中，多个蛋白质靶在单个细胞的表面表达。在一些实施例中，去除未结合的组合物包括用洗涤缓冲液洗涤单个细胞。在一些实施例中，这些方法包括裂解单个细胞。在一些实施例中，这些方法包括从蛋白质结合试剂中分离寡核苷酸。在一些实施例中，通过UV光解、化学处理(二硫苏糖醇)、加热、酶处理、或其任何组合将寡核苷酸从蛋白质结合试剂中分离。在一些实施例中，寡核苷酸探针中的每一个包括细胞标记、通用引物的结合位点、或其任何组合。在一些实施例中，靶结合区包括聚(dT)。在一些实施例中，多个寡核苷酸探针被固定在固体支持物上。在一些实施例中，固体支持物是珠。在一些实施例中，这些方法进一步包括扩增多个经标记的核酸以产生多个扩增子。在一些实施例中，扩增包括对条形码序列的至少一部分、独特标识的至少一部分和核酸靶分子的至少一部分进行PCR扩增。在一些实施例中，独特条形码序列的多元组包括至少100个独特条形码序列。在一些实施例中，独特条形码序列的多元组包括至少1,000个独特条形码序列。在一些实施例中，独特条形码序列的多元组包括至少10,000个独特条形码序列。多个组合物可以进一步包括不与寡核苷酸缀合的第二蛋白质结合试剂。蛋白质结合试剂和第二蛋白质结合试剂可以是相同的。在一些实施例中，这些方法进一步包括对多个扩增子进行测序。在一些实施例中，测序包括对条形码序列的至少一部分、独特标识的至少一部分和核酸靶分子的至少一部分进行测序。
本文披露的一些实施例提供了用于对样品中多个蛋白质靶和多个核酸靶分子进行同时定量分析的试剂盒，该试剂盒包括多个组合物(这些组合物中的每个包括与寡核苷酸缀合的蛋白质结合试剂，其中该寡核苷酸包括与蛋白质结合试剂缀合的该蛋白质结合试剂的独特标识并且该蛋白质结合试剂能够特异性结合蛋白质靶)和多个寡核苷酸探针，其中该多个寡核苷酸探针中的每个包括靶结合区和条形码序列(例如，分子标记序列)，其中该条形码序列来自独特条形码序列的多元组。本文披露的内容包括用于对样品中多个蛋白质靶和多个核酸靶分子进行同时定量分析的试剂盒，该试剂盒包括多个组合物(这些组合物中的每个包括各自与寡核苷酸缀合的两个或更多个蛋白质结合试剂，其中该寡核苷酸包括与两个或更多个蛋白质结合试剂中一个缀合的该两个或更多个蛋白质结合试剂中一个的独特标识，并且这些蛋白质结合试剂能够特异性结合蛋白质靶)和多个寡核苷酸探针，其中该多个寡核苷酸探针中的每个包括靶结合区和条形码序列(例如，分子标记序列)，其中该条形码序列来自独特条形码序列的多元组。本文披露的内容包括用于对样品中多个蛋白质靶和多个核酸靶分子进行同时定量分析的试剂盒，该试剂盒包括多个组合物(这些组合物中的每个包括各自与寡核苷酸缀合的两个或更多个蛋白质结合试剂，其中该寡核苷酸包括与蛋白质结合试剂缀合的该蛋白质结合试剂的独特标识，并且这些蛋白质结合试剂能够特异性结合蛋白质靶)和多个寡核苷酸探针，其中该多个寡核苷酸探针中的每个包括靶结合区和条形码序列(例如，分子标记序列)，其中该条形码序列来自独特条形码序列的多元组。
在一些实施例中，寡核苷酸探针中的每一个包括细胞标记、通用引物的结合位点、或其任何组合。在一些实施例中，靶结合区包括聚(dT)。在一些实施例中，多个寡核苷酸探针被固定在固体支持物上。在一些实施例中，固体支持物是珠。在一些实施例中，独特条形码序列的多元组包括至少100个独特条形码序列。在一些实施例中，独特条形码序列的多元组包括至少1,000个独特条形码序列。在一些实施例中，独特条形码序列的多元组包括至少10,000个独特条形码序列。在一些实施例中，这些试剂盒包括至少1,000个寡核苷酸探针。在一些实施例中，这些试剂盒包括至少10,000个寡核苷酸探针。在一些实施例中，这些试剂盒包括至少100,000个寡核苷酸探针。在一些实施例中，这些试剂盒包括至少1,000,000个寡核苷酸探针。在一些实施例中，独特标识包括长度为25-45个核苷酸的核苷酸序列。在一些实施例中，独特标识选自独特标识的多元组。在一些实施例中，独特标识的多元组包括至少100种不同的独特标识。在一些实施例中，独特标识的多元组包括至少1,000种不同的独特标识。在一些实施例中，独特标识的多元组包括至少10,000种不同的独特标识。多个组合物可以进一步包括不与寡核苷酸缀合的第二蛋白质结合试剂。蛋白质结合试剂和第二蛋白质结合试剂可以是相同的。在一些实施例中，多个组合物包括多个抗体、多个适配子、或其组合。在一些实施例中，寡核苷酸通过接头与蛋白质结合试剂缀合。在一些实施例中，该接头包括化学基团。在一些实施例中，该寡核苷酸包括接头。在一些实施例中，该化学基团可逆地附接至蛋白质结合试剂。在一些实施例中，该化学基团选自下组，该组由以下组成：UV可光解基团、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、及其任何组合。在一些实施例中，该独特标识与样品的基因组序列不同源。在一些实施例中，该样品是单个细胞、多个细胞、组织、肿瘤样品、或其任何组合。在一些实施例中，该样品是哺乳动物样品、细菌样品、病毒样品、酵母样品、真菌样品、或其任何组合。在一些实施例中，寡核苷酸包括条形码序列(例如，分子标记序列)、聚(A)尾、或其组合。在一些实施例中，多个组合物包括至少100种不同的蛋白质结合试剂。在一些实施例中，多个组合物包括至少100种不同的蛋白质结合试剂。在一些实施例中，多个组合物包括至少1,000种不同的蛋白质结合试剂。在一些实施例中，多个组合物包括至少10,000种不同的蛋白质结合试剂。在一些实施例中，多个组合物包括至少10,000种不同的蛋白质结合试剂。在一些实施例中，每种蛋白质结合试剂与一个或多个寡核苷酸缀合，这些寡核苷酸包括选自一组至少10种不同的条形码序列中的至少一种条形码序列。在一些实施例中，每种蛋白质结合试剂与一个或多个寡核苷酸缀合，这些寡核苷酸包括选自一组至少100种不同的条形码序列中的至少一种条形码序列。在一些实施例中，每种蛋白质结合试剂与一个或多个寡核苷酸缀合，这些寡核苷酸包括选自一组至少1,000种不同的条形码序列中的至少一种条形码序列。在一些实施例中，多个组合物能够特异性结合多个蛋白质靶。在一些实施例中，该多个蛋白质靶包括细胞表面蛋白质、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、抗体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、或其任何组合。在一些实施例中，多个蛋白质靶包括10-400种不同的蛋白质靶。
本文披露的一些实施例提供了鉴定样品中生物标志物的方法，该方法包括：提供包括多个蛋白质靶和多个核酸靶分子的样品；提供多个组合物，每个组合物包括与寡核苷酸缀合的蛋白质结合试剂，其中该寡核苷酸包括与该蛋白质结合试剂缀合的该蛋白质结合试剂的独特标识，并且该蛋白质结合试剂能够特异性结合该多个蛋白质靶中的至少一个；将该多个组合物与样品接触用于与该多个蛋白质靶特异性结合；去除未结合的组合物；提供多个寡核苷酸探针，其中该多个寡核苷酸探针中的每个包括靶结合区和条形码序列(例如，分子标记序列)，其中该条形码序列来自独特条形码序列的多元组；使该多个寡核苷酸探针与这些组合物的寡核苷酸和该多个核酸靶分子接触用于杂交；延伸与这些寡核苷酸和核酸靶分子杂交的寡核苷酸探针以产生多个经标记的核酸，其中每个经标记的核酸包括独特标识或核酸靶分子，以及条形码序列(例如，分子标记序列)；确定针对每种独特标识和每种核酸靶分子的独特条形码序列的数量；并且使用蛋白质靶的数量或核酸靶分子的数量鉴定生物标志物。在一些实施例中，这些方法包括确定至少一种蛋白质靶和至少一种核酸靶分子的数量。在一些实施例中，这些方法包括将至少一种蛋白质靶及其对应的核酸靶分子的数量进行比较。在一些实施例中，这些方法包括如果蛋白质靶的数量高于其对应的核酸靶分子则鉴定生物标志物。在一些实施例中，这些方法包括如果蛋白质靶的数量至少10X高于其对应的核酸靶分子则鉴定生物标志物。在一些实施例中，这些方法包括如果蛋白质靶的对应核酸靶分子的数量少于10则鉴定生物标志物。在一些实施例中，这些方法包括如果蛋白质靶的对应核酸靶分子的数量为0则鉴定生物标志物。
本文的披露包括对照颗粒组合物。在一些实施例中，对照颗粒组合物包括与对照颗粒相关联的多个对照颗粒寡核苷酸，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中的每一个包括对照条形码序列和聚(dA)区。多个对照颗粒寡核苷酸中至少两个可以包括不同的对照条形码序列。对照颗粒寡核苷酸可以包括条形码序列(例如，分子标记序列)。对照颗粒寡核苷酸可以包括通用引物的结合位点。
在一些实施例中，对照条形码序列长度为至少6个核苷酸、25-45个核苷酸、约128个核苷酸、至少128个核苷酸、约200-500个核苷酸、或其组合。对照颗粒寡核苷酸长度可以是约50个核苷酸、约100个核苷酸、约200个核苷酸、至少200个核苷酸、小于约200-300个核苷酸、约500个核苷酸、或其组合。多个对照颗粒寡核苷酸中至少5、10、100、1000、或更多个的对照条形码序列可以是相同的。多个对照颗粒寡核苷酸中约10、100、1000、或更多个的对照条形码序列可以是相同的。多个对照颗粒寡核苷酸中至少3、5、10、100、或更多个可以包括不同的对照条形码序列。
在一些实施例中，多个对照颗粒寡核苷酸包括多个第一对照颗粒寡核苷酸(各自包括第一对照条形码序列)和多个第二对照颗粒寡核苷酸(各自包括第二对照条形码序列)，并且其中该第一对照条形码序列和该第二对照条形码序列具有不同的序列。多个第一对照颗粒寡核苷酸的数量和多个第二对照颗粒寡核苷酸的数量可以大约相同。多个第一对照颗粒寡核苷酸的数量和多个第二对照颗粒寡核苷酸的数量可以是不同的。多个第一对照颗粒寡核苷酸的数量可以是多个第二对照颗粒寡核苷酸的数量的至少2倍、10倍、100倍、或更多倍。
在一些实施例中，对照条形码序列与物种的基因组序列不同源。对照条形码序列可以与物种的基因组序列同源。该物种可以是非哺乳动物物种。非哺乳动物物种可以是噬菌体物种。噬菌体物种可以是T7噬菌体、PhiX噬菌体、或其组合。
在一些实施例中，多个对照颗粒寡核苷酸中的至少一个通过接头与对照颗粒相关联。该多个对照颗粒寡核苷酸中的至少一个可以包括接头。该接头可以包括化学基团。该化学基团可以可逆地附接至多个对照颗粒寡核苷酸中的至少一个。该化学基团可以包括UV可光解基团、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、二硫键联、或其任何组合。
在一些实施例中，对照颗粒的直径为约1-1000微米、约10-100微米、7.5微米、或其组合。
在一些实施例中，多个对照颗粒寡核苷酸被固定在对照颗粒上。多个对照颗粒寡核苷酸可以被部分固定在对照颗粒上。多个对照颗粒寡核苷酸可以被包封在对照颗粒中。多个对照颗粒寡核苷酸可以被部分包封在对照颗粒中。对照颗粒可以是可破坏的。对照颗粒可以是珠。珠可以包括琼脂糖凝胶珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠、或其任何组合。对照颗粒可以包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮、或其任何组合的材料。对照颗粒可以包括可破坏的水凝胶颗粒。
在一些实施例中，对照颗粒与可检测部分相关联。对照颗粒寡核苷酸可以与可检测部分相关联。
在一些实施例中，对照颗粒与多个第一蛋白质结合试剂相关联，并且多个第一蛋白质结合试剂中至少一个与多个对照颗粒寡核苷酸之一相关联。第一蛋白质结合试剂可以包括第一抗体。该对照颗粒寡核苷酸可以通过接头与第一蛋白质结合试剂缀合。该第一对照颗粒寡核苷酸可以包括接头。该接头可以包括化学基团。该化学基团可以可逆地附接至第一蛋白质结合试剂。该化学基团可以包括UV可光解基团、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、二硫键联、或其任何组合。
在一些实施例中，该第一蛋白质结合试剂与具有相同对照条形码序列的多个对照颗粒寡核苷酸中的两个或更多个相关联。第一蛋白质结合试剂可以与具有不同对照条形码序列的多个对照颗粒寡核苷酸中的两个或更多个相关联。在一些实施例中，多个第一蛋白质结合试剂中至少一个不与多个对照颗粒寡核苷酸中的任一个相关联。与对照颗粒寡核苷酸相关联的第一蛋白质结合试剂和不与任何对照颗粒寡核苷酸相关联的第一蛋白质结合试剂可以是相同的蛋白质结合试剂。
在一些实施例中，对照颗粒与多个第二蛋白质结合试剂相关联。多个第二蛋白质结合试剂中至少一个可以与多个对照颗粒寡核苷酸中的一个相关联。与第一蛋白质结合试剂相关联的对照颗粒寡核苷酸和与第二蛋白质结合试剂相关联的对照颗粒寡核苷酸可以包括不同的对照条形码序列。第一蛋白质结合试剂和第二蛋白质结合试剂可以是相同的蛋白质结合试剂。
在一些实施例中，第一蛋白质结合试剂可以与配偶体结合试剂相关联，并且其中使用配偶体结合试剂使该第一蛋白质结合试剂与对照颗粒相关联。配偶体结合试剂可以包括配偶体抗体。配偶体抗体可以包括抗猫抗体、抗鸡抗体、抗奶牛抗体、抗狗抗体、抗驴抗体、抗山羊抗体、抗豚鼠抗体、抗仓鼠抗体、抗马抗体、抗人抗体、抗美洲驼抗体、抗猴抗体、抗小鼠抗体、抗猪抗体、抗兔抗体、抗大鼠抗体、抗绵羊抗体、或其组合。配偶体抗体可以包括免疫球蛋白G(IgG)、F(ab’)片段、F(ab’)2片段、其组合、或其片段。
在一些实施例中，第一蛋白质结合试剂可以与可检测部分相关联。第二蛋白质结合试剂可以与可检测部分相关联。
本文披露的是用于确定靶的数量的方法。在一些实施例中，该方法包括：使用多个条形码(例如，随机条形码)使多个细胞中的细胞的多个靶和多个对照颗粒寡核苷酸条形码化(例如，随机条形码化)，以创建多个条形码化的靶(例如，随机条形码化的靶)和多个条形码化的对照颗粒寡核苷酸(例如，随机条形码化的对照颗粒寡核苷酸)。在一些实施例中，多个随机条形码中的每一个包括以下的一个或多个：细胞标记序列、条形码序列(例如，分子标记序列)、和靶结合区。多个条形码中至少两个条形码的条形码序列可以包括不同的序列。多个条形码中至少两个条形码可以包括相同的细胞标记序列。在一些实施例中，对照颗粒组合物包括与该多个对照颗粒寡核苷酸相关联的对照颗粒，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中的每一个包括对照条形码序列和假-靶区，该假-靶区包括与该多个条形码中至少一个的靶结合区基本互补的序列。该方法可以包括：获得该多个条形码化的靶和该多个条形码化的对照颗粒寡核苷酸的测序数据；对测序数据中与具有该对照条形码序列的多个对照颗粒寡核苷酸相关联的具有不同序列的条形码序列的数量进行计数。该方法可以包括：对于该多个靶中的至少一个靶：对测序数据中与该靶相关联的具有不同序列的条形码序列的数量进行计数；并且估计靶的数量，其中经估计的靶的数量跟与经计数的靶相关联的具有不同序列的条形码序列的数量和与对照条形码序列相关联的具有不同序列的条形码序列的数量相关。
在一些实施例中，假-靶区包括聚(dA)区。假-靶区可以包括靶的子序列。在一些实施例中，对照条形码序列长度可以是至少6个核苷酸、25-45个核苷酸、约128个核苷酸、至少128个核苷酸、约200-500个核苷酸、或其组合。对照颗粒寡核苷酸长度可以是约50个核苷酸、约100个核苷酸、约200个核苷酸、至少200个核苷酸、少于约200-300个核苷酸、约500个核苷酸、或其任何组合。多个对照颗粒寡核苷酸中至少5、10、100、1000、或更多个的对照条形码序列可以是相同的。多个对照颗粒寡核苷酸中至少3、5、10、100、或更多个可以包括不同的对照条形码序列。
在一些实施例中，多个对照颗粒寡核苷酸包括多个第一对照颗粒寡核苷酸(各自包括第一对照条形码序列)和多个第二对照颗粒寡核苷酸(各自包括第二对照条形码序列)。第一对照条形码序列和第二对照条形码序列可以具有不同的序列。多个第一对照颗粒寡核苷酸的数量和多个第二对照颗粒寡核苷酸的数量可以大约相同。多个第一对照颗粒寡核苷酸的数量和多个第二对照颗粒寡核苷酸的数量可以是不同的。多个第一对照颗粒寡核苷酸的数量可以是多个第二对照颗粒寡核苷酸的数量的至少2倍、10倍、100倍、或更多倍。
在一些实施例中，对测序数据中与具有该对照条形码序列的多个对照颗粒寡核苷酸相关联的具有不同序列的条形码序列的数量进行计数包括：对测序数据中与该第一对照条形码序列相关联的具有不同序列的条形码序列的数量进行计数；并且对测序数据中与该第二对照条形码序列相关联的具有不同序列的条形码序列的数量进行计数；经估计的靶的数量可以与以下相关：与经计数的靶相关联具有不同序列的条形码序列的数量、与第一对照条形码序列相关联的具有不同序列的条形码序列的数量、以及与第二对照条形码序列相关联的具有不同序列条形码序列的数量。经估计的靶的数量可以与以下相关：与经计数的靶相关联的具有不同序列的条形码序列的数量、与对照条形码序列相关联的具有不同序列的条形码序列的数量、以及包括对照条形码序列的多个对照颗粒寡核苷酸的数量。经估计的靶的数量可以与以下相关：与经计数的靶相关联的具有不同序列的条形码序列的数量，以及包括对照条形码序列的多个对照颗粒寡核苷酸的数量与跟对照条形码序列相关联的具有不同序列的条形码序列的数量的比率。
在一些实施例中，对照颗粒寡核苷酸与细胞的基因组序列不同源。对照颗粒寡核苷酸可以与物种的基因组序列不同源。对照颗粒寡核苷酸可以与物种的基因组序列同源。该物种可以是非哺乳动物物种。非哺乳动物物种可以是噬菌体物种。噬菌体物种可以是T7噬菌体、PhiX噬菌体、或其组合。
在一些实施例中，对照颗粒寡核苷酸通过接头与对照颗粒缀合。多个对照颗粒寡核苷酸中的至少一个可以通过接头与对照颗粒相关联。该多个对照颗粒寡核苷酸中的至少一个可以包括接头。该化学基团可以可逆地附接至多个对照颗粒寡核苷酸中的至少一个。该化学基团可以包括UV可光解基团、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、二硫键联、或其任何组合。
在一些实施例中，对照颗粒的直径为约1-1000微米、约10-100微米、约7.5微米、或其组合。多个对照颗粒寡核苷酸被固定在对照颗粒上。多个对照颗粒寡核苷酸可以被部分固定在对照颗粒上。多个对照颗粒寡核苷酸可以被包封在对照颗粒中。多个对照颗粒寡核苷酸可以被部分包封在对照颗粒中。
在一些实施例中，该方法包括在将多个靶和对照颗粒以及多个对照颗粒寡核苷酸条形码化之前从对照颗粒释放多个对照颗粒寡核苷酸中的至少一个。
在一些实施例中，对照颗粒是可破坏的。对照颗粒可以是对照颗粒珠。对照颗粒珠可以包括琼脂糖凝胶珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠、或其任何组合。对照颗粒可以包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮、或其任何组合的材料。对照颗粒可以包括可破坏的水凝胶颗粒。
在一些实施例中，对照颗粒与可检测部分相关联。对照颗粒寡核苷酸可以与可检测部分相关联。
在一些实施例中，对照颗粒能与多种第一蛋白质结合试剂相关联，并且多个第一蛋白质结合试剂中至少一个能与多个对照颗粒寡核苷酸之一相关联。第一蛋白质结合试剂可以包括第一抗体。该对照颗粒寡核苷酸可以通过接头与第一蛋白质结合试剂缀合。该第一对照颗粒寡核苷酸可以包括接头。该接头可以包括化学基团。该化学基团可以可逆地附接至第一蛋白质结合试剂。该化学基团可以包括UV可光解基团、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、二硫键联、或其任何组合。
在一些实施例中，该第一蛋白质结合试剂可以与具有相同对照条形码序列的多个对照颗粒寡核苷酸中的两个或更多个相关联。第一蛋白质结合试剂可以与具有不同对照条形码序列的多个对照颗粒寡核苷酸中的两个或更多个相关联。多个第一蛋白质结合试剂中至少一个可以与多个对照颗粒寡核苷酸中的任一个相关联。与对照颗粒寡核苷酸相关联的第一蛋白质结合试剂和不与任何对照颗粒寡核苷酸相关联的第一蛋白质结合试剂可以是相同的蛋白质结合试剂。对照颗粒能与多个第二蛋白质结合试剂相关联。多个第二蛋白质结合试剂中至少一个可以与多个对照颗粒寡核苷酸中的一个相关联。与第一蛋白质结合试剂相关联的对照颗粒寡核苷酸和与第二蛋白质结合试剂相关联的对照颗粒寡核苷酸可以包括不同的对照条形码序列。第一蛋白质结合试剂和第二蛋白质结合试剂可以是相同的蛋白质结合试剂。
在一些实施例中，第一蛋白质结合试剂与配偶体结合试剂相关联，并且其中使用配偶体结合试剂使该第一蛋白质结合试剂与对照颗粒相关联。配偶体结合试剂可以包括配偶体抗体。配偶体抗体可以包括抗猫抗体、抗鸡抗体、抗奶牛抗体、抗狗抗体、抗驴抗体、抗山羊抗体、抗豚鼠抗体、抗仓鼠抗体、抗马抗体、抗人抗体、抗美洲驼抗体、抗猴抗体、抗小鼠抗体、抗猪抗体、抗兔抗体、抗大鼠抗体、抗绵羊抗体、或其组合。配偶体抗体可以包括免疫球蛋白G(IgG)、F(ab’)片段、F(ab’)2片段、其组合、或其片段。
在一些实施例中，第一蛋白质结合试剂可以与可检测部分相关联。第二蛋白质结合试剂可以与可检测部分相关联。
在一些实施例中，条形码包括通用引物的结合位点。该靶结合区可以包括聚(dT)区。
在一些实施例中，多个条形码与条形码化颗粒相关联。例如，多个条形码中的至少一个条形码可以被固定在条形码化颗粒上。多个条形码中的至少一个条形码可以被部分固定在条形码化颗粒上。多个条形码中的至少一个条形码可以被包封在条形码化颗粒中。多个条形码中的至少一个条形码可以被部分包封在条形码化颗粒中。
在一些实施例中，条形码化颗粒是可破坏的。条形码化颗粒可以是条形码化珠。条形码化珠可以包括琼脂糖凝胶珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠、或其任何组合。条形码化颗粒可以包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮、或其任何组合的材料。条形码化颗粒可以包括可破坏的水凝胶颗粒。
在一些实施例中，条形码化颗粒的条形码包括选自至少1000、10000或更多种不同的条形码序列的条形码序列。在一些实施例中，条形码的条形码序列包括随机序列。在一些实施例中，条形码化颗粒包括至少10000个条形码。
在一些实施例中，使用多个条形码使多个靶和多个对照颗粒寡核苷酸条形码化，包括：使该多个条形码与该多个靶的靶以及该多个对照颗粒寡核苷酸的对照颗粒寡核苷酸接触以生成与这些靶和这些对照颗粒寡核苷酸杂交的条形码；并且延伸与这些靶和这些对照颗粒寡核苷酸杂交的条形码以生成多个条形码化的靶和多个条形码化的对照颗粒寡核苷酸。延伸这些条形码可以包括使用DNA聚合酶、逆转录酶、或其组合延伸这些条形码。
在一些实施例中，该方法包括扩增多个条形码化的靶和多个条形码化的对照颗粒寡核苷酸以产生多个扩增子。扩增多个条形码化的靶和多个条形码化的对照颗粒寡核苷酸可以包括使用聚合酶链式反应(PCR)扩增条形码序列的至少一部分和对照颗粒寡核苷酸的至少一部分或条形码序列的至少一部分和对照颗粒寡核苷酸的至少一部分。获得测序数据可以包括获得多个扩增子的测序数据。获得测序数据可以包括对条形码序列的至少一部分和对照颗粒寡核苷酸的至少一部分，或条形码序列的至少一部分和对照颗粒寡核苷酸的至少一部分进行测序。
本文披露的是试剂盒。在一些实施例中，该试剂盒包括：包括与对照颗粒相关联的多个对照颗粒寡核苷酸的对照颗粒组合物，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中的每一个包括对照条形码序列和聚(dA)区。
在一些实施例中，多个对照颗粒寡核苷酸中的至少两个包括不同的对照条形码序列。在一些实施例中，对照条形码序列长度可以是至少6个核苷酸、25-45个核苷酸、约128个核苷酸、至少128个核苷酸、约200-500个核苷酸、或其组合。对照颗粒寡核苷酸长度可以是约50个核苷酸、约100个核苷酸、约200个核苷酸、至少200个核苷酸、少于约200-300个核苷酸、约500个核苷酸、或其任何组合。多个对照颗粒寡核苷酸中至少5、10、100、1000、或更多个的对照条形码序列可以是相同的。多个对照颗粒寡核苷酸中至少3、5、10、100、或更多个可以包括不同的对照条形码序列。
在一些实施例中，多个对照颗粒寡核苷酸包括多个第一对照颗粒寡核苷酸(各自包括第一对照条形码序列)和多个第二对照颗粒寡核苷酸(各自包括第二对照条形码序列)。第一对照条形码序列和第二对照条形码序列可以具有不同的序列。多个第一对照颗粒寡核苷酸的数量和多个第二对照颗粒寡核苷酸的数量可以大约相同。多个第一对照颗粒寡核苷酸的数量和多个第二对照颗粒寡核苷酸的数量可以是不同的。多个第一对照颗粒寡核苷酸的数量可以是多个第二对照颗粒寡核苷酸的数量的至少2倍、10倍、100倍、或更多倍。
在一些实施例中，对照颗粒寡核苷酸与细胞的基因组序列不同源。对照颗粒寡核苷酸可以与物种的基因组序列不同源。对照颗粒寡核苷酸可以与物种的基因组序列同源。该物种可以是非哺乳动物物种。非哺乳动物物种可以是噬菌体物种。噬菌体物种可以是T7噬菌体、PhiX噬菌体、或其组合。
在一些实施例中，对照颗粒寡核苷酸通过接头与对照颗粒缀合。多个对照颗粒寡核苷酸中的至少一个可以通过接头与对照颗粒相关联。该多个对照颗粒寡核苷酸中的至少一个可以包括接头。该化学基团可以可逆地附接至多个对照颗粒寡核苷酸中的至少一个。该化学基团可以包括UV可光解基团、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、二硫键联、或其任何组合。
在一些实施例中，对照颗粒的直径为约1-1000微米、约10-100微米、约7.5微米、或其组合。多个对照颗粒寡核苷酸被固定在对照颗粒上。多个对照颗粒寡核苷酸可以被部分固定在对照颗粒上。多个对照颗粒寡核苷酸可以被包封在对照颗粒中。多个对照颗粒寡核苷酸可以被部分包封在对照颗粒中。
在一些实施例中，对照颗粒是可破坏的。对照颗粒可以是对照颗粒珠。对照颗粒珠可以包括琼脂糖凝胶珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠、或其任何组合。对照颗粒可以包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮、或其任何组合的材料。对照颗粒可以包括可破坏的水凝胶颗粒。
在一些实施例中，对照颗粒与可检测部分相关联。对照颗粒寡核苷酸可以与可检测部分相关联。
在一些实施例中，对照颗粒能与多种第一蛋白质结合试剂相关联，并且多个第一蛋白质结合试剂中至少一个能与多个对照颗粒寡核苷酸之一相关联。第一蛋白质结合试剂可以包括第一抗体。该对照颗粒寡核苷酸可以通过接头与第一蛋白质结合试剂缀合。该第一对照颗粒寡核苷酸可以包括接头。该接头可以包括化学基团。该化学基团可以可逆地附接至第一蛋白质结合试剂。该化学基团可以包括UV可光解基团、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、二硫键联、或其任何组合。
在一些实施例中，该第一蛋白质结合试剂可以与具有相同对照条形码序列的多个对照颗粒寡核苷酸中的两个或更多个相关联。第一蛋白质结合试剂可以与具有不同对照条形码序列的多个对照颗粒寡核苷酸中的两个或更多个相关联。多个第一蛋白质结合试剂中至少一个可以与多个对照颗粒寡核苷酸中的任一个相关联。与对照颗粒寡核苷酸相关联的第一蛋白质结合试剂和不与任何对照颗粒寡核苷酸相关联的第一蛋白质结合试剂可以是相同的蛋白质结合试剂。对照颗粒能与多个第二蛋白质结合试剂相关联。多个第二蛋白质结合试剂中至少一个可以与多个对照颗粒寡核苷酸中的一个相关联。与第一蛋白质结合试剂相关联的对照颗粒寡核苷酸和与第二蛋白质结合试剂相关联的对照颗粒寡核苷酸可以包括不同的对照条形码序列。第一蛋白质结合试剂和第二蛋白质结合试剂可以是相同的蛋白质结合试剂。
在一些实施例中，第一蛋白质结合试剂与配偶体结合试剂相关联，并且其中使用配偶体结合试剂使该第一蛋白质结合试剂与对照颗粒相关联。配偶体结合试剂可以包括配偶体抗体。配偶体抗体可以包括抗猫抗体、抗鸡抗体、抗奶牛抗体、抗狗抗体、抗驴抗体、抗山羊抗体、抗豚鼠抗体、抗仓鼠抗体、抗马抗体、抗人抗体、抗美洲驼抗体、抗猴抗体、抗小鼠抗体、抗猪抗体、抗兔抗体、抗大鼠抗体、抗绵羊抗体、或其组合。配偶体抗体可以包括免疫球蛋白G(IgG)、F(ab’)片段、F(ab’)2片段、其组合、或其片段。
在一些实施例中，第一蛋白质结合试剂可以与可检测部分相关联。第二蛋白质结合试剂可以与可检测部分相关联。
在一些实施例中，该试剂盒包括多个条形码。多个条形码的条形码可以包括靶结合区和条形码序列(例如，分子标记序列)，并且多个条形码中至少两个条形码的条形码序列可以包括不同的分子标记序列。条形码可以包括细胞标记序列、通用引物的结合位点、或其任何组合。靶结合区包括聚(dT)区。
在一些实施例中，多个条形码可以与条形码化颗粒相关联。多个条形码中的至少一个条形码可以被固定在条形码化颗粒上。多个条形码中的至少一个条形码被部分固定在条形码化颗粒上。多个条形码中的至少一个条形码可以被包封在条形码化颗粒中。多个条形码中的至少一个条形码可以被部分包封在条形码化颗粒中。条形码化颗粒可以是可破坏的。条形码化颗粒可以是第二珠。珠可以包括琼脂糖凝胶珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠、或其任何组合。条形码化颗粒可以包括选自下组的材料，该组由以下组成：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮、及其任何组合。条形码化颗粒可以包括可破坏的水凝胶颗粒。
在一些实施例中，条形码化颗粒的条形码包括选自至少1000、10000或更多种不同的条形码序列的条形码序列。条形码的条形码序列可以包括随机序列。条形码化颗粒可以包括至少10000个条形码。该试剂盒可以包括DNA聚合酶。该试剂盒可以包括用于聚合酶链式反应(PCR)的试剂。
本文披露的是可以用于测序对照的方法和组合物。在一些实施例中，该方法包括：使多个细胞中的一个或多个细胞与多个对照组合物的对照组合物接触，其中该多个细胞中的细胞包括多个靶和多个蛋白质靶，其中该多个对照组合物中的每一个包括与对照寡核苷酸相关联的蛋白质结合试剂，其中该蛋白质结合试剂能够特异性结合该多个蛋白质靶中的至少一个，并且其中该对照寡核苷酸包括对照条形码序列和假-靶区，该假-靶区包括与该多个条形码中至少一个的靶结合区基本互补的序列；使用多个条形码使该对照寡核苷酸条形码化，以创建多个条形码化的对照寡核苷酸，其中该多个条形码中的每一个包括细胞标记序列、条形码序列(例如，分子标记序列)、和/或靶结合区，其中该多个条形码中至少两个条形码的条形码序列包括不同的序列，并且其中该多个条形码中至少两个条形码包括相同的细胞标记序列；获得该多个条形码化的对照寡核苷酸的测序数据；使用测序数据中该多个条形码化的对照寡核苷酸的至少一个特征确定该一个或多个细胞的至少一个特征。在一些实施例中，假-靶区包括聚(dA)区。
在一些实施例中，对照条形码序列长度为至少6个核苷酸、25-45个核苷酸、约128个核苷酸、至少128个核苷酸、约200-500个核苷酸、或其组合。对照颗粒寡核苷酸长度可以是约50个核苷酸、约100个核苷酸、约200个核苷酸、至少200个核苷酸、小于约200-300个核苷酸、约500个核苷酸、或其组合。多个对照颗粒寡核苷酸中至少2、10、100、1000、或更多个的对照条形码序列可以是相同的。多个对照颗粒寡核苷酸中至少2、10、100、1000、或更多个可以包括不同的对照条形码序列。
在一些实施例中，确定一个或多个细胞的至少一个特征包括：确定测序数据中与该多个条形码化的对照寡核苷酸相关联的具有不同序列的细胞标记序列的数量；并且使用与多个条形码化的对照寡核苷酸相关联的具有不同序列的细胞标记序列的数量，确定一个或多个细胞的数量。该方法可以包括：基于经确定的一个或多个细胞的数量确定单个细胞捕获效率。该方法可以包括：包括基于经确定的一个或多个细胞的数量和多个细胞的数量的比率确定单个细胞捕获效率。
在一些实施例中，使用测序数据中多个条形码化的对照寡核苷酸的特征确定一个或多个细胞的至少一个特征包括对于测序数据中的每个细胞标记，确定与该细胞标记和该对照条形码序列相关联的具有不同序列的条形码序列的数量；并且使用与该细胞标记和该对照条形码序列相关联的具有不同序列的条形码序列的数量确定一个或多个细胞的数量。确定与该细胞标记和该对照条形码序列相关联的具有不同序列的条形码序列的数量可以包括：对于测序数据中的每个细胞标记，确定与该细胞标记和该对照条形码序列相关联的具有最多数量不同序列的条形码序列的数量。使用与该细胞标记和该对照条形码序列相关联的具有不同序列的条形码序列的数量确定一个或多个细胞的数量可以包括：生成具有最多数量不同序列的条形码序列的数量和测序数据中与具有最多数量不同序列的条形码序列的数量相关联的细胞标记的数量的图；并且在图中确定截止值作为一个或多个细胞的数量。
在一些实施例中，对照寡核苷酸与多个细胞中任一个的基因组序列不同源。对照寡核苷酸可以与物种的基因组序列同源。该物种可以是非哺乳动物物种。非哺乳动物物种可以是噬菌体物种。噬菌体物种可以是T7噬菌体、PhiX噬菌体、或其组合。
在一些实施例中，方法包括在使对照寡核苷酸条形码化之前，从蛋白质结合试剂释放对照寡核苷酸。在一些实施例中，该方法包括去除多个对照组合物中未结合的对照组合物。去除未结合的对照组合物可以包括用洗涤缓冲液洗涤多个细胞中的一个或多个细胞。去除未结合的细胞鉴定组合物可以包括使用流式细胞术选择与对照组合物的至少一个蛋白质结合试剂结合的细胞。
在一些实施例中，多个蛋白质靶中的至少一个在细胞表面上。该多个蛋白质靶中的至少一个可以包括细胞表面蛋白质、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、整合素、或其任何组合。蛋白质结合试剂可以包括抗体。该对照寡核苷酸可以通过接头与蛋白质结合试剂缀合。该对照寡核苷酸可以包括接头。该接头可以包括化学基团。该化学基团可以可逆地附接至第一蛋白质结合试剂。该化学基团可以包括UV可光解基团、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、二硫键联、或其任何组合。
在一些实施例中，蛋白质结合试剂与具有相同对照条形码序列的两个或更多个对照寡核苷酸相关联。蛋白质结合试剂可以与具有不同相同对照条形码序列的两个或更多个对照寡核苷酸相关联。在一些实施例中，多个对照组合物的第二蛋白质结合试剂不与对照寡核苷酸相关联。蛋白质结合试剂和第二蛋白质结合试剂可以是相同的。
在一些实施例中，条形码包括通用引物的结合位点。该靶结合区可以包括聚(dT)区。在一些实施例中，多个条形码与条形码化颗粒相关联。多个条形码中的至少一个条形码可以被固定在条形码化颗粒上。多个条形码中的至少一个条形码可以被部分固定在条形码化颗粒上。多个条形码中的至少一个条形码被包封在条形码化颗粒中。多个条形码中的至少一个条形码被部分包封在条形码化颗粒中。条形码化颗粒可以是可破坏的。条形码化颗粒可以是条形码化珠。条形码化珠可以包括琼脂糖凝胶珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠、或其任何组合。条形码化颗粒可以包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮、或其任何组合的材料。条形码化颗粒可以包括可破坏的水凝胶颗粒。
在一些实施例中，条形码化颗粒与光学部分相关联。对照寡核苷酸可以与光学部分相关联。
在一些实施例中，条形码化颗粒的条形码包括选自至少1000、10000或更多种不同的条形码序列的条形码序列。在一些实施例中，条形码的条形码序列包括随机序列。在一些实施例中，条形码化颗粒包括至少10000个条形码。
在一些实施例中，使对照寡核苷酸条形码化包括：使用多个条形码使该对照寡核苷酸条形码化，以创建多个条形码化的对照寡核苷酸。在一些实施例中，使用多个条形码使多种对照寡核苷酸条形码化包括：使该多个条形码与该多个对照组合物的对照寡核苷酸接触以生成与这些对照寡核苷酸杂交的条形码；并且延伸与对照寡核苷酸杂交的条形码以生成多个条形码化的对照寡核苷酸。延伸这些条形码可以包括使用DNA聚合酶、逆转录酶、或其组合延伸这些条形码。在一些实施例中，该方法包括扩增多个条形码化的对照寡核苷酸以产生多个扩增子。扩增多个条形码化的对照寡核苷酸可以包括使用聚合酶链式反应(PCR)对条形码序列的至少一部分和对照寡核苷酸的至少一部分进行扩增。在一些实施例中，获得测序数据包括获得多个扩增子的测序数据。获得测序数据可以包括对条形码序列的至少一部分和对照寡核苷酸的至少一部分进行测序。
本文的披露内容包括用于测序对照的方法。在一些实施例中，该方法包括：使多个细胞中的一个或多个细胞与多个对照组合物的对照组合物接触，其中该多个细胞中的细胞包括多个靶和多个结合靶，其中该多个对照组合物中的每一个包括与对照寡核苷酸相关联的细胞组分结合试剂，其中该细胞组分结合试剂能够特异性结合该多个结合靶中的至少一个，并且其中该对照寡核苷酸包括对照条形码序列和假-靶区，该假-靶区包括与该多个条形码中至少一个的靶结合区基本互补的序列；使用多个条形码使该对照寡核苷酸条形码化，以创建多个条形码化的对照寡核苷酸，其中该多个条形码中的每一个包括细胞标记序列、条形码序列(例如，分子标记序列)、和/或靶结合区，其中该多个条形码中至少两个条形码的条形码序列包括不同的序列，并且其中该多个条形码中至少两个条形码包括相同的细胞标记序列；获得该多个条形码化的对照寡核苷酸的测序数据；使用测序数据中该多个条形码化的对照寡核苷酸的至少一个特征确定该一个或多个细胞的至少一个特征。在一些实施例中，假-靶区包括聚(dA)区。
在一些实施例中，对照条形码序列长度为至少6个核苷酸、25-45个核苷酸、约128个核苷酸、至少128个核苷酸、约200-500个核苷酸、或其组合。对照颗粒寡核苷酸长度可以是约50个核苷酸、约100个核苷酸、约200个核苷酸、至少200个核苷酸、小于约200-300个核苷酸、约500个核苷酸、或其组合。多个对照颗粒寡核苷酸中至少2、10、100、1000、或更多个的对照条形码序列可以是相同的。多个对照颗粒寡核苷酸中至少2、10、100、1000、或更多个可以包括不同的对照条形码序列。
在一些实施例中，确定一个或多个细胞的至少一个特征包括：确定测序数据中与该多个条形码化的对照寡核苷酸相关联的具有不同序列的细胞标记序列的数量；并且使用与多个条形码化的对照寡核苷酸相关联的具有不同序列的细胞标记序列的数量，确定一个或多个细胞的数量。在一些实施例中，该方法包括：基于经确定的一个或多个细胞的数量确定单个细胞捕获效率。在一些实施例中，该方法包括：基于经确定的一个或多个细胞的数量和多个细胞的数量的比率确定单个细胞捕获效率。
在一些实施例中，确定一个或多个细胞的至少一个特征可以包括：对于测序数据中的每个细胞标记，确定与该细胞标记和该对照条形码序列相关联的具有不同序列的条形码序列的数量；并且使用与该细胞标记和该对照条形码序列相关联的具有不同序列的条形码序列的数量确定一个或多个细胞的数量。确定与该细胞标记和该对照条形码序列相关联的具有不同序列的条形码序列的数量包括：对于测序数据中的每个细胞标记，确定与该细胞标记和该对照条形码序列相关联的具有最多数量不同序列的条形码序列的数量。使用与该细胞标记和该对照条形码序列相关联的具有不同序列的条形码序列的数量确定一个或多个细胞的数量可以包括：生成具有最多数量不同序列的条形码序列的数量和测序数据中与具有最多数量不同序列的条形码序列的数量相关联的细胞标记的数量的图；并且在图中确定截止值作为一个或多个细胞的数量。
在一些实施例中，对照寡核苷酸与多个细胞中任一个的基因组序列不同源。对照寡核苷酸可以与物种的基因组序列同源。该物种可以是非哺乳动物物种。非哺乳动物物种可以是噬菌体物种。噬菌体物种可以是T7噬菌体、PhiX噬菌体、或其组合。
在一些实施例中，该方法包括：在使对照寡核苷酸条形码化之前，从细胞组分结合试剂释放对照寡核苷酸。多个结合靶中的至少一个可以在细胞表面上表达。该多个结合靶中的至少一个可以包括细胞表面蛋白质、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、整合素、或其任何组合。细胞组分结合试剂可以包括细胞表面结合试剂、抗体、四聚体、适配子、蛋白质骨架、侵入物、或其组合。
在一些实施例中，细胞组分结合试剂的结合靶选自包括10-100种不同的结合靶的组。该细胞组分结合试剂的结合靶可以包括碳水化合物、脂质、蛋白质、细胞外蛋白质、细胞表面蛋白质、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、整合素、细胞内蛋白质、或其任何组合。该对照寡核苷酸可以通过接头与细胞组分结合试剂缀合。该对照寡核苷酸可以包括接头。该接头可以包括化学基团。该化学基团可以可逆地附接至第一细胞组分结合试剂。该化学基团可以包括UV可光解基团、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、二硫键联、或其任何组合。
在一些实施例中，细胞组分结合试剂可以与具有相同对照条形码序列的两个或更多个对照寡核苷酸相关联。细胞组分结合试剂可以与具有不同相同对照条形码序列的两个或更多个对照寡核苷酸相关联。在一些实施例中，多个对照组合物的第二细胞组分结合试剂不与对照寡核苷酸相关联。细胞组分结合试剂和第二细胞组分结合试剂可以是相同的。
在一些实施例中，条形码包括通用引物的结合位点。在一些实施例中，靶结合区包括聚(dT)区。
在一些实施例中，多个条形码与条形码化颗粒相关联。多个条形码中的至少一个条形码可以被固定在条形码化颗粒上。多个条形码中的至少一个条形码可以被部分固定在条形码化颗粒上。多个条形码中的至少一个条形码可以被包封在条形码化颗粒中。多个条形码中的至少一个条形码可以被部分包封在条形码化颗粒中。条形码化颗粒可以是可破坏的。条形码化颗粒可以是条形码化珠。在一些实施例中，条形码化珠包括琼脂糖凝胶珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠、或其任何组合。条形码化颗粒可以包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮、或其任何组合的材料。条形码化颗粒可以包括可破坏的水凝胶颗粒。条形码化颗粒可以与光学部分相关联。
在一些实施例中，对照寡核苷酸可以与光学部分相关联。在一些实施例中，条形码化颗粒的条形码包括选自至少1000、10000或更多种不同的条形码序列的条形码序列。在一些实施例中，条形码的条形码序列包括随机序列。条形码化颗粒可以包括至少10000个条形码。
在一些实施例中，使对照寡核苷酸条形码化包括：使用多个条形码使该对照寡核苷酸条形码化，以创建多个条形码化的对照寡核苷酸。使用多个条形码使多种对照寡核苷酸条形码化可以包括：使该多个条形码与该多个对照组合物的对照寡核苷酸接触以生成与这些对照寡核苷酸杂交的条形码；并且延伸与对照寡核苷酸杂交的条形码以生成多个条形码化的对照寡核苷酸。延伸这些条形码可以包括使用DNA聚合酶、逆转录酶、或其组合延伸这些条形码。在一些实施例中，该方法包括扩增多个条形码化的对照寡核苷酸以产生多个扩增子。扩增多个条形码化的对照寡核苷酸可以包括使用聚合酶链式反应(PCR)对条形码序列的至少一部分和对照寡核苷酸的至少一部分进行扩增。获得测序数据可以包括获得多个扩增子的测序数据。获得测序数据可以包括对条形码序列的至少一部分和对照寡核苷酸的至少一部分进行测序。
本文披露的是用于测序对照的方法。在一些实施例中，该方法包括：使多个细胞中的一个或多个细胞与多个对照组合物的对照组合物接触，其中该多个细胞中的细胞包括多个靶和多个蛋白质靶，其中该多个对照组合物中的每一个包括与对照寡核苷酸相关联的蛋白质结合试剂，其中该蛋白质结合试剂能够特异性结合该多个蛋白质靶中的至少一个，并且其中该对照寡核苷酸包括对照条形码序列和假-靶区，该假-靶区包括与该多个条形码中至少一个的靶结合区基本互补的序列；并且使用多个对照寡核苷酸的至少一个特征确定一个或多个细胞的至少一个特征。假-靶区可以包括聚(dA)区。
在一些实施例中，对照条形码序列长度为至少6个核苷酸、25-45个核苷酸、约128个核苷酸、至少128个核苷酸、约200-500个核苷酸、或其组合。对照颗粒寡核苷酸长度可以是约50个核苷酸、约100个核苷酸、约200个核苷酸、至少200个核苷酸、小于约200-300个核苷酸、约500个核苷酸、或其组合。多个对照颗粒寡核苷酸中至少2、10、100、1000、或更多个的对照条形码序列可以是相同的。多个对照颗粒寡核苷酸中至少2、10、100、1000、或更多个可以包括不同的对照条形码序列。
在一些实施例中，确定一个或多个细胞的至少一个特征包括：确定测序数据中与该多个条形码化的对照寡核苷酸相关联的具有不同序列的细胞标记序列的数量；并且使用与多个条形码化的对照寡核苷酸相关联的具有不同序列的细胞标记序列的数量，确定一个或多个细胞的数量。该方法可以包括：基于经确定的一个或多个细胞的数量确定单个细胞捕获效率。该方法可以包括：包括基于经确定的一个或多个细胞的数量和多个细胞的数量的比率确定单个细胞捕获效率。
在一些实施例中，使用测序数据中多个条形码化的对照寡核苷酸的特征确定一个或多个细胞的至少一个特征包括对于测序数据中的每个细胞标记，确定与该细胞标记和该对照条形码序列相关联的具有不同序列的条形码序列的数量；并且使用与该细胞标记和该对照条形码序列相关联的具有不同序列的条形码序列的数量确定一个或多个细胞的数量。确定与该细胞标记和该对照条形码序列相关联的具有不同序列的条形码序列的数量可以包括：对于测序数据中的每个细胞标记，确定与该细胞标记和该对照条形码序列相关联的具有最多数量不同序列的条形码序列的数量。使用与该细胞标记和该对照条形码序列相关联的具有不同序列的条形码序列的数量确定一个或多个细胞的数量可以包括：生成具有最多数量不同序列的条形码序列的数量和测序数据中与具有最多数量不同序列的条形码序列的数量相关联的细胞标记的数量的图；并且在图中确定截止值作为一个或多个细胞的数量。
在一些实施例中，对照寡核苷酸与多个细胞中任一个的基因组序列不同源。对照寡核苷酸可以与物种的基因组序列同源。该物种可以是非哺乳动物物种。非哺乳动物物种可以是噬菌体物种。噬菌体物种可以是T7噬菌体、PhiX噬菌体、或其组合。
在一些实施例中，方法包括在使对照寡核苷酸条形码化之前，从蛋白质结合试剂释放对照寡核苷酸。在一些实施例中，该方法包括去除多个对照组合物中未结合的对照组合物。去除未结合的对照组合物可以包括用洗涤缓冲液洗涤多个细胞中的一个或多个细胞。去除未结合的细胞鉴定组合物可以包括使用流式细胞术选择与对照组合物的至少一个蛋白质结合试剂结合的细胞。
在一些实施例中，多个蛋白质靶中的至少一个在细胞表面上。该多个蛋白质靶中的至少一个可以包括细胞表面蛋白质、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、整合素、或其任何组合。蛋白质结合试剂可以包括抗体。该对照寡核苷酸可以通过接头与蛋白质结合试剂缀合。该对照寡核苷酸可以包括接头。该接头可以包括化学基团。该化学基团可以可逆地附接至第一蛋白质结合试剂。该化学基团可以包括UV可光解基团、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、二硫键联、或其任何组合。
在一些实施例中，蛋白质结合试剂与具有相同对照条形码序列的两个或更多个对照寡核苷酸相关联。蛋白质结合试剂可以与具有不同相同对照条形码序列的两个或更多个对照寡核苷酸相关联。在一些实施例中，多个对照组合物的第二蛋白质结合试剂不与对照寡核苷酸相关联。蛋白质结合试剂和第二蛋白质结合试剂可以是相同的。
在一些实施例中，条形码包括通用引物的结合位点。该靶结合区可以包括聚(dT)区。在一些实施例中，多个条形码与条形码化颗粒相关联。多个条形码中的至少一个条形码可以被固定在条形码化颗粒上。多个条形码中的至少一个条形码可以被部分固定在条形码化颗粒上。多个条形码中的至少一个条形码被包封在条形码化颗粒中。多个条形码中的至少一个条形码被部分包封在条形码化颗粒中。条形码化颗粒可以是可破坏的。条形码化颗粒可以是条形码化珠。条形码化珠可以包括琼脂糖凝胶珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠、或其任何组合。条形码化颗粒可以包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮、或其任何组合的材料。条形码化颗粒可以包括可破坏的水凝胶颗粒。
在一些实施例中，条形码化颗粒与光学部分相关联。对照寡核苷酸可以与光学部分相关联。
在一些实施例中，该方法包括：使用多个条形码使该对照寡核苷酸条形码化，以创建多个条形码化的对照寡核苷酸，其中该多个条形码中的每一个包括细胞标记序列、条形码序列、和/或靶结合区，其中该多个条形码中至少两个条形码的条形码序列包括不同的序列，并且其中该多个条形码中至少两个条形码包括相同的细胞标记序列；并且获得该多个条形码化的对照寡核苷酸的测序数据；
在一些实施例中，条形码化颗粒的条形码包括选自至少1000、10000或更多种不同的条形码序列的条形码序列。在一些实施例中，条形码的条形码序列包括随机序列。在一些实施例中，条形码化颗粒包括至少10000个条形码。
在一些实施例中，使对照寡核苷酸条形码化包括：使用多个条形码使该对照寡核苷酸条形码化，以创建多个条形码化的对照寡核苷酸。在一些实施例中，使用多个条形码使多种对照寡核苷酸条形码化包括：使该多个条形码与该多个对照组合物的对照寡核苷酸接触以生成与这些对照寡核苷酸杂交的条形码；并且延伸与对照寡核苷酸杂交的条形码以生成多个条形码化的对照寡核苷酸。延伸这些条形码可以包括使用DNA聚合酶、逆转录酶、或其组合延伸这些条形码。在一些实施例中，该方法包括扩增多个条形码化的对照寡核苷酸以产生多个扩增子。扩增多个条形码化的对照寡核苷酸可以包括使用聚合酶链式反应(PCR)对条形码序列的至少一部分和对照寡核苷酸的至少一部分进行扩增。在一些实施例中，获得测序数据包括获得多个扩增子的测序数据。获得测序数据可以包括对条形码序列的至少一部分和对照寡核苷酸的至少一部分进行测序。
本文的披露内容包括用于细胞鉴定的方法。在一些实施例中，该方法包括：使第一多个细胞和第二多个细胞分别与两种细胞鉴定组合物接触，其中第一多个细胞中的每一个和第二多个细胞中的每一个包括一个或多个抗原靶，其中这两种细胞鉴定组合物中的每一种包括与细胞鉴定寡核苷酸相关联的抗原结合试剂，其中该抗原结合试剂能够特异性结合该一个或多个抗原靶中的至少一个，其中该细胞鉴定寡核苷酸包括细胞鉴定序列，并且其中这两种细胞鉴定组合物的细胞鉴定序列包括不同的序列；使用多个条形码使这些细胞鉴定寡核苷酸条形码化，以创建多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸，其中该多个条形码中的每一个包括细胞标记序列、条形码序列(例如，分子标记序列)、和/或靶结合区，其中该多个条形码中至少两个条形码的条形码序列包括不同的序列，并且其中该多个条形码中至少两个条形码包括相同的细胞标记序列；获得该多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸的测序数据；并且鉴定获得的测序数据中与两个或更多个细胞鉴定序列相关联的细胞标记序列；并且从获得的测序数据中去除与细胞标记序列相关联的测序数据和/或从后续分析中排除与细胞标记序列相关联的测序数据。在一些实施例中，细胞鉴定寡核苷酸包括条形码序列、通用引物的结合位点、或其组合。
本文的披露内容包括用于多重态鉴定的方法。在一些实施例中，该方法包括：使第一多个细胞和第二多个细胞分别与两种细胞鉴定组合物接触，其中第一多个细胞中的每一个和第二多个细胞中的每一个包括一个或多个抗原靶，其中这两种细胞鉴定组合物中的每一种包括与细胞鉴定寡核苷酸相关联的抗原结合试剂，其中该抗原结合试剂能够特异性结合该一个或多个抗原靶中的至少一个，其中该细胞鉴定寡核苷酸包括细胞鉴定序列，并且其中这两种细胞鉴定组合物的细胞鉴定序列包括不同的序列；使用多个条形码使这些细胞鉴定寡核苷酸条形码化，以创建多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸，其中该多个条形码中的每一个包括细胞标记序列、条形码序列(例如，分子标记序列)、和/或靶结合区，其中该多个条形码中至少两个条形码的条形码序列包括不同的序列，并且其中该多个条形码中至少两个条形码包括相同的细胞标记序列；获得该多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸的测序数据；并且在获得的测序数据中鉴定各自与两个或更多个细胞鉴定序列相关联的一个或多个多重态细胞标记序列。在一些实施例中，该方法包括：从获得的测序数据中去除与一个或多个多重态细胞标记序列相关联的测序数据和/或从后续分析中排除与一个或多个多重态细胞标记序列相关联的测序数据。在一些实施例中，细胞鉴定寡核苷酸包括条形码序列(例如，分子标记序列)、通用引物的结合位点、或其组合。
在一些实施例中，使第一多个细胞和第二多个细胞分别与两种细胞鉴定组合物接触包括：使该第一多个细胞与这两种细胞鉴定组合物中的第一细胞鉴定组合物接触；并且使第一多个细胞与两种细胞鉴定组合物的第二细胞鉴定组合物接触。
在一些实施例中，细胞鉴定序列长度为至少6个核苷酸、25-60个核苷酸(例如，45个核苷酸)、约128个核苷酸、至少128个核苷酸、约200-500个核苷酸、或其组合。细胞鉴定寡核苷酸长度为约50个核苷酸、约100个核苷酸、约200个核苷酸、至少200个核苷酸、少于约200-300个核苷酸、约500个核苷酸、或其组合。在一些实施例中，多个细胞鉴定组合物中至少10、100、1000、或更多个细胞鉴定组合物的细胞鉴定序列包括不同的序列。
在一些实施例中，抗原结合试剂包括抗体、四聚体、适配子、蛋白质骨架、或其组合。该细胞鉴定寡核苷酸可以通过接头与抗原结合试剂缀合。该寡核苷酸可以包括接头。该接头可以包括化学基团。该化学基团可以可逆或不可逆地附接至抗原结合试剂。该化学基团可以包括UV可光解基团、二硫键、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、二硫键联、或其任何组合。
在一些实施例中，第一多个细胞和第二多个细胞中的至少一个包括单个细胞。一个或多个抗原靶中的至少一个可以在细胞表面上。
在一些实施例中，该方法包括：去除两种细胞鉴定组合物中未结合的细胞鉴定组合物。去除未结合的细胞鉴定组合物可以包括用洗涤缓冲液洗涤第一多个细胞和第二多个细胞的细胞。去除未结合的细胞鉴定组合物可以包括使用流式细胞术选择与这两种细胞鉴定组合物的至少一个抗原结合试剂结合的细胞。在一些实施例中，该方法包括：裂解第一多个细胞和第二多个细胞中的一个或多个细胞。
在一些实施例中，细胞鉴定寡核苷酸被配置为与抗原结合试剂可分离或不可分离。该方法可以包括将细胞鉴定寡核苷酸与抗原结合试剂分离。分离细胞鉴定寡核苷酸可以包括通过UV光解、化学处理(例如，使用还原剂，比如二硫苏糖醇)、加热、酶处理、或其任何组合将细胞鉴定寡核苷酸与抗原结合试剂分离。
在一些实施例中，细胞鉴定寡核苷酸与一个或多个细胞中任一个的基因组序列不同源。对照条形码序列可以与物种的基因组序列不同源。该物种可以是非哺乳动物物种。非哺乳动物物种可以是噬菌体物种。噬菌体物种是T7噬菌体、PhiX噬菌体、或其组合。
在一些实施例中，第一多个细胞和第二多个细胞包括肿瘤细胞、哺乳动物细胞、细菌细胞、病毒细胞、酵母细胞、真菌细胞、或其任何组合。细胞鉴定寡核苷酸可以包括与多个条形码中至少一个条形码的捕获序列互补的序列。条形码可以包括含有捕获序列的靶结合区。该靶结合区可以包括聚(dT)区。与条形码的捕获序列互补的细胞鉴定寡核苷酸的序列可以包括聚(dA)区。
在一些实施例中，抗原靶包括细胞外蛋白质、细胞内蛋白质、或其任何组合。抗原靶可以包括细胞表面蛋白质、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、整合素、或其任何组合。抗原靶可以包括脂质、碳水化合物、或其任何组合。抗原靶可以选自包括10-100个不同抗原靶的组。
在一些实施例中，抗原结合试剂与具有相同序列的两个或更多个细胞鉴定寡核苷酸相关联。抗原结合试剂可以与具有不同细胞鉴定序列的两个或更多个细胞鉴定寡核苷酸相关联。多个细胞鉴定组合物的细胞鉴定组合物可以包括不与细胞鉴定寡核苷酸缀合的第二抗原结合试剂。抗原结合试剂和第二抗原结合试剂可以是相同的。
在一些实施例中，多个条形码的条形码包括靶结合区和条形码序列(例如，分子标记序列)，并且多个条形码中至少两个条形码的条形码序列包括不同的分子标记序列。条形码可以包括细胞标记序列、通用引物的结合位点、或其任何组合。该靶结合区可以包括聚(dT)区。
在一些实施例中，多个条形码可以与颗粒相关联。多个条形码中的至少一个条形码可以被固定在颗粒上。多个条形码中的至少一个条形码可以被部分固定在颗粒上。多个条形码中的至少一个条形码可以被包封在颗粒中。多个条形码中的至少一个条形码可以被部分包封在颗粒中。颗粒可以是可破坏的。颗粒可以是珠。珠可以包括琼脂糖凝胶珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠、或其任何组合。颗粒可以包括选自下组的材料，该组由以下组成：聚二甲基硅氧烷/(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮、及其任何组合。颗粒可以包括可破坏的水凝胶颗粒。
在一些实施例中，抗原结合试剂与可检测部分相关联。在一些实施例中，颗粒与可检测部分相关联。细胞鉴定寡核苷酸与光学部分相关联。在一些实施例中，颗粒的条形码可以包括选自至少1000、10000、或更多个不同条形码序列的条形码序列。条形码的条形码序列可以包括随机序列。颗粒可以包括至少10000个条形码。
在一些实施例中，使用多个条形码使细胞鉴定寡核苷酸条形码化，包括：使该多个条形码与这些细胞鉴定寡核苷酸接触以生成与这些细胞鉴定寡核苷酸杂交的条形码；并且延伸与细胞鉴定寡核苷酸杂交的条形码以生成多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸。延伸这些条形码可以包括使用DNA聚合酶延伸这些条形码以生成多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸。延伸这些条形码可以包括使用逆转录酶延伸这些条形码以生成多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸。
在一些实施例中，该方法包括：扩增多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸以产生多个扩增子。扩增多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸可以包括使用聚合酶链式反应(PCR)对条形码序列的至少一部分和细胞鉴定寡核苷酸的至少一部分进行扩增。在一些实施例中，获得多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸的测序数据可以包括获得该多个扩增子的测序数据。获得测序数据包括对条形码序列的至少一部分和细胞鉴定寡核苷酸的至少一部分进行测序。在一些实施例中，鉴定至少一个细胞的样品来源包括基于至少一个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸的细胞鉴定序列鉴定多个条形码化的靶的样品来源。
在一些实施例中，使用多个条形码使细胞鉴定寡核苷酸条形码化以创建多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸包括使用多个随机条形码使细胞鉴定寡核苷酸随机条形码化以创建多个随机条形码化的细胞鉴定寡核苷酸。
在一些实施例中，该方法包括：使用该多个条形码使该细胞的多个靶条形码化，以创建多个条形码化的靶，其中该多个条形码中的每一个包括细胞标记序列，并且其中该多个条形码中至少两个条形码包括相同的细胞标记序列；并且获得条形码化的靶的测序数据。使用多个条形码使多个靶条形码化以创建多个条形码化的靶可以包括：使这些靶的拷贝与这些条形码的靶结合区接触；并且使用多个条形码逆转录该多个靶以创建多个经逆转录的靶。
在一些实施例中，该方法包括：在获得该多个条形码化的靶的测序数据之前，扩增这些条形码化的靶以创建多个经扩增的条形码化的靶。扩增条形码化的靶以生成多个经扩增的条形码化的靶可以包括：通过聚合酶链式反应(PCR)扩增这些条形码化的靶。使用多个条形码使细胞的多个靶条形码化以创建多个条形码化的靶可以包括使用多个随机条形码使细胞的多个靶随机条形码化以创建多个随机条形码化的靶。
本文的披露内容包括用于细胞鉴定的方法。在一些实施例中，该方法包括：使第一多个细胞和第二多个细胞分别与两种细胞鉴定组合物接触，其中第一多个细胞中的每一个和第二多个细胞中的每一个包括一个或多个细胞组分靶，其中这两种细胞鉴定组合物中的每一种包括与细胞鉴定寡核苷酸相关联的细胞组分结合试剂，其中该细胞组分结合试剂能够特异性结合该一个或多个细胞组分靶中的至少一个，其中该细胞鉴定寡核苷酸包括细胞鉴定序列，并且其中多个细胞鉴定组合物中的这两种细胞鉴定组合物的细胞鉴定序列包括不同的序列；使用多个条形码使这些细胞鉴定寡核苷酸条形码化，以创建多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸，其中该多个条形码中的每一个包括细胞标记序列、条形码序列(例如，分子标记序列)、和/或靶结合区，其中该多个条形码中至少两个条形码的条形码序列包括不同的序列，并且其中该多个条形码中至少两个条形码包括相同的细胞标记序列；获得该多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸的测序数据；鉴定获得的测序数据中各自与两个或更多个细胞鉴定序列相关联的一个或多个细胞标记序列；并且从获得测序数据中去除各自与两个或更多个细胞鉴定序列相关联的一个或多个细胞标记序列相关联的测序数据和/或从后续分析中各自与两个或更多个细胞鉴定序列相关联的一个或多个细胞标记序列相关联的测序数据。在一些实施例中，细胞鉴定寡核苷酸包括条形码序列(例如，分子标记序列)、通用引物的结合位点、或其组合。
本文的披露内容包括用于多重态鉴定的方法。在一些实施例中，该方法包括：使第一多个细胞和第二多个细胞分别与两种细胞鉴定组合物接触，其中第一多个细胞中的每一个和第二多个细胞中的每一个包括一个或多个细胞组分靶，其中这两种细胞鉴定组合物中的每一种包括与细胞鉴定寡核苷酸相关联的细胞组分结合试剂，其中该细胞组分结合试剂能够特异性结合该一个或多个细胞组分靶中的至少一个，其中该细胞鉴定寡核苷酸包括细胞鉴定序列，并且其中多个细胞鉴定组合物中的这两种细胞鉴定组合物的细胞鉴定序列包括不同的序列；使用多个条形码使这些细胞鉴定寡核苷酸条形码化，以创建多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸，其中该多个条形码中的每一个包括细胞标记序列、条形码序列(例如，分子标记序列)、和/或靶结合区，其中该多个条形码中至少两个条形码的条形码序列包括不同的序列，并且其中该多个条形码中至少两个条形码包括相同的细胞标记序列；获得该多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸的测序数据；鉴定获得的测序数据中各自与两个或更多个细胞鉴定序列相关联的一个或多个多重态细胞标记序列。在一些实施例中，该方法包括：从获得的测序数据中去除与一个或多个多重态细胞标记序列相关联的测序数据和/或从后续分析中排除与一个或多个多重态细胞标记序列相关联的测序数据。在一些实施例中，细胞鉴定寡核苷酸包括条形码序列(例如，分子标记序列)、通用引物的结合位点、或其组合。
在一些实施例中，使第一多个细胞和第二多个细胞分别与两种细胞鉴定组合物接触包括：使该第一多个细胞与这两种细胞鉴定组合物中的第一细胞鉴定组合物接触；并且使第一多个细胞与两种细胞鉴定组合物的第二细胞鉴定组合物接触。
在一些实施例中，细胞鉴定序列长度为至少6个核苷酸、25-60个核苷酸(例如，45个核苷酸)、约128个核苷酸、至少128个核苷酸、约200-500个核苷酸、或其组合。细胞鉴定寡核苷酸长度为约50个核苷酸、约100个核苷酸、约200个核苷酸、至少200个核苷酸、少于约200-300个核苷酸、约500个核苷酸、或其组合。在一些实施例中，多个细胞鉴定组合物中至少10、100、1000、或更多个细胞鉴定组合物的细胞鉴定序列包括不同的序列。
在一些实施例中，细胞组分结合试剂包括抗体、四聚体、适配子、蛋白质骨架、或其组合。该细胞鉴定寡核苷酸可以通过接头与细胞组分结合试剂缀合。该寡核苷酸可以包括接头。该接头可以包括化学基团。该化学基团可以可逆或不可逆地附接至细胞组分结合试剂。该化学基团可以包括UV可光解基团、二硫键、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、二硫键联、或其任何组合。
在一些实施例中，第一多个细胞和第二多个细胞中的至少一个包括单个细胞。一个或多个细胞组分靶中的至少一个可以在细胞表面上。
在一些实施例中，该方法包括：去除两种细胞鉴定组合物中未结合的细胞鉴定组合物。去除未结合的细胞鉴定组合物可以包括用洗涤缓冲液洗涤第一多个细胞和第二多个细胞的细胞。去除未结合的细胞鉴定组合物可以包括使用流式细胞术选择与这两种细胞鉴定组合物的至少一个细胞组分结合试剂结合的细胞。在一些实施例中，该方法包括：裂解第一多个细胞和第二多个细胞中的一个或多个细胞。
在一些实施例中，细胞鉴定寡核苷酸被配置为与细胞组分结合试剂可分离或不可分离。该方法可以包括将细胞鉴定寡核苷酸与细胞组分结合试剂分离。分离细胞鉴定寡核苷酸可以包括通过UV光解、化学处理(例如，使用还原剂，比如二硫苏糖醇)、加热、酶处理、或其任何组合将细胞鉴定寡核苷酸与细胞组分结合试剂分离。
在一些实施例中，细胞鉴定寡核苷酸与一个或多个细胞中任一个的基因组序列不同源。对照条形码序列可以与物种的基因组序列不同源。该物种可以是非哺乳动物物种。非哺乳动物物种可以是噬菌体物种。噬菌体物种是T7噬菌体、PhiX噬菌体、或其组合。
在一些实施例中，第一多个细胞和第二多个细胞包括肿瘤细胞、哺乳动物细胞、细菌细胞、病毒细胞、酵母细胞、真菌细胞、或其任何组合。细胞鉴定寡核苷酸可以包括与多个条形码中至少一个条形码的捕获序列互补的序列。条形码可以包括含有捕获序列的靶结合区。该靶结合区可以包括聚(dT)区。与条形码的捕获序列互补的细胞鉴定寡核苷酸的序列可以包括聚(dA)区。
在一些实施例中，抗原靶包括细胞外蛋白质、细胞内蛋白质、或其任何组合。抗原靶可以包括细胞表面蛋白质、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、整合素、或其任何组合。抗原靶可以包括脂质、碳水化合物、或其任何组合。抗原靶可以选自包括10-100个不同抗原靶的组。
在一些实施例中，细胞组分结合试剂与具有相同序列的两个或更多个细胞鉴定寡核苷酸相关联。细胞组分结合试剂可以与具有不同细胞鉴定序列的两个或更多个细胞鉴定寡核苷酸相关联。多个细胞鉴定组合物的细胞鉴定组合物可以包括不与细胞鉴定寡核苷酸缀合的第二细胞组分结合试剂。细胞组分结合试剂和第二细胞组分结合试剂可以是相同的。
在一些实施例中，多个条形码的条形码包括靶结合区和条形码序列(例如，分子标记序列)，并且多个条形码中至少两个条形码的条形码序列包括不同的分子标记序列。条形码可以包括细胞标记序列、通用引物的结合位点、或其任何组合。该靶结合区可以包括聚(dT)区。
在一些实施例中，多个条形码可以与颗粒相关联。多个条形码中的至少一个条形码可以被固定在颗粒上。多个条形码中的至少一个条形码可以被部分固定在颗粒上。多个条形码中的至少一个条形码可以被包封在颗粒中。多个条形码中的至少一个条形码可以被部分包封在颗粒中。颗粒可以是可破坏的。颗粒可以是珠。珠可以包括琼脂糖凝胶珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠、或其任何组合。颗粒可以包括选自下组的材料，该组由以下组成：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮、及其任何组合。颗粒可以包括可破坏的水凝胶颗粒。
在一些实施例中，细胞组分结合试剂与可检测部分相关联。在一些实施例中，颗粒与可检测部分相关联。细胞鉴定寡核苷酸与光学部分相关联。
在一些实施例中，颗粒的条形码可以包括选自至少1000、10000、或更多种不同条形码序列的条形码序列。条形码的条形码序列可以包括随机序列。颗粒可以包括至少10000个条形码。
在一些实施例中，使用多个条形码使细胞鉴定寡核苷酸条形码化，包括：使该多个条形码与这些细胞鉴定寡核苷酸接触以生成与这些细胞鉴定寡核苷酸杂交的条形码；并且延伸与细胞鉴定寡核苷酸杂交的条形码以生成多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸。延伸这些条形码可以包括使用DNA聚合酶延伸这些条形码以生成多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸。延伸这些条形码可以包括使用逆转录酶延伸这些条形码以生成多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸。
在一些实施例中，该方法包括：扩增多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸以产生多个扩增子。扩增多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸可以包括使用聚合酶链式反应(PCR)对条形码序列的至少一部分和细胞鉴定寡核苷酸的至少一部分进行扩增。在一些实施例中，获得多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸的测序数据可以包括获得该多个扩增子的测序数据。获得测序数据包括对条形码序列的至少一部分和细胞鉴定寡核苷酸的至少一部分进行测序。在一些实施例中，鉴定至少一个细胞的样品来源包括基于至少一个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸的细胞鉴定序列鉴定多个条形码化的靶的样品来源。
在一些实施例中，使用多个条形码使细胞鉴定寡核苷酸条形码化以创建多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸包括使用多个随机条形码使细胞鉴定寡核苷酸随机条形码化以创建多个随机条形码化的细胞鉴定寡核苷酸。
在一些实施例中，该方法包括：使用该多个条形码使该细胞的多个靶条形码化，以创建多个条形码化的靶，其中该多个条形码中的每一个包括细胞标记序列，并且其中该多个条形码中至少两个条形码包括相同的细胞标记序列；并且获得条形码化的靶的测序数据。使用多个条形码使多个靶条形码化以创建多个条形码化的靶可以包括：使这些靶的拷贝与这些条形码的靶结合区接触；并且使用多个条形码逆转录该多个靶以创建多个经逆转录的靶。
在一些实施例中，该方法包括：在获得该多个条形码化的靶的测序数据之前，扩增这些条形码化的靶以创建多个经扩增的条形码化的靶。扩增条形码化的靶以生成多个经扩增的条形码化的靶可以包括：通过聚合酶链式反应(PCR)扩增这些条形码化的靶。使用多个条形码使细胞的多个靶条形码化以创建多个条形码化的靶可以包括使用多个随机条形码使细胞的多个靶随机条形码化以创建多个随机条形码化的靶。
本文的披露内容包括用于细胞鉴定的方法。在一些实施例中，该方法包括：使来自第一多个细胞和第二多个细胞中每一个的一个或多个细胞分别与多个两种细胞鉴定组合物的细胞鉴定组合物接触，其中第一多个细胞中的每一个和第二多个细胞中的每一个包括一个或多个抗原靶，其中这两种细胞鉴定组合物中的每一种包括与细胞鉴定寡核苷酸相关联的抗原结合试剂，其中该抗原结合试剂能够特异性结合该一个或多个抗原靶中的至少一个，其中该细胞鉴定寡核苷酸包括细胞鉴定序列，并且其中这两种细胞鉴定组合物的细胞鉴定序列包括不同的序列；并且鉴定各自与两个或更多个细胞鉴定序列相关联的一个或多个细胞。在一些实施例中，细胞鉴定寡核苷酸包括条形码序列、通用引物的结合位点、或其组合。
本文的披露内容是用于多重态鉴定的方法。在一些实施例中，该方法包括：使来自第一多个细胞和第二多个细胞中每一个的一个或多个细胞分别与多个两种细胞鉴定组合物的细胞鉴定组合物接触，其中第一多个细胞中的每一个和第二多个细胞中的每一个包括一个或多个抗原靶，其中这两种细胞鉴定组合物中的每一种包括与细胞鉴定寡核苷酸相关联的抗原结合试剂，其中该抗原结合试剂能够特异性结合该一个或多个抗原靶中的至少一个，其中该细胞鉴定寡核苷酸包括细胞鉴定序列，并且其中这两种细胞鉴定组合物的细胞鉴定序列包括不同的序列；并且鉴定各自与两个或更多个细胞鉴定序列相关联的一个或多个细胞作为多重态细胞(multiplet cell)。
在一些实施例中，鉴定各自与两个或更多个细胞鉴定序列相关联的细胞包括：使用多个条形码使这些细胞鉴定寡核苷酸条形码化，以创建多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸，其中该多个条形码中的每一个包括细胞标记序列、条形码序列(例如，分子标记序列)、和/或靶结合区，其中该多个条形码中至少两个条形码的条形码序列包括不同的序列，并且其中该多个条形码中至少两个条形码包括相同的细胞标记序列；获得该多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸的测序数据；并且在获得的测序数据中鉴定各自与两个或更多个细胞鉴定序列相关联的一个或多个细胞标记序列。该方法可以包括从获得测序数据中去除各自与两个或更多个细胞鉴定序列相关联的一个或多个细胞标记序列相关联的测序数据和/或从后续分析中各自与两个或更多个细胞鉴定序列相关联的一个或多个细胞标记序列相关联的测序数据。
在一些实施例中，使第一多个细胞和第二多个细胞分别与两种细胞鉴定组合物接触包括：使该第一多个细胞与这两种细胞鉴定组合物中的第一细胞鉴定组合物接触；并且使第一多个细胞与两种细胞鉴定组合物的第二细胞鉴定组合物接触。
在一些实施例中，细胞鉴定序列长度为至少6个核苷酸、25-60个核苷酸(例如，45个核苷酸)、约128个核苷酸、至少128个核苷酸、约200-500个核苷酸、或其组合。细胞鉴定寡核苷酸长度为约50个核苷酸、约100个核苷酸、约200个核苷酸、至少200个核苷酸、少于约200-300个核苷酸、约500个核苷酸、或其组合。在一些实施例中，多个细胞鉴定组合物中至少10、100、1000、或更多个细胞鉴定组合物的细胞鉴定序列包括不同的序列。
在一些实施例中，抗原结合试剂包括抗体、四聚体、适配子、蛋白质骨架、或其组合。该细胞鉴定寡核苷酸可以通过接头与抗原结合试剂缀合。该寡核苷酸可以包括接头。该接头可以包括化学基团。该化学基团可以可逆或不可逆地附接至抗原结合试剂。该化学基团可以包括UV可光解基团、二硫键、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、二硫键联、或其任何组合。
在一些实施例中，第一多个细胞和第二多个细胞中的至少一个包括单个细胞。一个或多个抗原靶中的至少一个可以在细胞表面上。在一些实施例中，该方法包括：去除两种细胞鉴定组合物中未结合的细胞鉴定组合物。去除未结合的细胞鉴定组合物可以包括用洗涤缓冲液洗涤第一多个细胞和第二多个细胞的细胞。去除未结合的细胞鉴定组合物可以包括使用流式细胞术选择与这两种细胞鉴定组合物的至少一个抗原结合试剂结合的细胞。在一些实施例中，该方法包括：裂解第一多个细胞和第二多个细胞中的一个或多个细胞。
在一些实施例中，细胞鉴定寡核苷酸被配置为与抗原结合试剂可分离或不可分离。该方法可以包括将细胞鉴定寡核苷酸与抗原结合试剂分离。分离细胞鉴定寡核苷酸可以包括通过UV光解、化学处理(例如，使用还原剂，比如二硫苏糖醇)、加热、酶处理、或其任何组合将细胞鉴定寡核苷酸与抗原结合试剂分离。
在一些实施例中，细胞鉴定寡核苷酸与一个或多个细胞中任一个的基因组序列不同源。对照条形码序列可以与物种的基因组序列不同源。该物种可以是非哺乳动物物种。非哺乳动物物种可以是噬菌体物种。噬菌体物种是T7噬菌体、PhiX噬菌体、或其组合。
在一些实施例中，第一多个细胞和第二多个细胞包括肿瘤细胞、哺乳动物细胞、细菌细胞、病毒细胞、酵母细胞、真菌细胞、或其任何组合。细胞鉴定寡核苷酸可以包括与多个条形码中至少一个条形码的捕获序列互补的序列。条形码可以包括含有捕获序列的靶结合区。该靶结合区可以包括聚(dT)区。与条形码的捕获序列互补的细胞鉴定寡核苷酸的序列可以包括聚(dA)区。
在一些实施例中，抗原靶包括细胞外蛋白质、细胞内蛋白质、或其任何组合。抗原靶可以包括细胞表面蛋白质、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、整合素、或其任何组合。抗原靶可以包括脂质、碳水化合物、或其任何组合。抗原靶可以选自包括10-100个不同抗原靶的组。
在一些实施例中，抗原结合试剂与具有相同序列的两个或更多个细胞鉴定寡核苷酸相关联。抗原结合试剂可以与具有不同细胞鉴定序列的两个或更多个细胞鉴定寡核苷酸相关联。多个细胞鉴定组合物的细胞鉴定组合物可以包括不与细胞鉴定寡核苷酸缀合的第二抗原结合试剂。抗原结合试剂和第二抗原结合试剂可以是相同的。
在一些实施例中，多个条形码的条形码包括靶结合区和条形码序列(例如，分子标记序列)，并且多个条形码中至少两个条形码的条形码序列包括不同的分子标记序列。条形码可以包括细胞标记序列、通用引物的结合位点、或其任何组合。该靶结合区可以包括聚(dT)区。
在一些实施例中，多个条形码可以与颗粒相关联。多个条形码中的至少一个条形码可以被固定在颗粒上。多个条形码中的至少一个条形码可以被部分固定在颗粒上。多个条形码中的至少一个条形码可以被包封在颗粒中。多个条形码中的至少一个条形码可以被部分包封在颗粒中。颗粒可以是可破坏的。颗粒可以是珠。珠可以包括琼脂糖凝胶珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠、或其任何组合。颗粒可以包括选自下组的材料，该组由以下组成：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮、及其任何组合。颗粒可以包括可破坏的水凝胶颗粒。
在一些实施例中，抗原结合试剂与可检测部分相关联。在一些实施例中，颗粒与可检测部分相关联。细胞鉴定寡核苷酸与光学部分相关联。
在一些实施例中，颗粒的条形码可以包括选自至少1000、10000、或更多种不同条形码序列的条形码序列。条形码的条形码序列可以包括随机序列。颗粒可以包括至少10000个条形码。
在一些实施例中，使用多个条形码使细胞鉴定寡核苷酸条形码化，包括：使该多个条形码与这些细胞鉴定寡核苷酸接触以生成与这些细胞鉴定寡核苷酸杂交的条形码；并且延伸与细胞鉴定寡核苷酸杂交的条形码以生成多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸。延伸这些条形码可以包括使用DNA聚合酶延伸这些条形码以生成多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸。延伸这些条形码可以包括使用逆转录酶延伸这些条形码以生成多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸。
在一些实施例中，该方法包括：扩增多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸以产生多个扩增子。扩增多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸可以包括使用聚合酶链式反应(PCR)对条形码序列的至少一部分和细胞鉴定寡核苷酸的至少一部分进行扩增。在一些实施例中，获得多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸的测序数据可以包括获得该多个扩增子的测序数据。获得测序数据包括对条形码序列的至少一部分和细胞鉴定寡核苷酸的至少一部分进行测序。在一些实施例中，鉴定至少一个细胞的样品来源包括基于至少一个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸的细胞鉴定序列鉴定多个条形码化的靶的样品来源。
在一些实施例中，使用多个条形码使细胞鉴定寡核苷酸条形码化以创建多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸包括使用多个随机条形码使细胞鉴定寡核苷酸随机条形码化以创建多个随机条形码化的细胞鉴定寡核苷酸。
在一些实施例中，该方法包括：使用该多个条形码使该细胞的多个靶条形码化，以创建多个条形码化的靶，其中该多个条形码中的每一个包括细胞标记序列，并且其中该多个条形码中至少两个条形码包括相同的细胞标记序列；并且获得条形码化的靶的测序数据。使用多个条形码使多个靶条形码化以创建多个条形码化的靶可以包括：使这些靶的拷贝与这些条形码的靶结合区接触；并且使用多个条形码逆转录该多个靶以创建多个经逆转录的靶。
在一些实施例中，该方法包括：在获得该多个条形码化的靶的测序数据之前，扩增这些条形码化的靶以创建多个经扩增的条形码化的靶。扩增条形码化的靶以生成多个经扩增的条形码化的靶可以包括：通过聚合酶链式反应(PCR)扩增这些条形码化的靶。使用多个条形码使细胞的多个靶条形码化以创建多个条形码化的靶可以包括使用多个随机条形码使细胞的多个靶随机条形码化以创建多个随机条形码化的靶。
本文披露的是用于确定蛋白质相互作用的方法。在一些实施例中，该方法包括：使细胞与第一对相互作用确定组合物接触，其中该细胞包括第一蛋白质靶和第二蛋白质靶，其中该第一对相互作用确定组合物中的每一个包括与相互作用确定寡核苷酸相关联的蛋白质结合试剂，其中该第一对相互作用确定组合物中之一的蛋白质结合试剂能够特异性结合第一蛋白质靶，并且该第一对相互作用确定组合物中另一个的蛋白质结合试剂能够特异性结合第二蛋白质靶，并且其中该相互作用确定寡核苷酸包括相互作用确定序列和桥寡核苷酸杂交区，并且其中该第一对相互作用确定组合物的相互作用确定序列包括不同的序列；使用桥寡核苷酸连接该第一对相互作用确定组合物的相互作用确定寡核苷酸以生成经连接的相互作用确定寡核苷酸，其中该桥寡核苷酸包括能够特异性结合该第一对相互作用确定组合物的桥寡核苷酸杂交区的两个杂交区；使用多个条形码使经连接的相互作用确定寡核苷酸条形码化以创建多个条形码化的相互作用确定寡核苷酸，其中该多个条形码中的每一个包括条形码序列和捕获序列；获得多个条形码化的相互作用确定寡核苷酸的测序数据；并且基于在获得的测序数据中该第一对相互作用确定组合物的相互作用确定序列的关联，确定第一和第二蛋白质靶之间的相互作用。
在一些实施例中，该方法包括：使细胞与第一对相互作用确定组合物接触，其中该细胞包括第一细胞组分靶和第二细胞组分靶，其中该第一对相互作用确定组合物中的每一个包括与相互作用确定寡核苷酸相关联的细胞组分结合试剂，其中该第一对相互作用确定组合物中之一的细胞组分结合试剂能够特异性结合第一细胞组分靶，并且该第一对相互作用确定组合物中另一个的细胞组分结合试剂能够特异性结合第二细胞组分靶，并且其中该相互作用确定寡核苷酸包括相互作用确定序列和桥寡核苷酸杂交区，并且其中该第一对相互作用确定组合物的相互作用确定序列包括不同的序列；使用桥寡核苷酸连接该第一对相互作用确定组合物的相互作用确定寡核苷酸以生成经连接的相互作用确定寡核苷酸，其中该桥寡核苷酸包括能够特异性结合该第一对相互作用确定组合物的桥寡核苷酸杂交区的两个杂交区；使用多个条形码使经连接的相互作用确定寡核苷酸条形码化以创建多个条形码化的相互作用确定寡核苷酸，其中该多个条形码中的每一个包括条形码序列和捕获序列；获得多个条形码化的相互作用确定寡核苷酸的测序数据；并且基于在获得的测序数据中该第一对相互作用确定组合物的相互作用确定序列的关联，确定第一和第二细胞组分靶之间的相互作用。在一些实施例中，两个细胞组分结合试剂中至少一个包括蛋白质结合试剂，其中该蛋白质结合试剂与两个相互作用确定寡核苷酸中之一相关联，并且其中该一个或多个细胞组分靶包括至少一个蛋白质靶。
在一些实施例中，使细胞与第一对相互作用确定组合物接触包括：使细胞与第一对相互作用确定组合物中的每一个依次或同时接触。第一蛋白质靶可以与第二蛋白质靶相同。第一蛋白质靶可以与第二蛋白质靶不同。
在一些实施例中，相互作用确定序列长度为至少6个核苷酸、25-60个核苷酸、约45个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸、约128个核苷酸、至少128个核苷酸、约200个核苷酸、至少200个核苷酸、少于约200-300个核苷酸、约200-500个核苷酸、约500个核苷酸、或其任何组合。
在一些实施例中，该方法包括使细胞与第二对相互作用确定组合物接触，其中该细胞包括第三蛋白质靶和第四蛋白质靶，其中该第二对相互作用确定组合物中的每个包括与相互作用确定寡核苷酸相关联的蛋白质结合试剂，其中该第二对相互作用确定组合物中之一的蛋白质结合试剂能够特异性结合第三蛋白质靶，并且该第二对相互作用确定组合物中另一个的蛋白质结合试剂能够特异性结合第四蛋白质靶。第三和第四蛋白质靶中的至少一个可以与第一和第二蛋白质靶不同。第三和第四蛋白质靶中的至少一个以及第一和第二蛋白质靶中的至少一个可以是相同的。
在一些实施例中，该方法包括使细胞与三对或更多对相互作用确定组合物接触。多对相互作用确定组合物的至少10、100、1000个、或其任何组合的相互作用确定组合物的相互作用确定序列可以包括不同的序列。
在一些实施例中，第一对相互作用确定组合物的桥寡核苷酸杂交区包括不同的序列。桥寡核苷酸杂交区中的至少一个可以与桥寡核苷酸中的两个杂交区中的至少一个互补。
在一些实施例中，使用桥寡核苷酸连接第一对相互作用确定组合物的相互作用确定寡核苷酸包括：将桥寡核苷酸的第一杂交区与相互作用确定寡核苷酸的桥寡核苷酸杂交区中的第一桥寡核苷酸杂交区杂交；将桥寡核苷酸的第二杂交区与相互作用确定寡核苷酸的桥寡核苷酸杂交区中的第二桥寡核苷酸杂交区杂交；并且连接与桥寡核苷酸杂交的相互作用确定寡核苷酸以生成经连接的相互作用确定寡核苷酸。
在一些实施例中，蛋白质结合试剂包括抗体、四聚体、适配子、蛋白质骨架、整合素、或其组合。
在一些实施例中，相互作用确定寡核苷酸通过接头与蛋白质结合试剂缀合。该寡核苷酸可以包括接头。该接头可以包括化学基团。该化学基团可以可逆或不可逆地附接至蛋白质结合试剂。该化学基团可以包括UV可光解基团、二硫键、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、二硫键联、或其任何组合。一个或多个蛋白质靶中的至少一个可以在细胞表面上。
在一些实施例中，该方法包括：在使细胞与第一对相互作用确定组合物接触之前固定细胞。该方法可以包括：去除第一对相互作用确定组合物中未结合的相互作用确定组合物。去除未结合的相互作用确定组合物可以包括用洗涤缓冲液洗涤细胞。去除未结合的相互作用确定组合物可以包括使用流式细胞术选择细胞。该方法可以包括裂解细胞。
在一些实施例中，相互作用确定寡核苷酸被配置为与蛋白质结合试剂可分离或不可分离。该方法可以包括将相互作用确定寡核苷酸与蛋白质结合试剂分离。分离相互作用确定寡核苷酸可以包括通过UV光解、化学处理、加热、酶处理、或其任何组合将相互作用确定寡核苷酸与蛋白质结合试剂分离。
在一些实施例中，相互作用确定寡核苷酸与细胞的基因组序列不同源。相互作用确定寡核苷酸可以与物种的基因组序列同源。该物种可以是非哺乳动物物种。非哺乳动物物种可以是噬菌体物种。噬菌体物种可以是T7噬菌体、PhiX噬菌体、或其组合。
在一些实施例中，细胞包括肿瘤细胞或非肿瘤细胞。该细胞可以包括哺乳动物细胞、细菌细胞、病毒细胞、酵母细胞、真菌细胞、或其任何组合。
在一些实施例中，该方法包括：使两个或更多个细胞与第一对相互作用确定组合物接触，并且其中该两个或更多个细胞中的每一个包括第一和第二蛋白质靶。该两个或更多个细胞中的至少一个细胞可以包括单个细胞。
在一些实施例中，条形码包括细胞标记序列、通用引物的结合位点、或其任何组合。多个条形码中至少两个条形码可以包括相同的细胞标记序列。第一对相互作用确定组合物中之一的相互作用确定寡核苷酸可以包括与捕获序列互补的序列。捕获序列可以包括聚(dT)区。与捕获序列互补的相互作用确定寡核苷酸的序列可以包括聚(dA)区。相互作用确定寡核苷酸可以包括第二条形码序列。第一对相互作用确定组合物中另一个的相互作用确定寡核苷酸可以包括通用引物的结合位点。
在一些实施例中，蛋白质靶包括细胞外蛋白质、细胞内蛋白质、或其任何组合。蛋白质靶可以包括细胞表面蛋白质、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、整合素、或其任何组合。
在一些实施例中，蛋白质靶包括脂质、碳水化合物、或其任何组合。蛋白质靶可以选自包括10-100个不同蛋白质靶的组。
在一些实施例中，蛋白质结合试剂与具有相同序列的两个或更多个相互作用确定寡核苷酸相关联。蛋白质结合试剂可以与具有不同相互作用确定序列的两个或更多个相互作用确定寡核苷酸相关联。
在一些实施例中，多个相互作用确定组合物中的一个包括不与相互作用确定寡核苷酸相关联的第二蛋白质结合试剂。蛋白质结合试剂和第二蛋白质结合试剂可以是相同的。蛋白质结合试剂可以与可检测部分相关联。
在一些实施例中，多个条形码与颗粒相关联。多个条形码中的至少一个条形码可以被固定在颗粒上。多个条形码中的至少一个条形码可以被部分固定在颗粒上。多个条形码中的至少一个条形码可以被包封在颗粒中。多个条形码中的至少一个条形码可以被部分包封在颗粒中。颗粒可以是可破坏的。颗粒可以包括珠。颗粒可以包括琼脂糖凝胶珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠、或其任何组合。颗粒可以包括选自下组的材料，该组由以下组成：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮、及其任何组合。颗粒可以包括可破坏的水凝胶颗粒。颗粒可以与可检测部分相关联。相互作用确定寡核苷酸可以与可检测部分相关联。颗粒的条形码包括条形码序列，所述条形码序列可以选自、约是、至少是、至多是1000、10000、或更多个、或更少个、或其任何组合的不同的条形码序列。条形码的条形码序列可以包括随机序列。颗粒可以包括至少10000个条形码。
在一些实施例中，使用多个条形码使相互作用确定寡核苷酸条形码化包括：使多个条形码与相互作用确定寡核苷酸接触以生成与相互作用确定寡核苷酸杂交的条形码；并且延伸与相互作用确定寡核苷酸杂交的条形码以生成多个条形码化的相互作用确定寡核苷酸。延伸这些条形码可以包括使用DNA聚合酶延伸这些条形码以生成多个条形码化的相互作用确定寡核苷酸。延伸这些条形码可以包括使用逆转录酶延伸这些条形码以生成多个条形码化的相互作用确定寡核苷酸。延伸这些条形码可以包括使用莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶或Taq DNA聚合酶延伸这些条形码以生成多个条形码化的相互作用确定寡核苷酸。延伸这些条形码可以包括从经连接的相互作用确定寡核苷酸置换桥寡核苷酸。该方法可以包括：扩增多个条形码化的相互作用确定寡核苷酸以产生多个扩增子。扩增多个条形码化的相互作用确定寡核苷酸可以包括使用聚合酶链式反应(PCR)对条形码序列的至少一部分和相互作用确定寡核苷酸的至少一部分进行扩增。
在一些实施例中，获得多个条形码化的相互作用确定寡核苷酸的测序数据可以包括获得该多个扩增子的测序数据。获得测序数据可以包括对条形码序列的至少一部分和相互作用确定寡核苷酸的至少一部分进行测序。获得多个条形码化的相互作用确定寡核苷酸的测序数据可以包括获得多个条形码化的相互作用确定寡核苷酸的部分和/或完整的序列。
在一些实施例中，其中多个条形码包括多种随机条形码，其中该多个随机条形码中每一个的条形码序列包括分子标记序列，其中该多个随机条形码中至少两个随机条形码的分子标记序列包括不同的序列，并且其中使用多个条形码使相互作用确定寡核苷酸条形码化以创建多个条形码化的相互作用确定寡核苷酸包括使用该多个随机条形码使相互作用确定寡核苷酸随机条形码化以创建多个随机条形码化的相互作用确定寡核苷酸。
在一些实施例中，使用多个条形码使细胞的多个靶条形码化以创建多个条形码化的靶；并且获得条形码化的靶的测序数据。使用多个条形码使多个靶条形码化以创建多个条形码化的靶可以包括：使这些靶的拷贝与这些条形码的靶结合区接触；并且使用多个条形码逆转录该多个靶以创建多个经逆转录的靶。
在一些实施例中，该方法可包括：在获得该多个条形码化的靶的测序数据之前，扩增这些条形码化的靶以创建多个经扩增的条形码化的靶。扩增条形码化的靶以生成多个经扩增的条形码化的靶可以包括：通过聚合酶链式反应(PCR)扩增这些条形码化的靶。使用多个条形码使细胞的多个靶条形码化以创建多个条形码化的靶可以包括使用多个随机条形码使细胞的多个靶随机条形码化以创建多个随机条形码化的靶。
本文披露的实施例包括用于鉴定蛋白质相互作用的试剂盒。在一些实施例中，该试剂盒包括：第一对相互作用确定组合物，其中该第一对相互作用确定组合物中的每一个包括与相互作用确定寡核苷酸相关联的蛋白质结合试剂，其中该第一对相互作用确定组合物中之一的蛋白质结合试剂能够特异性结合第一蛋白质靶，并且该第一对相互作用确定组合物中另一个的蛋白质结合试剂能够特异性结合第二蛋白质靶，其中该相互作用确定寡核苷酸包括相互作用确定序列和桥寡核苷酸杂交区，并且其中该第一对相互作用确定组合物的相互作用确定序列包括不同的序列；并且多个桥寡核苷酸各自包括能够特异性结合第一对相互作用确定组合物的桥寡核苷酸杂交区的两个杂交区。
在一些实施例中，相互作用确定序列长度为至少6个核苷酸、25-60个核苷酸、约45个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸、约128个核苷酸、至少128个核苷酸、约200-500个核苷酸、约200个核苷酸、至少200个核苷酸、约200-300个核苷酸、约500个核苷酸、或其任何组合。
在一些实施例中，该试剂盒包括：第二对相互作用确定组合物，其中该第二对相互作用确定组合物中的每个包括与相互作用确定寡核苷酸相关联的蛋白质结合试剂，其中该第二对相互作用确定组合物中之一的蛋白质结合试剂能够特异性结合第三蛋白质靶，并且该第二对相互作用确定组合物中另一个的蛋白质结合试剂能够特异性结合第四蛋白质靶。第三和第四蛋白质靶中的至少一个可以与第一和第二蛋白质靶不同。第三和第四蛋白质靶中的至少一个以及第一和第二蛋白质靶中的至少一个可以是相同的。
在一些实施例中，该试剂盒包括：三对或更多对的相互作用确定组合物。三对或更多对的相互作用确定组合物的至少10个相互作用确定组合物的相互作用确定序列可以包括不同的序列。三对或更多对的相互作用确定组合物的至少100个相互作用确定组合物的相互作用确定序列可以包括不同的序列。三对或更多对的相互作用确定组合物的至少1000个相互作用确定组合物的相互作用确定序列可以包括不同的序列。
在一些实施例中，多个相互作用确定组合物中两个相互作用确定组合物的桥寡核苷酸杂交区包括不同的序列。桥寡核苷酸杂交区中的至少一个可以与桥寡核苷酸中的两个杂交区中的至少一个互补。
在一些实施例中，蛋白质结合试剂可以包括抗体、四聚体、适配子、蛋白质骨架、或其组合。该相互作用确定寡核苷酸可以通过接头与蛋白质结合试剂缀合。该至少一个相互作用确定寡核苷酸可以包括接头。该接头可以包括化学基团。该化学基团可以可逆或不可逆地附接至蛋白质结合试剂。该化学基团可以包括UV可光解基团、二硫键、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、二硫键联、或其任何组合。
在一些实施例中，相互作用确定寡核苷酸与任何目的细胞的基因组序列不同源。目的细胞可以包括肿瘤细胞或非肿瘤细胞。目的细胞可以包括单个细胞、哺乳动物细胞、细菌细胞、病毒细胞、酵母细胞、真菌细胞、或其任何组合。
在一些实施例中，该试剂盒包括：多个条形码，其中该多个条形码中的每一个包括条形码序列和捕获序列。第一对相互作用确定组合物中之一的相互作用确定寡核苷酸可以包括与多个条形码中至少一个条形码的捕获序列互补的序列。捕获序列可以包括聚(dT)区。与条形码的捕获序列互补的相互作用确定寡核苷酸的序列可以包括聚(dA)区。第一对相互作用确定组合物中另一个的相互作用确定寡核苷酸可以包括细胞标记序列、通用引物的结合位点、或其任何组合。多个条形码可以包括多个随机条形码，其中该多个随机条形码中每一个的条形码序列包括分子标记序列，其中该多个随机条形码中至少两个随机条形码的分子标记序列包括不同的序列。
在一些实施例中，蛋白质靶包括细胞外蛋白质、细胞内蛋白质、或其任何组合蛋白质靶可以包括细胞表面蛋白质、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、或其任何组合。蛋白质靶可以选自包括10-100个不同蛋白质靶的组。
在一些实施例中，蛋白质结合试剂可以与具有相同序列的两个或更多个相互作用确定寡核苷酸相关联。蛋白质结合试剂可以与具有不同相互作用确定序列的两个或更多个相互作用确定寡核苷酸相关联。
在一些实施例中，第一对相互作用确定组合物中的一个包括不与相互作用确定寡核苷酸相关联的第二蛋白质结合试剂。第一蛋白质结合试剂和第二蛋白质结合试剂可以是相同或不同的。蛋白质结合试剂可以与可检测部分相关联。在一些实施例中，相互作用确定寡核苷酸与可检测部分相关联。
在一些实施例中，多个条形码与颗粒相关联。多个条形码中的至少一个条形码可以被固定在颗粒上。多个条形码中的至少一个条形码可以被部分固定在颗粒上。多个条形码中的至少一个条形码可以被包封在颗粒中。多个条形码中的至少一个条形码可以被部分包封在颗粒中。颗粒可以是可破坏的。颗粒可以包括珠。颗粒可以包括琼脂糖凝胶珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠、或其任何组合。颗粒可以包括选自下组的材料，该组由以下组成：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮、及其任何组合。颗粒可以包括可破坏的水凝胶颗粒。颗粒可以与可检测部分相关联。
颗粒的条形码可以包括选自至少1000种不同的条形码序列的条形码序列。颗粒的条形码可以包括选自至少10000种不同的条形码序列的条形码序列。条形码的条形码序列可以包括随机序列。颗粒可以包括至少10000个条形码。
在一些实施例中，该试剂盒包括：DNA聚合酶。该试剂盒可以包括逆转录酶。该试剂盒可以包括：莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶或Taq DNA聚合酶。在一些实施例中，该方法包括固定剂(例如，福尔马林、多聚甲醛、戊二醛/四氧化锇、酒精固定剂、Hepes-谷氨酸缓冲液介导的有机溶剂保护效应(HOPE)、Bouin溶液、或其任何组合)。
本文披露的是用于以快速、有效和高度可扩展的方式跨宽范围的生物分子和可检测标记组合而递送高质量和性能特异性产物的系统和方法。在本发明的实施例中，对经标记的生物分子作出要求，并且响应于该要求，从经激活的生物分子和经激活的标记的预先存在的集合制备经标记的生物分子。
在一些实施例中，生物分子包括多肽、核酸、多糖、或其任何组合。核酸可以是寡核苷酸、DNA或RNA。多肽可以是蛋白质、酶或蛋白质结合试剂。蛋白质结合试剂可以包括抗体、适配体、或其任何组合。与标记缀合的蛋白质结合试剂能够特异性结合多个蛋白质靶中的至少一个。
在一些实施例中，该多个蛋白质靶包括细胞表面蛋白质、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、抗体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、或其任何组合。多个蛋白质靶可以包括例如10-400种不同的蛋白质靶。生物分子可以选自至少100、1,000或10,000个不同的生物分子。一个或多个经标记的生物分子试剂可以进一步包括不与标记共价偶联的第二生物分子。生物分子和该第二生物分子可以是相同的。
在一些实施例中，该标记包括荧光团、发色团、多肽、蛋白质、酶、酶底物、催化剂、氧化还原标记、放射性标记、声学标记、拉曼(Raman)(SERS)标签、质量标签、同位素标签、磁颗粒、微颗粒、纳米颗粒、寡核苷酸、或其任何组合。在一些实施例中，标记包括酶、酶底物或其组合，并且其中该酶能够将酶底物修饰成相应的修饰的酶底物。
在一些实施例中，酶底物与对应的经修饰的酶底物具有至少一个官能团的差异。该至少一个官能团可以是烷基、烯基、炔基、苯基、苄基、卤基、氟、氯、溴、碘、羟基、羰基、醛、卤代甲酰基、碳酸酯、羧酸根、羧基、酯、甲氧基、氢过氧基、过氧基、醚、半缩醛、半缩酮、乙缩醛、缩酮、乙缩醛、原酸酯、亚甲基二氧基、原碳酸酯、甲酰胺、伯胺、仲胺、叔胺、4°铵、伯氯胺酮、仲氯胺酮、伯醛亚胺、仲醛亚胺、酰亚胺、叠氮基、偶氮基、二酰亚胺、氰酸酯、异氰酸酯、硝酸酯、腈、异腈、亚硝基氧基、硝基、亚硝基、吡啶基、巯基、硫醚、二硫醚、亚磺酰基、磺酰基、亚磺基、磺基、硫氰酸酯、异硫氰酸酯、碳硫酮、碳硫醛、膦基、膦酰基、磷酸酯、磷酸二酯、二羟硼基(borono)、硼酸酯(boronate)、亚二羟硼基(borino)、亚硼酸酯(borinate)、或其任何组合。
在一些实施例中，酶包括甲基转移酶、糖苷水解酶、琼脂水解酶、氨酸酶、淀粉酶、乙糖苷酶、卡拉胶酶、纤维素酶、神经酰胺酶、几丁质酶、脱乙酰几丁质酶、柠檬酸酶(citrinase)、葡聚糖酶、糊精酶、果糖苷酶、岩藻多糖酶、墨角藻糖苷酶、呋喃糖苷酶、半乳糖苷酶、半乳糖醛酸酶、葡聚糖酶、葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、葡萄糖苷酸酶、糖水解酶、糖苷酶、己糖苷酶、水解酶、艾杜糖醛酸酶、肌苷酶(inosidase)、菊粉酶、乳糖酶、果聚糖酶、地衣多糖酶、连接酶、裂解酶、溶菌酶、麦芽糖苷酶、麦芽糖壳三糖酶(maltotriosidase)、甘露二糖苷酶、甘露糖苷酶、胞壁酸酶、辛糖酸酶(octulosonase)、辛糖酸水解酶(octulosonidase)、樱草苷酶(primeverosidase)、蛋白酶、支链淀粉酶、鼠李糖苷酶、糖胺酶(saminidase)、唾液酸酶、合酶、转移酶、海藻糖酶、turonidase、turonosidase、木聚糖酶、木糖苷酶、或其组合。
在一些实施例中，酶底物包括6-巯基嘌呤、纤维二糖、纤维四糖、木四糖、异樱草糖(isoprimeverose)、β-D-龙胆二糖、木葡聚糖和甘露三糖、琼脂糖、胺酸、淀粉、寡糖、多糖、纤维素、神经酰胺、几丁质、壳聚糖、右旋糖、糊精、果糖、岩藻多糖、岩藻糖、呋喃糖苷、半乳糖苷、葡聚糖、吡喃葡萄糖苷、葡萄糖苷、葡萄糖醛酸、葡糖苷酸、葡萄糖、糖苷、糖胺聚糖、己糖苷(hexaoside)、菊粉、乳糖、levanose、脂多糖、甘露糖、麦芽糖苷、麦芽三糖苷、甘露糖、辛基酮糖酸(octulosonate)、寡糖、果胶酸酯、果胶、肽、聚半乳糖醛酸(polygalacturonide)、多核苷酸、支链淀粉、鼠李糖苷、木聚糖、或其任何组合。
在一些实施例中，寡核苷酸包括针对生物分子的独特标识。独特标识可以包括长度为25-45个核苷酸的核苷酸序列。独特标识可以选自独特标识的多元组。独特标识的多元组可以包括至少100、1,000或10,000种不同的独特标识。寡核苷酸可以具有选自至少10、100、或1,000种不同的条形码序列的序列。
在一些实施例中，该标记通过接头与生物分子缀合。该标记可以包括接头。该接头可以包括化学基团。该化学基团可以可逆地附接至生物分子。该化学基团可以选自下组，该组由以下组成：UV可光解基团、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、及其任何组合。
独特标识可以与样品的基因组序列不同源。该样品可以是单个细胞、多个细胞、组织、肿瘤样品、或其任何组合。该样品可以是哺乳动物样品、细菌样品、病毒样品、酵母样品、真菌样品、或其任何组合。寡核苷酸可以包括条形码序列(例如，分子标记序列)、聚(A)尾、或其组合。
本披露的多方面还包括用于在制备经标记的生物分子试剂中使用的系统。根据一些实施例的系统包括：输入管理器，其用于接收对经标记的生物分子试剂的要求；存储器，其用于存储具有多种经标记的生物分子试剂存储标识的数据集；处理模块，其通信地联接到该存储器并被配置为从该数据集鉴定与该经标记的生物分子试剂要求相对应的一个或多个经标记的生物分子试剂存储标识；以及输出管理器，其用于提供该一个或多个所鉴定的经标记的生物分子试剂存储标识。在一些实施例中，对经标记的生物分子试剂的要求包括生物分子要求和标记要求。在其他实施例中，对经标记的生物分子试剂的要求是经标记的生物分子要求。在一些实施例中，标记要求包括酶要求和底物要求。
在一些实施例中，生物分子包括多肽、核酸、多糖、或其任何组合。核酸可以是寡核苷酸、DNA或RNA。多肽可以是蛋白质、酶或蛋白质结合试剂。蛋白质结合试剂可以包括抗体、适配体、或其任何组合。与标记缀合的蛋白质结合试剂能够特异性结合多个蛋白质靶中的至少一个。
在一些实施例中，该多个蛋白质靶包括细胞表面蛋白质、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、抗体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、或其任何组合。多个蛋白质靶可以包括例如10-400种不同的蛋白质靶。生物分子可以选自至少100、1,000或10,000个不同的生物分子。
在一些实施例中，该标记包括荧光团、发色团、多肽、蛋白质、酶、酶底物、催化剂、氧化还原标记、放射性标记、声学标记、拉曼(Raman)(SERS)标签、质量标签、同位素标签、磁颗粒、微颗粒、纳米颗粒、寡核苷酸、或其任何组合。在一些实施例中，标记包括酶、酶底物或其组合，并且其中该酶能够将酶底物修饰成相应的修饰的酶底物。
在一些实施例中，酶底物与对应的经修饰的酶底物具有至少一个官能团的差异。该至少一个官能团可以是烷基、烯基、炔基、苯基、苄基、卤基、氟、氯、溴、碘、羟基、羰基、醛、卤代甲酰基、碳酸酯、羧酸根、羧基、酯、甲氧基、氢过氧基、过氧基、醚、半缩醛、半缩酮、乙缩醛、缩酮、乙缩醛、原酸酯、亚甲基二氧基、原碳酸酯、甲酰胺、伯胺、仲胺、叔胺、4°铵、伯氯胺酮、仲氯胺酮、伯醛亚胺、仲醛亚胺、酰亚胺、叠氮基、偶氮基、二酰亚胺、氰酸酯、异氰酸酯、硝酸酯、腈、异腈、亚硝基氧基、硝基、亚硝基、吡啶基、巯基、硫醚、二硫醚、亚磺酰基、磺酰基、亚磺基、磺基、硫氰酸酯、异硫氰酸酯、碳硫酮、碳硫醛、膦基、膦酰基、磷酸酯、磷酸二酯、二羟硼基、硼酸酯、亚二羟硼基、亚硼酸酯、或其任何组合。
在一些实施例中，酶包括甲基转移酶、糖苷水解酶、琼脂水解酶、氨酸酶、淀粉酶、乙糖苷酶、卡拉胶酶、纤维素酶、神经酰胺酶、几丁质酶、脱乙酰几丁质酶、柠檬酸酶、葡聚糖酶、糊精酶、果糖苷酶、岩藻多糖酶、墨角藻糖苷酶、呋喃糖苷酶、半乳糖苷酶、半乳糖醛酸酶、葡聚糖酶、葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、葡萄糖苷酸酶、糖水解酶、糖苷酶、己糖苷酶、水解酶、艾杜糖醛酸酶、肌苷酶、菊粉酶、乳糖酶、果聚糖酶、地衣多糖酶、连接酶、裂解酶、溶菌酶、麦芽糖苷酶、麦芽糖壳三糖酶、甘露二糖苷酶、甘露糖苷酶、胞壁酸酶、辛糖酸酶、辛糖酸水解酶、樱草苷酶、蛋白酶、支链淀粉酶、鼠李糖苷酶、糖胺酶、唾液酸酶、合酶、转移酶、海藻糖酶、turonidase、turonosidase、木聚糖酶、木糖苷酶、或其组合。
在一些实施例中，酶底物包括6-巯基嘌呤、纤维二糖、纤维四糖、木四糖、异樱草糖、β-D-龙胆二糖、木葡聚糖和甘露三糖、琼脂糖、胺酸、淀粉、寡糖、多糖、纤维素、神经酰胺、几丁质、壳聚糖、右旋糖、糊精、果糖、岩藻多糖、岩藻糖、呋喃糖苷、半乳糖苷、葡聚糖、吡喃葡萄糖苷、葡萄糖苷、葡萄糖醛酸、葡糖苷酸、葡萄糖、糖苷、糖胺聚糖、己糖苷、菊粉、乳糖、levanose、脂多糖、甘露糖、麦芽糖苷、麦芽三糖苷、甘露糖、辛基酮糖酸、寡糖、果胶酸酯、果胶、肽、聚半乳糖醛酸、多核苷酸、支链淀粉、鼠李糖苷、木聚糖、或其任何组合。
在一些实施例中，寡核苷酸包括针对生物分子的独特标识。独特标识可以包括长度为25-45个核苷酸的核苷酸序列。独特标识可以选自独特标识的多元组。独特标识的多元组可以包括至少100、1,000或10,000种不同的独特标识。寡核苷酸可以具有选自至少10、100、或1,000种不同的条形码序列的序列。
在一些实施例中，该标记通过接头与生物分子缀合。该标记可以包括接头。该接头可以包括化学基团。该化学基团可以可逆地附接至生物分子。该化学基团可以选自下组，该组由以下组成：UV可光解基团、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、及其任何组合。
独特标识可以与样品的基因组序列不同源。该样品可以是单个细胞、多个细胞、组织、肿瘤样品、或其任何组合。该样品可以是哺乳动物样品、细菌样品、病毒样品、酵母样品、真菌样品、或其任何组合。寡核苷酸可以包括条形码序列(例如，分子标记序列)、聚(A)尾、或其组合。
输入管理器可以可操作地联接到图形用户界面，例如网站菜单界面，其中将对经标记的生物分子试剂的要求输入到互联网网站。在一些实施例中，输入管理器被配置为接收经标记的生物分子要求。在其他实施例中，输入管理器被配置为接收生物分子要求和标记要求。在一些实施例中，标记要求包括酶要求和底物要求。输入管理器可以例如从单个用户或从多个用户接收多个经标记的生物分子试剂要求。
主题系统包括用于存储一个或多个数据集的存储器，这些数据集包括经标记的生物分子、生物分子、经激活的生物分子、标记、经激活的标记和反应接头的存储标识。系统还包括通信地联接到存储器的处理模块，该处理模块鉴定来自一个或多个数据集的与经标记的生物分子试剂要求的组分(例如，生物分子要求、标记要求、经标记的生物分子要求等)相对应的存储标识。在一些实施例中，输出管理器可操作地联接到通信部件，以例如在电子显示器上或通过用打印机打印存储标识来显示所鉴定的存储标识。
在一些实施例中，目的系统还包括与输出管理器可操作地通信以制备经标记的生物分子试剂的试剂制备装置。试剂制备管理器被配置为从输出管理器接收所鉴定的存储标识，并产生与经标记的生物分子试剂要求相对应的经标记的生物分子试剂。
在实施例中，试剂制备装置包括多个经激活的生物分子、多个经激活的标记和取样设备，该取样设备用以将经激活的生物分子和经激活的标记提供给接触装置。在一些实施例中，试剂制备装置包括试剂分析仪，其可用于例如通过固相液相色谱来表征、配制或纯化所产生的经标记的生物分子试剂。
生物分子可以是多肽、核酸或多糖。在一些实施例中，生物分子是核酸，例如寡核苷酸、DNA或RNA。在其他实施例中，生物分子是多肽，例如蛋白质、酶或抗体。标记可以包括荧光团、发色团、酶、酶底物、催化剂、化学发光底物、电化学发光底物、氧化还原标记、放射性标记、声学标记、拉曼(SERS)标签、质量标签、同位素标签(例如，同位素纯的稀土元素)、磁颗粒、微颗粒、纳米颗粒、寡核苷酸、或其任何组合。
经标记的生物分子试剂是通过将经激活的生物分子与经激活的标记联接来制备。经激活的生物分子和经激活的标记均含有反应性接头。在实施例中，反应性接头发生反应以在经激活的生物分子和经激活的接头之间形成化学键。
本披露的多方面还包括用于制备经标记的生物分子试剂的方法。根据一些实施例的方法包括接收对经标记的生物分子试剂的要求，鉴定与经标记的生物分子试剂要求的组分相对应的存储标识(例如，与生物分子要求和标记要求相对应的存储标识)，并输出一种或多种所鉴定的存储标识。在一些实施例中，将所鉴定的生物分子存储标识和标记存储标识输出到电子显示器上或者用打印机打印。在一些实施例中，例如从单个用户或多个用户接收对经标记的生物分子试剂的多个要求。在一些情况下，对经标记的生物分子试剂的要求可以包括多个生物分子要求和多个标记要求。在一些实施例中，对经标记的生物分子试剂的要求可以包括多个生物分子要求和单个标记要求。在仍一些实施例中，对经标记的生物分子试剂的要求可以包括单个生物分子要求和多个标记要求。在一些实施例中，标记要求包括酶要求和底物要求。
在一些实施例中，方法还包括使经激活的生物分子与经激活的标记接触以产生经标记的生物分子试剂。在一些实施例中，将经激活的生物分子和经激活的标记在试剂制备装置中接触。在一些情况下，对经标记的生物分子试剂进行进一步纯化。在制备后，可以将经标记的生物分子试剂进行包装，并运输到远的位置。
本披露的多方面还包括用于要求并接收经标记的生物分子试剂的方法。根据一些实施例的方法包括传送对经标记的生物分子试剂(例如，本文所述的主题系统之一)的要求并且接收包括共价结合于标签的生物分子的经标记的生物分子试剂。在一些实施例中，传送对经标记的生物分子试剂的要求包括将生物分子要求和标记要求输入到图形用户界面，例如互联网网站上的网站菜单界面。在一些实施例中，传送对经标记的生物分子试剂的要求包括输入多个生物分子要求和多个标记要求。在一些实施例中，标记要求包括酶要求和底物要求。在其他实施例中，传送对经标记的生物分子试剂的要求包括输入单个生物分子要求和多个标记要求。在又其他实施例中，传送对经标记的生物分子试剂的要求包括输入多个生物分子要求并输入单个标记要求。在再其他实施例中，传送对经标记的生物分子试剂的要求包括输入经标记的生物分子要求。
在一些实施例中，生物分子包括多肽、核酸、多糖、或其任何组合。核酸可以是寡核苷酸、DNA或RNA。多肽可以是蛋白质、酶或蛋白质结合试剂。蛋白质结合试剂可以包括抗体、适配体、或其任何组合。与标记缀合的蛋白质结合试剂能够特异性结合多个蛋白质靶中的至少一个。
在一些实施例中，该多个蛋白质靶包括细胞表面蛋白质、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、抗体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、或其任何组合。多个蛋白质靶可以包括例如10-400种不同的蛋白质靶。生物分子可以选自至少100、1,000或10,000个不同的生物分子。接收经标记的生物分子试剂可以包括接收与标记共价偶联的经标记的生物分子和不与标记共价偶联的第二生物分子。经标记的生物分子和该第二生物分子可以是相同的。
在一些实施例中，该标记包括荧光团、发色团、多肽、蛋白质、酶、酶底物、催化剂、氧化还原标记、放射性标记、声学标记、拉曼(SERS)标签、质量标签、同位素标签、磁颗粒、微颗粒、纳米颗粒、寡核苷酸、或其任何组合。在一些实施例中，标记包括酶、酶底物或其组合，并且其中该酶能够将酶底物修饰成相应的修饰的酶底物。
在一些实施例中，酶底物与对应的经修饰的酶底物具有至少一个官能团的差异。该至少一个官能团可以是烷基、烯基、炔基、苯基、苄基、卤基、氟、氯、溴、碘、羟基、羰基、醛、卤代甲酰基、碳酸酯、羧酸根、羧基、酯、甲氧基、氢过氧基、过氧基、醚、半缩醛、半缩酮、乙缩醛、缩酮、乙缩醛、原酸酯、亚甲基二氧基、原碳酸酯、甲酰胺、伯胺、仲胺、叔胺、4°铵、伯氯胺酮、仲氯胺酮、伯醛亚胺、仲醛亚胺、酰亚胺、叠氮基、偶氮基、二酰亚胺、氰酸酯、异氰酸酯、硝酸酯、腈、异腈、亚硝基氧基、硝基、亚硝基、吡啶基、巯基、硫醚、二硫醚、亚磺酰基、磺酰基、亚磺基、磺基、硫氰酸酯、异硫氰酸酯、碳硫酮、碳硫醛、膦基、膦酰基、磷酸酯、磷酸二酯、二羟硼基、硼酸酯、亚二羟硼基、亚硼酸酯、或其任何组合。
在一些实施例中，酶包括甲基转移酶、糖苷水解酶、琼脂水解酶、氨酸酶、淀粉酶、乙糖苷酶、卡拉胶酶、纤维素酶、神经酰胺酶、几丁质酶、脱乙酰几丁质酶、柠檬酸酶、葡聚糖酶、糊精酶、果糖苷酶、岩藻多糖酶、墨角藻糖苷酶、呋喃糖苷酶、半乳糖苷酶、半乳糖醛酸酶、葡聚糖酶、葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、葡萄糖苷酸酶、糖水解酶、糖苷酶、己糖苷酶、水解酶、艾杜糖醛酸酶、肌苷酶、菊粉酶、乳糖酶、果聚糖酶、地衣多糖酶、连接酶、裂解酶、溶菌酶、麦芽糖苷酶、麦芽糖壳三糖酶、甘露二糖苷酶、甘露糖苷酶、胞壁酸酶、辛糖酸酶、辛糖酸水解酶、樱草苷酶、蛋白酶、支链淀粉酶、鼠李糖苷酶、糖胺酶、唾液酸酶、合酶、转移酶、海藻糖酶、turonidase、turonosidase、木聚糖酶、木糖苷酶、或其组合。
在一些实施例中，酶底物包括6-巯基嘌呤、纤维二糖、纤维四糖、木四糖、异樱草糖、β-D-龙胆二糖、木葡聚糖和甘露三糖、琼脂糖、胺酸、淀粉、寡糖、多糖、纤维素、神经酰胺、几丁质、壳聚糖、右旋糖、糊精、果糖、岩藻多糖、岩藻糖、呋喃糖苷、半乳糖苷、葡聚糖、吡喃葡萄糖苷、葡萄糖苷、葡萄糖醛酸、葡糖苷酸、葡萄糖、糖苷、糖胺聚糖、己糖苷、菊粉、乳糖、levanose、脂多糖、甘露糖、麦芽糖苷、麦芽三糖苷、甘露糖、辛基酮糖酸、寡糖、果胶酸酯、果胶、肽、聚半乳糖醛酸、多核苷酸、支链淀粉、鼠李糖苷、木聚糖、或其任何组合。
在一些实施例中，寡核苷酸包括针对生物分子的独特标识。独特标识可以包括长度为25-45个核苷酸的核苷酸序列。独特标识可以选自独特标识的多元组。独特标识的多元组可以包括至少100、1,000或10,000种不同的独特标识。寡核苷酸可以具有选自至少10、100、或1,000种不同的条形码序列的序列。在一些实施例中，该寡核苷酸通过接头与生物分子缀合。该寡核苷酸可以包括接头。该接头可以包括化学基团。该化学基团可以可逆地附接至生物分子。该化学基团可以选自下组，该组由以下组成：UV可光解基团、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、及其任何组合。
独特标识可以与样品的基因组序列不同源。该样品可以是单个细胞、多个细胞、组织、肿瘤样品、或其任何组合。该样品可以是哺乳动物样品、细菌样品、病毒样品、酵母样品、真菌样品、或其任何组合。寡核苷酸可以包括条形码序列(例如，分子标记序列)、聚(A)尾、或其组合。
附图说明
图1说明了非限制性示例性随机条形码。
图2显示了随机条形码化和数字计数的非限制性示例性工作流程。
图3是显示用于从多个靶产生随机地条形码化的靶的索引文库的非限制性示例性过程的示意图。
图4显示了与包括蛋白质结合试剂的独特标识的寡核苷酸缀合的示例性蛋白质结合试剂(此处所示的抗体)的示意图。
图5显示了使用寡核苷酸缀合的抗体以高通量方式同时测量蛋白质表达和基因表达的示例性工作流程的示意图。
图6A-6E显示了用寡核苷酸功能化的颗粒的非限制性示例性示意图。
图7是使用用寡核苷酸功能化的颗粒进行单个细胞测序对照的示例性工作流程的示意图。
图8是使用用寡核苷酸功能化的颗粒进行单个细胞测序对照的另一个示例性工作流程的示意图。
图9显示了使用对照寡核苷酸-缀合的抗体确定单个细胞测序效率的示例性工作流程的示意图。
图10显示了使用对照寡核苷酸-缀合的抗体确定单个细胞测序效率的示例性工作流程的另一示意图。
图11A-11C是显示对照寡核苷酸可用于细胞计数的图。
图12说明了根据一个实施例制备用于提供用于实验室和临床测定用的经标记的生物分子试剂组合物的经标记的生物分子试剂的步骤。
图13提供了根据本发明实施例的方法的示意图。
图14说明了本披露的用于按需提供可定制的经标记的生物分子试剂的方法。
图15描绘了根据本发明的一些实施例的用于传送对经标记的生物分子试剂的要求的图形用户界面。
图16描绘了根据本发明的一些实施例的本披露的计算机系统。
图17展示了根据本发明的一些实施例的用于接收、处理和输出对经标记的生物分子试剂的要求的流程图。
图18图(a)-(d)显示了用于同时确定蛋白质表达和基因表达的寡核苷酸的非限制性示例性设计。
图19显示了用于同时测定蛋白质表达和基因表达的非限制性示例性寡核苷酸序列的示意图。
图20图(a)-(f)是非限制性示例性tSNE投影图，这些tSNE投影图显示了使用寡核苷酸缀合的抗体以高通量方式同时测量CD4蛋白表达和基因表达的结果。
图21图(a)-(f)是显示CD4T细胞、CD8T细胞、和髓样细胞中CD4mRNA和蛋白质表达的非限制性示例性条形图。
图22是非限制性示例性条形图，该条形图显示在相似测序深度情况下CD4蛋白质水平的检测灵敏度随着抗体:寡核苷酸的比率增加而增加，其中1:3比率表现优于1:1和1:2比率。
图23图(a)-(d)是显示使用流式细胞术分选的细胞的细胞表面上的CD4蛋白质表达的图。
图24图(a)-(f)是显示两个样品的CD4T细胞、CD8T细胞、和髓样细胞中CD4mRNA和蛋白质表达的非限制性示例性条形图。
图25是显示使用不同样品制备方案确定的CD4蛋白质水平的检测灵敏度的非限制性示例性条形图，其中抗体:寡核苷酸比率为1:3。
图26A-26C是显示使用稀释滴定确定抗体原液的最佳稀释度的非限制性示例性图。
图27显示了用于确定寡核苷酸-缀合的抗体的染色浓度使得抗体寡核苷酸占测序数据中总读数的所需百分比的非限制性示例性实验设计。
图28图(a)-(d)是非限制性示例性生物分析仪迹线，这些生物分析仪迹线显示与抗体寡核苷酸的预期大小一致的峰(由箭头指示)。
图29图(a)-(f)是非限制性示例性直方图，这些直方图显示了用不同抗体稀释液染色的样品的检测的抗体寡核苷酸分子数和与这些抗体寡核苷酸缀合的抗体分子(“热抗体”)的不同百分比。
图30A-30C是非限制性示例性图，这些示例性图显示寡核苷酸-缀合的抗CD147抗体分子可用于标记各种细胞类型。使用血液组(图30A)中的488个基因的表达谱确定细胞类型。用使用1:100稀释的储备液制备的10％热抗体:90％冷抗体的混合物对细胞染色，在直方图中产生显示检测到的抗体寡核苷酸分子数的清晰信号(图30B)。抗体寡核苷酸对各种细胞类型的标记示于图30C中。
图31A-31C是非限制性示例性图，这些示例性图显示寡核苷酸-缀合的抗CD147抗体可用于标记各种细胞类型。使用血液组(图31A)中的488个基因的表达谱确定细胞类型。用使用1:100稀释的储备液制备的1％热抗体:99％冷抗体的混合物对细胞染色，在直方图中不产生显示检测到的抗体寡核苷酸分子数的清晰信号(图31B)。抗体寡核苷酸对各种细胞类型的标记示于图31C中。
图32A-32C是非限制性示例性图，这些示例性图显示寡核苷酸-缀合的抗CD147抗体分子可用于标记各种细胞类型。使用血液组(图32A)中的488个基因的表达谱确定细胞类型。用1:800稀释的储备液对细胞染色，在直方图中产生显示检测到的抗体寡核苷酸分子数的清晰信号(图32B)。抗体寡核苷酸对各种细胞类型的标记示于图32C中。
图33A-33B是显示染色缓冲液中的对照颗粒寡核苷酸的组成和使用图7所示的工作流程检测的与对照颗粒相关联的对照颗粒寡核苷酸的组成的图。
图34A-34B是血细胞计数器中细胞(图34A，白色圆圈)和对照颗粒(图34B，黑色圆圈)的明视野图像。
图35A-35B是与荧光团相关联的寡核苷酸-缀合的抗体结合的对照颗粒的相差(图35A，10X)和荧光(图35B，10X)图像。
图36是显示被装载到盒的微孔中的细胞和对照颗粒的图像。
具体实施方式
在以下详细描述中，参考了附图，附图形成了本发明的一部分。在附图中，除非上下文另有指示，否则相似的符号通常标识相似的组件。在具体实施例、附图和权利要求中描述的说明性实施例不意味着是限制性的。在不脱离本文提出的主题的精神或范围的情况下，可以利用其他实施例，并且可以做出其他改变。容易理解的是，如本文一般描述的以及图中说明的本披露的方面能以各种不同的配置来布置、替换、组合、分离和设计，所有这些都在本文中明确考虑并且构成本披露内容的一部分。
来自GenBank的所有专利、公开的专利申请、其他出版物、和序列，以及本文提及的其他数据库关于相关技术通过引用以其整体并入。
对少量核酸(例如信使核糖核苷酸(mRNA)分子)进行量化对于确定例如在不同发育阶段或在不同环境条件下在细胞中表达的基因是临床上重要的。然而，确定核酸分子(例如，mRNA分子)的绝对数量也是非常具有挑战性的，尤其是当分子数量非常小时。确定样品中分子的绝对数量的一种方法是数字聚合酶链式反应(PCR)。理想地，PCR在每个循环中产生分子的相同拷贝。然而，PCR可具有缺点使得每个分子复制具有随机概率，且此概率根据PCR循环和基因序列而变化，这导致扩增偏差和不准确的基因表达测量。可以将具有独特分子标记的随机条形码(也称为分子指数(MI))用于计数分子数量并校正扩增偏差。如PreciseTM测定(赛卢拉研究公司(Cellular Research,Inc.)(帕洛阿尔托，加利福尼亚))的随机条形码化可以通过使用分子标记(ML)在逆转录(RT)期间标记mRNA来校正由PCR和文库制备步骤诱导的偏差。
PreciseTM测定可利用具有大量的(例如6561至65536个)随机条形码的非耗尽性池、聚(T)寡核苷酸上的独特分子标记，以在RT步骤期间与样品中的所有聚(A)-mRNA杂交。随机条形码可包括通用PCR引发位点。在RT期间，靶基因分子与随机条形码任意地反应。每个靶分子可以与随机条形码杂交，从而产生随机地条形码化的互补核糖核苷酸(cDNA)分子。在标记后，可将来自微孔板微孔的随机地条形码化的cDNA分子池化进单个管中用于PCR扩增和测序。可以分析原始测序数据以产生读数的数量、具有独特分子标记的随机条形码的数量、和mRNA分子的数量。
用于确定单个细胞的mRNA表达谱的方法能以大规模平行方式进行。例如，PreciseTM测定可用于同时确定超过10,000个细胞的mRNA表达谱。每个样品用于分析的单个细胞的数量(例如，100个或1,000个单个细胞)可以低于当前单个细胞技术的容量。将来自不同样品的细胞池化使得能够提高当前单一技术的容量利用率，从而降低试剂浪费和单个细胞分析的成本。将来自不同样品的细胞池化可以最小化不同样品的细胞的cDNA文库制备方面的变化，从而能够更准确地比较不同的样品。
本文披露的一些实施例提供多个组合物，其各自包括与寡核苷酸缀合的蛋白质结合试剂，其中该寡核苷酸包括与该蛋白质结合试剂缀合的该蛋白质结合试剂的独特标识，并且该蛋白质结合试剂能够特异性结合蛋白质靶。在一些实施例中，独特标识包括长度为25-45个核苷酸的核苷酸序列。在一些实施例中，独特标识选自独特标识的多元组。在一些实施例中，独特标识的多元组包括至少100种不同的独特标识。在一些实施例中，独特标识的多元组包括至少1,000种不同的独特标识。在一些实施例中，独特标识的多元组包括至少10,000种不同的独特标识。在一些实施例中，多个组合物包括多个抗体、多个适配子、或其组合。在一些实施例中，多个组合物包括至少100种不同的蛋白质结合试剂。在一些实施例中，多个组合物包括至少100种不同的蛋白质结合试剂。在一些实施例中，多个组合物包括至少1,000种不同的蛋白质结合试剂。在一些实施例中，多个组合物包括至少10,000种不同的蛋白质结合试剂。在一些实施例中，多个组合物包括至少10,000种不同的蛋白质结合试剂。在一些实施例中，每种蛋白质结合试剂与一个或多个寡核苷酸缀合，这些寡核苷酸包括选自一组至少10种不同的条形码序列中的至少一种条形码序列(例如，一个分子标记序列)。在一些实施例中，每种蛋白质结合试剂与一个或多个寡核苷酸缀合，这些寡核苷酸包括选自一组至少100种不同的条形码序列中的至少一种条形码序列。在一些实施例中，每种蛋白质结合试剂与一个或多个寡核苷酸缀合，这些寡核苷酸包括选自一组至少1,000种不同的条形码序列中的至少一种条形码序列。在一些实施例中，多个组合物能够特异性结合多个蛋白质靶。在一些实施例中，该多个蛋白质靶包括细胞表面蛋白质、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、抗体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、或其任何组合。在一些实施例中，多个蛋白质靶包括10-400种不同的蛋白质靶。
定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语具有与本披露所属领域的本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。如本说明书和所附权利要求书中使用的，除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”包括复数的提及物。除非另外说明，在本文中对“或”的任何提及旨在涵盖“和/或”。
如本文所用的，术语“衔接子”可以意指促进相关联的核酸的扩增或测序的序列。相关联的核酸可包括靶核酸。相关联的核酸可包括空间标记、靶标记、样品标记、索引标记、或条形码(例如，分子标记)中的一个或多个。衔接子可以是线性的。衔接子可以是预腺苷酸化的衔接子。衔接子可以是双链或单链的。一个或多个衔接子可以位于核酸的5’或3’端。当衔接子在5′和3′端包括已知序列时，已知序列可以是相同或不同的序列。位于多核苷酸的5′和/或3′端的衔接子能够与固定在表面上的一种或多种寡核苷酸杂交。在一些实施例中，衔接子可包括通用序列。通用序列可以是两个或更多个核酸分子共有的核苷酸序列的区域。两个或更多个核酸分子也可具有不同序列的区域。因此，例如，5’衔接子可包括相同和/或通用核酸序列，且3’衔接子可包括相同和/或通用序列。可存在于多个核酸分子的不同成员中的通用序列可允许使用与通用序列互补的单个通用引物复制或扩增多个不同序列。相似地，可以存在于核酸分子的集合中的不同成员中的至少一个、两个(例如，一对)或更多个通用序列可以允许使用与通用序列互补的至少一个、两个(例如，一对)或更多个单个通用引物复制或扩增多个不同序列。因此，通用引物包括可与此类通用序列杂交的序列。可以修饰携带靶核酸序列的分子以将通用衔接子(例如，非靶核酸序列)附接至不同靶核酸序列的一端或两端。与靶核酸附接的一个或多个通用引物可以提供通用引物杂交的位点。与靶核酸附接的一个或多个通用引物可以彼此相同或不同。
如本文所用的，抗体可以是全长(例如，天然存在的或通过正常免疫球蛋白基因片段重组过程形成的)免疫球蛋白分子(例如，IgG抗体)或免疫球蛋白分子的免疫活性(即，特异性结合)部分(像抗体片段)。
在一些实施例中，抗体是功能性抗体片段。例如，抗体片段可以是抗体的一部分，如F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、sFv等。抗体片段可以与由全长抗体识别的相同的抗原结合。抗体片段可以包括由抗体的可变区组成的分离的片段，如由重链和轻链的可变区组成的“Fv”片段和其中轻链和重链可变区通过肽接头连接的重组单链多肽分子(“scFv蛋白”)。示例性抗体可以包括但不限于癌细胞抗体、病毒抗体、结合至细胞表面受体(例如，CD8、CD34、和CD45)的抗体、和治疗性抗体。
如本文使用的，术语“关联”或“与……相关联”可意指两个或更多个种类可以被鉴定为在某个时间点处共定位。关联可意指两个或更多个种类在或曾经在相似的容器内。关联可以是信息学关联，其中例如关于两个或更多个种类的数字信息被存储并且可以用于确定所述种类中的一个或多个在某个时间点处共定位。关联也可以是物理关联。在一些情况下，两个或更多个相关联的种类彼此之间或与共同的固体或半固体表面是“连接的”、“附接的”或“固定的”。关联可以指用于将标记附接到固体或半固体支持物(如珠)上的共价或非共价方式。关联可以包括靶和标记之间的杂交。
如本文使用的，术语“互补性”可以指两个核苷酸之间精确配对的能力。例如，如果核酸的在给定位置的核苷酸能够与另一个核酸的核苷酸以氢键结合，则两个核酸被认为在所述位置处是彼此互补的。两单链核酸分子之间的互补性可以是“部分的”，其中该核苷酸中仅一些结合，或者当该单链分子之间存在完全互补性时，这种互补性可以是完全的。如果第一核苷酸序列与第二核苷酸序列互补，则可以认为第一核苷酸序列是第二序列的“互补体”。如果第一核苷酸序列互补于和第二序列相反的序列(即，核苷酸顺序相反)，则可以认为第一核苷酸序列是第二序列的“反向互补体”。如本文使用的，术语“互补体”、“互补”和“反向互补体”可以互换使用。从本披露可以理解，如果一个分子可以与另一个分子杂交，则其可以是杂交的分子的互补体。
如本文使用的，术语“数字计数”可以指用于估计样品中靶分子数量的方法。数字计数可以包括确定已经与样品中的靶相关联的独特标记的数量的步骤。这种随机方法将计数分子的问题从相同分子的定位和鉴定之一转化为有关检测到一组预定义标记的一系列是/否数字问题。
如本文使用的，术语(多个)“标记”可以指与样品中的靶相关联的核酸代码。标记可以是例如核酸标记。标记可以是完全或部分可扩增的标记。标记可以是完全或部分可测序的标记。标记可以是可鉴定为有区别的天然核酸的一部分。标记可以是已知的序列。标记可以包括核酸序列的接点，例如天然和非天然序列的接点。如本文使用的，术语“标记”可以与术语“索引”、“标签”或“标记-标签”互换使用。标记可以传达信息。例如，在各种实施例中，可以使用标记来确定样品的身份、样品的来源、细胞的身份和/或靶。
如本文使用的，术语“非耗尽性储库(non-depleting reservoir)”可以指由许多不同标记组成的条形码(例如，随机条形码)的池。非耗尽性储库可以包括大量不同的随机条形码，使得当非耗尽性储库与靶池相关联时，每个靶可能与独特的随机条形码相关联。每个经标记的靶分子的独特性可以通过随机选择的统计来确定，并且取决于与多样的标记相比在集合中相同的靶分子的拷贝数。所得的经标记的靶分子集合的大小可以通过条形码化处理的随机性质来确定，然后对检测到的随机条形码的数量的分析允许计算原始集合或样品中存在的靶分子的数量。当存在的靶分子的拷贝数与独特的随机条形码的数量的比率低时，经标记的靶分子是高度独特的(即，用给定的标记来标记多于一个靶分子的概率非常低)。
如本文所用的，术语“核酸”是指多核苷酸序列、或其片段。核酸可包括核苷酸。核酸对于细胞可以是外源的或内源的。核酸可以存在于无细胞环境中。核酸可以是基因或其片段。核酸可以是DNA。核酸可以是RNA。核酸可以包括一种或多种类似物(例如改变的骨架、糖或核碱基)。类似物的一些非限制性实例包括：5-溴尿嘧啶、肽核酸、外来核酸、吗啉代、锁核酸、二醇核酸、苏糖核酸、二脱氧核苷酸、虫草菌素、7-脱氮-GTP、荧光团(例如，罗丹明或与糖连接的荧光黄素)、含有核苷酸的硫醇、生物素连接的核苷酸、荧光基类似物、CpG岛、甲基-7-鸟苷、甲基化的核苷酸、肌苷、硫代尿苷、假尿苷、二氢尿苷、辫苷、以及怀俄苷。“核酸”、“多核苷酸”、“靶多核苷酸”和“靶核酸”可以互换使用。
核酸可以包括一种或多种修饰(例如，碱基修饰、骨架修饰)，以为核酸提供新的或增强的特征(例如，改进的稳定性)。核酸可以包括核酸亲和标签。核苷可以是碱基-糖组合。核苷的碱基部分可以是杂环碱基。此类杂环碱基的两个最常见的类别是嘌呤和嘧啶。核苷酸可以是还包括与核苷的糖部分共价连接的磷酸基团的核苷。对于包括呋喃戊糖的那些核苷，磷酸基团可以连接到糖的2′、3′或5′羟基部分。在形成核酸中，磷酸基团可以将相邻的核苷彼此共价连接以形成线性高分子化合物。转而此线性高分子化合物的各自端可以进一步接合而形成环状化合物；然而，线性化合物通常是合适的。此外，线性化合物可以具有内部核苷酸碱基互补性，并且因此可以按产生完全或部分双链化合物的方式折叠。在核酸中，该磷酸基团通常可以被称为形成核酸的核苷间骨架。连键或骨架可以是3’到5′磷酸二酯键。
核酸可以包括修饰的骨架和/或修饰的核苷间键。修饰的骨架可以包括在骨架中保留磷原子和在骨架中不具有磷原子的那些。其中含有磷原子的合适修饰的核酸骨架可以含有例如硫代磷酸酯；手性硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯；磷酸三酯；氨基烷基磷酸三酯；甲基膦酸酯和其他烷基膦酸酯，如3′-亚烷基膦酸酯、5′-亚烷基膦酸酯；手性膦酸酯；亚磷酸酯；包括3′-氨基磷酰胺酯和氨基烷基磷酰胺酯的磷酰胺酯；磷二酰胺酯；硫代羰基磷酰胺酯；硫代羰基烷基膦酸酯；硫代羰基烷基磷酸三酯；硒代磷酸酯；以及具有正常3′-5′键的硼烷磷酸酯，2′-5′连接的类似物和具有反向极性的那些，其中一个或多个核苷酸间键是3′至3′、5′至5′或2′至2′键。
核酸可以包括由短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子、和烷基或环烷基核苷间键或者一个或多个短链杂原子的或杂环的核苷间键形成的多核苷酸骨架。这些可包括具有以下结构的那些：吗啉代键(从核苷的糖部分部分地形成)；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基骨架；亚甲基甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基骨架；核糖乙酰基骨架；含烯的骨架；氨基磺酸盐骨架；亚甲亚氨基和亚甲肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架；和具有混合的N、O、S和CH2组分部分的其他骨架。
核酸可以包括核酸模拟物。术语“模拟物”可以旨在包括其中只有呋喃糖环或呋喃糖环和核苷酸间键两者被非呋喃糖基团替代的多核苷酸，仅替代呋喃糖环也可以称为糖替代物。可以保持杂环碱基部分或修饰的杂环碱基部分以便与适当的靶核酸杂交。一种这样的核酸可以是肽核酸(PNA)。在PNA中，多核苷酸的糖骨架可以被含酰胺的骨架(特别是氨基乙基甘氨酸骨架)替代。核苷酸可以被保持并且直接或间接地结合至骨架的酰胺部分的氮杂氮原子上。PNA化合物中的骨架可以包括两个或更多个连接的氨基乙基甘氨酸单元，其给予PNA含酰胺的骨架。杂环碱基部分可以直接或间接地结合到骨架的酰胺部分的氮杂氮原子上。
核酸可以包括吗啉代骨架结构。例如，核酸可以包括代替核糖环的6元吗啉代环。在这些实施例的一些中，磷二酰胺酯或其他非磷酸二酯核苷间键可替代磷酸二酯键。
核酸可以包括具有附接到吗啉代环上的杂环碱基的连接的吗啉代单元(即吗啉代核酸)。连接基团可以连接吗啉代核酸中的吗啉代单体单元。非离子型基于吗啉代的寡聚化合物可以与细胞蛋白具有较少的不希望的相互作用。基于吗啉代的多核苷酸可以是核酸的非离子模拟物。吗啉代类别中的多种化合物可以使用不同的连接基团连接。另一类多核苷酸模拟物可称为环己烯基核酸(CeNA)。通常存在于核酸分子中的呋喃糖环可以被环己烯基环替代。可以制备CeNA DMT保护的亚磷酰胺单体，并用于使用亚磷酰胺化学的寡聚化合物合成。将CeNA单体并入核酸链可以增加DNA/RNA杂交体的稳定性。CeNA寡聚腺苷酸可以与具有和天然复合物相似的稳定性的核酸互补体形成复合物。另外的修饰可以包括锁核酸(LNA)，其中2′-羟基基团连接到糖环的4′碳原子，从而形成2′-C,4′-C-氧亚甲基键，由此形成双环糖部分。该键可以是桥连2′氧原子和4′碳原子的基团亚甲基(-CH2)，其中n是1或2。LNA和LNA类似物可以表现出与互补性核酸非常高的双链体热稳定性(Tm＝+3℃至+10℃)、对3′-外切核苷酸降解的稳定性以及良好的溶解度特性。
核酸还可以包括核碱基(通常简称为“碱基”)修饰或取代。如本文使用的，“未修饰的”或“天然的”核碱基可以包括嘌呤碱基(例如腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G))、以及嘧啶碱基(例如胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U))。经修饰的核碱基可以包括其他合成以及天然的核碱基，如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)，5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基以及其他烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基以及其他烷基衍生物，2-硫尿嘧啶，2-硫胸腺嘧啶以及2-硫胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶以及胞嘧啶，5-丙炔基(-C＝C-CH3)尿嘧啶及胞嘧啶以及嘧啶碱基的其他炔基衍生物，6-偶氮基尿嘧啶，胞嘧啶以及胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，8-卤基、8-氨基、8-巯基、8-硫烷基、8-羟基以及其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤基特别是5-溴、5-三氟甲基以及其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌呤和7-脱氮杂腺嘌呤、以及3-脱氮杂鸟嘌呤和3-脱氮杂腺嘌呤。经修饰的核碱基可以包括三环嘧啶如吩噁嗪胞苷(1H-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并噻嗪-2(3H)-酮)，G-夹(clamp)如取代的吩噁嗪胞苷(例如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并(5,4-(b)(1,4)苯并噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并噻嗪-2(3H)-酮)，G-夹(clamp)如取代的吩噁嗪胞苷(例如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并(5,4-(b)(1,4)苯并噁嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶并(4,5-b)吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(H吡啶并(3′,′:4,5)吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-酮)。
如本文使用的，术语“样品”可以指包括靶的组合物。用于通过披露的方法、装置、和系统进行分析的合适样品包括细胞、组织、器官、或生物体。
如本文使用的，术语“采样装置”或“装置”可以指可以取一部分样品和/或将所述部分放置在基底上的装置。采样装置可以指例如荧光激活细胞分选(FACS)机、细胞分选机、活检针、活检装置、组织切片装置、微流体装置、叶栅和/或超薄切片机。
如本文使用的，术语“固体支持物”可以指可以附接多个条形码(例如，随机条形码)的离散固体或半固体表面。固体支持物可以包括任何类型的实心的、多孔的或空心的球体、球、承座、圆柱体或其他类似配置，其由塑料、陶瓷、金属或高分子材料(例如，水凝胶)构成，其上可以固定核酸(例如，共价地或非共价地)。固体支持物可以包括可以是球形的(例如，微球)或具有非球形或不规则形状的离散颗粒，所述形状是如立方形、长方形、锥形、圆柱形、圆锥形、椭圆形或圆盘形等。珠的形状可以是非球形的。以阵列间隔开的多个固体支持物可以不包括基底。固体支持物可以与术语“珠”互换使用。
如本文所用的，术语“随机条形码”是指包括本披露的标记的多核苷酸序列。随机条形码可以是可用于随机条形码化的多核苷酸序列。随机条形码可用于对样品中的靶定量。随机条形码可用于控制标记与靶相关联后可能发生的错误。例如，随机条形码可用于评估扩增或测序错误。与靶相关联的随机条形码可以称为随机条形码-靶或随机条形码-标签-靶。
如本文使用的，术语“随机条形码化”是指核酸的随机进行标记(例如，条形码化)。随机条形码化可以利用递归泊松策略来关联并对与靶相关的标记进行定量。如本文使用的，术语“随机条形码化”可以与“随机进行标记”互换使用。
如本文使用的，术语“靶”可以指可与条形码(例如，随机条形码)相关联的组合物。用于通过披露的方法、装置和系统进行分析的示例性合适的靶包括寡核苷酸、DNA、RNA、mRNA、微小RNA、tRNA等。靶可以是单链的或双链的。在一些实施例中，靶可以是蛋白质、多肽或肽。在一些实施例中，靶是脂质。如本文使用的，“靶”可以与“种类”互换使用。
术语“逆转录酶”可以指具有逆转录酶活性(即，催化从RNA模板合成DNA)的一组酶。通常，这样的酶包括但不限于逆转录病毒逆转录酶、逆转录转座子逆转录酶、逆转录质粒逆转录酶、逆转录子逆转录酶、细菌逆转录酶、II型内含子衍生的逆转录酶，及其突变体、变体或衍生物。非逆转录病毒逆转录酶包括非LTR逆转录转座子逆转录酶、逆转录质粒逆转录酶、逆转录子逆转录酶和II型内含子逆转录酶。II型内含子逆转录酶的实例包括乳酸乳球菌Ll.LtrB内含子逆转录酶、细长嗜热聚球藻(Thermosynechococcus elongatus)TeI4c内含子逆转录酶或嗜热脂肪土芽孢杆菌GsI-IIC内含子逆转录酶。其他类别的逆转录酶可以包括许多类型的非逆转录病毒逆转录酶(即，逆转录子、II型内含子、以及多样性产生型逆转录元件等等)。
术语“通用衔接子引物”、“通用引物衔接子”或“通用衔接子序列”可互换地使用是指可以用于与条形码(例如，随机条形码)杂交以产生基因特异性条形码的核苷酸序列。通用衔接子序列例如可以是在本披露的方法中使用的所有条形码通用的已知的序列。例如，当使用本文披露的方法标记多个靶时，每个靶特异性序列可以连接到相同的通用衔接子序列上。在一些实施例中，超过一个通用衔接子序列可以用于本文披露的方法中。例如，当使用本文披露的方法标记多个靶时，至少两个靶特异性序列连接到不同的通用衔接子序列上。通用衔接子引物及其互补物可以包括在两个寡核苷酸中，其中的一个包括靶特异性序列且另一个包括条形码。例如，通用衔接子序列可以是包括靶特异性序列的寡核苷酸的一部分，以产生与靶核酸互补的核苷酸序列。包括条形码和通用衔接子序列的互补序列的第二寡核苷酸可与核苷酸序列杂交并产生靶特异性条形码(例如，靶特异性随机条形码)。在一些实施例中，通用衔接子引物具有与本披露内容的方法中使用的通用PCR引物不同的序列。
本文披露的一些实施例提供多个组合物，其各自包括与寡核苷酸缀合的蛋白质结合试剂，其中该寡核苷酸包括与该蛋白质结合试剂缀合的该蛋白质结合试剂的独特标识，并且该蛋白质结合试剂能够特异性结合蛋白质靶。在一些实施例中，独特标识包括长度为25-45个核苷酸的核苷酸序列。在一些实施例中，独特标识选自独特标识的多元组。在一些实施例中，独特标识的多元组包括至少100种不同的独特标识。在一些实施例中，独特标识的多元组包括至少1,000种不同的独特标识。在一些实施例中，独特标识的多元组包括至少10,000种不同的独特标识。在一些实施例中，多个组合物包括多个抗体、多个适配子、或其组合。在一些实施例中，多个组合物包括至少100种不同的蛋白质结合试剂。在一些实施例中，多个组合物包括至少100种不同的蛋白质结合试剂。在一些实施例中，多个组合物包括至少1,000种不同的蛋白质结合试剂。在一些实施例中，多个组合物包括至少10,000种不同的蛋白质结合试剂。在一些实施例中，多个组合物包括至少10,000种不同的蛋白质结合试剂。在一些实施例中，每种蛋白质结合试剂与一个或多个寡核苷酸缀合，这些寡核苷酸包括选自一组至少10种不同的条形码序列中的至少一种条形码序列(例如，分子标记序列)。在一些实施例中，每种蛋白质结合试剂与一个或多个寡核苷酸缀合，这些寡核苷酸包括选自一组至少100种不同的条形码序列中的至少一种条形码序列。在一些实施例中，每种蛋白质结合试剂与一个或多个寡核苷酸缀合，这些寡核苷酸包括选自一组至少1,000种不同的条形码序列中的至少一种条形码序列。在一些实施例中，多个组合物能够特异性结合多个蛋白质靶。在一些实施例中，该多个蛋白质靶包括细胞表面蛋白质、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、抗体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、或其任何组合。在一些实施例中，多个蛋白质靶包括10-400种不同的蛋白质靶。
条形码
条形码化(如，随机条形码化)已描述于例如US 20150299784、WO 2015031691、以及Fu等人,Proc Natl Acad Sci U.S.A.[美国国家科学院院刊]2011年5月31日；108(22):9026-31中，这些出版物的内容通过引用以其整体结合在此。在一些实施例中，本文披露的条形码可以是随机条形码，该随机条形码可以是可用于对靶进行随机标记(例如，条形码，标签)的多核苷酸序列。如果随机条形码的不同的条形码序列的数量与待标记的任何靶的出现次数的比率可以是、或约1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1、或在这些值的任何两个之间的数字或范围，则条形码可以称为随机条形码。靶可以是包括具有相同或几乎相同序列的mRNA分子的mRNA种类。如果随机条形码的不同的条形码序列的数量与待标记的任何靶的出现次数的比率是至少、或至多1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、或100:1，则条形码可以称为随机条形码。随机条形码的条形码序列可以称为分子标记。
条形码(例如随机条形码)可以包括一个或多个标记。示例性标记可包括通用标记、细胞标记、条形码序列(例如，分子标记)、样品标记、板标记、空间标记、和/或前空间(pre-spatial)标记。图1说明了具有空间标记的示例性条形码104。条形码104可包括可将条形码与固体支持物105连接的5’胺。条形码可包括通用标记、维度标记、空间标记、细胞标记、和/或分子标记。条形码中不同标记(包括但不限于通用标记、维度标记、空间标记、细胞标记、和分子标记)的顺序可以改变。例如，如图1中显示，通用标记可以是5’-末端标记，且分子标记可以是3’-末端标记。空间标记、维度标记、和细胞标记能以任何顺序。在一些实施例中，通用标记、空间标记、维度标记、细胞标记、和分子标记是以任何顺序的。条形码可以包括靶结合区。靶结合区可以与样品中的靶(例如，靶核酸、RNA、mRNA、DNA)相互作用。例如，靶结合区可以包括可以与mRNA的聚(A)尾相互作用的寡聚(dT)序列。在一些情况下，条形码的标记(例如，通用标记、维度标记、空间标记、细胞标记和条形码序列)可以由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个或更多个核苷酸分开。
标记(例如细胞标记)可包括一组独特的定义长度的核酸子序列，例如每个七个核苷酸(相当于一些汉明错误校正代码中使用的比特数量)，其可以设计为提供错误校正能力。可以设计包括七个核苷酸序列的错误校正子序列组，使得所述组中的序列的任何成对组合展现出定义的“遗传距离”(或错配碱基数)，例如一组纠错子序列能被设计为展现三个核苷酸的遗传距离。在这种情况下，对于经标记的靶核酸分子的序列数据组中的错误校正序列的审查(在下面更全面地描述)能允许检测或校正扩增或测序误差。在一些实施例中，用于产生错误校正代码的核酸子序列的长度可以变化，例如，它们可以是、或是约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、31、40、50个、或在这些值的任何两个之间的数字或范围的核苷酸长度。在一些实施例中，其他长度的核酸子序列可以用来产生错误校正代码。
条形码可以包括靶结合区。靶结合区可以与样品中的靶相互作用。该靶可以是、或包括核糖核酸(RNA)、信使RNA(mRNA)、微小RNA、小干扰RNA(siRNA)、RNA降解产物、各自含有聚(A)尾的RNA、或其任何组合。在一些实施例中，多个靶可包括脱氧核糖核酸(DNA)。
在一些实施例中，靶结合区可以包括可以与mRNA的聚(A)尾相互作用的寡聚(dT)序列。条形码的一个或多个标记(例如，通用标记、维度标记、空间标记、细胞标记、和条形码序列(例如，分子标记))可以通过间隔物与条形码的剩余标记的另一个或两个分开。间隔物可以是例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个或更多个核苷酸。在一些实施例中，条形码的标记中没有一个被间隔物分开。
通用标记
条形码可以包括一个或多个通用标记。在一些实施例中，对于条形码组中的所有条形码(附接到给定的固体支持物上的)，一个或多个通用标记可以是相同的。在一些实施例中，对于附接到多个珠上的所有条形码，一个或多个通用标记可以是相同的。在一些实施例中，通用标记可以包括能够与测序引物杂交的核酸序列。测序引物可以用于对包括通用标记的条形码进行测序。测序引物(例如，通用测序引物)可以包括与高通量测序平台相联系的测序引物。在一些实施例中，通用标记可以包括能够与PCR引物杂交的核酸序列。在一些实施例中，通用标记可以包括能够与测序引物和PCR引物杂交的核酸序列。能够与测序或PCR引物杂交的通用标记的核酸序列可以被称为引物结合位点。通用标记可以包括可用于引发条形码转录的序列。通用标记可以包括可用于延伸条形码或条形码内的区域的序列。通用标记的长度可以是或是约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50个核苷酸、或在这些值的任何两个之间的数字或范围的核苷酸。例如，通用标记可包括至少约10个核苷酸。通用标记的长度可以是至少、或至多1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、200、或300个核苷酸。在一些实施例中，可切割接头或修饰的核苷酸可以是通用标记序列的一部分，以使条形码能够从支持物上被切割下来。
维度标记
条形码可以包括一个或多个维度标记。在一些实施例中，维度标记可以包括提供关于标记(例如，随机标记)发生的维度的信息的核酸序列。例如，维度标记可以提供关于对靶进行随机条形码化的时间的信息。维度标记可以与样品中条形码化(例如，随机条形码化)的时间相关联。维度标记可以在标记的时间处被激活。不同的维度标记可以在不同的时间被激活。该维度标记提供关于靶、靶组和/或样品被随机条形码化的顺序的信息。例如，在细胞周期的G0期可以对细胞群进行随机条形码化。在细胞周期的G1期，可以用条形码(例如，随机条形码)对这些细胞再次进行脉冲处理。在细胞周期的S期，可以用条形码对所述细胞再次进行脉冲处理，等等。每个脉冲(例如，细胞周期的每个阶段)处的条形码可以包括不同的维度标记。以这种方式，该维度标记提供关于哪些靶在细胞周期的哪个时期被标记的信息。维度标记可以探询许多不同的生物阶段。示例性的生物学时间可以包括但不限于细胞周期、转录(例如，转录起始)和转录物降解。在另一个实例中，样品(例如，细胞、细胞群)可以在用药物和/或疗法治疗之前和/或之后随机标记。不同靶的拷贝数的变化可以指示样品对药物和/或疗法的反应。
维度标记可以是可激活的。可以在特定时间点激活可激活的维度标记。可激活的标记可以被例如组成性地激活(例如，不关闭)。该可激活的维度标记可以被例如可逆地激活(例如，该可激活的维度标记可以打开和关闭)。该维度标记可以被例如可逆地激活至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次或更多次。该维度标记可以被可逆地激活例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次或更多次。在一些实施例中，可以用荧光；光；化学事件(例如，切割，另一种分子的连接，修饰的添加(例如，聚乙二醇化、sumo化、乙酰化、甲基化、去乙酰化、去甲基化)；光化学事件(例如，光锁定)；以及引入非天然的核苷酸将该维度标记激活。
在一些实施例中，该维度标记对于附接到给定的固体支持物(例如，珠)上的所有条形码(例如，随机条形码)可以是相同的，但对于不同的固体支持物(例如，珠)是不同的。在一些实施例中，相同固体支持物上的至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的条形码可以包括相同的维度标记。在一些实施例中，相同固体支持物上的至少60％的条形码可以包括相同的维度标记。在一些实施例中，相同固体支持物上的至少95％的条形码可以包括相同的维度标记。
多个固体支持物(例如，珠)可以表现多达106个或更多个独特维度标记序列。维度标记的长度可以是或是约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50个核苷酸、或在这些值的任何两个之间的数字或范围的核苷酸。维度标记的长度可以是至少、或至多1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、200、或300个核苷酸。维度标记可包括在约5至约200个之间的核苷酸。维度标记可包括在约10至约150个之间的核苷酸。维度标记可包括长度在约20至约125个之间的核苷酸。
空间标记
条形码可以包括一个或多个空间标记。在一些实施例中，空间标记可以包括提供与条形码相关联的靶分子的空间取向的信息的核酸序列。空间标记可以与样品中的坐标相关联。该坐标可以是固定的坐标。例如可以参考基底固定坐标。空间标记可以参考二维或三维网格。可以参考界标固定坐标。在空间中界标是可被鉴定的。界标可以是可被成像的结构。界标可以是生物学结构，例如解剖学界标。界标可以是细胞界标，例如细胞器。界标可以是非天然界标，如具有可鉴定标识(如色码、条形码、磁性、荧光、放射性或独特尺寸或形状)的结构。空间标记可以与物理分区(例如，孔、容器或液滴)相关联。在一些实施例中，将多个空间标记一起用于编码在空间中的一个或多个位置。
所述空间标记对于附接到给定的固体支持物(例如，珠)上的所有条形码可以是相同的，但对于不同的固体支持物(例如，珠)是不同的。在一些实施例中，包括相同空间标记的相同固体支持物上的条形码的百分比可以是、或是约60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％、或在这些值的任何两个之间的数字或范围。在一些实施例中，包括相同空间标记的相同固体支持物上的条形码的百分比可以是至少、或至多60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、或100％。在一些实施例中，相同固体支持物上的至少60％的条形码可以包括相同的空间标记。在一些实施例中，相同固体支持物上的至少95％的条形码可以包括相同的空间标记。
多个固体支持物(例如，珠)可以表现多达106个或更多个独特空间标记序列。空间标记的长度可以是或是约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50个核苷酸、或在这些值的任何两个之间的数字或范围的核苷酸。空间标记的长度可以是至少、或至多1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、200、或300个核苷酸。空间标记可包括在约5至约200个之间的核苷酸。空间标记可包括在约10至约150个之间的核苷酸。空间标记可包括长度在约20至约125个之间的核苷酸。
细胞标记
条形码可以包括一个或多个细胞标记。在一些实施例中，细胞标记可以包括提供用于确定哪个靶核酸来自哪个细胞的信息的核酸序列。在一些实施例中，该细胞标记对于附接到给定的固体支持物(例如，珠)上的所有条形码是相同的，但对于不同的固体支持物(例如，珠)是不同的。在一些实施例中，包括相同细胞标记的相同固体支持物上的条形码的百分比可以是、或是约60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％、或在这些值的任何两个之间的数字或范围。在一些实施例中，包括相同细胞标记的相同固体支持物上的条形码的百分比可以是、或是约60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、或100％。例如，相同固体支持物上的至少60％的条形码可以包括相同的细胞标记。作为另一个实例，相同固体支持物上的至少95％的条形码可以包括相同的细胞标记。
多个固体支持物(例如，珠)可以表现多达106个或更多个独特细胞标记序列。细胞标记的长度可以是或是约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50个核苷酸、或在这些值的任何两个之间的数字或范围的核苷酸。细胞标记的长度可以是至少、或至多1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、200、或300个核苷酸。例如，细胞标记可以包括约5至约200个之间的核苷酸。作为另一个实例，细胞标记可以包括约10至约150个之间的核苷酸。还作为另一个实例，细胞标记可包括长度在约20至约125个之间的核苷酸。
条形码序列
条形码可以包括一个或多个条形码序列。在一些实施例中，条形码序列可以包括为与条形码杂交的特定类型的靶核酸种类提供鉴定信息的核酸序列。条形码序列可以包括如下核酸序列，该核酸序列为与条形码(例如，靶结合区)杂交的靶核酸种类的特定出现提供计数器(例如，提供粗略近似)。
在一些实施例中，将一组不同的条形码序列附接到给定的固体支持物(例如，珠)上。在一些实施例中，可以有、或约有102、103、104、105、106、107、108、109个、或在这些值的任何两个之间的数字或范围的独特分子标记序列。例如，多个条形码可以包括具有不同序列的约6561个条形码序列。作为另一个实例，多个条形码可以包括具有不同序列的约65536个条形码序列。在一些实施例中，可以有至少、或至多102、103、104、105、106、107、108、或109个独特条形码序列。独特分子标记序列可以附接至给定的固体支持物(例如，珠)上。
条形码的长度可以是、或是约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50个、或在这些值的任何两个之间的数字或范围的核苷酸。条形码的长度可以是至少、或至多1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、200、或300个核苷酸。
分子标记
条形码可以包括一个或多个分子标记。分子标记可以包括条形码序列。在一些实施例中，分子标记可以包括为与随机条形码杂交的特定类型的靶核酸种类提供鉴定信息的核酸序列。分子标记可以包括如下核酸序列，该核酸序列为与随机条形码(例如，靶结合区)杂交的靶核酸种类的特定出现提供计数器。
在一些实施例中，将一组不同的分子标记附接到给定的固体支持物(例如，珠)上。在一些实施例中，可以有、或约有102、103、104、105、106、107、108、109个、或一个数量或一个范围的独特分子标记序列。例如，多个随机条形码可包括具有不同序列的约6561个分子标记。作为另一个实例，多个随机条形码可包括具有不同序列的约65536个分子标记。在一些实施例中，可以有至少、或至多102、103、104、105、106、107、108、或109个独特分子标记序列。具有独特分子标记序列的随机条形码可以附接至给定固体支持物(例如，珠)上。
对于使用多个随机条形码的随机条形码化，不同分子标记序列的数量与任何靶的出现次数的比率可以是、或约1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1、或在这些值的任何两个之间的数字或范围。靶可以是包括具有相同或几乎相同序列的mRNA分子的mRNA种类。在一些实施例中，不同分子标记序列的数量与任何靶的出现次数的比率是至少、或至多1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、或100:1。
分子标记的长度可以是或是约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50个、或在这些值的任何两个之间的数字或范围的核苷酸。分子标记的长度可以是至少、或至多1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、200、或300个核苷酸。
靶结合区
条形码可以包括一个或多个靶结合区，如捕获探针。在一些实施例中，靶结合区可以与目的靶杂交。在一些实施例中，该靶结合区可包括与靶(例如，靶核酸、靶分子，例如待分析的细胞核酸)特异性杂交(例如与特定基因序列杂交)的核酸序列。在一些实施例中，靶结合区可以包括可附接(例如，杂交)至特定靶核酸的特定位置的核酸序列。在一些实施例中，靶结合区可以包括能够与限制性酶位点突出端(例如EcoRI粘性末端突出端)进行特异性杂交的核酸序列。然后条形码可以连接到包括与限制性位点突出端互补的序列的任何核酸分子。
在一些实施例中，靶结合区可以包括非特异性靶核酸序列。非特异性靶核酸序列可以指独立于靶核酸的特定序列可与多个靶核酸结合的序列。例如，靶结合区可以包括与mRNA分子上的聚(A)尾杂交的随机多聚体序列或寡聚(dT)序列。随机多聚体序列可以是例如随机二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体、十聚体或任何长度的更高多聚体序列。在一些实施例中，对于附接至给定珠的所有条形码，所述靶结合区是相同的。在一些实施例中，对于附接到给定珠上的多个条形码，靶结合区可以包括两个或更多个不同的靶结合序列。靶结合区的长度可以是或是约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50个核苷酸、或在这些值的任何两个之间的数字或范围的核苷酸。靶结合区的长度可以是至多约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50个或更多个核苷酸。
在一些实施例中，靶结合区可以包括寡聚(dT)，该寡聚(dT)可以与包括聚腺苷酸化端的mRNA杂交。靶结合区可以是基因特异性的。例如，可以将靶结合区配置为与靶的特定区域杂交。靶结合区的长度可以是或是约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸、或在这些值的任何两个之间的数字或范围的核苷酸。靶结合区的长度可以是至少、或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个核苷酸。靶结合区的长度可以是约5-30个核苷酸。当条形码包括基因特异性靶结合区时，该条形码可以称为基因特异性条形码。
定向特性
条形码可以包括一种或多种可用于定向(例如，比对)条形码的定向特性。条形码可以包括用于等电聚焦的部分。不同的条形码可以包括不同的等电聚焦点。当将这些条形码被引入样品中时，该样品可以经历等电聚焦，以便于将所述条形码定位成已知的方式。以这种方式，该定向特性可以用于开发样品中条形码的已知的映射。示例性定向特性可以包括电泳迁移率(例如，基于条形码的尺寸)、等电点、自旋、电导率和/或自组装。例如，条形码具有自组装的定向特性，当激活时可以自组装成特定定向(例如，核酸纳米结构)。
亲和特性
条形码可以包括一种或多种亲和特性。例如，空间标记可以包括亲和特性。亲和力特性可包括在化学和/或生物部分中，该特性可以促进该条形码与另一种实体(例如，细胞受体)的结合。例如，亲和特性可包括抗体，例如，对于样品上的具体部分(例如，受体)特异性的抗体。在一些实施例中，抗体可以将条形码引导到特定细胞类型或分子上。在特定细胞类型或分子处的和/或附近的靶可以被随机标记。在一些实施例中，除了空间标记的核苷酸序列，亲和力特性可以提供空间信息，因为该抗体可以将该条形码引导至特定位置。抗体可以是治疗性抗体，例如单克隆抗体或多克隆抗体。抗体可以是人源化的或嵌合的。抗体可以是裸抗体或融合抗体。
抗体可以是全长(即，天然存在的或通过正常免疫球蛋白基因片段重组过程形成的)免疫球蛋白分子(例如，IgG抗体)或免疫球蛋白分子的免疫活性(即，特异性结合)部分(像抗体片段)。
抗体片段可以是例如抗体的一部分，如F(ab’)2、Fab′、Fab、Fv、sFv等。在一些实施例中，抗体片段可以与由全长抗体识别的相同的抗原结合。抗体片段可以包括由抗体的可变区组成的分离的片段，如由重链和轻链的可变区组成的“Fv”片段和其中轻链和重链可变区通过肽接头连接的重组单链多肽分子(“scFv蛋白”)。示例性抗体可以包括但不限于癌细胞抗体、病毒抗体、结合至细胞表面受体(CD8、CD34、CD45)的抗体、和治疗性抗体。
通用衔接子引物
条形码可包括一个或多个通用衔接子引物。例如，基因特异性条形码(如，基因特异性随机条形码)可以包括通用衔接子引物。通用衔接子引物可以指在所有条形码上通用的核苷酸序列。通用衔接子引物可以用于构建基因特异性条形码。通用衔接子引物的长度可以是、或是约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸、或在这些值的任何两个之间的数字或范围的核苷酸。通用衔接子引物的长度可以是至少、或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个核苷酸。通用衔接子引物的长度可以是从5-30个核苷酸。
错误校正
本披露的细胞标记和/或任何标记还可以包括一组独特的具有限定长度的核酸子序列，例如，每个为7个核苷酸(相当于一些汉明错误校正代码中使用的位数)，其被设计为提供纠错能力。类似于其他的错误校正代码，汉明码基于冗余原理，并且可以通过向待经嘈杂介质传输的数据中添加冗余校验位来构建。此类错误校正代码可以用冗余校验位编码样品鉴定物，并且“传输”呈字码的这些样品鉴定物。汉明码可以参考基于能够纠正单比特错误的固有冗余鉴别独特的二进制码的运算过程。例如，汉明码可以与核酸条形码匹配，以便筛选在核酸扩增期间发生的单核苷酸错误。通过使用汉明码鉴别单核苷酸错误，从而可以允许核酸条形码的纠正。
汉明码可以由选自二进制子空间中的多维球体(即，例如，超球面)中心的可能的字码亚组来表示。单比特错误可能落入与特定字码相关联的超球面内，并且因此可以被校正。另一方面，可以检测不与特定字码相关联的双比特错误，但是不校正。考虑到第一个超球面在坐标(0,0,0)(即，例如，使用x-y-z坐标系统)上居中，其中通过落入距离中心坐标1的半径内可以校正任何单比特错误；即，例如，单比特错误坐标为(0,0,0)；(0,1,0)；(0,0,1)；(1,0,0)、或(1,1,0)。同样地，可以构建第二个超球面，其中通过落入其中心坐标(1,1,1)(即，例如，(1,1,1)；(1,0,1)；(0,1,0)；或(0,1,1))的1的半径内，单比特错误可以被校正。
在一些实施例中，用于产生错误校正代码的核酸子序列的长度可以变化，例如它们的长度可以是至少3个核苷酸、至少7个核苷酸、至少15个核苷酸、或至少31个核苷酸。在一些实施例中，其他长度的核酸子序列可以用来产生错误校正代码。
接头
当条形码包括多于一个类型的标记(例如，多于一个细胞标记或多于一个条形码序列，如一个分子标记)时，这些标记可以穿插着接头标记序列。接头标记序列的长度可以是至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50个或更多个核苷酸。接头标记序列的长度可以是至多约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50个或更多个核苷酸。在一些情况下，接头标记序列的长度是12个核苷酸。可以将接头标记序列用于促进条形码的合成。该接头标记可以包括错误校正(例如，汉明)代码。
固体支持物
在一些实施例中，本文披露的条形码(如随机条形码)可以与固体支持物关联。例如，固体支持物可以是合成颗粒。在一些实施例中，固体支持物上的多个条形码(例如，第一多个条形码)的一些或所有条形码序列(如，随机条形码(例如，第一条形码序列)的分子标记)具有至少一个核苷酸的差异。相同固体支持物上的条形码的细胞标记可以是相同的。不同的固体支持物上的条形码的细胞标记可以具有至少一个核苷酸的差异。例如，第一固体支持物上的第一多个条形码的第一细胞标记可以具有相同的序列，且第二固体支持物上的第二多个条形码的第二细胞标记可以具有相同的序列。第一固体支持物上的第一多个条形码的第一细胞标记和第二固体支持物上的第二多个条形码的第二细胞标记可以具有至少一个核苷酸的差异。细胞标记例如可以约5-20个核苷酸长。条形码序列例如可以约5-20个核苷酸长。合成颗粒例如可以是珠。
珠可以例如是硅胶珠、可控孔径玻璃珠、磁珠、Dynabead、交联葡聚糖/琼脂糖珠、珠状纤维素、聚苯乙烯珠、或其任何组合。珠可包括如聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮、或其任何组合的材料。
在一些实施例中，珠可以是高分子微球(例如可变形的珠或凝胶珠)，其用条形码或随机条形码功能化(如来自10X基因组公司(10X Genomics)(旧金山，加利福尼亚)的凝胶珠)。在一些实现方式中，凝胶珠可包括基于聚合物的凝胶。例如，可以通过将一种或多种聚合物前体包封进液滴来产生凝胶珠。在将聚合物前体暴露于促进剂(例如，四甲基乙二胺(TEMED))后，可以产生凝胶珠。
在一些实施例中，颗粒可以是可降解的。例如，高分子微球可以例如在所希望的条件下溶解、熔化或降解。所希望的条件可包括环境条件。所希望的条件可导致高分子微球以受控方式溶解、熔化或降解。由于化学刺激、物理刺激、生物刺激、热刺激、磁刺激、电刺激、光刺激或其任何组合，凝胶珠可以溶解、融化或降解。
分析物和/或试剂(如寡核苷酸条形码)例如可以偶联/固定到凝胶珠的内表面(寡核苷酸条形码和/或用于产生寡核苷酸条形码的材料的扩散的可接近内部)和/或凝胶珠的外表面或本文描述的任何其他微胶囊。偶联/固定可以经由任何形式的化学键(例如，共价键、离子键)或物理现象(例如，范德华力、偶极-偶极相互作用等)。在一些实施例中，试剂与凝胶珠或本文描述的任何其他微胶囊的偶联/固定可以是可逆的，例如经由不稳定部分(例如，经由化学交联剂，包括本文描述的化学交联剂)。在施加刺激后，可以切割不稳定部分并释放固定化试剂。在一些实施例中，不稳定部分是二硫键。例如，在经由二硫键将寡核苷酸条形码固定到凝胶珠上的情况下，将二硫键暴露于还原剂可以切割二硫键并从珠释放寡核苷酸条形码。不稳定部分可以作为凝胶珠或微胶囊的一部分、作为将试剂或分析物与凝胶珠或微胶囊连接的化学接头的一部分、和/或作为试剂或分析物的一部分包括在内。在一些实施例中，多个条形码的至少一个条形码可固定在颗粒上、部分固定在颗粒上、包封在颗粒中、部分包封在颗粒中、或其任何组合。
在一些实施例中，凝胶珠可包括广泛多种不同的聚合物，包括但不限于：聚合物、热敏聚合物、光敏聚合物、磁性聚合物、pH敏感聚合物、盐敏感聚合物、化学敏感聚合物、聚电解质、多糖、肽、蛋白质和/或塑料。聚合物可包括但不限于以下材料：如聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)、聚(苯乙烯磺酸酯)(PSS)、聚(烯丙基胺)(PAAm)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚(乙烯亚胺)(PEI)、聚(双烯丙基二甲基-氯化铵)(PDADMAC)、聚(吡咯)(PPy)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVPON)、聚(乙烯基吡啶)(PVP)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMAA)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚苯乙烯(PS)、聚(四氢呋喃)(PTHF)、聚(邻苯二甲醛)(PTHF)、聚(己基紫精)(PHV)、聚(L-赖氨酸)(PLL)、聚(L-精氨酸)(PARG)、聚(乳酸-聚羟基乙酸)(PLGA)。
许多化学刺激可用于触发珠的破坏、溶解、或降解。这些化学改变的实例可包括但不限于pH介导的珠壁改变、经由交联键的化学裂解使珠壁分解、珠壁的触发解聚、和珠壁转换反应。批量改变也可用于触发珠的破坏。
通过各种刺激对微胶囊的批量或物理变化在设计胶囊以释放试剂方面也提供了许多优点。在宏观尺度上发生批量或物理变化，其中珠破裂是由刺激引起的机械-物理力的结果。这些过程可包括但不限于压力引起的破裂、珠壁熔化、或珠壁的孔隙率的改变。
生物刺激也可用于触发珠的破坏、溶解、或降解。通常，生物触发剂类似于化学触发剂，但是许多实例使用生物分子、或生命系统中常见的分子，如酶、肽、糖、脂肪酸、核酸等。例如，珠可包括具有肽交联的聚合物，该肽交联通过特定蛋白酶对切割敏感。更具体地，一个实例可包括含有GFLGK肽交联的微胶囊。在添加生物触发物(如蛋白酶组织蛋白酶B)后，壳孔的肽交联被切割且珠的内容物被释放。在其他情况下，蛋白酶可以是热激活的。在另一个实例中，珠包括含有纤维素的壳壁。水解酶壳聚糖的添加用作纤维素键裂解、壳壁解聚、和内部内容物释放的生物触发剂。
还可以在施加热刺激后诱导珠释放其内容物。温度的变化可导致珠的各种变化。热量的变化可能导致珠熔化，使得珠壁崩解。在其他情况下，热量可能增加珠内部组分的内部压力，使得珠破裂或爆炸。在仍其他情况下，热量可以使珠变成收缩的脱水状态。热量还可以作用于珠壁内的热敏聚合物，从而引起珠的破坏。
将磁性纳米颗粒包括在微胶囊的珠壁中可以允许珠的触发破裂以及将珠引导成阵列。本披露的装置可包括用于任一感兴趣的磁珠。在一个实例中，将Fe3O4纳米颗粒并入含聚电解质的珠中在振荡磁场刺激的存在下触发破裂。
由于电刺激的结果，珠也可能被破坏、溶解、或降解。与先前部分中描述的磁性颗粒相似，电敏珠可以允许珠的触发破裂以及其他功能，如电场中的对准、电导率或氧化还原反应。在一个实例中，含有电敏材料的珠在电场中排列，从而可以控制内部试剂的释放。在其他实例中，电场可以在珠壁本身内引起氧化还原反应，这可以增加孔隙率。
也可用光刺激来破坏珠。许多光触发是可能的，并可以包括使用各种分子(如能够吸收特定波长范围的光子的纳米颗粒和发色团)的系统。例如，金属氧化物涂层可用作胶囊触发剂。涂覆有SiO2的聚电解质胶囊的UV照射可导致珠壁的崩解。在又另一个实例中，可以将可光切换材料(如偶氮苯基团)并入珠壁中。在施加UV或可见光后，如这些的化学物质在吸收光子后经历可逆的顺式-反式异构化。在此方面，光子切换的并入导致珠壁在施加光触发剂后可崩解或变得更多孔。
例如，在图2中说明的条形码化(随机条形码化)的非限制性实例中，在框208处将细胞(如单个细胞)引入微孔阵列的多个微孔之后，在框212处可以将珠引入微孔阵列的多个微孔上。每个微孔可包括一个珠。珠可包括多个条形码。条形码可包括附接至珠的5’胺区域。条形码可以包括通用标记、条形码序列(例如，分子标记)、靶结合区、或其任何组合。
本文披露的条形码可以与固体支持物(例如，珠)关联(例如，附接)。与固体支持物关联的条形码每个可包括选自下组的条形码序列，该组由以下组成：具有独特序列的至少100或1000个条形码序列。在一些实施例中，与固体支持物关联的不同条形码可包括不同序列的条形码序列。在一些实施例中，与固体支持物关联的条形码的百分比包括相同的细胞标记。例如，该百分比可以是、或是约60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％、或在这些值的任何两个之间的数字或范围。作为另一个实例，该百分比可以是至少、或至多60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、或100％。在一些实施例中，与固体支持物关联的条形码可以具有相同的细胞标记。与不同固体支持物关联的条形码可以具有选自下组的不同的细胞标记，该组由以下组成：具有独特序列的至少100或1000个细胞标记。
本文披露的条形码可以与固体支持物(例如，珠)关联(例如，附接)。在一些实施例中，可以用包括与多个条形码关联的多个合成的颗粒的固体支持物对样品中的多个靶进行随机地条形码化。在一些实施例中，固体支持物可包括与多个条形码关联的多个合成的颗粒。不同固体支持物上的多个条形码的空间标记可以具有至少一个核苷酸的差异。固体支持物例如可以包括处于二维或三维的多个条形码。合成的颗粒可以是珠。珠可以是硅胶珠、可控孔径玻璃珠、磁珠、Dynabead、交联葡聚糖/琼脂糖珠、珠状纤维素、聚苯乙烯珠、或其任何组合。固体支持物可包括聚合物、基质、水凝胶、针阵列装置、抗体、或其任何组合。在一些实施例中，固体支持物可以自由浮动。在一些实施例中，固体支持物可嵌入半固体或固体阵列中。条形码可以不与固体支持物关联。条形码可以是单独的核苷酸。条形码可与基底相关联。
如本文使用的，术语“拴系”、“附接”和“固定”可互换使用，并且可以指用于将条形码附接到固体支持物上的共价或非共价方式。可以将多种不同的固体支持物中的任何一种用作固体支持物，以用于附接预先合成的条形码或用于条形码的原位固相合成。
在一些实施例中，固体支持物是珠。珠可以包括一种或多种类型的实心的、多孔的或空心的球体、球、承座、圆柱体或其他相似配置，其上可以固定核酸(例如，共价地或非共价地)。珠可以例如由塑料、陶瓷、金属、聚合物材料、或其任何组合构成。珠可以是、或包括球形的(例如，微球)或具有非球形或不规则形状的离散颗粒，该形状是如立方形、长方形、锥形、圆柱形、圆锥形、椭圆形或圆盘形等。在一些实施例中，珠的形状可以是非球形的。
珠可以包含多种材料，包括但不限于顺磁性材料(例如镁、钼、锂和钽)、超顺磁性材料(例如铁氧体(Fe3O4；磁铁矿)纳米颗粒)、铁磁材料(例如，铁、镍、钴，其一些合金，以及一些稀土金属化合物)、陶瓷、塑料、玻璃、聚苯乙烯、二氧化硅、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、胶乳、交联琼脂糖、琼脂糖、水凝胶、聚合物、纤维素、尼龙、或其任何组合。
在一些实施例中，珠(例如，标记所附接的珠)是水凝胶珠。在一些实施例中，珠包括水凝胶。
本文披露的一些实施例包括一个或多个颗粒(例如珠)。颗粒的每个可包括多个寡核苷酸(例如，条形码)。多个寡核苷酸的每个可包括条形码序列(例如，分子标记)、细胞标记、和靶结合区(例如，寡聚(dT)序列、基因特异性序列、随机多聚体、或其组合)。该多个寡核苷酸的每个的细胞标记序列可以是相同的。不同颗粒上的寡核苷酸的细胞标记序列可以是不同的，使得可以鉴定不同颗粒上的寡核苷酸。在不同实现方式中，不同细胞标记序列的数量可以是不同的。在一些实施例中，细胞标记序列的数量可以是、或是约10、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、106、107、108、109、在这些值的任何两个之间的数字或范围、或更多。在一些实施例中，细胞标记序列的数量可以是至少、或至多10、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、106、107、108、或109。在一些实施例中，多个颗粒中不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、或更多个包括具有相同细胞序列的寡核苷酸。在一些实施例中，包括具有相同细胞序列的寡核苷酸的多个颗粒可以是至多0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或更多。在一些实施例中，多个颗粒中没有一个具有相同的细胞标记序列。
在每个颗粒上的多个寡核苷酸可以包括不同的条形码序列(例如，分子标记)。在一些实施例中，条形码序列的数量可以是、或约10、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、106、107、108、109、或在这些值的任何两个之间的数字或范围。在一些实施例中，条形码序列的数量可以是至少、或至多10、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、106、107、108、或109。例如，多个寡核苷酸中的至少100个包括不同的条形码序列。作为另一个实例，在单个颗粒中，多个寡核苷酸中的至少100、500、1000、5000、10000、15000、20000、50000个、这些值的任何两个之间的数字或范围、或更多个包括不同的条形码序列。一些实施例提供了包括条形码的多个颗粒。在一些实施例中，待标记的靶和不同条形码序列的出现(或拷贝或数量)的比率可以是至少1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90、或更高。在一些实施例中，多个寡核苷酸的每个进一步包括样品标记、通用标记、或两者。颗粒例如可以是纳米颗粒或微颗粒。
珠的尺寸可以改变。例如，珠的直径范围可以从0.1微米至50微米。在一些实施例中，珠的直径可以是或是约0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50微米、或在这些值的任何两个之间或数字或范围。
珠的直径可以与基底的孔的直径相关。在一些实施例中，相比孔的直径，珠的直径可以更长或更短、或约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或在这些值的任何两个之间的数字或范围。珠的直径可以与细胞(例如，由基底的孔截留的单个细胞)的直径有关。在一些实施例中，相比孔的直径，珠的直径可以是至少、或至多10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％更长或更短。珠的直径可以与细胞(例如，由基底的孔截留的单个细胞)的直径有关。在一些实施例中，相比细胞的直径，珠的直径可以更长或更短、或约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、或在这些值的任何两个之间的数字或范围。在一些实施例中，相比孔的直径，珠的直径可以是至少、或至多10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、或300％更长或更短。
珠可以附接到和/或包埋在基底中。可以将珠附接和/或嵌入凝胶、水凝胶、聚合物，和/或基质中。使用存在于珠中可以充当位置地址的条形码上的空间标记，可以鉴定在基质(例如，凝胶、基质、支架，或聚合物)中珠的空间位置。
珠的实例可以包括但不限于链霉亲和素珠、琼脂糖珠、磁珠、 微珠、缀合抗体的珠(例如，抗免疫球蛋白微珠)、缀合A蛋白的珠、缀合G蛋白的珠、缀合A/G蛋白的珠、缀合L蛋白的珠、缀合寡聚(dT)的珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠以及BcMagTM羧基封端的磁珠。
珠可以关联有(例如浸渍有)量子点或荧光染料，以使其在一个荧光光通道或多个光通道中是荧光的。珠可以关联有氧化铁或氧化铬，以使其具有顺磁性或铁磁性。珠是可被鉴定的。例如，使用照相机可以将珠成像。珠可以具有与所述珠相关联的可检测的代码。例如，珠可包括条形码。珠的尺寸可以变化，例如由于在有机或无机溶液中的溶胀。珠可以是疏水的。珠可以是亲水的。珠可以是生物相容的。
可以使固体支持物(例如，珠)可视化。固体支持物可以包括可视化标签(例如，荧光染料)。可以用标识(例如，数字)将固体支持物(例如，珠)蚀刻。通过对珠成像可以将所述标识可视化。
固体支持物可以包括不溶性、半溶性或不溶性材料。当固体支持物包括接头、支架、结构单元或附接至其上的其他反应性部分时，它可以被称为“官能化的”，而当固体支持物缺少附接至其上的这样一个反应性部分时，它可以被称为“非官能化的”。固体支持物可以在溶液中不受约束地利用，如以微量滴定孔形式；以流通形式，如在柱中；或在试纸条(dipstick)中。
固体支持物可以包括膜、纸、塑料、涂覆的表面、平表面、玻璃、载玻片、芯片、或其任何组合。固体支持物可以采用树脂、凝胶、微球或其他几何构型的形式。固体支持物可以包括二氧化硅芯片；微颗粒；纳米颗粒；平板；阵列；毛细管；平支持物，如玻璃纤维过滤器，玻璃表面，金属表面(钢、金、银、铝、硅以及铜)，玻璃支持物，塑料支持物，硅支持物，芯片，过滤器，膜，微孔板，载玻片；塑料材料包括多孔板或膜(例如，由聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺、聚偏二氟乙烯形成)；和/或晶片；梳状物(comb)；针或针头(例如，适于组合合成或分析的针阵列)；或平表面(如晶片(例如，硅晶片)、带有具有或不具有滤底的凹陷的晶片)的凹陷或纳升孔的阵列中的珠。
所述固体支持物可以包括聚合物基质(例如，凝胶、水凝胶)。该聚合物基质可能能够渗透细胞内间隙(例如，细胞器周围)。该聚合物基质可能能够贯穿循环系统进行泵送。
固体支持物可以是生物分子。例如，固体支持物可以是核酸、蛋白质、抗体、组蛋白、细胞区室、脂质、碳水化合物等。作为生物分子的固体支持物可被扩增、翻译、转录、降解和/或修饰(例如，聚乙二醇化、sumo化、乙酰化、甲基化)。除了附接至生物分子的空间标记之外，作为生物分子的固体支持物可以提供空间和时间信息。例如，生物分子可以在未修饰时包括第一构象，但是在修饰时可以改变为第二构象。这些不同的构象可以将本披露的条形码(例如，随机条形码)暴露给靶。例如，生物分子可以包括由于生物分子的折叠而不可接近的条形码。在修饰生物分子(例如，乙酰化)时，这些生物分子可以改变构象以暴露这些条形码。修饰的时间设置可以为本披露的条形码化的方法提供另一时间维度。
在一些实施例中，包括本披露的条形码试剂的生物分子可以位于细胞的细胞质中。激活时，该生物分子可以移动到细胞核，于此可以进行条形码化。以这种方式，所述生物分子的修饰可以编码由条形码鉴别的靶的另外的空间-时间信息。
基底和微孔阵列
如本文所用，基底可以指一种固体支持物。基底可以指可包括本披露的条形码和随机条形码的固体支持物。例如，基底可以包括多个微孔。例如，基底可以是包括两个或更多个微孔的孔阵列。在一些实施例中，微孔可以包括具有确定体积的小反应室。在一些实施例中，微孔可以截留一个或多个细胞。在一些实施例中，微孔只能截留一个细胞。在一些实施例中，微孔可以截留一个或多个固体支持物。在一些实施例中，微孔只能截留一个固体支持物。在一些实施例中，微孔截留单个细胞和单个固体支持物(例如，珠)。微孔可以包括本披露的组合条形码试剂。
阵列的微孔能以多种形状和尺寸制造。适宜的几何形状包括但不限于圆柱形、圆锥形、半球形、矩形或多面体(例如，由若干平面组成的三维几何体，例如六角柱、八角柱、倒三棱锥、倒四棱锥、倒五棱锥、倒六棱椎或倒截棱锥)。微孔可以包括组合了这些几何形状中的两种或更多种的形状。例如，微孔可以是部分圆柱形的，其余部分具有倒锥形的形状。微孔可以包括两个并列圆柱体，一个的直径(例如大致对应于珠的直径)大于另一个(例如大致对应于细胞的直径)，这两个圆柱体通过延伸圆柱体的全长(深度)的竖直通道(即，平行于圆柱轴)连接。微孔的开口可以在基底的上表面。微孔的开口可以在基底的下表面。微孔的封闭端(或底部)可以是平的。微孔的封闭端(或底部)可以具有弯曲表面(例如，凸形或凹形)。微孔的形状和/或尺寸可以基于有待被捕获在微孔内的细胞或固体支持物的类型来确定。
基底的孔之间的部分可具有拓扑结构。例如，基底的孔之间的部分可以是圆形的。基底的孔之间的部分可以是尖的。基底的孔之间的间距部分可以是平的。基底的孔之间的部分可以不是平的。在一些情况下，基底的孔之间的部分是圆形的。换言之，基底的不包括孔的部分可以具有弯曲表面。曲面可以被制造成使得该曲面的最高点(例如，顶点)可以处于两个或更多个孔的边缘(例如，与孔等距离)之间的最远点。曲面可以被制造成使得曲面的起始位于第一微孔的边缘处，并产生在第二微孔末端处结束的抛物线。该抛物线可以在二维范围内延伸，以捕获在孔的六边形网格附近的微孔。曲面可以被制造成使得这些孔之间的表面比孔的开口的平面更高和/或更弯曲。弯曲表面的高度可以是或是至少0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、或7微米或更大。在一些实施例中，曲面的高度可以是至多0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、或7微米，或更大。
可以就孔的直径和深度而言来表征微孔尺寸。如本文使用的，微孔的直径是指可以内切于微孔几何体的平面横截面内的最大圆。微孔的直径的范围可以是有待捕获在微孔内的细胞或固体支持物的直径的从约1倍至约10倍。微孔直径可以是待俘获在微孔内的细胞或固体支持物的直径的至少1倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、或至少10倍。在一些实施例中，微孔直径可以是待俘获在微孔内的细胞或固体支持物的直径的至多10倍、至多5倍、至多4倍、至多3倍、至多2倍、至多1.5倍、或至多1倍。微孔直径可以是待俘获在微孔内的细胞或固体支持物的直径的约2.5倍。
可以就绝对尺寸而言指定微孔的直径。微孔的直径可以在从约5微米至约60微米的范围内。微孔直径可以是或是至少5微米、至少10微米、至少15微米、至少20微米、至少25微米、至少30微米、至少35微米、至少40微米、至少45微米、至少50微米、或至少60微米。微孔直径可以是至多60微米、至多50微米、至多45微米、至多40微米、至多35微米、至多30微米、至多25微米、至多20微米、至多15微米、至多10微米、或至多5微米。微孔直径可以是约30微米。
可以选择微孔深度以提供细胞和固体支持物的有效捕获。可以选择微孔深度以提供含在孔内的测定缓冲液和其他试剂的有效交换。可以选择直径与高度(即，纵横比)的比率，使得一旦细胞和固体支持物沉积在微孔内，它们将不会由于微孔上方的流体运动而移位。可以选择微孔的尺寸，使得微孔具有足够的空间以容纳各种大小的固体支持物和细胞，而不会由于微孔上方的流体运动而移动。微孔深度可以是待俘获在微孔内的细胞或固体支持物的直径的从约1倍至约10倍。微孔深度可以是或是待俘获在微孔内的细胞或固体支持物的直径的至少1倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、或至少10倍。微孔深度可以是待俘获在微孔内的细胞或固体支持物的直径的至多10倍、至多5倍、至多4倍、至多3倍、至多2倍、至多1.5倍、或至多1倍。微孔深度可以是待俘获在微孔内的细胞或固体支持物的直径的约2.5倍。
可以就绝对尺寸而言指定微孔的深度。微孔深度的范围可以是从约10微米至约60微米。微孔深度可以是或是至少10微米、至少20微米、至少25微米、至少30微米、至少35微米、至少40微米、至少50微米、或至少60微米。微孔深度可以是至多60微米、至多50微米、至多40微米、至多35微米、至多30微米、至多25微米、至多20微米、或至多10微米。微孔深度可以是约30微米。
在本披露的方法、装置和系统中使用的微孔的体积的范围可以是从约200微米3至约120,000微米3。微孔体积可以是至少200微米3、至少500微米3、至少1,000微米3、至少10,000微米3、至少25,000微米3、至少50,000微米3、至少100,000微米3、或至少120,000微米3。微孔体积可以是至多120,000微米3、至多100,000微米3、至多50,000微米3、至多25,000微米3、至多10,000微米3、至多1,000微米3、至多500微米3、或至多200微米3。微孔体积可以是约25,000微米3。微孔体积可以落入由任何这些值所限制的任何范围内(例如，从约18,000微米3至约30,000微米3)。
微孔体积可以是或是至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、或50纳升3、或更高。微孔体积可以是至多5、10、15、20、25、30、35、40、45、或50纳升3、或更高。可以容纳进微孔的流体体积可以是至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、或50纳升3、或更高。可以容纳进微孔的流体体积可以是至多5、10、15、20、25、30、35、40、45、或50纳升3、或更高。微孔体积可以是或是至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、或50皮升3、或更高。微孔体积可以是至多5、10、15、20、25、30、35、40、45、或50皮升3、或更高。可以容纳进微孔的流体体积可以是至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、或50皮升3、或更高。可以容纳在微孔中的液体的体积可以是至多5、10、15、20、25、30、35、40、45或50皮升3、更多。
在本披露的方法、装置和系统中使用的微孔的体积可以就从一个微孔到另一个微孔的体积变化而言来进一步表征。微孔体积的变异系数(表示为百分比)的范围可以是从约1％至约10％。微孔体积的变异系数可以是至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、或至少10％。微孔体积的变异系数可以是至多10％、至多9％、至多8％、至多7％、至多6％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％、或至多1％。微孔体积的变异系数可以具有在由这些值包括的范围内的任何值，例如在约1.5％和约6.5％之间。在一些实施例中，微孔体积的变异系数可以是约2.5％。
在本披露的方法、装置和系统中使用的微孔体积与珠的表面积(或条形码寡核苷酸可以附接的固体支持物的表面积)的比率的范围可以是从约2.5至约1,520微米。该比率可以是至少2.5、至少5、至少10、至少100、至少500、至少750、至少1,000、或至少1,520。该比率可以是至多1,520、至多1,000、至多750、至多500、至多100、至多10、至多5、或至多2.5。该比率可以是约67.5。微孔体积与珠(或用于固定的固体支持物)的表面积的比率可以落入由任何这些值所限制的任何范围内(例如，从约30至约120)。
微孔阵列的孔可以排列成一维、二维或三维阵列。在一些实施例中，三维阵列可以例如通过堆积一系列的两个或更多个二维阵列(即，通过堆积包括微孔阵列的两个或更多个基底)来实现。
可以选择微孔之间的模式和间距，以优化在每个孔中捕获单个细胞和单个固体支持物(例如，珠)的效率，并且使每单位面积的阵列中的孔的数量最大化。微孔可以根据各种随机或非随机模式分布。例如，它们可以在基底的表面上完全随机地分配，或者它们可以被安排成方形网格、矩形网格、六角网格等。在一些情况下，微孔被安排成六角的。孔之间的中心距(或间距)可以从约5微米至约75微米变化。在一些情况下，微孔之间的间距是约10微米。在其他实施例中，孔之间的间距是至少5微米、至少10微米、至少15微米、至少20微米、至少25微米、至少30微米、至少35微米、至少40微米、至少45微米、至少50微米、至少55微米、至少60微米、至少65微米、至少70微米、或至少75微米。微孔间距可以是至多75微米、至多70微米、至多65微米、至多60微米、至多55微米、至多50微米、至多45微米、至多40微米、至多35微米、至多30微米、至多25微米、至多20微米、至多15微米、至多10微米、至多5微米。微孔间距可以是约55微米。微孔间距可以落入由任何这些值所限制的任何范围内(例如，从约18微米至约72微米)。
微孔阵列在微孔之间可以包括表面特征，其被设计成帮助引导细胞和固体支持物进入孔和/或防止它们沉降在孔之间的表面上。适合的表面特征的实例可以包括但不限于环绕孔或跨过孔之间的表面的圆顶形的、脊形的或峰形的表面特征。
微孔阵列中的孔的总数量可以由孔的模式和间距以及阵列的总尺寸决定。阵列中的微孔数量的范围可以是从约96至约5,000,000或更多。阵列中的微孔数量可以是至少96、至少384、至少1,536、至少5,000、至少10,000、至少25,000、至少50,000、至少75,000、至少100,000、至少500,000、至少1,000,000或至少5,000,000。阵列中的微孔数量可以是至多5,000,000、至多1,000,000、至多75,000、至多50,000、至多25,000、至多10,000、至多5,000、至多1,536、至多384或至多96个孔。在阵列中微孔的数量可以是约96、384、和/或1536。微孔的数量可以是约150,000。在阵列中微孔的数量可以落入由任何这些值所限制的任何范围内(例如，从约100至325,000)。
微孔阵列可以使用多种制造技术中的任何一种来制造。可以使用的制造方法的实例包括但不限于体微机械加工技术，如光刻法和湿化学蚀刻、等离子蚀刻或深反应离子蚀刻；微模塑和微压花；激光微机械加工；3D打印或使用可固化材料的其他直接写入制造工艺；以及类似技术。
微孔阵列可以由多种基底材料中的任何一种制造。对材料的选择将取决于所使用的制造技术的选择，反之亦然。适合的材料的实例可以包括，但不限于，硅、熔融二氧化硅、玻璃、聚合物(例如，琼脂糖、明胶、水凝胶、聚二甲基硅氧烷(PDMS；弹性体)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、高密度聚乙烯(HDPE)、聚酰亚胺、环烯烃聚合物(COP)、环烯烃共聚物(COC)、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、环氧树脂、基于硫醇-烯的树脂)、金属或金属膜(例如，铝、不锈钢、铜、镍、铬和钛)等。在一些情况下，微孔包括光学粘合剂。在一些情况下，微孔由光学粘合剂制成。在一些情况下，微孔阵列包括PDMS和/或由PDMS制成。在一些情况下，微孔由塑料制成。亲水材料对于制造微孔阵列而言是令人希望的(例如，以增强润湿性并最小化细胞和其他生物材料的非特异性结合)。也可以使用可被处理或涂覆(例如通过氧等离子体处理或聚环氧乙烷表面层的接枝)的疏水材料。使用多孔亲水材料来制造微孔阵列可以是令人希望的，以便有助于装置中截留的气泡的毛细管芯吸/通气。微孔阵列可以由单一材料制成。微孔阵列可以包括两种或更多种已经结合在一起或机械连接的不同材料。
微孔阵列可以使用具有多种尺寸和形状中的任何一种的基底来制造。例如，其内制造有微孔的基底的形状(或印迹)可以是正方形、矩形、圆形或不规则形状。微孔阵列基底的印迹可以类似于微量滴定板的印迹。微孔阵列基底的足迹可以类似于标准显微镜载玻片的足迹，例如约75mm长×25mm宽(约3“长×1”宽)或约75mm长×50mm宽(约3“长×2”宽)。其内制造有微孔的基底的厚度的范围可以是从约0.1mm厚至约10mm厚或更厚。微孔阵列基底的厚度可以是至少0.1mm厚、至少0.5mm厚、至少1mm厚、至少2mm厚、至少3mm厚、至少4mm厚、至少5mm厚、至少6mm厚、至少7mm厚、至少8mm厚、至少9mm厚，或至少10mm厚。微孔阵列基底的厚度可以是至多10mm厚、至多9mm厚、至多8mm厚、至多7mm厚、至多6mm厚、至多5mm厚、至多4mm厚、至多3mm厚、至多2mm厚、至多1mm厚、至多0.5mm厚、或至多0.1mm厚。微孔阵列基底的厚度可以是约1mm厚。微孔阵列基底的厚度可以是这些范围内的任何值，例如，微孔阵列基底的厚度可以在约0.2mm和约9.5mm之间。微孔阵列基底的厚度可以是均匀的。
多种表面处理和表面修饰技术可以用于改变微孔阵列表面的特性。实例可以包括但不限于，氧等离子体处理以使得疏水材料表面更亲水、使用湿或干蚀刻技术以使玻璃和硅表面光滑(或粗糙)、将聚氧乙烯或其他聚合物层(如，普朗尼克)或牛血清白蛋白吸附或接枝到基底表面以使它们更亲水并且更不易于生物分子和细胞的非特异性吸附、使用硅烷反应以将化学反应性官能团接枝到另外的惰性硅和玻璃表面等。光脱保护技术可以用于选择性地激活阵列结构中的特定位置处的化学反应性官能团，例如，选择性添加或激活微孔的内壁上的化学反应性官能团(如伯胺或羧基基团)可以用于将寡核苷酸探针、肽、蛋白质或其他生物分子共价偶联至微孔壁。利用的表面处理或表面修饰的选择取决于所希望的表面特性的类型和制成微孔阵列的材料的类型两者或任一者。
可以例如在细胞裂解步骤期间密封微孔的开口，以防止靶核酸在相邻微孔之间的交叉杂交。微孔(或微孔阵列)可以使用例如夹紧在微孔阵列基底的表面上的固体材料(即，板或箔)的柔性膜或片或者合适的珠来密封或加帽，其中所述珠的直径大于所述微孔的直径。
使用柔性膜或固体材料的片材形成的密封件可以包括例如无机纳米孔膜(例如，氧化铝)、透析膜、载玻片、盖玻片、弹性膜(例如PDMS)、或亲水性聚合物膜(例如，涂覆有已经用裂解缓冲液水合的琼脂糖薄膜的聚合物膜)。
用于封盖微孔的固体支持物(例如，珠)可以包括本披露的任何固体支持物(例如，珠)。在一些情况下，固体支持物是交联的葡聚糖珠(例如，Sephadex)。交联葡聚糖的范围可以是从约10微米至约80微米。用于加帽的交联葡聚糖珠可以是从20微米至约50微米。在一些实施例中，珠可以比微孔直径大至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％。用于加帽的珠可以比微孔直径大至多约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％。
密封件或盖可以允许缓冲液穿进穿出微孔，同时阻止大分子(例如，核酸)从孔中迁移出来。通过密封或帽可以阻挡至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个、或更多个核苷酸的大分子迁移进入或离开微孔。通过密封或帽可以阻挡至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个或更多个核苷酸的大分子迁移进入或离开微孔。
固体支持物(例如，珠)可以分布在基底中。通过离心或其他非磁性手段可以将固体支持物(例如，珠)分布在基底的孔中、从基底的孔中去除、或否则通过包括一个或多个微孔阵列的装置进行输送。基底的微孔可以用固体支持物预加载。基底的微孔可以容纳至少1、2、3、4、或5、或更多个固体支持物。基底的微孔可以容纳至多1、2、3、4、或5、或更多个固体支持物。在一些情况下，基底的微孔可以容纳一个固体支持物。
可以使用微孔的替代物来区室化单独的细胞和珠，例如，单个固体支持物和单个细胞可以被限制在乳液中的单个液滴中(例如在液滴数字微流体系统中)。
细胞可以潜在地限制在其自身包括多个拴系条形码的多孔珠内。可以将单独的细胞和固体支持物在任何类型的容器、微容器、反应室、反应容器等中区室化。
或可以不使用微孔而进行单个细胞组合条形码化。可以不使用任何物理容器而进行单个细胞组合条形码化测定。例如，可以不使用物理容器而进行组合条形码化，通过将细胞和珠彼此靠近地嵌入聚合物层或凝胶层内以在不同的细胞/珠对之间创建扩散屏障进行。在另一个实例中，可以不使用物理容器在原位、在体内、在固体组织上，和/或在亚细胞内进行组合条形码化。
微孔阵列可以是测定系统的消耗性部件。微孔阵列可以是可重复使用的。微孔阵列可以被配置成被用作用于手动进行测定的独立式装置，或者它们可以被配置成包括提供测定程序的完全或部分自动的仪器系统的固定或可移除部件。在所披露的方法的一些实施例中，条形码(例如，随机条形码)的珠基文库可以沉积在微孔阵列的孔中作为测定程序的一部分。在一些实施例中，可以将珠预加载到微孔阵列的孔中，并且作为例如用于进行核酸靶的条形码化(例如，随机条形码化)和数字计数的试剂盒的一部分提供给用户。
在一些实施例中，提供两个配对的微孔阵列，一个预先加载有被第一磁体保持在适当位置的珠，并且另一个由用户用来加载单独的细胞。在将细胞分配到第二微孔阵列之后，这两个阵列可以面对面放置，并且第一磁体被去除，而第二磁体被用于将所述珠从第一阵列下拉到第二阵列的对应微孔中，从而确保所述珠位于第二微孔阵列中的细胞上方，并且因此最小化细胞裂解后靶分子的扩散损失，同时最大限度地将靶分子有效附接至所述珠上的条形码。
本披露的微孔阵列可以预先加载固体支持物(例如，珠)。微孔阵列的每个孔可以包括单个固体支持物。在微孔阵列中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％，或100％的孔可以用单个固体支持物预加载。在微孔阵列中至多10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％，或100％的孔可以用单个固体支持物预加载。固体支持物可以包括本披露的条形码(例如，随机条形码)。不同固体支持物上的条形码的细胞标记可以是不同的。相同固体支持物上的条形码的细胞标记可以是相同的。
条形码化的方法
本披露提供了用于估计身体样品(例如，组织、器官、肿瘤、细胞)中的不同位置处的不同靶的数量的方法。这些方法可以包括将条形码(例如，随机条形码)靠近样品放置，裂解样品，将不同靶与条形码相关联，对这些靶进行扩增和/或对靶进行数字计数。该方法可以进一步包括对获得自条形码上的空间标记的信息进行分析和/或可视化。在一些实施例中，该方法包括使样品中的多个靶可视化。将多个靶映射到样品的映射图上可以包括产生样品的二维映射图或三维映射图。可以在对样品中的多个靶进行条形码化(例如，随机条形码化)之前或之后产生二维映射图和三维映射图。将样品中的多个靶可视化包括将多个靶映射到样品的映射图上。将多个靶映射到样品的映射图上可以包括产生样品的二维映射图或三维映射图。可以在对样品中的多个靶进行条形码化之前或之后产生二维映射图和三维映射图。在一些实施例中，可以在裂解样品之前或之后产生二维映射图和三维映射图。在产生二维映射图或三维映射图之前或之后裂解样品可包括加热样品、使样品与洗涤剂接触、改变样品的pH、或其任何组合。
在一些实施例中，对多个靶进行条形码化包括将多个条形码与多个靶杂交以创建条形码化的靶(例如，随机地条形码化的靶)。对多个靶进行条形码化可包括产生条形码化的靶的索引文库。产生条形码化的靶的索引文库可以用包括多个条形码(例如，随机条形码)的固体支持物进行。
使样品和条形码接触
本披露提供了用于使样品(例如，细胞)与本披露的基底接触的方法。可以使包括例如细胞、器官或组织薄片的样品与条形码(例如，随机条形码)接触。例如，通过重力流可以使这些细胞接触，其中可以使这些细胞沉淀并且产生单层细胞。该样品可以是组织薄切片。可以将薄切片置于基底上。该样品可以是一维的(例如，形成平面)。可以将该样品(例如，细胞)涂布于基底上，例如，通过在基底上生长/培养这些细胞。
当条形码靠近靶时，靶可以与条形码进行杂交。条形码可以按不可耗尽的比率接触，使得每个不同的靶可以与本披露的不同条形码相关联。为了确保靶与条形码之间的有效关联，可以将靶与条形码交联。
细胞裂解
在细胞和条形码的分布之后，可以裂解细胞以释放靶分子。细胞裂解可以通过多种手段中的任何一种来完成，例如通过化学或生化手段，通过渗透冲击，或通过热裂解、机械裂解或光学裂解。可以通过添加包括洗涤剂(例如SDS、十二烷基硫酸锂、Triton X-100、Tween-20或NP-40)的细胞裂解缓冲液、有机溶剂(例如甲醇或丙酮)或消化酶(例如蛋白酶K、胃蛋白酶或胰蛋白酶)或其任何组合来裂解细胞。为了增加靶和条形码的关联，可通过例如降低裂解物的温度和/或增加裂解物的粘度来改变靶分子的扩散速率。
在一些实施例中，可以使用滤纸将样品裂解。可以用在滤纸上部的裂解缓冲液浸渍该滤纸。在压力下可以将滤纸应用于样品，该压力可以促进样品的裂解，以及样品的靶与基底的杂交。
在一些实施例中，裂解可以通过机械裂解、热裂解、光学裂解、和/或化学裂解来进行。化学裂解可以包括使用消化酶类，如蛋白酶K、胃蛋白酶、以及胰蛋白酶。可以通过将裂解缓冲液添加到基底中进行裂解。裂解缓冲液可以包括Tris HCl。裂解缓冲液可包括至少约0.01M、0.05M、0.1M、0.5M、或1M或更多Tris HCl。裂解缓冲液可包括至多约0.01M、0.05M、0.1M、0.5M、或1M或更多Tris HCL。裂解缓冲液可以包括约0.1M Tris HCl。裂解缓冲液的pH可以是至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10，或更高。裂解缓冲液的pH可以是至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10，或更高。在一些实施例中，该裂解缓冲液的pH是约7.5。该裂解缓冲液可以包括盐(例如，LiCl)。在裂解缓冲液中盐的浓度可以是至少约0.1M、0.5M、或1M、或更高。在裂解缓冲液中盐的浓度可以是至多约0.1M、0.5M、或1M、或更高。在一些实施例中，在裂解缓冲液中盐的浓度是约0.5M。裂解缓冲液可以包括洗涤剂(例如，SDS、十二烷基硫酸锂、曲通X、tween、NP-40)。在裂解缓冲液中洗涤剂的浓度可以是至少约0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、或7％、或更高。在裂解缓冲液中洗涤剂的浓度可以是至多约0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、或7％、或更高。在一些实施例中，在裂解缓冲液中洗涤剂的浓度是约1％十二烷基硫酸锂。该裂解方法中所用时间可以依赖于所用洗涤剂的量。在一些实施例中，所用洗涤剂越多，裂解所需时间越短。裂解缓冲液可以包括螯合剂(例如，EDTA、EGTA)。在裂解缓冲液中螯合剂的浓度可以是至少约1mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、或30mM或更高。在裂解缓冲液中螯合剂的浓度可以是至多约1、5、10、15、20、25、或30mM或更高。在一些实施例中，在裂解缓冲液中的螯合剂的浓度是约10mM。裂解缓冲液可以包括还原剂(例如，β-巯基乙醇、DTT)。在裂解缓冲液中还原剂的浓度可以是至少约1、5、10、15、或20mM或更高。在裂解缓冲液中还原剂的浓度可以是至多约1、5、10、15、或20mM或更高。在一些实施例中，在裂解缓冲液中还原剂的浓度是约5mM。在一些实施例中，裂解缓冲液可以包括约0.1M Tris HCl、约pH 7.5、约0.5M LiCl、约1％十二烷基硫酸锂、约10mM EDTA，以及约5mM DTT。
可以在约4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、或30℃的温度进行裂解。裂解可以进行约1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、或20分钟或更多分钟。裂解的细胞可以包括至少约100000、200000、300000、400000、500000、600000、或700000个靶核酸分子，或更多。裂解的细胞可以包括至多约100000、200000、300000、400000、500000、600000、或700000个靶核酸分子，或更多。
将条形码附接至靶核酸分子
在细胞裂解和核酸分子从释放之后，核酸分子可以随机地与共定位的固体支持物的条形码相关联。关联可以包括将条形码的靶识别区与靶核酸分子的互补部分的杂交(例如，条形码的寡聚(dT)可与靶的聚(A)尾相互作用)。可以选择用于杂交的测定条件(例如缓冲液pH、离子强度、温度等)以促进形成特定的稳定的杂交体。在一些实施例中，可以将从裂解的细胞释放出的核酸分子与基底上的多个探针(例如，与基底上的探针杂交)相关联。当该探针包括寡聚(dT)时，可以将mRNA分子与探针杂交，并且进行逆转录。可以将寡核苷酸的寡聚(dT)部分充当用于cDNA分子的第一链合成的引物。例如，图2中(在框216上)说明的条形码化的非限制性实例中，mRNA分子可以与珠上的条形码杂交。例如，单链的核苷酸片段可以与条形码的靶结合区杂交。
附接可以进一步包括将条形码的靶识别区与靶核酸分子的一部分连接。例如，靶结合区可以包括可能够与限制性位点突出端(例如EcoRI粘性末端突出端)进行特异性杂交的核酸序列。测定程序还可以包括用限制性酶(例如EcoRI)处理靶核酸以产生限制性位点突出端。然后条形码可以连接到包括与限制性位点突出端互补的序列的任何核酸分子。连接酶(例如，T4DNA连接酶)可用于连接两个片段。
例如，在图2(在框220处)中说明的条形码化的非限制性实例中，随后可以将来自多个细胞(或多个样品)的经标记的靶(例如，靶-条形码分子)例如池化至管中。经标记的靶可以通过例如回收条形码和/或附接靶-条形码分子的珠来池化。
可以通过使用磁珠和外部施加的磁场来实现附接的靶-条形码分子的基于固体支持物的集合的检索。一旦该靶-条形码分子已经池化，所有进一步的处理可以在单个反应容器中进行。进一步的处理可以包括例如逆转录反应、扩增反应、切割反应、解离反应和/或核酸延伸反应。进一步的处理反应可以在微孔内进行，即，不首先池化来自多个细胞的经标记的靶核酸分子。
逆转录
本披露提供了使用逆转录来产生靶-条形码缀合物的方法(在图2的框224中)。靶-条形码缀合物可以包括条形码以及靶核酸(即，条形码化的cDNA分子，如随机条形码化的cDNA分子)的全部或部分的互补性序列。关联的RNA分子的逆转录可以通过添加逆转录引物连同逆转录酶一起而发生。逆转录引物可以是寡聚dT引物、随机六核苷酸引物或靶特异性寡核苷酸引物。寡聚(dT)引物的长度可以是、或可以是约12-18个核苷酸，并与哺乳动物mRNA的3′端的内源性聚(A)尾结合。随机六核苷酸引物可在多个互补位点处结合至mRNA。靶特异性寡核苷酸引物通常选择性地引发目的mRNA。
在一些实施例中，标记的RNA分子的逆转录可通过添加逆转录引物而进行。在一些实施例中，该逆转录引物是寡聚(dT)引物、随机六核苷酸引物或靶特异性寡核苷酸引物。通常，寡聚(dT)引物的长度为12-18个核苷酸，并结合至在哺乳动物mRNA的3’端的内源性聚(A)+尾。随机六核苷酸引物可在多个互补位点处结合至mRNA。靶特异性寡核苷酸引物通常选择性地引发目的mRNA。
逆转录可以重复地发生以产生多个标记的cDNA分子。本文披露的方法可包括进行至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次逆转录反应。该方法可包括进行至少约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100次逆转录反应。
扩增
可以进行一个或多个核酸扩增反应(例如，在图2的框228中)以产生经标记的靶核酸分子的多个拷贝。扩增能以多路方式进行，其中多个靶核酸序列同时进行扩增。扩增反应可用于向核酸分子添加测序衔接子。扩增反应可以包括扩增样品标记(如果存在)的至少一部分。扩增反应可以包括扩增细胞标记和/或条形码序列(例如，分子标记)的至少一部分。扩增反应可以包括扩增样品标签、细胞标记、空间标记、条形码(例如，分子标记)、靶核酸或其组合的至少一部分。扩增反应可包括扩增多个核酸的0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、100％、或在这些值的任何两个之间的数字或范围。该方法可以进一步包括进行一个或多个cDNA合成反应以产生包括样品标记、细胞标记、空间标记和/或条形码序列(例如，分子标记)的靶-条形码分子的一个或多个cDNA拷贝。
在一些实施例中，可以使用聚合酶链式反应(PCR)进行扩增。如本文使用的，PCR可以指用于通过DNA的互补链的同时引物延伸使特异性DNA序列体外扩增的反应。如本文使用的，PCR可包括所述反应的派生形式，包括但不限于RT-PCR、实时PCR、巢式PCR、定量PCR、多重PCR、数字PCR、和组装PCR。
经标记的核酸的扩增可以包括基于非PCR的方法。非基于PCR的方法的实例包括但不限于多重置换扩增(MDA)、转录介导的扩增(TMA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、实时SDA、滚环扩增或环到环扩增(circle-to-circle amplification)。其他非基于PCR的扩增方法包括DNA依赖性RNA聚合酶驱动的RNA转录扩增或RNA指导的DNA合成和转录的多个循环以扩增DNA或RNA靶、连接酶链式反应(LCR)、和Qβ复制酶(Qβ)方法、回文探针的使用、链置换扩增、使用限制性内切核酸酶的寡核苷酸驱动的扩增、使引物与核酸序列杂交并且将所得双链体在延伸反应和扩增之前切割的扩增方法、使用缺乏5’外切核酸酶活性的核酸聚合酶的链置换扩增、滚环扩增和分支延伸扩增(RAM)。在一些实施例中，扩增不产生环化转录物。
在一些实施例中，本文披露的方法进一步包括对经标记的核酸(例如，标记的RNA、标记的DNA、标记的cDNA)进行聚合酶链式反应，以产生标记的扩增子(例如，随机标记的扩增子)。标记的扩增子可以是双链分子。双链分子可包括双链RNA分子、双链DNA分子或者与DNA分子杂交的RNA分子。双链分子的一条或两条链可以包括样品标记、空间标记、细胞标记、和/或条形码序列(例如，分子标记)。标记的扩增子可以是单链分子。单链分子可包括DNA、RNA或其组合。本披露的核酸可以包括合成的或改变的核酸。
扩增可以包括使用一个或多个非天然核苷酸。非天然核苷酸可包括光不稳定或可触发的核苷酸。非天然核苷酸的实例可以包括但不限于肽核酸(PNA)、吗啉代和锁核酸(LNA)、以及二醇核酸(GNA)与苏糖核酸(TNA)。可以将非天然核苷酸添加至扩增反应的一个或多个循环中。添加非天然核苷酸也可以用于鉴别扩增反应中特定循环或时间点的产物。
进行一个或多个扩增反应可以包括使用一种或多种引物。一种或多种引物可以包括例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15个或更多个核苷酸。一种或多种引物可以包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15个或更多个核苷酸。一种或多种引物可以包括少于12-15个核苷酸。一种或多种引物可以退火至多个经标记的靶(例如，随机地经经标记的靶)的至少一部分。一种或多种引物可以退火至多个经标记的靶的3′端或5′端。一种或多种引物可以退火至多个经标记的靶的内部区域。内部区可以是从该多个经标记的靶的3’端的至少约50、100、150、200、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、650、700、750、800、850、900或1000个核苷酸。一种或多种引物可以包括一组固定的引物。一种或多种引物可以包括至少一种或多种定制引物。一种或多种引物可以包括至少一种或多种对照引物。一种或多种引物可以包括至少一种或多种基因特异性引物。
一种或多种引物可以包括通用引物。通用引物可以退火至通用引物结合位点。一种或多种定制引物可以退火至第一样品标记、第二样品标记、空间标记、细胞标记、条形码序列(例如，分子标记)、靶、或其任何组合。一种或多种引物可以包括通用引物和定制引物。定制引物可以设计用于扩增一个或多个靶。靶可以包括一个或多个样品中总核酸的子集。靶可以包括一个或多个样品中总的经标记的靶的子集。一种或多种引物可以包括至少96种或更多种定制引物。一种或多种引物可以包括至少960种或更多种定制引物。一种或多种引物可以包括至少9600种或更多种定制引物。一种或多种定制引物可以退火至两个或更多个不同的经标记的核酸。两个或更多个不同的经标记的核酸可以对应于一个或多个基因。
可以在本披露的方法中使用任何扩增方案。例如，在一个方案中，第一轮PCR可以使用基因特异性引物和针对通用亿明达(Illumina)测序引物1序列的引物来扩增附接到珠上的分子。第二轮PCR可以使用侧翼于亿明达测序引物2序列的巢式基因特异性引物和针对通用亿明达测序引物1序列的引物扩增第一PCR产物。第三轮PCR添加P5和P7以及样品索引，以便使PCR产物进入亿明达测序文库。使用150bp x 2测序的测序可以揭示读数1上的细胞标记和条形码序列(例如，分子标记)、读数2上的基因、以及索引1读数上的样品索引。
在一些实施例中，使用化学切割可以将核酸从基底中去除。例如，可以将存在于核酸中的化学基团或经修饰的碱基用于促进将其从固体支持物中去除。例如，酶可以用于从基底中去除核酸。例如，通过限制性内切核酸酶消化，可以将核酸从基底中去除。例如，使用尿嘧啶-d-糖基化酶(UDG)处理含有dUTP或ddUTP的核酸可以从基底中去除核酸。例如，可以使用用于核苷酸切除(例如，碱基切除修复酶(例如，脱嘌呤/脱嘧啶(AP)核酸内切酶))的酶将核酸从基底中去除。在一些实施例中，可以使用可光解(photocleavable)基团以及光将核酸从基底中去除。在一些实施例中，可以使用可切割接头从基底中去除核酸。例如，可切割接头可以包括以下中的至少一种：生物素/亲和素、生物素/链霉抗生物素蛋白、生物素/中性链亲和素、Ig蛋白A、光不稳定性接头、酸或碱不稳定性接头基团、或适配体。
当探针是基因特异性时，可以将这些分子与探针杂交，并且进行逆转录和/或扩增。在一些实施例中，在核酸已经合成(例如，逆转录)之后，可以将其扩增。扩增能以多重方式进行，其中多个靶核酸序列同时进行扩增。扩增可以将测序衔接子添加至核酸。
在一些实施例中，例如，用桥接扩增可以将扩增在基底上进行。cDNA可以是同聚物尾部，使用基底上的寡聚(dT)探针，以产生用于桥接扩增的相容端。在桥接扩增中，与模板核酸的3′端互补的引物可以是共价附接至固体颗粒的每对引物的第一引物。当含有模板核酸的样品与颗粒接触并进行单个热循环时，可以将模板分子退火至第一引物，并且第一引物通过添加核苷酸而向前延伸以形成双链体分子，该双链体分子由模板分子和与模板互补的新形成的DNA链构成。在下一循环的加热步骤中，双链体分子可以变性，从颗粒释放模板分子，并通过第一引物将互补性DNA链附接至颗粒。在随后的退火和延伸步骤的退火阶段中，互补链可以与第二引物杂交，该第二引物在从第一引物去除的位置处与互补链的片段互补。该杂交可导致互补链在通过共价键固定到第一引物的第一和第二引物之间形成桥接，并通过杂交形成第二引物。在延伸阶段，通过在相同的反应混合物中添加核苷酸，第二引物可以按相反方向延伸，从而将桥转化为双链桥。然后开始下一个循环，并且该双链桥可以变性以产生两个单链核酸分子，每个单链核酸分子的一端分别经第一和第二引物附接至颗粒表面，其中每个单链核酸分子的另一端是未附接的。在该第二个循环的退火和延伸步骤中，每条链可以与先前未使用的另外的互补引物杂交在相同的颗粒上，以形成新的单链桥。将现在杂交的两个先前未使用的引物延伸从而将两个新桥转换成双链桥。
扩增反应可以包括扩增多个核酸的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或100％。
对经标记的核酸的扩增可以包括基于PCR的方法或非基于PCR的方法。对经标记的核酸的扩增可以包括对经标记的核酸的指数式扩增。对经标记的核酸的扩增可以包括对经标记的核酸的线性扩增。扩增可以通过聚合酶链式反应(PCR)来进行。PCR可指用于通过DNA的互补链的同时引物延伸使特异性DNA序列体外扩增的反应。PCR可涵盖该反应的派生形式，包括但不限于，RT-PCR、实时PCR、巢式PCR、定量PCR、多重PCR、数字PCR、抑制PCR、半抑制PCR以及装配PCR。
在一些实施例中，所述经标记的核酸的扩增包括非基于PCR的方法。非基于PCR的方法的实例包括但不限于多重置换扩增(MDA)、转录介导的扩增(TMA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、实时SDA、滚环扩增或环到环扩增(circle-to-circleamplification)。其他非基于PCR的扩增方法包括DNA依赖性RNA聚合酶驱动的RNA转录扩增或RNA指导的DNA合成和转录的多个循环以扩增DNA或RNA靶、连接酶链式反应(LCR)、Qβ复制酶(Qβ)、回文探针的使用、链置换扩增、使用限制性内切核酸酶的寡核苷酸驱动的扩增、使引物与核酸序列杂交并且将所得双链体在延伸反应和扩增之前切割的扩增方法、使用缺乏5’外切核酸酶活性的核酸聚合酶的链置换扩增、滚环扩增和分支延伸扩增(RAM)。
在一些实施例中，本文披露的这些方法进一步包括对扩增的扩增子(例如，靶)进行巢式聚合酶链式反应。扩增子可以是双链分子。双链分子可包括双链RNA分子、双链DNA分子或者与DNA分子杂交的RNA分子。双链分子的一条或两条链可包括样品标签或分子鉴定物标记。可替代地，该扩增子可以是单链分子。单链分子可包括DNA、RNA或其组合。本发明的核酸可以包括合成的或改变的核酸。
在一些实施例中，该方法包括反复扩增经标记的核酸以产生多个扩增子。本文披露的方法可包括进行至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次扩增反应。可替代地，该方法包括进行至少约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100次扩增反应。
扩增可进一步包括将一个或多个对照核酸添加至一个或多个包括多个核酸的样品中。扩增可进一步包括将一个或多个对照核酸添加至多个核酸中。对照核酸可以包括对照标记。
扩增可以包括使用一个或多个非天然核苷酸。非天然核苷酸可以包括光不稳定和/或可触发的核苷酸。非天然核苷酸的实例包括但不限于肽核酸(PNA)、吗啉代和锁核酸(LNA)以及二醇核酸(GNA)与苏糖核酸(TNA)。可以将非天然核苷酸添加至扩增反应的一个或多个循环中。添加非天然核苷酸也可以用于鉴别扩增反应中特定循环或时间点的产物。
进行一个或多个扩增反应可以包括使用一种或多种引物。一种或多种引物可以包括一种或多种寡核苷酸。一种或多种寡核苷酸可以包括至少约7至9个核苷酸。一种或多种寡核苷酸可包括少于12-15个核苷酸。一种或多种引物可以退火至多个经标记的核酸的至少一部分。一种或多种引物可以退火至多个经标记的核酸的3’端和/或5’端。一种或多种引物可以退火至该多个经标记的核酸的内部区。内部区可以是从该多个经标记的核酸的3’端的至少约50、100、150、200、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、650、700、750、800、850、900或1000个核苷酸。一种或多种引物可以包括一组固定的引物。一种或多种引物可以包括至少一种或多种定制引物。一种或多种引物可以包括至少一种或多种对照引物。一种或多种引物可以包括至少一种或多种管家基因引物。一种或多种引物可以包括通用引物。通用引物可以退火至通用引物结合位点。一种或多种定制引物可以退火至第一样品标签、第二样品标签、分子鉴定物标记、核酸或它们的产物。一种或多种引物可以包括通用引物和定制引物。定制引物可以被设计成扩增一个或多个靶核酸。靶核酸可以包括一个或多个样品中总核酸的子集。在一些实施例中，这些引物是附接至本披露的阵列的探针。
在一些实施例中，条形码化(例如，随机地条形码化)在样品中的多个靶进一步包括产生条形码化的片段的索引文库。不同的条形码的条形码序列(例如，不同的随机条形码的分子标记)可以彼此不同。产生条形码化的靶(例如，随机地条形码化的靶)的索引文库包括从样品中的多个靶产生多个索引多核苷酸。例如，对于包括第一索引靶和第二索引靶的条形码化的靶的索引文库，第一索引多核苷酸的标记区与第二索引多核苷酸的标记区可以具有、具有约、具有至少、或具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50个核苷酸的差异、或在这些值的任何两个之间的数字或范围的核苷酸差异。在一些实施例中，产生条形码化的靶的索引文库包括使多个靶(例如mRNA分子)与包括聚(T)区和标记区的多个寡核苷酸接触；以及使用逆转录酶进行第一链合成以产生单链标记的cDNA分子(每个包括cDNA区和标记区)，其中多个靶包括不同序列的至少两个mRNA分子，且多个寡核苷酸包括不同序列的至少两个寡核苷酸。产生条形码化的靶的索引文库可进一步包括扩增单链标记的cDNA分子以产生双链标记的cDNA分子；以及在双链标记的cDNA分子上进行巢式PCR以产生标记的扩增子。在一些实施例中，该方法可包括产生衔接子标记的扩增子。
随机条形码化可以使用核酸条形码或标签以标记单个核酸(例如，DNA或RNA)分子。在一些实施例中，其涉及将DNA条形码或标签添加至cDNA分子，因为它们是从mRNA产生的。可以进行巢式PCR以最小化PCR扩增偏差。可以使用例如下一代测序(NGS)添加衔接子用于测序。例如在图2的框232处，可以使用测序结果以确定靶的一个或多个拷贝的细胞标记、条形码序列(例如，分子标记)、和核苷酸片段的序列。
图3是显示产生条形码化的靶(例如，随机地条形码化的靶)例如mRNA的索引文库的非限制性示例性过程的示意图。如步骤1显示，逆转录过程可以编码具有独特条形码序列(例如，分子标记)、细胞标记和通用PCR位点的每个mRNA分子。特别地，通过将一组条形码(例如，随机条形码)310)杂交到RNA分子302的聚(A)尾区308，可以将RNA分子302逆转录以产生经标记的cDNA分子304(包括cDNA区306)。每个条形码310可包括靶结合区，例如聚(dT)区312、条形码序列或分子标记314、和通用PCR区316。
在一些实施例中，细胞标记可包括3至20个核苷酸。在一些实施例中，条形码序列(例如，分子标记)可包括3至20个核苷酸。在一些实施例中，多个随机条形码的每个进一步包括通用标记和细胞标记的一个或多个，其中通用标记对于固体支持物上的多个随机条形码是相同的且细胞标记对于固体支持物上的多个随机条形码是相同的。在一些实施例中，通用标记可包括3至20个核苷酸。在一些实施例中，细胞标记包括3至20个核苷酸。
在一些实施例中，标记区314可包括标记序列或分子标记318和细胞标记320。在一些实施例中，标记区314可包括通用标记、维度标记、和细胞标记的一个或多个。条形码序列或分子标记318的长度可以是、可以是约、可以是至少、或可以是至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100个核苷酸、或在这些值的任何之间的数量或范围的核苷酸。细胞标记320的长度可以是、可以是约、可以是至少、或可以是至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100个核苷酸、或在这些值的任何之间的数量或范围的核苷酸。通用标记的长度可以是、可以是约、可以是至少、或可以是至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100个核苷酸、或在这些值的任何之间的数字或范围的核苷酸。对于固体支持物上的多个随机条形码，通用标记可以是相同的，且对于固体支持物上的多个随机条形码，细胞标记是相同的。维度标记的长度可以是、可以是约、可以是至少、或可以是至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100个核苷酸、或在这些值的任何之间的数字或范围的核苷酸。
在一些实施例中，标记区314可包括、包括约、包括至少、或包括至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000个不同标记、或在这些值的任何之间的数字或范围的不同标记，如条形码序列或分子标记318和细胞标记320。每个标记的长度可以是、可以是约、可以是至少、或可以是至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100个核苷酸、或在这些值的任何之间的数字或范围的核苷酸。一组条形码或随机条形码310可以含有、含有约、含有至少、或可以是至多10、20、40、50、70、80、90、102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1020个条形码或随机条形码310、或在这些值的任何之间的数字或范围的条形码或随机条形码310。并且条形码或随机条形码310的组可以例如，各自含有独特标记区314。经标记的cDNA分子304可以进行纯化以去除过量条形码或随机条形码310。纯化可以包括Ampure珠纯化。
如步骤2所示，来自逆转录过程的产物在步骤1中可以池化至1管中，且用第1PCR引物池和第1通用PCR引物进行PCR扩增。因为独特标记区314，池化是可能的。特别地，可以将标记的cDNA分子304扩增以产生巢式PCR标记的扩增子322。扩增可包括多重PCR扩增。扩增可以包括在单一反应体积中用96种多重引物进行的多重PCR扩增。在一些实施例中，在单一反应体积中，多重PCR扩增可以利用、利用约、利用至少、或利用至多10、20、40、50、70、80、90、102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1020个多重引物、或在这些值的任何之间的数字或范围的多重引物。扩增可包括靶向特异性基因的定制引物326A-C和通用引物328的第1PCR引物池324。定制引物326可以与经标记的cDNA分子304的cDNA部分306’内的区域杂交。通用引物328可以与经标记的cDNA分子304的通用PCR区域316杂交。
如图3的步骤3中显示，来自步骤2中的PCR扩增的产物可以用巢式PCR引物池和第2通用PCR引物进行扩增。巢式PCR可以最小化PCR扩增偏差。特别地，巢式PCR标记的扩增子322可通过巢式PCR进行进一步扩增。巢式PCR可以包括在单个反应体积中用巢式PCR引物332a-c的巢式PCR引物池330和第2通用PCR引物328′的多重PCR。巢式PCR引物池328可含有、含有约、含有至少、或含有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000个不同巢式PCR引物330、或在这些值的任何之间的数字或范围的不同巢式PCR引物330。巢式PCR引物332可含有衔接子334，并与经标记的扩增子322的cDNA部分306”内的区域杂交。通用引物328’可以含有衔接子336，并与经标记的扩增子322的通用PCR区域316杂交。因此，步骤3产生经衔接子标记的扩增子338。在一些实施例中，巢式PCR引物332和第2通用PCR引物328’可以不含有衔接子334和336。相反，衔接子334和336可以连接到巢式PCR的产物以产生经衔接子标记的扩增子338。
如步骤4中显示，可以使用文库扩增引物将来自步骤3的PCR产物进行PCR扩增用于测序。特别地，可以将衔接子334和336用于对经衔接子标记的扩增子338执行一个或多个另外的测定。衔接子334和336可以与引物340和342杂交。一个或多个引物340和342可以是PCR扩增引物。一个或多个引物340和342可以是测序引物。一个或多个衔接子334和336可以用于经衔接子标记的扩增子338的进一步扩增。一个或多个衔接子334和336可以用于对经衔接子标记的扩增子338进行测序。引物342可含有板索引344，使得使用条形码或随机条形码310的相同组产生的扩增子可以使用下一代测序(NGS)在一个测序反应中测序。
包括与寡核苷酸缀合的细胞组分结合试剂的组合物
本文披露的一些实施例提供多个组合物，每个组合物包括与寡核苷酸缀合的细胞组分结合试剂(例如，蛋白质结合试剂)，其中该寡核苷酸包括与该细胞组分结合试剂缀合的该细胞组分结合试剂的独特标识。该细胞组分结合试剂的结合靶可以是、或包括碳水化合物、脂质、蛋白质、细胞外蛋白质、细胞表面蛋白质、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、整合素、细胞内蛋白质、或其任何组合。在一些实施例中，细胞组分结合试剂(例如，蛋白质结合试剂)能够与蛋白质靶特异性结合。在一些实施例中，寡核苷酸的每个可以包括条形码，如随机条形码。条形码可以包括条形码序列(例如，分子标记)、细胞标记、样品标记、或其任何组合。在一些实施例中，寡核苷酸的每个可以包括接头。在一些实施例中，寡核苷酸的每个可以包括寡核苷酸探针的结合位点(如聚(A)尾)。例如，聚(A)尾可以例如未锚定到固体支持物或锚定到固体支持物上。聚(A)尾的长度可以是从约10至50个核苷酸。在一些实施例中，聚(A)尾的长度可以是18个核苷酸。这些寡核苷酸可包括脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、或两者。
独特标识可以是例如，具有任何适合的长度的核苷酸序列，例如，从约4个核苷酸至约200个核苷酸。在一些实施例中，独特标识是长度为25个核苷酸至约45个核苷酸的核苷酸序列。在一些实施例中，独特标识的长度可以是、是约、是小于、是大于4个核苷酸、5个核苷酸、6个核苷酸、7个核苷酸、8个核苷酸、9个核苷酸、10个核苷酸、15个核苷酸、20个核苷酸、25个核苷酸、30个核苷酸、35个核苷酸、40个核苷酸、45个核苷酸、50个核苷酸、55个核苷酸、60个核苷酸、70个核苷酸、80个核苷酸、90个核苷酸、100个核苷酸、200个核苷酸、或在以上值的任何两个之间的范围。
在一些实施例中，独特标识选自独特标识的多元组。独特标识的多元组可以包括至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1,000、至少2,000、至少5,000个、或更多种不同的独特标识。在一些实施例中，该组独特标识被设计为与待分析样品的DNA或RNA序列具有最小的序列同源性。在一些实施例中，该组独特标识的序列与彼此、或其互补序列相差至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少6个核苷酸、至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸、至少10个核苷酸、或更多个。在一些实施例中，该组独特标识的序列与彼此、或与其互补序列相差至少3％、至少5％、至少8％、至少10％、至少15％、至少20％、或更多。
在一些实施例中，独特标识可以包括引物(如通用引物)的结合位点。在一些实施例中，独特标识可以包括引物(如通用引物)的至少两个结合位点。在一些实施例中，独特标识可以包括引物(如通用引物)的至少三个结合位点。引物可用于扩增独特标识，例如通过PCR扩增。在一些实施例中，引物可用于巢式PCR反应。
本披露考虑了任何合适的蛋白质结合试剂，如抗体或其片段、适配体、小分子、配体、肽、寡核苷酸等、或其任何组合。在一些实施例中，蛋白质结合试剂可以是多克隆抗体、单克隆抗体、重组抗体、单链抗体(sc-Ab)、或其片段，如Fab、Fv等。在一些实施例中，多个蛋白质结合试剂可以包括至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1,000、至少2,000、至少5,000个、或更多种不同的蛋白质结合试剂。
寡核苷酸可以通过各种机制与蛋白质结合试剂缀合。在一些实施例中，寡核苷酸可以与蛋白质结合试剂共价地缀合。在一些实施例中，寡核苷酸可以与蛋白质结合试剂非共价地缀合。在一些实施例中，寡核苷酸通过接头与蛋白质结合试剂缀合。接头可以，例如，从蛋白质结合试剂和/或寡核苷酸可切割或可分离。在一些实施例中，接头可包括可将寡核苷酸可逆地附接至蛋白质结合试剂的化学基团。化学基团可以与接头缀合，例如通过胺基团。在一些实施例中，接头可包括与缀合至蛋白质结合试剂的另一化学基团形成稳定键的化学基团。例如，化学基团可以是UV可光解基团、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺等。在一些实施例中，化学基团可以通过氨基酸(例如赖氨酸)或者N末端上的伯胺与蛋白质结合试剂缀合。可商购的缀合试剂盒，如蛋白质-寡核苷酸缀合试剂盒(Solulink公司，圣地亚哥，加利福尼州)、Thunder-寡核苷酸缀合系统(英诺华生物科学(Innova Biosciences)，剑桥，英国)等可以用于将寡核苷酸与蛋白质结合试剂缀合。
寡核苷酸可以缀合到细胞组分结合试剂(例如，蛋白质结合试剂)的任何合适位点，只要它不干扰细胞组分结合试剂与其细胞组分靶之间的特异性结合即可。在一些实施例中，细胞组分结合试剂是蛋白质。在一些实施例中，细胞组分结合试剂不是抗体。在其中蛋白质结合试剂是抗体的实施例中，寡核苷酸可以在除抗原结合位点之外的任何位置(例如，Fc区、CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域、CL结构域等)缀合至抗体。将寡核苷酸与抗体缀合的方法先前披露在例如美国专利号6,531,283中，其每个的内容通过引用以其整体明确地并入本文。寡核苷酸与蛋白质结合试剂的化学计量可以变化。为了增加在测序中检测蛋白质结合试剂特异性寡核苷酸的灵敏度，在缀合期间增加寡核苷酸与蛋白质结合试剂的比例可以是有利的。在一些实施例中，每个蛋白质结合试剂可以与单个寡核苷酸分子缀合。在一些实施例中，每个蛋白质结合试剂可以与超过一个寡核苷酸分子，例如，至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少100、至少1,000个、或更多个寡核苷酸分子缀合，其中每个寡核苷酸分子包括相同的独特标识。
图4显示了示例性蛋白质结合试剂(例如抗体)的示意图，其与包括抗体的独特标识序列的寡核苷酸缀合。与抗体缀合的寡核苷酸、用于与抗体缀合的寡核苷酸、或先前与抗体缀合的寡核苷酸在本文中可称为抗体寡核苷酸(缩写为“AbOligo”或“AbO”)。寡核苷酸还可以包括另外的组分，这些组分包括但不限于一个或多个接头、抗体的一个或多个独特标识、任选地一个或多个条形码序列(例如，分子标记)、和聚(A)尾。在一些实施例中，寡核苷酸从5’至3’可以包括接头、独特标识、条形码序列(例如，分子标记)、和聚(A)尾。
在一些实施例中，多个细胞组分结合试剂能够特异性结合样品中的多个细胞组分靶，如单个细胞、多个细胞、组织样品、肿瘤样品、血液样品、等等。在一些实施例中，细胞组分结合试剂是蛋白质结合试剂，并且多个蛋白质靶包括细胞表面蛋白质、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、抗体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、或其任何组合。在一些实施例中，多个蛋白质靶可以包括细胞内蛋白质。在一些实施例中，多个蛋白质靶可以包括细胞内蛋白质。在一些实施例中，多个蛋白质可以是生物体中所有编码的蛋白质的至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、或更多。在一些实施例中，多个蛋白质靶可以包括至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少100、至少1,000、至少10,000个、或更多种不同的蛋白质靶。
本文披露的抗体寡核苷酸可以例如包括条形码序列(例如，分子标记)、聚(A)尾、或其任何组合。在一些实施例中，抗体寡核苷酸包括与多个条形码中的至少一个条形码的捕获序列互补的序列。条形码的靶结合区可以包括捕获序列。靶结合区可以例如包括聚(dT)区。在一些实施例中，与条形码的捕获序列互补的抗体寡核苷酸的序列可包括聚(A)尾。抗体寡核苷酸可以包括条形码序列(例如，分子标记)。
在一些实施例中，抗体寡核苷酸序列包括长度在、或约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、128、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000个、或在这些值的任何两个之间的数字或范围的核苷酸的核苷酸序列。在一些实施例中，抗体寡核苷酸序列包括长度为至少、或至多6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、128、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、或1000个核苷酸的核苷酸序列。
在一些实施例中，蛋白质结合试剂包括抗体、四聚物、适配体、蛋白质骨架、或其任何组合。抗体寡核苷酸可以例如通过接头与蛋白质结合试剂缀合。一个抗体寡核苷酸可以包括接头。该接头可以包括化学基团。该化学基团可以可逆地附接至蛋白质结合试剂的分子上。该化学基团可以选自下组，该组由以下组成：UV可光解基团、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、及其任何组合。
在一些实施例中，蛋白质结合试剂可以结合至ADAM10、CD156c、ANO6、ATP1B2、ATP1B3、BSG、CD147、CD109、CD230、CD29、CD298、ATP1B3、CD44、CD45、CD47、CD51、CD59、CD63、CD97、CD98、SLC3A2、CLDND1、HLA-ABC、ICAM1、ITFG3、MPZL1、NA K ATP酶α1、ATP1A1、NPTN、PMCA ATP酶、ATP2B1、SLC1A5、SLC29A1、SLC2A1、SLC44A2、或其任何组合。
在一些实施例中，蛋白质靶包括细胞外蛋白质、细胞内蛋白质、或其任何组合。在一些实施例中，蛋白质靶包括细胞表面蛋白质、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、抗体、或其任何组合。蛋白质靶可包括脂质、碳水化合物、或其任何组合。蛋白质靶可以选自包多个蛋白质靶的组。蛋白质靶的数量可以是、或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000个、或在这些值的任何两个之间的数字或范围。蛋白质靶的数量可以是至少、或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、或10000个。
蛋白质结合试剂可以与具有相同序列的两个或更个种抗体寡核苷酸关联。蛋白质结合试剂可以与具有不同抗体寡核苷酸序列的两个或更多个抗体寡核苷酸关联。与蛋白质结合试剂关联的抗体寡核苷酸的数量在不同的实现方式中可以是不同的。在一些实施例中，抗体寡核苷酸(具有相同或不同的序列)的数量可以是、或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000个、或在这些值的任何两个之间的数字或范围。在一些实施例中，抗体寡核苷酸的数量可以是至少、或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000。
多个组合物可包括一个或多个不与抗体寡核苷酸缀合的其他蛋白质结合试剂(在本文中也称为无抗体寡核苷酸的蛋白质结合试剂)。多个组合物中另外的蛋白质结合试剂的数量在不同的实现方式中可以是不同的。在一些实施例中，另外的蛋白质结合试剂的数量可以是、或是约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100个、或在这些值的任何两个之间或数字或范围。在一些实施例中，另外的蛋白质结合试剂的数量可以是至少、或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100个。在一些实施例中，蛋白质结合试剂和任何另外的蛋白质结合试剂可以是相同的。
在一些实施例中，提供了包括与一个或多个抗体寡核苷酸缀合的一个或多个蛋白质结合试剂和不与抗体寡核苷酸缀合的一个或多个蛋白质结合试剂的混合物。该混合物可用于本文披露的方法的一些实施例中，例如，用于接触一个或多个样品或一个或多个细胞。在混合物中(1)与抗体寡核苷酸缀合的蛋白质结合试剂的数量与(2)不与抗体寡核苷酸或一个或多个其他抗体寡核苷酸缀合的另一个蛋白质结合试剂(例如，相同的蛋白质结合试剂)的数量的比率在不同的实现方式中可以不同。在一些实施例中，该比率可以是、或是约1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.5、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29、1:30、1:31、1:32、1:33、1:34、1:35、1:36、1:37、1:38、1:39、1:40、1:41、1:42、1:43、1:44、1:45、1:46、1:47、1:48、1:49、1:50、1:51、1:52、1:53、1:54、1:55、1:56、1:57、1:58、1:59、1:60、1:61、1:62、1:63、1:64、1:65、1:66、1:67、1:68、1:69、1:70、1:71、1:72、1:73、1:74、1:75、1:76、1:77、1:78、1:79、1:80、1:81、1:82、1:83、1:84、1:85、1:86、1:87、1:88、1:89、1:90、1:91、1:92、1:93、1:94、1:95、1:96、1:97、1:98、1:99、1:100、1:200、1:300、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900、1:1000、1:2000、1:3000、1:4000、1:5000、1:6000、1:7000、1:8000、1:9000、1:10000、或在这些值的任何两个之间的数字或范围。在一些实施例中，该比率可以是至少、或至多1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.5、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29、1:30、1:31、1:32、1:33、1:34、1:35、1:36、1:37、1:38、1:39、1:40、1:41、1:42、1:43、1:44、1:45、1:46、1:47、1:48、1:49、1:50、1:51、1:52、1:53、1:54、1:55、1:56、1:57、1:58、1:59、1:60、1:61、1:62、1:63、1:64、1:65、1:66、1:67、1:68、1:69、1:70、1:71、1:72、1:73、1:74、1:75、1:76、1:77、1:78、1:79、1:80、1:81、1:82、1:83、1:84、1:85、1:86、1:87、1:88、1:89、1:90、1:91、1:92、1:93、1:94、1:95、1:96、1:97、1:98、1:99、1:100、1:200、1:300、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900、1:1000、1:2000、1:3000、1:4000、1:5000、1:6000、1:7000、1:8000、1:9000、或1:10000。
在一些实施例中，该比率可以是、或是约1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.5:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1、38:1、39:1、40:1、41:1、42:1、43:1、44:1、45:1、46:1、47:1、48:1、49:1、50:1、51:1、52:1、53:1、54:1、55:1、56:1、57:1、58:1、59:1、60:1、61:1、62:1、63:1、64:1、65:1、66:1、67:1、68:1、69:1、70:1、71:1、72:1、73:1、74:1、75:1、76:1、77:1、78:1、79:1、80:1、81:1、82:1、83:1、84:1、85:1、86:1、87:1、88:1、89:1、90:1、91:1、92:1、93:1、94:1、95:1、96:1、97:1、98:1、99:1、100:1、200:1、300:1、400:1、500:1、600:1、700:1、800:1、900:1、1000:1、2000:1、3000:1、4000:1、5000:1、6000:1、7000:1、8000:1、9000:1、10000:1、或在这些值的任何两个之间的数字或范围。在一些实施例中，该比率可以是至少、或至多1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.5:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1、38:1、39:1、40:1、41:1、42:1、43:1、44:1、45:1、46:1、47:1、48:1、49:1、50:1、51:1、52:1、53:1、54:1、55:1、56:1、57:1、58:1、59:1、60:1、61:1、62:1、63:1、64:1、65:1、66:1、67:1、68:1、69:1、70:1、71:1、72:1、73:1、74:1、75:1、76:1、77:1、78:1、79:1、80:1、81:1、82:1、83:1、84:1、85:1、86:1、87:1、88:1、89:1、90:1、91:1、92:1、93:1、94:1、95:1、96:1、97:1、98:1、99:1、100:1、200:1、300:1、400:1、500:1、600:1、700:1、800:1、900:1、1000:1、2000:1、3000:1、4000:1、5000:1、6000:1、7000:1、8000:1、9000:1、或10000:1。
蛋白质结合试剂可以与抗体寡核苷酸缀合或不缀合。在一些实施例中，在包括与抗体寡核苷酸缀合的蛋白质结合试剂和不与抗体寡核苷酸缀合的一个或多个蛋白质结合试剂的混合物中，与抗体寡核苷酸缀合的蛋白质结合试剂的百分比可以是、或是约0.000000001％、0.00000001％、0.0000001％、0.000001％、0.00001％、0.0001％、0.001％、0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、或在这些值的任何两个之间的数字或范围。在一些实施例中，在混合物中，与抗体寡核苷酸缀合的蛋白质结合试剂的百分比可以是至少、或至多0.000000001％、0.00000001％、0.0000001％、0.000001％、0.00001％、0.0001％、0.001％、0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％。
在一些实施例中，在包括与抗体寡核苷酸缀合的蛋白质结合试剂和不与抗体寡核苷酸缀合的蛋白质结合试剂的混合物中，不与抗体寡核苷酸缀合的蛋白质结合试剂的比率可以是、或是约0.000000001％、0.00000001％、0.0000001％、0.000001％、0.00001％、0.0001％、0.001％、0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、或在这些值的任何两个之间的数字或范围。在一些实施例中，在混合物中，不与抗体寡核苷酸缀合的蛋白质结合试剂的百分比可以是至少、或至多0.000000001％、0.00000001％、0.0000001％、0.000001％、0.00001％、0.0001％、0.001％、0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％。
细胞组分靶的定量分析方法
本文披露的一些实施例提供了使用本文披露的组合物以及寡核苷酸探针定量分析样品中的多个细胞组分靶(例如，蛋白质靶)的方法，这些寡核苷酸探针可以将条形码序列(例如，分子标记序列)与细胞组分结合试剂(例如，蛋白质结合试剂)的寡核苷酸关联。在一些实施例中，样品可以是单个细胞、多个细胞、组织样品、肿瘤样品、血液样品等等。在一些实施例中，样品可包括细胞类型的混合物，如正常细胞、肿瘤细胞、血细胞、B细胞、T细胞、母体细胞、胎儿细胞等、或来自不同受试者的细胞混合物。
在一些实施例中，样品可包括多个分离进入单个区室(例如微孔阵列中的微孔)的单个细胞。
该细胞组分结合试剂的结合靶(即，细胞组分靶)例如可以是、或包括碳水化合物、脂质、蛋白质、细胞外蛋白质、细胞表面蛋白质、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、整合素、细胞内蛋白质、或其任何组合。在一些实施例中，细胞组分靶是蛋白质靶。在一些实施例中，该多个蛋白质靶包括细胞表面蛋白质、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、抗体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、或其任何组合。在一些实施例中，多个蛋白质靶可以包括细胞内蛋白质。在一些实施例中，多个蛋白质可以是生物体中所有编码的蛋白质的至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、或更多。在一些实施例中，多个蛋白质靶可以包括至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少100、至少1,000、至少10,000个、或更多种不同的蛋白质靶。
在一些实施例中，使多个蛋白质结合试剂与样品接触以与多个蛋白质靶特异性结合。可以例如通过洗涤去除未结合的蛋白质结合试剂。在其中样品包括细胞的实施例中，可以除去未特异性结合细胞的任何蛋白质结合试剂。
在一些情况下，来自细胞群的细胞可以分离(例如，隔离)到本披露的基底的孔中。细胞群可以在分离前稀释。可以将这些细胞群进行稀释使得至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％的基底的孔接收单个细胞。可以将这些细胞群进行稀释使得至多1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％的基底的孔接收单个细胞。可以将这些细胞群进行稀释，使得在经稀释的细胞群中的细胞数量是或是至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％在基底上的孔的数量。可以将这些细胞群进行稀释，使得在经稀释的细胞群中的细胞数量是或是至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％在基底上的孔的数量。在一些情况下，将细胞群稀释使得细胞的数量是基底中孔的数量的约10％。
将单个细胞分布到基底的孔中可以遵循泊松分布。例如，可以至少有0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％或更多的概率，使得基底的孔具有多于一个细胞。可以至少有0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％或更多的概率，使得基底的孔具有多于一个细胞。将单个细胞分布到基底的孔中可以是随机的。将单个细胞分布到基底的孔中可以是非随机的。可以分离细胞，使得基底的孔仅接收一个细胞。
在一些实施例中，蛋白质结合试剂可以另外与荧光分子缀合，以使细胞能够流式分选到单独的区室中。
在一些实施例中，本文披露的方法提供使多个组合物与样品接触以与多种蛋白质靶特异性结合。应理解，所用条件可允许蛋白质结合试剂(例如抗体)与蛋白质靶特异性结合。在接触步骤之后，可以除去未结合的组合物。例如，在其中样品包括细胞、并且与蛋白质靶特异性结合的组合物是细胞表面蛋白质的实施例中，可以通过用缓冲液洗涤细胞来除去未结合的组合物，使得仅与蛋白质靶特异性结合的组合物与细胞一起保留。
在一些实施例中，本文披露的方法可以包括将条形码(例如，随机条形码)与蛋白质结合试剂的多个寡核苷酸关联，该条形码可以包括条形码序列(如分子标记)、细胞标记、样品标记等、或其任何组合。例如，包括条形码的多个寡核苷酸探针可用于与组合物的多个寡核苷酸杂交。
在一些实施例中，多个寡核苷酸探针可以固定在固体支持物上。固体支持物可以是自由浮动的，例如溶液中的珠。固体支持物可包埋在半固体或固体阵列中。在一些实施例中，多个寡核苷酸探针可以不固定在固体支持物上。当多个寡核苷酸探针紧邻蛋白质结合试剂的多个寡核苷酸时，蛋白质结合试剂的多个寡核苷酸可以与寡核苷酸探针杂交。寡核苷酸探针能以不可耗尽的比例接触，使得蛋白质结合试剂的每个不同的寡核苷酸可以与本披露的具有不同条形码序列(例如，分子标记)的寡核苷酸探针关联。
在一些实施例中，本文披露的方法提供将寡核苷酸与特异性结合蛋白质靶的蛋白质结合试剂分离。能以多种方式进行分离以将化学基团与蛋白质结合试剂分离，如UV光切割、化学处理(例如，二硫苏糖醇)、加热、酶处理、或其任何组合。可以在将多个寡核苷酸探针与组合物的多个寡核苷酸杂交的步骤之前、之后或期间进行将寡核苷酸与蛋白质结合试剂分离。
同时定量分析蛋白质和核酸靶的方法
本文披露的一些实施例提供了使用本文披露的组合物和寡核苷酸探针同时定量分析样品中的多个蛋白质靶和多个核酸靶分子的方法，这些寡核苷酸探针可以将条形码序列(例如，分子标记序列)与蛋白质结合试剂的寡核苷酸和核酸靶分子两者关联。在一些实施例中，样品可以是单个细胞、多个细胞、组织样品、肿瘤样品、血液样品等等。在一些实施例中，样品可包括细胞类型的混合物，如正常细胞、肿瘤细胞、血细胞、B细胞、T细胞、母体细胞、胎儿细胞等、或来自不同受试者的细胞混合物。
在一些实施例中，样品可包括多个分离进入单个区室(例如微孔阵列中的微孔)的单个细胞。
在一些实施例中，该多个蛋白质靶包括细胞表面蛋白质、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、抗体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、或其任何组合。在一些实施例中，多个蛋白质靶可以包括细胞内蛋白质。在一些实施例中，多个蛋白质可以是生物体中所有编码的蛋白质的至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、或更多。在一些实施例中，多个蛋白质靶可以包括至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少100、至少1,000、至少10,000个、或更多种不同的蛋白质靶。
在一些实施例中，使多个蛋白质结合试剂与样品接触以与多个蛋白质靶特异性结合。可以例如通过洗涤去除未结合的蛋白质结合试剂。在其中样品包括细胞的实施例中，可以除去未特异性结合细胞的任何蛋白质结合试剂。
在一些情况下，来自细胞群的细胞可以分离(例如，隔离)到本披露的基底的孔中。细胞群可以在分离前稀释。可以将这些细胞群进行稀释使得至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％的基底的孔接收单个细胞。可以将这些细胞群进行稀释使得至多1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％的基底的孔接收单个细胞。可以将这些细胞群进行稀释，使得在经稀释的细胞群中的细胞数量是或是至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％在基底上的孔的数量。可以将这些细胞群进行稀释，使得在经稀释的细胞群中的细胞数量是或是至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％在基底上的孔的数量。在一些情况下，将细胞群稀释使得细胞的数量是基底中孔的数量的约10％。
将单个细胞分布到基底的孔中可以遵循泊松分布。例如，可以至少有0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％或更多的概率，使得基底的孔具有多于一个细胞。可以至少有0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％或更多的概率，使得基底的孔具有多于一个细胞。将单个细胞分布到基底的孔中可以是随机的。将单个细胞分布到基底的孔中可以是非随机的。可以分离细胞，使得基底的孔仅接收一个细胞。
在一些实施例中，蛋白质结合试剂可以另外与荧光分子缀合，以使细胞能够流式分选到单独的区室中。
在一些实施例中，本文披露的方法提供使多个组合物与样品接触以与多种蛋白质靶特异性结合。应理解，所用条件可允许蛋白质结合试剂(例如抗体)与蛋白质靶特异性结合。在接触步骤之后，可以除去未结合的组合物。例如，在其中样品包括细胞、并且与蛋白质靶特异性结合的组合物是细胞表面蛋白质的实施例中，可以通过用缓冲液洗涤细胞来除去未结合的组合物，使得仅与蛋白质靶特异性结合的组合物与细胞一起保留。
在一些实施例中，本文披露的方法可以提供从样品(例如细胞)释放多个核酸靶分子。例如，可以裂解细胞以释放多个核酸靶分子。细胞裂解可以通过多种方法中的任何一种来完成，例如，通过化学处理、渗透压休克、热处理、机械处理、光学处理、或其任何组合。可以通过添加包括洗涤剂(例如SDS、十二烷基硫酸锂、Triton X-100、Tween-20或NP-40)的细胞裂解缓冲液、有机溶剂(例如甲醇或丙酮)或消化酶(例如蛋白酶K、胃蛋白酶或胰蛋白酶)或其任何组合来裂解细胞。
本领域普通技术人员将理解，多个(the plurality of)核酸分子可包括多种(avariety of)核酸分子。在一些实施例中，多个核酸分子可以包括DNA分子、RNA分子、基因组DNA分子、mRNA分子、rRNA分子、siRNA分子或其组合，并且可以是双链的或单链的。在一些实施例中，多个核酸分子包括至少100个、至少1,000个、至少10,000个、至少20,000个、至少30,000个、至少40,000个、至少50,000个、至少100,000个、至少1,000,000个或更多个种类。在一些实施例中，多个核酸分子可以来自样品，如单个细胞或多个细胞。在一些实施例中，多个核酸分子可以从多个样品(如多个单个细胞)中池化。
在一些实施例中，本文披露的方法可以包括将条形码(例如，随机条形码)与多个核酸靶分子和蛋白质结合试剂的多个寡核苷酸关联，该条形码可以包括条形码序列(如分子标记)、细胞标记、样品标记等、或其任何组合。例如，包括条形码的多个寡核苷酸探针可用于与多个核酸靶分子和组合物的多个寡核苷酸杂交。
在一些实施例中，多个寡核苷酸探针可以固定在固体支持物上。固体支持物可以是自由浮动的，例如溶液中的珠。固体支持物可包埋在半固体或固体阵列中。在一些实施例中，多个寡核苷酸探针可以不固定在固体支持物上。当多个寡核苷酸探针紧邻多个核酸靶分子和蛋白质结合试剂的多个寡核苷酸时，多个核酸靶分子和蛋白质结合试剂的多个寡核苷酸可以与寡核苷酸探针杂交。寡核苷酸探针能以不可耗尽的比例接触，使得每个不同的核酸靶分子和蛋白质结合试剂的寡核苷酸可以与本披露的具有不同条形码序列(例如，分子标记)的寡核苷酸探针关联。
在一些实施例中，本文披露的方法提供将寡核苷酸与特异性结合蛋白质靶的蛋白质结合试剂分离。能以多种方式进行分离以将化学基团与蛋白质结合试剂分离，如UV光切割、化学处理(例如，二硫苏糖醇)、加热、酶处理、或其任何组合。可以在将多个寡核苷酸探针与多个核酸靶分子和组合物的多个寡核苷酸杂交的步骤之前、之后或期间进行将寡核苷酸与蛋白质结合试剂分离。
条形码的关联
蛋白质结合试剂和/或核酸分子的寡核苷酸可以随机地与寡核苷酸探针关联。例如，关联可以例如包括寡核苷酸探针的靶结合区与靶核酸分子和/或蛋白质结合试剂的寡核苷酸(例如，条形码的寡核苷酸(dT)可以与靶核酸分子的聚(A)尾和/或蛋白质结合试剂的寡核苷酸的聚(A)尾相互作用)的互补部分杂交。可以选择用于杂交的测定条件(例如缓冲液pH、离子强度、温度等)以促进形成特定的稳定的杂交体。
本披露提供了使用逆转录将条形码序列(例如，分子标记)与靶核酸和/或蛋白质结合试剂的寡核苷酸关联的方法。由于逆转录酶可以使用RNA和DNA作为模板，所以最初缀合在蛋白质结合试剂上的寡核苷酸可以由RNA或DNA碱基、或两者组成。除细胞mRNA分子外，蛋白质结合试剂特异性寡核苷酸可以复制并共价连接至细胞标记和条形码序列(例如，分子标记)。
在一些实施例中，条形码序列(例如，分子标记)可以通过连接寡核苷酸探针靶结合区和靶核酸分子的部分和/或蛋白质结合试剂的寡核苷酸的部分来添加。例如，靶结合区可以包括能够与限制性位点突出端(例如EcoRI粘端突出端)特异性杂交的核酸序列。这些方法可以进一步包括用限制酶(例如EcoRI)处理蛋白质结合试剂的靶核酸和/或寡核苷酸以产生限制性位点突出端。连接酶(例如，T4DNA连接酶)可用于连接两个片段。
同时定量分析蛋白质和核酸靶
图5显示了同时定量分析单个细胞中蛋白质和核酸靶两者的示例性方法的示意图。在一些实施例中，提供了多个组合物505、505b、505c等，每个组合物包括蛋白质结合试剂，如抗体。与不同蛋白质靶结合的不同蛋白质结合试剂(如抗体)与不同的独特标识缀合。接下来，蛋白质结合试剂可以与含有多个细胞510的样品一起孵育。不同的蛋白质结合试剂可以特异性结合细胞表面的蛋白质，如细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、抗体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、或任何其组合。可以例如通过用缓冲液洗涤细胞来除去未结合的蛋白质结合试剂。然后可以将具有蛋白质结合试剂的细胞分离进入多个区室，如微孔阵列，其中单个区室515的大小适合单个细胞和单个珠520。每个珠可包括多个寡核苷酸探针，该多个寡核苷酸探针可包括珠上所有寡核苷酸探针共有的细胞标记、以及条形码序列(例如，分子标记序列)。在一些实施例中，每个寡核苷酸探针可以包括靶结合区，例如，聚(dT)序列。可以使用化学、光学或其他方法将与抗体缀合的寡核苷酸525与抗体分离。可以裂解细胞535以释放细胞内的核酸，如基因组DNA或细胞mRNA 530。细胞mRNA 530、寡核苷酸525或两者可以通过珠520上的寡核苷酸探针捕获，例如，通过与聚(dT)序列杂交。使用细胞mRNA 530和寡核苷酸525作为模板，逆转录酶可用于延伸与细胞mRNA 530和寡核苷酸525杂交的寡核苷酸探针。可以将由逆转录酶产生的延伸产物进行扩增和测序。测序读数可以经受细胞标记、条形码序列(例如，分子标记)、基因同一性、抗体特异性寡核苷酸同一性等的多路分解，这可以产生样品中每个单一细胞的蛋白质和基因表达的数字表示。
确定独特条形码序列(例如，分子标记序列)的数量
在一些实施例中，本文披露的方法包括确定每种独特标识和/或每种核酸靶分子的独特条形码序列(例如，分子标记序列)的数量。例如，测序读数可以用于确定每种独特标识和/或每种核酸靶分子的独特条形码序列的数量。
在一些实施例中，每种独特标识和/或每种核酸靶分子的独特条形码序列的数量指示样品中每种蛋白质靶和/或每种核酸靶分子的数量。在一些实施例中，可以将蛋白质靶的量和其相应的核酸靶分子(例如mRNA分子)的量彼此比较。在一些实施例中，可以计算蛋白质靶的量与其相应的核酸靶分子(例如mRNA分子)的量的比率。蛋白质靶可以是例如细胞表面蛋白质标志物。在一些实施例中，细胞表面蛋白标志物的蛋白质水平与细胞表面蛋白质标志物的mRNA水平之间的比率低。
本文披露的方法可以用于多种应用中。例如，本文披露的方法可用于样品的蛋白质组和/或转录组分析。在一些实施例中，本文披露的方法可用于鉴定样品中的蛋白质靶和/或核酸靶，即生物标志物。在一些实施例中，蛋白质靶和核酸靶彼此对应，即核酸靶编码蛋白质靶。在一些实施例中，本文披露的方法可用于鉴定蛋白质靶，这些蛋白质靶在样品中在蛋白质靶的量与其相应核酸靶分子(例如mRNA分子)的量之间具有所需比率。在一些实施例中，比率是至少0.001、至少0.01、至少0.1、至少1、至少10、至少100、至少1000、或更多个、或在以上值的任何两个之间的范围。在一些实施例中，比率是至多0.001、至多0.01、至多0.1、至多1、至多10、至多100、至多1000、或更少、或在以上值的任何两个之间的范围。在一些实施例中，本文披露的方法可用于鉴定样品中其相应的核酸靶分子的量小于1000、小于100、小于10、小于5、小于2、小于1、或者是0的蛋白质靶。
试剂盒
本文披露的一些实施例提供用于同时定量分析样品中的多个蛋白质和多个核酸靶分子的试剂盒，该试剂盒包括与寡核苷酸缀合的多个蛋白质结合试剂(其中该寡核苷酸包括该蛋白质结合试剂的独特标识)和多个寡核苷酸探针，其中该多个寡核苷酸探针的每个包括靶结合区、条形码序列(例如，分子标记序列)，其中该条形码序列选自独特条形码序列(例如，分子标记序列)的多元组。本文披露内容的包括用于同时定量分析样品中的多个蛋白质靶和多个核酸靶分子的试剂盒，该试剂盒包括多个组合物(每个组合物包括各自与寡核苷酸缀合的多个蛋白质结合试剂，其中该寡核苷酸包括针对与该多个蛋白质结合试剂之一缀合的该多个蛋白质结合试剂之一的独特标识，并且这些蛋白质结合试剂能够特异性结合蛋白质靶(例如，该蛋白质靶的不同部分、该蛋白质靶的不同片段、或该蛋白质靶的不同的同种型))和多个寡核苷酸探针。本文披露内容的包括用于同时定量分析样品中的多个蛋白质靶和多个核酸靶分子的试剂盒，该试剂盒包括多个组合物(每个组合物包括与寡核苷酸缀合的多个蛋白质结合试剂，其中该寡核苷酸包括针对与该蛋白质结合试剂缀合的该蛋白质结合试剂的独特标识，并且这些蛋白质结合试剂能够特异性结合蛋白质靶)和多个寡核苷酸探针。
能够特异性结合蛋白质靶的多个蛋白质结合试剂的蛋白质结合试剂的数量在不同的实现方式中可以是不同的。在一些实施例中，能够特异性结合至蛋白质靶的蛋白质结合试剂的数量可以是、或是约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、或在这些值的任何两个之间的数字或范围。在一些实施例中，能够特异性结合至蛋白质靶的蛋白质结合试剂的数量可以是至少、或至多2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、或100。
在一些实施例中，寡核苷酸的每个可以包括条形码序列(例如，分子标记)、细胞标记、样品标记、或其任何组合。在一些实施例中，寡核苷酸的每个可以包括接头。在一些实施例中，寡核苷酸的每个可以包括寡核苷酸探针的结合位点(如聚(A)尾)。例如，聚(A)尾可以是例如oligodA18(未锚定到固体支持物上)或oligoA18V(锚定到固体支持物上)。寡核苷酸可以包括DNA残基、RNA残基、或两者。
独特标识可以具有任何适合的长度，例如，从约25个核苷酸至约45个核苷酸长。在一些实施例中，独特标识的长度可以是、是约、是小于、是大于4个核苷酸、5个核苷酸、6个核苷酸、7个核苷酸、8个核苷酸、9个核苷酸、10个核苷酸、15个核苷酸、20个核苷酸、25个核苷酸、30个核苷酸、35个核苷酸、40个核苷酸、45个核苷酸、50个核苷酸、55个核苷酸、60个核苷酸、70个核苷酸、80个核苷酸、90个核苷酸、100个核苷酸、200个核苷酸、或在以上值的任何两个之间的范围。
在一些实施例中，独特标识选自独特标识的多元组。独特标识的多元组可以包括至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1,000、至少2,000、至少5,000个、或更多种不同的独特标识。在一些实施例中，该组独特标识被设计为与待分析样品的DNA或RNA序列具有最小的序列同源性。在一些实施例中，该组独特标识的序列与彼此、或其互补序列相差至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少6个核苷酸、至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸、至少10个核苷酸、或更多个。
在一些实施例中，独特标识可以包括引物(如通用引物)的结合位点。在一些实施例中，独特标识可以包括引物(如通用引物)的至少两个结合位点。在一些实施例中，独特标识可以包括引物(如通用引物)的至少三个结合位点。引物可用于扩增独特标识，例如通过PCR扩增。在一些实施例中，引物可用于巢式PCR反应。
本披露考虑了任何合适的蛋白质结合试剂，如抗体或其片段、适配体、小分子、配体、肽、寡核苷酸等、或其任何组合。在一些实施例中，蛋白质结合试剂可以是多克隆抗体、单克隆抗体、重组抗体、单链抗体(scAb)、或其片段，如Fab、Fv等。在一些实施例中，多个蛋白质结合试剂可以包括至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1,000、至少2,000、至少5,000个、或更多种不同的蛋白质结合试剂。
在一些实施例中，寡核苷酸通过接头与蛋白质结合试剂缀合。在一些实施例中，寡核苷酸可以与蛋白质结合试剂共价地缀合。在一些实施例中，寡核苷酸可以与蛋白质结合试剂非共价地缀合。在一些实施例中，接头可包括可将寡核苷酸可逆地附接至蛋白质结合试剂的化学基团。化学基团可以与接头缀合，例如通过胺基团。在一些实施例中，接头可包括与缀合至蛋白质结合试剂的另一化学基团形成稳定键的化学基团。例如，化学基团可以是UV可光解基团、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺等。在一些实施例中，化学基团可以通过氨基酸(例如赖氨酸)或者N末端上的伯胺与蛋白质结合试剂缀合。寡核苷酸可以与蛋白质结合试剂的任何适合的位点缀合，只要它不干扰蛋白质结合试剂与其蛋白质靶之间的特异性结合即可。在其中蛋白质结合试剂是抗体的实施例中，寡核苷酸可以在除抗原结合位点之外的任何位置(例如，Fc区、CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域、CL结构域等)缀合至抗体。在一些实施例中，每个蛋白质结合试剂可以与单个寡核苷酸分子缀合。在一些实施例中，每个蛋白质结合试剂可以与超过一个寡核苷酸分子，例如，至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少100、至少1,000个、或更多个寡核苷酸分子缀合，其中每个寡核苷酸分子包括相同的独特标识。
在一些实施例中，多个蛋白质结合试剂能够特异性结合样品中的多个蛋白质靶，如单个细胞、多个细胞、组织样品、肿瘤样品、血液样品、等等。在一些实施例中，该多个蛋白质靶包括细胞表面蛋白质、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、抗体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、或其任何组合。在一些实施例中，多个蛋白质靶可以包括细胞内蛋白质。在一些实施例中，多个蛋白质靶可以包括细胞内蛋白质。在一些实施例中，多个蛋白质可以是生物体中所有编码的蛋白质的至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、或更多。在一些实施例中，多个蛋白质靶可以包括至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少100、至少1,000、至少10,000个、或更多种不同的蛋白质靶。
单个细胞测序对照颗粒
本文披露的内容包括可以用于例如单个细胞测序对照的对照颗粒组合物。对照颗粒组合物可用于本文披露的任何合适的方法、试剂盒和系统中，例如使用与寡核苷酸关联的细胞组分结合试剂测量细胞组分表达水平(例如蛋白质表达水平)的方法、试剂盒和系统。在一些实施例中，对照颗粒组合物包括与对照颗粒关联的多个对照颗粒寡核苷酸。与多个对照颗粒寡核苷酸关联的对照颗粒在本文中也称为官能化对照颗粒。图6A是用多种寡核苷酸功能化的颗粒的非限制性示例性示意图。图6A显示与对照颗粒关联的对照颗粒寡核苷酸可以包括对照条形码序列和聚(dA)区(模拟mRNA聚(A)尾)。对照颗粒寡核苷酸可以包括条形码序列(例如，分子标记序列)、通用引物的结合位点、或其任何组合。与对照颗粒关联的对照颗粒寡核苷酸与彼此可以是相同的或不同的。在一些实施例中，与对照颗粒关联的对照颗粒寡核苷酸的至少两个具有不同的对照条形码序列。在一些实施例中，多个第一对照颗粒寡核苷酸和多个第二对照寡核苷酸与对照颗粒关联，其中第一和第二颗粒寡核苷酸具有不同的对照条形码序列。
可以用与寡核苷酸缀合的抗体对珠(如CompBeadTM Plus(BD(Franklin Lake，新泽西)))进行官能化。CompBeads Plus的大小约为7.5微米，其与免疫细胞的大小相似。当用与寡核苷酸缀合的抗体官能化时，CompBead Plus可用作单个细胞工作流程的对照细胞或对照颗粒。AbO官能化的珠可以作为单个细胞测序对照与任何单个细胞工作流程一起使用。
对照颗粒寡核苷酸
对照条形码序列的长度在不同的实现方式中可以是不同的。在一些实施例中，对照条形码序列的长度是、或约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、128、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000个、或在这些值的任何两个之间的数字或范围的核苷酸。在一些实施例中，对照条形码序列的长度是至少、或至多6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、128、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、或1000个核苷酸。
对照颗粒寡核苷酸的长度在不同的实现方式中可以是不同的。在一些实施例中，对照颗粒寡核苷酸的长度是、或约25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、128、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000个、或在这些值的任何两个之间的数字或范围的核苷酸。在一些实施例中，对照颗粒寡核苷酸的长度是至少、或至多25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、128、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、或1000个核苷酸。
在一些实施例中，多个对照颗粒寡核苷酸的数量可以是、或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、1000000、10000000、100000000、1000000000、或在这些值的任何两个之间的数字或范围。在一些实施例中，多个对照颗粒寡核苷酸的数量可以是至少、或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、1000000、10000000、100000000、或1000000000。
多个对照颗粒寡核苷酸可以包括相同或不同的对照条形码序列。例如，多个对照颗粒寡核苷酸的至少两个可以包括不同的对照条形码序列。在一些实施例中，多个对照颗粒寡核苷酸中的至少或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、1000000、10000000、100000000、或1000000000个的对照条形码序列可以是相同的。在一些实施例中，多个对照颗粒寡核苷酸中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、1000000、10000000、100000000、1000000000个、或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、1000000、10000000、100000000、1000000000个、或在这些值的任何两个之间的数字或范围的对照条形码序列可以是相同的。
多个对照颗粒寡核苷酸中的至少或至多0.000000001％、0.00000001％、0.0000001％、0.000001％、0.00001％、0.0001％、0.001％、0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、或在这些值的任何两个之间的数字或范围的对照条形码序列可以是相同的。多个对照颗粒寡核苷酸中的0.000000001％、0.00000001％、0.0000001％、0.000001％、0.00001％、0.0001％、0.001％、0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、或约0.000000001％、0.00000001％、0.0000001％、0.000001％、0.00001％、0.0001％、0.001％、0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、或在这些值的任何两个之间的数字或范围的对照条形码序列可以是相同的。
在一些实施例中，对照条形码序列与物种的基因组序列不同源。对照条形码序列可以与物种的基因组序列同源。该物种可以是非哺乳动物物种。非哺乳动物物种可以是噬菌体物种。噬菌体物种可以是T7噬菌体、PhiX噬菌体、或其组合。
对照颗粒
在一些实施例中，多个对照颗粒寡核苷酸中的至少一个通过接头与对照颗粒相关联。该多个对照颗粒寡核苷酸中的至少一个可以包括接头。该接头可以包括化学基团。该化学基团可以可逆地或不可逆地附接到多个对照颗粒寡核苷酸中的至少一个上。该化学基团可以包括UV可光解基团、二硫键、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、二硫键联、或其任何组合。
对照颗粒的直径可以是、或约1-1000微米，如10-100微米或7.5微米。在一些实施例中，对照颗粒的直径可以是、或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000微米、或在这些值的任何两个之间的数字或范围。在一些实施例中，对照颗粒的直径可以是至少、或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000微米。
在一些实施例中，多个对照颗粒寡核苷酸被固定在对照颗粒上。多个对照颗粒寡核苷酸可以被部分固定在对照颗粒上。多个对照颗粒寡核苷酸可以被包封在对照颗粒中。多个对照颗粒寡核苷酸可以被部分包封在对照颗粒中。对照颗粒可以是可破坏的。
在一些实施例中，对照颗粒可以是珠。珠可以包括琼脂糖凝胶珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠、或其任何组合。对照颗粒可以包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮、或其任何组合的材料。对照颗粒可以包括可破坏的水凝胶颗粒。
蛋白质结合试剂
在一些实施例中，对照颗粒与多个第一蛋白质结合试剂相关联，并且多个第一蛋白质结合试剂中至少一个与多个对照颗粒寡核苷酸之一相关联。图6B显示了涂覆有用寡核苷酸官能化的许多抗体的非限制性示例性颗粒。第一蛋白质结合试剂可以包括第一抗体(例如，第一抗体、或第二抗体)。该对照颗粒寡核苷酸可以通过接头与第一蛋白质结合试剂缀合。该第一对照颗粒寡核苷酸可以包括接头。该接头可以包括化学基团。化学基团可以可逆地或不可逆地附接至第一蛋白质结合试剂。该化学基团可以包括UV可光解基团、二硫键、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、二硫键联、或其任何组合。
在一些实施例中，对照颗粒与多个第二蛋白质结合试剂相关联。多个第二蛋白质结合试剂中至少一个可以与多个对照颗粒寡核苷酸中的一个相关联。图6C显示了涂覆有用寡核苷酸官能化的多个第一抗体和未用寡核苷酸官能化的多个第二抗体的非限制性示例性颗粒。可以用热抗体(例如，与对照颗粒寡核苷酸相关联)和冷抗体(例如，与对照颗粒寡核苷酸无关联)的比例来滴定对照颗粒上的抗体，以改变从对照颗粒获得的测序读数的量。第一抗体与第二抗体可以是相同的或不同的。
图6D是在相对高、中等的、和低丰度情况下用多个第一对照颗粒寡核苷酸、与多个第二抗体缀合的多个第二对照颗粒寡核苷酸、和多个第三对照颗粒寡核苷酸官能化的颗粒的非限制性示例性示意图。多个第一对照颗粒寡核苷酸可以与多个第一蛋白质结合试剂缀合。多个第二对照颗粒寡核苷酸可以与多个第二蛋白质结合试剂缀合。多个第三对照颗粒寡核苷酸可以与多个第三蛋白质结合试剂缀合。
第一、第二和第三对照颗粒寡核苷酸的相对丰度可以模拟具有不同表达水平的mRNA。与第一蛋白质结合试剂相关联的对照颗粒寡核苷酸和与第二蛋白质结合试剂相关联的对照颗粒寡核苷酸可以包括不同的对照条形码序列。可以滴定不同的蛋白质结合试剂(如抗体)、和对照颗粒上的不同对照颗粒寡核苷酸，以产生标准曲线。第一蛋白质结合试剂、第二蛋白质结合试剂、或第三蛋白质结合试剂可以是相同的或不同的蛋白质结合试剂。
在一些实施例中，多个第一对照颗粒寡核苷酸的数量与多个第二(或第三)对照颗粒寡核苷酸的数量的比率可以是、或是约1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.5、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29、1:30、1:31、1:32、1:33、1:34、1:35、1:36、1:37、1:38、1:39、1:40、1:41、1:42、1:43、1:44、1:45、1:46、1:47、1:48、1:49、1:50、1:51、1:52、1:53、1:54、1:55、1:56、1:57、1:58、1:59、1:60、1:61、1:62、1:63、1:64、1:65、1:66、1:67、1:68、1:69、1:70、1:71、1:72、1:73、1:74、1:75、1:76、1:77、1:78、1:79、1:80、1:81、1:82、1:83、1:84、1:85、1:86、1:87、1:88、1:89、1:90、1:91、1:92、1:93、1:94、1:95、1:96、1:97、1:98、1:99、1:100、或在这些值的任何两个之间的数字或范围。在一些实施例中，多个第一对照颗粒寡核苷酸的数量与多个第二(或第三)对照颗粒寡核苷酸的数量的比率可以是至少、或至多1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.5、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29、1:30、1:31、1:32、1:33、1:34、1:35、1:36、1:37、1:38、1:39、1:40、1:41、1:42、1:43、1:44、1:45、1:46、1:47、1:48、1:49、1:50、1:51、1:52、1:53、1:54、1:55、1:56、1:57、1:58、1:59、1:60、1:61、1:62、1:63、1:64、1:65、1:66、1:67、1:68、1:69、1:70、1:71、1:72、1:73、1:74、1:75、1:76、1:77、1:78、1:79、1:80、1:81、1:82、1:83、1:84、1:85、1:86、1:87、1:88、1:89、1:90、1:91、1:92、1:93、1:94、1:95、1:96、1:97、1:98、1:99、或1:100。
在一些实施例中，第一蛋白质结合试剂可以与配偶体结合试剂(例如，第二抗体)相关联，并且使用配偶体结合试剂使第一蛋白质结合试剂与对照颗粒相关联。配偶体结合试剂可以包括配偶体抗体。配偶体抗体可以包括抗猫抗体、抗鸡抗体、抗奶牛抗体、抗狗抗体、抗驴抗体、抗山羊抗体、抗豚鼠抗体、抗仓鼠抗体、抗马抗体、抗人抗体、抗美洲驼抗体、抗猴抗体、抗小鼠抗体、抗猪抗体、抗兔抗体、抗大鼠抗体、抗绵羊抗体、或其组合。配偶体抗体可以包括免疫球蛋白G(IgG)、F(ab’)片段、F(ab’)2片段、其组合、或其片段。
在一些实施例中，该第一蛋白质结合试剂与具有相同对照条形码序列的多个对照颗粒寡核苷酸中的两个或更多个相关联。第一蛋白质结合试剂可以与具有不同对照条形码序列的多个对照颗粒寡核苷酸中的两个或更多个相关联。在一些实施例中，多个第一蛋白质结合试剂中至少一个不与多个对照颗粒寡核苷酸中的任一个相关联。与对照颗粒寡核苷酸相关联的第一蛋白质结合试剂和不与任何对照颗粒寡核苷酸相关联的第一蛋白质结合试剂可以是相同的蛋白质结合试剂。
对照条形码多样性
与一个对照颗粒相关联的多个对照颗粒寡核苷酸可以包括许多具有不同对照条形码序列的对照颗粒寡核苷酸。对照颗粒寡核苷酸具有的对照条形码序列的数量在不同的实现方式中可以是不同的。在一些实施例中，对照颗粒寡核苷酸具有的对照条形码序列的数量可以是、或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、10000、100000、1000000、或在这些值的任何两个之间的数字或范围。在一些实施例中，对照颗粒寡核苷酸具有的对照条形码序列的数量可以是至少、或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、10000、100000、或1000000。
在一些实施例中，具有相同对照颗粒寡核苷酸序列的对照颗粒寡核苷酸的数量可以是、或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、10000、100000、1000000、或在这些值的任何两个之间的数字或范围。在一些实施例中，具有相同对照颗粒寡核苷酸序列的对照颗粒寡核苷酸的数量可以是至少、或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、10000、100000、或1000000。
在一些实施例中，多个对照颗粒寡核苷酸包括多个第一对照颗粒寡核苷酸(各自包括第一对照条形码序列)和多个第二对照颗粒寡核苷酸(各自包括第二对照条形码序列)，并且该第一对照条形码序列和该第二对照条形码序列具有不同的序列。多个第一对照颗粒寡核苷酸的数量和多个第二对照颗粒寡核苷酸的数量可以大约相同。多个第一对照颗粒寡核苷酸的数量和多个第二对照颗粒寡核苷酸的数量可以是不同的。多个第一对照颗粒寡核苷酸的数量可以是多个第二对照颗粒寡核苷酸的数量的至少2倍、10倍、100倍、或更多倍。在一些实施例中，多个第一对照颗粒寡核苷酸的数量和多个第二对照颗粒寡核苷酸的数量的比率可以是、或是约1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.5、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29、1:30、1:31、1:32、1:33、1:34、1:35、1:36、1:37、1:38、1:39、1:40、1:41、1:42、1:43、1:44、1:45、1:46、1:47、1:48、1:49、1:50、1:51、1:52、1:53、1:54、1:55、1:56、1:57、1:58、1:59、1:60、1:61、1:62、1:63、1:64、1:65、1:66、1:67、1:68、1:69、1:70、1:71、1:72、1:73、1:74、1:75、1:76、1:77、1:78、1:79、1:80、1:81、1:82、1:83、1:84、1:85、1:86、1:87、1:88、1:89、1:90、1:91、1:92、1:93、1:94、1:95、1:96、1:97、1:98、1:99、1:100、1:200、1:300、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900、1:1000、1:2000、1:3000、1:4000、1:5000、1:6000、1:7000、1:8000、1:9000、1:10000、或在这些值的任何两个之间的数字或范围。在一些实施例中，多个第一对照颗粒寡核苷酸的数量和多个第二对照颗粒寡核苷酸的数量的比率可以是至少、或至多1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.5、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29、1:30、1:31、1:32、1:33、1:34、1:35、1:36、1:37、1:38、1:39、1:40、1:41、1:42、1:43、1:44、1:45、1:46、1:47、1:48、1:49、1:50、1:51、1:52、1:53、1:54、1:55、1:56、1:57、1:58、1:59、1:60、1:61、1:62、1:63、1:64、1:65、1:66、1:67、1:68、1:69、1:70、1:71、1:72、1:73、1:74、1:75、1:76、1:77、1:78、1:79、1:80、1:81、1:82、1:83、1:84、1:85、1:86、1:87、1:88、1:89、1:90、1:91、1:92、1:93、1:94、1:95、1:96、1:97、1:98、1:99、1:100、1:200、1:300、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900、1:1000、1:2000、1:3000、1:4000、1:5000、1:6000、1:7000、1:8000、1:9000、或1:10000。
可检测部分
在一些实施例中，对照颗粒是与可检测部分(例如光学部分，例如荧光团或发色团)相关联的。对照颗粒寡核苷酸可以与可检测部分(例如光学部分)相关联。在一些实施例中，第一蛋白质结合试剂可以与光学部分相关联(图6E)。第二蛋白质结合试剂可以与光学部分相关联。与光学部分关联的对照颗粒(例如，荧光标记的珠)也可用于成像和流式细胞术。
可检测的部分可以选自光谱不同的可检测部分的组。光谱不同的可检测部分包括具有可区分发射光谱的可检测部分，即使它们的发射光谱可以重叠。可检测部分的非限制性实例包括呫吨衍生物：荧光素、罗丹明、俄勒冈绿、曙红、和德克萨斯红(Texas red)；菁蓝衍生物：菁蓝、吲哚碳菁、氧杂碳菁、硫代碳菁、和份菁；方酸菁衍生物和环取代的方酸菁，包括Seta、SeTau、和Square染料；萘衍生物(丹酰和氟硅酸钠(prodan)衍生物)；香豆素衍生物；噁二唑衍生物：吡啶基噁唑、基苯并噁二唑、和苯并噁二唑；蒽衍生物：蒽醌，包括DRAQ5、DRAQ7和CyTRAK橙；芘衍生物：瀑布蓝(cascade blue)；噁嗪衍生物：尼罗红、尼罗蓝、甲酚紫、噁嗪170；吖啶衍生物：前黄素(proflavin)、吖啶橙、吖啶黄；芳基次甲基衍生物：金胺(auramine)、结晶紫、孔雀石绿；和四吡咯衍生物：卟吩、酞菁、胆红素。可检测部分的其他非限制性实例包括羟基香豆素、氨基香豆素、甲氧基香豆素、瀑布蓝、太平洋蓝、太平洋橙、荧光黄、NBD、R-藻红蛋白(PE)、PE-Cy5缀合物、PE-Cy7缀合物、红613、PerCP、TruRed、FluorX、荧光素、BODIPY-FL、Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、TRITC、X-罗丹明、丽丝胺罗丹明B、德克萨斯红、别藻蓝蛋白(APC)、APC-Cy7缀合物、Hoechst 33342、DAPI、Hoechst 33258、SYTOX蓝、色霉素A3、光神霉素(Mithramycin)、YOYO-1、溴化乙锭，吖啶橙、SYTOX绿、TOTO-1、TO-PRO-1、TO-PRO：菁蓝单体、噻唑橙、CyTRAK橙、碘化丙啶(PI)、LDS 751、7-AAD、SYTOX橙、TOTO-3、TO-PRO-3、DRAQ5、DRAQ7、Indo-1、Fluo-3、Fluo-4、DCFH、DHR、和SNARF。
可检测部分的激发波长可以变化，例如是、或是约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000纳米、或在这些值的任何两个之间的数字或范围。可检测部分的发射波长可以变化，例如是、或是约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000纳米、或在这些值的任何两个之间的数字或范围。
可检测部分的分子量可以变化，例如是、或是约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000道尔顿(Da)、或在这些值的任何两个之间的数字或范围。可检测部分的分子量也可以变化，例如是、或是约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000千道尔顿(kDa)、或在这些值的任何两个之间的数字或范围。
例如，光谱不同的可检测部分的组可以例如包括五种不同的荧光团、五种不同的发色团、五种荧光团和发色团的组合、四种不同荧光团和非荧光团的组合、四种发色团和非发色团的组合、或四种荧光团和发色团以及非荧光团非发色团的组合。在一些实施例中，可检测部分可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000个、或在这些值的任何两个之间的数字或范围的光谱不同的部分之一。
对照颗粒工作流程
AbO官能化的珠可以作为单个细胞测序对照与任何单个细胞工作流程一起使用。单个细胞工作流程可利用微孔阵列或微孔盒(例如，BD ResolveTM)或微流体装置(例如，10X基因组公司(10X Genomics)(旧金山，加利福尼亚)、Drop-seq(McCarroll实验室，哈佛医学院(剑桥，麻省理工学院)；Macosko等人,Cell[细胞],2015年5月21日16；5:1202，其内容通过引用以其整体特此结合)、或Abseq(Mission Bio(旧金山，加利福尼亚)；Shahi等人,SciRep.[科学报告]2017年3月14日；7:44447，其内容通过引用以其整体特此结合)，与固体或半固体颗粒(与随机条形码相关联)(例如，BD Resolve、或Drop-seq)或包围可释放的随机条形码的可破坏的水凝胶颗粒(例如，10X基因组公司(10X Genomics)，或Abseq)组合。官能化的珠可以是用于确定单个细胞工作流程效率的对照，类似于用于大量RNAseq或微阵列研究的外部RNA对照聚生体(ERCC)。
本文披露的是使用多个对照颗粒寡核苷酸确定靶的数量的方法。用于确定靶(例如，基因表达)的数量的方法可以与本文披露的其他方法一起使用。例如，工作流程可用于使用多个对照颗粒寡核苷酸确定蛋白质表达和基因表达。
在一些实施例中，该方法包括：使用多个条形码(例如，随机条形码)使多个细胞中的细胞的多个靶和多个对照颗粒寡核苷酸条形码化(例如，随机条形码化)，以创建多个条形码化的靶(例如，随机条形码化的靶)和多个条形码化的对照颗粒寡核苷酸(例如，随机条形码化的对照颗粒寡核苷酸)，其中该多个条形码的每个包括细胞标记序列、条形码序列(例如，分子标记)、和靶结合区，其中该多个条形码中的至少两个条形码的条形码序列包括不同的序列，并且其中该多个条形码中的至少两个条形码包括相同的细胞标记序列，其中对照颗粒组合物包括与多个对照颗粒寡核苷酸关联的对照颗粒，其中该多个对照颗粒寡核苷酸的每个包括对照条形码序列和假-靶区，该假-靶区包括与该多个条形码的至少一个的靶结合区基本上互补的序列。该方法可以包括：获得多个随机地条形码化的靶和多个随机地条形码化的对照颗粒寡核苷酸的测序数据；对测序数据中与具有该对照条形码序列的多个对照颗粒寡核苷酸相关联的具有不同序列的条形码序列的数量进行计数。该方法可以包括：对于该多个靶中的至少一个靶：对测序数据中与该靶相关联的具有不同序列的条形码序列的数量进行计数；并且估计靶的数量，其中经估计的靶的数量跟与经计数的靶相关联的具有不同序列的条形码序列的数量和与对照条形码序列相关联的具有不同序列的条形码序列的数量相关。在一些实施例中，假-靶区包括聚(dA)区。假-靶区可以包括靶的子序列。
在一些实施例中，经估计的靶的数量可以与以下相关：与经计数的靶相关联的具有不同序列的条形码序列的数量、与对照条形码序列相关联的具有不同序列的条形码序列的数量、以及包含对照条形码序列的多个对照颗粒寡核苷酸的数量。经估计的靶的数量可以与以下相关：与经计数的靶相关联的具有不同序列的条形码序列的数量，以及包括对照条形码序列的多个对照颗粒寡核苷酸的数量与跟对照条形码序列相关联的具有不同序列的条形码序列的数量的比率。
例如，如果对照颗粒具有100个具有特定对照条形码序列的对照颗粒寡核苷酸，并且与对照条形码序列相关联的具有不同序列的条形码序列的数量(例如，具有在文库制备过程中幸存的对照条形码序列的对照颗粒寡核苷酸的数量)是80，则文库制备的效率(例如，逆转录、扩增等)是80％。因此，可以通过使用文库制备效率进行标准化来比较来自不同文库制备的数据。
作为另一个实例，对照颗粒可以包括五种对照颗粒寡核苷酸，其具有模拟低表达基因的特定对照条形码测序。如果与对照条形码序列相关联的具有不同序列的条形码序列的数量是5，并且未检测到低表达基因，则可以得出低表达基因不表达的结论(或该细胞的该基因的mRNA少于5个)。然而，如果与对照条形码序列相关联的具有不同序列的条形码序列的数量为零，并且未检测到低表达基因，则不能得出低表达基因不表达的结论。
可以确定具有不同丰度的对照颗粒寡核苷酸的捕获效率。可以基于具有两个或更多个对照条形码序列的对照颗粒寡核苷酸的捕获效率进行标准化。在一些实施例中，对测序数据中与具有该对照条形码序列的多个对照颗粒寡核苷酸相关联的具有不同序列的条形码序列的数量进行计数包括：对测序数据中与该第一对照条形码序列相关联的具有不同序列的条形码序列的数量进行计数；并且对测序数据中与该第二对照条形码序列相关联的具有不同序列的条形码序列的数量进行计数；经估计的靶的数量可以与以下相关：与经计数的靶相关联具有不同序列的条形码序列的数量、与第一对照条形码序列相关联的具有不同序列的条形码序列的数量、以及与第二对照条形码序列相关联的具有不同序列条形码序列的数量。
在一些实施例中，该方法包括在将多个靶和对照颗粒以及多个对照颗粒寡核苷酸随机地条形码化之前从对照颗粒释放多个对照颗粒寡核苷酸中的至少一个。
在一些实施例中，使用多个条形码使多个靶和多个对照颗粒寡核苷酸条形码化(例如，随机地条形码化)包括：使多个条形码与多个靶的靶以及多个对照颗粒寡核苷酸的对照颗粒寡核苷酸接触以生成与靶和对照颗粒寡核苷酸杂交的条形码(例如，随机条形码)；并且延伸与靶和对照颗粒寡核苷酸杂交的条形码(例如，随机条形码)以生成多个随机地条形码化的靶和多个随机地条形码化的对照颗粒寡核苷酸。延伸这些条形码可以包括使用DNA聚合酶、逆转录酶、或其组合延伸这些条形码。
在一些实施例中，该方法包括扩增多个随机地条形码化的靶和多个随机地条形码化的对照颗粒寡核苷酸以产生多个扩增子。扩增多个随机地条形码化的靶和多个随机地条形码化的对照颗粒寡核苷酸可以包括使用聚合酶链式反应(PCR)扩增条形码序列的至少一部分和对照颗粒寡核苷酸的至少一部分或条形码序列的至少一部分和对照颗粒寡核苷酸的至少一部分。获得测序数据可以包括获得多个扩增子的测序数据。获得测序数据可以包括对条形码序列的至少一部分和对照颗粒寡核苷酸的至少一部分，或条形码序列的至少一部分和对照颗粒寡核苷酸的至少一部分进行测序。
微孔盒或阵列工作流程
图7是使用用寡核苷酸功能化的颗粒进行单个细胞测序对照的示例性工作流程的示意图。在一些实施例中，对照颗粒组合物包括与对照颗粒704关联的多个对照颗粒寡核苷酸。例如，对照颗粒740可以与缀合至抗体705的对照颗粒寡核苷酸725相关联，该抗体705结合至对照颗粒740。对照颗粒寡核苷酸725官能化的多个对照颗粒740能以例如5％掺入多个细胞中。对照颗粒740可以在后续工作流程中被视为“细胞”。对照颗粒740也可以称为对照细胞或对照细胞颗粒。然后可将细胞710和对照颗粒740分离进入多个区室(如微孔阵列的孔)，其中单个区室715a、715b的大小适合单个细胞或对照颗粒和单个珠720a、720b。珠720a、720b可以加载在区室715a、715b上。
每个珠可包括多个寡核苷酸探针，该多个寡核苷酸探针可包括珠上所有寡核苷酸探针共有的细胞标记、以及条形码序列(例如，分子标记序列)。在一些实施例中，每个寡核苷酸探针可以包括靶结合区，例如，聚(dT)序列。可以使用化学、光学或其他方法将与抗体705缀合的寡核苷酸725与抗体705分离。可以裂解735细胞710以释放细胞内的核酸，如基因组DNA或细胞mRNA 730。可以分别通过在珠720a、720b上的寡核苷酸探针捕获细胞mRNA 530和对照颗粒寡核苷酸725，例如，通过与聚(dT)序列杂交。可以回收珠并且捕获的细胞mRNA730和对照颗粒寡核苷酸725(例如，对应于总共约5000个细胞)可以池化。
使用细胞mRNA 730和寡核苷酸725作为模板，逆转录酶可用于延伸与细胞mRNA730和寡核苷酸725杂交的寡核苷酸探针。可以将由逆转录酶产生的延伸产物进行扩增和测序。测序读数可以经受细胞标记、条形码序列(例如，分子标记)、基因同一性、对照颗粒寡核苷酸序列等的多路分解，其可以用于确定单个细胞基因表达谱和整个或部分工作流程的数量效率(例如，细胞捕获效率)。例如，可以基于数据中的与对照条形码序列相关联的细胞标记的数量来确定捕获的对照颗粒的数量。工作流程的效率可以是捕获的对照颗粒的数量与加入的对照颗粒的数量的比率。
微流体工作流程
图8是使用用寡核苷酸功能化的颗粒进行单个细胞测序对照的另一个示例性工作流程的示意图。对照颗粒寡核苷酸725官能化的多个对照颗粒740能以例如5％掺入多个细胞中。对照颗粒740可以在后续工作流程中被视为“细胞”。对照颗粒740也可以称为对照细胞或对照细胞颗粒。然后可以使用微流体装置将细胞710和对照颗粒740分离进入多个区室，如液滴745a、745。每个液滴745a、745b可以包括一个细胞710或一个对照颗粒740和水凝胶珠720a、720b。
每个珠720a、720b可包括多个寡核苷酸探针，该多个寡核苷酸探针可包括珠上所有寡核苷酸探针共有的细胞标记、以及条形码序列(例如，分子标记序列)。在一些实施例中，每个寡核苷酸探针可以包括靶结合区，例如，聚(dT)序列。珠720a、720b可包括用于后续工作流程(例如，逆转录)的试剂。可以使用化学、光学或其他方法将与抗体705缀合的寡核苷酸725与抗体705分离。可以裂解735细胞710以释放细胞内的核酸，如基因组DNA或细胞mRNA 730。可以分别通过从珠720a、720b释放的寡核苷酸探针捕获细胞mRNA 530和对照颗粒寡核苷酸725，例如，通过与聚(dT)序列杂交。使用细胞mRNA 730和寡核苷酸725作为模板，逆转录酶可用于延伸与细胞mRNA 730和寡核苷酸725杂交的寡核苷酸探针。
在破碎液滴745a、745b后，可以将由逆转录酶产生的延伸产物进行池化并进行扩增和测序。测序读数可以经受细胞标记、分子标记、基因同一性、对照颗粒寡核苷酸序列等的多路分解，以确定单个细胞基因表达谱和整个或部分工作流程的数量效率。
用于确定单个细胞测序效率的对照寡核苷酸
在一些实施例中，通过用与寡核苷酸缀合的抗体(例如，用通用抗体或生物标记抗体)标记单个细胞并用它们产生下一代测序文库，来自NGS读数中的寡核苷酸的信号可用于确定单个细胞NGS效率。然后，这可以用作QC步骤或用于不同单个细胞测序平台的功效的评估工具。例如，对照寡核苷酸可用于本文披露的任何合适的方法、试剂盒和系统中，例如使用与寡核苷酸关联的细胞组分结合试剂测量细胞组分表达水平(例如蛋白质表达水平)的方法、试剂盒和系统。
与寡核苷酸缀合的抗体(在本文中称为“AbO”)可以作为单个细胞测序对照与任何单个细胞工作流程一起使用。单个细胞工作流程可利用微孔阵列或微孔盒(例如，BDResolveTM)或微流体装置(例如，10X基因组公司(10X Genomics)(旧金山，加利福尼亚)、Drop-seq(McCarroll实验室，哈佛医学院(剑桥，麻省理工学院)；Macosko等人,Cell[细胞],2015年5月21日16；5:1202，其内容通过引用以其整体特此结合)、或Abseq(MissionBio(旧金山，加利福尼亚)；Shahi等人,Sci Rep.[科学报告]2017年3月14日；7:44447，其内容通过引用以其整体特此结合)，与固体或半固体颗粒(与条形码，如随机条形码相关联)(例如，BD Resolve、或Drop-seq)或可释放的条形码(如随机条形码)包围的可破坏的水凝胶颗粒(例如，10X基因组公司(10X Genomics)，或Abseq)组合。AbO可以作为确定单个细胞工作流程效率的对照。例如，来自10X基因组公司(10X Genomics)的单个细胞测序平台使用乳液将单个细胞包封在液滴中进行单个细胞捕获。因为这些液滴不容易可视化，所以不能容易地确定单个细胞的捕获效率。在这种单个细胞测序工作流程的上游使用AbO允许用户评估测序后的单个细胞捕获效率和双联体形成速率。
图9显示了使用对照寡核苷酸-缀合的抗体确定单个细胞测序效率的示例性工作流程的示意图。在一些实施例中，在加载到微孔盒或阵列的微孔915上之前，可以用与对照寡核苷酸925缀合的抗体905对一个或多个细胞(例如，5000个)900进行染色。然后可以将细胞910分离进入多个区室，如微孔阵列的孔，其中单个区室915的大小适合单个细胞和单个珠920。
例如，珠可包括多个寡核苷酸探针，该多个寡核苷酸探针可包括珠上所有寡核苷酸探针共有的细胞标记、以及条形码序列(例如，分子标记序列)。在一些实施例中，每个寡核苷酸探针可以包括靶结合区，例如，聚(dT)序列。可以使用化学、光学或其他方法将与抗体905缀合的寡核苷酸925与抗体905分离。可以裂解935细胞910以释放细胞内的核酸，如基因组DNA或细胞mRNA 930。可以分别通过在珠920上的寡核苷酸探针捕获细胞mRNA 930和对照寡核苷酸925，例如，通过与聚(dT)序列杂交。可以回收珠并且可以池化捕获的细胞mRNA930(例如，对应于总共约5000个细胞)。
使用细胞mRNA 930和寡核苷酸925作为模板，逆转录酶可用于延伸与细胞mRNA930和寡核苷酸925杂交的寡核苷酸探针。可以将由逆转录酶产生的延伸产物进行扩增和测序。测序读数可以经受细胞标记、条形码序列(例如，分子标记)、基因同一性、对照寡核苷酸序列等的多路分解，以确定单个细胞基因表达谱和整个或部分工作流程的数量效率(例如，细胞捕获效率)。可以确定捕获并成功通过文库制备的细胞的数量(例如，少于5000个细胞)。
图10显示了使用对照寡核苷酸-缀合的抗体确定单个细胞测序效率的示例性工作流程的另一示意图。在图10中，可以使用微流体装置形成含有单个细胞1010a、1010b和单个颗粒1020a、1020b的液滴1045a、1045b。单个细胞1010a、1010b可以与缀合有对照寡核苷酸1025a、1025b的抗体1005a、1005b结合。在细胞裂解并在液滴1045a、1045b中逆转录后，可以破碎液滴并池化内容物用于文库制备。可以确定捕获并成功通过文库制备的细胞的数量。
图11A-11C是显示对照寡核苷酸可用于细胞计数的图。图11A-11B显示AbO的对照寡核苷酸可用作细胞计数的对照。如果实现100％捕获和文库制备效率，则mRNA计数图和对照寡核苷酸计数图的下降分数可以重合。图11C显示使用常规的仅mRNA细胞标记调用可以在高转录细胞的雾中错过低转录细胞。该方法可以在n个细胞条形码处调用截止。这可以发生在大量激活的T细胞中的静止T细胞情况下，其中激活的T细胞在RNA转录中可以高若干倍。当在靶向组(例如，癌症组)中时，这也可以发生，具有靶基因低表达的非靶向细胞(非癌细胞)将被丢弃。然而，由于蛋白质表达高得多，低转录细胞仍有更高的被调用机会。该方法可以在m个细胞条码处调用截止，其中m>n。
本文披露的是用于测序对照的方法(例如，确定单个细胞测序效率)。用于确定单个细胞测序效率的方法可以与本文披露的其他方法一起使用。例如，用于单个细胞测序效率的方法可以与测定蛋白质表达的方法一起使用。作为另一个实例，工作流程可用于确定单个细胞测序效率、蛋白质表达、和/或基因表达。
在一些实施例中，该方法包括：使多个细胞中的一个或多个细胞与多个对照组合物的对照组合物接触，其中该多个细胞中的细胞包括多个靶和多个蛋白质靶，其中该多个对照组合物中的每一个包括与对照寡核苷酸相关联的蛋白质结合试剂，其中该蛋白质结合试剂能够特异性结合该多个蛋白质靶中的至少一个，并且其中该对照寡核苷酸包括对照条形码序列和假-靶区，该假-靶区包括与该多个条形码中至少一个的靶结合区基本互补的序列；使用多个条形码使该对照寡核苷酸条形码化，以创建多个条形码化的对照寡核苷酸，其中该多个条形码中的每一个包括细胞标记序列、条形码序列(例如，分子标记序列)、和靶结合区，其中该多个条形码中至少两个条形码的条形码序列包括不同的序列，并且其中该多个条形码中至少两个条形码包括相同的细胞标记序列；获得该多个条形码化的对照寡核苷酸的测序数据；使用测序数据中的多个条形码化的对照寡核苷酸的至少一个特征确定一个或多个细胞的至少一个特征(例如，捕获并成功通过文库制备的细胞的数量)。在一些实施例中，假-靶区包括聚(dA)区。
在一些实施例中，确定一个或多个细胞的至少一个特征包括：确定测序数据中与该多个条形码化的对照寡核苷酸相关联的具有不同序列的细胞标记序列的数量；并且使用与多个条形码化的对照寡核苷酸相关联的具有不同序列的细胞标记序列的数量，确定一个或多个细胞的数量。该方法可以包括：基于经确定的一个或多个细胞的数量确定单个细胞捕获效率。该方法可以包括：包括基于经确定的一个或多个细胞的数量和多个细胞的数量的比率确定单个细胞捕获效率。
在一些实施例中，使用测序数据中多个条形码化的对照寡核苷酸的特征确定一个或多个细胞的至少一个特征包括对于测序数据中的每个细胞标记，确定与细胞标记和对照条形码序列相关联的具有不同序列的条形码序列(例如，分子标记序列)的数量；并且使用与该细胞标记和该对照条形码序列相关联的具有不同序列的条形码序列的数量确定一个或多个细胞的数量。确定与该细胞标记和该对照条形码序列相关联的具有不同序列的条形码序列的数量可以包括：对于测序数据中的每个细胞标记，确定与该细胞标记和该对照条形码序列相关联的具有最多数量不同序列的条形码序列的数量。使用与该细胞标记和该对照条形码序列相关联的具有不同序列的条形码序列的数量确定一个或多个细胞的数量可以包括：生成具有最多数量不同序列的条形码序列的数量和测序数据中与具有最多数量不同序列的条形码序列的数量相关联的细胞标记的数量的图；并且在图中确定截止值作为一个或多个细胞的数量。
在一些实施例中，方法包括在使对照寡核苷酸条形码化之前，从蛋白质结合试剂释放对照寡核苷酸。在一些实施例中，该方法包括去除多个对照组合物中未结合的对照组合物。去除未结合的对照组合物可以包括用洗涤缓冲液洗涤多个细胞中的一个或多个细胞。去除未结合的细胞鉴定组合物可以包括使用流式细胞术选择与对照组合物的至少一个蛋白质结合试剂结合的细胞。
在一些实施例中，使对照寡核苷酸条形码化包括：使用多个条形码(例如，随机条形码)使对照寡核苷酸条形码化，以创建多个随机地条形码化的对照寡核苷酸。在一些实施例中，使用多个条形码使多种对照寡核苷酸条形码化包括：使该多个条形码与该多个对照组合物的对照寡核苷酸接触以生成与这些对照寡核苷酸杂交的条形码；并且延伸与对照寡核苷酸杂交的条形码以生成多个条形码化的对照寡核苷酸。延伸这些条形码可以包括使用DNA聚合酶、逆转录酶、或其组合延伸这些条形码。在一些实施例中，该方法包括扩增多个条形码化的对照寡核苷酸以产生多个扩增子。扩增多个条形码化的对照寡核苷酸可以包括使用聚合酶链式反应(PCR)对条形码序列(例如，分子标记序列)的至少一部分和对照寡核苷酸的至少一部分进行扩增。在一些实施例中，获得测序数据包括获得多个扩增子的测序数据。获得测序数据可以包括对分子标记序列的至少一部分和对照寡核苷酸的至少一部分进行测序。
细胞过载和多重态鉴定
本文还披露了用于鉴定细胞过载和多重态的方法、试剂盒和系统。此类方法、试剂盒和系统可以与本文披露的任何合适的方法、试剂盒和系统组合，例如使用与寡核苷酸关联的细胞组分结合试剂测量细胞组分表达水平(例如蛋白质表达水平)的方法、试剂盒和系统。使用当前的细胞加载技术，当将约20000个细胞加载到具有约60000个微孔的微孔盒或阵列中时，具有两个或更多个细胞(称为双重态或多重态)的微孔或液滴的数量可以是最小的。然而，当加载的细胞数量增加时，具有多个细胞的微孔或液滴的数量可显著增加。例如，当将约50000个细胞加载到微孔盒或阵列的约60000个微孔中时，具有多个细胞的微孔的百分比可以非常高，如11％-14％。这种将大量细胞加载到微孔中可以称为细胞过载。然而，如果细胞被分成许多组(例如，5个)，可以用具有不同细胞鉴定序列的细胞鉴定寡核苷酸标记，则与两个或更多个细胞鉴定序列相关联的细胞标记可以在测序数据中鉴定并从随后处理中移除。相对于微孔盒或阵列中的微孔数量，可以将这种更高数量的细胞加载到微孔中。
本文披露了包括用于细胞或液滴鉴定的方法。用于细胞鉴定或双重态鉴定的方法可以与本文披露的其他方法一起使用。例如，双重态鉴定的方法可以与用于确定蛋白质表达的方法一起使用。作为另一个实例，工作流程可用于确定单个细胞的双重态、蛋白质表达、和/或基因表达。
在一些实施例中，用于细胞或双重态鉴定的方法包括：使第一多个细胞和第二多个细胞分别与两种细胞鉴定组合物接触，其中该第一多个细胞中的每一个和该第二多个细胞中的每一个包括一个或多个抗原靶或蛋白质靶，其中这两种细胞鉴定组合物中的每一种包括与细胞鉴定寡核苷酸相关联的蛋白质结合试剂，其中该蛋白质结合试剂能够特异性结合这一个或多个抗原靶或蛋白质靶中的至少一个，其中该细胞鉴定寡核苷酸包括细胞鉴定序列，并且其中这两种细胞鉴定组合物的细胞鉴定序列包括不同的序列；使用多个条形码使这些细胞鉴定寡核苷酸条形码化，以创建多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸，其中该多个条形码中的每一个包括细胞标记序列、条形码序列(例如，分子标记序列)、和靶结合区，其中该多个条形码中至少两个条形码的条形码序列包括不同的序列，并且其中该多个条形码中至少两个条形码包括相同的细胞标记序列；获得该多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸的测序数据；并且在获得的测序数据中鉴定各自与两个或更多个细胞鉴定序列相关联的一个或多个细胞标记序列；并且从获得测序数据中去除各自与两个或更多个细胞鉴定序列相关联的一个或多个细胞标记序列相关联的测序数据和/或从后续分析(例如，单个细胞mRNA谱、或整个转录组分析)中各自与两个或更多个细胞鉴定序列相关联的一个或多个细胞标记序列相关联的测序数据)。在一些实施例中，细胞鉴定寡核苷酸包括条形码序列(例如，分子标记序列)、通用引物的结合位点、或其组合。
例如，该方法可用于使用细胞鉴定加载50,000个或更多个细胞(与10,000-20,000个细胞相比)。细胞鉴定可以使用寡核苷酸缀合的蛋白质结合试剂(例如，抗体)或针对通用蛋白质标记的细胞组分结合试剂，用独特细胞组分结合试剂标记来自不同样品的细胞。当来自不同样品的两个或更多个细胞或来自样品的不同细胞群的两个或更多个细胞被捕获在相同的微孔或液滴中时，组合的“细胞”(或两个或更多个细胞的内容物)可以与具有不同细胞鉴定序列的细胞鉴定寡核苷酸相关联。不同的细胞群的数量在不同的实现方式中可以是不同的。在一些实施例中，不同群的数量可以是、或约2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100个、或在这些值的任何两个之间或数字或范围。在一些实施例中，不同群的数量可以是至少、或至多2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100。通过将样品的细胞等分成多个群，可以将样品的细胞分成多个群。基于与测序数据中的与一个细胞标记序列相关联的两个或更多个细胞鉴定序列，可以将与多于一个细胞鉴定序列相关联的细胞鉴定为“多重态”。组合的“细胞”的测序数据在本文中也称为多重态。多重态可以是双重态、三重态、四重态、五重态、六重态、七重态、八重态、九重态、或其任何组合。
双重态可以指与具有不同细胞鉴定序列的两个细胞鉴定寡核苷酸相关联的组合的“细胞”。双重态还可以指与具有两种细胞鉴定序列的细胞鉴定寡核苷酸相关联的组合的“细胞”。当与不同序列的两个细胞鉴定寡核苷酸相关联的两个细胞(或与具有两个不同细胞鉴定序列的细胞鉴定寡核苷酸相关联的两个或更多个细胞)被捕获在相同的微孔或液滴中时，可发生双重态，组合的“细胞”可以是与具有不同细胞鉴定序列的两个细胞鉴定寡核苷酸相关联。三重态可以指与具有不同细胞鉴定序列的三个细胞鉴定寡核苷酸相关联的组合的“细胞”、或与具有三个不同细胞鉴定序列的细胞鉴定寡核苷酸相关联的组合的“细胞”。四重态可以指与具有不同细胞鉴定序列的四个细胞鉴定寡核苷酸相关联的组合的“细胞”、或与具有四个不同细胞鉴定序列的细胞鉴定寡核苷酸相关联的组合的“细胞”。五重态可以指与具有不同细胞鉴定序列的五个细胞鉴定寡核苷酸相关联的组合的“细胞”、或与具有五个不同细胞鉴定序列的细胞鉴定寡核苷酸相关联的组合的“细胞”。六重态可以指与具有不同细胞鉴定序列的六个细胞鉴定寡核苷酸相关联的组合的“细胞”、或与具有六个不同细胞鉴定序列的细胞鉴定寡核苷酸相关联的组合的“细胞”。七重态可以指与具有不同细胞鉴定序列的七个细胞鉴定寡核苷酸相关联的组合的“细胞”、或与具有七个不同细胞鉴定序列的细胞鉴定寡核苷酸相关联的组合的“细胞”。八重态可以指与具有不同细胞鉴定序列的八个细胞鉴定寡核苷酸相关联的组合的“细胞”、或与具有八个不同细胞鉴定序列的细胞鉴定寡核苷酸相关联的组合的“细胞”。九重态可以指与具有不同细胞鉴定序列的九个细胞鉴定寡核苷酸相关联的组合的“细胞”、或与具有九个不同细胞鉴定序列的细胞鉴定寡核苷酸相关联的组合的“细胞”。
作为另一个实例，该方法可用于多重态鉴定，无论是在样品过载的情况下还是在将细胞加载到微孔阵列的微孔上或产生含有细胞的液滴的情况下。当将两个或更多个细胞加载到一个微孔中时，来自组合的“细胞”(或两个或更多个细胞的内容物)的结果数据是具有异常基因表达谱的多重态细胞。通过使用细胞鉴定，可以通过寻找各自与具有不同细胞鉴定序列的两个或更多个细胞鉴定寡核苷酸(或具有两种或更多种细胞鉴定序列的细胞鉴定寡核苷酸)相关联或分配其的细胞条形码来鉴定这些多重态中的一些。用细胞鉴定序列，本文披露的方法可用于多重态鉴定(无论是在样品过载或不过载的情况下，还是在将细胞加载到微孔阵列的微孔上或产生含有细胞的液滴的情况下)。在一些实施例中，该方法包括：使第一多个细胞和第二多个细胞分别与两种细胞鉴定组合物接触，其中该第一多个细胞中的每一个和该第二多个细胞中的每一个包括一个或多个蛋白质靶，其中这两种细胞鉴定组合物中的每一种包括与细胞鉴定寡核苷酸相关联的蛋白质结合试剂，其中该蛋白质结合试剂能够特异性结合该一个或多个蛋白质靶中的至少一个，其中该细胞鉴定寡核苷酸包括细胞鉴定序列，并且其中这两种细胞鉴定组合物的细胞鉴定序列包括不同的序列；使用多个条形码使这些细胞鉴定寡核苷酸条形码化，以创建多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸，其中该多个条形码中的每一个包括细胞标记序列、条形码序列(例如，分子标记序列)、和靶结合区，其中该多个条形码中至少两个条形码的条形码序列包括不同的序列，并且其中该多个条形码中至少两个条形码包括相同的细胞标记序列；获得该多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸的测序数据；并且在获得的测序数据中鉴定各自与两个或更多个细胞鉴定序列相关联的一个或多个多重态细胞标记序列。
可以加载到微孔盒的微孔上或使用微流体装置产生的液滴中的细胞的数量可以受多重态率(multiplet rate)限制。加载更多细胞可以导致更多的多重态，这可能难以鉴定并在单个细胞数据中产生噪声。通过细胞鉴定，该方法可用于更准确地标记或鉴定多重态并从测序数据或后续分析中去除多重态。能够以更高的置信度鉴定多重态可以增加用户对多重态率的容忍度并且将更多细胞加载到每个微孔盒上或者产生具有每个至少一个细胞的液滴。
在一些实施例中，使第一多个细胞和第二多个细胞分别与两种细胞鉴定组合物接触包括：使该第一多个细胞与这两种细胞鉴定组合物中的第一细胞鉴定组合物接触；并且使第一多个细胞与两种细胞鉴定组合物的第二细胞鉴定组合物接触。在不同的实现方式中，多个细胞的数量和多个细胞鉴定组合物的数量可以是不同的。在一些实施例中，多个细胞和/或细胞鉴定组合物的数量可以是、或约2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、10000、100000、1000000、或在这些值的任何两个之间的数字或范围。在一些实施例中，多个细胞和/或细胞鉴定组合物的数量可以是至少、或至多2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、10000、100000、或1000000。
在一些实施例中，该方法包括：去除两种细胞鉴定组合物中未结合的细胞鉴定组合物。去除未结合的细胞鉴定组合物可以包括用洗涤缓冲液洗涤第一多个细胞和第二多个细胞的细胞。去除未结合的细胞鉴定组合物可以包括使用流式细胞术选择与这两种细胞鉴定组合物的至少一个蛋白质结合试剂结合的细胞。在一些实施例中，该方法包括：从多个样品中的每个中裂解一个或多个细胞。
在一些实施例中，细胞鉴定寡核苷酸被配置为与蛋白质结合试剂可分离或不可分离。该方法可以包括将细胞鉴定寡核苷酸与蛋白质结合试剂分离。分离细胞鉴定寡核苷酸可以包括通过UV光解、化学处理(例如，使用还原剂，比如二硫苏糖醇)、加热、酶处理、或其任何组合将细胞鉴定寡核苷酸与蛋白质结合试剂分离。
在一些实施例中，使用多个条形码使细胞鉴定寡核苷酸条形码化，包括：使该多个条形码与这些细胞鉴定寡核苷酸接触以生成与这些细胞鉴定寡核苷酸杂交的条形码；并且延伸与细胞鉴定寡核苷酸杂交的条形码以生成多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸。延伸这些条形码可以包括使用DNA聚合酶延伸这些条形码以生成多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸。延伸这些条形码可以包括使用逆转录酶延伸这些条形码以生成多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸。
在一些实施例中，该方法包括：扩增多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸以产生多个扩增子。扩增多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸可以包括使用聚合酶链式反应(PCR)对条形码序列的至少一部分和细胞鉴定寡核苷酸的至少一部分进行扩增。在一些实施例中，获得多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸的测序数据可以包括获得该多个扩增子的测序数据。获得测序数据包括对条形码序列的至少一部分和细胞鉴定寡核苷酸的至少一部分进行测序。在一些实施例中，鉴定至少一个细胞的样品来源包括基于至少一个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸的细胞鉴定序列鉴定多个条形码化的靶的样品来源。
在一些实施例中，使用多个条形码使细胞鉴定寡核苷酸条形码化以创建多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸包括使用多个条形码(例如，多个随机条形码)来条形码化(例如，随机地条形码化)细胞鉴定寡核苷酸以创建多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸(例如，多个随机地条形码化的细胞鉴定寡核苷酸)。
在一些实施例中，该方法包括：使用该多个条形码使该细胞的多个靶条形码化，以创建多个条形码化的靶，其中该多个条形码中的每一个包括细胞标记序列，并且其中该多个条形码中至少两个条形码包括相同的细胞标记序列；并且获得条形码化的靶的测序数据。使用多个条形码使多个靶条形码化以创建多个条形码化的靶可以包括：使这些靶的拷贝与这些条形码的靶结合区接触；并且使用多个条形码逆转录该多个靶以创建多个经逆转录的靶。
在一些实施例中，该方法包括：在获得该多个条形码化的靶的测序数据之前，扩增这些条形码化的靶以创建多个经扩增的条形码化的靶。扩增条形码化的靶以生成多个经扩增的条形码化的靶可以包括：通过聚合酶链式反应(PCR)扩增这些条形码化的靶。使用多个条形码使细胞的多个靶条形码化以创建多个条形码化的靶可以包括使用多个条形码(例如，随机条形码)使多个靶条形码化(例如，随机条形码化)以创建多个条形码化的靶(例如，随机条形码化的靶)。
确定细胞组分-细胞组分相互作用
本文披露的是用于确定蛋白质相互作用的方法。用于确定蛋白质-蛋白质相互作用的方法可以与本文披露的其他方法一起使用。例如，用于确定蛋白质-蛋白质相互作用的方法可以与用于确定蛋白质表达的方法一起使用。作为另一个实例，工作流程可用于确定单个细胞的蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质表达、和/或基因表达。此类方法可以与本文披露的任何合适的方法、试剂盒和系统组合，例如使用与寡核苷酸关联的细胞组分结合试剂测量细胞组分表达水平(例如蛋白质表达水平)的方法、试剂盒和系统。
在一些实施例中，用于确定蛋白质-蛋白质相互作用的方法包括：使细胞与第一对相互作用确定组合物接触，其中该细胞包括第一细胞组分靶和第二细胞组分靶，其中该第一对相互作用确定组合物中的每一个包括与相互作用确定寡核苷酸相关联的细胞组分结合试剂，其中该第一对相互作用确定组合物中之一的细胞组分结合试剂能够特异性结合第一细胞组分靶，并且该第一对相互作用确定组合物中另一个的细胞组分结合试剂能够特异性结合第二细胞组分靶，并且其中该相互作用确定寡核苷酸包括相互作用确定序列和桥寡核苷酸杂交区，并且其中该第一对相互作用确定组合物的相互作用确定序列包括不同的序列；使用桥寡核苷酸连接该第一对相互作用确定组合物的相互作用确定寡核苷酸以生成经连接的相互作用确定寡核苷酸，其中该桥寡核苷酸包括能够特异性结合该第一对相互作用确定组合物的桥寡核苷酸杂交区的两个杂交区；使用多个条形码使经连接的相互作用确定寡核苷酸条形码化以创建多个条形码化的相互作用确定寡核苷酸，其中该多个条形码中的每一个包括条形码序列和捕获序列；获得多个条形码化的相互作用确定寡核苷酸的测序数据；并且基于在获得的测序数据中该第一对相互作用确定组合物的相互作用确定序列的关联，确定第一和第二细胞组分靶之间的相互作用。在一些实施例中，两个细胞组分结合试剂中至少一个包括蛋白质结合试剂，其中该蛋白质结合试剂与两个相互作用确定寡核苷酸中之一相关联，并且其中该一个或多个细胞组分靶包括至少一个蛋白质靶。
在一些实施例中，该方法包括：使细胞与第一对相互作用确定组合物接触，其中该细胞包括第一蛋白质靶和第二蛋白质靶，其中该第一对相互作用确定组合物中的每一个包括与相互作用确定寡核苷酸相关联的蛋白质结合试剂，其中该第一对相互作用确定组合物中之一的蛋白质结合试剂能够特异性结合第一蛋白质靶，并且该第一对相互作用确定组合物中另一个的蛋白质结合试剂能够特异性结合第二蛋白质靶，并且其中该相互作用确定寡核苷酸包括相互作用确定序列和桥寡核苷酸杂交区，并且其中该第一对相互作用确定组合物的相互作用确定序列包括不同的序列；使用桥寡核苷酸连接该第一对相互作用确定组合物的相互作用确定寡核苷酸以生成经连接的相互作用确定寡核苷酸，其中该桥寡核苷酸包括能够特异性结合该第一对相互作用确定组合物的桥寡核苷酸杂交区的两个杂交区；使用多个条形码使经连接的相互作用确定寡核苷酸条形码化以创建多个条形码化的相互作用确定寡核苷酸，其中该多个条形码中的每一个包括条形码序列和捕获序列；获得多个条形码化的相互作用确定寡核苷酸的测序数据；并且基于在获得的测序数据中该第一对相互作用确定组合物的相互作用确定序列的关联，确定第一和第二蛋白质靶之间的相互作用。
在一些实施例中，使细胞与第一对相互作用确定组合物接触包括：使细胞与第一对相互作用确定组合物中的每一个依次或同时接触。第一细胞组分靶可以与第二细胞组分靶相同。第一细胞组分靶可以与第二细胞组分靶不同。
在一些实施例中，相互作用确定序列长度为至少6个核苷酸、25-60个核苷酸、约45个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸、约128个核苷酸、至少128个核苷酸、约200个核苷酸、至少200个核苷酸、少于约200-300个核苷酸、约200-500个核苷酸、约500个核苷酸、或其任何组合。
在一些实施例中，该方法包括使细胞与第二对相互作用确定组合物接触，其中该细胞包括第三细胞组分靶和第四细胞组分靶，其中该第二对相互作用确定组合物中的每个包括与相互作用确定寡核苷酸相关联的细胞组分结合试剂，其中该第二对相互作用确定组合物中之一的细胞组分结合试剂能够特异性结合第三细胞组分靶，并且该第二对相互作用确定组合物中另一个的细胞组分结合试剂能够特异性结合第四细胞组分靶。第三和第四细胞组分靶中的至少一个可以与第一和第二细胞组分靶可以不同。第三和第四细胞组分靶中的至少一个以及第一和第二细胞组分靶中的至少一个可以相同。
在一些实施例中，该方法包括使细胞与三对或更多对相互作用确定组合物接触。多对相互作用确定组合物的至少10、100、1000个、或其任何组合的相互作用确定组合物的相互作用确定序列可以包括不同的序列。
在一些实施例中，第一对相互作用确定组合物的桥寡核苷酸杂交区包括不同的序列。桥寡核苷酸杂交区中的至少一个可以与桥寡核苷酸中的两个杂交区中的至少一个互补。
在一些实施例中，使用桥寡核苷酸连接第一对相互作用确定组合物的相互作用确定寡核苷酸包括：将桥寡核苷酸的第一杂交区与相互作用确定寡核苷酸的桥寡核苷酸杂交区中的第一桥寡核苷酸杂交区杂交；将桥寡核苷酸的第二杂交区与相互作用确定寡核苷酸的桥寡核苷酸杂交区中的第二桥寡核苷酸杂交区杂交；并且连接与桥寡核苷酸杂交的相互作用确定寡核苷酸以生成经连接的相互作用确定寡核苷酸。
在一些实施例中，细胞组分结合试剂包括抗体、四聚体、适配体、蛋白质骨架、整合素、或其任何组合。
在一些实施例中，相互作用确定寡核苷酸通过接头与细胞组分结合试剂缀合。该寡核苷酸可以包括接头。该接头可以包括化学基团。该化学基团可以可逆或不可逆地附接至细胞组分结合试剂。该化学基团可以包括UV可光解基团、二硫键、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、二硫键联、或其任何组合。一个或多个细胞组分靶中的至少一个可以在细胞表面上。
在一些实施例中，该方法包括：在使细胞与第一对相互作用确定组合物接触之前固定细胞。该方法可以包括：去除第一对相互作用确定组合物中未结合的相互作用确定组合物。去除未结合的相互作用确定组合物可以包括用洗涤缓冲液洗涤细胞。去除未结合的相互作用确定组合物可以包括使用流式细胞术选择细胞。该方法可以包括裂解细胞。
在一些实施例中，相互作用确定寡核苷酸被配置为与细胞组分结合试剂可分离或不可分离。该方法可以包括将相互作用确定寡核苷酸与细胞组分结合试剂分离。分离相互作用确定寡核苷酸可以包括通过UV光解、化学处理、加热、酶处理、或其任何组合将相互作用确定寡核苷酸与细胞组分结合试剂分离。
在一些实施例中，相互作用确定寡核苷酸与细胞的基因组序列不同源。相互作用确定寡核苷酸可以与物种的基因组序列同源。该物种可以是非哺乳动物物种。非哺乳动物物种可以是噬菌体物种。噬菌体物种可以是T7噬菌体、PhiX噬菌体、或其组合。
在一些实施例中，细胞包括肿瘤细胞或非肿瘤细胞。该细胞可以包括哺乳动物细胞、细菌细胞、病毒细胞、酵母细胞、真菌细胞、或其任何组合。
在一些实施例中，该方法包括：使两个或更多个细胞与第一对相互作用确定组合物接触，并且其中该两个或更多个细胞中的每一个包含第一和第二细胞组分靶。该两个或更多个细胞中的至少一个细胞可以包括单个细胞。
在一些实施例中，条形码包括细胞标记序列、通用引物的结合位点、或其任何组合。多个条形码中至少两个条形码可以包括相同的细胞标记序列。第一对相互作用确定组合物中之一的相互作用确定寡核苷酸可以包括与捕获序列互补的序列。捕获序列可以包括聚(dT)区。与捕获序列互补的相互作用确定寡核苷酸的序列可以包括聚(dA)区。相互作用确定寡核苷酸可以包括第二条形码序列。第一对相互作用确定组合物中另一个的相互作用确定寡核苷酸可以包括通用引物的结合位点。
在一些实施例中，细胞组分靶包括细胞外蛋白质、细胞内蛋白质、或其任何组合。细胞组分靶可以包括细胞表面蛋白质、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、整合素、或其任何组合。
在一些实施例中，细胞组分靶包括脂质、碳水化合物、或其任何组合。细胞组分靶可以选自包括10-100个不同蛋白质靶的组。
在一些实施例中，细胞组分结合试剂与具有相同序列的两个或更多个相互作用确定寡核苷酸相关联。细胞组分结合试剂可以与具有不同相互作用确定序列的两个或更多个相互作用确定寡核苷酸相关联。
在一些实施例中，多个相互作用确定组合物中的一个包括不与相互作用确定寡核苷酸相关联的第二细胞组分结合试剂。细胞组分结合试剂和第二细胞组分结合试剂可以是相同的。细胞组分结合试剂可以与可检测的部分相关联。
在一些实施例中，多个条形码与颗粒相关联。多个条形码中的至少一个条形码可以被固定在颗粒上。多个条形码中的至少一个条形码可以被部分固定在颗粒上。多个条形码中的至少一个条形码可以被包封在颗粒中。多个条形码中的至少一个条形码可以被部分包封在颗粒中。颗粒可以是可破坏的。颗粒可以包括珠。颗粒可以包括琼脂糖凝胶珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠、或其任何组合。颗粒可以包括选自下组的材料，该组由以下组成：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮、及其任何组合。颗粒可以包括可破坏的水凝胶颗粒。颗粒可以与可检测部分相关联。相互作用确定寡核苷酸可以与可检测部分相关联。颗粒的条形码包括条形码序列，所述条形码序列可以选自、约是、至少是、至多是1000、10000、或更多个、或更少个、或其任何组合的不同的条形码序列。条形码的条形码序列可以包括随机序列。颗粒可以包括至少10000个条形码。
在一些实施例中，使用多个条形码使相互作用确定寡核苷酸条形码化包括：使多个条形码与相互作用确定寡核苷酸接触以生成与相互作用确定寡核苷酸杂交的条形码；并且延伸与相互作用确定寡核苷酸杂交的条形码以生成多个条形码化的相互作用确定寡核苷酸。延伸这些条形码可以包括使用DNA聚合酶延伸这些条形码以生成多个条形码化的相互作用确定寡核苷酸。延伸这些条形码可以包括使用逆转录酶延伸这些条形码以生成多个条形码化的相互作用确定寡核苷酸。延伸这些条形码可以包括使用莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶或Taq DNA聚合酶延伸这些条形码以生成多个条形码化的相互作用确定寡核苷酸。延伸这些条形码可以包括从经连接的相互作用确定寡核苷酸置换桥寡核苷酸。该方法可以包括：扩增多个条形码化的相互作用确定寡核苷酸以产生多个扩增子。扩增多个条形码化的相互作用确定寡核苷酸可以包括使用聚合酶链式反应(PCR)对条形码序列的至少一部分和相互作用确定寡核苷酸的至少一部分进行扩增。
在一些实施例中，获得多个条形码化的相互作用确定寡核苷酸的测序数据可以包括获得该多个扩增子的测序数据。获得测序数据可以包括对条形码序列的至少一部分和相互作用确定寡核苷酸的至少一部分进行测序。获得多个条形码化的相互作用确定寡核苷酸的测序数据可以包括获得多个条形码化的相互作用确定寡核苷酸的部分和/或完整的序列。
在一些实施例中，多个条形码包括多个随机条形码，该多个随机条形码中每一个的条形码序列包括条形码序列(例如，分子标记序列)，该多个随机条形码中至少两个随机条形码的条形码序列包括不同的序列，并且使用多个条形码使相互作用确定寡核苷酸条形码化以创建多个条形码化的相互作用确定寡核苷酸包括使用多个随机条形码使相互作用确定寡核苷酸随机地条形码化以创建多个随机地条形码化的相互作用确定寡核苷酸。
在一些实施例中，使用多个条形码使细胞的多个靶条形码化以创建多个条形码化的靶；并且获得条形码化的靶的测序数据。使用多个条形码使多个靶条形码化以创建多个条形码化的靶可以包括：使这些靶的拷贝与这些条形码的靶结合区接触；并且使用多个条形码逆转录该多个靶以创建多个经逆转录的靶。
在一些实施例中，该方法可包括：在获得该多个条形码化的靶的测序数据之前，扩增这些条形码化的靶以创建多个经扩增的条形码化的靶。扩增条形码化的靶以生成多个经扩增的条形码化的靶可以包括：通过聚合酶链式反应(PCR)扩增这些条形码化的靶。使用多个条形码使细胞的多个靶条形码化以创建多个条形码化的靶可以包括使用多个随机条形码使细胞的多个靶随机条形码化以创建多个随机条形码化的靶。
本文披露的实施例包括用于鉴定细胞组分-细胞组分相互作用(例如，蛋白质-蛋白质相互作用)的试剂盒。在一些实施例中，该试剂盒包括：第一对相互作用确定组合物，其中该第一对相互作用确定组合物中的每一个包括与相互作用确定寡核苷酸相关联的细胞组分结合试剂，其中该第一对相互作用确定组合物中之一的细胞组分结合试剂能够特异性结合第一细胞组分靶，并且该第一对相互作用确定组合物中另一个的细胞组分结合试剂能够特异性结合第二细胞组分靶，其中该相互作用确定寡核苷酸包含相互作用确定序列和桥寡核苷酸杂交区，并且其中该第一对相互作用确定组合物的相互作用确定序列包含不同的序列；并且多个桥寡核苷酸各自包括能够特异性结合第一对相互作用确定组合物的桥寡核苷酸杂交区的两个杂交区。
在一些实施例中，该试剂盒包括：第二对相互作用确定组合物，其中该第二对相互作用确定组合物中的每个包括与相互作用确定寡核苷酸相关联的细胞组分结合试剂，其中该第二对相互作用确定组合物中之一的细胞组分结合试剂能够特异性结合第三细胞组分靶，并且该第二对相互作用确定组合物中另一个的细胞组分结合试剂能够特异性结合第四细胞组分靶。在一些实施例中，该试剂盒包括：三对或更多对的相互作用确定组合物。
在一些实施例中，该试剂盒包括：多个条形码，其中该多个条形码中的每一个包括条形码序列和捕获序列。多个条形码可以包括多个随机条形码，其中该多个随机条形码中每一个的条形码序列包括条形码序列(例如，分子标记序列)，其中该多个随机条形码中至少两个随机条形码的条形码序列包括不同的序列。在一些实施例中，多个条形码与颗粒相关联。多个条形码的至少一个条形码可固定在颗粒上、部分固定在颗粒上、包封在颗粒中、部分包封在颗粒中、或其任何组合。颗粒可以是可破坏的。颗粒可以包括珠。
在一些实施例中，该试剂盒包括：DNA聚合酶。该试剂盒可以包括逆转录酶。该试剂盒可以包括：莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶或Taq DNA聚合酶。在一些实施例中，该方法包括固定剂(例如，福尔马林、多聚甲醛、戊二醛/四氧化锇、酒精固定剂、Hepes-谷氨酸缓冲液介导的有机溶剂保护效应(HOPE)、Bouin溶液、或其任何组合)。
用于在制备经标记的生物分子试剂中使用的系统
在许多分析物测定中使用的经标记的生物分子试剂组合物包括与可检测标记化合物缀合的生物分子。通过到生物分子的骨架或侧链上的一个或多个共价键，生物分子与可检测标记物缀合，或者可以通过离子或其他非共价相互作用联接在一起。通常，生物分子是针对目的分析物具有特异性结合区域的探针化合物，并且可检测标记物是能例如在显微镜下用肉眼或通过某种形式的光谱(例如，UV-vis，荧光光谱等)可视化的化合物。在一些实施例中，生物分子包括多肽、核酸、多糖、或其任何组合。核酸可以是寡核苷酸、DNA或RNA。多肽可以是蛋白质、酶或蛋白质结合试剂。蛋白质结合试剂可以包括抗体、适配体、或其任何组合。与标记缀合的蛋白质结合试剂能够特异性结合多个蛋白质靶中的至少一个。
在一些实施例中，该多个蛋白质靶包括细胞表面蛋白质、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、抗体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、或其任何组合。多个蛋白质靶可以包括例如10-400种不同的蛋白质靶。生物分子可以选自至少100、1,000或10,000个不同的生物分子。
在一些实施例中，寡核苷酸包括针对生物分子的独特标识。独特标识可以包括长度为25-45个核苷酸的核苷酸序列。独特标识可以选自独特标识的多元组。独特标识的多元组可以包括至少100、1,000或10,000种不同的独特标识。寡核苷酸可以具有选自至少10、100或1,000种不同条形码序列(例如，分子标记序列)的序列。在一些实施例中，该寡核苷酸通过接头与生物分子缀合。该寡核苷酸可以包括接头。该接头可以包括化学基团。该化学基团可以可逆地附接至生物分子。该化学基团可以选自下组，该组由以下组成：UV可光解基团、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、及其任何组合。
独特标识可以与样品的基因组序列不同源。该样品可以是单个细胞、多个细胞、组织、肿瘤样品、或其任何组合。该样品可以是哺乳动物样品、细菌样品、病毒样品、酵母样品、真菌样品、或其任何组合。寡核苷酸可以包括条形码序列(例如，分子标记序列)、聚(A)尾、或其组合。
用于测定生物流体中分析物的存在和浓度的测定通常依赖于探针化合物的特异性结合。取决于目的分析物，探针化合物可以是多肽，例如各自均具有特异性结合区域的抗体或寡核苷酸。为了检测靶分析物的结合，可将能可视化的标记物(例如可通过光谱法检测)与探针化合物缀合。目前，为了制备经标记的生物分子试剂，通过单独的合成方案将每种生物分子(例如CD4-RPA-T4)分别与可检测标记(PE-Cy5)缀合，然后纯化(例如柱色谱)。由于每种经标记的生物分子试剂是分开制备和纯化的，因此提供适用于测定的特异性结合探针组合物的过程是昂贵且劳动密集的，特别是对于小规模的客户要求。此外，由于合成经标记的生物分子和随后的纯化需要一定量的交付周期，不可能按需制备性能特异性和高质量的探针组合物。商业上，常用的经标记的生物分子试剂是预先制备和存储的，并且客户只能从预先合成的经标记的生物分子试剂组合物的有限数据库中进行选择。
图12说明了根据一个实施例制备用于提供用于实验室和临床测定用的经标记的生物分子试剂组合物的经标记的生物分子试剂的步骤。首先对目的生物分子(抗体探针)进行纯化(步骤1201)，并使其经历足以使生物分子与产生经标记的生物分子1200a、1200b、1200c、1200d和1200e的五种不同的可检测标记物缀合的反应条件(步骤1202)。然后对经标记的生物分子1200a、1200b、1200c、1200d和1200e各自进行纯化(步骤1203)并存储。根据客户的要求，将经标记的生物分子1200a、1200b、1200c、1200d和1200e配制成经标记的生物分子试剂组合物并包装以交付给客户。
在一些实施例中，生物分子包括多肽、核酸、多糖、或其任何组合。核酸可以是寡核苷酸、DNA或RNA。多肽可以是蛋白质、酶或蛋白质结合试剂。蛋白质结合试剂可以包括抗体、适配体、或其任何组合。与标记缀合的蛋白质结合试剂能够特异性结合多个蛋白质靶中的至少一个。
在一些实施例中，该多个蛋白质靶包括细胞表面蛋白质、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、抗体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、或其任何组合。多个蛋白质靶可以包括例如10-400种不同的蛋白质靶。生物分子可以选自至少100、1,000或10,000个不同的生物分子。
在一些实施例中，寡核苷酸包括针对生物分子的独特标识。独特标识可以包括长度为25-45个核苷酸的核苷酸序列。独特标识可以选自独特标识的多元组。独特标识的多元组可以包括至少100、1,000或10,000种不同的独特标识。寡核苷酸可以具有选自至少10、100或1,000种不同条形码序列(例如，分子标记序列)的序列。在一些实施例中，该寡核苷酸通过接头与生物分子缀合。该寡核苷酸可以包括接头。该接头可以包括化学基团。该化学基团可以可逆地附接至生物分子。该化学基团可以选自下组，该组由以下组成：UV可光解基团、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、及其任何组合。
独特标识可以与样品的基因组序列不同源。该样品可以是单个细胞、多个细胞、组织、肿瘤样品、或其任何组合。该样品可以是哺乳动物样品、细菌样品、病毒样品、酵母样品、真菌样品、或其任何组合。寡核苷酸可以包括条形码序列(例如，分子标记序列)、聚(A)尾、或其组合。
本文披露的是用于以快速、有效和高度可扩展的方式跨宽范围的生物分子和可检测标记组合而递送高质量和性能特异性产物的系统和方法。在本发明的实施例中，对经标记的生物分子作出要求，并且响应于该要求，从经激活的生物分子和经激活的标记的预先存在的集合制备经标记的生物分子。图13提供了根据本发明实施例的方法的示意图。在图13中，首先对生物分子的集合(1301a)和可检测标记或标记物的集合(1301b)进行纯化(步骤1301)。然后将每种生物分子缀合至反应性接头以用反应性部分官能化生物分子(即，用反应性接头L1激活生物分子，1302a)。然后对经激活的生物分子的集合进行纯化并存储。单独地，可检测标记物的集合还与反应性接头缀合以用反应性部分官能化可检测标记物的集合(即，用反应性接头L2激活标记，1302b)。也对经激活的标记的集合进行纯化并存储(步骤1302)。根据客户对经标记的生物分子试剂的要求，通过使经激活的生物分子(L1)与经激活的标记(L2)反应使生物分子与标记缀合(步骤1303)，以形成经标记的生物分子(通过连键L1-L2键合)。通过这种方式，可以通过简单地将经激活的生物分子与经激活的标记混合来按需制备生物分子和可检测标记物的任何所需组合。
图14说明了本披露的这种独特的用于按需提供可定制的经标记的生物分子试剂的新方法。可以对目的生物分子进行纯化(步骤1401)，并且然后用反应性接头官能化(步骤1402)以产生经激活的生物分子1400a。经激活的标记1400b、1400c、1400d、和1400e是通过用反应性接头官能化可检测标记来单独地制备。在接收到来自客户的要求时，经激活的生物分子1400a和经激活的标记1400b、1400c、1400d、和1400e的任何组合可以通过使经激活的生物分子500a的反应性接头与经激活的标记1400b、1400c、1400d、和1400e的反应性接头发生反应来按需制备。一旦缀合，将经标记的生物分子1400a-1400b、1400a-1400c、1400a-1400d和1400a-1400e配制成经标记的生物分子试剂组合物并包装以交付给客户。在一些实施例中，生物分子包括多肽、核酸、多糖、或其任何组合。核酸可以是寡核苷酸、DNA或RNA。多肽可以是蛋白质、酶或蛋白质结合试剂。蛋白质结合试剂可以包括抗体、适配体、或其任何组合。与标记缀合的蛋白质结合试剂能够特异性结合多个蛋白质靶中的至少一个。
在一些实施例中，该多个蛋白质靶包括细胞表面蛋白质、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、抗体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、或其任何组合。多个蛋白质靶可以包括例如10-400种不同的蛋白质靶。生物分子可以选自至少100、1,000或10,000个不同的生物分子。
在一些实施例中，寡核苷酸包括针对生物分子的独特标识。独特标识可以包括长度为25-45个核苷酸的核苷酸序列。独特标识可以选自独特标识的多元组。独特标识的多元组可以包括至少100、1,000或10,000种不同的独特标识。寡核苷酸可以具有选自至少10、100或1,000种不同条形码序列(例如，分子标记序列)的序列。在一些实施例中，该寡核苷酸通过接头与生物分子缀合。该寡核苷酸可以包括接头。该接头可以包括化学基团。该化学基团可以可逆地附接至生物分子。该化学基团可以选自下组，该组由以下组成：UV可光解基团、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、及其任何组合。
独特标识可以与样品的基因组序列不同源。该样品可以是单个细胞、多个细胞、组织、肿瘤样品、或其任何组合。该样品可以是哺乳动物样品、细菌样品、病毒样品、酵母样品、真菌样品、或其任何组合。寡核苷酸可以包括条形码序列(例如，分子标记序列)、聚(A)尾、或其组合。
本披露提供了用于在制备经标记的生物分子试剂中使用的系统。在进一步描述本披露的实施例中，首先更详细地描述了具有用于接收经标记的生物分子试剂要求的输入管理器和用于提供生物分子和标记存储标识的输出管理器的系统。接下来，描述了用于从经激活的生物分子和经激活的标记制备经标记的生物分子试剂的试剂制备装置。还提供了用于传送和接收经标记的生物分子试剂要求并制备主题经标记的生物分子试剂的方法。
在一些实施例中，生物分子包括多肽、核酸、多糖、或其任何组合。核酸可以是寡核苷酸、DNA或RNA。多肽可以是蛋白质、酶或蛋白质结合试剂。蛋白质结合试剂可以包括抗体、适配体、或其任何组合。与标记缀合的蛋白质结合试剂能够特异性结合多个蛋白质靶中的至少一个。
在一些实施例中，该多个蛋白质靶包括细胞表面蛋白质、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、抗体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、或其任何组合。多个蛋白质靶可以包括例如10-400种不同的蛋白质靶。生物分子可以选自至少100、1,000或10,000个不同的生物分子。
在一些实施例中，寡核苷酸包括针对生物分子的独特标识。独特标识可以包括长度为25-45个核苷酸的核苷酸序列。独特标识可以选自独特标识的多元组。独特标识的多元组可以包括至少100、1,000或10,000种不同的独特标识。寡核苷酸可以具有选自至少10、100或1,000种不同条形码序列(例如，分子标记序列)的序列。在一些实施例中，该寡核苷酸通过接头与生物分子缀合。该寡核苷酸可以包括接头。该接头可以包括化学基团。该化学基团可以可逆地附接至生物分子。该化学基团可以选自下组，该组由以下组成：UV可光解基团、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、及其任何组合。
独特标识可以与样品的基因组序列不同源。该样品可以是单个细胞、多个细胞、组织、肿瘤样品、或其任何组合。该样品可以是哺乳动物样品、细菌样品、病毒样品、酵母样品、真菌样品、或其任何组合。寡核苷酸可以包括条形码序列(例如，分子标记序列)、聚(A)尾、或其组合。
本披露的多方面包括用于在制备经标记的生物分子试剂中使用的系统。根据一些实施例的系统包括：输入管理器，其用于接收对经标记的生物分子试剂的要求；存储器，其用于存储具有多种存储标识的数据集，该多种存储标识与经标记的生物分子试剂要求的一种或多种组分(例如，生物分子、标记等)相对应；处理模块，其通信地联接到存储器并被配置为鉴定来自数据集的与经标记的生物分子试剂要求的组分相对应的存储标识；以及输出管理器，其用于提供所鉴定的存储标识。如下文更详细描述的，术语“经标记的生物分子”试剂是指与可检测标记物联接(例如通过共价键)的生物大分子。生物大分子可以是生物聚合物。“生物聚合物”是具有一种或多种类型的重复单元的聚合物。生物聚合物通常发现于生物系统中，并且具体包括多糖(例如碳水化合物)和肽(该术语用于包括多肽和蛋白质，无论是否附接至多糖)和多核苷酸、以及它们的类似物，例如由氨基酸类似物或非氨基酸基团或核苷酸类似物或非核苷酸基团构成的那些化合物或者含有氨基酸类似物或非氨基酸基团或核苷酸类似物或非核苷酸基团的那些化合物。它包括其中常规骨架已被替换为一种非天然存在的或合成的骨架的多核苷酸和其中常规碱基的一个或多个已经被替换为能够参与沃森-克里克(Watson-Crick)型氢键相互作用的一个基团(天然的或合成)的核酸(或合成的或天然存在的类似物)。多核苷酸包括单链或多链构型，其中链中的一个或多个可以或可以不与另一个完全对齐。特别地，“生物聚合物”包括DNA(包括cDNA)、RNA和寡核苷酸，无论来源如何。这样，生物分子可以包括多糖、核酸和多肽。例如，核酸可以是寡核苷酸、截短的或全长的DNA或RNA。在实施例中，寡核苷酸、截短的和全长的DNA或RNA是由10个核苷酸单体或更多，例如15个或更多，例如25个或更多，例如50个或更多，例如100个或更多，例如250个或更多(且包括500个或更多)核苷酸单体构成。例如，目的寡核苷酸、截短的和全长的DNA或RNA的长度范围可以是从10个核苷酸到108个核苷酸，例如从102个核苷酸至107个核苷酸，包括从103个核苷酸至106个核苷酸。在实施例中，生物聚合物不是单核苷酸或短链寡核苷酸(例如少于10个核苷酸)。“全长”是指DNA或RNA是如下的核酸聚合物，其具有其完整序列(例如自然界中发现的)的70％或更多，例如DNA或RNA的全长序列(例如自然界中发现的)的75％或更多，例如80％或更多，例如85％或更多，例如90％或更多，例如95％或更多，例如97％或更多，例如99％或更多并包括100％。
在一些实施例中，生物分子包括多肽、核酸、多糖、或其任何组合。核酸可以是寡核苷酸、DNA或RNA。多肽可以是蛋白质、酶或蛋白质结合试剂。蛋白质结合试剂可以包括抗体、适配体、或其任何组合。与标记缀合的蛋白质结合试剂能够特异性结合多个蛋白质靶中的至少一个。
在一些实施例中，该多个蛋白质靶包括细胞表面蛋白质、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、抗体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、或其任何组合。多个蛋白质靶可以包括例如10-400种不同的蛋白质靶。生物分子可以选自至少100、1,000或10,000个不同的生物分子。
在一些实施例中，寡核苷酸包括针对生物分子的独特标识。独特标识可以包括长度为25-45个核苷酸的核苷酸序列。独特标识可以选自独特标识的多元组。独特标识的多元组可以包括至少100、1,000或10,000种不同的独特标识。寡核苷酸可以具有选自至少10、100或1,000种不同条形码序列(例如，分子标记序列)的序列。在一些实施例中，该寡核苷酸通过接头与生物分子缀合。该寡核苷酸可以包括接头。该接头可以包括化学基团。该化学基团可以可逆地附接至生物分子。该化学基团可以选自下组，该组由以下组成：UV可光解基团、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、及其任何组合。
独特标识可以与样品的基因组序列不同源。该样品可以是单个细胞、多个细胞、组织、肿瘤样品、或其任何组合。该样品可以是哺乳动物样品、细菌样品、病毒样品、酵母样品、真菌样品、或其任何组合。寡核苷酸可以包括条形码序列(例如，分子标记序列)、聚(A)尾、或其组合。
在一些实施例中，多肽可以是截短的或全长的蛋白质、酶或抗体。在实施例中，多肽、截短的和全长的蛋白质、酶或抗体是由10个氨基酸单体或更多，例如15个或更多，例如25个或更多，例如50个或更多，例如100个或更多，例如250个或更多(且包括500个或更多)氨基酸单体构成。例如，目的多肽、截短的和全长的蛋白质、酶或抗体的长度范围可以是从10个氨基酸至108个氨基酸，例如从102个氨基酸至107个氨基酸，包括从103个氨基酸至106个氨基酸。在实施例中，生物聚合物不是单氨基酸或短链多肽(例如少于10个氨基酸)。“全长”是指蛋白质、酶或抗体是如下的多肽聚合物，其具有其完整序列(例如自然界中发现的)的70％或更多，例如蛋白质、酶或抗体的全长序列(例如自然界中发现的)的75％或更多，例如80％或更多，例如85％或更多，例如90％或更多，例如95％或更多，例如97％或更多，例如99％或更多并包括100％。在本披露的实施例中，标记是基于例如荧光发射、吸光度、荧光偏振、荧光寿命、荧光波长、吸光度最大值、吸光度波长、斯托克斯位移、光散射、质量、分子量、氧化还原作用、声学、拉曼、磁性、射频、酶促反应(包括化学发光和电化学发光)或其组合可检测的可检测部分或标记物。例如，标记可以是荧光团、发色团、酶、酶底物、催化剂、氧化还原标记、放射性标记、声学标记、拉曼(SERS)标签、质量标签、同位素标签(例如，同位素纯的稀土元素)、磁性颗粒、微颗粒、纳米颗粒、寡核苷酸、或其任何组合。
本文描述的系统可包括用于接收经标记的生物分子试剂要求的输入管理器。经标记的生物分子试剂要求可包括一种或多种组分。在一些情况下，经标记的生物分子试剂要求包括单个组分，并且是经标记的生物分子要求(即对通过反应性接头共价键合到标记的生物分子的要求)。在一些实施例中，经标记的生物分子试剂要求包括两个或更多个组分。例如，经标记的生物分子试剂要求包括生物分子要求和标记要求。在一些实施例中，生物分子要求是包括生物分子和反应性接头的经激活的生物分子要求，并且标记要求是包括标记和反应性接头的经激活的标记要求。在一些实施例中，标记要求包括酶要求和底物要求。
在一些实施例中，生物分子包括多肽、核酸、多糖、或其任何组合。核酸可以是寡核苷酸、DNA或RNA。多肽可以是蛋白质、酶或蛋白质结合试剂。蛋白质结合试剂可以包括抗体、适配体、或其任何组合。与标记缀合的蛋白质结合试剂能够特异性结合多个蛋白质靶中的至少一个。
在一些实施例中，该多个蛋白质靶包括细胞表面蛋白质、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、抗体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、或其任何组合。多个蛋白质靶可以包括例如10-400种不同的蛋白质靶。生物分子可以选自至少100、1,000或10,000个不同的生物分子。
在一些实施例中，寡核苷酸包括针对生物分子的独特标识。独特标识可以包括长度为25-45个核苷酸的核苷酸序列。独特标识可以选自独特标识的多元组。独特标识的多元组可以包括至少100、1,000或10,000种不同的独特标识。寡核苷酸可以具有选自至少10、100或1,000种不同条形码序列(例如，分子标记序列)的序列。在一些实施例中，该寡核苷酸通过接头与生物分子缀合。该寡核苷酸可以包括接头。该接头可以包括化学基团。该化学基团可以可逆地附接至生物分子。该化学基团可以选自下组，该组由以下组成：UV可光解基团、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、及其任何组合。
独特标识可以与样品的基因组序列不同源。该样品可以是单个细胞、多个细胞、组织、肿瘤样品、或其任何组合。该样品可以是哺乳动物样品、细菌样品、病毒样品、酵母样品、真菌样品、或其任何组合。寡核苷酸可以包括条形码序列(例如，分子标记序列)、聚(A)尾、或其组合。
本文使用短语“经标记的生物分子要求”、“生物分子要求”和“标记要求”以分别指代与特定的经标记的生物分子、生物分子或标记相关联的信息或数据。该要求可以包括与特定的经标记的生物分子、生物分子、标记、经激活的生物分子、经激活的标记或反应性接头相关联的一个或多个字符(例如字母数字字符)的字符串、符号、图像或其他一种或多种图形表示。在一些情况下，该要求是经标记的生物分子、生物分子、标记、经激活的生物分子、经激活的标记或反应性接头的“简写”名称。例如，该要求可包括登录号或缩写探针序列。该要求还可包括描述性信息，如化学结构或反应性。在一些实施例中，信息或数据可以是经标记的生物分子、生物分子或标记的任何合适的标识，并且可以包括但不限于生物分子的名称、单体序列、序列标识号、登录号或生物来源以及标记的名称、化学结构、化学文摘服务(CAS)登记号或标记物类别(例如荧光、磁)。
在一些实施例中，生物分子是用于目的分析物的生物探针，并且生物分子要求包括涉及结合至目的分析物的特异性结合结构域的信息或数据。目的特异性结合结构域包括但不限于抗体结合剂、蛋白质、肽、半抗原、核酸等。如在此使用的术语“抗体结合剂”包括足以结合目的分析物的多克隆抗体或单克隆抗体或片段。例如，抗体片段可以是单体Fab片段、单体Fab′片段、或二聚F(ab)′2片段。还在术语“抗体结合剂”的范围内的是由抗体工程产生的分子，例如单链抗体分子(scFv)或产生自单克隆抗体的人源化抗体或嵌合抗体，通过替换重链和轻链的恒定区以产生嵌合抗体，或替换恒定区和可变区的框架部分二者以产生人源化抗体。
在一些情况下，生物分子是多肽，并且生物分子要求可以包括如下信息，例如多肽名称、蛋白质名称、酶名称、抗体名称，或者蛋白质、酶或抗体片段的名称，源自特定生物流体(例如，血液、粘液、淋巴液、滑液、脑脊髓液、唾液、支气管肺泡灌洗液、羊水、羊膜脐血、尿液、阴道液和精液)的多肽，源自特定物种的多肽(例如小鼠单克隆抗体)，以及氨基酸序列标识号。
在一些实施例中，生物分子是核酸，并且生物分子要求可以包括如下信息，例如寡核苷酸名称，由基因名称标识的寡核苷酸，由登录号标识的寡核苷酸，来自特定物种(例如小鼠、人)的基因的寡核苷酸，与特定组织(例如肝、脑、心脏)相关联的基因的寡核苷酸，与特定生理功能(例如凋亡、应激反应)相关联的基因的寡核苷酸，与特定疾病状态(例如癌症、心血管疾病)相关联的基因的寡核苷酸，以及核苷酸序列。
在一些实施例中，标记要求包括酶要求和底物要求。酶要求可以包括但不限于酶名称、多肽序列、酶的类别、EC编号、多肽共有序列、保守结构域名和/或序列、或多个相关的蛋白质(例如，属于相同蛋白质家族的蛋白质)、或其任何组合。基底要求可包括但不限于基底名称、基底的官能团、基底的类型、具有特定EC编号的一个或多个酶的一个或多个基底、或其任何组合。
如上所讨论的，标记可以包括基于例如荧光发射、吸光度、荧光偏振、荧光寿命、荧光波长、吸光度波长、斯托克斯位移、光散射、质量、分子量、氧化还原作用、声学、拉曼、磁性、射频、酶促反应(包括化学发光和电化学发光)或其组合可检测的可检测部分或标记物。例如，标记可以是荧光团、发色团、酶、酶底物、催化剂、氧化还原标记、放射性标记、声学标记、拉曼(SERS)标签、质量标签、同位素标签(例如，同位素纯的稀土元素)、磁性颗粒、微颗粒、纳米颗粒、寡核苷酸、或其任何组合。在一些实施例中，标记是荧光团(即荧光标记，荧光染料等)。目的荧光团可以包括但不限于适用于分析应用(例如流式细胞术、成像等)的染料，例如吖啶染料、蒽醌染料、芳基甲烷染料、二芳基甲烷染料(例如二苯基甲烷染料)、含叶绿素的染料、三芳基甲烷染料(例如三苯基甲烷染料)、偶氮染料、重氮染料、硝基染料、亚硝基染料、酞菁染料、菁蓝染料、不对称菁蓝染料、醌亚胺染料、吖嗪染料、悠乐丁(eurodin)染料、番红染料、吲达胺、靛酚染料、氟染料、噁嗪染料，噁嗪酮(oxazone)染料、噻嗪染料、噻唑染料、呫吨染料、芴染料、派洛宁染料、氟染料、罗丹明染料、菲啶染料、以及化合了上述染料中的两种或更多种(例如串列)的染料、具有一种或多种单体染料单元的聚合物染料以及两种或更多种前述染料的混合物。大量染料可以从各种来源例如像分子探针(MolecularProbes)(尤金，俄勒冈州)、Dyomics GmbH(耶拿，德国)、西格玛奥德里奇(圣路易斯，密苏里州)、Sirigen公司(圣巴巴拉，加利福尼亚州)和Exciton(代顿，俄亥俄州)商购。例如，荧光团可以包括4-乙酰胺基-4′-异硫氰酰芪-2,2′二磺酸；吖啶和衍生物如吖啶、吖啶橙、吖啶黄、吖啶红和吖啶异硫氰酸酯；别藻蓝素、藻红蛋白、多甲藻素-叶绿素蛋白、5-(2′-氨乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)；4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘二甲酰亚胺-3,5二磺酸盐(荧光黄VS)；N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺；邻氨基苯甲酰胺；亮黄；香豆素和衍生物，例如香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，香豆素120)、7-氨基-4-三氟甲基香豆素(氯杀鼠灵151)；菁蓝和衍生物例如玫瑰红、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、和Cy7；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)；5′,5”-二溴邻苯三酚磺酞(溴邻苯三酚红)；7-二乙氨基-3-(4′-异硫氰酰苯基)-4-甲基香豆素；二乙氨基香豆素；二乙烯三胺五醋酸盐；4,4′-二异硫氰酰二氢-茋-2,2′-二磺酸；4,4′-二异硫氰酰茋-2,2′-二磺酸；5-[二甲氨基]萘-1-磺酰氯(DNS、丹磺酰氯)；4-(4′-二甲氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)；4-二甲氨基苯基偶氮苯基-4′-异硫氰酸酯(DABITC)；曙红和衍生物，例如曙红和曙红异硫氰酸酯；藻红和衍生物，例如藻红B和藻红异硫氰酸酯；乙锭；荧光素和衍生物，例如5-羧基荧光素(FAM)、5-(4,6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF)、2′7′-二甲氧基-4′5′-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、荧光素异硫氰酸酯(FITC)、荧光素氯三嗪基、萘并荧光素、和QFITC(XRITC)；荧胺；IR144；IR1446；绿色荧光蛋白(GFP)；造礁珊瑚荧光蛋白(RCFP)；LissamineTM；丽丝胺罗丹明、荧光黄；孔雀绿异硫氰酸酯；4-甲基伞形酮；邻位甲酚酞；硝基酪氨酸；副品红；尼罗红；俄勒冈绿；酚红；B-藻红蛋白；o-邻苯二甲醛；芘和衍生物，例如芘、芘丁酸酯和琥珀酰亚胺基1-芘丁酸酯；活性红4(CibacronTM亮红3B-A)；罗丹明和衍生物，例如6-羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基罗丹明(R6G)、4,7-二氯罗丹明丽丝胺、罗丹明B磺酰氯、罗丹明(Rhod)、罗丹明B、罗丹明123、罗丹明X异硫氰酸酯、磺基罗丹明B、磺基罗丹明101、磺基罗丹明101的磺酰氯衍生物(德克萨斯红)、N,N,N′,N′-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、四甲基罗丹明、和四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)；核黄素；玫红酸和铽配合物衍生物；呫吨；染料缀合的聚合物(即附接聚合物的染料)，例如异硫氰酸荧光素-葡聚糖；以及化合了两种或更多种染料(例如串列)的染料、具有一种或多种单体染料单元的聚合物染料以及两种或更多种前述染料的混合物、或其组合。
在一些情况下，荧光团(即染料)是荧光聚合物染料。可用于主题方法和系统的荧光聚合物染料可以改变。在该方法的一些情况下，聚合物染料包括缀合聚合物。
缀合的聚合物(CP)的特征在于离域电子结构，该结构包括具有交替的不饱和键(例如双键和/或三键)和饱和键(例如单键)的骨架，其中π电子可以从一个键移动到另一个键。这样，缀合的骨架可以在聚合物染料上赋予延长的线性结构，聚合物的重复单元之间具有有限的键角。例如，蛋白质和核酸虽然也是聚合物，但在一些情况下不形成延长杆状结构，而是折叠成更高级的三维形状。此外，CP可形成“刚性杆”状聚合物骨架，并沿着聚合物骨架链经历单体重复单元之间有限的扭曲(例如，扭转)角。在一些情况下，聚合物染料包括具有刚性杆状结构的CP。如上所概述，聚合物染料的结构特征可影响分子的荧光特性。
可以在主题方法和系统中使用任何便利的聚合物染料。在一些情况下，聚合物染料是一种多发色团，该多发色团具有能够集光以放大荧光团的荧光输出的结构。在一些情况下，聚合物染料能够集光并将其高效转化为更长波长的发射光。在一些实施例中，聚合物染料具有能够将能量高效地转移到附近发光物质(例如“信号传导发色团”)的集光多发色团系统。能量转移机制包括例如共振能量转移(例如，Forster(或荧光)共振能量转移，FRET)、量子电荷交换(Dexter能量转移)等。在一些情况下，这些能量转移机制是相对较短的范围；也就是说，集光多发色团系统与信号传导发色团的紧密接近提供了高效的能量转移。在高效能量转移的条件下，当集光多发色团系统中各发色团的数量较大时，从信号传导发色团的发射发生放大；也就是说，相比当信号传导发色团直接被泵浦光激发时，入射光(“激发光”)处于被集光多发色团系统吸收的波长时，从信号传导发色团的发射更强烈。
多发色团可以是缀合的聚合物。缀合的聚合物(CP)的特征在于离域电子结构，并且可用作针对化学和生物靶的高响应性光学报告物。由于有效缀合长度比聚合物链的长度短得多，所以骨架中含有大量很靠近的缀合的区段。因此，缀合的聚合物可高效集光，并通过能量转移实现光学放大。
在一些情况下，聚合物可以用作直接荧光报告物，例如具有高消光系数、高亮度等的荧光聚合物。在一些情况下，聚合物可以用作强发色团，其中颜色或光密度用作指标。
目的聚合物染料包括但不限于由Gaylord等人在美国专利号20040142344、20080293164、20080064042、20100136702、20110256549、20120028828、20120252986、20130190193和20160025735(其披露内容通过引用以其整体特此结合)；和Gaylord等人,J.Am.Chem.Soc.[美国化学会志],2001,123(26),第6417-6418页；Feng等人,Chem.Soc.Rev.[化学学会评论],2010,39,2411-2419；和Traina等人,J.Am.Chem.Soc.[美国化学会志],2011,133(32),第12600-12607页(其披露内容通过引用以其整体特此结合)中描述的那些染料。
在一些实施例中，聚合物染料包括含有形成缀合系统的多个第一光学活性单元的缀合的聚合物，该缀合系统具有第一光学活性单元吸收光以形成激发态的第一吸收波长(例如，如本文所述的)。缀合的聚合物(CP)可以是聚阳离子、聚阴离子和/或带中性电荷的缀合的聚合物。
CP可以是水溶性的，以便在生物样品中使用。在聚合物染料中可包括任何便利的取代基以提供增加的水溶性，例如亲水性取代基(例如亲水性聚合物)或带电荷的取代基(例如在水性溶液中(例如在生理条件下)带正电荷或负电荷的基团)。任何便利的水溶性基团(WSG)都可用于主题集光多发色团。术语“水溶性基团”是指在水性环境中很好溶剂化并且赋予与其附接的分子改进的水溶性的官能团。在一些实施例中，与缺乏WSG的多发色团相比，WSG增加多发色团在主要为水性的溶液(例如如本文所述的)中的溶解度。水溶性基团可以是在水性环境中很好溶剂化的任何便利的亲水基团。在一些实施例中，亲水性水溶性基团是带电的，例如带正电荷或带负电荷或带两性离子。在一些实施例中，亲水性水溶性基团是中性亲水基团。在一些实施例中，WSG是亲水性聚合物，例如聚乙二醇、纤维素、壳聚糖或其衍生物。
如本文使用的，术语“聚环氧乙烷”、“PEO”、“聚乙二醇”和“PEG”可互换使用，并且是指包括由化学式-(CH2-CH2-O-)n-描述的链的聚合物或其衍生物。在一些实施例中，“n”是5000或更少，如1000或更少、500或更少、200或更少、100或更少、50或更少、40或更少、30或更少、20或更少、15或更少，如5至15或10至15。应理解的是，PEG聚合物可以具有任何便利的长度，并且可以包括各种末端集团，这些末端集团包括但不限于烷基、芳基、羟基、氨基、酰基、酰氧基和酰胺基末端集团。可以被适配为用于在主题多发色团中使用的官能化PEG包括由S.Zalipsky在“Functionalized poly(ethylene glycol)for preparation ofbiologically relevant conjugates[用于制备生物相关缀合物的官能化聚乙二醇]”,Bioconjugate Chemistry[生物缀合化学]1995,6(2),150-165中描述的那些PEG。目的水溶性基团包括但不限于羧酸盐、膦酸盐、磷酸盐、磺酸盐、硫酸盐、亚磺酸盐、酯、聚乙二醇(PEG)和修饰PEG、羟基、胺、铵、胍鎓、多胺和锍、多元醇、直链或环状糖类、伯胺、仲胺、叔胺或季胺和多胺、膦酸盐基团、次膦酸盐基团、抗坏血酸盐基团、二醇(包括聚醚、-COOM′、-SO3M′、-PO3M′、-NR3 +、Y′、(CH2CH2O)pR)及其混合物，其中Y′可以是任何卤素、硫酸根、磺酸根或含氧阴离子，p可以是1至500，每个R可以独立地是H或烷基(如甲基)，并且M′可以是阳离子平衡离子或氢、-(CH2CH2O)yyCH2CH2XRyy、-(CH2CH2O)yyCH2CH2X-、-X(CH2CH2O)yyCH2CH2-、二醇和聚乙二醇，其中yy选自1至1000，X选自O、S和NRZZ，并且RZZ和RYY独立地选自H和C1-3烷基。
聚合物染料可以具有任何便利的长度。在一些实施例中，聚合物染料的单体重复单元或区段的具体数量可以落在2至500,000的范围内，例如2至100,000、2至30,000、2至10,000、2至3,000或2至1,000个单元或区段，或例如100至100,000、200至100,000、或500至50,000个单元或区段。在一些实施例中，聚合物染料的单体重复单元或区段的数量在2至1000个单元或区段的范围内，例如2至750个单元或区段，例如2至500个单元或区段，例如2至250个单元或区段，例如2至150个单元或区段，例如2至100个单元或区段，例如2至75个单元或区段，例如2至50个单元或区段，并且包括2至25个单元或区段。
聚合物染料可具有任何便利的分子量(MW)。在一些实施例中，聚合物染料的MW可以表示为平均分子量。在一些实例中，聚合物染料具有从500至500,000，如从1,000至100,000、从2,000至100,000、从10,000至100,000的平均分子量，或甚至从50,000至100,000的平均分子量。在一些实施例中，聚合物染料具有70,000的平均分子量。
在一些实施例中，聚合物染料包括以下结构：
其中CP1、CP2、CP3和CP4独立地为缀合聚合物区段或寡聚结构，其中CP1、CP2、CP3和CP4中的一个或多个为带隙修饰的n-缀合重复单元。
在一些实施例中，缀合聚合物为聚芴缀合聚合物、聚亚苯基亚乙烯基缀合聚合物、聚亚苯基醚缀合聚合物、聚亚苯基聚合物以及其他类型的缀合聚合物。
在一些情况下，聚合物染料包括以下结构：
其中每个R1独立地为增溶基团或接头-染料；L1和L2是任选的接头；每个R2独立地是H或芳基取代基；每个A1和A2独立地是H、芳基取代基或荧光团；G1和G2各自独立地选自下组，该组由以下组成：端基、π缀合的区段、接头和所连接的特异性结合成员；每个n和每个m独立地是0或从1至10,000的整数；并且p是从1至100,000的整数。目的增溶基团包括但不限于水溶性官能团，例如亲水性聚合物(例如聚环氧烷、纤维素、壳聚糖等)，以及进一步被亲水基团取代的烷基、芳基和杂环基团，该亲水基团例如聚环氧烷(例如，包括2-20个单元的PEG的聚乙二醇)、铵、锍、鏻也具有带电荷(带正电、带负电或两性离子)的亲水性水溶性基团等。
在一些实施例中，聚合物染料包括作为聚合物骨架一部分的缀合区段，该缀合区段具有以下结构之一：
其中每个R3独立地为任选经取代的水溶性官能团，例如亲水性聚合物(例如聚环氧烷、纤维素、壳聚糖等)或进一步被亲水基团取代的烷基或芳基，该亲水基团例如聚环氧烷(例如包括2-20个单元的PEG的聚乙二醇)、铵、锍、鏻也具有带电荷(带正电、带负电或两性离子)的亲水性水溶性基团；Ar是任选地经取代的芳基或杂芳基基团；并且n是1至10000。在一些实施例中，R3是任选地经取代的烷基基团。在一些实施例中，R3是任选地经取代的芳基基团。在一些实施例中，R3被聚乙二醇、染料、化学选择性官能团或特异性结合部分取代。在一些实施例中，Ar被聚乙二醇、染料、化学选择性官能团或特异性结合部分取代。
在一些实施例中，聚合物染料包括以下结构：
其中每个R1是增溶基团或接头染料基团；每个R2独立地是H或芳基取代基；L1和L2是任选的接头；每个A1和A3独立地为H、荧光团、官能团或特异性结合部分(例如抗体)；并且n和m各自独立地是0至10000，其中n+m>1。
聚合物染料可以具有一种或多种所需的光谱特性，例如特定最大吸收波长、特定最大发射波长、消光系数、量子产率等(参见例如Chattopadhyay等人，“Brilliant violetfluorophores:A new class of ultrabright fluorescent compounds forimmunofluorescence experiments[一类新的用于免疫荧光实验的超亮荧光化合物].”Cytometry Part A[细胞计数A部分],81A(6),456-466,2012)。
在一些实施例中，聚合物染料具有在280和850nm之间的吸收曲线。在一些实施例中，聚合物染料具有在280至850nm范围内的最大吸收。在一些实施例中，聚合物染料吸收波长在280至850nm范围内的入射光，其中目的最大吸收的具体实例包括但不限于：348nm、355nm、405nm、407nm、445nm、488nm、640nm和652nm。在一些实施例中，聚合物染料具有选自下组的范围内的最大吸收波长，该组由以下组成：280-310nm、305-325nm、320-350nm、340-375nm、370-425nm、400-450nm、440-500nm、475-550nm、525-625nm、625-675nm和650-750nm。在一些实施例中，聚合物染料具有348nm的最大吸收波长。在一些实施例中，聚合物染料具有355nm的最大吸收波长。在一些实施例中，聚合物染料具有405nm的最大吸收波长。在一些实施例中，聚合物染料具有407nm的最大吸收波长。在一些实施例中，聚合物染料具有445nm的最大吸收波长。在一些实施例中，聚合物染料具有488nm的最大吸收波长。在一些实施例中，聚合物染料具有640nm的最大吸收波长。在一些实施例中，聚合物染料具有652nm的最大吸收波长。
在一些实施例中，聚合物染料具有范围为400至850nm，例如415至800nm的最大发射波长，其中目的最大发射的具体实例包括但不限于：395nm、421nm、445nm、448nm、452nm、478nm、480nm、485nm、491nm、496nm、500nm、510nm、515nm、519nm、520nm、563nm、570nm、578nm、602nm、612nm、650nm、661nm、667nm、668nm、678nm、695nm、702nm、711nm、719nm、737nm、785nm、786nm、805nm。在一些实施例中，聚合物染料具有选自下组的范围内的最大发射波长，该组由以下组成：380-400nm、410-430nm、470-490nm、490-510nm、500-520nm、560-580nm、570-595nm、590-610nm、610-650nm、640-660nm、650-700nm、700-720nm、710-750nm、740-780nm和775-795nm。在一些实施例中，聚合物染料具有395nm的最大发射。在一些实施例中，聚合物染料具有421nm的最大发射波长。在一些实施例中，聚合物染料具有478nm的最大发射波长。在一些实施例中，聚合物染料具有480nm的最大发射波长。在一些实施例中，聚合物染料具有485nm的最大发射波长。在一些实施例中，聚合物染料具有496nm的最大发射波长。在一些实施例中，聚合物染料具有510nm的最大发射波长。在一些实施例中，聚合物染料具有570nm的最大发射波长。在一些实施例中，聚合物染料具有602nm的最大发射波长。在一些实施例中，聚合物染料具有650nm的最大发射波长。在一些实施例中，聚合物染料具有711nm的最大发射波长。在一些实施例中，聚合物染料具有737nm的最大发射波长。在一些实施例中，聚合物染料具有750nm的最大发射波长。在一些实施例中，聚合物染料具有786nm的最大发射波长。在一些实施例中，聚合物染料具有421nm±5nm的最大发射波长。在一些实施例中，聚合物染料具有510nm±5nm的最大发射波长。在一些实施例中，聚合物染料具有570nm±5nm的最大发射波长。在一些实施例中，聚合物染料具有602nm±5nm的最大发射波长。在一些实施例中，聚合物染料具有650nm±5nm的最大发射波长。在一些实施例中，聚合物染料具有711nm±5nm的最大发射波长。在一些实施例中，聚合物染料具有786nm±5nm的最大发射波长。在一些实施例中，聚合物染料具有选自下组的最大发射，该组由以下组成：421nm、510nm、570nm、602nm、650nm、711nm和786nm。
在一些实施例中，聚合物染料具有1 x 106cm-1M-1或更大，例如2 x 106cm-1M-1或更大、2.5 x 106cm-1M-1或更大、3 x 106cm-1M-1或更大、4 x 106cm-1M-1或更大、5 x 106cm-1M-1或更大、6 x 106cm-1M-1或更大、7 x 106cm-1M-1或更大、或8 x 106cm-1M-1或更大的消光系数。在一些实施例中，聚合物染料具有如下量子产率：0.05或更高，例如0.1或更高、0.15或更高、0.2或更高、0.25或更高、0.3或更高、0.35或更高、0.4或更高、0.45或更高、0.5或更高、0.6或更高、0.7或更高、0.8或更高、0.9或更高、0.95或更高、0.99或更高，且包括0.999或更高。例如，目的聚合物染料的量子产率范围可以是从0.05至1，例如从0.1至0.95，例如从0.15至0.9，例如从0.2至0.85，例如从0.25至0.75，例如从0.3至0.7，且包括从0.4至0.6的量子产率。在一些实施例中，聚合物染料具有0.1或更高的量子产率。在一些实施例中，聚合物染料具有0.3或更高的量子产率。在一些实施例中，聚合物染料具有0.5或更高的量子产率。在一些实施例中，聚合物染料具有0.6或更高的量子产率。在一些实施例中，聚合物染料具有0.7或更高的量子产率。在一些实施例中，聚合物染料具有0.8或更高的量子产率。在一些实施例中，聚合物染料具有0.9或更高的量子产率。在一些实施例中，聚合物染料具有0.95或更高的量子产率。在一些实施例中，聚合物染料具有1 x 106或更大的消光系数和0.3或更高的量子产率。在一些实施例中，聚合物染料具有2 x 106或更大的消光系数和0.5或更高的量子产率。
在一些实施例中，该标记包括酶、酶底物、或其组合。该酶能够将酶底物修饰成对应的经修饰的酶底物。在一些实施例中，这些酶可以是、或可以包括酶学委员会(EC)1氧化还原酶(例如，脱氢酶或氧化酶)；EC 2转移酶(例如，转氨酶或激酶)；EC 3水解酶(例如，脂肪酶、淀粉酶或肽酶)；EC 4裂解酶(例如，脱羧酶)；EC 5异构酶(例如，异构酶或变位酶)；或EC 6连接酶(例如，合成酶)。
在一些实施例中，这些酶可以是、或可以包括作用于供体的CH-OH基团的EC 1.1氧化还原酶；作用于供体的醛或氧代基团的EC 1.2氧化还原酶；作用于供体的CH-CH基团的EC1.3氧化还原酶；作用于供体的CH-NH(2)基团的EC 1.4氧化还原酶；作用于供体的CH-NH基团的EC 1.5氧化还原酶；作用于NADH或NADPH的EC 1.6氧化还原酶；作用于作为供体的其他含氮化合物的EC 1.7氧化还原酶；作用于供体的硫基团的EC 1.8氧化还原酶；作用于供体的血红素基团的EC 1.9氧化还原酶；作用于作为供体的二酚和相关的底物的EC 1.10氧化还原酶；氧化金属离子的EC 1.16氧化还原酶；作用于CH或CH(2)基团的EC 1.17氧化还原酶；作用于作为供体的铁硫蛋白的EC 1.18氧化还原酶；作用于作为供体的还原的黄素氧还蛋白的EC 1.19氧化还原酶；作用于供体中的磷或砷的EC 1.20氧化还原酶；催化反应X-H+Y-H＝′X-Y′的EC 1.21氧化还原酶；作用于供体中卤素的EC 1.22氧化还原酶；还原作为受体的C-O-C基团的EC 1.23氧化还原酶；或EC 1.97其他氧化还原酶。
在一些实施例中，这些酶可以是、或可以包括EC 2.1转移酶，其与底物：DNA、RNA、邻苯二酚一起转移一碳基团；转移醛或酮基团的EC 2.2转移酶；EC 2.3酰基转移酶；EC 2.4糖基转移酶；转移除甲基基团以外的烷基或芳基基团的EC 2.5转移酶；转移含氮基团的EC2.6转移酶；转移含磷基团的EC 2.7转移酶；转移含硫基团的EC 2.8转移酶；转移含硒基团的EC 2.9转移酶；或转移含钼或钨基团的EC 2.10转移酶。
在一些实施例中，这些酶可以是、或可以包括作用于酯键的EC 3.1水解酶；EC 3.2糖基化酶；作用于醚键的EC 3.3水解酶；作用于肽键(肽酶)的EC 3.4水解酶；作用于碳-氮键、而不是肽键的EC 3.5水解酶；作用于酸酐的EC 3.6水解酶；作用于碳-碳键的EC 3.7水解酶；作用于卤化物键的EC 3.8水解酶；作用于磷-氮键的EC 3.9水解酶；作用于硫-氮键的EC 3.10水解酶；作用于碳-磷键的EC 3.11水解酶；作用于硫-硫键的EC 3.12水解酶；或作用于碳-硫键的EC 3.13水解酶。
在一些实施例中，这些酶可以是、或可以包括糖基水解酶(可用于分解植物生物质以生产生物燃料的酶)、氨基转移酶(涉及结合和运输小有机分子或蛋白质(其对于生物制造而言重要的)的蛋白质)、ATP结合盒(ABC)转运蛋白的溶质结合蛋白(涉及土壤微生物代谢的蛋白质，其具有生物修复中的潜在影响)、或其任何组合。
在一些实施例中，这些酶可以是、或可以包括EC 4.1碳-碳裂解酶；EC 4.2碳-氧裂解酶；EC 4.3碳-氮裂解酶；EC 4.4碳-硫裂解酶；EC 4.5碳-卤化物裂解酶；EC 4.6磷-氧裂解酶；EC 4.7碳-磷裂解酶；或EC 4.99其他裂解酶。
在一些实施例中，这些酶可以是、或可以包括形成碳-氧键的EC 6.1连接酶；形成碳-硫键的EC 6.2连接酶；形成碳-氮键的EC 6.3连接酶；形成碳-碳键的EC 6.4连接酶；形成磷酸酯键的EC 6.5连接酶；或形成氮-金属键的EC 6.6连接酶。
在一些实施例中，酶底物与对应的经修饰的酶底物可以相差至少一个官能团。该至少一个官能团可以是烷基、烯基、炔基、苯基、苄基、卤基、氟、氯、溴、碘、羟基、羰基、醛、卤代甲酰基、碳酸酯、羧酸根、羧基、酯、甲氧基、氢过氧基、过氧基、醚、半缩醛、半缩酮、乙缩醛、缩酮、乙缩醛、原酸酯、亚甲基二氧基、原碳酸酯、甲酰胺、伯胺、仲胺、叔胺、4°铵、伯氯胺酮、仲氯胺酮、伯醛亚胺、仲醛亚胺、酰亚胺、叠氮基、偶氮基、二酰亚胺、氰酸酯、异氰酸酯、硝酸酯、腈、异腈、亚硝基氧基、硝基、亚硝基、吡啶基、巯基、硫醚、二硫醚、亚磺酰基、磺酰基、亚磺基、磺基、硫氰酸酯、异硫氰酸酯、碳硫酮、碳硫醛、膦基、膦酰基、磷酸酯、磷酸二酯、二羟硼基、硼酸酯、亚二羟硼基、亚硼酸酯、或其任何组合。
在一些实施例中，酶可以包括甲基转移酶、糖苷水解酶、琼脂水解酶、氨酸酶、淀粉酶、乙糖苷酶、卡拉胶酶、纤维素酶、神经酰胺酶、几丁质酶、脱乙酰几丁质酶、柠檬酸酶、葡聚糖酶、糊精酶、果糖苷酶、岩藻多糖酶、墨角藻糖苷酶、呋喃糖苷酶、半乳糖苷酶、半乳糖醛酸酶、葡聚糖酶、葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、葡萄糖苷酸酶、糖水解酶、糖苷酶、己糖苷酶、水解酶、艾杜糖醛酸酶、肌苷酶、菊粉酶、乳糖酶、果聚糖酶、地衣多糖酶、连接酶、裂解酶、溶菌酶、麦芽糖苷酶、麦芽糖壳三糖酶、甘露二糖苷酶、甘露糖苷酶、胞壁酸酶、辛糖酸酶、辛糖酸水解酶、樱草苷酶、蛋白酶、支链淀粉酶、鼠李糖苷酶、糖胺酶、唾液酸酶、合酶、转移酶、海藻糖酶、turonidase、turonosidase、木聚糖酶、木糖苷酶、或其组合。
在一些实施例中，酶底物可以包括6-巯基嘌呤、纤维二糖、纤维四糖、木四糖、异樱草糖、β-D-龙胆二糖、木葡聚糖和甘露三糖、琼脂糖、胺酸、淀粉、寡糖、多糖、纤维素、神经酰胺、几丁质、壳聚糖、右旋糖、糊精、果糖、岩藻多糖、岩藻糖、呋喃糖苷、半乳糖苷、葡聚糖、吡喃葡萄糖苷、葡萄糖苷、葡萄糖醛酸、葡糖苷酸、葡萄糖、糖苷、糖胺聚糖、己糖苷、菊粉、乳糖、levanose、脂多糖、甘露糖、麦芽糖苷、麦芽三糖苷、甘露糖、辛基酮糖酸、寡糖、果胶酸酯、果胶、肽、聚半乳糖醛酸、多核苷酸、支链淀粉、鼠李糖苷、木聚糖、或其任何组合。标记要求可以包括酶要求和底物要求。
经标记的生物分子试剂是通过将经激活的生物分子与经激活的标记联接来制备。本文使用术语“经激活的”以指代具有反应性接头或反应性部分的生物分子或标记，当在适当条件下进行时其与第二反应性接头或第二反应性部分反应以形成化学键，例如像离子键(电荷-电荷相互作用)、非共价键(例如偶极-偶极或电荷-偶极)或共价键。在一些实施例中，经激活的生物分子的反应性接头或部分与经激活的标记的反应性接头或部分反应以产生离子键。在其他实施例中，经激活的生物分子的反应性接头或部分与经激活的标记的反应性接头或部分反应以产生非共价键。在又其他实施例中，经激活的生物分子的反应性接头或部分与经激活的标记的反应性接头或部分反应以产生共价键。
在一些实施例中，经激活的生物分子的反应性接头或部分与经激活的标记的反应性接头或部分反应以产生共价键。可以使用使得在经激活的生物分子的反应性接头与经激活的标记的反应性接头之间形成共价键的任何便利方案，包括但不限于加成反应、消去反应、取代反应、周环反应、光化学反应、氧化还原反应、自由基反应、通过碳烯中间体的反应、复分解反应以及其他类型的成键反应。在一些实施例中，经激活的生物分子可以通过反应性连接化学与经激活的标记缀合，例如其中反应性接头对包括但不限于：马来酰亚胺/硫醇；硫醇/硫醇；吡啶基二硫醇/硫醇；碘乙酸琥珀酰亚胺酯/硫醇；N-琥珀酰亚胺酯(NHS酯)、磺基二氯苯酚酯(SDP酯)或五氟苯基酯(PFP酯)/胺；双琥珀酰亚胺酯/胺；亚氨酸酯/胺；肼或胺/醛，二醛或苯甲醛；异氰酸酯/羟基或胺；碳水化合物-高碘酸盐/肼或胺；二吖丙因/芳基叠氮化物化学；吡啶基二硫醇/芳基叠氮化物化学；炔/叠氮化物；羧基-碳二亚胺/胺；胺/磺基-SMCC(磺基琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-甲酸酯)/硫醇和胺/BMPH(N-[β-马来酰亚胺基丙酸]酰肼.TFA)/硫醇；叠氮化物/三芳基膦；硝酮/环辛炔；叠氮化物/四嗪和甲酰基苯甲酰胺/肼基-烟酰胺。在一些实施例中，经激活的生物分子的反应性接头和经激活的标记的反应性接头经历环加成反应，例如[1+2]-环加成、[2+2]-环加成、[3+2]-环加成、[2+4]-环加成、[4+6]-环加成、或螯键反应(cheleotropic reaction)，包括接头经历1,3-偶极环加成(例如叠氮化物-炔烃Huisgen环加成)、狄尔斯-阿尔德反应、逆电子需求狄尔斯阿尔德环加成、烯反应或[2+2]光化学环加成反应。
在一些实施例中，生物分子要求和标记要求包括关于经激活的生物分子和经激活的标记的反应性接头的信息或数据。例如，生物分子要求和标记要求可以包括关于反应性接头的名称、化学结构、反应性接头的结构描述或反应性接头CAS号的信息或数据。在一些实施例中，生物分子要求和标记要求包括反应性接头对的名称，例如其中反应性接头对可以选自马来酰亚胺/硫醇；硫醇/硫醇；吡啶基二硫醇/硫醇；碘乙酸琥珀酰亚胺酯/硫醇；N-琥珀酰亚胺酯(NHS酯)、磺基二氯苯酚酯(SDP酯)或五氟苯基酯(PFP酯)/胺；双琥珀酰亚胺酯/胺；亚氨酸酯/胺；肼或胺/醛，二醛或苯甲醛；异氰酸酯/羟基或胺；碳水化合物-高碘酸盐/肼或胺；二吖丙因/芳基叠氮化物化学；吡啶基二硫醇/芳基叠氮化物化学；炔/叠氮化物；羧基-碳二亚胺/胺；胺/磺基-SMCC(磺基琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-甲酸酯)/硫醇和胺/BMPH(N-[β-马来酰亚胺基丙酸]酰肼.TFA)/硫醇；叠氮化物/三芳基膦；硝酮/环辛炔；叠氮化物/四嗪和甲酰基苯甲酰胺/肼基-烟酰胺；二烯/亲二烯体；和1,3-偶极/偶极体。
在一些实施例中，标记要求包括酶要求和底物要求。酶要求可以包括但不限于酶名称、多肽序列、酶的类别、EC编号、多肽共有序列、保守结构域名和/或序列、或多个相关的蛋白质(例如，属于相同蛋白质家族的蛋白质)、或其任何组合。基底要求可包括但不限于基底名称、基底的官能团、基底的类型、具有特定EC编号的一个或多个酶的一个或多个基底、或其任何组合。
输入管理器被配置为接收对经标记的生物分子的要求。为了接收经标记的生物分子试剂要求，输入管理器可操作地联接到图形用户界面，在该图形用户界面处输入一个或多个经标记的生物分子试剂要求。在一些实施例中，将经标记的生物分子试剂要求在互联网网站菜单界面(例如，在远程位置)输入并通过互联网或局域网传送给输入管理器。在一些实施例中，输入管理器被配置为接收多个经标记的生物分子试剂要求。例如，输入管理器可以被配置为接收2个或更多个经标记的生物分子试剂要求，例如5个或更多个，例如10个或更多个，并且包括25个或更多个经标记的生物分子试剂要求。
在对经标记的生物分子试剂的要求仅包括单个组分并且是经标记的生物分子要求时，输入管理器可以被配置为接收2个或更多个经标记的生物分子要求，例如5个或更多个，例如10个或更多个，并且包括25个或更多个经标记的生物分子要求。在经标记的生物分子试剂要求包括两个组分例如生物分子要求和标记要求时，输入管理器可以被配置为接收2个或更多个生物分子要求，例如5个或更多个，例如10个或更多个，并且包括25个或更多个生物分子要求，并被配置为接收2个或更多个标记要求，例如5个或更多个，例如10个或更多个，并且包括25个或更多个标记要求。在一些实施例中，输入管理器被配置为接收经标记的生物分子试剂要求，该经标记的生物分子试剂要求包括单个生物分子要求和单个标记要求。在一些实施例中，输入管理器被配置为接收经标记的生物分子试剂要求，该经标记的生物分子试剂要求包括单个生物分子要求和多个不同的标记要求。在又一些实施例中，输入管理器被配置为接收经标记的生物分子试剂要求，该经标记的生物分子试剂要求包括多个不同的生物分子要求和单个标记要求。在仍一些实施例中，输入管理器被配置为接收经标记的生物分子试剂要求，该经标记的生物分子试剂要求包括多个不同的生物分子要求和多个不同的标记要求。该输入管理器被配置为从单个用户或多个不同用户例如2个或更多个不同用户，例如5个或更多个不同用户，例如10个或更多个不同用户，例如25个或更多个不同用户和包括100个或更多不同用户接收标记的生物分子要求。在一些实施例中，标记要求包括酶要求和底物要求。
在实施例中，输入管理器还被配置为接收与被要求的经标记的生物分子试剂的所需量相对应的数量要求。可以通过在文本框中键入数字和单位(例如，μg、μmole、μM等)、选择与适当的数字和单位值相对应的复选框或从第一下拉菜单中选择数值并第二下拉菜单中选择单位值来输入数量要求。
在一些实施例中，输入管理器可操作地联接至经标记的生物分子、经激活的生物分子、生物分子、经激活的标记、标记和反应性接头的一个或多个可搜索数据库(例如目录)。在一些实施例中，输入管理器包括经标记的生物分子的数据库。在一些实施例中，输入管理器包括经激活的生物分子和经激活的标记的数据库。在又一些实施例中，输入管理器包括生物分子、标记和反应接头的数据库。
经标记的生物分子、经激活的生物分子、生物分子、经激活的标记、标记和反应性接头的每个数据库的全部或部分可以显示在图形用户界面上，例如在列表、下拉菜单或其他配置(例如，平铺)中。例如，图形用户界面可以同时显示每个经标记的生物分子、经激活的生物分子、生物分子、经激活的标记、标记和反应性接头的列表(即在单个屏幕上)，或者可以含有经标记的生物分子试剂要求的每个组分的下拉菜单。在其他实施例中，通过将信息输入到适当的文本字段中、选择复选框、从下拉菜单选择一个或多个项目、或通过使用它们的组合来提供经标记的生物分子试剂要求。
在一个实例中，图形用户界面包括下拉菜单以通过从下拉菜单选择一种或多种经标记的生物分子来输入经标记的生物分子试剂要求。在另一个实例中，图形用户界面包括用以输入生物分子要求的第一下拉菜单和用以输入标记要求的第二下拉菜单，这些输入是通过从第一和第二下拉菜单中选择一种或多种生物分子以及一种或多种标记来进行。在又另一个实例中，图形用户界面包括用以输入生物分子要求的第一下拉菜单、用以输入标记要求的第二下拉菜单以及用以输入反应性接头要求的第三下拉菜单，这些输入是通过从下拉菜单中选择一种或多种生物分子、一种或多种标记以及一种或多种反应性接头来进行。
在仍另一个实例中，图形用户界面包括用以输入经激活的生物分子要求的第一下拉菜单和用以输入经激活的标记要求的第二下拉菜单，这些输入是通过从第一和第二下拉菜单中选择一种或多个经激活的生物分子以及一种或多种经激活的接头来进行。在一些实施例中，标记要求包括酶要求和底物要求。图形用户界面可包括用于输入经激活的生物分子要求的第一下拉菜单、用于输入经激活的酶要求的第二下拉菜单、以及用于输入酶底物的第三下拉菜单。图形用户界面可包括用于输入经激活的生物分子要求的第一下拉菜单、用于输入经激活的底物的第二下拉菜单、以及用于输入酶的第三下拉菜单。
在另一个实例中，图形用户界面包括数据库中可用的经标记的生物分子、经激活的生物分子、生物分子、经激活的标记、标记和反应性接头的列表。例如，图形用户界面可以在一个或多个屏幕上同时显示每个经标记的生物分子、经激活的生物分子、生物分子、经激活的标记、标记和反应性接头的列表，或者可以含有经标记的生物分子试剂要求的每个组分的下拉菜单。在一些实施例中，所有可用的经标记的生物分子、经激活的生物分子、生物分子、经激活的标记、标记和反应性接头的列表显示在单页上。在一些实施例中，所有可用的经标记的生物分子、经激活的生物分子、生物分子、经激活的标记、标记和反应性接头的列表显示在多个页面上，例如2页或更多页，如3页或更多页，例如5页或更多页，例如10页或更多页，并包括25页或更多页。在又一些实施例中，所有可用的经标记的生物分子、经激活的生物分子、生物分子、经激活的标记、标记和反应性接头的列表各自显示在单页上的单独下拉菜单中。
图15描绘了根据一些实施例的用于传送对经标记的生物分子试剂的要求的图形用户界面。为了传送经标记的生物分子试剂要求，用户将生物分子要求和标记要求输入到要求表格1500上。通过从下拉菜单1501a中选择可检测标记物(例如，荧光团)来输入标记要求，并且通过从下拉菜单1501b选择生物分子(例如抗体探针)来输入生物分子要求。要求表格1500还包括用于输入与经标记的生物分子试剂的所需量(以微克计)相对应的数量要求的文本框1502。在一些实施例中，标记要求包括酶要求和底物要求。
在一些实施例中，生物分子包括多肽、核酸、多糖、或其任何组合。核酸可以是寡核苷酸、DNA或RNA。多肽可以是蛋白质、酶或蛋白质结合试剂。蛋白质结合试剂可以包括抗体、适配体、或其任何组合。与标记缀合的蛋白质结合试剂能够特异性结合多个蛋白质靶中的至少一个。
在一些实施例中，该多个蛋白质靶包括细胞表面蛋白质、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、抗体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、或其任何组合。多个蛋白质靶可以包括例如10-400种不同的蛋白质靶。生物分子可以选自至少100、1,000或10,000个不同的生物分子。
在一些实施例中，寡核苷酸包括针对生物分子的独特标识。独特标识可以包括长度为25-45个核苷酸的核苷酸序列。独特标识可以选自独特标识的多元组。独特标识的多元组可以包括至少100、1,000或10,000种不同的独特标识。寡核苷酸可以具有选自至少10、100或1,000种不同条形码序列(例如，分子标记序列)的序列。在一些实施例中，该寡核苷酸通过接头与生物分子缀合。该寡核苷酸可以包括接头。该接头可以包括化学基团。该化学基团可以可逆地附接至生物分子。该化学基团可以选自下组，该组由以下组成：UV可光解基团、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、及其任何组合。
独特标识可以与样品的基因组序列不同源。该样品可以是单个细胞、多个细胞、组织、肿瘤样品、或其任何组合。该样品可以是哺乳动物样品、细菌样品、病毒样品、酵母样品、真菌样品、或其任何组合。寡核苷酸可以包括条形码序列(例如，分子标记序列)、聚(A)尾、或其组合。
在一些实施例中，输入管理器包括用于搜索、添加或修改经标记的生物分子试剂要求以及用于响应于用户查询的搜索引擎(例如，在本地或从远程位置通过互联网或局域网输入到图形用户界面中)。在一些实施例中，系统存储器中的每个持久对象在系统数据库中都有关联的表，并且对象属性被映射到表列。在另一方面，每个对象具有对象关系映射文件，该对象关系映射文件将该对象绑定到数据库中的表。
对象也相互关联，并且该关联被映射为表之间的关系。对象还通过许多不同的关系相互关联，如一对一、一对多、多对一和多对多。用户查询中提供的搜索标准可包括与对象关联的属性或特性的描述，或者通过与这些属性相对应的值的描述。
关系也可以用作搜索标准。基本搜索标准可以取决于对象的属性，并且高级搜索标准可以取决于对象与其他对象的关联，例如通过搜索相关对象的特性。在一些实施例中，目的搜索引擎包括将构建多个可搜索条件(例如，所有可能的可查询条件)的查找器框架。当用户指定要搜索的实体或对象时，框架会为该对象生成所有可能的搜索条件，然后根据用户选择的条件给出结果。
使用搜索引擎，系统的用户可以搜索可用的经标记的生物分子、生物分子、经激活的生物分子、标记、经激活的标记和反应性接头。搜索引擎还被配置为搜索未决或完成的经标记的生物分子试剂要求。此外，用户可以使用搜索引擎查询并找到可能目的经标记的生物分子、生物分子、经激活的生物分子、标记、经激活的标记和反应性接头。例如，用户可以搜索充当特异性抗原探针的特定生物分子或者搜索可通过预定波长的光的荧光检测的标记。对于不同的对象，搜索条件可能会有所不同，并且在一种情况下，通用查找器框架为这种搜索提供通用方案。
在一些实施例中，搜索引擎可以构建查询、保存查询、修改查询、和/或更新查询，这些查询用以鉴定经标记的生物分子、生物分子、经激活的生物分子、标记、经激活的标记或反应性接头。在一些实施例中，可以共享、比较或修改搜索结果。在一些实施例中，系统被配置为设置符合有待在图形用户界面上显示的搜索标准的最大搜索结果。在一些实施例中，搜索结果显示在网页上，网页包括用于允许可能的动作的能力。此类能力包括但不限于用于从用户接收信息的链接、按钮、下拉菜单、字段等。在某些方面，系统还包括用于格式化搜索结果的结果格式化器(例如，构建适当的用户界面(如网页)以指定链接，提供了将动作(例如，“删除”、“编辑”等)与图像、文本、超链接和/或其他显示相关联的方式。
系统还可以在网页上显示搜索对象的搜索标准。在一个方面，系统从查找器框架中获取输入数据并创建动态显示该对象的搜索标准的网页。在另一方面，查找器框架为搜索对象创建所有可能的可查询条件。这些条件作为不同的字段显示在搜索网页上。用户可以选择或指定这些字段的值并执行搜索。待显示的字段的标记为本地化形式。字段可以是“选择”框的形式，也可以是文本框或用于输入文本的其他区域。例如，用户可能希望搜索生物分子。在可搜索数据库中的生物分子包括可查询条件，如化合物名称或序列号(例如登录号)。
在一个实施例中，搜索引擎支持搜索数据库中的经标记的生物分子、生物分子、经激活的生物分子、标记、经激活的标记和反应性接头中的每一个。在一些实施例中，系统提供一个通用查找器框架来为搜索对象创建所有可查询条件。此类条件将总体上取决于对象的特性及其与其他对象的一种或多种关系。在其他实施例中，查找器框架检索这些条件及其顺序的本地化字段名称，并将这些存储在系统存储器中(例如，存储在objectdefinition.xml文件中)。在一个实例中，字段按其存储在文件中的顺序作为用户可以选择或输入值的一组搜索参数显示在搜索页面上。搜索参数可以处于对象列表的形式，并且参数可与属性类别相关。例如，响应于用户搜索经标记的生物分子，系统可以显示可查询条件：“经标记的生物分子的名称”、“用于搜索的关键词”、“由……创建”、“由……修改”、“修改日期”、“注释”等。查找器框架可以以集合的形式返回可查询条件，该集合可以显示在搜索页面上，该集合以本地化的形式列出或表示与属性类别相对应的各种搜索字段。用户可以输入这些字段的值并且执行例如选择具有特定名称、结构、登记号等的经标记的生物分子、生物分子、经激活的生物分子、标记、经激活的标记和反应性接头中的一个或多个，提供具体的关键字，标识所需的域、创建者、修改日期、注释等。然后系统会显示满足搜索条件的经标记的生物分子、生物分子、经激活的生物分子、标记、经激活的标记或反应性接头的列表。在一些实施例中，系统显示关于用于执行搜索的标准的信息。
在一些实施例中，输入管理器包括经标记的生物分子设计平台，其被配置为提供用于选择一种或多种生物分子、经激活的生物分子、标记、经激活的标记或反应性接头的推荐。在一些实施例中，设计平台被配置为基于用户对所需经标记的生物分子的一个或多个参数的输入来提供对于选择一种或多种生物分子、经激活的生物分子、标记、经激活的标记或反应性接头的推荐。例如，可由用户输入到设计平台中的所需经标记的生物分子的参数可包括但不限于经标记的生物分子的所需物理特性(例如，分子量、熔点、纯度等)；经标记的生物分子的所需化学特性(例如，化学结构、与第二经标记的生物分子的结构相似性、电离度、溶剂化、水解、化学反应性、酶促反应性、结合亲和性等)；光谱特性(例如吸光度波长范围、吸光度最大值、发射波长范围、发射最大值、斯托克斯位移、量子产率、摩尔消光系数等)。在一些实施例中，设计平台被配置为基于经标记的生物分子的应用来提供对于选择一种或多种生物分子、经激活的生物分子、标记、经激活的标记或反应性接头的推荐。例如，设计平台可被配置为基于将使用的仪器(例如流式细胞仪、荧光光谱仪等)、仪器配置以及实验参数(例如目标丰度，如细胞上的抗原密度)来提供对于选择经标记的生物分子的各组分的推荐。图形用户界面可以包括一个或多个文本输入字段或下拉菜单，以便输入由设计平台使用的数据，以提供对于选择一种或多种生物分子、经激活的生物分子、标记、经激活的标记或反应性接头的推荐。
经标记的生物分子设计平台可以被配置为基于用户输入的信息(例如经标记的生物分子的特性或经标记的生物分子的预期应用)提供对于多种不同的生物分子、经激活的生物分子、标记、经激活的标记或反应性接头的推荐。
例如，设计平台可以被配置为基于用户输入的信息推荐2种或更多种不同的生物分子、经激活的生物分子、标记、经激活的标记或反应性接头，例如3种或更多种、例如4种或更多种、例如5种或更多种、例如10种或更多种且包括25种或更多种生物分子、经激活的生物分子、标记、经激活的标记或反应性接头。
在一些实施例中，经标记的生物分子设计平台被配置为提供关于最适合于特定应用(例如，流式细胞仪的配置)的生物分子、标记、经激活的标记或反应性接头的组合的推荐。例如，可以将设计平台配置为使得用户输入一种或多种生物分子和一种或多种标记的列表以及应用信息(例如仪器配置、目标丰度等)，并且设计平台输出最适合于所述应用的生物分子、标记、经激活的标记和反应性接头的推荐组合。在一些实施例中，对于经标记的生物分子、生物分子、经激活的生物分子、标记、经激活的标记或反应性接头的推荐显示在显示器(例如电子显示器)上，或可以用打印机打印到例如人类可读介质(纸)上或打印成机器可读格式(例如，作为条形码)。在其他实施例中，对经标记的生物分子、生物分子、经激活的生物分子、标记、经激活的标记或反应性接头的推荐可以传送给输入管理器，并且可以如上所述来制备推荐的经标记的生物分子。
本披露的系统还包括用于存储具有多种存储标识的数据集的存储器，该多种存储标识与标记生物分子试剂要求的组分相对应。术语“存储器”在本文中以其常规意义使用，以指代存储供处理器随后检索的信息的设备，并且可以包括磁性或光学设备(例如硬盘、软盘、CD或DVD)或固态存储设备(如易失性或非易失性RAM)。存储器或存储单元可具有多于一个相同或不同类型的物理存储设备(例如，存储器可具有多个存储设备，如多个硬盘驱动器或多个固态存储设备，或硬盘驱动器和固态存储设备的一些组合)。存储器可以是计算机可读介质或永久性存储器。在实施例中，存储器可以包括具有多种存储标识的一个或多个数据集，该多种存储标识与系统数据库中的每个经标记的生物分子、生物分子、标记、经激活的生物分子、经激活的标记和反应性接头相对应。
存储于存储器中的数据集包括存储标识，这些存储标识与每个经标记的生物分子、生物分子、标记、经激活的生物分子、经激活的标记或反应性接头相对应。存储标识可以在数据集中作为与特定的经标记的生物分子、生物分子、标记、经激活的生物分子、经激活的标记或反应性接头相关联的一个或多个字符(例如字母数字字符)的字符串、符号、图像或其他一种或多种图形表示来呈现。在一些实施例中，存储标识是经标记的生物分子、生物分子、标记、经激活的生物分子、经激活的标记或接头的缩写名称。例如，存储标识可以包括对登录号、序列标识号、可鉴定的探针序列、CAS登记号的参考，或者可以是定制标识码。
存储在存储器中的每个数据集中的存储标识的数量可能不同，这取决于存储标识的类型。例如，存储在存储器中的具有多个经标记的生物分子存储标识的数据集可以包括10种或更多个经标记的生物分子存储标识，例如25种或更多种，例如50种或更多种，例如100种或更多种标识，例如250种或更多种，例如500种或更多种，并且包括1000种或更多个经标记的生物分子存储标识。存储在存储器中的具有多种生物分子或经激活的生物分子的数据集可以包括25种或更多种生物分子或经激活的生物分子存储标识，例如50种或更多种，例如100种或更多种，例如250种或更多种，例如500种或更多种，并且包括1000种或更多种生物分子或经激活的生物分子存储标识。存储在存储器中的具有多种标记或经激活的标记的数据集可以包括5种或更多种标记或经激活的标记存储标识，例如10种或更多种，例如15种或更多种，例如25种或更多种，并且包括50种或更多种标记或经激活的标记存储标识。在一些实施例中，存储在存储器中的具有多种反应性接头的数据集包括2种或更多种反应性接头存储标识，例如3种或更多种，例如5种或更多种，例如10种或更多种，并且包括15种或更多种反应性接头存储标识。
存储器与处理模块处于可操作的通信中，处理模块鉴定来自数据集的与由输入管理器接收的要求相对应的一种或多种存储标识。在一些实施例中，对经标记的生物分子试剂的要求是经标记的生物分子要求，并且处理模块鉴定来自存储器中的数据集的经标记的生物分子存储标识，该数据集具有多个经标记的生物分子存储标识。在其他实施例中，对经标记的生物分子试剂的要求包括生物分子要求和标记要求，并且处理模块鉴定：1)来自存储器中的第一数据集的生物分子存储标识，该第一数据集具有多种生物分子存储标识；和2)来自存储器中的第二数据集的标记存储标识，该第二数据集具有多种标记存储标识。在再其他实施例中，对经标记的生物分子试剂的要求包括生物分子要求、标记要求和反应性接头要求，并且处理模块鉴定：1)来自存储器中的第一数据集的生物分子存储标识，该第一数据集具有多种生物分子存储标识；2)来自存储器中的第二数据集的标记存储标识，该第二数据集具有多种标记存储标识；和3)来自存储器中的第三数据集的反应性接头存储标识，该第三数据集具有多种反应性接头存储标识。在一些实施例中，标记要求包括酶要求和底物要求。
当与经标记的生物分子要求、生物分子要求、标记要求、经激活的生物分子要求、经激活的标记要求或反应性接头要求相对应的具体存储标识不可得(即不能由来自存储器中的任何数据集的处理模块鉴定)时，存储器可以包括用于提供对可替代的经标记的生物分子、生物分子、标记、经激活的生物分子、经激活的标记或反应性接头的推荐的算法。推荐可以是基于与所要求的经标记的生物分子、生物分子、标记、经激活的生物分子、经激活的标记或反应性接头在化学结构、反应性、探针靶、结合亲和性、目标丰度、目标密度、标记串扰、大小、价格等方面的相似性。根据所要求的组分和可用的经标记的生物分子、生物分子、标记、经激活的生物分子、经激活的标记或反应性接头之间的相似性，存储器可以被配置为提供对于以下的推荐：一种或多种替代方案，例如2种或更多种替代方案、例如3种或更多种替代方案且包括5种或更多种替代方案。
处理模块可以包括可商购的处理器，例如由Intel公司制造的处理器，由SunMicrosystems制造的处理器，或者它可以是可用的或将变得可用的其他处理器之一。
处理器执行操作系统，该操作系统可以是例如微软公司的型操作系统；or Linux-型操作系统或未来的操作系统；或其一些组合。操作系统以熟知的方式与固件和硬件接合，并且有助于该处理器协调和执行可以用各种编程语言来编写的不同计算机程序的功能，这些编程语言如Java、Perl、C++、其他高级或低级语言以及其组合，如本领域中已知的。操作系统通常与处理器配合来协调和执行计算机的其他部件的功能。该操作系统还提供调度、输入-输出控制、文档和数据管理、存储器管理以及通信控制和相关的服务，所有这些都是根据已知的技术。
本发明的系统的处理模块包括硬件部件和软件部件两者，其中这些硬件部件可以采取一个或多个平台的形式(例如服务器的形式)，这样使得功能元件、即系统的实行该系统的特定任务(诸如管理信息的输入和输出、处理信息等)的那些元件可以通过在代表该系统的一个或多个计算机平台上并且跨越该一个或多个计算机平台执行软件应用来实行。存在于本发明系统中的一个或多个平台可以是任何类型的已知的计算机平台或未来有待开发出的一种类型的计算机平台，尽管它们典型地将属于通常称为服务器的一类计算机。
然而，这些平台也可以是大型计算机、工作站或其他计算机类型。这些平台可以经由任何已知的或未来的类型的电缆敷设或包括无线系统的其他通信系统来连接，或者经互联网或者以另外的方式。这些平台可以是共定位的或这些平台可以是物理上分离的。可能取决于所选择的计算机平台的类型和/或配置，可以在任何计算机平台上采用不同操作系统。适当的操作系统包括WINDOWSSun Solaris、Linux、OS/400、Compaq Tru64Unix、SGI IRIX、Siemens Reliant Unix和其他。其他开发产品，例如来自太阳微系统公司(Sun Microsystems)的JavaTM2平台可以在本发明系统的处理器中被采用以提供应用程序编程接口(API)程序组，这些程序组除其他事项外，其尤其增强可扩展和安全部件的实现方式。可以使用各种其他软件开发方法或架构实施系统的功能元件及其互连，如本领域普通技术人员将理解的。
本披露的系统还包括输出管理器，其提供来自处理模块的所鉴定的存储标识。在一些实施例中，输出管理器包括电子显示器，并且将所鉴定的存储标识输出到电子显示器上。可将一种或多种存储标识同时输出到电子显示器上，例如2种或更多种、例如3种或更多种、例如5种或更多种、例如10种或更多种、例如25种或更多种、例如100种或更多种且包括500种或更多种存储标识。输出管理器可以显示来自单个用户或来自多个用户(例如来自2个或更多个用户，例如5个或更多个用户，例如10个或更多个用户，例如25个或更多个用户，并且包括100个或更多个用户)的经标记的生物分子试剂要求的存储标识。输出管理器可以被配置为按照需要组织经显示的存储标识，例如将存储标识根据对经标记的生物分子的每个要求，以用户或以存储标识的类型(例如，经标记的生物分子存储标识，生物分子存储标识，标记存储标识，反应性接头存储标识)分组。在其他实施例中，输出管理器包括打印机，并且所鉴定的存储标识被打印到人类可读介质(纸张)上或者打印成机器可读格式(例如作为条形码)。
在一些实施例中，输出管理器例如通过局域网或通过互联网，将由处理模块汇编的存储标识，例如一种或多个经标记的生物分子存储标识、生物分子存储标识、标记存储标识、反应性接头存储标识以电子格式传送给用户。由输出管理器进行的数据的电子通信可以根据常规协议实施，包括但不限于SQL、HTML或XML文档、电子邮件或其他文件、或其他形式的数据。
数据还可以包括互联网URL地址，这样使得用户可以从远程来源中检索另外的SQL、HTML、XML或其他文档或数据。
本披露的用于输入经标记的生物分子试剂要求、存储与标记生物分子试剂要求的组分相对应的多种存储标识、鉴定一种或多种存储标识、并且输出所鉴定的存储标识的系统包括计算机。在一些实施例中，通用计算机可以被配置为用于本文披露的方法和程序的功能配置。这种计算机的硬件体系结构是本领域技术人员所熟知的，并且可以包括硬件部件，这些硬件部件包括一个或多个处理器(CPU)、随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、内部或外部数据存储介质(例如，硬盘驱动器)。计算机系统还可以包括用于处理和输出图形信息到显示器件的一个或多个图形板。
上述部件可以通过计算机内部的总线进行适当的互连。计算机还可以包括用于与例如监视器、键盘、鼠标、网络等的通用外部部件进行通信的合适接口。在一些实施例中，计算机能够并行处理或者可以是被配置用于并行计算或分布式计算的网络的一部分，以增加本发明的方法和程序的处理能力。在一些实施例中，可以将从存储介质读出的程序代码写入到在插入计算机中的扩展板或连接到计算机的扩展单元中提供的存储器中，并且在扩展板或扩展单元中提供的CPU或类似物可以根据程序代码的指令实际执行部分或全部操作，从而实现下述功能。在其他实施例中，该方法可以使用云计算系统来进行。在这些实施例中，可以将数据文件和编程输出到运行该程序并将输出返回给用户的云计算机。
在一些实施例中，系统可以包括计算机，该计算机包括：a)中央处理单元；b)主要的非易失性存储驱动器，其可以包括用于存储软件和数据的一个或多个硬盘驱动器，其中存储驱动器由磁盘控制器控制；c)系统存储器，例如高速随机存取存储器(RAM)，用于存储系统控制程序、数据和应用程序，包括从非易失性存储驱动器加载的程序和数据；系统存储器还可以包括只读存储器(ROM)；d)用户界面，其包括一个或多个输入或输出设备，如鼠标、键盘和显示器；e)任选的网络接口卡，其用于连接到任何有线或无线通信网络(例如打印机)；和f)内部总线，其用于连接系统的上述元件。
计算机系统的存储器可以是可存储供处理器检索的信息的任何设备，并且可以包括磁性或光学设备、或固态存储设备(如易失性或非易失性RAM)。内存或内存单元可以具有相同或不同类型的多于一个物理存储设备(例如，存储器可以具有多个存储设备，例如多个驱动器、卡或多个固态存储设备或其某些组合)。关于计算机可读介质，“永久性存储器”是指永久的存储器。
永久性存储器不会通过终止向计算机或处理器供电而被擦除。计算机硬盘驱动ROM(即，不用作虚拟存储器的ROM)、CD-ROM、软盘和DVD都是永久性存储器的例子。随机存取存储器(RAM)是非永久性(即易失性)存储器的一个例子。在永久性存储器中的文件可以是可编辑并且可重写的。
计算机的操作主要由操作系统控制，该操作系统由中央处理单元执行。操作系统可以存储在系统存储器中。在一些实施例中，操作系统包括文件系统。除了操作系统之外，系统存储器的一种可能的实现方式还包括用于实施下述方法的各种编程文件和数据文件。在一些实施例中，编程可以含有程序，其中该程序可以由各种模块以及用户界面模块构成，该用户界面模块允许用户手动选择或改变程序使用的输入或参数。数据文件可以包括针对程序的各种输入。
在一些实施例中，可以将依照本文所述的方法的指令以“编程”的形式编码到计算机可读介质上，其中，如本文使用的术语“计算机可读介质”是指参与将指令和/或数据提供至计算机以便执行和/或处理的任何存储介质或传输介质。存储介质的实例包括软盘、硬盘、光盘、磁光盘、CD-ROM、CD-R、磁带、非易失性存储卡、ROM、DVD-ROM、蓝光光盘、固态盘和网络附加存储器(NAS)，无论这些设备是否在计算机内部或外部。含有信息的文件可以“存储”在计算机可读介质上，其中“存储”是指记录信息，以便日后可以通过计算机访问和检索。
本文描述的计算机实现的方法可以使用可以以任何数量的计算机编程语言中的一种或多种来编写的程序来执行。此类语言包括例如Java(Sun Microsystems公司，圣克拉拉，加利福尼亚州)、Visual Basic(微软公司，雷德蒙德，华盛顿州)和C++(AT&T公司，贝德明斯特，新泽西州)以及任何许多其他语言。
在任何实施例中，数据可以被转发到“远程位置”，其中“远程位置”是指除了执行程序的位置之外的位置。
例如，远程位置可以是同一城市中的另一位置(例如办公室、实验室等)，不同城市中的另一位置，不同州中的另一位置，不同国家中的另一位置等。这样，当一个项目被指示为距另一个项目“遥远”时，意思是这两个项目可以在同一个房间中但是是分开的，或者至少在不同的房间中或不同的建筑物中，并且可以是相隔至少一英里、十英里、或至少一百英里。“传送”信息涉及通过合适的通信通道(例如，私人或公共网络)将代表该信息的数据作为电信号传输。“转发”项目是指将该项目从一个位置放到下个位置的任何方式，不论是通过物理运输该项目还是其他方式(如果可能的话)，并且至少在数据的情况下包括物理运输承载数据的介质或传送数据。通信介质的实例包括无线电或红外传输通道，以及与另一台计算机或联网设备的网络连接，以及互联网或包括电子邮件传输和将信息记录在网站上等。
一些实施例包括在单个计算机上或跨计算机网络或跨计算机网络的网络的实施，例如跨网络云、跨局域网、在手持计算机设备上等。在一些实施例中，本文描述的一个或多个步骤是在一种或多种计算机程序上实施。此类计算机程序执行本文描述的一个或多个步骤。在一些实施例中，主题方法的实现方式包括编码在一种或多种计算机可读介质上并且可以通过一种或多种通信网络传输的本文描述的各种数据结构、类别和修饰符。
本发明的软件、网络、互联网、云或其他存储物和计算机网络实现方式可以用标准编程技术来完成，以执行各种分配、计算、鉴定、评分、存取、生成或丢弃步骤。
图16描绘了根据一些实施例的本披露的计算机系统1600。计算机系统包括用户界面1601，其包括用于输入经标记的生物分子试剂要求的键盘1601a、鼠标1601b和监视器1601c。用户界面1601可操作地联接到存储器1602，该存储器包括操作系统1602a、系统文件1602b和数据集，这些数据集包括与经标记的生物分子试剂要求的组分对应的多种存储标识，这些组分如下：1)经标记的生物分子要求1602d；2)生物分子要求1602e；3)标记要求1602f；4)经激活的生物分子要求1602g；5)经激活的标记要求1602h；和6)反应性接头要求1602i。存储器1602还包括数据库1602j，该数据库包括经标记的生物分子1602k、生物分子1602l、标记1602m和反应性接头1602n的可搜索库存列表。在一些实施例中，标记要求包括酶要求和底物要求。
存储器和用户界面通过连接件1604可操作地联接到处理器1603，该连接件包括由磁盘控制器1605控制的存储驱动器1606。如上所述，处理器从数据集中鉴定与输入管理器所接收的要求相对应的一种或多种存储标识。
为了输出所鉴定的存储标识，根据此实施例的目的系统包括输出存储标识的网络接口控制器1607。网络接口控制器1607可以与电子显示器接合以可视地显示所鉴定的存储标识，或者可以与打印机接合以将所鉴定的存储标识呈现在人类可读介质(纸张)上或者以机器可读格式(例如，作为条形码)呈现。在一些实施例中，网络接口控制器1607例如通过局域网或通过互联网以电子格式传送存储标识，并且可以根据任何电子格式来实施，包括但不限于SQL、HTML或XML文档、电子邮件或其他文件或其他形式的数据。
图17展示了根据一些实施例的用于接收、处理和输出对经标记的生物分子试剂的要求的流程图1700。接收和处理1701要求是以输入经标记的生物分子试剂要求的一种或多种组分(1702)开始。如上所讨论，经标记的生物分子试剂要求可以包括以下中的一个或多个：1)经标记的生物分子要求；和2)生物分子要求和标记要求。在一些实施例中，生物分子要求是经激活的生物分子要求，其中生物分子与反应性接头联接。在一些实施例中，标记要求是经激活的标记要求，其中标记与反应性接头联接。在一些实施例中，标记要求包括酶要求和底物要求。
在一些实施例中，生物分子包括多肽、核酸、多糖、或其任何组合。核酸可以是寡核苷酸、DNA或RNA。多肽可以是蛋白质、酶或蛋白质结合试剂。蛋白质结合试剂可以包括抗体、适配体、或其任何组合。与标记缀合的蛋白质结合试剂能够特异性结合多个蛋白质靶中的至少一个。
在一些实施例中，该多个蛋白质靶包括细胞表面蛋白质、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、抗体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、或其任何组合。多个蛋白质靶可以包括例如10-400种不同的蛋白质靶。生物分子可以选自至少100、1,000或10,000个不同的生物分子。
在一些实施例中，寡核苷酸包括针对生物分子的独特标识。独特标识可以包括长度为25-45个核苷酸的核苷酸序列。独特标识可以选自独特标识的多元组。独特标识的多元组可以包括至少100、1,000或10,000种不同的独特标识。寡核苷酸可以具有选自至少10、100或1,000种不同条形码序列(例如，分子标记序列)的序列。在一些实施例中，该寡核苷酸通过接头与生物分子缀合。该寡核苷酸可以包括接头。该接头可以包括化学基团。该化学基团可以可逆地附接至生物分子。该化学基团可以选自下组，该组由以下组成：UV可光解基团、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、及其任何组合。
独特标识可以与样品的基因组序列不同源。该样品可以是单个细胞、多个细胞、组织、肿瘤样品、或其任何组合。该样品可以是哺乳动物样品、细菌样品、病毒样品、酵母样品、真菌样品、或其任何组合。寡核苷酸可以包括条形码序列(例如，分子标记序列)、聚(A)尾、或其组合。
在系统已接收经标记的生物分子试剂要求后，处理器确定要求的组分(即，经标记的生物分子要求；或生物分子要求和标记要求)，并且系统针对与那个具体要求相对应的存储标识搜索(1703)存储器。当检索到适当的数据集时，处理模块鉴定与经标记的生物分子试剂要求的组分相对应的一种或多种存储标识(1704)。如果单个用户输入了多于一个经标记的生物分子试剂要求，则系统可以重复上述步骤，直到处理器搜找出并鉴定来自用户要求的所有存储标识(1705)。
系统被配置为一旦处理了来自用户的经标记的生物分子试剂要求，则输出(1706)所鉴定的存储标识。输出管理器可以将存储标识显示在电子显示器上或打印存储标识(1707)。存储标识还可以以电子方式传送(1708)至例如试剂制备装置或通过互联网传送至第三方制造商。
在一些实施例中，系统包括试剂制备装置，该试剂制备装置用于制备与由输入管理器接收的所要求的经标记的生物分子相对应的经标记的生物分子试剂。试剂制备装置可操作地联接到输出管理器并且被配置为接收所鉴定的存储标识(例如，经标记的生物分子存储标识、生物分子存储标识、标记存储标识、反应性接头存储标识)并且根据所接收的存储标识产生经标记的生物分子试剂。在这些实施例中，试剂制备装置可以例如通过电缆或局域网与输出管理器本地通信，或者可以在远程位置并且通过广域网或通过互联网连接至输出管理器。为了促进试剂制备装置和输出管理器之间的连接性，系统可以包括任何合适的连接协议，例如电缆、发送器、中继站、网络服务器、网络接口卡、以太网调制解调器、电话网络连接以及卫星网络连接。在一些实施例中，试剂制备装置包括图形用户界面，其中来自输出管理器的存储标识被手动输入到输入管理器中，该输入管理器可操作地联接到试剂制备装置的图形用户界面。
在一些实施例中，试剂制备装置是全自动的。
“全自动”是指试剂制备装置从输出管理器接收所鉴定的存储标识，并制备、配制并包装经标记的生物分子试剂，其中几乎不用人为干预或手动输入到主题系统中。在一些实施例中，主题系统被配置为在没有任何人为干预的情况下从经激活的生物分子和经激活的标记制备、纯化并包装经标记的生物分子试剂。
试剂制备装置包括取样设备，该取样设备将经激活的生物分子和经激活的标记提供给接触装置。取样设备可以是与经激活的生物分子和经激活的标记的每个来源处于流体连通的任何便利设备，例如像具有多个试剂小瓶的高通量换样器，这些试剂小瓶含有经激活的生物分子和经激活的标记。取样设备还可以包括微流体通道、注射器、针、移液管、抽吸器以及其他取样设备。接触装置可以是任何适合的允许经激活的生物分子与经激活的标记接触的装置。例如，在一些实施例中，接触装置是样品室(例如封闭的、密封的、气密的、开放的、板等)。在其他实施例中，接触装置是微管。在其他实施例中，接触装置是试管。在又其他实施例中，接触装置是玻璃烧瓶(例如烧杯、容量瓶、锥形瓶等)。在仍其他实施例中，接触装置是96孔板。在一些实施例中，主题系统可以进一步包括包装单元，该包装单元被配置为将产生的经标记的生物分子试剂密封在接触装置(例如，微管、试管等)中。在其他实施例中，首先表征所产生的经标记的生物分子试剂，并进行进一步纯化、稀释、浓缩或重新配制，之后密封在容器中并用包装单元包装。
接触装置可以进一步包括用于将所组合的经激活的生物分子和经激活的标记进行混合的搅拌器。搅拌器可以是足以混合主题组合物的任何便利的搅拌器，包括但不限于涡旋器、超声仪、振动器(例如手动、机械或电动振动器)、摇动器、振动板、磁力搅拌器、静态混合器、旋转器、共混器、混合器、转筒、定轨摇床、气泡、微流体流动以及其他搅拌方案。
在一些实施例中，试剂制备装置还包括经激活的生物分子和经激活的标记的来源。来源可包括多个经激活的生物分子和经激活的标记。在一些实施例中，试剂制备装置包括含有以下的来源：5种或更多种不同类型的经激活的生物分子，例如10种或更多种、例如100种或更多种、例如250种或更多种、例如500种或更多种并且包括1000种或更多种不同类型的经激活的生物分子。例如，试剂制备装置可以包括含有以下的来源：5种或更多种不同类型的经激活的抗体探针或经激活的寡核苷酸探针，例如10种或更多种、例如100种或更多种、例如250种或更多种、例如500种或更多种并且包括1000种或更多种不同类型的经激活的抗体探针或经激活的寡核苷酸探针。
在一些实施例中，试剂制备装置包括含有以下的来源：5种或更多种不同类型的经激活的标记，例如10种或更多种、例如15种或更多种、例如25种或更多种、例如50种或更多种并且包括100种或更多种不同类型的经激活的标记。例如，试剂制备装置可以包括含有以下的来源：5种或更多种不同类型的经激活的荧光团，例如10种或更多种、例如15种或更多种、例如25种或更多种、例如50种或更多种并且包括100种或更多种不同类型的经激活的荧光团。
经激活的生物分子和经激活的标记的来源可以是任何适合的能够存储并向接触装置提供一种或多种类型的经激活的生物分子和经激活的标记的贮存器。在一个实例中，来源是单个高通量贮存器，该贮存器将多种不同类型的经激活的生物分子和经激活的标记存储在分开的分隔的试剂室中。在另一个实例中，经激活的生物分子和经激活的标记的来源是具有每种经激活的生物分子和每种经激活的标记的多个单独小瓶。在又另一个实例中，经激活的生物分子和经激活的标记的来源是具有每种经激活的生物分子和每种经激活的标记的预先测量的等分部分的贮存器。例如，贮存器可以包括每种经激活的生物分子和每种经激活的标记的预先测量的等分部分，这些等分部分足以制备一种或多种经标记的生物分子，例如2种或更多种，例如5种或更多种，例如10种或更多种，例如25种或更多种，例如100种或更多种，例如500种或更多种，并且包括1000种或更多种经标记的生物分子。
取决于含有经激活的生物分子和经激活的标记的贮存器的具体设计，试剂制备装置可进一步包括一个或多个入口，以用于将经激活的生物分子和经激活的标记递送至接触装置。
试剂制备装置还可以包括一个或多个试剂净化器。目的试剂纯化方案可以包括但不限于尺寸排阻色谱、离子交换色谱、过滤(例如膜过滤器，截留大小过滤)、液-液萃取、被动透析、活性透析、离心、沉淀、以及其他纯化方案。
试剂制备装置也可以包括试剂分析器。在一些实施例中，样品分析仪可以是质谱流式细胞技术、质谱(例如TOF质谱，电感耦合等离子质谱法)、吸收光谱法、荧光光谱法、容量分析、传导率分析、核磁共振光谱法、红外光谱法、紫外可见光谱法、比色法、元素分析、液相色谱-质谱或气相色谱-质谱系统。例如，装置可以包括分析分离设备，例如液相色谱仪(LC)(包括高效液相色谱仪(HPLC)、快速蛋白质液相色谱仪(FPLC)、微型或纳米液相色谱仪或超高压液相色谱(UHPLC)设备)、毛细管电泳(CE)、或毛细管电泳色谱(CEC)装置。然而，可以使用任何手动或自动注射或分配泵系统。例如，在一些实施例中，可以通过采用纳米泵或微型泵将主题样品应用于LC-MS系统。质谱仪系统可以是任何便利的质谱系统，其通常含有用于离子化样品的离子源、用于分离离子的质量分析器以及检测离子的检测器。在一些实施例中，质谱仪可以是所谓的“串联”质谱仪，其能够分离前体离子、使前体离子片段化、并分析经片段化的前体离子。离子源可依赖于任何类型的电离方法，包括但不限于例如电喷雾电离(ESI)、大气压化学电离(APCI)、电子碰撞(EI)、大气压光电离(APPI)、基质辅助激光解吸电离(MALDI)或电感耦合等离子体(ICP)电离或其任何组合(以提供所谓的“多模”电离源)。在一个实施例中，可以通过EI、ESI或MALDI制备前体离子，并且可以通过碰撞或使用光子将所选择的前体离子片段化以产生随后分析的产物离子。同样，可以采用各种不同的质量分析器中的任何一种，包括飞行时间(TOF)、傅里叶变换离子回旋共振(FTICR)、离子阱、四极杆或双聚焦磁电扇形质量分析器或其任何混合。在一个实施例中，质量分析器可以是扇区、传输四极杆或飞行时间质量分析器。
试剂制备装置还可被配置为用一种或多种赋形剂如缓冲液、防腐剂、干燥剂等配制经标记的生物分子试剂。在一些实施例中，试剂制备装置被配置为用一种或多种缓冲液配制经标记的生物分子试剂。
实例缓冲液可以包括但不限于PBS(磷酸盐)缓冲液、乙酸盐缓冲液、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸(Bicine)缓冲液、3-{[三(羟甲基)甲基]氨基}丙磺酸(TAPS)缓冲液、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、三(羟甲基)甲胺(Tris)缓冲液、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)缓冲液、3-[N-三(羟甲基)甲基氨基]-2-羟基丙磺酸(TAPSO)缓冲液、4-2-羟乙基-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液、2-{[三(羟甲基)甲基]氨基}乙磺酸(TES)缓冲液、哌嗪-N,N′-双(2-乙磺酸)(PIPES)缓冲液、二甲胂酸(二甲胂酸盐)缓冲液、盐水柠檬酸钠(SSC)缓冲液、2(R)-2-(甲基氨基)琥珀酸(琥珀酸)缓冲液、磷酸钾缓冲液、N-环己基-2-氨基乙磺酸(CHES)缓冲液、以及其他类型的缓冲溶液。
试剂制备装置还可以包括用于包装经标记的生物分子试剂的包装单元。在一些实施例中，包装单元可以包装制备好的经标记的生物分子试剂并制备用于运输(例如通过邮件)的经标记的生物分子试剂。在一些实施例中，将制备好的经标记的生物分子试剂分配到容器中并密封。在一些实施例中，将经标记的生物分子试剂分配到容器中、密封并进一步包装，例如装入小袋、包、管、小瓶、微管或瓶中。如果需要，包装可以是无菌的。
在一些实施例中，感兴趣的系统包括按需独立式经标记的生物分子试剂分配站，其被配置为：1)接收对经标记的生物分子试剂的一个或多个要求；2)制备所要求的经标记的生物分子试剂，并且3)将制备好的经标记的生物分子试剂递送至要求者(例如，客户)。例如，独立式试剂分配站可以是自动售货机，其被配置为接收来自客户的一个或多个经标记的生物分子试剂要求，制备所要求的经标记的生物分子并且按需将制备好的经标记的生物分子分配给客户。取决于经标记的生物分子试剂要求的数量和所要求的每种经标记的生物分子试剂的量，目的独立式试剂分配站可以在输入经标记的生物分子要求之后在10秒或更长时间内按需将经标记的生物分子制备并分配给要求者，例如在15秒或更长时间内，例如在30秒或更长时间内，例如在1分钟或更长时间内，例如在5分钟或更长时间内，例如在10分钟或更长时间内，例如在15分钟或更长时间内，例如在30分钟或更长时间内，并且包括在60分钟或更长时间内，例如在1.5小时或更长时间内，例如在2小时或更长时间内，例如在2.5小时或更长时间内，例如在3小时或更长时间内，例如在4小时或更长时间内，例如在5小时或更长时间内，例如在6小时或更长时间内，例如在8小时或更长时间内，例如在10小时或更长时间内，例如在12小时或更长时间内，例如在16小时或更长时间内，例如在18小时或更长时间内并且包括在24小时或更长时间内。在一些实施例中，独立式试剂分配站被配置为在一个持续时间内按需将经标记的生物分子制备并分配给要求者，该持续时间的范围为从5秒至60秒，例如从10秒至50秒，并且包括从15秒至45秒。在一些实施例中，独立式试剂分配站被配置为在一个持续时间内按需将经标记的生物分子制备和分配给要求者，该持续时间的范围为从1分钟至60分钟，例如从2分钟至55分钟，例如从5分钟至50分钟，例如从15分钟至45分钟，并且包括从20分钟至40分钟，例如在30分钟内将经标记的生物分子制备并分配给要求者。在仍一些实施例中，独立式试剂分配站被配置为在一个持续时间内按需将经标记的生物分子制备并分配给要求者，该持续时间的范围为从0.5小时至24小时，例如从1小时至20小时，例如从1.5小时至18小时，例如从2小时至16小时，例如从2.5小时至12小时，例如从3小时至10小时，例如从3.5小时至8小时，并且包括从4小时至6小时。
在这些实施例中，如上所述，主题独立式试剂分配站可以包括用于接收经标记的生物分子试剂要求并制备所要求的经标记的生物分子试剂的部件。例如，独立式经标记的生物分子试剂分配站可以包括用于接收对经标记的生物分子的要求的输入模块；试剂制备装置；和用于输出包装好的经标记的生物分子的分配模块。在这些实施例中，输入模块可以包括：输入管理器，其用于接收对经标记的生物分子的要求；存储器，其用于存储具有多种存储标识的数据集，该多种存储标识与经标记的生物分子试剂要求的一种或多种组分(例如，生物分子、标记等)相对应；处理模块，其通信地联接到存储器并被配置为鉴定来自数据集的与经标记的生物分子试剂要求的组分相对应的存储标识；以及输出管理器，其用于提供所鉴定的存储标识。如上所述，独立站还包括图形用户界面以及用于将经标记的生物分子要求传送给独立式分配站的输入管理器的用户输入设备。
在实施例中，输出管理器通信地联接到独立式试剂分配站中的试剂制备装置上，该独立式试剂分配站配置有生物分子、标记、反应性接头、经激活的生物分子和经激活的标记以及接触站的一个或多个来源，该接触站用于将经激活的生物分子和经激活的标记联接以产生所要求的经标记的生物分子。在一些实施例中，独立式试剂分配站包括多种预先合成的经标记的生物分子，并且独立式试剂分配站被配置为将一定量的预先合成的经标记的生物分子试剂等分到容器中，并将经标记的生物分子试剂分配给要求者。
独立式经标记的生物分子试剂分配站还包括分配模块，该分配模块被配置为提供包装好的经标记的生物分子试剂。在实施例中，分配模块可以包括用于包装制备好的经标记的生物分子试剂的包装单元。在一些实施例中，将制备好的经标记的生物分子试剂分配到容器中并密封。在一些实施例中，将经标记的生物分子试剂分配到容器中、密封并进一步包装，例如装入小袋、包、管、小瓶、微管或瓶中。如果需要，包装可以是无菌的。
在一些实施例中，独立式试剂分配站是完全自动化的，在这里接收经标记的生物分子要求，并且该站制备、纯化并包装经标记的生物分子试剂，几乎不用人为干预或手动输入(除了经标记的生物分子要求外)到主题系统中。
用于制备标记的生物分子试剂的方法
本披露的多方面还包括用于制备经标记的生物分子试剂的方法。根据一些实施例的方法包括接收对经标记的生物分子试剂的要求并制备经标记的生物分子。在其他实施例中，方法包括：如上所述用一个或多个输入管理器接收对经标记的生物分子试剂的要求，鉴定与经标记的生物分子试剂要求相对应的存储标识；输出一种或多种所鉴定的存储标识并从所鉴定的存储标识制备经标记的生物分子。
在一些实施例中，生物分子包括多肽、核酸、多糖、或其任何组合。核酸可以是寡核苷酸、DNA或RNA。多肽可以是蛋白质、酶或蛋白质结合试剂。蛋白质结合试剂可以包括抗体、适配体、或其任何组合。与标记缀合的蛋白质结合试剂能够特异性结合多个蛋白质靶中的至少一个。
在一些实施例中，该多个蛋白质靶包括细胞表面蛋白质、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、抗体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、或其任何组合。多个蛋白质靶可以包括例如10-400种不同的蛋白质靶。生物分子可以选自至少100、1,000或10,000个不同的生物分子。
在一些实施例中，寡核苷酸包括针对生物分子的独特标识。独特标识可以包括长度为25-45个核苷酸的核苷酸序列。独特标识可以选自独特标识的多元组。独特标识的多元组可以包括至少100、1,000或10,000种不同的独特标识。寡核苷酸可以具有选自至少10、100或1,000种不同条形码序列(例如，分子标记序列)的序列。在一些实施例中，该寡核苷酸通过接头与生物分子缀合。该寡核苷酸可以包括接头。该接头可以包括化学基团。该化学基团可以可逆地附接至生物分子。该化学基团可以选自下组，该组由以下组成：UV可光解基团、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、及其任何组合。
独特标识可以与样品的基因组序列不同源。该样品可以是单个细胞、多个细胞、组织、肿瘤样品、或其任何组合。该样品可以是哺乳动物样品、细菌样品、病毒样品、酵母样品、真菌样品、或其任何组合。寡核苷酸可以包括条形码序列(例如，分子标记序列)、聚(A)尾、或其组合。
如上所讨论，经标记的生物分子试剂是与可检测标记联接(例如共价键合)的生物大分子。在一些实施例中，方法包括制备与可检测标记联接的多肽、与可检测标记联接的核酸、与可检测标记联接的多糖、或其组合。在一个实例中，生物分子是寡核苷酸、截短的或全长的DNA或RNA。在另一个实例中，生物分子是多肽、蛋白质、酶或抗体。在一些实施例中，生物分子是具有足以结合目的分析物的特异性结合结构域的生物探针。目的特异性结合结构域包括但不限于抗体结合剂、蛋白质、肽、半抗原、核酸等。如在此使用的术语“抗体结合剂”包括足以结合目的分析物的多克隆抗体或单克隆抗体或片段。抗体片段可以是例如单体Fab片段、单体Fab′片段或二聚体F(ab)′2片段；以及通过抗体工程产生的分子，例如单链抗体分子(scFv)或者从单克隆抗体产生的人源化或嵌合抗体，通过置换重链和轻链的恒定区以产生嵌合抗体或置换恒定区和可变区的框架部分二者以产生人源化抗体。
目的标记包括基于例如荧光发射、荧光偏振、荧光寿命、荧光波长、吸光度最大值、吸光度波长、斯托克斯位移、光散射、质量、分子量、氧化还原作用、声学、拉曼、磁性、射频、酶促反应(包括化学发光和电化学发光)或其组合可检测的标记物。目的标记可以包括但不限于荧光团、发色团、酶、酶底物、催化剂、氧化还原标记、放射性标记、声学标记、拉曼(SERS)标签、质量标签、同位素标签(例如同位素纯的稀土元素)、磁颗粒、微颗粒、纳米颗粒、寡核苷酸、或其任何组合。
方法包括接收对经标记的生物分子试剂的要求。在本披露的实施例中，经标记的生物分子试剂要求包括以下中的一个或多个：1)经标记的生物分子要求；和2)生物分子要求和标记要求。在一些实施例中，标记要求包括酶要求和底物要求。在一些实施例中，生物分子要求是经激活的生物分子要求，其中生物分子与反应性接头联接。在一些实施例中，标记要求是经激活的标记要求，其中标记与反应性接头联接。经标记的生物分子试剂要求可以通过任何便利的通信协议接收，包括但不限于通过电话、传真、电子邮件或邮寄接收经标记的生物分子试剂要求。在一些实施例中，经标记的生物分子试剂要求是通过将经标记的生物分子试剂要求输入到计算机上的图形用户界面中例如通过互联网网站来传送。
可以接收(同时或顺序地)一个或多个经标记的生物分子试剂要求，例如接收2个或更多个经标记的生物分子试剂要求，例如5个或更多个，例如10个或更多个，并且包括接收25个或更多个经标记的生物分子试剂要求。在对经标记的生物分子试剂的要求仅包括单个组分并且是经标记的生物分子要求时，方法可以包括接收2个或更多个经标记的生物分子要求，例如5个或更多个，例如10个或更多个，并且包括25个或更多个经标记的生物分子要求。在经标记的生物分子试剂要求包括两个组分例如生物分子要求和标记要求时，方法可以包括接收2个或更多个生物分子要求，例如5个或更多个，例如10个或更多个，并且包括25个或更多个生物分子要求，并被配置为接收2个或更多个标记要求，例如5个或更多个，例如10个或更多个，并且包括25个或更多个标记要求。在一些实施例中，方法包括接收包括单个生物分子要求和单个标记要求的经标记的生物分子试剂要求。在一些实施例中，方法包括接收包括单个生物分子要求和多个不同标记要求的经标记的生物分子试剂要求。在又一些实施例中，方法包括接收包括多个不同生物分子要求和单个标记要求的经标记的生物分子试剂要求。在仍一些实施例中，方法包括接收包括多个不同生物分子要求和多个不同标记要求的经标记的生物分子试剂要求。
经标记的生物分子试剂要求可以从单个用户或多个用户接收，例如从2个或更多个用户，例如从5个或更多个用户，例如从10个或更多个用户，例如从25个或更多个用户，并且包括从100个或更多个用户接收经标记的生物分子要求。
在一些实施例中，方法包括接收对经标记的生物分子试剂的要求并将该要求输入到输入管理器(如上所述)(通过其进入)的图形用户界面中。在其他实施例中，制备经标记的生物分子试剂要求的用户将该要求直接输入到图形用户界面中。在这些实施例中，可以将经标记的生物分子要求输入到图形用户界面中，并作为经标记的生物分子的一个或多个字符(例如字母数字字符)的字符串、符号、图像或其他一种或多种图形表示传送至输入管理器。在一些实施例中，该要求是经标记的生物分子、生物分子、标记、经激活的生物分子、经激活的标记或反应性接头的“简写”名称或其他合适的标识。例如，该要求可包括生物分子名称、标记名称、登录号、序列标识号、缩写探针序列、化学结构或化学文摘服务(CAS)登记号。
如上所述，在输入管理器接收到经标记的生物分子要求之后，主题系统的处理模块鉴定来自存储在存储器中的数据集的与所接收的经标记的生物分子试剂要求的组分相对应的一种或多种存储标识(例如，经标记的生物分子存储标识、生物分子存储标识、标记存储标识、反应性接头存储标识等)。输出管理器输出与所接收的经标记的生物分子试剂要求的每个组分相对应的存储标识。在一些实施例中，每个经标记的生物分子存储标识都显示在监视器上。在一些实施例中，通过在机器中打印(例如，作为条形码)或人类可读格式来输出存储标识。在通过计算机控制的试剂制备装置制备经标记的生物分子试剂的情况下(如下文更详细描述)，输出管理器可操作地联接到试剂制备装置，并且每个存储标识可以电子地传送到试剂制备装置，例如通过互联网协议，包括但不限于SQL、HTML或XML文档、电子邮件或其他文件或其他形式的数据。
取决于所接收的经标记的生物分子要求的数量，输出管理器可以同时输出一种或多种存储标识，例如2种或更多种，例如3种或更多种，例如3种或更多种，例如5种或更多种，例如10种或更多种，例如25种或更多种，例如100种或更多种，并且包括输出500种或更多种存储标识。每组输出的存储标识可以与来自单个用户或来自多个用户的经标记的生物分子要求相对应。
在一些实施例中，输出管理器在显示或打印存储标识之前基于预定标准来组织(例如，组合在一起)存储标识。在一个实例中，输出管理器将来自特定用户的所有存储标识分组在一起。在另一个实例中，输出管理器将所有相同的经标记的生物分子存储标识分组在一起。在又另一个实例中，输出管理器基于生物分子的名称或类型(例如，抗体、寡核苷酸)组织存储标识。在仍另一个实例中，输出管理器基于标记的名称或类型(例如，荧光素、香豆素)组织存储标识。
在一些实施例中，方法包括根据所接收的要求和/或输出的存储标识来制备经标记的生物分子试剂。在一些实施例中，制备经标记的生物分子试剂包括从具有多个经激活的生物分子和多个经激活的标记的存储中选择经激活的生物分子和经激活的标记。每种经标记的生物分子试剂可以例如在实验室中由一个或多个个体手动制备，或者可以如上所述用计算机控制的试剂制备装置(例如高通量制备系统)制备。在一些实施例中，在输出的存储标识是经标记的生物分子存储标识的情况下，方法包括检索来自存储中的与输出的经标记的生物分子存储标识相对应的经标记的生物分子。在这些情况下，方法可以进一步包括根据需要纯化来自存储物的经标记的生物分子或添加一种或多种另外的试剂(例如缓冲液、抗氧化剂等)。在一些实施例中，可以将检索到的经标记的生物分子包装并运输给用户，而不需要进一步纯化或添加到组合物中。
在其他实施例中，经标记的生物分子是通过使与输出的生物分子存储标识相对应的经激活的生物分子与和输出的标记存储标识相对应的经激活的标记接触来制备。可以采用任何便利的反应方案以将经激活的生物分子与经激活的标记混合，只要反应足以在经激活的生物分子的反应性接头和经激活的标记的反应性接头之间形成共价键。在一些实施例中，混合可以包括用磁力搅拌棒搅拌混合物或手动搅拌混合物以及手动(即通过手)或机械(即，通过机械或电动摇动设备)涡旋或搅动混合物。使经激活的生物分子和经激活的标记接触持续一段时间，该持续时间足以将经激活的生物分子与经激活的标记联接，例如持续1分钟或更长时间，例如持续5分钟或更长时间，例如持续10分钟或更长时间并包括持续30分钟或更长时间。
如上所讨论，经激活的生物分子和经激活的标记各自包括反应性接头，当在适当条件下进行时，这些反应性接头一起反应形成化学键，例如像离子键(电荷-电荷相互作用)、非共价键(例如偶极-偶极或电荷-偶极)或共价键。在一些实施例中，经激活的生物分子的反应性接头或部分与经激活的标记的反应性接头或部分反应以产生离子键。在其他实施例中，经激活的生物分子的反应性接头或部分与经激活的标记的反应性接头或部分反应以产生非共价键。在又其他实施例中，经激活的生物分子的反应性接头或部分与经激活的标记的反应性接头或部分反应以产生共价键。在一些实施例中，经激活的生物分子的反应性接头和经激活的标记的反应性接头发生反应以产生共价键。可以使用使得在经激活的生物分子的反应性接头与经激活的标记的反应性接头之间形成共价键的任何便利方案，包括但不限于加成反应、消去反应、取代反应、周环反应、光化学反应、氧化还原反应、自由基反应、通过碳烯中间体的反应、复分解反应以及其他类型的成键反应。在一些实施例中，经激活的生物分子可以通过反应性连接化学与经激活的标记缀合，例如其中反应性接头对包括但不限于：马来酰亚胺/硫醇；硫醇/硫醇；吡啶基二硫醇/硫醇；碘乙酸琥珀酰亚胺酯/硫醇；N-琥珀酰亚胺酯(NHS酯)、磺基二氯苯酚酯(SDP酯)或五氟苯基酯(PFP酯)/胺；双琥珀酰亚胺酯/胺；亚氨酸酯/胺；肼或胺/醛，二醛或苯甲醛；异氰酸酯/羟基或胺；碳水化合物-高碘酸盐/肼或胺；二吖丙因/芳基叠氮化物化学；吡啶基二硫醇/芳基叠氮化物化学；炔/叠氮化物；羧基-碳二亚胺/胺；胺/磺基-SMCC(磺基琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-甲酸酯)/硫醇和胺/BMPH(N-[β-马来酰亚胺基丙酸]酰肼.TFA)/硫醇；叠氮化物/三芳基膦；硝酮/环辛炔；叠氮化物/四嗪和甲酰基苯甲酰胺/肼基-烟酰胺。
在使经激活的生物分子和经激活的标记接触持续足以在每个相应的反应性接头之间形成化学键(例如共价键)的时间之后，可以进一步将经标记的生物分子例如通过微萃取、凝胶电泳、液-液萃取、离心、沉淀、被动或主动透析、或固相色谱(包括但不限于离子交换色谱)、采用反相固定柱的液相色谱、尺寸排阻色谱、高效液相色谱和制备薄层色谱、超滤(具有尺寸截留的膜过滤器)、以及其他纯化方案来纯化。
方法还可以包括对制备好的经标记的生物分子试剂的分析。
分析是指表征经标记的生物分子试剂的化学组成，包括但不限于制备好的试剂组合物中化合物以及存在的任何杂质的量和类型。可以使用任何便利的方案进行对于制备好的经标记的生物分子试剂的分析，例如像通过物理测量(例如质量分析、密度分析、体积分析等)、质谱(例如TOF质谱、电感耦合等离子质谱法)、质谱流式细胞技术、吸收光谱法、荧光光谱法、传导率分析、红外光谱法、紫外可见光谱法、比色法、元素分析和核磁共振光谱法。在一些实施例中，经标记的生物分子的分析是通过质谱进行的。在一些实施例中，经标记的生物分子的分析是通过荧光光谱进行的。在一些实施例中，经标记的生物分子的分析是通过气相色谱进行的。在一些实施例中，经标记的生物分子的分析是通过液相色谱进行的。在一些实施例中，经标记的生物分子的分析是通过元素分析进行的。在一些实施例中，经标记的生物分子试剂的分析是通过气相色谱-质谱进行的。在其他实施例中，经标记的生物分子试剂的分析是通过液相色谱-质谱进行的。例如，装置可以包括分析分离设备，例如液相色谱仪(LC)(包括高效液相色谱仪(HPLC)、快速蛋白质液相色谱仪(FPLC)、微型或纳米液相色谱仪或超高压液相色谱(UHPLC)设备)、毛细管电泳(CE)、或毛细管电泳色谱(CEC)装置。然而，可以使用任何手动或自动注射或分配泵系统。例如，在一些实施例中，可以通过采用纳米泵或微型泵将主题样品应用于LC-MS系统。质谱仪系统可以是任何便利的质谱系统，其通常含有用于离子化样品的离子源、用于分离离子的质量分析器以及检测离子的检测器。在一些实施例中，质谱仪可以是所谓的“串联”质谱仪，其能够分离前体离子、使前体离子片段化、并分析经片段化的前体离子。离子源可依赖于任何类型的电离方法，包括但不限于例如电喷雾电离(ESI)、大气压化学电离(APCI)、电子碰撞(EI)、大气压光电离(APPI)、基质辅助激光解吸电离(MALDI)或电感耦合等离子体(ICP)电离或其任何组合(以提供所谓的“多模”电离源)。在一个实施例中，可以通过EI、ESI或MALDI制备前体离子，并且可以通过碰撞或使用光子将所选择的前体离子片段化以产生随后分析的产物离子。同样，可以采用各种不同的质量分析器中的任何一种，包括飞行时间(TOF)、傅里叶变换离子回旋共振(FTICR)、离子阱、四极杆或双聚焦磁电扇形质量分析器或其任何混合。在一个实施例中，质量分析器可以是扇区、传输四极杆或飞行时间质量分析器。
在制备好经标记的生物分子试剂(以及纯化和分析，如果需要的话)之后，可将每种制备好的经标记的生物分子试剂装载到容器中以用于根据经标记的生物分子要求进行包装和递送(即，运输到发起经标记的生物分子要求的用户那里)。在一些实施例中，将经标记的生物分子试剂在用于使经激活的生物分子与经激活的标记接触的容器中制备好并递送至用户。例如，可以将经标记的生物分子试剂在用于使经激活的生物分子与经激活的标记接触的微管中包装并递送。方法还可以包括将包装好的经标记的生物分子试剂例如通过邮件递送至要求者。
可以将制备好的经标记的生物分子试剂与其他组分一起包装，例如以用于使用或存储经标记的生物分子试剂，所述其他组分包括但不限于缓冲液、注射器、针、微量移液管、载玻片、干燥剂等。此外，包装好的经标记的生物分子试剂还可以包括用于存储和使用经标记的生物分子试剂的说明书。说明书可以记录在合适的记录介质上，例如印刷在纸或塑料上等。说明书可以作为包装插入物存在，例如在容器标签中。在其他实施例中，说明书可以作为存在于合适的计算机可读存储介质例如CD-ROM、SD卡、USB驱动器等上的电子存储数据文件存在。在又其他实施例中，实际说明书不存在于包装中，而是提供了用于从远程来源例如通过互联网获得说明书的方式。此实施例的例子是具有网址的纸或塑料插入物，在网址上可以查看说明书并且/或可以从网址下载说明书。
用于要求并接收经标记的生物分子试剂的方法
本披露的多方面还包括用于要求并接收经标记的生物分子试剂的方法。根据一些实施例的方法包括传送对经标记的生物分子试剂的要求，该经标记的生物分子要求包括以下中的一个或多个：1)经标记的生物分子要求；和2)生物分子要求和标记要求；并接收经标记的生物分子试剂，该经标记的生物分子试剂包括与标记共价键合的生物分子。在一些实施例中，标记要求包括酶要求和底物要求。在实践主题方法时，可以将经标记的生物分子要求通过任何便利的通信协议传送，包括但不限于通过电话、传真、电子邮件或邮寄来传送经标记的生物分子要求。在一些实施例中，经标记的生物分子要求是通过将经标记的生物分子试剂要求输入到计算机上的图形用户界面中例如在互联网网站上来传送。
在一些实施例中，生物分子包括多肽、核酸、多糖、或其任何组合。核酸可以是寡核苷酸、DNA或RNA。多肽可以是蛋白质、酶或蛋白质结合试剂。蛋白质结合试剂可以包括抗体、适配体、或其任何组合。与标记缀合的蛋白质结合试剂能够特异性结合多个蛋白质靶中的至少一个。
在一些实施例中，该多个蛋白质靶包括细胞表面蛋白质、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、抗体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、或其任何组合。多个蛋白质靶可以包括例如10-400种不同的蛋白质靶。生物分子可以选自至少100、1,000或10,000个不同的生物分子。
在一些实施例中，寡核苷酸包括针对生物分子的独特标识。独特标识可以包括长度为25-45个核苷酸的核苷酸序列。独特标识可以选自独特标识的多元组。独特标识的多元组可以包括至少100、1,000或10,000种不同的独特标识。寡核苷酸可以具有选自至少10、100或1,000种不同条形码序列(例如，分子标记序列)的序列。在一些实施例中，该寡核苷酸通过接头与生物分子缀合。该寡核苷酸可以包括接头。该接头可以包括化学基团。该化学基团可以可逆地附接至生物分子。该化学基团可以选自下组，该组由以下组成：UV可光解基团、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、及其任何组合。
独特标识可以与样品的基因组序列不同源。该样品可以是单个细胞、多个细胞、组织、肿瘤样品、或其任何组合。该样品可以是哺乳动物样品、细菌样品、病毒样品、酵母样品、真菌样品、或其任何组合。寡核苷酸可以包括条形码序列(例如，分子标记序列)、聚(A)尾、或其组合。
可以传送一个或多个经标记的生物分子试剂要求，例如传送2个或更多个经标记的生物分子试剂要求，例如5个或更多个，例如10个或更多个，并且包括传送25个或更多个经标记的生物分子试剂要求。在一些实施例中，方法包括传送包括单个生物分子要求和单个标记要求的经标记的生物分子试剂要求。在其他实施例中，经标记的生物分子试剂要求包括单个生物分子要求和多个标记要求。在又其他实施例中，经标记的生物分子试剂要求包括多个生物分子要求和单个标记要求。在再其他实施例中，经标记的生物分子要求包括多个生物分子要求和多个标记要求。在一些实施例中，经标记的生物分子试剂要求包括一个或多个经标记的生物分子要求。在一些实施例中，标记要求包括酶要求和底物要求。
在一些实施例中，将经标记的生物分子试剂要求通过在图形用户界面上，例如在互联网网站上输入要求来传送。图形用户界面可以显示经标记的生物分子、经激活的生物分子、生物分子、经激活的标记、标记和反应性接头的数据库(例如目录)的全部或部分。来自数据库的每个类别可以显示为列表、下拉菜单或其他配置。可以通过将与生物分子和标记相关联的信息或数据输入到适当的文本字段中，或通过选择复选框或从下拉菜单中选择一个或多个项目，或通过使用它们的组合来输入经标记的生物分子试剂要求。
在一个实例中，通过从下拉菜单中选择经标记的生物分子，将经标记的生物分子试剂要求输入到图形用户界面中。在另一个实例中，通过从第一下拉菜单中选择一种或多种生物分子并且从第二下拉菜单中选择一种或多种标记，将经标记的生物分子试剂要求输入到图形用户界面中。在又另一个实例中，通过从第一下拉菜单中选择一种或多种生物分子，从第二下拉菜单中选择一种或多种标记，并且从第三下拉菜单中选择一种或多种反应性接头，将经标记的生物分子试剂要求输入到图形用户界面中。
为了输入经标记的生物分子试剂要求，将与特定经标记的生物分子、生物分子或标记相关联的信息或数据输入到图形用户界面上。输入的信息或数据可以是经标记的生物分子的一个或多个字符(例如字母数字字符)的字符串、符号、图像或其他一种或多种图形表示。在一些实施例中，输入经标记的生物分子、生物分子、标记、经激活的生物分子、经激活的标记或反应性接头的“简写”名称或其他合适的标识。例如，可以输入生物分子名称、标记名称、登录号、序列标识号、缩写探针序列、化学结构或化学文摘服务(CAS)登记号。
在一些实施例中，经标记的生物分子试剂包括多肽，并且要求可以包括如下信息，例如多肽名称、蛋白质名称、酶名称、抗体名称，或者蛋白质、酶或抗体片段的名称，源自特定生物流体(例如，血液、粘液、淋巴液、滑液、脑脊髓液、唾液、支气管肺泡灌洗液、羊水、羊膜脐血、尿液、阴道液和精液)的多肽，源自特定物种的多肽(例如小鼠单克隆抗体)，以及氨基酸序列标识号。在一些实施例中，经标记的生物分子试剂包括生物探针，并且要求包括与特异性结合结构域相关联的信息或数据。
在其他实施例中，经标记的生物分子试剂包括核酸，并且要求可以包括如下信息，例如寡核苷酸名称，由基因名称标识的寡核苷酸，由登录号标识的寡核苷酸，来自特定物种(例如小鼠、人)的基因的寡核苷酸，与特定组织(例如肝、脑、心脏)相关联的基因的寡核苷酸，与特定生理功能(例如凋亡、应激反应)相关联的基因的寡核苷酸，与特定疾病状态(例如癌症、心血管疾病)相关联的基因的寡核苷酸，以及核苷酸序列标识号。
在一些实施例中，用于要求经标记的生物分子的方法还包括完成与经标记的生物分子要求相关的问卷或调查。在这些实施例中，经标记的生物分子的要求者被提示一系列与经标记的生物分子要求相关的问题，或以与经标记的生物分子要求相关的问卷或调查的形式提示。例如，问卷或调查可以包括与经标记的生物分子要求相关的一个问题，例如2个或更多个问题，例如3个或更多个问题，例如4个或更多个问题，并且包括与经标记的生物分子要求相关的5个或更多个问题。问卷调查或调查的内容可以取决于所需的信息而有所不同。例如，问卷或调查中的问题可包括但不限于要求提供要求者的试剂清单的内容，用经标记的生物分子进行的实验的类型，以及使用经标记的生物分子试剂的时间安排。问卷还可以包括用于输入的一个或多个打开的文本字段。例如，问卷可以是一个打开的文本反馈表。
在一些实施例中，方法包括提示要求者在传送经标记的生物分子要求(例如，输入到图形用户界面中)之前完成一系列问题或调查。在其他实施例中，方法包括在完成经标记的生物分子要求之后提示要求者完成一系列问题或调查。在再其他实施例中，在传送经标记的生物分子要求的同时，可以提示要求者与经标记的生物分子要求相关的问题。例如，方法可以包括在传送经标记的生物分子要求时提示要求者关于经标记的生物分子的具体用途(例如正在进行的实验)的问题。
如上所讨论，设计平台可以使用完成的一系列问题或调查，提供对于一种或多种经标记的生物分子、生物分子、经激活的生物分子、标记、经激活的标记或反应性接头的推荐。例如，设计平台可以使用问题或调查的答案来推荐最适合用于与特定分析仪器(例如，流式细胞仪、荧光光谱仪)一起使用或最适合用于经标记的生物分子的预期应用的经标记的生物分子、生物分子、经激活的生物分子、标记、经激活的标记或反应性接头。在一些实施例中，设计平台被配置为使用完成的一系列问题或调查的答案以基于目标密度(例如，细胞上的抗原密度)提供对于经标记的生物分子、生物分子、经激活的生物分子、标记、经激活的标记或反应性接头的推荐。
可以使用与用于传送经标记的生物分子要求相同或不同的方案(例如，电话、传真、电子邮件、独立站的图形用户界面、通过互联网的图形用户界面)传送系列问题或调查的答案。例如，在通过互联网通过图形用户界面传送经标记的生物分子要求时，还可以将系列问题的答案通过图形用户界面例如用下拉菜单或文本字段输入。
根据本披露的实施例的方法还包括接收经标记的生物分子试剂。可以将经标记的生物分子试剂装载在容器中来接收，并且可以与例如用于使用或存储主题组合物的一种或多种辅助组分一起包装。在一些实施例中，将经标记的生物分子试剂与缓冲液、注射器、针、微量移液管、载玻片、干燥剂等一起接收。还可以将包装好的经标记的生物分子试剂与用于存储和使用经标记的生物分子试剂的说明书一起接收，说明书例如印刷在纸、塑料上或在计算机可读介质(例如，CD-ROM、SD卡、USB驱动器)上或作为插入物提供用于从远程来源(例如在互联网上)检索用于存储和使用主题组合物的说明书的说明。
含有多个经激活的生物分子和多个经激活的标记的存储物
本披露的方面还包括含有多个经激活的生物分子和多个经激活的标记的存储物。如上文详细讨论的，主题经标记的生物分子试剂是通过使经激活的生物分子(例如，经激活的蛋白质结合试剂，其中蛋白质结合试剂能够特异性结合蛋白质靶)与经激活的标记(例如，经激活的寡核苷酸，其中寡核苷酸包括与蛋白质结合试剂缀合的该蛋白质结合试剂的独特标识)接触来制备。在一些实施例中，在存储物中的经激活的生物分子是联接至反应性接头的多肽、核酸、多肽或其组合。在一些实施例中，存储物中的经激活的生物分子是与反应性接头联接的生物探针，其中探针包括针对目的分析物如抗体结合剂、蛋白质、肽、半抗原、核酸等的特异性结合结构域。经激活的标记是可以基于例如荧光发射、吸光度、荧光偏振、荧光寿命、荧光波长、吸光度最大值、吸光度波长、斯托克斯位移、光散射、质量、分子量、氧化还原作用、声学、拉曼、磁性、射频、酶促反应(包括化学发光和电化学发光)或其组合可检测的标记物化合物。例如，标记可以是荧光团、发色团、酶、酶底物、催化剂、氧化还原标记、放射性标记、声学标记、拉曼(SERS)标签、质量标签、同位素标签(例如，同位素纯的稀土元素)、磁性颗粒、微颗粒、纳米颗粒、寡核苷酸、或其任何组合。
在一些实施例中，在存储物中的经激活的标记是联接至反应性接头的荧光团。目的荧光团可以包括但不限于适用于分析应用(例如流式细胞术、成像等)的染料，例如吖啶染料、蒽醌染料、芳基甲烷染料、二芳基甲烷染料(例如二苯基甲烷染料)、含叶绿素的染料、三芳基甲烷染料(例如三苯基甲烷染料)、偶氮染料、重氮染料、硝基染料、亚硝基染料、酞菁染料、菁蓝染料、不对称菁蓝染料、醌亚胺染料、吖嗪染料、eurodin染料、番红染料、吲达胺、靛酚染料、氟染料、噁嗪染料，噁嗪酮(oxazone)染料、噻嗪染料、噻唑染料、呫吨染料、芴染料、派洛宁染料、氟染料、罗丹明染料、菲啶染料、以及化合了两种或更多种染料(例如串列)的染料、以及具有一种或多种单体染料单元的聚合物染料以及两种或更多种染料的混合物。例如，荧光团可以是4-乙酰胺基-4′-异硫氰酰芪-2,2′二磺酸；吖啶和衍生物如吖啶、吖啶橙、吖啶黄、吖啶红和吖啶异硫氰酸酯；别藻蓝素、藻红蛋白、多甲藻素-叶绿素蛋白、5-(2′-氨乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)；4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘二甲酰亚胺-3,5二磺酸盐(荧光黄VS)；N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺；邻氨基苯甲酰胺；亮黄；香豆素和衍生物，例如香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，香豆素120)、7-氨基-4-三氟甲基香豆素(氯杀鼠灵151)；菁蓝和衍生物例如玫瑰红、Cy3、Cy5、Cy5.5、和Cy7；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)；5′,5”-二溴邻苯三酚磺酞(溴邻苯三酚红)；7-二乙氨基-3-(4′-异硫氰酰苯基)-4-甲基香豆素；二乙氨基香豆素；二乙烯三胺五醋酸盐；4,4′-二异硫氰酰二氢-茋-2,2′-二磺酸；4,4′-二异硫氰酰茋-2,2′-二磺酸；5-[二甲氨基]萘-1-磺酰氯(DNS、丹磺酰氯)；4-(4′-二甲氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)；4-二甲氨基苯基偶氮苯基-4′-异硫氰酸酯(DABITC)；曙红和衍生物，例如曙红和曙红异硫氰酸酯；藻红和衍生物，例如藻红B和藻红异硫氰酸酯；乙锭；荧光素和衍生物，例如5-羧基荧光素(FAM)、5-(4,6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF)、2′7′-二甲氧基-4′5′-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、荧光素异硫氰酸酯(FITC)、荧光素氯三嗪基、萘并荧光素、和QFITC(XRITC)；荧胺；IR144；IR1446；绿色荧光蛋白(GFP)；造礁珊瑚荧光蛋白(RCFP)；LissamineTM；丽丝胺罗丹明、荧光黄；孔雀绿异硫氰酸酯；4-甲基伞形酮；邻位甲酚酞；硝基酪氨酸；副品红；尼罗红；俄勒冈绿；酚红；B-藻红蛋白；o-邻苯二甲醛；芘和衍生物，例如芘、芘丁酸酯和琥珀酰亚胺基1-芘丁酸酯；活性红4(CibacronTM亮红3B-A)；罗丹明和衍生物，例如6-羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基罗丹明(R6G)、4,7-二氯罗丹明丽丝胺、罗丹明B磺酰氯、罗丹明(Rhod)、罗丹明B、罗丹明123、罗丹明X异硫氰酸酯、磺基罗丹明B、磺基罗丹明101、磺基罗丹明101的磺酰氯衍生物(德克萨斯红)、N,N,N′,N′-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、四甲基罗丹明、和四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)；核黄素；玫红酸和铽配合物衍生物；呫吨；染料缀合的聚合物(即附接聚合物的染料)，例如异硫氰酸荧光素-葡聚糖；以及化合了两种或更多种前述染料(例如串列)的染料、具有一种或多种单体染料单元的聚合物染料以及两种或更多种前述染料的混合物。
在一些实施例中，荧光团(即染料)是荧光聚合物染料。可用于主题方法和系统的荧光聚合物染料是各种各样的。在该方法的一些实施例中，聚合物染料包括缀合聚合物。
缀合的聚合物(CP)的特征在于离域电子结构，该结构包括具有交替的不饱和键(例如双键和/或三键)和饱和键(例如单键)的骨架，其中π电子可以从一个键移动到另一个键。这样，缀合的骨架可以在聚合物染料上赋予延长的线性结构，聚合物的重复单元之间具有有限的键角。例如，蛋白质和核酸虽然也是聚合物，但在一些情况下不形成延长杆状结构，而是折叠成更高级的三维形状。此外，CP可形成“刚性杆”状聚合物骨架，并沿着聚合物骨架链经历单体重复单元之间有限的扭曲(例如，扭转)角。在一些实施例中，聚合物染料包括具有刚性杆状结构的CP。如上所概述，聚合物染料的结构特征可影响分子的荧光特性。
可以在主题方法和系统中使用任何便利的聚合物染料。在一些实施例中，聚合物染料是一种多发色团，该多发色团具有能够集光以放大荧光团的荧光输出的结构。在一些实施例中，聚合物染料能够集光并将其高效转化为更长波长的发射光。在一些实施例中，聚合物染料具有能够将能量高效地转移到附近发光物质(例如“信号传导发色团”)的集光多发色团系统。能量转移机制包括例如共振能量转移(例如，Forster(或荧光)共振能量转移，FRET)、量子电荷交换(Dexter能量转移)等。在一些实施例中，这些能量转移机制是相对较短的范围；也就是说，集光多发色团系统与信号传导发色团的紧密接近提供了高效的能量转移。在高效能量转移的条件下，当集光多发色团系统中各发色团的数量较大时，从信号传导发色团的发射发生放大；也就是说，相比当信号传导发色团直接被泵浦光激发时，入射光(“激发光”)处于被集光多发色团系统吸收的波长时，从信号传导发色团的发射更强烈。
多发色团可以是缀合的聚合物。缀合的聚合物(CP)的特征在于离域电子结构，并且可用作针对化学和生物靶的高响应性光学报告物。由于有效缀合长度比聚合物链的长度短得多，所以骨架中含有大量很靠近的缀合的区段。因此，缀合的聚合物可高效集光，并通过能量转移实现光学放大。
在一些实施例中，聚合物可以用作直接荧光报告物，例如具有高消光系数、高亮度等的荧光聚合物。在一些实施例中，聚合物可以用作强发色团，其中颜色或光密度用作指标。
目的聚合物染料包括但不限于由Gaylord等人在美国专利号20040142344、20080293164、20080064042、20100136702、20110256549、20120028828、20120252986和20130190193(其披露内容通过引用以其整体特此结合)；和Gaylord等人,J.Am.Chem.Soc.[美国化学会志],2001,123(26),第6417-6418页；Feng等人,Chem.Soc.Rev.[化学学会评论],2010,39,2411-2419；和Traina等人,J.Am.Chem.Soc.[美国化学会志],2011,133(32),第12600-12607页(其披露内容通过引用以其整体特此结合)中描述的那些染料。
在一些实施例中，聚合物染料包括含有形成缀合系统的多个第一光学活性单元的缀合的聚合物，该缀合系统具有第一光学活性单元吸收光以形成激发态的第一吸收波长(例如，如本文所述的)。缀合的聚合物(CP)可以是聚阳离子、聚阴离子和/或带中性电荷的缀合的聚合物。
CP可以是水溶性的，以便在生物样品中使用。在聚合物染料中可包括任何便利的取代基以提供增加的水溶性，例如亲水性取代基(例如亲水性聚合物)或带电荷的取代基(例如在水性溶液中(例如在生理条件下)带正电荷或负电荷的基团)。任何便利的水溶性基团(WSG)都可用于主题集光多发色团。术语“水溶性基团”是指在水性环境中很好溶剂化并且赋予与其附接的分子改进的水溶性的官能团。在一些实施例中，与缺乏WSG的多发色团相比，WSG增加多发色团在主要为水性的溶液(例如如本文所述的)中的溶解度。水溶性基团可以是在水性环境中很好溶剂化的任何便利的亲水基团。在一些实施例中，亲水性水溶性基团是带电的，例如带正电荷或带负电荷或带两性离子。在一些实施例中，亲水性水溶性基团是中性亲水基团。在一些实施例中，WSG是亲水性聚合物，例如聚乙二醇、纤维素、壳聚糖或其衍生物。
如本文使用的，术语“聚环氧乙烷”、“PEO”、“聚乙二醇”和“PEG”可互换使用，并且是指包括由化学式-(CH2-CH2-O-)n-描述的链的聚合物或其衍生物。在一些实施例中，“n”是5000或更少，如1000或更少、500或更少、200或更少、100或更少、50或更少、40或更少、30或更少、20或更少、15或更少，如5至15或10至15。应理解的是，PEG聚合物可以具有任何便利的长度，并且可以包括各种末端集团，这些末端集团包括但不限于烷基、芳基、羟基、氨基、酰基、酰氧基和酰胺基末端集团。可以被适配为用于在主题多发色团中使用的官能化PEG包括由S.Zalipsky在“Functionalized poly(ethylene glycol)for preparation ofbiologically relevant conjugates[用于制备生物相关缀合物的官能化聚乙二醇]”,Bioconjugate Chemistry[生物缀合化学]1995,6(2),150-165中描述的那些PEG。目的水溶性基团包括但不限于羧酸盐、膦酸盐、磷酸盐、磺酸盐、硫酸盐、亚磺酸盐、酯、聚乙二醇(PEG)和经修饰的PEG、羟基、胺、铵、胍鎓、多胺和锍、多元醇、直链或环状糖类、伯胺、仲胺、叔胺或季胺和多胺、膦酸盐基团、次膦酸盐基团、抗坏血酸盐基团、二醇(包括聚醚、-COOM′、-SO3M′、-PO3M′、-NR3、Y′、(CH2CH2O)pR)及其混合物，其中Y′可以是任何卤素、硫酸根、磺酸根或含氧阴离子，p可以是1至500，每个R可以独立地是H或烷基(如甲基)，并且M′可以是阳离子平衡离子或氢、-(CH2CH2O)yyCH2CH2XRyy-、-(CH2CH2O)yyCH2CH2X-、-X(CH2CH2O)yyCH2CH2--、二醇和聚乙二醇，其中yy选自1至1000，X选自O、S和NRZZ，并且RZZ和RYY独立地选自H和C1-3烷基。
聚合物染料可以具有任何便利的长度。在一些实施例中，聚合物染料的单体重复单元或区段的具体数量可以落在2至500,000的范围内，例如2至100,000、2至30,000、2至10,000、2至3,000或2至1,000个单元或区段，或例如100至100,000、200至100,000、或500至50,000个单元或区段。在一些实施例中，聚合物染料的单体重复单元或区段的数量在2至1000个单元或区段的范围内，例如2至750个单元或区段，例如2至500个单元或区段，例如2至250个单元或区段，例如2至150个单元或区段，例如2至100个单元或区段，例如2至75个单元或区段，例如2至50个单元或区段，并且包括2至25个单元或区段。
聚合物染料可具有任何便利的分子量(MW)。在一些实施例中，聚合物染料的MW可以表示为平均分子量。在一些实施例中，聚合物染料具有从500至500,000，如从1,000至100,000、从2,000至100,000、从10,000至100,000的平均分子量，或甚至从50,000至100,000的平均分子量。在一些实施例中，聚合物染料具有70,000的平均分子量。
聚合物染料可以具有一种或多种令人希望的光谱特性，如特定的最大吸收波长、特定的最大发射波长、消光系数、量子产率等。
在一些实施例中，聚合物染料具有在280和850nm之间的吸收曲线。在一些实施例中，聚合物染料具有在280至850nm范围内的最大吸收。在一些实施例中，聚合物染料吸收波长在280至850nm范围内的入射光，其中目的最大吸收的具体实例包括但不限于：348nm、355nm、405nm、407nm、445nm、488nm、640nm和652nm。在一些实施例中，聚合物染料具有选自下组的范围内的最大吸收波长，该组由以下组成：280-310nm、305-325nm、320-350nm、340-375nm、370-425nm、400-450nm、440-500nm、475-550nm、525-625nm、625-675nm和650-750nm。在一些实施例中，聚合物染料具有348nm的最大吸收波长。在一些实施例中，聚合物染料具有355nm的最大吸收波长。在一些实施例中，聚合物染料具有405nm的最大吸收波长。在一些实施例中，聚合物染料具有407nm的最大吸收波长。在一些实施例中，聚合物染料具有445nm的最大吸收波长。在一些实施例中，聚合物染料具有488nm的最大吸收波长。在一些实施例中，聚合物染料具有640nm的最大吸收波长。在一些实施例中，聚合物染料具有652nm的最大吸收波长。
在一些实施例中，聚合物染料具有范围从400至850nm(如415至800nm)的最大发射波长，其中目的最大发射的具体实例包括但不限于：395nm、421nm、445nm、448nm、452nm、478nm、480nm、485nm、491nm、496nm、500nm、510nm、515nm、519nm、520nm、563nm、570nm、578nm、602nm、612nm、650nm、661nm、667nm、668nm、678nm、695nm、702nm、711nm、719nm、737nm、785nm、786nm、805nm。在一些实施例中，聚合物染料具有选自下组的范围内的最大发射波长，该组由以下组成：380-400nm、410-430nm、470-490nm、490-510nm、500-520nm、560-580nm、570-595nm、590-610nm、610-650nm、640-660nm、650-700nm、700-720nm、710-750nm、740-780nm和775-795nm。在一些实施例中，聚合物染料具有395nm的最大发射。在一些实施例中，聚合物染料具有421nm的最大发射波长。在一些实施例中，聚合物染料具有478nm的最大发射波长。在一些实施例中，聚合物染料具有480nm的最大发射波长。在一些实施例中，聚合物染料具有485nm的最大发射波长。在一些实施例中，聚合物染料具有496nm的最大发射波长。在一些实施例中，聚合物染料具有510nm的最大发射波长。在一些实施例中，聚合物染料具有570nm的最大发射波长。在一些实施例中，聚合物染料具有602nm的最大发射波长。在一些实施例中，聚合物染料具有650nm的最大发射波长。在一些实施例中，聚合物染料具有711nm的最大发射波长。在一些实施例中，聚合物染料具有737nm的最大发射波长。在一些实施例中，聚合物染料具有750nm的最大发射波长。在一些实施例中，聚合物染料具有786nm的最大发射波长。在一些实施例中，聚合物染料具有421nm±5nm的最大发射波长。在一些实施例中，聚合物染料具有510nm±5nm的最大发射波长。在一些实施例中，聚合物染料具有570nm±5nm的最大发射波长。在一些实施例中，聚合物染料具有602nm±5nm的最大发射波长。在一些实施例中，聚合物染料具有650nm±5nm的最大发射波长。在一些实施例中，聚合物染料具有711nm±5nm的最大发射波长。在一些实施例中，聚合物染料具有786nm±5nm的最大发射波长。在一些实施例中，聚合物染料具有选自下组的最大发射，该组由以下组成：421nm、510nm、570nm、602nm、650nm、711nm和786nm。
在一些实施例中，聚合物染料具有1 x 106cm-1M-1或更大，例如2 x 106cm-1M-1或更大、2.5 x 106cm-1M-1或更大、3 x 106cm-1M-1或更大、4 x 106cm-1M-1或更大、5 x 106cm-1M-1或更大、6 x 106cm-1M-1或更大、7 x 106cm-1M-1或更大、或8 x 106cm-1M-1或更大的消光系数。在一些实施例中，聚合物染料具有如下量子产率：0.05或更高，例如0.1或更高、0.15或更高、或更高、0.25或更高、0.3或更高、0.35或更高、0.4或更高、0.45或更高、0.5或更高、0.6或更高、0.7或更高、0.8或更高、0.9或更高、0.95或更高、0.99或更高，且包括0.999或更高。例如，目的聚合物染料的量子产率范围可以是从0.05至1，例如从0.1至0.95，例如从0.15至0.9，例如从0.2至0.85，例如从0.25至0.75，例如从0.3至0.7，且包括从0.4至0.6的量子产率。在一些实施例中，聚合物染料具有0.1或更高的量子产率。在一些实施例中，聚合物染料具有或更高的量子产率。在一些实施例中，聚合物染料具有0.5或更高的量子产率。在一些实施例中，聚合物染料具有0.6或更高的量子产率。在一些实施例中，聚合物染料具有0.7或更高的量子产率。在一些实施例中，聚合物染料具有0.8或更高的量子产率。在一些实施例中，聚合物染料具有0.9或更高的量子产率。在一些实施例中，聚合物染料具有0.95或更高的量子产率。在一些实施例中，聚合物染料具有1 x 106或更大的消光系数和0.3或更高的量子产率。在一些实施例中，聚合物染料具有2 x 106或更大的消光系数和0.5或更高的量子产率。
在一些实施例中，该标记包括荧光团、发色团、多肽、蛋白质、酶、酶底物、催化剂、氧化还原标记、放射性标记、声学标记、拉曼(SERS)标签、质量标签、同位素标签、磁颗粒、微颗粒、纳米颗粒、寡核苷酸、或其任何组合。在一些实施例中，标记包括酶、酶底物或其组合，并且其中该酶能够将酶底物修饰成相应的修饰的酶底物。
在一些实施例中，酶底物与对应的经修饰的酶底物具有至少一个官能团的差异。该至少一个官能团可以是烷基、烯基、炔基、苯基、苄基、卤基、氟、氯、溴、碘、羟基、羰基、醛、卤代甲酰基、碳酸酯、羧酸根、羧基、酯、甲氧基、氢过氧基、过氧基、醚、半缩醛、半缩酮、乙缩醛、缩酮、乙缩醛、原酸酯、亚甲基二氧基、原碳酸酯、甲酰胺、伯胺、仲胺、叔胺、4°铵、伯氯胺酮、仲氯胺酮、伯醛亚胺、仲醛亚胺、酰亚胺、叠氮基、偶氮基、二酰亚胺、氰酸酯、异氰酸酯、硝酸酯、腈、异腈、亚硝基氧基、硝基、亚硝基、吡啶基、巯基、硫醚、二硫醚、亚磺酰基、磺酰基、亚磺基、磺基、硫氰酸酯、异硫氰酸酯、碳硫酮、碳硫醛、膦基、膦酰基、磷酸酯、磷酸二酯、二羟硼基、硼酸酯、亚二羟硼基、亚硼酸酯、或其任何组合。
在一些实施例中，酶包括甲基转移酶、糖苷水解酶、琼脂水解酶、氨酸酶、淀粉酶、乙糖苷酶、卡拉胶酶、纤维素酶、神经酰胺酶、几丁质酶、脱乙酰几丁质酶、柠檬酸酶、葡聚糖酶、糊精酶、果糖苷酶、岩藻多糖酶、墨角藻糖苷酶、呋喃糖苷酶、半乳糖苷酶、半乳糖醛酸酶、葡聚糖酶、葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、葡萄糖苷酸酶、糖水解酶、糖苷酶、己糖苷酶、水解酶、艾杜糖醛酸酶、肌苷酶、菊粉酶、乳糖酶、果聚糖酶、地衣多糖酶、连接酶、裂解酶、溶菌酶、麦芽糖苷酶、麦芽糖壳三糖酶、甘露二糖苷酶、甘露糖苷酶、胞壁酸酶、辛糖酸酶、辛糖酸水解酶、樱草苷酶、蛋白酶、支链淀粉酶、鼠李糖苷酶、糖胺酶、唾液酸酶、合酶、转移酶、海藻糖酶、turonidase、turonosidase、木聚糖酶、木糖苷酶、或其组合。
在一些实施例中，酶底物包括6-巯基嘌呤、纤维二糖、纤维四糖、木四糖、异樱草糖、β-D-龙胆二糖、木葡聚糖和甘露三糖、琼脂糖、胺酸、淀粉、寡糖、多糖、纤维素、神经酰胺、几丁质、壳聚糖、右旋糖、糊精、果糖、岩藻多糖、岩藻糖、呋喃糖苷、半乳糖苷、葡聚糖、吡喃葡萄糖苷、葡萄糖苷、葡萄糖醛酸、葡糖苷酸、葡萄糖、糖苷、糖胺聚糖、己糖苷、菊粉、乳糖、levanose、脂多糖、甘露糖、麦芽糖苷、麦芽三糖苷、甘露糖、辛基酮糖酸、寡糖、果胶酸酯、果胶、肽、聚半乳糖醛酸、多核苷酸、支链淀粉、鼠李糖苷、木聚糖、或其任何组合。
在实施例中，用于根据经标记的生物分子试剂要求制备经标记的生物分子试剂的经激活的生物分子和经激活的标记是从存储物获得。存储物可以具有10种或更多种不同的经激活的生物分子，例如25种或更多种，例如50种或更多种，例如100种或更多种，例如250种或更多种，例如500种或更多种，并且包括1000种或更多个经激活的生物分子。在一个实例中，存储物包括10种或更多种不同的经激活的寡核苷酸，例如25种或更多种，例如50种或更多种，例如100种或更多种，例如250种或更多种，例如500种或更多种，并且包括1000种或更多种经激活的寡核苷酸。在另一个实例中，存储物包括10种或更多种不同的经激活的多肽，例如25种或更多种，例如50种或更多种，例如100种或更多种，例如250种或更多种，例如500种或更多种，并且包括1000种或更多种经激活的多肽。
存储物还可以包括10种或更多种不同的经激活的标记，例如15种或更多种，例如20种或更多种，例如30种或更多种，例如40种或更多种，并且包括50种或更多种不同的经激活的标记。
多个经激活的生物分子和经激活的标记中的每一个可以存在于在任何适合的容器中的存储物中，该容器能够存储并在需要时提供经激活的生物分子或经激活的标记。在一些实施例中，将多种不同的经激活的生物分子和多种不同的经激活的标记存储在分隔成单独试剂室的单个贮存器中。在其他实施例中，多种不同的经激活的生物分子和多种不同的经激活的标记中的每一个被存储在单独的容器(例如瓶、罐等)中。在又其他实施例中，多种不同的经激活的生物分子和多种不同的经激活的标记中的每一个被存储在多个小瓶中，其中每个小瓶包括每个经激活的生物分子和每个经激活的标记的预先测量的等分试样。存储物中的每个容器还可以包括标识经激活的生物分子或经激活的标记的组分的标记(例如，生物分子、标记和反应性接头的名称、结构、CAS登记号、登录号、探针序列等)。标记还可以包括一种或多种机器可读组分，例如快速响应(QR)码或条形码。
在一些实施例中，存储物还包括可用的经激活的生物分子和经激活的标记的数据库。该数据库可以是纸质或电子形式的印刷目录，或可以是可检索的电子数据库，例如可通过关键词、化学结构、登录号、单体序列(如氨基酸或核苷酸序列)或CAS化学注册号检索的。
实用性
主题系统和方法可用于制备复杂的生物试剂(例如，与可检测标记物联接的生物大分子)，这种制备是一种当大规模进行时通常耗费时间、经济上效率低下并且非常耗费密集劳力的过程。本披露提供用于跨广泛生物分子和可检测标记集来交付高质量和性能特异性产品的快速、高效和高度可规模化的过程。
本文描述的系统和方法还提供了一种用以要求并提供定制生物试剂的独特新方法。除了能够从广泛的数据库(例如，在线数据库)中选择预先合成的试剂，主题系统和方法还提供用户定制，其中用户可以按需创建任何期望的经标记的生物分子。通过在易用的图形界面上简单选择生物大分子和可检测标记物，用户可以要求在各种不同的研究应用和医学诊断中使用的任何经标记的生物分子。
本披露还提供了获得大量复杂生物试剂的途径，通过小规模合成制备这些是不可能的。主题系统和方法是可规模化的，有助于按需制备成千上万的生物分子和可检测标记物的不同组合。在一些实施例中，主题系统提供完全自动化的方案，使得定制的可检测生物分子探针的制备几乎不需要人类输入。
本披露还用于可以希望将来自生物样品的细胞分析用于研究、实验室测试或用于治疗的应用中。在一些实施例中，主题方法和系统可以有助于分析从流体或组织样品(例如用于疾病如癌症的样本)获得的细胞。与使用从头合成的探针组合物相比，本披露的方法和系统还允许以增强的效率和低成本分析来自生物样品(例如器官、组织、组织片段、流体)的细胞。
实例
以上讨论的实施例的一些方面在以下实例中进一步详细披露，其不是旨在以任何方式限制本披露的范围。
实例1
与蛋白质结合试剂缀合的寡核苷酸
该实例表明设计可以与蛋白质结合试剂缀合的寡核苷酸。可以将这些寡核苷酸用于同时确定蛋白质表达和基因表达。
95mer寡核苷酸设计
将以下方法用于生成候选寡核苷酸序列和相应的引物序列用于同时确定蛋白质表达和基因表达。
1.序列生成和消除
将以下方法用于生成用于同时确定蛋白质表达和基因表达的候选寡核苷酸序列。
1a.随机生成许多具有所需长度(45bps)的候选序列(50,000个序列)。
1b.将转录调控LSRR序列附接在所生成的序列的5’末端，并且将聚(A)序列(25bps)附接在所生成的序列的3’末端。
1c.去除所生成并附接的不具有在40％至50％范围内的GC含量的序列。
1d.去除各自具有一个或多个发夹结构的剩余序列。
剩余候选寡核苷酸序列的数量是423。
2.引物设计
将以下方法用于设计针对剩余423个候选寡核苷酸序列的引物。
2.1 N1引物：使用通用N1序列：GTTGTCAAGATGCTACCGTTCAGAG(LSRR序列；SEQ IDNO.5)作为N1引物。
2.2 N2引物(用于扩增具体的抗体寡核苷酸；例如，图18中的N2引物)：
2.2a.去除不从N1序列下游开始的候选N2引物。
2.2b.去除与候选寡核苷酸序列的最后35bps重叠的候选N2引物。
2.2c.使用寡核苷酸(例如，人转录组或小鼠转录组)去除与正在被研究的细胞种类的转录组对齐的引物候选物。
2.2d.使用ILR2序列作为默认对照(ACACGACGCTCTTCCGATCT)以最小化或避免引物-引物相互作用。
在423个候选寡核苷酸序列中，设计针对390个候选序列的N2引物。
3.筛选
将以下方法用于筛选剩余390个候选引物序列。
3a.消除具有以As结尾的随机序列的任何候选寡核苷酸序列(即聚(A)序列的有效长度大于25bps)，以使聚(A)尾对于所有条形码保持相同的长度。
3b.消除具有4个或更多个连续Gs(>3Gs)的任何候选寡核苷酸序列，因为Gs运行的寡核苷酸合成中的额外成本和潜在较低的产率。
图18图(a)示出了使用以上方法生成的非限制性示例性候选寡核苷酸序列。
200mer寡核苷酸设计
将以下方法用于生成候选寡核苷酸序列和相应的引物序列用于同时确定蛋白质表达和基因表达。
1.序列生成和消除
将以下用于生成用于同时确定蛋白质表达和基因表达的候选寡核苷酸序列。
1a.随机生成许多具有所需长度(128bps)的候选序列(100,000个序列)。
1b.将转录调控LSRR序列和另外的非人类、非小鼠锚定序列附接在所生成的序列的5’末端，并且将聚(A)序列(25bps)附接在所生成的序列的3’末端。
1c.去除所生成并附接的不具有在40％至50％范围内的GC含量的序列。
1d.基于发夹结构得分分选剩余的候选寡核苷酸序列。
1e.选择具有最低发夹得分的1,000个剩余的候选寡核苷酸序列。
2.引物设计
将以下方法用于设计针对具有最低发夹得分的400个候选寡核苷酸序列的引物。
2.1 N1引物：使用通用N1序列：GTTGTCAAGATGCTACCGTTCAGAG(LSRR序列；SEQ IDNO.5)作为N1引物。
2.2 N2引物(用于扩增具体的抗体寡核苷酸；例如，图18中的N2引物)：
2.2a.去除不从N1序列的下游23nts开始的候选N2引物(该锚定序列在所有候选寡核苷酸序列中是通用的)。
2.2b.去除在靶序列的最后100bps重叠的候选N2引物。所得引物候选物可以在靶序列的第48个核苷酸和第100个核苷酸之间。
2.2c.使用寡核苷酸(例如，人转录组或小鼠转录组)去除与正在被研究的细胞种类的转录组对齐的引物候选物。
2.2d.使用ILR2序列作为默认对照(ACACGACGCTCTTCCGATCT)以最小化或避免引物-引物相互作用。
2.2e.去除在靶序列的最后100bps重叠的N2引物候选物。
在400个候选寡核苷酸序列中，设计针对392个候选序列的N2引物。
3.筛选
将以下用于筛选剩余392个候选引物序列。
3a.消除具有以As结尾的随机序列的任何候选寡核苷酸序列(即聚(A)序列的有效长度大于25bps)，以使聚(A)尾对于所有条形码保持相同的长度。
3b.消除具有4个或更多个连续Gs(>3Gs)的任何候选寡核苷酸序列，因为Gs运行的寡核苷酸合成中的额外成本和潜在较低的产率。
图18图(b)示出了使用以上方法生成的非限制性示例性候选寡核苷酸序列。图18图(b)中示出的巢式N2引物可以与抗体序列结合用于靶向扩增。图18图(c)示出了具有与锚定序列相对应的用于靶向扩增的巢式通用N2引物的相同非限制性示例性候选寡核苷酸序列。图18图(d)示出了具有用于一步靶向扩增的N2引物的相同的非限制性示例性候选寡核苷酸序列。
总之，这些数据表明可以设计不同长度的寡核苷酸序列用于同时确定蛋白质表达和基因表达。这些寡核苷酸序列可以包括通用引物序列、抗体特异性寡核苷酸序列、和聚(A)序列。
实例2
对不同抗体:寡核苷酸比率情况下的检测灵敏度的比较
该实例表明使用与1、2、或3个寡核苷酸缀合的抗CD4抗体，CD4蛋白质的检测灵敏度。
将受试者的冷冻的外周血单核细胞(PBMC)解冻。将解冻的PBMC用三种类型的抗CD4抗体以0.06μg/100μl(寡核苷酸-缀合的抗体储备液的1:333稀释物)在室温下染色20分钟。抗CD4抗体类型中的每一种与1、2、或3个寡核苷酸缀合(“抗体寡核苷酸”)。抗体寡核苷酸的序列示出在图19中。洗涤细胞以去除未结合的抗CD4抗体。将这些细胞用钙黄绿素AM(BD(富兰克林湖(Franklin Lake)，新泽西))和Draq7TM(Abcam(剑桥，英国))染色用于使用流式细胞术进行分选以获得活细胞。将这些细胞进行洗涤以去除过量的钙黄绿素AM和Draq7TM。使用流式细胞术，将钙黄绿素AM(活细胞)而不是Draq7TM(非死细胞或透化细胞)染色的单个细胞分选进入BD ResolveTM筒中。
在含有单个细胞和珠的孔中，孔中的3500个单个细胞在含有5mM DTT的裂解缓冲液中裂解。使用BD ResolveTM珠确定CD4mRNA表达谱。使用BD ResolveTM珠和抗体寡核苷酸确定CD4蛋白质表达谱。简言之，细胞裂解后释放mRNA分子。ResolveTM珠与随机条形码相关联，这些随机条形码各自含有分子标记、细胞标记、和聚T区。从裂解的细胞释放mRNA分子的聚(A)区与随机条形码的聚T区杂交。寡核苷酸的聚(A)区与随机条形码的聚T区杂交。使用随机条形码将mRNA分子逆转录。使用随机条形码复制抗体寡核苷酸。在一个样品等分试样中同时发生逆转录和复制。
使用引物(使用血液组N1引物确定488个血液组基因的mRNA表达谱，并且使用抗体寡核苷酸N1引物(“PCR 1”)确定CD4蛋白质的表达谱)将逆转录产物和复制产物在60度退火温度下PCR扩增15个循环。用Ampure清理去除过量的随机条形码。将来自PCR1的产物分成两个等分试样，使用血液组N2引物确定其中一个等分试样的488个血液组基因的mRNA表达谱，并且使用抗体寡核苷酸N2引物(“PCR 2”)确定另一个等分试样的CD4蛋白质的表达谱。在60度退火温度下将两个等分试样PCR扩增15个循环。如图19(“PCR 2”)中的说明，基于抗体寡核苷酸确定在裂解的细胞中CD4蛋白质的表达。测序适配子连接(“PCR3”)后获得测序数据并进行分析。基于488个血液组基因的表达谱确定细胞类型。
图20图(a)-(f)是非限制性示例性t-分布随机邻接嵌入(tSNE)投影图，这些tSNE投影图显示了使用寡核苷酸缀合的抗体以高通量方式同时测量CD4蛋白表达和基因表达的结果。在与1、2、或3个抗体寡核苷酸缀合的抗CD4抗体的情况下，表达CD4的细胞类型(例如，CD4T细胞)中明显且有力地检测CD4蛋白质表达(分别是图20图(b)、(d)、和(f))。图21，图(a)-(f)是显示在CD4T细胞(高CD4表达)、CD8T细胞(最低CD4表达)、和髓样细胞(一些CD4表达)中CD4mRNA和蛋白质表达的非限制性示例性条形图。在相似测序深度情况下，CD4蛋白质水平的检测灵敏度随着抗体:寡核苷酸的比率增加而增加，其中1:3比率表现优于1:1和1:2比率(图22)。如图23图(a)-(d)显示，使用FlowJo(FlowJo(Ashland，OR))确认在使用流式细胞术分选的细胞的细胞表面上CD4蛋白质的表达。图24图(a)-(f)是显示两个样品的CD4T细胞、CD8T细胞、和髓样细胞中CD4mRNA和CD4蛋白质表达的非限制性示例性条形图。使用两种不同样品的制备方案制备第二样品。图25是显示使用不同样品制备方案确定的CD4蛋白质水平的检测灵敏度的非限制性示例性条形图，其中抗体:寡核苷酸比率为1:3。
总之，这些数据表明基于与抗CD4抗体缀合的寡核苷酸可以明显且有力地检测CD4蛋白质表达。CD4蛋白质水平的检测灵敏度可以随着更高的抗体:寡核苷酸比率而增加。
实例3
热抗体:冷抗体滴定
该实例表明确定寡核苷酸-缀合的抗体(“热抗体”)和不与寡核苷酸缀合的抗体(“冷抗体”)的比率，使得这些抗体寡核苷酸占测序数据中总读数的所希望的百分比(例如，2％)。
用PE缓冲液将抗CD147抗体储备液按1:20、1:100、1:200、1:300、1:400、1:600、1:800、和1:1000稀释液进行稀释。在室温下，将100μl染色缓冲液(FBS)中(BD(富兰克林湖(Franklin Lake)，新泽西))的大约150,000个Jurkat细胞在各种抗体稀释液中染色20分钟。染色后，用500μl染色缓冲液将这些细胞洗涤一次，并重悬浮于200μl中用于测量荧光强度。将MuseTM Autophagy LC3-抗体(EMD密理博公司(EMD Millipore)(比勒利卡(Billerica)，马萨诸塞州))用于检测与Jurkat细胞结合的抗CD147抗体。测量并比较在各种抗CD147抗体稀释液中染色的细胞或未被染色的细胞的荧光强度，从而确定抗体的最佳稀释(图26A-26C)。荧光强度随着稀释的增加而增加。在1:800的稀释比率情况下超过99％的细胞被染色。荧光信号在1:800处开始下降。将细胞染色至饱和直至稀释比率为1:200。将细胞染色接近饱和直至稀释比率为1:400。
图27显示了用于确定寡核苷酸-缀合的抗体的染色浓度使得抗体寡核苷酸占测序数据中总读数的所需百分比的非限制性示例性实验设计。按1:3(“热抗体”)的抗体:寡核苷酸比率将抗CD147抗体与可切割的95mer抗体寡核苷酸缀合。使用pH 7.5稀释液，按1:100比率或按1:800比率稀释热抗体。使用9μl冷抗CD147抗体和1μl热抗体制备10％热抗体:90％冷抗体的混合物。使用9μl冷抗CD147抗体以及1μl的10％热抗体:90％冷抗体的混合物制备1％热抗体:90％冷抗体的混合物。
在具有1:100稀释的储备液(其具有100％热抗体(1％的储备热抗体)、10％热抗体:90％冷抗体(0.1％的储备热抗体)的混合物、1％热抗体:99％冷抗体(0.01％的储备热抗体)的混合物)和1:800稀释的储备液(其具有100％热抗体(0.0125％的储备热抗体)的100μl染色缓冲液(FBS)中，对具有大约50万个细胞的解冻的外周血单核细胞(PBMC)进行染色。染色后，洗涤细胞以去除未结合的抗体分子。将这些细胞用钙黄绿素AM和Draq7TM染色用于使用流式细胞术分选以获得活细胞。将这些细胞进行洗涤以去除过量的钙黄绿素AM和Draq7TM。使用流式细胞术，将钙黄绿素AM(活细胞)而不是Draq7TM(非死细胞或透化细胞)染色的单个细胞分选进入BD ResolveTM筒中。
在含有单个细胞和珠的孔中，孔中的1000个单个细胞在裂解缓冲液中裂解。对于每个单个细胞，使用针对细胞的与珠缀合的随机条形码将mRNA分子逆转录并复制抗体寡核苷酸。使用引物(使用血液组N1引物确定488个血液组基因的mRNA表达谱，并且使用抗体寡核苷酸N1引物(“PCR 1”)确定CD147蛋白质的表达)将逆转录并复制后的样品在60度退火温度下PCR扩增15个循环。用Ampure清除去除过量的引物。使用具有用于适配子连接的侧翼序列的血液组N2引物和抗体寡核苷酸N1引物，在60度退火温度下将来自PCR1的产物进一步PCR扩增(“PCR 2”)15个循环。测序适配子连接(“PCR 3”)后获得测序数据并进行分析。
图28图(a)-(d)是非限制性示例性生物分析仪迹线，这些生物分析仪迹线显示与抗体寡核苷酸的预期大小一致的峰(由箭头指示)。随着用冷抗体滴定热抗体，抗体寡核苷酸峰减少。
表1是测序数据度量的汇总。通过用使用1:100稀释的储备液制备的1％热抗体:99％冷抗体的混合物对细胞染色，抗体寡核苷酸占测序数据中总的原始读数的2.4％。然而，如图29图(a)-(f)和图30B、31B、和32B中所示，如果用使用1:100稀释的储备液制备的1％热抗体:99％冷抗体的混合物对细胞染色，在递推性取代误差校正(substitutionerror correction，RSEC)或基于分布的误差校正(distribution-based errorcorrection，DBEC)后检测的抗体寡核苷酸的分子数的分布直方图不包括明确的信号峰。RSEC已经内描述于2017年5月25日提交的美国专利申请号15/605874中，通过引用将该内容以其全文并入本文。
图30A-30C是非限制性示例性图，这些示例性图显示寡核苷酸-缀合的抗CD147抗体分子可用于标记各种细胞类型。使用血液组(图30A)中的488个基因的表达谱确定细胞类型。用使用1:100稀释的储备液制备的10％热抗体:90％冷抗体的混合物对细胞染色，在直方图中产生显示检测到的抗体寡核苷酸分子数的清晰信号(图30B)。抗体寡核苷酸对各种细胞类型的标记示于图30C中。
图31A-31C是非限制性示例性图，这些示例性图显示寡核苷酸-缀合的抗CD147抗体可用于标记各种细胞类型。使用血液组(图31A)中的488个基因的表达谱确定细胞类型。用使用1:100稀释的储备液制备的1％热抗体:99％冷抗体的混合物对细胞染色，在直方图中不产生显示检测到的抗体寡核苷酸分子数的清晰信号(图31B)。抗体寡核苷酸对各种细胞类型的标记示于图31C中。
图32A-32C是非限制性示例性图，这些示例性图显示寡核苷酸-缀合的抗CD147抗体分子可用于标记各种细胞类型。使用血液组(图32A)中的488个基因的表达谱确定细胞类型。用1:800稀释的储备液对细胞染色，在直方图中产生显示检测到的抗体寡核苷酸分子数的清晰信号(图32B)。抗体寡核苷酸对各种细胞类型的标记示于图32C中。
表1.测序数据度量的汇总
总之，这些数据表明可以调整寡核苷酸-缀合的抗体(“热抗体”)和不与寡核苷酸缀合的抗体(“冷抗体”)的比率，使得抗体寡核苷酸占测序数据中总读数的所希望的百分比，并且代表信号抗体寡核苷酸的数据明确地与代表噪音抗体寡核苷酸的数据分开。
实例4
标准化
该实例表明标准化(使用寡核苷酸-缀合的抗体(“热抗体”)和不与寡核苷酸缀合的抗体(“冷抗体”)的混合物)是如何在无论抗体的蛋白质靶的丰度如何的情况下以所需的覆盖率导致这些抗体寡核苷酸占测序数据中总读数的所希望的百分比。
表2显示了使用热抗体对10,000个B细胞中不同丰度的三种细胞表面标志物的定量比较。解析三种细胞表面标志物的相对表达水平所需的总读数为4752万读数。
表2.使用热抗体进行实例蛋白质定量
表3.使用热抗体和冷抗体进行实例蛋白质定量
表3显示使用热抗体:冷抗体的混合物解析三种细胞表面标志物的相对表达水平所需的总读数是1百万读数。同样，当将热抗体:冷抗体的混合物用于定量三种细胞表面标志物的表达水平时，与表2中显示的定量结果相比(1百万读数对比4752万读数)需要仅读数数量的2％来实现所有的三种蛋白质标志物的最佳覆盖率(例如，测序深度为4)。使用具有较高百分比的冷抗体的混合物使高表达蛋白质分子标准化，这减少了低丰度蛋白质检测、参数数量和测序成本之间的权衡，使得该测定作为工具更具吸引力。
总之，这些数据表明，使用热抗体:冷抗体的混合物，对于不同丰度的蛋白质靶(例如，抗原)，可以实现具有所需覆盖率的测序数据中总读数的所需数量。
实例5
T细胞亚群的鉴定
该实例通过大规模平行单个细胞测序证明了蛋白质和mRNA含量的同时数字测量，以更好地鉴定T细胞亚群。
已经将高通量单个细胞RNA测序用于描述复杂和异质细胞群及动态。然而，缺乏关于蛋白质表达的信息可以使鉴定通常由细胞表面标志物定义的细胞类型具有挑战性，因为mRNA和蛋白质表达可能不紧密相关。特别是T细胞含有相对低丰度的转录物，并且不同的T细胞亚群通常表现出高度相似的转录谱。该实例说明了通过测序使用寡核苷酸缀合的抗体测量蛋白质表达的方法，该方法能够同时检测单个细胞中的蛋白质和mRNA表达。
使用BDTM Resolve(一种大规模平行单个细胞分析系统)在单个工作流程中捕获、扩增抗体特异性寡核苷酸并与mRNA一起进行测序。为证明该方法的功效，创建了包括许多常见T细胞标志物的寡核苷酸缀合的抗体组。将该组应用于人外周血单核细胞(PBMC)。通过寡核苷酸缀合的抗体对蛋白质表达的检测是高度敏感和特异的。并且蛋白质标志物测量的添加提供了更加明显且有力的单个细胞表达谱的聚类，尤其是在T细胞区室中，例如原始CD4与CD8T细胞的分离，以及原始T细胞与记忆T细胞的分离。特别地，鉴定了罕见的并在最近描述的T细胞亚群，干记忆T细胞。干记忆T细胞构成具有干细胞样特性的长效记忆T细胞群。
总之，数据显示通过大规模并行单个细胞测序进行的蛋白质和mRNA含量的同时数字测量可以将单个细胞转录谱分析和高参数蛋白质组学转化为进一步努力阐明复杂的生物系统，了解疾病状态和实现更有效的生物标志物发现。
实例6
对照颗粒
该实例表明生成包括具有不同序列的对照颗粒寡核苷酸的对照颗粒以及使用官能化对照颗粒以确定捕获效率。
材料
BD CompBead Plus抗小鼠Ig(7.5um)颗粒集(51-9006274)
BD染色缓冲液(FBS)
程序
1.在使用之前将Vortex BD CompBead Plus充分涡旋(至少1分钟)。
2.向管中添加800uL染色缓冲液(表7显示染色缓冲液以及与具有不同丰度的五个序列的寡核苷酸缀合的CD147的组合物。图33A是显示染色缓冲液组合物的图)。
3.添加5个全滴(大约300uL)的CompBead Plus抗小鼠。
4.向管中添加20uL的以下染色混合物。涡旋
5.在室温下避光孵育30分钟。
6.以200g旋转珠粒10分钟。
7.小心去除上清液并用1mL染色缓冲液重悬浮。
8.以200g旋转珠粒10分钟。
9.小心去除上清液并用1mL染色缓冲液重悬浮以生成官能化的CompBead储备溶液。
10.对珠粒计数。
表7.染色混合物组合物
结果
图34A-34B是血细胞计数器中细胞(图34A，白色圆圈)和对照颗粒(图34B，黑色圆圈)的明视野图像。图35A-35B是与荧光团相关联的寡核苷酸-缀合的抗体结合的对照颗粒的相差(图35A，10X)和荧光(图35B，10X)图像。荧光显微镜被用于确定5ul官能化的CompBead储备溶液含有约2000个细胞(总输入的4％)，其中制得约400000个官能化的CompBead。
图36是显示被装载到盒的微孔中的细胞和颗粒的对照颗粒图像。可以伴随常规的解析实验使用CompBead。将522个官能化的CompBead添加至多个细胞中。在20000个细胞(包括对照颗粒)序列中，156个具有高于20的所有对照颗粒寡核苷酸总数。因此，156个对照颗粒是序列。图33B是显示具有五种不同的对照条形码序列(LZ15-LZ19)的对照颗粒寡核苷酸的数量的图，该数量与染色缓冲液中它们的丰度相关。
总之，这些数据显示可以用寡核苷酸(例如，对照颗粒寡核苷酸)将颗粒(例如，CompBead Plus)官能化。官能化的颗粒可以与单个细胞测序工作流程一起使用，以确定捕获的和测序的颗粒的数量。
尽管本文已经披露了各种方面和实施例，但其他方面和实施例对本领域技术人员将是明显的。本文披露的各种方面和实施例用于说明的目的而并不意于限制由以下权利要求所指出的真实范围和精神。
本领域技术人员将理解，对于本文披露的此过程和方法，以及其他过程和方法，在这些过程和方法中进行的功能可以按不同顺序实施。此外，概述的步骤和操作仅提供为实例，并且一些步骤和操作可以是任选的，合并为更少的步骤和操作，或扩展为另外的步骤和操作，而不减损披露的实施例的精华。
关于本文中使用基本上任何复数和/或单数术语，在对于背景和/或应用适当的情况下，本领域技术人员可以从复数转换为单数和/或从单数转换为复数。为了清楚起见，可以在本文明确阐述各种单数/复数排列。
本领域技术人员将理解，一般来说，本文使用的术语，尤其是所附权利要求书(例如，所附权利要求书的主体)中的术语，通常旨在作为“开放性的”术语(例如，术语“包括(including)”应解释为“包括但不限于(including but not limited to)”，术语“具有(having)”应解释为“具有至少(having at least)”，术语“包括(includes)”应解释为“包括但不限于(includes but is not limited to)”等)。本领域技术人员将进一步理解，如果预期到所介绍的权利要求陈述的特定数目，这样的预期将明确地陈述于权利要求中，并且在不存在这种陈述的情况下没有这种意图存在。例如，作为对理解的帮助，以下所附权利要求书可以包含介绍性短语“至少一个”和“一个或多个”的使用，以介绍权利要求陈述。然而，此类短语的使用不应解读为意味着由不定冠词“一个”或“一种”介绍权利要求陈述会将任何包含这种介绍的权利要求陈述的具体权利要求限制到包含仅一个这种陈述的实施例中，甚至当相同的权利要求包括介绍性短语“一个或多个”或“至少一个”以及不定冠词如“一个”或“一种”时也是如此(例如，“一个”和/或“一种”应解释为意指“至少一个”或“一个或多个”)；这对于使用定冠词来介绍权利要求陈述同样适用。此外，即使明确地陈述了介绍的权利要求陈述的特定数目，本领域技术人员将认识到，这种陈述应解释为意指至少所陈述的数字(例如，仅陈述“两个陈述”而没有其他修饰词意指至少两个陈述、或两个或更多个陈述)。此外，在使用类似于“A、B和C等中的至少一个”的惯例的那些情况下，通常这种句法结构是在本领域技术人员将理解所述惯例的意义上预期(例如，“具有A、B和C中的至少一个的系统”将包括但不限于仅具有A，仅具有B，仅具有C，A和B一起，A和C一起，B和C一起，和/或A、B、和C一起等的系统)。在使用类似于“A、B或C等中的至少一个”的惯例的那些情况下，通常这种句法结构是在本领域技术人员将理解所述惯例的意义上预期(例如，“具有A、B或C中的至少一个的系统”将包括但不限于仅具有A，仅具有B，仅具有C，A和B一起，A和C一起，B和C一起，和/或A、B、和C一起等的系统)。本领域技术人员将进一步理解，实际上，无论在说明书、权利要求书还是在附图中，呈现两个或更多个替代术语的任何分离性词语和/或短语应被理解为考虑到包括术语之一、任一术语或两个术语的可能性。例如，短语“A或B”将被理解为包括“A”或“B”或“A和B”的可能性。
此外，当本披露的特征或方面以马库什组(Markush group)描述时，本领域技术人员将意识到本披露还由此以马库什组的任何单独的成员或成员子组描述。
如本领域技术人员将理解的，出于任何和所有目的，如在提供书面描述方面，本文披露的所有范围还包括任何和所有可能的它的子范围和子范围组合。任何列出的范围都可以很容易地被识别为充分描述并使相同的范围能被分解为至少相等的一半，三分之一，四分之一，五分之一，十分之一等。作为非限制性示例，这里讨论的每个范围可以容易地分解为下三分之一，中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的，所有语言，如“多至”、“至少”、等包括所陈述的数字，并且指代可以随后分解为如上讨论的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个细胞的组是指具有1、2或3个细胞的组。类似地，具有1-5个细胞的组指代具有1、2、3、4或5个细胞的组，等等。
根据上文，应当理解，本文出于解释说明的目的已经描述了本披露的各种实施例，并且在不偏离本披露的范围和精神的条件下做出各种修改。因此本文披露的各种实施例并不意于限制由以下权利要求书所指出的真实范围和精神。
序列表
<110> 赛卢拉研究公司
贝克顿迪金森公司
克里斯蒂娜·范
克里斯蒂娜·张
艾琳·夏姆
奥拉夫·佐尔纳
尼坦杰里·班萨尔
詹姆斯·贾迪亚里
格雷琴·因博恩·拉姆
艾瑞克·延森
于尔格·罗雷尔
布伦特·盖洛德
乔迪·马丁
杰森·G·维达尔
<120> 使用具有条形码化的寡核苷酸序列的试剂测量蛋白质表达
<130> BDCRI.025A
<150> 62/399,795
<151> 2016-09-26
<150> 62/464279
<151> 2017-02-27
<150> 62/515,952
<151> 2017-06-06
<160> 7
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 注意="对人工序列：合成寡核苷酸的描述"
<400> 1
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 注意="对人工序列：合成寡核苷酸的描述"
<400> 2
tttttttttt tttttttttt 20
<210> 3
<211> 95
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 注意="对人工序列：合成寡核苷酸的描述"
<220>
<221> 5AmMC6
<222> (1)..(1)
<223> 5' 氨基修饰物C6
<400> 3
gttgtcaaga tgctaccgtt cagagtacgt ggagttggtg gcccgacccc gagcgctacg 60
agccccccgg aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 95
<210> 4
<211> 200
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 注意="对人工序列：合成寡核苷酸的描述"
<220>
<221> 5AmMC6
<222> (1)..(1)
<223> 5' 氨基修饰物C6
<400> 4
gttgtcaaga tgctaccgtt cagagctact gtccgaagtt accgtgtatc taccacgggt 60
ggtttttcga atccggaaaa gatagtaata agtgttttag ttggaataag tcgcaacttt 120
tggagacggt tacctctcaa tttttctgat ccgtaggccc cccgatctcg gcctcaaaaa 180
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 200
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 注意="对人工序列：合成寡核苷酸的描述"
<400> 5
gttgtcaaga tgctaccgtt cagag 25
<210> 6
<211> 95
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 注意="对人工序列：合成寡核苷酸的描述"
<400> 6
gttgtcaaga tgctaccgtt cagagcccca tgtctagtac ctattggtcc cctatcctca 60
gattcgttta aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 95
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 注意="对人工序列：合成寡核苷酸的描述"
<400> 7
tttttttttt tttttttttt tttttt 26

Claims (1107)

1.多个组合物，其各自包括与寡核苷酸缀合的蛋白质结合试剂，其中该寡核苷酸包括与该蛋白质结合试剂缀合的该蛋白质结合试剂的独特标识，并且该蛋白质结合试剂能够特异性结合蛋白质靶。
2.如权利要求1所述的多个组合物，其中该独特标识包括长度为25-45个核苷酸的核苷酸序列。
3.如权利要求1或2所述的多个组合物，其中该独特标识选自独特标识的多元组。
4.如权利要求3所述的多个组合物，其中独特标识的该多元组包括至少100种不同的独特标识。
5.如权利要求3所述的多个组合物，其中独特标识的该多元组包括至少1,000种不同的独特标识。
6.如权利要求3所述的多个组合物，其中独特标识的该多元组包括至少10,000种不同的独特标识。
7.如权利要求1-6中任一项所述的多个组合物，该多个组合物包括多个抗体、多个适配子、或其组合。
8.如权利要求1-7中任一项所述的多个组合物，其中该寡核苷酸通过接头与该蛋白质结合试剂缀合。
9.如权利要求8所述的多个组合物，其中该接头包括化学基团。
10.如权利要求8所述的多个组合物，其中该寡核苷酸包括该接头。
11.如权利要求9或10所述的多个组合物，其中该化学基团可逆地附接至该蛋白质结合试剂。
12.如权利要求8-11中任一项所述的多个组合物，其中该化学基团选自下组，该组由以下组成：UV可光解基团、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、及其任何组合。
13.如权利要求1-12中任一项所述的多个组合物，其中该独特标识与样品的基因组序列不同源。
14.如权利要求13所述的多个组合物，其中该样品是单个细胞、多个细胞、组织、肿瘤样品、或其任何组合。
15.如权利要求13或14所述的多个组合物，其中该样品是哺乳动物样品、细菌样品、病毒样品、酵母样品、真菌样品、或其任何组合。
16.如权利要求1-15中任一项所述的多个组合物，其中该寡核苷酸包括条形码序列、聚(A)尾、或其组合。
17.如权利要求1-16中任一项所述的多个组合物，该多个组合物包括至少100种不同的蛋白质结合试剂。
18.如权利要求1-16中任一项所述的多个组合物，该多个组合物包括至少1,000种不同的蛋白质结合试剂。
19.如权利要求1-16中任一项所述的多个组合物，该多个组合物包括至少10,000种不同的蛋白质结合试剂。
20.如权利要求17-19中任一项所述的多个组合物，其中每种蛋白质结合试剂与一个或多个寡核苷酸缀合，这些寡核苷酸包括选自一组至少10种不同的条形码序列中的至少一种条形码序列。
21.如权利要求17-19中任一项所述的多个组合物，其中每种蛋白质结合试剂与一个或多个寡核苷酸缀合，这些寡核苷酸包括选自一组至少100种不同的条形码序列中的至少一种条形码序列。
22.如权利要求17-19中任一项所述的多个组合物，其中每种蛋白质结合试剂与一个或多个寡核苷酸缀合，这些寡核苷酸包括选自一组至少1,000种不同的条形码序列中的至少一种条形码序列。
23.如权利要求1-22中任一项所述的多个组合物，其中该多个组合物进一步包括一种或多种第二蛋白质结合试剂，这些试剂不与该寡核苷酸缀合。
24.如权利要求23所述的多个组合物，其中该蛋白质结合试剂与该一种或多种第二蛋白质结合试剂是相同的。
25.如权利要求1-24中任一项所述的多个组合物，该多个组合物能够特异性结合多个蛋白质靶。
26.如权利要求25所述的多个组合物，其中该多个蛋白质靶包括细胞表面蛋白质、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、抗体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、或其任何组合。
27.如权利要求25所述的多个组合物，其中该多个蛋白质靶包括10-400种不同的蛋白质靶。
28.一种对样品中多个蛋白质靶定量分析的方法，该方法包括：
提供包括多个蛋白质靶的样品；
提供多个组合物，每个组合物包括与寡核苷酸缀合的蛋白质结合试剂，其中该寡核苷酸包括与该蛋白质结合试剂缀合的该蛋白质结合试剂的独特标识，并且该蛋白质结合试剂能够特异性结合该多个蛋白质靶中的至少一个；
将该多个组合物与样品接触用于与该多个蛋白质靶特异性结合；
去除未结合的组合物；
提供多个寡核苷酸探针，其中该多个寡核苷酸探针中的每个包括靶结合区和条形码序列，其中该条形码序列来自独特条形码序列的多元组；
使该多个寡核苷酸探针与该多个组合物的寡核苷酸接触；
延伸与这些寡核苷酸杂交的寡核苷酸探针以产生多个经标记的核酸，其中每个经标记的核酸包括独特标识和条形码序列；并且
确定针对每种独特标识的独特条形码序列的数量，
凭此确定样品中每种蛋白质靶的数量。
29.如权利要求28所述的方法，其中该独特标识包括长度为25-45个核苷酸的核苷酸序列。
30.如权利要求28或29所述的方法，其中该独特标识选自独特标识的多元组。
31.如权利要求30所述的方法，其中独特标识的该多元组包括至少100种不同的独特标识。
32.如权利要求30所述的方法，其中独特标识的该多元组包括至少1,000种不同的独特标识。
33.如权利要求30所述的方法，其中独特标识的该多元组包括至少10,000种不同的独特标识。
34.如权利要求28-33中任一项所述的方法，其中该多个组合物包括多个抗体、多个适配子、或其组合。
35.如权利要求28-34中任一项所述的方法，其中该寡核苷酸通过接头与该蛋白质结合试剂缀合。
36.如权利要求35所述的方法，其中该接头包括化学基团。
37.如权利要求35所述的方法，其中该寡核苷酸包括该接头。
38.如权利要求36或37所述的方法，其中该化学基团可逆地附接至该蛋白质结合试剂。
39.如权利要求35-38中任一项所述的方法，其中该化学基团选自下组，该组由以下组成：UV可光解基团、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、及其任何组合。
40.如权利要求28-39中任一项所述的方法，其中该样品包括单个细胞。
41.如权利要求40所述的方法，其中该多个蛋白质靶在该单个细胞的表面上表达。
42.如权利要求40或41所述的方法，其中去除未结合的组合物包括用洗涤缓冲液洗涤该单个细胞。
43.如权利要求42所述的方法，该方法包括裂解该单个细胞。
44.如权利要求28-43中任一项所述的方法，该方法包括将这些寡核苷酸与这些蛋白质结合试剂分离。
45.如权利要求44所述的方法，其中将这些寡核苷酸通过UV光解、化学处理(二硫苏糖醇)、加热、酶处理、或其任何组合与这些蛋白质结合试剂分离。
46.如权利要求28-45中任一项所述的方法，其中这些寡核苷酸探针中的每一个包括细胞标记、通用引物的结合位点、或其任何组合。
47.如权利要求28-46中任一项所述的方法，其中该靶结合区包括聚(dT)。
48.如权利要求28-47中任一项所述的方法，其中该多个寡核苷酸探针被固定在固体支持物上。
49.如权利要求48所述的方法，其中该固体支持物是珠。
50.如权利要求28-49中任一项所述的方法，该方法进一步包括扩增该多个经标记的核酸以产生多个扩增子。
51.如权利要求50所述的方法，其中该扩增包括对该条形码序列的至少一部分和该独特标识的至少一部分进行PCR扩增。
52.如权利要求28-51中任一项所述的方法，其中独特条形码序列的该多元组包括至少100个独特条形码序列。
53.如权利要求28-51中任一项所述的方法，其中独特条形码序列的该多元组包括至少1,000个独特条形码序列。
54.如权利要求28-51中任一项所述的方法，其中独特条形码序列的该多元组包括至少10,000个独特条形码序列。
55.如权利要求28-54中任一项所述的方法，其中该多个组合物进一步包括一种或多种第二蛋白质结合试剂，这些试剂不与该寡核苷酸缀合。
56.如权利要求55所述的方法，其中该蛋白质结合试剂与该一种或多种第二蛋白质结合试剂是相同的。
57.如权利要求50-54中任一项所述的方法，该方法进一步包括对该多个扩增子测序。
58.如权利要求57所述的方法，其中该测序包括对该条形码序列的至少一部分和该独特标识的至少一部分进行测序。
59.一种对样品中多个蛋白质靶和多个核酸靶分子同时定量分析的方法，该方法包括：
提供包括多个蛋白质靶和多个核酸靶分子的样品；
提供多个组合物，每个组合物包括与寡核苷酸缀合的蛋白质结合试剂，其中该寡核苷酸包括与该蛋白质结合试剂缀合的该蛋白质结合试剂的独特标识，并且该蛋白质结合试剂能够特异性结合该多个蛋白质靶中的至少一个；
将该多个组合物与样品接触用于与该多个蛋白质靶特异性结合；
去除未结合的组合物；
提供多个寡核苷酸探针，其中该多个寡核苷酸探针中的每个包括靶结合区和条形码序列，其中该条形码序列来自独特条形码序列的多元组；
使该多个寡核苷酸探针与这些组合物的寡核苷酸和该多个核酸靶分子接触用于杂交；
延伸与这些寡核苷酸和核酸靶分子杂交的寡核苷酸探针以产生多个经标记的核酸，其中每个经标记的核酸包括独特标识或核酸靶分子，以及条形码序列；并且
确定针对每种独特标识和每种核酸靶分子的独特条形码序列的数量，
凭此确定样品中每种蛋白质靶和每种核酸靶分子的数量。
60.如权利要求59所述的方法，其中该独特标识包括长度为25-45个核苷酸的核苷酸序列。
61.如权利要求59或60所述的方法，其中该独特标识选自独特标识的多元组。
62.如权利要求61所述的方法，其中独特标识的该多元组包括至少100种不同的独特标识。
63.如权利要求61所述的方法，其中独特标识的该多元组包括至少1,000种不同的独特标识。
64.如权利要求61所述的方法，其中独特标识的该多元组包括至少10,000种不同的独特标识。
65.如权利要求59-64中任一项所述的方法，其中该多个组合物包括多个抗体、多个适配子、或其组合。
66.如权利要求59-65中任一项所述的方法，其中该寡核苷酸通过接头与该蛋白质结合试剂缀合。
67.如权利要求66所述的方法，其中该接头包括化学基团。
68.如权利要求66所述的方法，其中该寡核苷酸包括该接头。
69.如权利要求67或68所述的方法，其中该化学基团可逆地附接至该蛋白质结合试剂。
70.如权利要求67-69中任一项所述的方法，其中该化学基团选自下组，该组由以下组成：UV可光解基团、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、及其任何组合。
71.如权利要求59-70中任一项所述的方法，其中该样品包括单个细胞。
72.如权利要求71所述的方法，其中该多个蛋白质靶在该单个细胞的表面上表达。
73.如权利要求71或72所述的方法，其中去除未结合的组合物包括用洗涤缓冲液洗涤该单个细胞。
74.如权利要求73所述的方法，该方法包括裂解该单个细胞。
75.如权利要求59-74中任一项所述的方法，该方法包括将这些寡核苷酸与这些蛋白质结合试剂分离。
76.如权利要求75所述的方法，其中将这些寡核苷酸通过UV光解、化学处理(二硫苏糖醇)、加热、酶处理、或其任何组合与这些蛋白质结合试剂分离。
77.如权利要求59-76中任一项所述的方法，其中这些寡核苷酸探针中的每一个包括细胞标记、通用引物的结合位点、或其任何组合。
78.如权利要求59-77中任一项所述的方法，其中该靶结合区包括聚(dT)。
79.如权利要求59-78中任一项所述的方法，其中该多个寡核苷酸探针被固定在固体支持物上。
80.如权利要求79所述的方法，其中该固体支持物是珠。
81.如权利要求59-80中任一项所述的方法，该方法进一步包括扩增该多个经标记的核酸以产生多个扩增子。
82.如权利要求81所述的方法，其中该扩增包括对该条形码序列的至少一部分、该独特标识的至少一部分和该核酸靶分子的至少一部分进行PCR扩增。
83.如权利要求59-82中任一项所述的方法，其中独特条形码序列的该多元组包括至少100个独特条形码序列。
84.如权利要求59-82中任一项所述的方法，其中独特条形码序列的该多元组包括至少1,000个独特条形码序列。
85.如权利要求59-82中任一项所述的方法，其中独特条形码序列的该多元组包括至少10,000个独特条形码序列。
86.如权利要求59-85中任一项所述的方法，其中该多个组合物进一步包括不与该寡核苷酸缀合的一种或多种第二蛋白质结合试剂。
87.如权利要求86所述的方法，其中该蛋白质结合试剂与该一种或多种第二蛋白质结合试剂是相同的。
88.如权利要求81-87中任一项所述的方法，该方法进一步包括对该多个扩增子测序。
89.如权利要求88所述的方法，其中该测序包括对该条形码序列的至少一部分、该独特标识的至少一部分和该核酸靶分子的至少一部分进行测序。
90.一种用于对样品中多个蛋白质靶和多个核酸靶分子进行同时定量分析的试剂盒，该试剂盒包括多个组合物和多个寡核苷酸探针，该多个组合物中的每个包括与寡核苷酸缀合的蛋白质结合试剂，其中该寡核苷酸包括与该蛋白质结合试剂缀合的该蛋白质结合试剂的独特标识并且该蛋白质结合试剂能够特异性结合蛋白质靶，其中该多个寡核苷酸探针中的每个包括靶结合区和条形码序列，其中该条形码序列来自独特条形码序列的多元组。
91.一种用于对样品中多个蛋白质靶和多个核酸靶分子进行同时定量分析的试剂盒，该试剂盒包括多个组合物和多个寡核苷酸探针，该多个组合物中的每个包括各自与寡核苷酸缀合的两个或更多个蛋白质结合试剂，其中该寡核苷酸包含与该两个或更多个蛋白质结合试剂中一个缀合的该两个或更多个蛋白质结合试剂中一个的独特标识，并且这些蛋白质结合试剂能够特异性结合蛋白质靶，其中该多个寡核苷酸探针中的每个包含靶结合区和条形码序列，其中该条形码序列来自独特条形码序列的多元组。
92.一种用于对样品中多个蛋白质靶和多个核酸靶分子进行同时定量分析的试剂盒，该试剂盒包括多个组合物和多个寡核苷酸探针，该多个组合物中的每个包括各自与寡核苷酸缀合的两个或更多个蛋白质结合试剂，其中该寡核苷酸包括与该蛋白质结合试剂缀合的该蛋白质结合试剂的独特标识并且这些蛋白质结合试剂能够特异性结合蛋白质靶，其中该多个寡核苷酸探针中的每个包括靶结合区和条形码序列，其中该条形码序列来自独特条形码序列的多元组。
93.如权利要求90-92中任一项所述的试剂盒，其中这些寡核苷酸探针中的每一个包括细胞标记、通用引物的结合位点、或其任何组合。
94.如权利要求90-93中任一项所述的试剂盒，其中该靶结合区包括聚(dT)。
95.如权利要求90-94中任一项所述的试剂盒，其中该多个寡核苷酸探针被固定在固体支持物上。
96.如权利要求95所述的试剂盒，其中该固体支持物是珠。
97.如权利要求90-96中任一项所述的试剂盒，其中独特条形码序列的该多元组包括至少100个独特条形码序列。
98.如权利要求90-96中任一项所述的试剂盒，其中独特条形码序列的该多元组包括至少1,000个独特条形码序列。
99.如权利要求90-96中任一项所述的试剂盒，其中独特条形码序列的该多元组包括至少10,000个独特条形码序列。
100.如权利要求90-99中任一项所述的试剂盒，该试剂盒包括至少1,000个寡核苷酸探针。
101.如权利要求90-99中任一项所述的试剂盒，该试剂盒包括至少10,000个寡核苷酸探针。
102.如权利要求90-99中任一项所述的试剂盒，该试剂盒包括至少100,000个寡核苷酸探针。
103.如权利要求90-99中任一项所述的试剂盒，该试剂盒包括至少1,000,000个寡核苷酸探针。
104.如权利要求90-103中任一项所述的试剂盒，其中该独特标识包括25-45个核苷酸。
105.如权利要求90-104中任一项所述的试剂盒，其中该独特标识选自独特标识的多元组。
106.如权利要求105所述的试剂盒，其中独特标识的该多元组包括至少100种不同的独特标识。
107.如权利要求105所述的试剂盒，其中独特标识的该多元组包括至少1,000种不同的独特标识。
108.如权利要求105所述的试剂盒，其中独特标识的该多元组包括至少10,000种不同的独特标识。
109.如权利要求90-108中任一项所述的试剂盒，其中该多个组合物进一步包括不与该寡核苷酸缀合的一种或多种第二蛋白质结合试剂。
110.如权利要求109所述的试剂盒，其中该蛋白质结合试剂与该一种或多种第二蛋白质结合试剂是相同的。
111.如权利要求90-110中任一项所述的试剂盒，其中该多个组合物包括多个抗体、多个适配子、或其组合。
112.如权利要求90-111中任一项所述的试剂盒，其中该寡核苷酸通过接头与该蛋白质结合试剂缀合。
113.如权利要求112所述的试剂盒，其中该接头包括化学基团。
114.如权利要求112所述的试剂盒，其中该寡核苷酸包括该接头。
115.如权利要求113或114所述的试剂盒，其中该化学基团可逆地附接至该蛋白质结合试剂。
116.如权利要求112-115中任一项所述的试剂盒，其中该化学基团选自下组，该组由以下组成：UV可光解基团、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、及其任何组合。
117.如权利要求90-116中任一项所述的试剂盒，其中该独特标识与样品的基因组序列不同源。
118.如权利要求117所述的试剂盒，其中该样品是单个细胞、多个细胞、组织、肿瘤样品、或其任何组合。
119.如权利要求117或118所述的试剂盒，其中该样品是哺乳动物样品、细菌样品、病毒样品、酵母样品、真菌样品、或其任何组合。
120.如权利要求90-119中任一项所述的试剂盒，其中该寡核苷酸包括条形码序列、聚(A)尾、或其组合。
121.如权利要求90-120中任一项所述的试剂盒，该多个组合物包括至少100种不同的蛋白质结合试剂。
122.如权利要求90-120中任一项所述的试剂盒，该试剂盒包括至少1,000种不同的蛋白质结合试剂。
123.如权利要求90-120中任一项所述的试剂盒，该试剂盒包括至少10,000种不同的蛋白质结合试剂。
124.如权利要求121-123中任一项所述的试剂盒，其中每种蛋白质结合试剂与一个或多个寡核苷酸缀合，这些寡核苷酸包括选自一组至少10种不同的条形码序列中的至少一种条形码序列。
125.如权利要求121-123中任一项所述的试剂盒，其中每种蛋白质结合试剂与一个或多个寡核苷酸缀合，这些寡核苷酸包括选自一组至少100种不同的条形码序列中的至少一种条形码序列。
126.如权利要求121-123中任一项所述的试剂盒，其中每种蛋白质结合试剂与一个或多个寡核苷酸缀合，这些寡核苷酸包括选自一组至少1,000种不同的条形码序列中的至少一种条形码序列。
127.如权利要求90-126中任一项所述的试剂盒，该多个组合物能够特异性结合多个蛋白质靶。
128.如权利要求127所述的试剂盒，其中该多个蛋白质靶包括细胞表面蛋白质、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、抗体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、或其任何组合。
129.如权利要求127所述的试剂盒，其中该多个蛋白质靶包括10-400种不同的蛋白质靶。
130.一种鉴定样品中生物标志物的方法，该方法包括：
提供包括多个蛋白质靶和多个核酸靶分子的样品；
提供多个组合物，每个组合物包括与寡核苷酸缀合的蛋白质结合试剂，其中该寡核苷酸包括与该蛋白质结合试剂缀合的该蛋白质结合试剂的独特标识，并且该蛋白质结合试剂能够特异性结合该多个蛋白质靶中的至少一个；
将该多个组合物与样品接触用于与该多个蛋白质靶特异性结合；
去除未结合的组合物；
提供多个寡核苷酸探针，其中该多个寡核苷酸探针中的每个包括靶结合区和条形码序列，其中该条形码序列来自独特条形码序列的多元组；
使该多个寡核苷酸探针与这些组合物的寡核苷酸和该多个核酸靶分子接触用于杂交；
延伸与这些寡核苷酸和核酸靶分子杂交的寡核苷酸探针以产生多个经标记的核酸，其中每个经标记的核酸包括独特标识或核酸靶分子，以及条形码序列；
确定针对每种独特标识和每种核酸靶分子的独特条形码序列的数量；并且
使用蛋白质靶的数量或核酸靶分子的数量鉴定生物标志物。
131.如权利要求130所述的方法，该方法包括确定至少一种蛋白质靶和至少一种核酸靶分子的数量。
132.如权利要求130所述的方法，该方法包括将至少一种蛋白质靶及其对应的核酸靶分子的数量进行比较。
133.如权利要求132所述的方法，该方法包括如果蛋白质靶的数量高于其对应的核酸靶分子则鉴定生物标志物。
134.如权利要求132所述的方法，该方法包括如果蛋白质靶的数量至少10X高于其对应的核酸靶分子则鉴定生物标志物。
135.如权利要求132所述的方法，该方法包括如果蛋白质靶的对应核酸靶分子的数量少于10则鉴定生物标志物。
136.如权利要求132所述的方法，该方法包括如果蛋白质靶的对应核酸靶分子的数量为0则鉴定生物标志物。
137.一种对照颗粒组合物，其包括与对照颗粒相关联的多个对照颗粒寡核苷酸，
其中该多个对照颗粒寡核苷酸中每一个包括对照条形码序列和聚(dA)区。
138.如权利要求137所述的对照颗粒组合物，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中至少两个包括不同的对照条形码序列。
139.如权利要求137-138中任一项所述的对照颗粒组合物，其中该对照条形码序列长度为至少6个核苷酸。
140.如权利要求137-138中任一项所述的对照颗粒组合物，其中该对照条形码序列长度为25-45个核苷酸。
141.如权利要求137-138中任一项所述的对照颗粒组合物，其中该对照条形码序列长度为约128个核苷酸。
142.如权利要求137-138中任一项所述的对照颗粒组合物，其中该对照条形码序列长度为至少128个核苷酸。
143.如权利要求137-138中任一项所述的对照颗粒组合物，其中该对照条形码序列长度为约200-500个核苷酸。
144.如权利要求137-140中任一项所述的对照颗粒组合物，其中该对照颗粒寡核苷酸长度为约50个核苷酸。
145.如权利要求137-140中任一项所述的对照颗粒组合物，其中该对照颗粒寡核苷酸长度为约100个核苷酸。
146.如权利要求137-142中任一项所述的对照颗粒组合物，其中该对照颗粒寡核苷酸长度为约200个核苷酸。
147.如权利要求137-142中任一项所述的对照颗粒组合物，其中该对照颗粒寡核苷酸长度为至少200个核苷酸。
148.如权利要求137-143中任一项所述的对照颗粒组合物，其中该对照颗粒寡核苷酸长度为少于约200-300个核苷酸。
149.如权利要求137-143中任一项所述的对照颗粒组合物，其中该对照颗粒寡核苷酸长度为约500个核苷酸。
150.如权利要求137-149中任一项所述的对照颗粒组合物，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中至少五个的对照条形码序列是相同的。
151.如权利要求137-149中任一项所述的对照颗粒组合物，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中约10个的对照条形码序列是相同的。
152.如权利要求137-149中任一项所述的对照颗粒组合物，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中约100个的对照条形码序列是相同的。
153.如权利要求137-149中任一项所述的对照颗粒组合物，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中约1000个的对照条形码序列是相同的。
154.如权利要求137-153中任一项所述的对照颗粒组合物，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中至少三个包括不同的对照条形码序列。
155.如权利要求137-153中任一项所述的对照颗粒组合物，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中至少五个包括不同的序列。
156.如权利要求137-153中任一项所述的对照颗粒组合物，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中至少10个包括不同的序列。
157.如权利要求137-153中任一项所述的对照颗粒组合物，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中至少100个包括不同的序列。
158.如权利要求137-157中任一项所述的对照颗粒组合物，
其中该多个对照颗粒寡核苷酸包括
多个第一对照颗粒寡核苷酸，其各自包括第一对照条形码序列，和
多个第二对照颗粒寡核苷酸，其包括第二对照条形码序列，并且
其中该第一对照条形码序列和该第二对照条形码序列具有不同的序列。
159.如权利要求158所述的对照颗粒组合物，其中该多个第一对照颗粒寡核苷酸的数量和该多个第二对照颗粒寡核苷酸的数量大约是相同的。
160.如权利要求158所述的对照颗粒组合物，其中该多个第一对照颗粒寡核苷酸的数量和该多个第二对照颗粒寡核苷酸的数量是不同的。
161.如权利要求160所述的对照颗粒组合物，其中该多个第一对照颗粒寡核苷酸的数量至少两倍高于该多个第二对照颗粒寡核苷酸的数量。
162.如权利要求160所述的对照颗粒组合物，其中该多个第一对照颗粒寡核苷酸的数量至少10倍高于该多个第二对照颗粒寡核苷酸的数量。
163.如权利要求160所述的对照颗粒组合物，其中该多个第一对照颗粒寡核苷酸的数量约100倍高于该多个第二对照颗粒寡核苷酸的数量。
164.如权利要求137-163中任一项所述的对照颗粒组合物，其中该对照条形码序列与物种的基因组序列不同源。
165.如权利要求137-163中任一项所述的对照颗粒组合物，其中该对照条形码序列与物种的基因组序列同源。
166.如权利要求165所述的对照颗粒组合物，其中该物质是非哺乳动物物种。
167.如权利要求166所述的对照颗粒组合物，其中该非哺乳动物物种是噬菌体物种。
168.如权利要求167所述的对照颗粒组合物，其中该噬菌体物种是T7噬菌体、PhiX噬菌体、或其组合。
169.如权利要求137-168中任一项所述的对照颗粒组合物，其中该对照颗粒寡核苷酸包括条形码序列。
170.如权利要求137-169中任一项所述的对照颗粒组合物，其中该对照颗粒寡核苷酸包括通用引物的结合位点。
171.如权利要求137-170中任一项所述的对照颗粒组合物，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中的至少一个通过接头与该对照颗粒相关联。
172.如权利要求171所述的对照颗粒组合物，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中的至少一个包括该接头。
173.如权利要求171-172中任一项所述的对照颗粒组合物，其中该接头包括化学基团。
174.如权利要求173所述的对照颗粒组合物，其中该化学基团可逆地附接至该多个对照颗粒寡核苷酸中的至少一个。
175.如权利要求173-174中任一项所述的对照颗粒组合物，其中该化学基团包括UV可光解基团、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、二硫键联、或其任何组合。
176.如权利要求137-175中任一项所述的对照颗粒组合物，其中该对照颗粒的直径是约1-1000微米。
177.如权利要求137-175中任一项所述的对照颗粒组合物，其中该对照颗粒的直径为约10-100微米。
178.如权利要求137-175中任一项所述的对照颗粒组合物，其中该对照颗粒的直径为约7.5微米。
179.如权利要求137-178中任一项所述的对照颗粒组合物，其中该多个对照颗粒寡核苷酸被固定在该对照颗粒上。
180.如权利要求137-178中任一项所述的对照颗粒组合物，其中该多个对照颗粒寡核苷酸被部分固定在该对照颗粒上。
181.如权利要求137-178中任一项所述的对照颗粒组合物，其中该多个对照颗粒寡核苷酸被包封在该对照颗粒中。
182.如权利要求137-178中任一项所述的对照颗粒组合物，其中该多个对照颗粒寡核苷酸被部分包封在该对照颗粒中。
183.如权利要求137-182中任一项所述的对照颗粒组合物，其中该对照颗粒是可破坏的。
184.如权利要求137-183中任一项所述的对照颗粒组合物，其中该对照颗粒包括珠。
185.如权利要求137-184中任一项所述的对照颗粒组合物，其中该对照颗粒包括琼脂糖凝胶珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠、或其任何组合。
186.如权利要求137-185中任一项所述的对照颗粒组合物，其中该对照颗粒包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮、或其任何组合的材料。
187.如权利要求137-186中任一项所述的对照颗粒组合物，其中该对照颗粒包括可破坏的水凝胶颗粒。
188.如权利要求137-187中任一项所述的对照颗粒组合物，其中该对照颗粒与可检测部分相关联。
189.如权利要求137-188中任一项所述的对照颗粒组合物，其中该对照颗粒寡核苷酸与可检测部分相关联。
190.如权利要求137-189中任一项所述的对照颗粒组合物，
其中该对照颗粒与多个第一蛋白质结合试剂相关联，并且
其中该多个第一蛋白质结合试剂中的至少一个与该多个对照颗粒寡核苷酸中的一个相关联。
191.如权利要求190所述的对照颗粒组合物，其中该第一蛋白质结合试剂包括第一抗体。
192.如权利要求190-191中任一项所述的对照颗粒组合物，其中该对照颗粒寡核苷酸通过接头与该第一蛋白质结合试剂缀合。
193.如权利要求192所述的对照颗粒组合物，其中该第一对照颗粒寡核苷酸包括该接头。
194.如权利要求192-193中任一项所述的对照颗粒组合物，其中该接头包括化学基团。
195.如权利要求194所述的对照颗粒组合物，其中该化学基团可逆地附接至该第一蛋白质结合试剂。
196.如权利要求194-195中任一项所述的对照颗粒组合物，其中该化学基团包括UV可光解基团、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、二硫键联、或其任何组合。
197.如权利要求190-196中任一项所述的对照颗粒组合物，其中该第一蛋白质结合试剂与该多个对照颗粒寡核苷酸中的具有相同对照条形码序列的两个或更多个相关联。
198.如权利要求190-197中任一项所述的对照颗粒组合物，其中该第一蛋白质结合试剂与该多个对照颗粒寡核苷酸中的具有不同对照条形码序列的两个或更多个相关联。
199.如权利要求190-198中任一项所述的对照颗粒组合物，其中该多个第一蛋白质结合试剂中的至少一个不与该多个对照颗粒寡核苷酸中的任一个相关联。
200.如权利要求199所述的对照颗粒组合物，其中与该对照颗粒寡核苷酸相关联的第一蛋白质结合试剂和不与任何对照颗粒寡核苷酸相关联的第一蛋白质结合试剂是相同的蛋白质结合试剂。
201.如权利要求190-200中任一项所述的对照颗粒组合物，其中该对照颗粒与多个第二蛋白质结合试剂相关联。
202.如权利要求201所述的对照颗粒组合物，其中该多个第二蛋白质结合试剂中至少一个与该多个对照颗粒寡核苷酸中的一个相关联。
203.如权利要求202所述的对照颗粒组合物，其中与该第一蛋白质结合试剂相关联的对照颗粒寡核苷酸以及与该第二蛋白质结合试剂相关联的对照颗粒寡核苷酸包括不同的对照条形码序列。
204.如权利要求202所述的对照颗粒组合物，其中该第一蛋白质结合试剂和该第二蛋白质结合试剂是相同的蛋白质结合试剂。
205.如权利要求190-204中任一项所述的对照颗粒组合物，其中该第一蛋白质结合试剂与配偶体结合试剂相关联，并且其中使用配偶体结合试剂使该第一蛋白质结合试剂与该对照颗粒相关联。
206.如权利要求205所述的对照颗粒组合物，其中该配偶体结合试剂包括配偶体抗体。
207.如权利要求206所述的对照颗粒组合物，其中该配偶体抗体包括抗猫抗体、抗鸡抗体、抗奶牛抗体、抗狗抗体、抗驴抗体、抗山羊抗体、抗豚鼠抗体、抗仓鼠抗体、抗马抗体、抗人抗体、抗美洲驼抗体、抗猴抗体、抗小鼠抗体、抗猪抗体、抗兔抗体、抗大鼠抗体、抗绵羊抗体、或其组合。
208.如权利要求206-207中任一项所述的对照颗粒组合物，其中该配偶体抗体包括免疫球蛋白G(IgG)、F(ab’)片段、F(ab’)2片段、其组合、或其片段。
209.如权利要求190-208中任一项所述的对照颗粒组合物，其中该第一蛋白质结合试剂与可检测部分相关联。
210.如权利要求190-209中任一项所述的对照颗粒组合物，其中该第二蛋白质结合试剂与可检测部分相关联。
211.一种用于确定靶的数量的方法，该方法包括：
使用多个条形码使多个细胞中的细胞的多个靶和多个对照颗粒寡核苷酸条形码化，以创建多个条形码化的靶和多个条形码化的对照颗粒寡核苷酸，
其中该多个条形码的每个包括细胞标记序列、条形码序列、和靶结合区，其中该多个条形码中的至少两个条形码的条形码序列包括不同的序列，并且其中该多个条形码中的至少两个条形码包括相同的细胞标记序列，
其中对照颗粒组合物包括与该多个对照颗粒寡核苷酸相关联的对照颗粒，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中的每一个包括对照条形码序列和假-靶区，该假-靶区包括与该多个条形码中至少一个的靶结合区基本互补的序列；
获得该多个条形码化的靶和该多个条形码化的对照颗粒寡核苷酸的测序数据；
对测序数据中与具有该对照条形码序列的多个对照颗粒寡核苷酸相关联的具有不同序列的条形码序列的数量进行计数；并且
对于该多个靶中的至少一个靶：
对测序数据中与该靶相关联的具有不同序列的条形码序列的数量进行计数；并且
估计靶的数量，其中经估计的靶的数量跟与经计数的靶相关联的具有不同序列的条形码序列的数量和与对照条形码序列相关联的具有不同序列的条形码序列的数量相关。
212.如权利要求211所述的方法，其中该假-靶区包括聚(dA)区。
213.如权利要求211-212中任一项所述的方法，其中该假-靶区包括该靶的子序列。
214.如权利要求211-213中任一项所述的方法，其中该对照条形码序列长度为至少6个核苷酸。
215.如权利要求211-213中任一项所述的方法，其中该对照条形码序列长度为25-45个核苷酸。
216.如权利要求211-213中任一项所述的方法，其中该对照条形码序列长度为约128个核苷酸。
217.如权利要求211-213中任一项所述的方法，其中该对照条形码序列长度为至少128个核苷酸。
218.如权利要求211-213中任一项所述的方法，其中该对照条形码序列长度为约200-500个核苷酸。
219.如权利要求211-215中任一项所述的方法，其中该对照颗粒寡核苷酸长度为约50个核苷酸。
220.如权利要求211-215中任一项所述的方法，其中该对照颗粒寡核苷酸长度为约100个核苷酸。
221.如权利要求211-217中任一项所述的方法，其中该对照颗粒寡核苷酸长度为约200个核苷酸。
222.如权利要求211-217中任一项所述的方法，其中该对照颗粒寡核苷酸长度为至少200个核苷酸。
223.如权利要求211-218中任一项所述的方法，其中该对照颗粒寡核苷酸长度为少于约200-300个核苷酸。
224.如权利要求211-218中任一项所述的方法，其中该对照颗粒寡核苷酸长度为约500个核苷酸。
225.如权利要求211-224中任一项所述的方法，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中至少五个的对照条形码序列是相同的。
226.如权利要求211-224中任一项所述的方法，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中约10个的对照条形码序列是相同的。
227.如权利要求211-224中任一项所述的方法，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中约100个的对照条形码序列是相同的。
228.如权利要求211-224中任一项所述的方法，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中约1000个的对照条形码序列是相同的。
229.如权利要求211-228中任一项所述的方法，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中至少三个包括不同的对照条形码序列。
230.如权利要求211-228中任一项所述的方法，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中至少五个包括不同的序列。
231.如权利要求211-228中任一项所述的方法，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中至少10个包括不同的序列。
232.如权利要求211-228中任一项所述的方法，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中至少100个包括不同的序列。
233.如权利要求211-232中任一项所述的方法，
其中该多个对照颗粒寡核苷酸包括
多个第一对照颗粒寡核苷酸，其各自包括第一对照条形码序列，和
多个第二对照颗粒寡核苷酸，其包括第二对照条形码序列，并且
其中该第一对照条形码序列和该第二对照条形码序列具有不同的序列。
234.如权利要求233所述的方法，其中该多个第一对照颗粒寡核苷酸的数量和该多个第二对照颗粒寡核苷酸的数量大约是相同的。
235.如权利要求233所述的方法，其中该多个第一对照颗粒寡核苷酸的数量和该多个第二对照颗粒寡核苷酸的数量是不同的。
236.如权利要求235所述的方法，其中该多个第一对照颗粒寡核苷酸的数量至少两倍高于该多个第二对照颗粒寡核苷酸的数量。
237.如权利要求235所述的方法，其中该多个第一对照颗粒寡核苷酸的数量至少10倍高于该多个第二对照颗粒寡核苷酸的数量。
238.如权利要求235所述的方法，其中该多个第一对照颗粒寡核苷酸的数量至少100倍高于该多个第二对照颗粒寡核苷酸的数量。
239.如权利要求233-238中任一项所述的方法，其中对测序数据中与具有该对照条形码序列的多个对照颗粒寡核苷酸相关联的具有不同序列的条形码序列的数量进行计数包括：
对测序数据中与该第一对照条形码序列相关联的具有不同序列的条形码序列的数量进行计数；并且
对测序数据中与该第二对照条形码序列相关联的具有不同序列的条形码序列的数量进行计数。
240.如权利要求239所述的方法，其中经估计的靶的数量与以下相关
与经计数的靶相关联的具有不同序列的条形码序列的数量，
与该第一对照条形码序列相关联的具有不同序列的条形码序列的数量，以及
与该第二对照条形码序列相关联的具有不同序列的条形码序列的数量。
241.如权利要求211-232中任一项所述的方法，其中经估计的靶的数量与以下相关
与经计数的靶相关联的具有不同序列的条形码序列的数量，
与该对照条形码序列相关联的具有不同序列的条形码序列的数量，以及
包括该对照条形码序列的该多个对照颗粒寡核苷酸的数量。
242.如权利要求241所述的方法，其中经估计的靶的数量与以下相关
与经计数的靶相关联的具有不同序列的条形码序列的数量，以及
包括该对照条形码序列的该多个对照颗粒寡核苷酸的数量，和
与该对照条形码序列相关联的具有不同序列的条形码序列的数量的比率。
243.如权利要求211-242中任一项所述的方法，其中该对照颗粒寡核苷酸与细胞的基因组序列不同源。
244.如权利要求211-242中任一项所述的方法，其中该对照颗粒寡核苷酸与物种的基因组序列不同源。
245.如权利要求211-242中任一项所述的方法，其中该对照颗粒寡核苷酸与物种的基因组序列同源。
246.如权利要求245所述的方法，其中该物种是非哺乳动物物种。
247.如权利要求246所述的方法，其中该非哺乳动物物种是噬菌体物种。
248.如权利要求247所述的方法，其中该噬菌体物种是T7噬菌体、PhiX噬菌体、或其组合。
249.如权利要求211-248中任一项所述的方法，其中该对照颗粒寡核苷酸通过接头与该对照颗粒缀合。
250.如权利要求249所述的方法，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中的至少一个通过接头与该对照颗粒相关联。
251.如权利要求249-250中任一项所述的方法，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中的至少一个包括该接头。
252.如权利要求251所述的方法，其中该化学基团可逆地附接至该多个对照颗粒寡核苷酸中的至少一个。
253.如权利要求251-252中任一项所述的方法，其中该化学基团包括UV可光解基团、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、二硫键联、或其任何组合。
254.如权利要求211-253中任一项所述的方法，其中该对照颗粒的直径是约1-1000微米。
255.如权利要求211-253中任一项所述的方法，其中该对照颗粒的直径是约10-100微米。
256.如权利要求211-253中任一项所述的方法，其中该对照颗粒的直径是约7.5微米。
257.如权利要求211-256中任一项所述的方法，其中该多个对照颗粒寡核苷酸被固定在该对照颗粒上。
258.如权利要求211-256中任一项所述的方法，其中该多个对照颗粒寡核苷酸被部分固定在该对照颗粒上。
259.如权利要求211-256中任一项所述的方法，其中该多个对照颗粒寡核苷酸被包封在该对照颗粒中。
260.如权利要求211-256中任一项所述的方法，其中该多个对照颗粒寡核苷酸被部分包封在该对照颗粒中。
261.如权利要求211-260中任一项所述的方法，该方法包括在使该多个靶和该对照颗粒以及该多个对照颗粒寡核苷酸条形码化之前从该对照颗粒释放该多个对照颗粒寡核苷酸中的至少一个。
262.如权利要求211-261中任一项所述的方法，其中该对照颗粒是可破坏的。
263.如权利要求211-262中任一项所述的方法，其中该对照颗粒包括对照颗粒珠。
264.如权利要求211-263中任一项所述的方法，其中该对照颗粒包括琼脂糖凝胶珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠、或其任何组合。
265.如权利要求211-264中任一项所述的方法，其中该对照颗粒包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮、或其任何组合的材料。
266.如权利要求211-265中任一项所述的方法，其中该对照颗粒包括可破坏的水凝胶颗粒。
267.如权利要求211-266中任一项所述的方法，其中该对照颗粒与可检测部分相关联。
268.如权利要求211-267中任一项所述的方法，其中该对照颗粒寡核苷酸与可检测部分相关联。
269.如权利要求211-268中任一项所述的方法，
其中该对照颗粒与多个第一蛋白质结合试剂相关联，并且
其中该多个第一蛋白质结合试剂中的至少一个与该多个对照颗粒寡核苷酸中的一个相关联。
270.如权利要求269所述的方法，其中该第一蛋白质结合试剂包括第一抗体。
271.如权利要求269-270中任一项所述的方法，其中该对照颗粒寡核苷酸通过接头与该第一蛋白质结合试剂缀合。
272.如权利要求271所述的方法，其中该第一对照颗粒寡核苷酸包括该接头。
273.如权利要求271-272中任一项所述的方法，其中该接头包括化学基团。
274.如权利要求273所述的方法，其中该化学基团可逆地附接至该第一蛋白质结合试剂。
275.如权利要求273-274中任一项所述的方法，其中该化学基团包括UV可光解基团、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、二硫键联、或其任何组合。
276.如权利要求269-275中任一项所述的方法，其中该第一蛋白质结合试剂与该多个对照颗粒寡核苷酸中的具有相同对照条形码序列的两个或更多个相关联。
277.如权利要求269-276中任一项所述的方法，其中该第一蛋白质结合试剂与该多个对照颗粒寡核苷酸中的具有不同对照条形码序列的两个或更多个相关联。
278.如权利要求269-277中任一项所述的方法，其中该多个第一蛋白质结合试剂中的至少一个不与该多个对照颗粒寡核苷酸中的任一个相关联。
279.如权利要求278所述的方法，其中与该对照颗粒寡核苷酸相关联的第一蛋白质结合试剂和不与任何对照颗粒寡核苷酸相关联的第一蛋白质结合试剂是相同的蛋白质结合试剂。
280.如权利要求278-279中任一项所述的方法，其中该对照颗粒与多个第二蛋白质结合试剂相关联。
281.如权利要求280所述的方法，其中该多个第二蛋白质结合试剂中至少一个与该多个对照颗粒寡核苷酸中的一个相关联。
282.如权利要求281所述的方法，其中与该第一蛋白质结合试剂相关联的对照颗粒寡核苷酸以及与该第二蛋白质结合试剂相关联的对照颗粒寡核苷酸包括不同的对照条形码序列。
283.如权利要求281所述的方法，其中该第一蛋白质结合试剂和该第二蛋白质结合试剂是相同的蛋白质结合试剂。
284.如权利要求269-283中任一项所述的方法，其中该第一蛋白质结合试剂与配偶体结合试剂相关联，并且其中使用配偶体结合试剂使该第一蛋白质结合试剂与该对照颗粒相关联。
285.如权利要求284所述的方法，其中该配偶体结合试剂包括配偶体抗体。
286.如权利要求285所述的方法，其中该配偶体抗体包括抗猫抗体、抗鸡抗体、抗奶牛抗体、抗狗抗体、抗驴抗体、抗山羊抗体、抗豚鼠抗体、抗仓鼠抗体、抗马抗体、抗人抗体、抗美洲驼抗体、抗猴抗体、抗小鼠抗体、抗猪抗体、抗兔抗体、抗大鼠抗体、抗绵羊抗体、或其组合。
287.如权利要求285-286中任一项所述的方法，其中该配偶体抗体包括免疫球蛋白G(IgG)、F(ab’)片段、F(ab’)2片段、其组合、或其片段。
288.如权利要求269-287中任一项所述的方法，其中该第一蛋白质结合试剂与可检测部分相关联。
289.如权利要求269-288中任一项所述的方法，其中该第二蛋白质结合试剂与可检测部分相关联。
290.如权利要求211-287中任一项所述的方法，其中该条形码包括通用引物的结合位点。
291.如权利要求211-290中任一项所述的方法，其中该靶结合区包括聚(dT)区。
292.如权利要求211-291中任一项所述的方法，其中该多个条形码与条形码化颗粒相关联。
293.如权利要求292所述的方法，其中该多个条形码中的至少一个条形码被固定在该条形码化颗粒上。
294.如权利要求292所述的方法，其中该多个条形码中的至少一个条形码被部分固定在该条形码化颗粒上。
295.如权利要求292所述的方法，其中该多个条形码中的至少一个条形码被包封在该条形码化颗粒中。
296.如权利要求292所述的方法，其中该多个条形码中的至少一个条形码被部分包封在该条形码化颗粒中。
297.如权利要求292-296中任一项所述的方法，其中该条形码化颗粒是可破坏的。
298.如权利要求292-297中任一项所述的方法，其中该条形码化颗粒包括条形码化珠。
299.如权利要求292-298中任一项所述的方法，其中该条形码化珠包括琼脂糖凝胶珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠、或其任何组合。
300.如权利要求292-299中任一项所述的方法，其中该条形码化颗粒包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮、或其任何组合的材料。
301.如权利要求292-300中任一项所述的方法，其中该条形码化颗粒包括可破坏的水凝胶颗粒。
302.如权利要求292-301中任一项所述的方法，其中该条形码化颗粒的条形码包括选自至少1000种不同的条形码序列的条形码序列。
303.如权利要求292-302中任一项所述的方法，其中条形码化颗粒的条形码包括选自至少10000种不同的条形码序列的条形码序列。
304.如权利要求292-303中任一项所述的方法，其中这些条形码的条形码序列包括随机序列。
305.如权利要求292-304中任一项所述的方法，其中该条形码化颗粒包括至少10000个条形码。
306.如权利要求211-305中任一项所述的方法，其中使用该多个条形码使该多个靶和该多个对照颗粒寡核苷酸条形码化包括：
使该多个条形码与该多个靶的靶以及该多个对照颗粒寡核苷酸的对照颗粒寡核苷酸接触以生成与这些靶和这些对照颗粒寡核苷酸杂交的条形码；并且
延伸与这些靶和这些对照颗粒寡核苷酸杂交的条形码以生成多个条形码化的靶和多个条形码化的对照颗粒寡核苷酸。
307.如权利要求306所述的方法，其中延伸这些条形码包括使用DNA聚合酶、逆转录酶、或其组合延伸这些条形码。
308.如权利要求211-307中任一项所述的方法，该方法包括扩增该多个条形码化的靶和该多个条形码化的对照颗粒寡核苷酸以产生多个扩增子。
309.如权利要求308所述的方法，其中扩增该多个条形码化的靶和该多个条形码化的对照颗粒寡核苷酸包括使用聚合酶链式反应(PCR)对，
该条形码序列的至少一部分和该对照颗粒寡核苷酸的至少一部分或
该条形码序列的至少一部分和该对照颗粒寡核苷酸的至少一部分进行扩增。
310.如权利要求308-309中任一项所述的方法，其中获得测序数据包括获得该多个扩增子的测序数据。
311.如权利要求310所述的方法，其中获得测序数据包括对
该条形码序列的至少一部分和该对照颗粒寡核苷酸的至少一部分，或
该条形码序列的至少一部分和该对照颗粒寡核苷酸的至少一部分进行测序。
312.一种试剂盒，该试剂盒包括：
包括与对照颗粒相关联的多个对照颗粒寡核苷酸的对照颗粒组合物，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中的每一个包括对照条形码序列和聚(dA)区。
313.如权利要求312所述的试剂盒，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中至少两个包括不同的对照条形码序列。
314.如权利要求312-313中任一项所述的试剂盒，其中该对照条形码序列长度为至少6个核苷酸。
315.如权利要求312-313中任一项所述的试剂盒，其中该对照条形码序列长度为25-45个核苷酸。
316.如权利要求312-313中任一项所述的试剂盒，其中该对照条形码序列长度为约128个核苷酸。
317.如权利要求312-313中任一项所述的试剂盒，其中该对照条形码序列长度为至少128个核苷酸。
318.如权利要求312-313中任一项所述的试剂盒，其中该对照条形码序列长度为约200-500个核苷酸。
319.如权利要求312-315中任一项所述的试剂盒，其中该对照颗粒寡核苷酸长度为约50个核苷酸。
320.如权利要求312-315中任一项所述的试剂盒，其中该对照颗粒寡核苷酸长度为约100个核苷酸。
321.如权利要求312-317中任一项所述的试剂盒，其中该对照颗粒寡核苷酸长度为约200个核苷酸。
322.如权利要求312-317中任一项所述的试剂盒，其中该对照颗粒寡核苷酸长度为至少200个核苷酸。
323.如权利要求312-318中任一项所述的试剂盒，其中该对照颗粒寡核苷酸长度为少于约200-300个核苷酸。
324.如权利要求312-318中任一项所述的试剂盒，其中该对照颗粒寡核苷酸长度为约500个核苷酸。
325.如权利要求312-324中任一项所述的试剂盒，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中至少五个的对照条形码序列是相同的。
326.如权利要求312-324中任一项所述的试剂盒，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中约10个的对照条形码序列是相同的。
327.如权利要求312-324中任一项所述的试剂盒，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中约100个的对照条形码序列是相同的。
328.如权利要求312-324中任一项所述的试剂盒，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中约1000个的对照条形码序列是相同的。
329.如权利要求312-328中任一项所述的试剂盒，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中至少三个包括不同的对照条形码序列。
330.如权利要求312-328中任一项所述的试剂盒，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中至少五个包括不同的序列。
331.如权利要求312-328中任一项所述的试剂盒，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中至少10个包括不同的序列。
332.如权利要求312-328中任一项所述的试剂盒，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中至少100个包括不同的序列。
333.如权利要求312-332中任一项所述的试剂盒，
其中该多个对照颗粒寡核苷酸包括
多个第一对照颗粒寡核苷酸，其各自包括第一对照条形码序列，和
多个第二对照颗粒寡核苷酸，其包括第二对照条形码序列，并且
其中该第一对照条形码序列和该第二对照条形码序列具有不同的序列。
334.如权利要求333所述的试剂盒，其中该多个第一对照颗粒寡核苷酸的数量和该多个第二对照颗粒寡核苷酸的数量大约是相同的。
335.如权利要求333所述的试剂盒，其中该多个第一对照颗粒寡核苷酸的数量和该多个第二对照颗粒寡核苷酸的数量是不同的。
336.如权利要求335所述的试剂盒，其中该多个第一对照颗粒寡核苷酸的数量至少两倍高于该多个第二对照颗粒寡核苷酸的数量。
337.如权利要求335所述的试剂盒，其中该多个第一对照颗粒寡核苷酸的数量至少10倍高于该多个第二对照颗粒寡核苷酸的数量。
338.如权利要求335所述的试剂盒，其中该多个第一对照颗粒寡核苷酸的数量约100倍高于该多个第二对照颗粒寡核苷酸的数量。
339.如权利要求312-338中任一项所述的试剂盒，其中该对照条形码序列与物种的基因组序列不同源。
340.如权利要求312-338中任一项所述的试剂盒，其中该对照条形码序列与物种的基因组序列同源。
341.如权利要求340所述的试剂盒，其中该物种是非哺乳动物物种。
342.如权利要求341所述的试剂盒，其中该非哺乳动物物种是噬菌体物种。
343.如权利要求342所述的试剂盒，其中该噬菌体物种是T7噬菌体、PhiX噬菌体、或其组合。
344.如权利要求312-343中任一项所述的试剂盒，其中该第一对照颗粒寡核苷酸包括条形码序列。
345.如权利要求312-344中任一项所述的试剂盒，其中该第一对照颗粒寡核苷酸包括通用引物的结合位点。
346.如权利要求312-345中任一项所述的试剂盒，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中的至少一个通过接头与该对照颗粒相关联。
347.如权利要求346所述的试剂盒，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中的至少一个包括该接头。
348.如权利要求346-347中任一项所述的试剂盒，其中该接头包括化学基团。
349.如权利要求348所述的试剂盒，其中该化学基团可逆地附接至该多个对照颗粒寡核苷酸中的至少一个。
350.如权利要求348-349中任一项所述的试剂盒，其中该化学基团包括UV可光解基团、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、二硫键联、或其任何组合。
351.如权利要求312-350中任一项所述的试剂盒，其中该对照颗粒的直径是约1-1000微米。
352.如权利要求312-350中任一项所述的试剂盒，其中该对照颗粒的直径是约10-100微米。
353.如权利要求312-350中任一项所述的试剂盒，其中该对照颗粒的直径是约7.5微米。
354.如权利要求312-353中任一项所述的试剂盒，其中该多个对照颗粒寡核苷酸被固定在该对照颗粒上。
355.如权利要求312-353中任一项所述的试剂盒，其中该多个对照颗粒寡核苷酸被部分固定在该对照颗粒上。
356.如权利要求312-353中任一项所述的试剂盒，其中该多个对照颗粒寡核苷酸被包封在该对照颗粒中。
357.如权利要求312-353中任一项所述的试剂盒，其中该多个对照颗粒寡核苷酸被部分包封在该对照颗粒中。
358.如权利要求312-357中任一项所述的试剂盒，其中该对照颗粒是可破坏的。
359.如权利要求312-358中任一项所述的试剂盒，其中该对照颗粒包括珠。
360.如权利要求359所述的试剂盒，其中该珠包括琼脂糖凝胶珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠、或其任何组合。
361.如权利要求312-360中任一项所述的试剂盒，其中该对照颗粒包括选自下组的材料，该组由以下组成：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮、及其任何组合。
362.如权利要求312-361中任一项所述的试剂盒，其中该对照颗粒包括可破坏的水凝胶颗粒。
363.如权利要求312-362中任一项所述的试剂盒，其中该对照颗粒与可检测部分相关联。
364.如权利要求312-363中任一项所述的试剂盒，其中该对照颗粒寡核苷酸与可检测部分相关联。
365.如权利要求312-364中任一项所述的试剂盒，
其中该对照颗粒与多个第一蛋白质结合试剂相关联，并且
其中该多个第一蛋白质结合试剂中的至少一个与该多个对照颗粒寡核苷酸中的一个相关联。
366.如权利要求365所述的试剂盒，其中该第一蛋白质结合试剂包括第一抗体。
367.如权利要求365-366中任一项所述的试剂盒，其中该对照颗粒寡核苷酸通过接头与该第一蛋白质结合试剂缀合。
368.如权利要求367所述的试剂盒，其中该第一对照颗粒寡核苷酸包括该接头。
369.如权利要求367-368中任一项所述的试剂盒，其中该接头包括化学基团。
370.如权利要求369所述的试剂盒，其中该化学基团可逆地附接至该第一蛋白质结合试剂。
371.如权利要求369-370中任一项所述的试剂盒，其中该化学基团包括UV可光解基团、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、二硫键联、或其任何组合。
372.如权利要求365-371中任一项所述的试剂盒，其中该第一蛋白质结合试剂与该多个对照颗粒寡核苷酸中的具有相同对照条形码序列的两个或更多个相关联。
373.如权利要求365-372中任一项所述的试剂盒，其中该第一蛋白质结合试剂与该多个对照颗粒寡核苷酸中的具有不同对照条形码序列的两个或更多个相关联。
374.如权利要求365-373中任一项所述的试剂盒，其中该多个第一蛋白质结合试剂中的至少一个不与该多个对照颗粒寡核苷酸中的任一个相关联。
375.如权利要求374所述的试剂盒，其中与该对照颗粒寡核苷酸相关联的第一蛋白质结合试剂和不与任何对照颗粒寡核苷酸相关联的第一蛋白质结合试剂是相同的蛋白质结合试剂。
376.如权利要求365-375中任一项所述的试剂盒，其中该对照颗粒与多个第二蛋白质结合试剂相关联。
377.如权利要求376所述的试剂盒，其中该多个第二蛋白质结合试剂中至少一个与该多个对照颗粒寡核苷酸中的一个相关联。
378.如权利要求377所述的试剂盒，其中与该第一蛋白质结合试剂相关联的对照颗粒寡核苷酸以及与该第二蛋白质结合试剂相关联的对照颗粒寡核苷酸包括不同的对照条形码序列。
379.如权利要求377所述的试剂盒，其中该第一蛋白质结合试剂和该第二蛋白质结合试剂是相同的蛋白质结合试剂。
380.如权利要求365-375中任一项所述的试剂盒，其中该第一蛋白质结合试剂与配偶体结合试剂相关联，并且其中使用配偶体结合试剂使该第一蛋白质结合试剂与该对照颗粒相关联。
381.如权利要求380所述的试剂盒，其中该配偶体蛋白质结合试剂包括配偶体抗体。
382.如权利要求381所述的试剂盒，其中该配偶体抗体包括抗猫抗体、抗鸡抗体、抗奶牛抗体、抗狗抗体、抗驴抗体、抗山羊抗体、抗豚鼠抗体、抗仓鼠抗体、抗马抗体、抗人抗体、抗美洲驼抗体、抗猴抗体、抗小鼠抗体、抗猪抗体、抗兔抗体、抗大鼠抗体、抗绵羊抗体、或其组合。
383.如权利要求381-382中任一项所述的试剂盒，其中该第二抗体包括免疫球蛋白G(IgG)、F(ab’)片段、F(ab’)2片段、其组合、或其片段。
384.如权利要求312-383中任一项所述的试剂盒，其中该第一蛋白质结合试剂与可检测部分相关联。
385.如权利要求312-384中任一项所述的试剂盒，其中该第二蛋白质结合试剂与可检测部分相关联。
386.如权利要求312-383中任一项所述的试剂盒，该试剂盒包括多个条形码。
387.如权利要求386所述的试剂盒，
其中该多个条形码中的条形码包括靶结合区和条形码序列，并且
其中该多个条形码中至少两个条形码的条形码序列包括不同的分子标记序列。
388.如权利要求387所述的试剂盒，其中该条形码包括细胞标记序列、通用引物的结合位点、或其任何组合。
389.如权利要求387-388中任一项所述的试剂盒，其中该靶结合区包括聚(dT)区。
390.如权利要求386-389中任一项所述的试剂盒，其中该多个条形码与条形码化颗粒相关联。
391.如权利要求390所述的试剂盒，其中该多个条形码中的至少一个条形码被固定在该条形码化颗粒上。
392.如权利要求390所述的试剂盒，其中该多个条形码中的至少一个条形码被部分固定在该条形码化颗粒上。
393.如权利要求390所述的试剂盒，其中该多个条形码中的至少一个条形码被包封在该条形码化颗粒中。
394.如权利要求390所述的试剂盒，其中该多个条形码中的至少一个条形码被部分包封在该条形码化颗粒中。
395.如权利要求390-394中任一项所述的试剂盒，其中该条形码化颗粒是可破坏的。
396.如权利要求390-395中任一项所述的试剂盒，其中该条形码化颗粒包括第二珠。
397.如权利要求390-396中任一项所述的试剂盒，其中该条形码化颗粒包括琼脂糖凝胶珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠、或其任何组合。
398.如权利要求390-397中任一项所述的试剂盒，其中该条形码化颗粒包括选自下组的材料，该组由以下组成：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮、及其任何组合。
399.如权利要求390-398中任一项所述的试剂盒，其中该条形码化颗粒包括可破坏的水凝胶颗粒。
400.如权利要求390-399中任一项所述的试剂盒，其中该条形码化颗粒的条形码包括选自至少1000种不同的条形码序列的条形码序列。
401.如权利要求390-400中任一项所述的试剂盒，其中条形码化颗粒的条形码包括选自至少10000种不同的条形码序列的条形码序列。
402.如权利要求390-401中任一项所述的试剂盒，其中这些条形码的条形码序列包括随机序列。
403.如权利要求390-402中任一项所述的试剂盒，其中该条形码化颗粒包括至少10000个条形码。
404.如权利要求306-403中任一项所述的试剂盒，该试剂盒包括DNA聚合酶。
405.如权利要求306-404中任一项所述的试剂盒，该试剂盒包括用于聚合酶链式反应(PCR)的试剂。
406.一种用于测序对照的方法，该方法包括：
使多个细胞中的一个或多个细胞与多个对照组合物中的对照组合物接触，
其中该多个细胞中的细胞包括多个靶和多个蛋白质靶，
其中该多个对照组合物中的每一个包括与对照寡核苷酸相关联的蛋白质结合试剂，其中该蛋白质结合试剂能够特异性结合该多个蛋白质靶中的至少一个，并且其中该对照寡核苷酸包括对照条形码序列和假-靶区，该假-靶区包括与该多个条形码中至少一个的靶结合区基本互补的序列；
使用多个条形码使该对照寡核苷酸条形码化，以创建多个条形码化的对照寡核苷酸，
其中该多个条形码的每个包括细胞标记序列、条形码序列、和靶结合区，其中该多个条形码中的至少两个条形码的条形码序列包括不同的序列，并且其中该多个条形码中的至少两个条形码包括相同的细胞标记序列；
获得该多个条形码化的对照寡核苷酸的测序数据；
使用测序数据中该多个条形码化的对照寡核苷酸的至少一个特征确定该一个或多个细胞的至少一个特征。
407.如权利要求406所述的方法，其中该假-靶区包括聚(dA)区。
408.如权利要求406-407中任一项所述的方法，其中该对照条形码序列长度为至少6个核苷酸。
409.如权利要求406-407中任一项所述的方法，其中该对照条形码序列长度为25-45个核苷酸。
410.如权利要求406-407中任一项所述的方法，其中该对照条形码序列长度为约128个核苷酸。
411.如权利要求406-407中任一项所述的方法，其中该对照条形码序列长度为至少128个核苷酸。
412.如权利要求406-407中任一项所述的方法，其中该对照条形码序列长度为约200-500个核苷酸。
413.如权利要求406-409中任一项所述的方法，其中该对照条形码寡核苷酸长度为约50个核苷酸。
414.如权利要求406-409中任一项所述的方法，其中该对照条形码寡核苷酸长度为约100个核苷酸。
415.如权利要求406-411中任一项所述的方法，其中该对照条形码寡核苷酸长度为约200个核苷酸。
416.如权利要求406-411中任一项所述的方法，其中该对照条形码寡核苷酸长度为至少200个核苷酸。
417.如权利要求406-412中任一项所述的方法，其中该对照条形码寡核苷酸长度为少于约200-300个核苷酸。
418.如权利要求406-412中任一项所述的方法，其中该对照条形码寡核苷酸长度为约500个核苷酸。
419.如权利要求406-418中任一项所述的方法，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中至少两个的对照条形码序列是相同的。
420.如权利要求406-418中任一项所述的方法，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中约10个的对照条形码序列是相同的。
421.如权利要求406-418中任一项所述的方法，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中约100个的对照条形码序列是相同的。
422.如权利要求406-418中任一项所述的方法，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中约1000个的对照条形码序列是相同的。
423.如权利要求406-422中任一项所述的方法，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中至少两个包括不同的对照条形码序列。
424.如权利要求406-422中任一项所述的方法，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中至少10个包括不同的序列。
425.如权利要求406-422中任一项所述的方法，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中至少100个包括不同的序列。
426.如权利要求406-422中任一项所述的方法，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中至少1000个包括不同的序列。
427.如权利要求406-426中任一项所述的方法，其中确定该一个或多个细胞的至少一个特征包括：
确定测序数据中与该多个条形码化的对照寡核苷酸相关联的具有不同序列的细胞标记序列的数量；并且
使用与该多个条形码化的对照寡核苷酸相关联的具有不同序列的细胞标记序列的数量，确定该一个或多个细胞的数量。
428.如权利要求427所述的方法，该方法包括基于经确定的该一个或多个细胞的数量确定单个细胞捕获效率。
429.如权利要求427所述的方法，该方法包括基于经确定的该一个或多个细胞的数量和该多个细胞的数量的比率确定单个细胞捕获效率。
430.如权利要求406-426中任一项所述的方法，其中使用测序数据中该多个条形码化的对照寡核苷酸的特征确定该一个或多个细胞的至少一个特征包括：
对于测序数据中的每个细胞标记，确定与该细胞标记和该对照条形码序列相关联的具有不同序列的条形码序列的数量；并且
使用与该细胞标记和该对照条形码序列相关联的具有不同序列的条形码序列的数量确定该一个或多个细胞的数量。
431.如权利要求430所述的方法，其中确定与该细胞标记和该对照条形码序列相关联的具有不同序列的条形码序列的数量包括：
对于测序数据中的每个细胞标记，确定与该细胞标记和该对照条形码序列相关联的具有最多数量不同序列的条形码序列的数量。
432.如权利要求431所述的方法，其中使用与该细胞标记和该对照条形码序列相关联的具有不同序列的条形码序列的数量确定该一个或多个细胞的数量包括：
生成具有最多数量不同序列的条形码序列的数量和测序数据中与具有最多数量不同序列的条形码序列的数量相关联的细胞标记的数量的图；并且
在该图中确定截止值作为该一个或多个细胞的数量。
433.如权利要求406-432中任一项所述的方法，其中该对照寡核苷酸与该多个细胞中任一个的基因组序列不同源。
434.如权利要求406-433中任一项所述的方法，其中该对照寡核苷酸与物种的基因组序列同源。
435.如权利要求434所述的方法，其中该物种是非哺乳动物物种。
436.如权利要求435所述的方法，其中该非哺乳动物物种是噬菌体物种。
437.如权利要求436所述的方法，其中该噬菌体物种是T7噬菌体、PhiX噬菌体、或其组合。
438.如权利要求406-433中任一项所述的方法，该方法包括在使该对照寡核苷酸条形码化之前从该蛋白质结合试剂释放该对照寡核苷酸。
439.如权利要求406-438中任一项所述的方法，该方法包括去除该多个对照组合物中未结合的对照组合物。
440.如权利要求439所述的方法，其中去除这些未结合的对照组合物包括用洗涤缓冲液洗涤该多个细胞中的一个或多个细胞。
441.如权利要求439所述的方法，其中去除这些未结合的细胞鉴定组合物包括使用流式细胞术选择与该对照组合物的至少一个蛋白质结合试剂结合的细胞。
442.如权利要求406-438中任一项所述的方法，其中该多个蛋白质靶中的至少一个在细胞表面上。
443.如权利要求406-442中任一项所述的方法，其中该多个蛋白质靶中的至少一个包括细胞表面蛋白质、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、整合素、或其任何组合。
444.如权利要求406-443中任一项所述的方法，其中该蛋白质结合试剂包括抗体。
445.如权利要求406-444中任一项所述的方法，其中该对照寡核苷酸通过接头与该蛋白质结合试剂缀合。
446.如权利要求445所述的方法，其中该对照寡核苷酸包括该接头。
447.如权利要求445-446中任一项所述的方法，其中该接头包括化学基团。
448.如权利要求447所述的方法，其中该化学基团可逆地附接至该第一蛋白质结合试剂。
449.如权利要求447-448中任一项所述的方法，其中该化学基团包括UV可光解基团、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、二硫键联、或其任何组合。
450.如权利要求406-449中任一项所述的方法，其中该蛋白质结合试剂与具有相同对照条形码序列的两个或更多个对照寡核苷酸相关联。
451.如权利要求406-449中任一项所述的方法，其中该蛋白质结合试剂与具有不同相同的对照条形码序列的两个或更多个对照寡核苷酸相关联。
452.如权利要求中406-451任一项所述的方法，其中该多个对照组合物的第二蛋白质结合试剂不与该对照寡核苷酸相关联。
453.如权利要求452所述的方法，其中该蛋白质结合试剂和该第二蛋白质结合试剂是相同的。
454.如权利要求406-453中任一项所述的方法，其中该条形码包括通用引物的结合位点。
455.如权利要求406-454中任一项所述的方法，其中该靶结合区包括聚(dT)区。
456.如权利要求406-454中任一项所述的方法，其中该多个条形码与条形码化颗粒相关联。
457.如权利要求456所述的方法，其中该多个条形码中的至少一个条形码被固定在该条形码化颗粒上。
458.如权利要求456所述的方法，其中该多个条形码中的至少一个条形码被部分固定在该条形码化颗粒上。
459.如权利要求456所述的方法，其中该多个条形码中的至少一个条形码被包封在该条形码化颗粒中。
460.如权利要求456所述的方法，其中该多个条形码中的至少一个条形码被部分包封在该条形码化颗粒中。
461.如权利要求456-460中任一项所述的方法，其中该条形码化颗粒是可破坏的。
462.如权利要求456-461中任一项所述的方法，其中该条形码化颗粒包括条形码化珠。
463.如权利要求456-462中任一项所述的方法，其中该条形码化珠包括琼脂糖凝胶珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠、或其任何组合。
464.如权利要求456-463中任一项所述的方法，其中该条形码化颗粒包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮、或其任何组合的材料。
465.如权利要求456-464中任一项所述的方法，其中该条形码化颗粒包括可破坏的水凝胶颗粒。
466.如权利要求456-465中任一项所述的方法，其中该条形码化颗粒与光学部分相关联。
467.如权利要求456-466中任一项所述的对照颗粒组合物，其中该对照寡核苷酸与光学部分相关联。
468.如权利要求456-467中任一项所述的方法，其中该条形码化颗粒的条形码包括选自至少1000种不同的条形码序列的条形码序列。
469.如权利要求456-468中任一项所述的方法，其中条形码化颗粒的条形码包括选自至少10000种不同的条形码序列的条形码序列。
470.如权利要求456-469中任一项所述的方法，其中这些条形码的条形码序列包括随机序列。
471.如权利要求456-470中任一项所述的方法，其中该条形码化颗粒包括至少10000个条形码。
472.如权利要求406-471中任一项所述的方法，其中使该对照寡核苷酸条形码化包括：使用多个条形码使该对照寡核苷酸条形码化，以创建多个条形码化的对照寡核苷酸。
473.如权利要求406-472中任一项所述的方法，其中使用该多个条形码使该多个对照寡核苷酸条形码化包括：
使该多个条形码与该多个对照组合物的对照寡核苷酸接触以生成与这些对照寡核苷酸杂交的条形码；并且
延伸与这些对照寡核苷酸杂交的条形码以生成多个条形码化的对照寡核苷酸。
474.如权利要求473所述的方法，其中延伸这些条形码包括使用DNA聚合酶、逆转录酶、或其组合延伸这些条形码。
475.如权利要求406-474中任一项所述的方法，该方法包括扩增该多个条形码化的对照寡核苷酸以产生多个扩增子。
476.如权利要求475所述的方法，其中扩增该多个条形码化的对照寡核苷酸包括使用聚合酶链式反应(PCR)对该条形码序列的至少一部分和该对照寡核苷酸的至少一部分进行扩增。
477.如权利要求475-476中任一项所述的方法，其中获得测序数据包括获得该多个扩增子的测序数据。
478.如权利要求477所述的方法，其中获得测序数据包括对该条形码序列的至少一部分和该对照寡核苷酸的至少一部分进行测序。
479.一种用于测序对照的方法，该方法包括：
使多个细胞中的一个或多个细胞与多个对照组合物中的对照组合物接触，
其中该多个细胞中的细胞包括多个靶和多个结合靶，
其中该多个对照组合物中的每一个包括与对照寡核苷酸相关联的细胞组分结合试剂，其中该细胞组分结合试剂能够特异性结合该多个细胞组分靶中的至少一个，并且其中该对照寡核苷酸包括对照条形码序列和假-靶区，该假-靶区包括与该多个条形码中至少一个的靶结合区基本互补的序列；
使用多个条形码使该对照寡核苷酸条形码化，以创建多个条形码化的对照寡核苷酸，
其中该多个条形码的每个包括细胞标记序列、条形码序列、和靶结合区，其中该多个条形码中的至少两个条形码的条形码序列包括不同的序列，并且其中该多个条形码中的至少两个条形码包括相同的细胞标记序列；
获得该多个条形码化的对照寡核苷酸的测序数据；
使用测序数据中该多个条形码化的对照寡核苷酸的至少一个特征确定该一个或多个细胞的至少一个特征。
480.如权利要求479所述的方法，其中该假-靶区包括聚(dA)区。
481.如权利要求479-480中任一项所述的方法，其中该对照条形码序列长度为至少6个核苷酸。
482.如权利要求479-480中任一项所述的方法，其中该对照条形码序列长度为25-45个核苷酸。
483.如权利要求479-480中任一项所述的方法，其中该对照条形码序列长度为约128个核苷酸。
484.如权利要求479-480中任一项所述的方法，其中该对照条形码序列长度为至少128个核苷酸。
485.如权利要求479-480中任一项所述的方法，其中该对照条形码序列长度为约200-500个核苷酸。
486.如权利要求479-482中任一项所述的方法，其中该对照条形码寡核苷酸长度为约50个核苷酸。
487.如权利要求479-482中任一项所述的方法，其中该对照条形码寡核苷酸长度为约100个核苷酸。
488.如权利要求479-484中任一项所述的方法，其中该对照条形码寡核苷酸长度为约200个核苷酸。
489.如权利要求479-484中任一项所述的方法，其中该对照条形码寡核苷酸长度为至少200个核苷酸。
490.如权利要求479-485中任一项所述的方法，其中该对照条形码寡核苷酸长度为少于约200-300个核苷酸。
491.如权利要求479-485中任一项所述的方法，其中该对照条形码寡核苷酸长度为约500个核苷酸。
492.如权利要求479-491中任一项所述的方法，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中至少两个的对照条形码序列是相同的。
493.如权利要求479-491中任一项所述的方法，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中约10个的对照条形码序列是相同的。
494.如权利要求479-491中任一项所述的方法，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中约100个的对照条形码序列是相同的。
495.如权利要求479-491中任一项所述的方法，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中约1000个的对照条形码序列是相同的。
496.如权利要求479-495中任一项所述的方法，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中至少两个包括不同的对照条形码序列。
497.如权利要求479-495中任一项所述的方法，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中至少10个包括不同的序列。
498.如权利要求479-495中任一项所述的方法，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中至少100个包括不同的序列。
499.如权利要求479-495中任一项所述的方法，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中至少1000个包括不同的序列。
500.如权利要求479-499中任一项所述的方法，其中确定该一个或多个细胞的至少一个特征包括：
确定测序数据中与该多个条形码化的对照寡核苷酸相关联的具有不同序列的细胞标记序列的数量；并且
使用与该多个条形码化的对照寡核苷酸相关联的具有不同序列的细胞标记序列的数量，确定该一个或多个细胞的数量。
501.如权利要求500所述的方法，该方法包括基于经确定的该一个或多个细胞的数量确定单个细胞捕获效率。
502.如权利要求500所述的方法，该方法包括基于经确定的该一个或多个细胞的数量和该多个细胞的数量的比率确定单个细胞捕获效率。
503.如权利要求479-499中任一项所述的方法，其中确定该一个或多个细胞的至少一个特征包括：
对于测序数据中的每个细胞标记，确定与该细胞标记和该对照条形码序列相关联的具有不同序列的条形码序列的数量；并且
使用与该细胞标记和该对照条形码序列相关联的具有不同序列的条形码序列的数量确定该一个或多个细胞的数量。
504.如权利要求503所述的方法，其中确定与该细胞标记和该对照条形码序列相关联的具有不同序列的条形码序列的数量包括：
对于测序数据中的每个细胞标记，确定与该细胞标记和该对照条形码序列相关联的具有最多数量不同序列的条形码序列的数量。
505.如权利要求504所述的方法，其中使用与该细胞标记和该对照条形码序列相关联的具有不同序列的条形码序列的数量确定该一个或多个细胞的数量包括：
生成具有最多数量不同序列的条形码序列的数量和测序数据中与具有最多数量不同序列的条形码序列的数量相关联的细胞标记的数量的图；并且
在该图中确定截止值作为该一个或多个细胞的数量。
506.如权利要求479-505中任一项所述的方法，其中该对照寡核苷酸与该多个细胞中任一个的基因组序列不同源。
507.如权利要求479-506中任一项所述的方法，其中该对照寡核苷酸与物种的基因组序列同源。
508.如权利要求507所述的方法，其中该物种是非哺乳动物物种。
509.如权利要求508所述的方法，其中该非哺乳动物物种是噬菌体物种。
510.如权利要求509所述的方法，其中该噬菌体物种是T7噬菌体、PhiX噬菌体、或其组合。
511.如权利要求479-506中任一项所述的方法，该方法包括在使该对照寡核苷酸条形码化之前从该细胞组分结合试剂释放该对照寡核苷酸。
512.如权利要求479-511中任一项所述的方法，其中该多个结合靶中至少一个在细胞表面上表达。
513.如权利要求479-512中任一项所述的方法，其中该多个结合靶中的至少一个包括细胞表面蛋白质、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、整合素、或其任何组合。
514.如权利要求479-513中任一项所述的方法，其中该细胞组分结合试剂包括细胞表面结合试剂、抗体、四聚体、适配子、蛋白质骨架、侵入物、或其组合。
515.如权利要求479-514中任一项所述的方法，其中该细胞组分结合试剂的结合靶选自包括10-100种不同的结合靶的组。
516.如权利要求515所述的方法，其中该细胞组分结合试剂的结合靶包括碳水化合物、脂质、蛋白质、细胞外蛋白质、细胞表面蛋白质、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、整合素、细胞内蛋白质、或其任何组合。
517.如权利要求479-516中任一项所述的方法，其中该对照寡核苷酸通过接头与细胞组分结合试剂缀合。
518.如权利要求517所述的方法，其中该对照寡核苷酸包括该接头。
519.如权利要求517-518中任一项所述的方法，其中该接头包括化学基团。
520.如权利要求519所述的方法，其中该化学基团可逆地附接至该第一细胞组分结合试剂。
521.如权利要求519-520中任一项所述的方法，其中该化学基团包括UV可光解基团、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、二硫键联、或其任何组合。
522.如权利要求479-521中任一项所述的方法，其中该细胞组分结合试剂与具有相同对照条形码序列的两个或更多个对照寡核苷酸相关联。
523.如权利要求479-521中任一项所述的方法，其中该细胞组分结合试剂与具有不同相同的对照条形码序列的两个或更多个对照寡核苷酸相关联。
524.如权利要求中479-523任一项所述的方法，其中该多个对照组合物的第二细胞组分结合试剂不与该对照寡核苷酸相关联。
525.如权利要求524所述的方法，其中该细胞组分结合试剂和该第二细胞组分结合试剂是相同的。
526.如权利要求479-525中任一项所述的方法，其中该条形码包括通用引物的结合位点。
527.如权利要求479-526中任一项所述的方法，其中该靶结合区包括聚(dT)区。
528.如权利要求479-527中任一项所述的方法，其中该多个条形码与条形码化颗粒相关联。
529.如权利要求528所述的方法，其中该多个条形码中的至少一个条形码被固定在条形码化颗粒上。
530.如权利要求528所述的方法，其中该多个条形码中的至少一个条形码被部分固定在该条形码化颗粒上。
531.如权利要求528所述的方法，其中该多个条形码中的至少一个条形码被包封在该条形码化颗粒中。
532.如权利要求528所述的方法，其中该多个条形码中的至少一个条形码被部分包封在该条形码化颗粒中。
533.如权利要求529-532中任一项所述的方法，其中该条形码化颗粒是可破坏的。
534.如权利要求528-533中任一项所述的方法，其中该条形码化颗粒包括条形码化珠。
535.如权利要求528-534中任一项所述的方法，其中该条形码化颗粒包括琼脂糖凝胶珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠、或其任何组合。
536.如权利要求528-535中任一项所述的方法，其中该条形码化颗粒包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮、或其任何组合的材料。
537.如权利要求528-536中任一项所述的方法，其中该条形码化颗粒包括可破坏的水凝胶颗粒。
538.如权利要求528-537中任一项所述的方法，其中该条形码化颗粒与光学部分相关联。
539.如权利要求528-538中任一项所述的对照颗粒组合物，其中该对照寡核苷酸与光学部分相关联。
540.如权利要求528-536中任一项所述的方法，其中该条形码化颗粒的条形码包括选自至少1000种不同的条形码序列的条形码序列。
541.如权利要求528-540中任一项所述的方法，其中条形码化颗粒的条形码包括选自至少10000种不同的条形码序列的条形码序列。
542.如权利要求528-541中任一项所述的方法，其中这些条形码的条形码序列包括随机序列。
543.如权利要求528-542中任一项所述的方法，其中该条形码化颗粒包括至少10000个条形码。
544.如权利要求479-543中任一项所述的方法，其中使该对照寡核苷酸条形码化包括：使用多个条形码使该对照寡核苷酸条形码化，以创建多个条形码化的对照寡核苷酸。
545.如权利要求479-544中任一项所述的方法，其中使用该多个条形码使该多个对照寡核苷酸条形码化包括：
使该多个条形码与该多个对照组合物的对照寡核苷酸接触以生成与这些对照寡核苷酸杂交的条形码；并且
延伸与这些对照寡核苷酸杂交的条形码以生成多个条形码化的对照寡核苷酸。
546.如权利要求545所述的方法，其中延伸这些条形码包括使用DNA聚合酶、逆转录酶、或其组合延伸这些条形码。
547.如权利要求479-546中任一项所述的方法，该方法包括扩增该多个条形码化的对照寡核苷酸以产生多个扩增子。
548.如权利要求547所述的方法，其中扩增该多个条形码化的对照寡核苷酸包括使用聚合酶链式反应(PCR)对该条形码序列的至少一部分和该对照寡核苷酸的至少一部分进行扩增。
549.如权利要求547-548中任一项所述的方法，其中获得测序数据包括获得该多个扩增子的测序数据。
550.如权利要求549所述的方法，其中获得测序数据包括对该条形码序列的至少一部分和该对照寡核苷酸的至少一部分进行测序。
551.一种用于测序对照的方法，该方法包括：
使多个细胞中的一个或多个细胞与多个对照组合物中的对照组合物接触，
其中该多个细胞中的细胞包括多个靶和多个蛋白质靶，
其中该多个对照组合物中的每一个包括与对照寡核苷酸相关联的蛋白质结合试剂，其中该蛋白质结合试剂能够特异性结合该多个蛋白质靶中的至少一个，并且其中该对照寡核苷酸包括对照条形码序列和假-靶区，该假-靶区包括与该多个条形码中至少一个的靶结合区基本互补的序列；并且
使用该多个对照寡核苷酸的至少一个特征确定该一个或多个细胞的至少一个特征。
552.如权利要求551所述的方法，其中该假-靶区包括聚(dA)区。
553.如权利要求551-552中任一项所述的方法，其中该对照条形码序列长度为至少6个核苷酸。
554.如权利要求551-552中任一项所述的方法，其中该对照条形码序列长度为25-45个核苷酸。
555.如权利要求551-552中任一项所述的方法，其中该对照条形码序列长度为约128个核苷酸。
556.如权利要求551-552中任一项所述的方法，其中该对照条形码序列长度为至少128个核苷酸。
557.如权利要求551-552中任一项所述的方法，其中该对照条形码序列长度为约200-500个核苷酸。
558.如权利要求551-554中任一项所述的方法，其中该对照条形码寡核苷酸长度为约50个核苷酸。
559.如权利要求551-554中任一项所述的方法，其中该对照条形码寡核苷酸长度为约100个核苷酸。
560.如权利要求551-556中任一项所述的方法，其中该对照条形码寡核苷酸长度为约200个核苷酸。
561.如权利要求551-556中任一项所述的方法，其中该对照条形码寡核苷酸长度为至少200个核苷酸。
562.如权利要求551-557中任一项所述的方法，其中该对照条形码寡核苷酸长度为少于约200-300个核苷酸。
563.如权利要求551-557中任一项所述的方法，其中该对照条形码寡核苷酸长度为约500个核苷酸。
564.如权利要求551-563中任一项所述的方法，其中该对照条形码序列长度为25-45个核苷酸。
565.如权利要求551-552中任一项所述的方法，其中该对照条形码序列长度为约128个核苷酸。
566.如权利要求551-552中任一项所述的方法，其中该对照条形码序列长度为至少128个核苷酸。
567.如权利要求551-566中任一项所述的方法，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中至少两个的对照条形码序列是相同的。
568.如权利要求551-566中任一项所述的方法，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中约10个的对照条形码序列是相同的。
569.如权利要求551-566中任一项所述的方法，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中约100个的对照条形码序列是相同的。
570.如权利要求551-566中任一项所述的方法，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中约1000个的对照条形码序列是相同的。
571.如权利要求551-570中任一项所述的方法，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中至少两个包括不同的对照条形码序列。
572.如权利要求551-570中任一项所述的方法，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中至少10个包括不同的序列。
573.如权利要求551-570中任一项所述的方法，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中至少100个包括不同的序列。
574.如权利要求551-570中任一项所述的方法，其中该多个对照颗粒寡核苷酸中至少1000个包括不同的序列。
575.如权利要求551-574中任一项所述的方法，其中确定该一个或多个细胞的至少一个特征包括：
确定测序数据中与该多个条形码化的对照寡核苷酸相关联的具有不同序列的细胞标记序列的数量；并且
使用与该多个条形码化的对照寡核苷酸相关联的具有不同序列的细胞标记序列的数量，确定该一个或多个细胞的数量。
576.如权利要求575所述的方法，该方法包括基于经确定的该一个或多个细胞的数量确定单个细胞捕获效率。
577.如权利要求575所述的方法，该方法包括基于经确定的该一个或多个细胞的数量和该多个细胞的数量的比率确定单个细胞捕获效率。
578.如权利要求551-574中任一项所述的方法，其中确定该一个或多个细胞的至少一个特征包括：
对于测序数据中的每个细胞标记，确定与该细胞标记和该对照条形码序列相关联的具有不同序列的条形码序列的数量；并且
使用与该细胞标记和该对照条形码序列相关联的具有不同序列的条形码序列的数量确定该一个或多个细胞的数量。
579.如权利要求578所述的方法，其中确定与该细胞标记和该对照条形码序列相关联的具有不同序列的条形码序列的数量包括：
对于测序数据中的每个细胞标记，确定与该细胞标记和该对照条形码序列相关联的具有最多数量不同序列的条形码序列的数量。
580.如权利要求579所述的方法，其中使用与该细胞标记和该对照条形码序列相关联的具有不同序列的条形码序列的数量确定该一个或多个细胞的数量包括：
生成具有最多数量不同序列的条形码序列的数量和测序数据中与具有最多数量不同序列的条形码序列的数量相关联的细胞标记的数量的图；并且
在该图中确定截止值作为该一个或多个细胞的数量。
581.如权利要求551-580中任一项所述的方法，其中该对照寡核苷酸与该多个细胞中任一个的基因组序列不同源。
582.如权利要求551-581中任一项所述的方法，其中该对照寡核苷酸与物种的基因组序列同源。
583.如权利要求582所述的方法，其中该物种是非哺乳动物物种。
584.如权利要求583所述的方法，其中该非哺乳动物物种是噬菌体物种。
585.如权利要求584所述的方法，其中该噬菌体物种是T7噬菌体、PhiX噬菌体、或其组合。
586.如权利要求551-585中任一项所述的方法，该方法包括在使该对照寡核苷酸条形码化之前从该蛋白质结合试剂释放该对照寡核苷酸。
587.如权利要求551-586中任一项所述的方法，该方法包括去除该多个对照组合物中未结合的对照组合物。
588.如权利要求587所述的方法，其中去除这些未结合的对照组合物包括用洗涤缓冲液洗涤该多个细胞中的一个或多个细胞。
589.如权利要求588所述的方法，其中去除这些未结合的细胞鉴定组合物包括使用流式细胞术选择与该对照组合物的至少一个蛋白质结合试剂结合的细胞。
590.如权利要求551-589中任一项所述的方法，其中该多个蛋白质靶中的至少一个在细胞表面上表达。
591.如权利要求551-590中任一项所述的方法，其中该多个蛋白质靶中的至少一个包括细胞表面蛋白质、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、整合素、或其任何组合。
592.如权利要求551-591中任一项所述的方法，其中该蛋白质结合试剂包括碳水化合物、脂质、蛋白质、细胞外蛋白质、细胞表面蛋白质、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、细胞内蛋白质或其任何组合。
593.如权利要求592所述的方法，其中该对照寡核苷酸通过接头与该蛋白质结合试剂缀合。
594.如权利要求593所述的方法，其中该对照寡核苷酸包括该接头。
595.如权利要求593-594中任一项所述的方法，其中该接头包括化学基团。
596.如权利要求595所述的方法，其中该化学基团可逆地附接至该第一蛋白质结合试剂。
597.如权利要求595-596中任一项所述的方法，其中该化学基团包括UV可光解基团、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、二硫键联、或其任何组合。
598.如权利要求551-597中任一项所述的方法，其中该蛋白质结合试剂与具有相同对照条形码序列的两个或更多个对照寡核苷酸相关联。
599.如权利要求551-597中任一项所述的方法，其中该蛋白质结合试剂与具有不同相同的对照条形码序列的两个或更多个对照寡核苷酸相关联。
600.如权利要求中551-599任一项所述的方法，其中该多个对照组合物的第二蛋白质结合试剂不与该对照寡核苷酸相关联。
601.如权利要求600所述的方法，其中该蛋白质结合试剂和该第二蛋白质结合试剂是相同的。
602.如权利要求551-601中任一项所述的方法，其中该条形码包括通用引物的结合位点。
603.如权利要求551-602中任一项所述的方法，其中该靶结合区包括聚(dT)区。
604.如权利要求551-602中任一项所述的方法，其中该多个条形码与条形码化颗粒相关联。
605.如权利要求604所述的方法，其中该多个条形码中的至少一个条形码被固定在该条形码化颗粒上。
606.如权利要求604所述的方法，其中该多个条形码中的至少一个条形码被部分固定在该条形码化颗粒上。
607.如权利要求604所述的方法，其中该多个条形码中的至少一个条形码被包封在该条形码化颗粒中。
608.如权利要求604所述的方法，其中该多个条形码中的至少一个条形码被部分包封在该条形码化颗粒中。
609.如权利要求604-608中任一项所述的方法，其中该条形码化颗粒是可破坏的。
610.如权利要求604-609中任一项所述的方法，其中该条形码化颗粒包括条形码化珠。
611.如权利要求604-610中任一项所述的方法，其中该条形码化颗粒包括琼脂糖凝胶珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠、或其任何组合。
612.如权利要求604-611中任一项所述的方法，其中该条形码化颗粒包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮、或其任何组合的材料。
613.如权利要求604-612中任一项所述的方法，其中该条形码化颗粒包括可破坏的水凝胶颗粒。
614.如权利要求604-613中任一项所述的方法，其中该条形码化颗粒与光学部分相关联。
615.如权利要求604-614中任一项所述的对照颗粒组合物，其中该对照寡核苷酸与光学部分相关联。
616.如权利要求604-615中任一项所述的方法，该方法包括：
使用多个条形码使该对照寡核苷酸条形码化，以创建多个条形码化的对照寡核苷酸，其中该多个条形码的每个包括细胞标记序列、条形码序列、和靶结合区，其中该多个条形码中的至少两个条形码的条形码序列包括不同的序列，并且其中该多个条形码中的至少两个条形码包括相同的细胞标记序列；并且
获得该多个条形码化的对照寡核苷酸的测序数据。
617.如权利要求616-612中任一项所述的方法，其中该条形码化颗粒的条形码包括选自至少1000种不同的条形码序列的条形码序列。
618.如权利要求616-617中任一项所述的方法，其中条形码化颗粒的条形码包括选自至少10000种不同的条形码序列的条形码序列。
619.如权利要求616-618中任一项所述的方法，其中这些条形码的条形码序列包括随机序列。
620.如权利要求616-619中任一项所述的方法，其中该条形码化颗粒包括至少10000个条形码。
621.如权利要求616-620中任一项所述的方法，其中使该对照寡核苷酸条形码化包括：使用多个条形码使该对照寡核苷酸条形码化，以创建多个条形码化的对照寡核苷酸。
622.如权利要求616-621中任一项所述的方法，其中使用该多个条形码使该多个对照寡核苷酸条形码化包括：
使该多个条形码与该多个对照组合物的对照寡核苷酸接触以生成与这些对照寡核苷酸杂交的条形码；并且
延伸与这些对照寡核苷酸杂交的条形码以生成多个条形码化的对照寡核苷酸。
623.如权利要求622所述的方法，其中延伸这些条形码包括使用DNA聚合酶、逆转录酶、或其组合延伸这些条形码。
624.如权利要求616-623中任一项所述的方法，该方法包括扩增该多个条形码化的对照寡核苷酸以产生多个扩增子。
625.如权利要求624所述的方法，其中扩增该多个条形码化的对照寡核苷酸包括使用聚合酶链式反应(PCR)对该条形码序列的至少一部分和该对照寡核苷酸的至少一部分进行扩增。
626.如权利要求624-625中任一项所述的方法，其中获得测序数据包括获得该多个扩增子的测序数据。
627.如权利要求626所述的方法，其中获得测序数据包括对该条形码序列的至少一部分和该对照寡核苷酸的至少一部分进行测序。
628.一种用于细胞鉴定的方法，该方法包括：
使第一多个细胞和第二多个细胞分别与多个细胞鉴定组合物中的两种细胞鉴定组合物接触，
其中该第一多个细胞中的每一个和该第二多个细胞中的每一个包括一个或多个蛋白质靶，其中这两种细胞鉴定组合物中的每一种包括与细胞鉴定寡核苷酸相关联的蛋白质结合试剂，其中该蛋白质结合试剂能够特异性结合该一个或多个蛋白质靶中的至少一个，
其中该细胞鉴定寡核苷酸包括细胞鉴定序列，并且其中这两种细胞鉴定组合物的细胞鉴定序列包括不同的序列；
使用多个条形码使这些细胞鉴定寡核苷酸条形码化，以创建多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸，
其中该多个条形码的每个包括细胞标记序列、条形码序列、和靶结合区，其中该多个条形码中的至少两个条形码的条形码序列包括不同的序列，并且其中该多个条形码中的至少两个条形码包括相同的细胞标记序列；
获得该多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸的测序数据；
鉴定获得的测序数据中各自与两个或更多个细胞鉴定序列相关联的一个或多个细胞标记序列；并且
去除与该一个或多个细胞标记序列相关联的测序数据，该一个或多个细胞标记序列各自与来自获得的测序数据的两个或更多个细胞鉴定序列相关联。
629.一种用于多重态鉴定的方法，该方法包括：
使第一多个细胞和第二多个细胞分别与多个细胞鉴定组合物中的两种细胞鉴定组合物接触，
其中该第一多个细胞中的每一个和该第二多个细胞中的每一个包括一个或多个蛋白质靶，其中这两种细胞鉴定组合物中的每一种包括与细胞鉴定寡核苷酸相关联的蛋白质结合试剂，其中该蛋白质结合试剂能够特异性结合该一个或多个蛋白质靶中的至少一个，
其中该细胞鉴定寡核苷酸包括细胞鉴定序列，并且其中这两种细胞鉴定组合物的细胞鉴定序列包括不同的序列；
使用多个条形码使这些细胞鉴定寡核苷酸条形码化，以创建多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸，
其中该多个条形码的每个包括细胞标记序列、条形码序列、和靶结合区，其中该多个条形码中的至少两个条形码的条形码序列包括不同的序列，并且其中该多个条形码中的至少两个条形码包括相同的细胞标记序列；
获得该多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸的测序数据；并且
鉴定获得的测序数据中各自与两个或更多个细胞鉴定序列相关联的一个或多个多重态细胞标记序列。
630.一种用于细胞鉴定的方法，该方法包括：
使第一多个细胞和第二多个细胞分别与多个细胞鉴定组合物中的两种细胞鉴定组合物接触，
其中该第一多个细胞中的每一个和该第二多个细胞中的每一个包括一个或多个细胞组分靶，其中这两种细胞鉴定组合物中的每一种包括与细胞鉴定寡核苷酸相关联的细胞组分结合试剂，其中该细胞组分结合试剂能够特异性结合该一个或多个细胞组分靶中的至少一个，
其中该细胞鉴定寡核苷酸包括细胞鉴定序列，并且其中这两种细胞鉴定组合物的细胞鉴定序列包括不同的序列；
使用多个条形码使这些细胞鉴定寡核苷酸条形码化，以创建多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸，
其中该多个条形码的每个包括细胞标记序列、条形码序列、和靶结合区，其中该多个条形码中的至少两个条形码的条形码序列包括不同的序列，并且其中该多个条形码中的至少两个条形码包括相同的细胞标记序列；
获得该多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸的测序数据；
鉴定获得的测序数据中各自与两个或更多个细胞鉴定序列相关联的一个或多个细胞标记序列；并且
去除与该一个或多个细胞标记序列相关联的测序数据，该一个或多个细胞标记序列各自与来自获得的测序数据的两个或更多个细胞鉴定序列相关联。
631.一种用于多重态鉴定的方法，该方法包括：
使第一多个细胞和第二多个细胞分别与多个细胞鉴定组合物中的两种细胞鉴定组合物接触，
其中该第一多个细胞中的每一个和该第二多个细胞中的每一个包括一个或多个细胞组分靶，其中这两种细胞鉴定组合物中的每一种包括与细胞鉴定寡核苷酸相关联的细胞组分结合试剂，其中该细胞组分结合试剂能够特异性结合该一个或多个细胞组分靶中的至少一个，
其中该细胞鉴定寡核苷酸包括细胞鉴定序列，并且其中这两种细胞鉴定组合物的细胞鉴定序列包括不同的序列；
使用多个条形码使这些细胞鉴定寡核苷酸条形码化，以创建多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸，
其中该多个条形码的每个包括细胞标记序列、条形码序列、和靶结合区，其中该多个条形码中的至少两个条形码的条形码序列包括不同的序列，并且其中该多个条形码中的至少两个条形码包括相同的细胞标记序列；
获得该多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸的测序数据；并且
鉴定测序数据中各自与两个或更多个细胞鉴定序列相关联的一个或多个多重态细胞标记序列。
632.如权利要求630-631中任一项所述的方法，其中该细胞组分结合试剂包括蛋白质结合试剂，其中该蛋白质结合试剂与该细胞鉴定寡核苷酸相关联，并且其中该一个或多个细胞组分靶包括一个或多个蛋白质靶。
633.如权利要求628-632中任一项所述的方法，其中使该第一多个细胞和该第二多个细胞分别与这两种细胞鉴定组合物接触包括：
使该第一多个细胞与这两种细胞鉴定组合物中的第一细胞鉴定组合物接触；并且
使该第一多个细胞与这两种细胞鉴定组合物中的第二细胞鉴定组合物接触。
634.如权利要求628-633中任一项所述的方法，其中该细胞鉴定序列长度为至少6个核苷酸。
635.如权利要求628-634中任一项所述的方法，其中该细胞鉴定序列长度为25-60个核苷酸。
636.如权利要求628-635中任一项所述的方法，其中该细胞鉴定序列长度为约45个核苷酸。
637.如权利要求628-635中任一项所述的方法，其中该细胞鉴定寡核苷酸长度为约50个核苷酸。
638.如权利要求628-634中任一项所述的方法，其中该细胞鉴定寡核苷酸长度为约100个核苷酸。
639.如权利要求628-634中任一项所述的方法，其中该细胞鉴定序列长度为约128个核苷酸。
640.如权利要求628-634中任一项所述的方法，其中该细胞鉴定序列长度为至少128个核苷酸。
641.如权利要求628-634中任一项所述的方法，其中该细胞鉴定寡核苷酸长度为约200个核苷酸。
642.如权利要求628-634中任一项所述的方法，其中该细胞鉴定寡核苷酸长度为至少200个核苷酸。
643.如权利要求628-634中任一项所述的方法，其中该细胞鉴定寡核苷酸长度为少于约200-300个核苷酸。
644.如权利要求628-634中任一项所述的方法，其中该细胞鉴定序列长度为约200-500个核苷酸。
645.如权利要求628-634中任一项所述的方法，其中该细胞鉴定寡核苷酸长度为约500个核苷酸。
646.如权利要求628-645中任一项所述的方法，其中该多个细胞鉴定组合物中至少10个细胞鉴定组合物的细胞鉴定序列包括不同的序列。
647.如权利要求628-645中任一项所述的方法，其中该多个细胞鉴定组合物中至少100个细胞鉴定组合物的细胞鉴定序列包括不同的序列。
648.如权利要求628-645中任一项所述的方法，其中该多个细胞鉴定组合物中至少1000个细胞鉴定组合物的细胞鉴定序列包括不同的序列。
649.如权利要求628和632-648中任一项所述的方法，其中该蛋白质结合试剂包括抗体、四聚体、适配子、蛋白质骨架、整合素、或其组合。
650.如权利要求628和632-649中任一项所述的方法，其中该细胞鉴定寡核苷酸通过接头与该蛋白质结合试剂缀合。
651.如权利要求650所述的方法，其中该寡核苷酸包括该接头。
652.如权利要求650-651中任一项所述的方法，其中该接头包括化学基团。
653.如权利要求652所述的方法，其中该化学基团可逆或不可逆地附接至该蛋白质结合试剂。
654.如权利要求652-653中任一项所述的方法，其中该化学基团包括UV可光解基团、二硫键、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、二硫键联、或其任何组合。
655.如权利要求628-654中任一项所述的方法，其中该第一多个细胞和该第二多个细胞中的至少一个包括单个细胞。
656.如权利要求628-629和632-655中任一项所述的方法，其中该一个或多个蛋白质靶中的至少一个在细胞表面上。
657.如权利要求628-656中任一项所述的方法，该方法包括去除这两种细胞鉴定组合物中未结合的细胞鉴定组合物。
658.如权利要求657所述的方法，其中去除这些未结合的细胞鉴定组合物包括用洗涤缓冲液洗涤该第一多个细胞和该第二多个细胞的细胞。
659.如权利要求657所述的方法，其中去除这些未结合的细胞鉴定组合物包括使用流式细胞术选择与这两种细胞鉴定组合物中至少一个细胞组分结合试剂结合的细胞。
660.如权利要求628-659中任一项所述的方法，该方法包括裂解该第一多个细胞和该第二多个细胞的细胞。
661.如权利要求628-629和632-660中任一项所述的方法，其中该细胞鉴定寡核苷酸被配置为与该蛋白质结合试剂可分离或不可分离。
662.如权利要求628-629和632-661中任一项所述的方法，该方法包括将该细胞鉴定寡核苷酸与该蛋白质结合试剂分离。
663.如权利要求662所述的方法，其中分离该细胞鉴定寡核苷酸包括通过UV光解、化学处理、加热、酶处理、或其任何组合将该细胞鉴定寡核苷酸与该蛋白质结合试剂分离。
664.如权利要求628-663中任一项所述的方法，其中该细胞鉴定寡核苷酸与该一个或多个细胞中任一个的基因组序列不同源。
665.如权利要求628-664中任一项所述的方法，其中该细胞鉴定寡核苷酸与物种的基因组序列同源。
666.如权利要求665所述的方法，其中该物种是非哺乳动物物种。
667.如权利要求666所述的方法，其中该非哺乳动物物种是噬菌体物种。
668.如权利要求667所述的方法，其中该噬菌体物种是T7噬菌体、PhiX噬菌体、或其组合。
669.如权利要求628-668中任一项所述的方法，其中该第一多个细胞和该第二多个细胞中的至少一个包括肿瘤细胞或非肿瘤细胞。
670.如权利要求628-669中任一项所述的方法，其中该第一多个细胞和该第二多个细胞中的至少一个包括哺乳动物细胞、细菌细胞、病毒细胞、酵母细胞、真菌细胞、或其任何组合。
671.如权利要求628-670中任一项所述的方法，其中该细胞鉴定寡核苷酸包括与该多个条形码中至少一个条形码的捕获序列互补的序列。
672.如权利要求671所述的方法，其中该条形码包括包含捕获序列的靶结合区。
673.如权利要求672所述的方法，其中该靶结合区包括聚(dT)区。
674.如权利要求671-673中任一项所述的方法，其中与该条形码的捕获序列互补的该细胞鉴定寡核苷酸的序列包括聚(dA)区。
675.如权利要求628-674中任一项所述的方法，其中该细胞鉴定寡核苷酸包括条形码序列。
676.如权利要求628-675中任一项所述的方法，其中该细胞鉴定寡核苷酸包括通用引物的结合位点。
677.如权利要求628-629和632-676中任一项所述的方法，其中该蛋白质靶包括细胞外蛋白质、细胞内蛋白质、或其任何组合。
678.如权利要求677所述的方法，其中该蛋白质靶包括细胞表面蛋白质、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、整合素、或其任何组合。
679.如权利要求628-629和632-678中任一项所述的方法，其中该蛋白质靶包括脂质、碳水化合物、或其任何组合。
680.如权利要求628-629和632-679中任一项所述的方法，其中该蛋白质靶选自包括10-100种不同蛋白质靶的组。
681.如权利要求628-629和632-680中任一项所述的方法，其中该蛋白质结合试剂与具有相同序列的两个或更多个细胞鉴定寡核苷酸相关联。
682.如权利要求628-629和632-680中任一项所述的方法，其中该蛋白质结合试剂与具有不同细胞鉴定序列的两个或更多个细胞鉴定寡核苷酸相关联。
683.如权利要求628-629和632-682中任一项所述的方法，其中该多种细胞鉴定组合物中的细胞鉴定组合物包括不与该细胞鉴定寡核苷酸缀合的第二蛋白质结合试剂。
684.如权利要求683所述的方法，其中该蛋白质结合试剂和该第二蛋白质结合试剂是相同的。
685.如权利要求628-629和632-684中任一项所述的方法，其中该蛋白质结合试剂与可检测部分相关联。
686.如权利要求628-685中任一项所述的方法，
其中该多个条形码中的条形码包括靶结合区和条形码序列，并且
其中该多个条形码中至少两个条形码的条形码序列包括不同的分子标记序列。
687.如权利要求686所述的方法，其中该条形码包括细胞标记序列、通用引物的结合位点、或其任何组合。
688.如权利要求686-687中任一项所述的方法，其中该靶结合区包括聚(dT)区。
689.如权利要求686-688中任一项所述的方法，其中该多个条形码与颗粒相关联。
690.如权利要求689所述的方法，其中该多个条形码中的至少一个条形码被固定在该颗粒上。
691.如权利要求689所述的方法，其中该多个条形码中的至少一个条形码被部分固定在该颗粒上。
692.如权利要求689所述的方法，其中该多个条形码中至少一个条形码被包封在该颗粒中。
693.如权利要求689所述的方法，其中该多个条形码中至少一个条形码被部分包封在该颗粒中。
694.如权利要求689-693中任一项所述的方法，其中该颗粒是可破坏的。
695.如权利要求689-694中任一项所述的方法，其中该颗粒包括珠。
696.如权利要求689-695中任一项所述的方法，其中该颗粒包括琼脂糖凝胶珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠、或其任何组合。
697.如权利要求689-696中任一项所述的方法，其中该颗粒包括选自下组的材料，该组由以下组成：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮、及其任何组合。
698.如权利要求689-697中任一项所述的方法，其中该颗粒包括可破坏的水凝胶颗粒。
699.如权利要求689-698中任一项所述的方法，其中该颗粒与可检测部分相关联。
700.如权利要求689-699中任一项所述的方法，其中该细胞鉴定寡核苷酸与可检测部分相关联。
701.如权利要求689-700中任一项所述的方法，其中该颗粒的条形码包括选自至少1000种不同的条形码序列的条形码序列。
702.如权利要求689-701中任一项所述的方法，其中该颗粒的条形码包括选自至少10000种不同的条形码序列的条形码序列。
703.如权利要求689-702中任一项所述的方法，其中这些条形码的条形码序列包括随机序列。
704.如权利要求689-703中任一项所述的方法，其中该颗粒包括至少10000个条形码。
705.如权利要求628-704中任一项所述的方法，其中使用该多个条形码使这些细胞鉴定寡核苷酸条形码化包括：
使该多个条形码与这些细胞鉴定寡核苷酸接触以生成与这些细胞鉴定寡核苷酸杂交的条形码；并且
延伸与这些细胞鉴定寡核苷酸杂交的条形码以生成多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸。
706.如权利要求705所述的方法，其中延伸这些条形码包括使用DNA聚合酶延伸这些条形码以生成多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸。
707.如权利要求705所述的方法，其中延伸这些条形码包括使用逆转录酶延伸这些条形码以生成多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸。
708.如权利要求705-707中任一项所述的方法，该方法包括扩增该多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸以产生多个扩增子。
709.如权利要求708所述的方法，其中扩增该多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸包括使用聚合酶链式反应(PCR)对该条形码序列的至少一部分和该细胞鉴定寡核苷酸的至少一部分进行扩增。
710.如权利要求708-709中任一项所述的方法，其中获得该多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸的测序数据包括获得该多个扩增子的测序数据。
711.如权利要求710所述的方法，其中获得测序数据包括对该条形码序列的至少一部分和该细胞鉴定寡核苷酸的至少一部分进行测序。
712.如权利要求628-711中任一项所述的方法，其中使用该多个条形码使这些细胞鉴定寡核苷酸条形码化以创建多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸包括使用多个条形码使这些细胞鉴定寡核苷酸条形码化，以创建多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸。
713.如权利要求628-712中任一项所述的方法，该方法包括：
使用该多个条形码使该细胞的多个靶条形码化，以创建多个条形码化的靶，其中该多个条形码中的每一个包括细胞标记序列，并且其中该多个条形码中至少两个条形码包括相同的细胞标记序列；并且
获得这些条形码化的靶的测序数据。
714.如权利要求713所述的方法，其中使用该多个条形码使该多个靶条形码化以创建多个条形码化的靶包括：
使这些靶的拷贝与这些条形码的靶结合区接触；并且
使用该多个条形码逆转录该多个靶以创建多个经逆转录的靶。
715.如权利要求713-714中任一项所述的方法，该方法包括：在获得该多个条形码化的靶的测序数据之前，扩增这些条形码化的靶以创建多个经扩增的条形码化的靶。
716.如权利要求715所述的方法，其中扩增这些条形码化的靶以生成多个经扩增的条形码化的靶包括：通过聚合酶链式反应(PCR)扩增这些条形码化的靶。
717.如权利要求713-716中任一项所述的方法，其中使用该多个条形码使该细胞的多个靶条形码化以创建多个条形码化的靶包括使用多个条形码使该细胞的多个靶条形码化以创建多个条形码化的靶。
718.一种用于细胞鉴定的方法，该方法包括：
使来自第一多个细胞和第二多个细胞中每一个的一个或多个细胞分别与多个两种细胞鉴定组合物的细胞鉴定组合物接触，
其中该第一多个细胞中的每一个和该第二多个细胞中的每一个包括一个或多个抗原靶，其中这两种细胞鉴定组合物中的每一种包括与细胞鉴定寡核苷酸相关联的抗原结合试剂，其中该抗原结合试剂能够特异性结合该一个或多个抗原靶中的至少一个，
其中该细胞鉴定寡核苷酸包括细胞鉴定序列，并且其中这两种细胞鉴定组合物的细胞鉴定序列包括不同的序列；并且
鉴定各自与两个或更多个细胞鉴定序列相关联的一个或多个细胞。
719.一种用于多重态鉴定的方法，该方法包括：
使来自第一多个细胞和第二多个细胞中每一个的一个或多个细胞分别与多个两种细胞鉴定组合物的细胞鉴定组合物接触，
其中该第一多个细胞中的每一个和该第二多个细胞中的每一个包括一个或多个抗原靶，其中这两种细胞鉴定组合物中的每一种包括与细胞鉴定寡核苷酸相关联的抗原结合试剂，其中该抗原结合试剂能够特异性结合该一个或多个抗原靶中的至少一个，
其中该细胞鉴定寡核苷酸包括细胞鉴定序列，并且其中这两种细胞鉴定组合物的细胞鉴定序列包括不同的序列；并且
鉴定各自与两个或更多个细胞鉴定序列相关联的一个或多个细胞作为多重态细胞。
720.如权利要求718-719中任一项所述的方法，其中使该第一多个细胞和该第二多个细胞分别与这两种细胞鉴定组合物接触包括：
使该第一多个细胞与这两种细胞鉴定组合物中的第一细胞鉴定组合物接触；并且
使该第一多个细胞与这两种细胞鉴定组合物中的第二细胞鉴定组合物接触。
721.如权利要求718-720中任一项所述的方法，其中该细胞鉴定序列长度为至少6个核苷酸。
722.如权利要求718-720中任一项所述的方法，其中该细胞鉴定序列长度为25-60个核苷酸。
723.如权利要求718-720中任一项所述的方法，其中该细胞鉴定序列长度为约45个核苷酸。
724.如权利要求718-720中任一项所述的方法，其中该细胞鉴定序列长度为约128个核苷酸。
725.如权利要求718-720中任一项所述的方法，其中该细胞鉴定序列长度为至少128个核苷酸。
726.如权利要求718-720中任一项所述的方法，其中该细胞鉴定序列长度为约200-500个核苷酸。
727.如权利要求718-722中任一项所述的方法，其中该细胞鉴定寡核苷酸长度为约50个核苷酸。
728.如权利要求718-722中任一项所述的方法，其中该细胞鉴定寡核苷酸长度为约100个核苷酸。
729.如权利要求718-725中任一项所述的方法，其中该细胞鉴定寡核苷酸长度为约200个核苷酸。
730.如权利要求718-725中任一项所述的方法，其中该细胞鉴定寡核苷酸长度为至少200个核苷酸。
731.如权利要求718-726中任一项所述的方法，其中该细胞鉴定寡核苷酸长度为少于约200-300个核苷酸。
732.如权利要求718-726中任一项所述的方法，其中该细胞鉴定寡核苷酸长度为约500个核苷酸。
733.如权利要求718-732中任一项所述的方法，其中该多个细胞鉴定组合物中至少10个细胞鉴定组合物的细胞鉴定序列包括不同的序列。
734.如权利要求718-732中任一项所述的方法，其中该多个细胞鉴定组合物中至少100个细胞鉴定组合物的细胞鉴定序列包括不同的序列。
735.如权利要求718-732中任一项所述的方法，其中该多个细胞鉴定组合物中至少1000个细胞鉴定组合物的细胞鉴定序列包括不同的序列。
736.如权利要求718-735中任一项所述的方法，其中该抗原结合试剂包括抗体、四聚体、适配子、蛋白质骨架、或其组合。
737.如权利要求718-736中任一项所述的方法，其中该细胞鉴定寡核苷酸通过接头与抗原结合试剂缀合。
738.如权利要求737所述的方法，其中该寡核苷酸包括该接头。
739.如权利要求737-738中任一项所述的方法，其中该接头包括化学基团。
740.如权利要求739所述的方法，其中该化学基团可逆或不可逆地附接至该抗原结合试剂。
741.如权利要求739-740中任一项所述的方法，其中该化学基团包括UV可光解基团、二硫键、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、二硫键联、或其任何组合。
742.如权利要求718-741中任一项所述的方法，其中该第一多个细胞和该第二多个细胞中的至少一个包括单个细胞。
743.如权利要求742所述的方法，其中该一个或多个抗原靶中的至少一个在细胞表面上表达。
744.如权利要求718-743中任一项所述的方法，该方法包括去除这两种细胞鉴定组合物中未结合的细胞鉴定组合物。
745.如权利要求744所述的方法，其中去除这些未结合的细胞鉴定组合物包括用洗涤缓冲液洗涤该第一多个细胞和该第二多个细胞的细胞。
746.如权利要求744所述的方法，其中去除这些未结合的细胞鉴定组合物包括使用流式细胞术选择与这两种细胞鉴定组合物中至少一个抗原结合试剂结合的细胞。
747.如权利要求718-746中任一项所述的方法，该方法包括裂解该第一多个细胞和该第二多个细胞的一个或多个细胞。
748.如权利要求718-747中任一项所述的方法，其中该细胞鉴定寡核苷酸被配置为与该抗原结合试剂可分离或不可分离。
749.如权利要求718-748中任一项所述的方法，该方法包括将该细胞鉴定寡核苷酸与该抗原结合试剂分离。
750.如权利要求749所述的方法，其中分离该细胞鉴定寡核苷酸包括通过UV光解、化学处理、加热、酶处理、或其任何组合将该细胞鉴定寡核苷酸与该抗原结合试剂分离。
751.如权利要求718-750中任一项所述的方法，其中该细胞鉴定寡核苷酸与该一个或多个细胞中任一个的基因组序列不同源。
752.如权利要求718-750中任一项所述的方法，其中该细胞鉴定寡核苷酸与物种的基因组序列同源。
753.如权利要求752所述的方法，其中该物种是非哺乳动物物种。
754.如权利要求753所述的方法，其中该非哺乳动物物种是噬菌体物种。
755.如权利要求754所述的方法，其中该噬菌体物种是T7噬菌体、PhiX噬菌体、或其组合。
756.如权利要求718-755中任一项所述的方法，其中该第一多个细胞和该第二多个细胞中至少一个包括肿瘤细胞或非肿瘤细胞。
757.如权利要求718-756中任一项所述的方法，其中该第一多个细胞和该第二多个细胞中的至少一个包括哺乳动物细胞、细菌细胞、病毒细胞、酵母细胞、真菌细胞、或其任何组合。
758.如权利要求718-757中任一项所述的方法，其中该细胞鉴定寡核苷酸包括与捕获序列互补的序列，该捕获序列被配置为捕获该细胞鉴定寡核苷酸的序列。
759.如权利要求758所述的方法，其中该条形码包括包含捕获序列的靶结合区。
760.如权利要求759所述的方法，其中该靶结合区包括聚(dT)区。
761.如权利要求758-760中任一项所述的方法，其中与该捕获序列互补的该细胞鉴定寡核苷酸的序列包括聚(dA)区。
762.如权利要求758-761中任一项所述的方法，其中该细胞鉴定寡核苷酸包括条形码序列。
763.如权利要求758-762中任一项所述的方法，其中该细胞鉴定寡核苷酸包括通用引物的结合位点。
764.如权利要求718-763中任一项所述的方法，其中该蛋白质靶包括碳水化合物、脂质、蛋白质、细胞外蛋白质、细胞表面蛋白质、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、细胞内蛋白质或其任何组合。
765.如权利要求718-764中任一项所述的方法，其中该蛋白质靶选自包括10-100种不同蛋白质靶的组。
766.如权利要求718-765中任一项所述的方法，其中该蛋白质结合试剂与具有相同序列的两个或更多个细胞鉴定寡核苷酸相关联。
767.如权利要求718-765中任一项所述的方法，其中该蛋白质结合试剂与具有不同的细胞鉴定序列的两个或更多个细胞鉴定寡核苷酸相关联。
768.如权利要求718-767中任一项所述的方法，其中该多种细胞鉴定组合物中的细胞鉴定组合物包括不与该细胞鉴定寡核苷酸缀合的第二蛋白质结合试剂。
769.如权利要求768所述的方法，其中该蛋白质结合试剂和该第二蛋白质结合试剂是相同的。
770.如权利要求718-769中任一项所述的方法，其中该蛋白质结合试剂与可检测部分相关联。
771.如权利要求718-770中任一项所述的方法，其中鉴定各自与两个或更多个细胞鉴定序列相关联的一个或多个细胞包括：
使用多个条形码使这些细胞鉴定寡核苷酸条形码化，以创建多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸，
其中该多个条形码的每个包括细胞标记序列、条形码序列、和靶结合区，其中该多个条形码中的至少两个条形码的条形码序列包括不同的序列，并且其中该多个条形码中的至少两个条形码包括相同的细胞标记序列；
获得该多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸的测序数据；并且
鉴定获得的测序数据中各自与两个或更多个细胞鉴定序列相关联的一个或多个细胞标记序列。
772.如权利要求771所述的方法，该方法包括去除与该一个或多个细胞标记序列相关联的测序数据，该一个或多个细胞标记序列各自与来自获得的测序数据的两个或更多个细胞鉴定序列相关联。
773.如权利要求771所述的方法，该方法包括排除与该一个或多个细胞标记序列相关联的测序数据，该一个或多个细胞标记序列各自与来自后续分析的两个或更多个细胞鉴定序列相关联。
774.如权利要求718-770中任一项所述的方法，
其中该多个条形码中的条形码包括靶结合区和条形码序列，并且
其中该多个条形码中至少两个条形码的条形码序列包括不同的分子标记序列。
775.如权利要求774所述的方法，其中该条形码包括细胞标记序列、通用引物的结合位点、或其任何组合。
776.如权利要求771-775中任一项所述的方法，其中该靶结合区包括聚(dT)区。
777.如权利要求771-776中任一项所述的方法，其中该多个条形码与颗粒相关联。
778.如权利要求777所述的方法，其中该多个条形码中的至少一个条形码被固定在该颗粒上。
779.如权利要求777所述的方法，其中该多个条形码中的至少一个条形码被部分固定在该颗粒上。
780.如权利要求777所述的方法，其中该多个条形码中至少一个条形码被包封在该颗粒中。
781.如权利要求777所述的方法，其中该多个条形码中至少一个条形码被部分包封在该颗粒中。
782.如权利要求777-781中任一项所述的方法，其中该颗粒是可破坏的。
783.如权利要求777-782中任一项所述的方法，其中该颗粒包括珠。
784.如权利要求777-783中任一项所述的方法，其中该颗粒包括琼脂糖凝胶珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠、或其任何组合。
785.如权利要求777-784中任一项所述的方法，其中该颗粒包括选自下组的材料，该组由以下组成：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮、及其任何组合。
786.如权利要求777-785中任一项所述的方法，其中该颗粒包括可破坏的水凝胶颗粒。
787.如权利要求777-786中任一项所述的方法，其中该颗粒与可检测部分相关联。
788.如权利要求777-787中任一项所述的方法，其中该细胞鉴定寡核苷酸与可检测部分相关联。
789.如权利要求777-788中任一项所述的方法，其中该颗粒的条形码包括选自至少1000种不同的条形码序列的条形码序列。
790.如权利要求777-789中任一项所述的方法，其中该颗粒的条形码包括选自至少10000种不同的条形码序列的条形码序列。
791.如权利要求789-790中任一项所述的方法，其中这些条形码的条形码序列包括随机序列。
792.如权利要求777-791中任一项所述的方法，其中该颗粒包括至少10000个条形码。
793.如权利要求771-792中任一项所述的方法，其中使用该多个条形码使这些细胞鉴定寡核苷酸条形码化包括：
使该多个条形码与这些细胞鉴定寡核苷酸接触以生成与这些细胞鉴定寡核苷酸杂交的条形码；并且
延伸与这些细胞鉴定寡核苷酸杂交的条形码以生成多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸。
794.如权利要求793所述的方法，其中延伸这些条形码包括使用DNA聚合酶延伸这些条形码以生成多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸。
795.如权利要求793所述的方法，其中延伸这些条形码包括使用逆转录酶延伸这些条形码以生成多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸。
796.如权利要求793-795中任一项所述的方法，该方法包括扩增该多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸以产生多个扩增子。
797.如权利要求796所述的方法，其中扩增该多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸包括使用聚合酶链式反应(PCR)对该条形码序列的至少一部分和该细胞鉴定寡核苷酸的至少一部分进行扩增。
798.如权利要求796-797中任一项所述的方法，其中获得该多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸的测序数据包括获得该多个扩增子的测序数据。
799.如权利要求798所述的方法，其中获得测序数据包括对该条形码序列的至少一部分和该细胞鉴定寡核苷酸的至少一部分进行测序。
800.如权利要求771-799中任一项所述的方法，其中使用该多个条形码使这些细胞鉴定寡核苷酸条形码化以创建多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸包括使用多个条形码使这些细胞鉴定寡核苷酸条形码化，以创建多个条形码化的细胞鉴定寡核苷酸。
801.一种用于在制备经标记的生物分子试剂中使用的系统，该系统包括：
输入管理器，其用于接收对经标记的生物分子试剂的要求；
存储器，其用于存储包括多个经标记的生物分子存储标识的数据集；
处理模块，其通信地联接到该存储器并被配置为鉴定来自该数据集的与该经标记的生物分子试剂要求的组分相对应的一种或多个经标记的生物分子存储标识；
输出管理器，其用于提供所鉴定的经标记的生物分子存储标识。
802.如权利要求801所述的系统，其中对经标记的生物分子试剂的该要求包括生物分子要求和标记要求。
803.如权利要求801-802中任一项所述的系统，其中该生物分子包括多肽、核酸、多糖、或其任何组合。
804.如权利要求803所述的系统，其中该核酸是寡核苷酸、DNA或RNA。
805.如权利要求803所述的系统，其中该多肽是蛋白质、酶或蛋白质结合试剂。
806.如权利要求805所述的系统，其中该蛋白质结合试剂包括抗体、适配子、或其组合。
807.如权利要求805所述的系统，其中与该标记缀合的该蛋白质结合试剂能够特异性结合多个蛋白质靶中的至少一个。
808.如权利要求807所述的系统，其中该多个蛋白质靶包括细胞表面蛋白质、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、抗体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、或其任何组合。
809.如权利要求807所述的系统，其中该多个蛋白质靶包括10-400种不同的蛋白质靶。
810.如权利要求801-809中任一项所述的系统，其中该生物分子选自至少100种不同的生物分子。
811.如权利要求801-809中任一项所述的系统，其中该生物分子选自至少1,000种不同的生物分子。
812.如权利要求801-809中任一项所述的系统，其中该生物分子选自至少10,000种不同的生物分子。
813.如权利要求801-812中任一项所述的系统，其中该标记包括荧光团、发色团、多肽、蛋白质、酶、酶底物、催化剂、氧化还原标记、放射性标记、声学标记、拉曼(SERS)标签、质量标签、同位素标签、磁颗粒、微颗粒、纳米颗粒、寡核苷酸、或其任何组合。
814.如权利要求813所述的系统，
其中该标记包括酶、酶底物、或其组合，并且
其中该酶能够将该酶底物修饰成对应的经修饰的酶底物。
815.如权利要求814所述的系统，其中该酶底物与对应的经修饰的酶底物具有至少一个官能团的差异。
816.如权利要求815所述的系统，其中该至少一个官能团是烷基、烯基、炔基、苯基、苄基、卤基、氟、氯、溴、碘、羟基、羰基、醛、卤代甲酰基、碳酸酯、羧酸根、羧基、酯、甲氧基、氢过氧基、过氧基、醚、半缩醛、半缩酮、乙缩醛、缩酮、乙缩醛、原酸酯、亚甲基二氧基、原碳酸酯、甲酰胺、伯胺、仲胺、叔胺、4°铵、伯氯胺酮、仲氯胺酮、伯醛亚胺、仲醛亚胺、酰亚胺、叠氮基、偶氮基、二酰亚胺、氰酸酯、异氰酸酯、硝酸酯、腈、异腈、亚硝基氧基、硝基、亚硝基、吡啶基、巯基、硫醚、二硫醚、亚磺酰基、磺酰基、亚磺基、磺基、硫氰酸酯、异硫氰酸酯、碳硫酮、碳硫醛、膦基、膦酰基、磷酸酯、磷酸二酯、二羟硼基、硼酸酯、亚二羟硼基、亚硼酸酯、或其任何组合。
817.如权利要求814-816中任一项所述的系统，其中该酶包括甲基转移酶、糖苷水解酶、琼脂水解酶、氨酸酶、淀粉酶、乙糖苷酶、卡拉胶酶、纤维素酶、神经酰胺酶、几丁质酶、脱乙酰几丁质酶、柠檬酸酶、葡聚糖酶、糊精酶、果糖苷酶、岩藻多糖酶、墨角藻糖苷酶、呋喃糖苷酶、半乳糖苷酶、半乳糖醛酸酶、葡聚糖酶、葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、葡萄糖苷酸酶、糖水解酶、糖苷酶、己糖苷酶、水解酶、艾杜糖醛酸酶、肌苷酶、菊粉酶、乳糖酶、果聚糖酶、地衣多糖酶、连接酶、裂解酶、溶菌酶、麦芽糖苷酶、麦芽糖壳三糖酶、甘露二糖苷酶、甘露糖苷酶、胞壁酸酶、辛糖酸酶、辛糖酸水解酶、樱草苷酶、蛋白酶、支链淀粉酶、鼠李糖苷酶、糖胺酶、唾液酸酶、合酶、转移酶、海藻糖酶、turonidase、turonosidase、木聚糖酶、木糖苷酶、或其组合。
818.如权利要求814-817中任一项所述的系统，其中该酶底物包括6-巯基嘌呤、纤维二糖、纤维四糖、木四糖、异樱草糖、β-D-龙胆二糖、木葡聚糖和甘露三糖、琼脂糖、胺酸、淀粉、寡糖、多糖、纤维素、神经酰胺、几丁质、壳聚糖、右旋糖、糊精、果糖、岩藻多糖、岩藻糖、呋喃糖苷、半乳糖苷、葡聚糖、吡喃葡萄糖苷、葡萄糖苷、葡萄糖醛酸、葡糖苷酸、葡萄糖、糖苷、糖胺聚糖、己糖苷、菊粉、乳糖、levanose、脂多糖、甘露糖、麦芽糖苷、麦芽三糖苷、甘露糖、辛基酮糖酸、寡糖、果胶酸酯、果胶、肽、聚半乳糖醛酸、多核苷酸、支链淀粉、鼠李糖苷、木聚糖、或其任何组合。
819.如权利要求814-818中任一项所述的系统，其中该标记要求包括酶要求和底物要求。
820.如权利要求813所述的系统，其中该寡核苷酸包括针对该生物分子的独特标识。
821.如权利要求820所述的系统，其中该独特标识包括长度为25-45个核苷酸的核苷酸序列。
822.如权利要求820-821中任一项所述的系统，其中该独特标识选自独特标识的多元组。
823.如权利要求822所述的系统，其中独特标识的该多元组包括至少100种不同的独特标识。
824.如权利要求822所述的系统，其中独特标识的该多元组包括至少1,000种不同的独特标识。
825.如权利要求822所述的系统，其中独特标识的该多元组包括至少10,000种不同的独特标识。
826.如权利要求813-825中任一项所述的系统，其中该独特标识与样品的基因组序列不同源。
827.如权利要求826所述的系统，其中该样品是单个细胞、多个细胞、组织、肿瘤样品、或其任何组合。
828.如权利要求826或827所述的系统，其中该样品是哺乳动物样品、细菌样品、病毒样品、酵母样品、真菌样品、或其任何组合。
829.如权利要求813-828中任一项所述的系统，其中该寡核苷酸包括条形码序列、聚(A)尾、或其组合。
830.如权利要求813-829中任一项所述的系统，其中该寡核苷酸的条形码序列选自至少10种不同的条形码序列。
831.如权利要求813-829中任一项所述的系统，其中该寡核苷酸的条形码序列选自至少100种不同的条形码序列。
832.如权利要求813-829中任一项所述的系统，其中该寡核苷酸的条形码序列选自至少1,000种不同的条形码序列。
833.如权利要求801-832中任一项所述的系统，其中该标记通过接头与该生物分子缀合。
834.如权利要求833所述的系统，其中该寡核苷酸包括该接头。
835.如权利要求834所述的系统，其中该接头包括化学基团。
836.如权利要求835所述的系统，其中该化学基团可逆地附接至该生物分子。
837.如权利要求835-836中任一项所述的系统，其中该化学基团选自下组，该组由以下组成：UV可光解基团、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、及其任何组合。
838.一种方法，该方法包括：
传送对经标记的生物分子试剂的要求，该要求包括以下中的一个或多个：
经标记的生物分子要求；以及
生物分子要求和标记要求；并且
接收一个或多个经标记的生物分子试剂，每个经标记的生物分子试剂包括通过接头与标记共价偶联的生物分子。
839.如权利要求838所述的方法，其中该生物分子包括多肽、核酸、多糖、或其任何组合。
840.如权利要求839所述的方法，其中该核酸是寡核苷酸、DNA或RNA。
841.如权利要求839所述的方法，其中该多肽是蛋白质、酶或蛋白质结合试剂。
842.如权利要求841所述的方法，其中该蛋白质结合试剂包括抗体、适配子、或其组合。
843.如权利要求841所述的方法，其中该蛋白质结合试剂能够特异性结合多个蛋白质靶中的至少一个。
844.如权利要求843所述的方法，其中该多个蛋白质靶包括细胞表面蛋白质、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、抗体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、或其任何组合。
845.如权利要求843所述的方法，其中该多个蛋白质靶包括10-400种不同的蛋白质靶。
846.如权利要求838-845中任一项所述的方法，其中每个生物分子选自至少100种不同的生物分子。
847.如权利要求838-845中任一项所述的方法，其中每个生物分子选自至少1,000种不同的生物分子。
848.如权利要求838-845中任一项所述的方法，其中每个生物分子选自至少10,000种不同的分子。
849.如权利要求838-848中任一项所述的方法，其中该一种或多种经标记的生物分子试剂进一步包括不与该标记共价偶联的一个或多个第二生物分子。
850.如权利要求849所述的方法，其中该生物分子与该一个或多个第二生物分子是相同的。
851.如权利要求838-850中任一项所述的方法，其中该标记包括荧光团、发色团、多肽、蛋白质、酶、酶底物、催化剂、氧化还原标记、放射性标记、声学标记、拉曼(SERS)标签、质量标签、同位素标签、磁颗粒、微颗粒、纳米颗粒、和寡核苷酸、或其任何组合。
852.如权利要求851所述的方法，
其中该标记包括酶、酶底物、或其组合，并且
其中该酶能够将该酶底物修饰成对应的经修饰的酶底物。
853.如权利要求852所述的方法，其中该酶底物与对应的经修饰的酶底物具有至少一个官能团的差异。
854.如权利要求853所述的方法，其中该至少一个官能团是烷基、烯基、炔基、苯基、苄基、卤基、氟、氯、溴、碘、羟基、羰基、醛、卤代甲酰基、碳酸酯、羧酸根、羧基、酯、甲氧基、氢过氧基、过氧基、醚、半缩醛、半缩酮、乙缩醛、缩酮、乙缩醛、原酸酯、亚甲基二氧基、原碳酸酯、甲酰胺、伯胺、仲胺、叔胺、4°铵、伯氯胺酮、仲氯胺酮、伯醛亚胺、仲醛亚胺、酰亚胺、叠氮基、偶氮基、二酰亚胺、氰酸酯、异氰酸酯、硝酸酯、腈、异腈、亚硝基氧基、硝基、亚硝基、吡啶基、巯基、硫醚、二硫醚、亚磺酰基、磺酰基、亚磺基、磺基、硫氰酸酯、异硫氰酸酯、碳硫酮、碳硫醛、膦基、膦酰基、磷酸酯、磷酸二酯、二羟硼基、硼酸酯、亚二羟硼基、亚硼酸酯、或其任何组合。
855.如权利要求852-854中任一项所述的方法，其中该酶包括甲基转移酶、糖苷水解酶、琼脂水解酶、氨酸酶、淀粉酶、乙糖苷酶、卡拉胶酶、纤维素酶、神经酰胺酶、几丁质酶、脱乙酰几丁质酶、柠檬酸酶、葡聚糖酶、糊精酶、果糖苷酶、岩藻多糖酶、墨角藻糖苷酶、呋喃糖苷酶、半乳糖苷酶、半乳糖醛酸酶、葡聚糖酶、葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、葡萄糖苷酸酶、糖水解酶、糖苷酶、己糖苷酶、水解酶、艾杜糖醛酸酶、肌苷酶、菊粉酶、乳糖酶、果聚糖酶、地衣多糖酶、连接酶、裂解酶、溶菌酶、麦芽糖苷酶、麦芽糖壳三糖酶、甘露二糖苷酶、甘露糖苷酶、胞壁酸酶、辛糖酸酶、辛糖酸水解酶、樱草苷酶、蛋白酶、支链淀粉酶、鼠李糖苷酶、糖胺酶、唾液酸酶、合酶、转移酶、海藻糖酶、turonidase、turonosidase、木聚糖酶、木糖苷酶、或其组合。
856.如权利要求852-855中任一项所述的方法，其中该酶底物包括6-巯基嘌呤、纤维二糖、纤维四糖、木四糖、异樱草糖、β-D-龙胆二糖、木葡聚糖和甘露三糖、琼脂糖、胺酸、淀粉、寡糖、多糖、纤维素、神经酰胺、几丁质、壳聚糖、右旋糖、糊精、果糖、岩藻多糖、岩藻糖、呋喃糖苷、半乳糖苷、葡聚糖、吡喃葡萄糖苷、葡萄糖苷、葡萄糖醛酸、葡糖苷酸、葡萄糖、糖苷、糖胺聚糖、己糖苷、菊粉、乳糖、levanose、脂多糖、甘露糖、麦芽糖苷、麦芽三糖苷、甘露糖、辛基酮糖酸、寡糖、果胶酸酯、果胶、肽、聚半乳糖醛酸、多核苷酸、支链淀粉、鼠李糖苷、木聚糖、或其任何组合。
857.如权利要求852-856中任一项所述的方法，其中该标记要求包括酶要求和底物要求。
858.如权利要求851所述的方法，其中该寡核苷酸包括针对该生物分子的独特标识。
859.如权利要求858所述的方法，其中该独特标识包括长度为25-45个核苷酸的核苷酸序列。
860.如权利要求858-859中任一项所述的方法，其中该独特标识选自独特标识的多元组。
861.如权利要求860所述的方法，其中独特标识的该多元组包括至少100种不同的独特标识。
862.如权利要求860所述的方法，其中独特标识的该多元组包括至少1,000种不同的独特标识。
863.如权利要求860所述的方法，其中独特标识的该多元组包括至少10,000种不同的独特标识。
864.如权利要求858-863中任一项所述的方法，其中该独特标识与样品的基因组序列不同源。
865.如权利要求864所述的方法，其中该样品是单个细胞、多个细胞、组织、肿瘤样品、或其任何组合。
866.如权利要求864或865所述的方法，其中该样品是哺乳动物样品、细菌样品、病毒样品、酵母样品、真菌样品、或其任何组合。
867.如权利要求858-866中任一项所述的方法，其中该寡核苷酸包括条形码序列、聚(A)尾、或其组合。
868.如权利要求858-867中任一项所述的方法，其中该寡核苷酸的条形码序列选自至少10种不同的条形码序列。
869.如权利要求858-867中任一项所述的方法，其中该寡核苷酸的条形码序列选自至少100种不同的条形码序列。
870.如权利要求858-867中任一项所述的方法，其中该寡核苷酸的条形码序列选自至少1,000种不同的条形码序列。
871.如权利要求838-870中任一项所述的方法，其中该标记通过接头与该生物分子缀合。
872.如权利要求871所述的方法，其中该寡核苷酸包括该接头。
873.如权利要求872所述的方法，其中该接头包括化学基团。
874.如权利要求873所述的方法，其中该化学基团可逆地附接至该生物分子。
875.如权利要求873-874中任一项所述的方法，其中该化学基团选自下组，该组由以下组成：UV可光解基团、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、及其任何组合。
876.一种方法，该方法包括：
将对经标记的生物分子试剂的要求传送给系统，该系统包括：
输入管理器，其接收经标记的生物分子试剂要求；
存储器，其用于存储包括多个经标记的生物分子存储标识的数据集；
处理模块，其通信地联接到该存储器并被配置为鉴定来自该数据集的与该经标记的生物分子试剂要求的组分相对应的一种或多个经标记的生物分子存储标识；和
输出管理器，其用于提供所鉴定的经标记的生物分子存储标识；和
接收包含与标记共价偶联的生物分子的经标记的生物分子试剂。
877.如权利要求876所述的方法，其中对经标记的生物分子试剂的该要求包括生物分子要求和标记要求。
878.如权利要求876-877中任一项所述的方法，其中该生物分子包括多肽、核酸、和多糖、或其任何组合。
879.如权利要求878所述的方法，其中该核酸是寡核苷酸、DNA或RNA。
880.如权利要求878所述的方法，其中该多肽是蛋白质、酶或蛋白质结合试剂。
881.如权利要求880所述的方法，其中该蛋白质结合试剂包括抗体、适配子、或其组合。
882.如权利要求880所述的系统，其中该蛋白质结合试剂能够特异性结合多个蛋白质靶中的至少一个。
883.如权利要求882所述的系统，其中该多个蛋白质靶包括细胞表面蛋白质、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、抗体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、或其任何组合。
884.如权利要求882所述的系统，其中该多个蛋白质靶包括10-400种不同的蛋白质靶。
885.如权利要求876-884中任一项所述的方法，其中该生物分子选自至少100种不同的生物分子。
886.如权利要求876-884中任一项所述的方法，其中该生物分子选自至少1,000种不同的生物分子。
887.如权利要求876-884中任一项所述的方法，其中该生物分子选自至少10,000种不同的生物分子。
888.如权利要求876-887中任一项所述的方法，其中接收该经标记的生物分子试剂包括接收与该标记共价偶联的经标记的生物分子和不与该标记共价偶联的一个或多个第二生物分子。
889.如权利要求888所述的方法，其中该经标记的生物分子和该一个或多个第二生物分子是相同的。
890.如权利要求876-889中任一项所述的方法，其中该标记包括荧光团、发色团、多肽、蛋白质、酶、酶底物、催化剂、氧化还原标记、放射性标记、声学标记、拉曼(SERS)标签、质量标签、同位素标签、磁颗粒、微颗粒、纳米颗粒、寡核苷酸、或其任何组合。
891.如权利要求890所述的方法，
其中该标记包括酶、酶底物、或其组合，并且
其中该酶能够将该酶底物修饰成对应的经修饰的酶底物。
892.如权利要求891所述的方法，其中该酶底物与对应的经修饰的酶底物具有至少一个官能团的差异。
893.如权利要求892所述的方法，其中该至少一个官能团是烷基、烯基、炔基、苯基、苄基、卤基、氟、氯、溴、碘、羟基、羰基、醛、卤代甲酰基、碳酸酯、羧酸根、羧基、酯、甲氧基、氢过氧基、过氧基、醚、半缩醛、半缩酮、乙缩醛、缩酮、乙缩醛、原酸酯、亚甲基二氧基、原碳酸酯、甲酰胺、伯胺、仲胺、叔胺、4°铵、伯氯胺酮、仲氯胺酮、伯醛亚胺、仲醛亚胺、酰亚胺、叠氮基、偶氮基、二酰亚胺、氰酸酯、异氰酸酯、硝酸酯、腈、异腈、亚硝基氧基、硝基、亚硝基、吡啶基、巯基、硫醚、二硫醚、亚磺酰基、磺酰基、亚磺基、磺基、硫氰酸酯、异硫氰酸酯、碳硫酮、碳硫醛、膦基、膦酰基、磷酸酯、磷酸二酯、二羟硼基、硼酸酯、亚二羟硼基、亚硼酸酯、或其任何组合。
894.如权利要求891-893中任一项所述的方法，其中该酶包括甲基转移酶、糖苷水解酶、琼脂水解酶、氨酸酶、淀粉酶、乙糖苷酶、卡拉胶酶、纤维素酶、神经酰胺酶、几丁质酶、脱乙酰几丁质酶、柠檬酸酶、葡聚糖酶、糊精酶、果糖苷酶、岩藻多糖酶、墨角藻糖苷酶、呋喃糖苷酶、半乳糖苷酶、半乳糖醛酸酶、葡聚糖酶、葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、葡萄糖苷酸酶、糖水解酶、糖苷酶、己糖苷酶、水解酶、艾杜糖醛酸酶、肌苷酶、菊粉酶、乳糖酶、果聚糖酶、地衣多糖酶、连接酶、裂解酶、溶菌酶、麦芽糖苷酶、麦芽糖壳三糖酶、甘露二糖苷酶、甘露糖苷酶、胞壁酸酶、辛糖酸酶、辛糖酸水解酶、樱草苷酶、蛋白酶、支链淀粉酶、鼠李糖苷酶、糖胺酶、唾液酸酶、合酶、转移酶、海藻糖酶、turonidase、turonosidase、木聚糖酶、木糖苷酶、或其组合。
895.如权利要求891-894中任一项所述的方法，其中该酶底物包括6-巯基嘌呤、纤维二糖、纤维四糖、木四糖、异樱草糖、β-D-龙胆二糖、木葡聚糖和甘露三糖、琼脂糖、胺酸、淀粉、寡糖、多糖、纤维素、神经酰胺、几丁质、壳聚糖、右旋糖、糊精、果糖、岩藻多糖、岩藻糖、呋喃糖苷、半乳糖苷、葡聚糖、吡喃葡萄糖苷、葡萄糖苷、葡萄糖醛酸、葡糖苷酸、葡萄糖、糖苷、糖胺聚糖、己糖苷、菊粉、乳糖、levanose、脂多糖、甘露糖、麦芽糖苷、麦芽三糖苷、甘露糖、辛基酮糖酸、寡糖、果胶酸酯、果胶、肽、聚半乳糖醛酸、多核苷酸、支链淀粉、鼠李糖苷、木聚糖、或其任何组合。
896.如权利要求891-895中任一项所述的方法，其中该标记要求包括酶要求和底物要求。
897.如权利要求890所述的方法，其中该寡核苷酸包括针对该生物分子的独特标识。
898.如权利要求897所述的方法，其中该独特标识包括长度为25-45个核苷酸的核苷酸序列。
899.如权利要求897-898中任一项所述的方法，其中该独特标识选自独特标识的多元组。
900.如权利要求899所述的方法，其中独特标识的该多元组包括至少100种不同的独特标识。
901.如权利要求899所述的方法，其中独特标识的该多元组包括至少1,000种不同的独特标识。
902.如权利要求899所述的方法，其中独特标识的该多元组包括至少10,000种不同的独特标识。
903.如权利要求897-902中任一项所述的方法，其中该寡核苷酸通过接头与该生物分子缀合。
904.如权利要求903所述的方法，其中该寡核苷酸包括该接头。
905.如权利要求903所述的方法，其中该接头包括化学基团。
906.如权利要求905所述的方法，其中该化学基团可逆地附接至该生物分子。
907.如权利要求905-906中任一项所述的方法，其中该化学基团选自下组，该组由以下组成：UV可光解基团、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、及其任何组合。
908.如权利要求897-907中任一项所述的方法，其中该独特标识与样品的基因组序列不同源。
909.如权利要求908所述的方法，其中该样品是单个细胞、多个细胞、组织、肿瘤样品、或其任何组合。
910.如权利要求908或909所述的方法，其中该样品是哺乳动物样品、细菌样品、病毒样品、酵母样品、真菌样品、或其任何组合。
911.如权利要求897-910中任一项所述的方法，其中该寡核苷酸包括条形码序列、聚(A)尾、或其组合。
912.如权利要求897-911中任一项所述的方法，其中该寡核苷酸的条形码序列选自至少10种不同的条形码序列。
913.如权利要求897-911中任一项所述的方法，其中该寡核苷酸的条形码序列选自至少100种不同的条形码序列。
914.如权利要求897-911中任一项所述的方法，其中该寡核苷酸的条形码序列选自至少1,000种不同的条形码序列。
915.如权利要求876-914中任一项所述的方法，其中该标记通过接头与该生物分子缀合。
916.如权利要求915所述的方法，其中该寡核苷酸包括该接头。
917.如权利要求916所述的方法，其中该接头包括化学基团。
918.如权利要求917所述的方法，其中该化学基团可逆地附接至该生物分子。
919.如权利要求917-918中任一项所述的方法，其中该化学基团选自下组，该组由以下组成：UV可光解基团、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、及其任何组合。
920.一种方法，该方法包括：
接收对经标记的生物分子试剂的要求，该要求包括以下中的一个或多个：
经标记的生物分子要求；和
生物分子要求和标记要求；和
通过以下方式制备与该经标记的生物分子试剂要求相对应的经标记的生物分子试剂：使经激活的生物分子与经激活的标记接触以产生该经标记的生物分子试剂，
其中该制备包括从包含多个经激活的生物分子和多个经激活的标记的存储物中选择经激活的生物分子和经激活的标记。
921.如权利要求920所述的方法，其中该生物分子包括多肽、核酸、和多糖、或其任何组合。
922.如权利要求921所述的方法，其中该核酸是寡核苷酸、DNA或RNA。
923.如权利要求921所述的方法，其中该多肽是蛋白质、酶或蛋白质结合试剂。
924.如权利要求923所述的方法，其中该蛋白质结合试剂包括抗体、适配子、或其组合。
925.如权利要求923所述的系统，其中该蛋白质结合试剂能够特异性结合多个蛋白质靶中的至少一个。
926.如权利要求925所述的系统，其中该多个蛋白质靶包括细胞表面蛋白质、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、抗体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、或其任何组合。
927.如权利要求925所述的系统，其中该多个蛋白质靶包括10-400种不同的蛋白质靶。
928.如权利要求920-927中任一项所述的方法，其中该生物分子选自至少100种不同的生物分子。
929.如权利要求920-927中任一项所述的方法，其中该生物分子选自至少1,000种不同的生物分子。
930.如权利要求920-927中任一项所述的方法，其中该生物分子选自至少10,000种不同的生物分子。
931.如权利要求920-930中任一项所述的方法，其中制备该经标记的生物分子包括制备与该经标记的生物分子试剂要求相对应的经标记的生物分子试剂和制备不与该标记相关联的一个或多个第二生物分子试剂。
932.如权利要求931所述的方法，其中该生物分子与该一个或多个第二生物分子是相同的。
933.如权利要求920-932中任一项所述的方法，其中该标记包括荧光团、发色团、多肽、蛋白质、酶、酶底物、催化剂、氧化还原标记、放射性标记、声学标记、拉曼(SERS)标签、质量标签、同位素标签、磁颗粒、微颗粒、纳米颗粒、寡核苷酸、或其任何组合。
934.如权利要求933所述的方法，
其中该标记包括酶、酶底物、或其组合，并且
其中该酶能够将该酶底物修饰成对应的经修饰的酶底物。
935.如权利要求934所述的方法，其中该酶底物与对应的经修饰的酶底物具有至少一个官能团的差异。
936.如权利要求935所述的方法，其中该至少一个官能团是烷基、烯基、炔基、苯基、苄基、卤基、氟、氯、溴、碘、羟基、羰基、醛、卤代甲酰基、碳酸酯、羧酸根、羧基、酯、甲氧基、氢过氧基、过氧基、醚、半缩醛、半缩酮、乙缩醛、缩酮、乙缩醛、原酸酯、亚甲基二氧基、原碳酸酯、甲酰胺、伯胺、仲胺、叔胺、4°铵、伯氯胺酮、仲氯胺酮、伯醛亚胺、仲醛亚胺、酰亚胺、叠氮基、偶氮基、二酰亚胺、氰酸酯、异氰酸酯、硝酸酯、腈、异腈、亚硝基氧基、硝基、亚硝基、吡啶基、巯基、硫醚、二硫醚、亚磺酰基、磺酰基、亚磺基、磺基、硫氰酸酯、异硫氰酸酯、碳硫酮、碳硫醛、膦基、膦酰基、磷酸酯、磷酸二酯、二羟硼基、硼酸酯、亚二羟硼基、亚硼酸酯、或其任何组合。
937.如权利要求933-936中任一项所述的方法，其中该酶包括甲基转移酶、糖苷水解酶、琼脂水解酶、氨酸酶、淀粉酶、乙糖苷酶、卡拉胶酶、纤维素酶、神经酰胺酶、几丁质酶、脱乙酰几丁质酶、柠檬酸酶、葡聚糖酶、糊精酶、果糖苷酶、岩藻多糖酶、墨角藻糖苷酶、呋喃糖苷酶、半乳糖苷酶、半乳糖醛酸酶、葡聚糖酶、葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、葡萄糖苷酸酶、糖水解酶、糖苷酶、己糖苷酶、水解酶、艾杜糖醛酸酶、肌苷酶、菊粉酶、乳糖酶、果聚糖酶、地衣多糖酶、连接酶、裂解酶、溶菌酶、麦芽糖苷酶、麦芽糖壳三糖酶、甘露二糖苷酶、甘露糖苷酶、胞壁酸酶、辛糖酸酶、辛糖酸水解酶、樱草苷酶、蛋白酶、支链淀粉酶、鼠李糖苷酶、糖胺酶、唾液酸酶、合酶、转移酶、海藻糖酶、turonidase、turonosidase、木聚糖酶、木糖苷酶、或其组合。
938.如权利要求933-937中任一项所述的方法，其中该酶底物包括6-巯基嘌呤、纤维二糖、纤维四糖、木四糖、异樱草糖、β-D-龙胆二糖、木葡聚糖和甘露三糖、琼脂糖、胺酸、淀粉、寡糖、多糖、纤维素、神经酰胺、几丁质、壳聚糖、右旋糖、糊精、果糖、岩藻多糖、岩藻糖、呋喃糖苷、半乳糖苷、葡聚糖、吡喃葡萄糖苷、葡萄糖苷、葡萄糖醛酸、葡糖苷酸、葡萄糖、糖苷、糖胺聚糖、己糖苷、菊粉、乳糖、levanose、脂多糖、甘露糖、麦芽糖苷、麦芽三糖苷、甘露糖、辛基酮糖酸、寡糖、果胶酸酯、果胶、肽、聚半乳糖醛酸、多核苷酸、支链淀粉、鼠李糖苷、木聚糖、或其任何组合。
939.如权利要求933-938中任一项所述的方法，其中该标记要求包括酶要求和底物要求。
940.如权利要求933所述的方法，其中该寡核苷酸包括针对该生物分子的独特标识，以及。
941.如权利要求940所述的方法，其中该独特标识包括长度为25-45个核苷酸的核苷酸序列。
942.如权利要求940-941中任一项所述的方法，其中该独特标识选自独特标识的多元组。
943.如权利要求942所述的方法，其中独特标识的该多元组包括至少100种不同的独特标识。
944.如权利要求943所述的方法，其中独特标识的该多元组包括至少1,000种不同的独特标识。
945.如权利要求943所述的方法，其中独特标识的该多元组包括至少10,000种不同的独特标识。
946.如权利要求940-945中任一项所述的方法，其中该一个或多个经标记的生物分子试剂的生物分子包括多个抗体、多个适配子、或其组合。
947.如权利要求940-946中任一项所述的方法，其中该独特标识与样品的基因组序列不同源。
948.如权利要求947所述的方法，其中该样品是单个细胞、多个细胞、组织、肿瘤样品、或其任何组合。
949.如权利要求947或948所述的方法，其中该样品是哺乳动物样品、细菌样品、病毒样品、酵母样品、真菌样品、或其任何组合。
950.如权利要求940-949中任一项所述的方法，其中该寡核苷酸包括条形码序列、聚(A)尾、或其组合。
951.如权利要求940-950中任一项所述的方法，其中该寡核苷酸的条形码序列选自至少10种不同的条形码序列。
952.如权利要求940-950中任一项所述的方法，其中该寡核苷酸的条形码序列选自至少100种不同的条形码序列。
953.如权利要求940-950中任一项所述的方法，其中该寡核苷酸的条形码序列选自至少1,000种不同的条形码序列。
954.如权利要求920-953中任一项所述的方法，其中该标记通过接头与该生物分子缀合。
955.如权利要求954所述的方法，其中该寡核苷酸包括该接头。
956.如权利要求955所述的方法，其中该接头包括化学基团。
957.如权利要求956所述的方法，其中该化学基团可逆地附接至该生物分子。
958.如权利要求956-957中任一项所述的方法，其中该化学基团选自下组，该组由以下组成：UV可光解基团、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、及其任何组合。
959.一种方法，该方法包括：
用系统接收对经标记的生物分子试剂的要求，该系统包括：
输入管理器，其接收经标记的生物分子试剂要求；
存储器，其用于存储包括多个经标记的生物分子存储标识的数据集；
处理模块，其通信地联接到该存储器并被配置为鉴定来自该数据集的与该经标记的生物分子试剂要求的组分相对应的一种或多个经标记的生物分子存储标识；和
输出管理器；
鉴定与该经标记的生物分子试剂要求相对应的经标记的生物分子存储标识；和
输出所鉴定的经标记的生物分子试剂存储标识。
960.如权利要求959所述的方法，其中对经标记的生物分子试剂的该要求包括生物分子要求和标记要求。
961.如权利要求959-960中任一项所述的方法，其中该生物分子包括多肽、核酸、和多糖、或其任何组合。
962.如条款961所述的方法，其中该生物分子是核酸。
963.如权利要求962所述的方法，其中该核酸是寡核苷酸、DNA或RNA。
964.如权利要求961所述的方法，其中该多肽是蛋白质、酶或蛋白质结合试剂。
965.如权利要求964所述的方法，其中该蛋白质结合试剂包括抗体、适配子、或其组合。
966.如权利要求964所述的系统，其中该蛋白质结合试剂能够特异性结合多个蛋白质靶中的至少一个。
967.如权利要求966所述的系统，其中该多个蛋白质靶包括细胞表面蛋白质、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、抗体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、或其任何组合。
968.如权利要求964所述的系统，其中该多个蛋白质靶包括10-400种不同的蛋白质靶。
969.如权利要求959-968中任一项所述的方法，其中该生物分子选自至少100种不同的生物分子。
970.如权利要求959-968中任一项所述的方法，其中该生物分子选自至少1,000种不同的生物分子。
971.如权利要求959-968中任一项所述的方法，其中该生物分子选自至少10,000种不同的生物分子。
972.如权利要求959-971中任一项所述的方法，其中该标记包括荧光团、发色团、多肽、蛋白质、酶、酶底物、催化剂、氧化还原标记、放射性标记、声学标记、拉曼(SERS)标签、质量标签、同位素标签、磁颗粒、微颗粒、纳米颗粒、和寡核苷酸、或其任何组合。
973.如权利要求972所述的方法，
其中该标记包括酶、酶底物、或其组合，并且
其中该酶能够将该酶底物修饰成对应的经修饰的酶底物。
974.如权利要求973所述的方法，其中该酶底物与对应的经修饰的酶底物具有至少一个官能团的差异。
975.如权利要求974所述的方法，其中该至少一个官能团是烷基、烯基、炔基、苯基、苄基、卤基、氟、氯、溴、碘、羟基、羰基、醛、卤代甲酰基、碳酸酯、羧酸根、羧基、酯、甲氧基、氢过氧基、过氧基、醚、半缩醛、半缩酮、乙缩醛、缩酮、乙缩醛、原酸酯、亚甲基二氧基、原碳酸酯、甲酰胺、伯胺、仲胺、叔胺、4°铵、伯氯胺酮、仲氯胺酮、伯醛亚胺、仲醛亚胺、酰亚胺、叠氮基、偶氮基、二酰亚胺、氰酸酯、异氰酸酯、硝酸酯、腈、异腈、亚硝基氧基、硝基、亚硝基、吡啶基、巯基、硫醚、二硫醚、亚磺酰基、磺酰基、亚磺基、磺基、硫氰酸酯、异硫氰酸酯、碳硫酮、碳硫醛、膦基、膦酰基、磷酸酯、磷酸二酯、二羟硼基、硼酸酯、亚二羟硼基、亚硼酸酯、或其任何组合。
976.如权利要求973-975中任一项所述的方法，其中该酶包括甲基转移酶、糖苷水解酶、琼脂水解酶、氨酸酶、淀粉酶、乙糖苷酶、卡拉胶酶、纤维素酶、神经酰胺酶、几丁质酶、脱乙酰几丁质酶、柠檬酸酶、葡聚糖酶、糊精酶、果糖苷酶、岩藻多糖酶、墨角藻糖苷酶、呋喃糖苷酶、半乳糖苷酶、半乳糖醛酸酶、葡聚糖酶、葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、葡萄糖苷酸酶、糖水解酶、糖苷酶、己糖苷酶、水解酶、艾杜糖醛酸酶、肌苷酶、菊粉酶、乳糖酶、果聚糖酶、地衣多糖酶、连接酶、裂解酶、溶菌酶、麦芽糖苷酶、麦芽糖壳三糖酶、甘露二糖苷酶、甘露糖苷酶、胞壁酸酶、辛糖酸酶、辛糖酸水解酶、樱草苷酶、蛋白酶、支链淀粉酶、鼠李糖苷酶、糖胺酶、唾液酸酶、合酶、转移酶、海藻糖酶、turonidase、turonosidase、木聚糖酶、木糖苷酶、或其组合。
977.如权利要求973-976中任一项所述的方法，其中该酶底物包括6-巯基嘌呤、纤维二糖、纤维四糖、木四糖、异樱草糖、β-D-龙胆二糖、木葡聚糖和甘露三糖、琼脂糖、胺酸、淀粉、寡糖、多糖、纤维素、神经酰胺、几丁质、壳聚糖、右旋糖、糊精、果糖、岩藻多糖、岩藻糖、呋喃糖苷、半乳糖苷、葡聚糖、吡喃葡萄糖苷、葡萄糖苷、葡萄糖醛酸、葡糖苷酸、葡萄糖、糖苷、糖胺聚糖、己糖苷、菊粉、乳糖、levanose、脂多糖、甘露糖、麦芽糖苷、麦芽三糖苷、甘露糖、辛基酮糖酸、寡糖、果胶酸酯、果胶、肽、聚半乳糖醛酸、多核苷酸、支链淀粉、鼠李糖苷、木聚糖、或其任何组合。
978.如权利要求973-977中任一项所述的方法，其中该标记要求包括酶要求和底物要求。
979.如权利要求972所述的方法，其中该寡核苷酸包括针对该生物分子的独特标识。
980.如权利要求979所述的方法，其中该独特标识选自独特标识的多元组。
981.如权利要求980所述的方法，其中独特标识的该多元组包括至少100种不同的独特标识。
982.如权利要求980所述的方法，其中独特标识的该多元组包括至少1,000种不同的独特标识。
983.如权利要求980所述的方法，其中独特标识的该多元组包括至少10,000种不同的独特标识。
984.如权利要求979-983中任一项所述的方法，其中该一个或多个经标记的生物分子试剂的生物分子包括多个抗体、多个适配子、或其组合。
985.如权利要求979-984中任一项所述的方法，其中该独特标识与样品的基因组序列不同源。
986.如权利要求985所述的方法，其中该样品是单个细胞、多个细胞、组织、肿瘤样品、或其任何组合。
987.如权利要求985或986所述的方法，其中该样品是哺乳动物样品、细菌样品、病毒样品、酵母样品、真菌样品、或其任何组合。
988.如权利要求979-987中任一项所述的方法，其中该寡核苷酸包括条形码序列、聚(A)尾、或其组合。
989.如权利要求979-988中任一项所述的方法，其中该寡核苷酸的条形码序列选自至少10种不同的条形码序列。
990.如权利要求979-988中任一项所述的方法，其中该寡核苷酸的条形码序列选自至少100种不同的条形码序列。
991.如权利要求979-988中任一项所述的方法，其中该寡核苷酸的条形码序列选自至少1,000种不同的条形码序列。
992.如权利要求959-991中任一项所述的方法，其中该标记通过接头与该生物分子缀合。
993.如权利要求992所述的方法，其中该寡核苷酸包括该接头。
994.如权利要求993所述的方法，其中该接头包括化学基团。
995.如权利要求994所述的方法，其中该化学基团可逆地附接至该生物分子。
996.如权利要求994-995中任一项所述的方法，其中该化学基团选自下组，该组由以下组成：UV可光解基团、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、及其任何组合。
997.一种系统，该系统包括：
多个经激活的生物分子，其包括多个经激活的蛋白质结合试剂；
多个经激活的标记；和
用于制备经标记的生物分子试剂的试剂制备装置，
其中该试剂制备装置被配置为：
接收所鉴定的生物分子存储标识和标记存储标识；和
产生与所接收的生物分子存储标识和标记存储标识相对应的经标记的生物分子试剂。
998.如权利要求997所述的系统，其中该生物分子包括多肽、核酸、和多糖、或其任何组合。
999.如权利要求998所述的系统，其中该核酸是寡核苷酸、DNA或RNA。
1000.如权利要求998所述的系统，其中该多肽是蛋白质、酶或蛋白质结合试剂。
1001.如权利要求1000所述的系统，其中该蛋白质结合试剂包括抗体、适配子、或其组合。
1002.如权利要求1000所述的系统，其中该蛋白质结合试剂能够特异性结合多个蛋白质靶中的至少一个。
1003.如权利要求1002所述的系统，其中该多个蛋白质靶包括细胞表面蛋白质、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、抗体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、或其任何组合。
1004.如权利要求1002所述的系统，其中该多个蛋白质靶包括10-400种不同的蛋白质靶。
1005.如权利要求997-1004中任一项所述的系统，其中每个生物分子选自至少100种不同的生物分子。
1006.如权利要求997-1004中任一项所述的系统，其中每个生物分子选自至少1,000种不同的生物分子。
1007.如权利要求997-1004中任一项所述的系统，其中每个生物分子选自至少10,000种不同的生物分子。
1008.如权利要求997-1007中任一项所述的系统，其中每个经激活的生物分子包括反应性接头。
1009.如权利要求997-1007中任一项所述的系统，其中该系统包括100种或更多种不同的经激活的标记。
1010.如权利要求997-1009中任一项所述的系统，其中经激活的标记包括反应性接头。
1011.如权利要求997-1010中任一项所述的系统，其中该标记包括荧光团、发色团、多肽、蛋白质、酶、酶底物、催化剂、氧化还原标记、放射性标记、声学标记、拉曼(SERS)标签、质量标签、同位素标签、磁颗粒、微颗粒、纳米颗粒、寡核苷酸、或其任何组合。
1012.如权利要求1011所述的系统，
其中该标记包括酶、酶底物、或其组合，并且
其中该酶能够将该酶底物修饰成对应的经修饰的酶底物。
1013.如权利要求1012所述的系统，其中该酶底物与对应的经修饰的酶底物具有至少一个官能团的差异。
1014.如权利要求1013所述的系统，其中该至少一个官能团是烷基、烯基、炔基、苯基、苄基、卤基、氟、氯、溴、碘、羟基、羰基、醛、卤代甲酰基、碳酸酯、羧酸根、羧基、酯、甲氧基、氢过氧基、过氧基、醚、半缩醛、半缩酮、乙缩醛、缩酮、乙缩醛、原酸酯、亚甲基二氧基、原碳酸酯、甲酰胺、伯胺、仲胺、叔胺、4°铵、伯氯胺酮、仲氯胺酮、伯醛亚胺、仲醛亚胺、酰亚胺、叠氮基、偶氮基、二酰亚胺、氰酸酯、异氰酸酯、硝酸酯、腈、异腈、亚硝基氧基、硝基、亚硝基、吡啶基、巯基、硫醚、二硫醚、亚磺酰基、磺酰基、亚磺基、磺基、硫氰酸酯、异硫氰酸酯、碳硫酮、碳硫醛、膦基、膦酰基、磷酸酯、磷酸二酯、二羟硼基、硼酸酯、亚二羟硼基、亚硼酸酯、或其任何组合。
1015.如权利要求1011-1014中任一项所述的系统，其中该酶包括甲基转移酶、糖苷水解酶、琼脂水解酶、氨酸酶、淀粉酶、乙糖苷酶、卡拉胶酶、纤维素酶、神经酰胺酶、几丁质酶、脱乙酰几丁质酶、柠檬酸酶、葡聚糖酶、糊精酶、果糖苷酶、岩藻多糖酶、墨角藻糖苷酶、呋喃糖苷酶、半乳糖苷酶、半乳糖醛酸酶、葡聚糖酶、葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、葡萄糖苷酸酶、糖水解酶、糖苷酶、己糖苷酶、水解酶、艾杜糖醛酸酶、肌苷酶、菊粉酶、乳糖酶、果聚糖酶、地衣多糖酶、连接酶、裂解酶、溶菌酶、麦芽糖苷酶、麦芽糖壳三糖酶、甘露二糖苷酶、甘露糖苷酶、胞壁酸酶、辛糖酸酶、辛糖酸水解酶、樱草苷酶、蛋白酶、支链淀粉酶、鼠李糖苷酶、糖胺酶、唾液酸酶、合酶、转移酶、海藻糖酶、turonidase、turonosidase、木聚糖酶、木糖苷酶、或其组合。
1016.如权利要求1011-1015中任一项所述的系统，其中该酶底物包括6-巯基嘌呤、纤维二糖、纤维四糖、木四糖、异樱草糖、β-D-龙胆二糖、木葡聚糖和甘露三糖、琼脂糖、胺酸、淀粉、寡糖、多糖、纤维素、神经酰胺、几丁质、壳聚糖、右旋糖、糊精、果糖、岩藻多糖、岩藻糖、呋喃糖苷、半乳糖苷、葡聚糖、吡喃葡萄糖苷、葡萄糖苷、葡萄糖醛酸、葡糖苷酸、葡萄糖、糖苷、糖胺聚糖、己糖苷、菊粉、乳糖、levanose、脂多糖、甘露糖、麦芽糖苷、麦芽三糖苷、甘露糖、辛基酮糖酸、寡糖、果胶酸酯、果胶、肽、聚半乳糖醛酸、多核苷酸、支链淀粉、鼠李糖苷、木聚糖、或其任何组合。
1017.如权利要求1011-1016中任一项所述的系统，其中该标记要求包括酶要求和底物要求。
1018.如权利要求1011所述的系统，其中该寡核苷酸包括与蛋白质结合试剂缀合的该蛋白质结合试剂的独特标识。
1019.如权利要求1018所述的系统，其中该独特标识包括长度为25-45个核苷酸的核苷酸序列。
1020.如权利要求1018-1019中任一项所述的系统，其中该独特标识选自独特标识的多元组。
1021.如权利要求1020所述的系统，其中独特标识的该多元组包括至少100种不同的独特标识。
1022.如权利要求1020所述的系统，其中独特标识的该多元组包括至少1,000种不同的独特标识。
1023.如权利要求1020所述的系统，其中独特标识的该多元组包括至少10,000种不同的独特标识。
1024.如权利要求1018-1023中任一项所述的系统，其中该独特标识与样品的基因组序列不同源。
1025.如权利要求1024所述的系统，其中该样品是单个细胞、多个细胞、组织、肿瘤样品、或其任何组合。
1026.如权利要求1024或1025所述的系统，其中该样品是哺乳动物样品、细菌样品、病毒样品、酵母样品、真菌样品、或其任何组合。
1027.如权利要求1018-1026中任一项所述的系统，其中该寡核苷酸包括条形码序列、聚(A)尾、或其组合。
1028.如权利要求1018-1027中任一项所述的系统，其中该寡核苷酸的条形码序列具有选自至少10种不同条形码序列的序列。
1029.如权利要求1018-1027中任一项所述的系统，其中该寡核苷酸的条形码序列选自至少100种不同的条形码序列。
1030.如权利要求1018-1027中任一项所述的系统，其中该寡核苷酸的条形码序列选自至少1,000种不同的条形码序列。
1031.如权利要求997-1030中任一项所述的系统，其中该标记通过接头与该生物分子缀合。
1032.如权利要求1031所述的系统，其中该寡核苷酸包括该接头。
1033.如权利要求1032所述的系统，其中该接头包括化学基团。
1034.如权利要求1033所述的系统，其中该化学基团可逆地附接至该生物分子。
1035.如权利要求1033-1034中任一项所述的系统，其中该化学基团选自下组，该组由以下组成：UV可光解基团、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、及其任何组合。
1036.一种存储物，该存储物包括：
多个经激活的生物分子；和多个经激活的标记。
1037.如权利要求1036所述的存储物，其中该生物分子包括多肽、核酸、和多糖、或其任何组合。
1038.如权利要求1037所述的存储物，其中该核酸是寡核苷酸、DNA或RNA。
1039.如权利要求1037所述的存储物，其中该多肽是蛋白质、酶或蛋白质结合试剂。
1040.如权利要求1039所述的存储物，其中该蛋白质结合试剂包括抗体、适配子、或其组合。
1041.如权利要求1039所述的存储物，其中该蛋白质结合试剂能够特异性结合多个蛋白质靶中的至少一个。
1042.如权利要求1041所述的存储物，其中该多个蛋白质靶包括细胞表面蛋白质、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、抗体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、或其任何组合。
1043.如权利要求1041所述的存储物，其中该多个蛋白质靶包括10-400种不同的蛋白质靶。
1044.如权利要求1036-1043中任一项所述的存储物，其中每个生物分子选自至少100种不同的生物分子。
1045.如权利要求1036-1043中任一项所述的存储物，其中每个生物分子选自至少1,000种不同的生物分子。
1046.如权利要求1036-1043中任一项所述的存储物，其中每个生物分子选自至少10,000种不同的分子。
1047.如权利要求1036-1046中任一项所述的存储物，其中每个经激活的生物分子包括反应性接头。
1048.如权利要求1036-1047中任一项所述的存储物，其中该标记包括荧光团、发色团、多肽、蛋白质、酶、酶底物、催化剂、氧化还原标记、放射性标记、声学标记、拉曼(SERS)标签、质量标签、同位素标签、磁颗粒、微颗粒、和纳米颗粒、寡核苷酸、或其任何组合。
1049.如权利要求1048所述的存储物，
其中该标记包括酶、酶底物、或其组合，并且
其中该酶能够将该酶底物修饰成对应的经修饰的酶底物。
1050.如权利要求1049所述的存储物，其中该酶底物与对应的经修饰的酶底物具有至少一个官能团的差异。
1051.如权利要求1050所述的存储物，其中该至少一个官能团是烷基、烯基、炔基、苯基、苄基、卤基、氟、氯、溴、碘、羟基、羰基、醛、卤代甲酰基、碳酸酯、羧酸根、羧基、酯、甲氧基、氢过氧基、过氧基、醚、半缩醛、半缩酮、乙缩醛、缩酮、乙缩醛、原酸酯、亚甲基二氧基、原碳酸酯、甲酰胺、伯胺、仲胺、叔胺、4°铵、伯氯胺酮、仲氯胺酮、伯醛亚胺、仲醛亚胺、酰亚胺、叠氮基、偶氮基、二酰亚胺、氰酸酯、异氰酸酯、硝酸酯、腈、异腈、亚硝基氧基、硝基、亚硝基、吡啶基、巯基、硫醚、二硫醚、亚磺酰基、磺酰基、亚磺基、磺基、硫氰酸酯、异硫氰酸酯、碳硫酮、碳硫醛、膦基、膦酰基、磷酸酯、磷酸二酯、二羟硼基、硼酸酯、亚二羟硼基、亚硼酸酯、或其任何组合。
1052.如权利要求1048-1051中任一项所述的存储物，其中该酶包括甲基转移酶、糖苷水解酶、琼脂水解酶、氨酸酶、淀粉酶、乙糖苷酶、卡拉胶酶、纤维素酶、神经酰胺酶、几丁质酶、脱乙酰几丁质酶、柠檬酸酶、葡聚糖酶、糊精酶、果糖苷酶、岩藻多糖酶、墨角藻糖苷酶、呋喃糖苷酶、半乳糖苷酶、半乳糖醛酸酶、葡聚糖酶、葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、葡萄糖苷酸酶、糖水解酶、糖苷酶、己糖苷酶、水解酶、艾杜糖醛酸酶、肌苷酶、菊粉酶、乳糖酶、果聚糖酶、地衣多糖酶、连接酶、裂解酶、溶菌酶、麦芽糖苷酶、麦芽糖壳三糖酶、甘露二糖苷酶、甘露糖苷酶、胞壁酸酶、辛糖酸酶、辛糖酸水解酶、樱草苷酶、蛋白酶、支链淀粉酶、鼠李糖苷酶、糖胺酶、唾液酸酶、合酶、转移酶、海藻糖酶、turonidase、turonosidase、木聚糖酶、木糖苷酶、或其组合。
1053.如权利要求1048-1052中任一项所述的存储物，其中该酶底物包括6-巯基嘌呤、纤维二糖、纤维四糖、木四糖、异樱草糖、β-D-龙胆二糖、木葡聚糖和甘露三糖、琼脂糖、胺酸、淀粉、寡糖、多糖、纤维素、神经酰胺、几丁质、壳聚糖、右旋糖、糊精、果糖、岩藻多糖、岩藻糖、呋喃糖苷、半乳糖苷、葡聚糖、吡喃葡萄糖苷、葡萄糖苷、葡萄糖醛酸、葡糖苷酸、葡萄糖、糖苷、糖胺聚糖、己糖苷、菊粉、乳糖、levanose、脂多糖、甘露糖、麦芽糖苷、麦芽三糖苷、甘露糖、辛基酮糖酸、寡糖、果胶酸酯、果胶、肽、聚半乳糖醛酸、多核苷酸、支链淀粉、鼠李糖苷、木聚糖、或其任何组合。
1054.如权利要求1048所述的存储物，其中该寡核苷酸包括与蛋白质结合试剂缀合的该蛋白质结合试剂的独特标识。
1055.如权利要求1054所述的存储物，其中该独特标识包括长度为25-45个核苷酸的核苷酸序列。
1056.如权利要求1054-1055中任一项所述的存储物，其中该独特标识选自独特标识的多元组。
1057.如权利要求1056所述的存储物，其中独特标识的该多元组包括至少100种不同的独特标识。
1058.如权利要求1056所述的存储物，其中独特标识的该多元组包括至少1,000种不同的独特标识。
1059.如权利要求1056所述的存储物，其中独特标识的该多元组包括至少10,000种不同的独特标识。
1060.如权利要求1054-1059中任一项所述的存储物，其中该独特标识与样品的基因组序列不同源。
1061.如权利要求1060所述的存储物，其中该样品是单个细胞、多个细胞、组织、肿瘤样品、或其任何组合。
1062.如权利要求1060或1061所述的存储物，其中该样品是哺乳动物样品、细菌样品、病毒样品、酵母样品、真菌样品、或其任何组合。
1063.如权利要求1054-1062中任一项所述的存储物，其中该寡核苷酸包括条形码序列、聚(A)尾、或其组合。
1064.如权利要求1054-1063中任一项所述的存储物，其中该寡核苷酸的条形码序列选自至少10种不同的条形码序列。
1065.如权利要求1054-1063中任一项所述的存储物，其中该寡核苷酸的条形码序列选自至少100种不同的条形码序列。
1066.如权利要求1054-1063中任一项所述的存储物，其中该寡核苷酸的条形码序列选自至少1,000种不同的条形码序列。
1067.如权利要求1036-1066中任一项所述的存储物，其中该标记通过接头与该生物分子缀合。
1068.如权利要求1067所述的存储物，其中该寡核苷酸包括该接头。
1069.如权利要求1068所述的存储物，其中该接头包括化学基团。
1070.如权利要求1069所述的存储物，其中该化学基团可逆地附接至该生物分子。
1071.如权利要求1069-1070中任一项所述的存储物，其中该化学基团选自下组，该组由以下组成：UV可光解基团、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺、及其任何组合。
1072.一种经标记的生物分子试剂分配系统，该系统包括：
输入模块，其用于接收对经标记的生物分子试剂的要求；
试剂制备装置；和
分配模块，其用于输出包装好的经标记的生物分子。
1073.如权利要求1072所述的经标记的生物分子试剂分配系统，其中该生物分子包括多肽、核酸、和多糖、或其任何组合。
1074.如权利要求1073所述的经标记的生物分子试剂分配系统，其中该核酸是寡核苷酸、DNA或RNA。
1075.如权利要求1073所述的经标记的生物分子试剂分配系统，其中该多肽是蛋白质、酶或蛋白质结合试剂。
1076.如权利要求1075所述的经标记的生物分子试剂分配系统，其中该蛋白质结合试剂包括抗体、适配子、或其组合。
1077.如权利要求1075所述的经标记的生物分子试剂分配系统，其中该蛋白质结合试剂能够特异性结合多个蛋白质靶中的至少一个。
1078.如权利要求1077所述的经标记的生物分子试剂分配系统，其中该多个蛋白质靶包括细胞表面蛋白质、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、抗体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、或其任何组合。
1079.如权利要求1077所述的经标记的生物分子试剂分配系统，其中该多个蛋白质靶包括10-400种不同的蛋白质靶。
1080.如权利要求1072-1079中任一项所述的经标记的生物分子试剂分配系统，其中每个生物分子选自至少100种不同的生物分子。
1081.如权利要求1072-1079中任一项所述的经标记的生物分子试剂分配系统，其中每个生物分子选自至少1,000种不同的生物分子。
1082.如权利要求1072-1079中任一项所述的经标记的生物分子试剂分配系统，其中每个生物分子选自至少10,000种不同的分子。
1083.如权利要求1072-1082中任一项所述的经标记的生物分子试剂分配系统，其中每个经激活的生物分子包括反应性接头。
1084.如权利要求1072-1083中任一项所述的经标记的生物分子试剂分配系统，其中该标记包括荧光团、发色团、多肽、蛋白质、酶、酶底物、催化剂、氧化还原标记、放射性标记、声学标记、拉曼(SERS)标签、质量标签、同位素标签、磁颗粒、微颗粒、纳米颗粒、和寡核苷酸、或其任何组合。
1085.如权利要求1084所述的经标记的生物分子试剂分配系统，
其中该标记包括酶、酶底物、或其组合，并且
其中该酶能够将该酶底物修饰成对应的经修饰的酶底物。
1086.如权利要求1085所述的经标记的生物分子试剂分配系统，其中该酶底物与对应的经修饰的酶底物具有至少一个官能团的差异。
1087.如权利要求1086所述的经标记的生物分子试剂分配系统，其中该至少一个官能团是烷基、烯基、炔基、苯基、苄基、卤基、氟、氯、溴、碘、羟基、羰基、醛、卤代甲酰基、碳酸酯、羧酸根、羧基、酯、甲氧基、氢过氧基、过氧基、醚、半缩醛、半缩酮、乙缩醛、缩酮、乙缩醛、原酸酯、亚甲基二氧基、原碳酸酯、甲酰胺、伯胺、仲胺、叔胺、4°铵、伯氯胺酮、仲氯胺酮、伯醛亚胺、仲醛亚胺、酰亚胺、叠氮基、偶氮基、二酰亚胺、氰酸酯、异氰酸酯、硝酸酯、腈、异腈、亚硝基氧基、硝基、亚硝基、吡啶基、巯基、硫醚、二硫醚、亚磺酰基、磺酰基、亚磺基、磺基、硫氰酸酯、异硫氰酸酯、碳硫酮、碳硫醛、膦基、膦酰基、磷酸酯、磷酸二酯、二羟硼基、硼酸酯、亚二羟硼基、亚硼酸酯、或其任何组合。
1088.如权利要求1084-1087中任一项所述的经标记的生物分子试剂分配系统，其中该酶包括甲基转移酶、糖苷水解酶、琼脂水解酶、氨酸酶、淀粉酶、乙糖苷酶、卡拉胶酶、纤维素酶、神经酰胺酶、几丁质酶、脱乙酰几丁质酶、柠檬酸酶、葡聚糖酶、糊精酶、果糖苷酶、岩藻多糖酶、墨角藻糖苷酶、呋喃糖苷酶、半乳糖苷酶、半乳糖醛酸酶、葡聚糖酶、葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、葡萄糖苷酸酶、糖水解酶、糖苷酶、己糖苷酶、水解酶、艾杜糖醛酸酶、肌苷酶、菊粉酶、乳糖酶、果聚糖酶、地衣多糖酶、连接酶、裂解酶、溶菌酶、麦芽糖苷酶、麦芽糖壳三糖酶、甘露二糖苷酶、甘露糖苷酶、胞壁酸酶、辛糖酸酶、辛糖酸水解酶、樱草苷酶、蛋白酶、支链淀粉酶、鼠李糖苷酶、糖胺酶、唾液酸酶、合酶、转移酶、海藻糖酶、turonidase、turonosidase、木聚糖酶、木糖苷酶、或其组合。
1089.如权利要求1084-1088中任一项所述的经标记的生物分子试剂分配系统，其中该酶底物包括6-巯基嘌呤、纤维二糖、纤维四糖、木四糖、异樱草糖、β-D-龙胆二糖、木葡聚糖和甘露三糖、琼脂糖、胺酸、淀粉、寡糖、多糖、纤维素、神经酰胺、几丁质、壳聚糖、右旋糖、糊精、果糖、岩藻多糖、岩藻糖、呋喃糖苷、半乳糖苷、葡聚糖、吡喃葡萄糖苷、葡萄糖苷、葡萄糖醛酸、葡糖苷酸、葡萄糖、糖苷、糖胺聚糖、己糖苷、菊粉、乳糖、levanose、脂多糖、甘露糖、麦芽糖苷、麦芽三糖苷、甘露糖、辛基酮糖酸、寡糖、果胶酸酯、果胶、肽、聚半乳糖醛酸、多核苷酸、支链淀粉、鼠李糖苷、木聚糖、或其任何组合。
1090.如权利要求1084所述的经标记的生物分子试剂分配系统，其中该寡核苷酸包括与蛋白质结合试剂缀合的该蛋白质结合试剂的独特标识。
1091.如权利要求1090所述的经标记的生物分子试剂分配系统，其中该独特标识包括长度为25-45个核苷酸的核苷酸序列。
1092.如权利要求1090-1091中任一项所述的经标记的生物分子试剂分配系统，其中该独特标识选自独特标识的多元组。
1093.如权利要求1092所述的经标记的生物分子试剂分配系统，其中独特标识的该多元组包括至少100种不同的独特标识。
1094.如权利要求1092所述的经标记的生物分子试剂分配系统，其中独特标识的该多元组包括至少1,000种不同的独特标识。
1095.如权利要求1092所述的经标记的生物分子试剂分配系统，其中独特标识的该多元组包括至少10,000种不同的独特标识。
1096.如权利要求1090-1095中任一项所述的经标记的生物分子试剂分配系统，其中该独特标识与样品的基因组序列不同源。
1097.如权利要求1096所述的经标记的生物分子试剂分配系统，其中该样品是单个细胞、多个细胞、组织、肿瘤样品、或其任何组合。
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