CN104540964A - 使用序列标签的单细胞分析 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了通过形成包含单细胞和预定数目、通常1个的同质序列标签的反应器对群体的个体细胞进行测量的方法。在一方面，本发明提供了通过进行聚合酶循环组装(PCA)反应以将其标示核酸序列诸如源于同质序列标签的序列标签拷贝连接至感兴趣的其他细胞核酸，从而生成融合产物，来对此种群体的个体细胞进行多参数测量的方法。然后对此种PCA反应的融合产物测序并制成表以生成对于群体的细胞的多参数数据。

Description

使用序列标签的单细胞分析
交叉引用
本申请要求2012年7月24日提交的美国临时专利申请号61/675,254的权益，其通过引用其全部并入。
背景
细胞计量术在很多医学和研究领域扮演着不可或缺的角色。已发现基于图像的及流式细胞仪在这些领域中广泛的用于计数细胞和测量其物理和分子性质，例如Shapiro,Practical Flow Cytometry,4th Edition(Wiley-Liss,2003)。尤其是，流式细胞术是用于对群体的大量个体细胞快速测量多个参数，使能够获得关于群体或其亚群体的统计学上可靠信息的有力技术。该技术在一个范围的疾病的检测和控制中已是重要的，尤其是血液相关的疾病，诸如造血系统癌症(hematopoietic cancer)、HIV等，例如Woijciech,FlowCytometry in Neoplastic Hematology,第二版(Informa Healthcare,2010)；Brown等人Clinical Chemistry,46:8(B):1221-1229(2000)。尽管有此效用，流式细胞术具有许多缺点，包括在稀有细胞检测(rare cell detection)中有限的灵敏度，例如Campana等人Hematol.Oncol.Clin.North Am.,23(5):1083-1098(2009)；在实际可同时测量的细胞参数数量中的局限性；及昂贵的仪器操作。
鉴于以上，如果有克服现有细胞计量法的缺点、对大量个体细胞进行多参数测量的可用的替代方法及系统，对很多医学和研究领域将是有益的。
发明概述
本发明涉及用于通过为各细胞生成一个或更多个靶核酸和独特序列标签的融合产物，进行群体的个体细胞的此种核酸的多参数测量的方法。本发明的各方面以一些实施和应用举例说明，其中一些在以下概述并贯穿说明书始末。
在一方面，本发明包括分析群体的单细胞的多个靶核酸的方法，包括步骤：(a)提供多个反应器，反应器各自包含在扩增混合物中的群体的单细胞和单一同质序列标签(homogeneous sequence tag)，扩增混合物包含用于扩增多个中的各靶核酸的引物对；(b)提供来自同质序列标签的可扩增的序列标签；(c)扩增靶核酸和可扩增的序列标签以产生包含序列标签的扩增子；及(d)对来自反应器的扩增子测序以通过掺入扩增子的序列标签来鉴定来自群体的各细胞的靶核酸。在一些实施方案中，该方法还包括在扩增步骤之前在反应器中裂解单细胞的步骤。还有一些实施方案中，反应器为通过微流体装置制备的油包水微团。又还有一些实施方案中，本发明的微团具有均匀的尺寸分布；例如，在一些实施方案中，微团具有30％或更小的变异系数的体积分布。
本发明的这些以上特点方面及其他方面以一些说明性的实施和应用举例说明，其中一些显示在附图中并在以下的权利要求部分中描述其特征。尽管如此，以上发明内容并不意图描述本发明的每一个说明性的实施方案或每一个应用。
附图简述
图1A显示了本发明的方法的一个实施方案的步骤。
图1B显示了来自本发明的一个实施方案的单细胞分析的数据。
图1C-1F显示了同质序列标签的多种实施方案。
图1G显示了从以珠样式(bead format)的同质序列标签释放加序列标签的引物(sequence tagged primer)的酶法。
图1H显示了利用连接酶和瓣状(flap)内切核酸酶附着加序列标签的引物结合位点至靶核酸的方法。
图1I显示了在图1H中图示的反应的组成部分。
图1J显示了其中独特序列标签附着至靶多核苷酸的各末端的实施方案。
图1K图解地显示了用于富集含有细胞和同质序列标签二者的微团的微流体装置。
图2A-2C显示了在内部引物对具有互补的尾部时用于连接靶序列的PCA策略。
图3A-3C显示了在各对内部引物的仅1个引物具有与靶序列末端互补的尾部时用于连接靶序列的PCA策略。
图4A-4C显示了在内部引物对具有互补的尾部及外部引物对具有用于通过PCR继续扩增组装产物的尾部时用于连接靶序列的PCA策略。
图5A-5F显示了靶序列的多重成对组装(a multiplex of pairwiseassemblies of target sequences)。
图6A-6E显示了用PCA将3个序列连接在一起的方法。
图7显示了用于从细胞基因组DNA的随机区段提供同质序列标签的实施方案。
发明详述
除非有其他说明，本发明的实施可使用属于该技术领域的技术的有机化学、分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学、和生物化学的常规技术和描述。此类常规技术包括但不限于血细胞的取样和分析、核酸测序和分析等。合适技术的具体说明可通过参考本文以下实例获得。尽管如此，其他相当的常规步骤当然地也可使用。此类常规技术和描述可在标准实验室手册诸如Genome Analysis:A Laboratory Manual Series(Vols.I-IV)；PCRPrimer:A Laboratory Manual；and Molecular Cloning:A Laboratory Manual(都来自Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Ausubel，编辑，CurrentProtocols in Molecular Biology(John Wiley&Sons，电子和印刷版)；等中找到。
本发明提供了用于分析种群的个体细胞或颗粒中的多核酸的方法。在另一方面，对各个体细胞或颗粒的核酸进行反应以使独特序列标签连接至感兴趣的一个或更多个细胞核酸，之后序列标签和靶核酸的结合物(本文中被称作“融合产物”)通过高通量核酸测序分析。即，其核酸被分析的各细胞或颗粒接收独特的序列标签，由此来自其的核酸可被鉴定，并且来自其他细胞的核酸可被从其区分。如此连接的产物即上述的结合物在本文中称为“融合产物”。其生成后，融合产物被测序并制表以生成群体的各细胞或颗粒的数据，特别地多参数数据。此类数据可包括基因表达数据、关于一种或更多种预定基因组序列(诸如癌基因)的存在或缺失的数据、基因拷贝数的数据、或前述的组合。在一些实施方案中，此类数据特别地包括基因表达数据，诸如源于分离自细胞细胞质的信使RNA。分析的细胞可包括血细胞、从组织中分解的细胞、单细胞有机体、循环肿瘤细胞等。分析的颗粒可包括细胞器、外排体(exosomes)、囊泡、微泡等。在一个实施方案中，要分析的细胞和/或颗粒来自相同的样品或相同的生物来源，诸如(例如)患者的组织样品。在另一个实施方案中，要分析的细胞和/或颗粒可以是样品的混合物或来自多个生物来源。在一些实施方案中，通过本发明的方法分析的细胞缺少细胞壁。在其他实施方案中，通过本发明的方法分析的细胞为哺乳类动物细胞，且更特别地人类细胞。
在一些实施方案中，单序列标签通过聚合酶循环组装(PCA)反应附加于多靶核酸。在其他实施方案中，一个序列标签附加于各靶核酸。图1A给出了本发明一个实施方案的概述。细胞(100)与PCA反应混合物中的同质序列标签(102)结合，之后PCA反应混合物被分配到小的反应体积，由此被分配到许多此类体积，每个包含单细胞和单一同质序列标签。此类分配可以以下更充分公开的多种方式进行。在一些实施方案中，分配通过生成油包水乳液(126)完成，在其中微团诸如(110)充当单细胞反应器。微团的一部分诸如微团(108)和(110)包含单细胞和单一同质序列标签。在此类微团中，靶核酸被同质序列标签独特地标记。如以下更充分的讨论的，同质序列标签可具有多种形式。在图1A的实施方案中，同质序列标签(102)为滚环扩增反应产物，即RCA扩增子，其包含加序列标签的引物的拷贝。放大(Blow-up)(105)把在单链RCA扩增子中的序列标签表示为二进制数。在一个实施方案中，此类加序列标签的引物为线性寡核苷酸，各自包含在其5’末端的引物结合位点、在其3’末端的靶特异序列、及夹在之间的序列标签(例如图1C中作为一个实施方案显示的)。此类PCA反应物可为PCA反应中的内侧引物或外侧引物。在另一个实施方案中，序列标签-包含同质序列标签(102)的组成部分在PCA反应中可被当作靶核酸，而非作为引物。即，区段(154)并非是位点特异的，其还可以是对通用或连接引物特异的，从而其在PCA反应中沿着细胞靶核酸扩增，以产生包含至少一个序列标签的融合产物。
每个细胞具有和/或表达多种感兴趣的核酸(104)，即，通过字母“a”、“b”、“c”和“w”表示的靶核酸，其可以为基因组DNA、RNA、表达的基因等。RNA靶核酸通常利用常规试剂和技术通过逆转录酶反应转化成DNA，所述常规试剂和技术例如如Tecott等人，美国专利5,168,038中公开的。依照本发明，细胞(100)被置入(106)单细胞反应器，其在该实例中被显示为油包水乳液的微团(126)，然而可使用多种单细胞反应器，包括但不限于带有纳升体积孔阵列的平板、微流体装置等，如以下更充分的描述。在一方面，单细胞乳液(126)利用微流体乳液发生器诸如由Zeng等人Anal.Chem.,82:3183-3190(2010)等公开的生成。
单细胞反应器(诸如乳液(126)的微团)包含PCA反应混合物，其例如可包括核酸聚合酶、外部引物和连接引物(以下更充分的描述)、核苷三磷酸、缓冲溶液等。在一些实施方案中，PCA反应混合物还可包含一种或更多种细胞裂解试剂，因此此类试剂可更容易的获得接近靶核酸。对于包含细胞和同质序列标签的每个反应器例如(110)，PCA反应(112)生成融合产物(114)，其可包含一对或更多对序列，从而该对中的一个成员为序列标签且另一个成员为感兴趣的核酸诸如表达的基因、癌基因等。在另一个实施方案中，融合产物可包括三联体序列或更高阶连接体(concatenations)。在一些实施方案中，每个细胞(或每个反应器)可生成单种融合产物或每个细胞(或每个反应器)可生成多个不同种类的融合产物。如此的多个(Suchplurality)可为在从2至1000、或从2至200、或从2至100、或从2至20的范围。在一个实施方案中，如此的多个可为在从2至10的范围。应理解的是在一些实施方案中，至少一种序列标签包含于如此的多个中。
PCA反应(112)完成后，乳液(126)被破坏且融合产物(114)被分离(116)。融合产物(114)在图1中被表示为序列标签(103)和靶核酸(128)的结合物(118)。多种常规方法可用来分离融合产物(114)，包括但不限于柱色谱法、乙醇沉淀、使用生物素化引物后的亲和纯化、凝胶电泳等。作为PCA反应(112)的部分或分离(116)后，另外的序列可被添加到融合产物(114)，如测序(120)所需，例如使用P5和P7引物用于基于Illumina的测序。测序可使用常规的高通量仪器(122)进行，例如Genome Analyzer IIx(Illumina,Inc.,SanDiego)等。来自仪器(122)的数据可以多种方式分析和展示(124)。在一个实施方案中，靶核酸为选择的基因表达产物例如mRNA的情况下，可以以与流式细胞术数据类似的方式，对整个群体或亚群绘制图来展示每个细胞的选择的基因的表达水平，如通过图(130)显示的。各细胞与通过PCA反应连接到在细胞中与其细胞丰度成比例的表达的基因的独特序列标签关联。因此，通过计数连接到特定的克隆型序列的表达的基因序列的数目，实验者得到对于细胞中关联特定序列标签的此类基因的表达的量度。如在图1B的图(130)中显示的，细胞的三个亚群基于基因w和基因a的表达水平通过不同的集群(132、134、和136)的存在示出。在一些实施方案中，无论何时检测基因表达水平，至少一种基因被选为内部标准用于其他基因表达测量值的标准化。
用于分配的细胞样品的同质序列标签
同质序列标签为包含多个相同序列标签的反应物，或在确定的反应条件下能够生成多个相同序列标签的反应物。同质序列标签可具有多种形式，包括但不限于(i)包含同一序列标签的重复拷贝的滚环扩增(RCA)扩增子、(ii)珠固定的序列标签、(iii)自我复制(self-reproducing)的序列标签等。同质序列标签的共性为此类标签包含能够释放或产生相同序列标签的多拷贝的单分子或微粒实体。同质序列标签可用于制备包含单细胞和独特反应物(例如用于PCR或PCA反应的加序列标签的引物)的反应器。这种情况可通过适当调整细胞和同质序列标签在反应混合物中的浓度及将反应混合物分配到小的体积从而使此类体积的一部分各包含单细胞和单一同质序列标签来完成。在一些实施方案中，其通过形成油包水乳液中的含水微团完成，如以下更充分描述的。在一些实施方案中，多种同质序列标签形式可一起使用。
图1C和1D显示了基于RCA扩增子的2种示例同质序列标签。在两个实例中，通过同质序列标签释放的终反应物是用于在PCA反应中使用的加序列标签的引物。在图1C中，RCA扩增子(146)利用常规技术例如Fire等人美国专利5,648,245(其通过引用并入)制备，并被设计为包含重复单位(149)，重复单位(149)转而包括加序列标签的引物(148)和反向互补的茎区段(151)和(153)。在一些实施方案中，加序列标签的引物(148)包括三个区段：(i)5’区段(150)，其包含连接序列(如以下描述，如果其为PCA中的内部引物，用于连接靶多核苷酸)或通用引物序列(例如，如果其为PCA中的外部引物)；(ii)序列标签(152)；及(iii)位点特异的区段(locus specificsegment)或用于退火至靶多核苷酸的引物，以便聚合酶延伸能够发生。RCA扩增子(146)生成后，调整条件以使茎区段(151)和(153)形成含有限制性内切核酸酶识别位点的双链的茎(155)，用于使RCA扩增子(146)断裂，从而释放环(157)中加序列标签的引物。所以消化并非始于RCA扩增子与限制性内切核酸酶组合，后者可选自耐热性的限制性内切核酸酶或切口酶，从而反应物可在较低温度例如室温下组合，且可通过升高温度至酶的最佳裂解温度引发裂解。示例的耐热性的限制性内切核酸酶包括Bsp QI(可购自New England Biolabs)。裂解(158)后，加序列标签的引物(160)被释放。
在图1D中，RCA扩增子(161)利用常规技术生成。区段(161)和(163)夹着加序列标签的引物(165)。一经加入含有与区段(161)和(163)互补的区域的寡核苷酸(162)，形成含有限制性内切核酸酶位点的双链体(167)。选择限制性内切核酸酶和位点位置，以使一经裂解(168)，加序列标签的引物(170)就被释放。如以上，可使用耐热性的限制性内切核酸酶和/或切口酶，以使得RCA扩增子和酶可在较低温度下组合而不消化(例如在制备乳液期间)，并然后可升高温度以引发消化和加序列标签的引物的释放(例如，在乳液的微团内)。
在图1E中，同质序列标签包括在联合的聚合酶延伸反应和切口酶反应(等温指数扩增反应，或EXPAR)中生成加序列标签的引物的核酸结构。EXPAR在Van Ness等人美国专利7,112,423中公开，其通过引用并入。EXPAR核酸结构(171)包括双链DNA部分(177)(通过寡核苷酸(175)退火至区段(174)形成)和充当用于聚合酶从(175)的3’末端延伸的模板的单链部分(172)。在双链部分(177)内置有切口酶位点以使其在区段(172)和(174)之间的边界处中止聚合酶延伸。因此，由于在适当的缓冲液(178)中聚合酶和切口酶活性与dNTP一起存在，加序列标签的引物(180)持续生成。
同质序列标签也可以是基于珠的，如在图1F和1G中所显示。在此实施方案中，相同加序列标签的引物在珠上合成，以使得其可在单细胞反应器形成后以化学法或酶促法释放。在一方面，加序列标签的引物利用常规化学反应例如亚磷酰胺化学反应在珠上化学合成。携带序列标签的相同(即克隆的)群体的珠通过加序列标签的引物的序列标签部分的常规的均分混合合成法(split and mix synthesis)制备，例如Yang等人Nucleic AcidsResearch,30(23):e132(2002)。图1F显示了以化学法合成同质序列标签的一个实施方案。在图中，为了清晰，仅显示了一条附着于固体支持物(1000)的链，但请理解为充分负载的珠。固体支持物(1000)的大小和组成及接头(1002)是部分地取决于应用的设计选择。在此实施方案中，加序列标签的引物(1011)从靠近固体支持物(1000)的3’末端(1001)开始包括以下元件：包含限制性内切核酸酶位点的一条链的区段(1004)；包含对靶核酸特异的引物的区段(1006)；序列标签(1008)；和包含用于扩增加标签的靶多核苷酸的通用引物的引物结合位点的区段(1010)。如图1G中所示，在一个实施方案中，在分配至反应器之前，在允许双链体(1018)形成的条件下，与区段(1004)互补的寡核苷酸(1016)在反应混合物中与固体支持物(1000)组合(1012)。双链体(1018)包含限制性内切核酸酶的限制位点，其经升高温度被激活。对本领域普通技术人员来说很清楚，双链体(1018)的序列组成和长度取决于用于从固体支持物(1000)裂解加序列标签的引物(1011)的耐热性的限制性内切核酸酶的操作温度。升高温度(1014)以激活限制性酶后，附着的加序列标签的引物(1011)与双链体(1018)从固体支持物(1000)上裂解下来，从而释放可操作的加序列标签的引物(1011)。依照限制性内切核酸酶的裂解特性，可选择加序列标签的引物(1011)的3’末端以与靶多核苷酸互补(例如，II型酶Bsp QI允许如此选择)。对于其他限制性酶，加序列标签的引物的3’末端可对适配体引物的5’尾巴特异，所述适配体引物转而对靶核酸特异。
聚合酶循环组装(PCA)反应形式
聚合酶循环组装(PCA)反应(有时候也称作连接PCR)允许多个核酸片段在片段退火和聚合酶延伸的一个或更多个循环中融合在一起以形成单融合产物，例如Xiong等人FEBS Micro biol.Rev.,32:522-540(2008)。PCA反应以很多方式发生。在一种感兴趣的方式中，PCA包括多个聚合酶链式反应(PCR)在同一反应体积中发生，其中各组成PCR包括允许来自产生的扩增子的链退火至来自反应中的另一扩增子的链并被延伸以形成融合产物或融合产物的前体的至少一种连接引物。具有多种方式的PCA(并有多种别名)是用于片段组装和基因合成的被人们所熟知的方法，其几种方式在以下和以下通过引用并入的参考文献中公开：Yon等人Nucleic AcidsResearch,17:4895(1989)；Stemmer等人美国专利5,928,905；Chen等人J.Am.Chem.Soc.,116:8799-8800(1994)；Stemmer等人Gene,164:49-53(1995)；Hoover等人Nucleic Acids Research,30(10):e43(2002)；Xiong等人Biotechnology Advances,26:121-134(2008)；Xiong等人FEBS Microbiol.Rev.,32:522-540(2008)等。
特定的PCA反应条件对于特别的实施方案可广泛的变化且可包括对于该领域普通技术人员的常规设计选择。示例的PCA反应条件可包括以下：39.4μL蒸馏水加入10μL的10×缓冲液(100mM Tris-HCl、pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、和0.01％明胶)、2μL各dNTP 10mM溶液、0.5μL Taq聚合酶(5单位/μL)、外部引物各1μL(取自100μM贮存液)和内部引物各10μL(取自0.1μM贮存液)。通常，在PCA反应中外部引物的浓度大于内部引物的浓度以使融合产物的扩增在最初形成后继续。例如，在一个实施方案中为了融合两个靶核酸，外部引物浓度可为内部引物浓度的从约10至100倍，例如外部引物为1μM且内部引物为0.01μM。另外，PCA反应可包括PCR的成分。
本发明中一些有用的PCA形式在图2A-2C、3A-3C、4A-4C、5A-5D、和6A-6E中描述。图2A-2C显示了示例的PCA策略(“策略1”)，用于将两个单独的片段A’(208)和B’(210)加入单融合产物(222)。在同一PCR混合物中片段A’(208)用引物(200)和(202)扩增并且片段B’(210)用引物(206)和(204)扩增。引物(200)和(206)为PCA反应的“外部”引物且引物(202)和(204)为PCA反应的“内部”引物。内部引物(202)和(204)各具有与A’或B’(或相邻序列，如果A’和B’为嵌入较长序列中的区段)不互补的尾巴(203和205，分别地)。尾巴(203)和(205)彼此互补。通常，选择此类内部引物尾巴用于对其相应的内部引物(且非别处)选择性杂交；但其他情况此类尾巴可在长度和序列上广泛地变化。在一方面，此类尾巴具有在从8至30个核苷酸的范围的长度；或在从14至24个核苷酸的范围的长度。至于PCR过程(212)，制备产物片段A(215)和B(217)使得将尾巴(203)和(205)分别地掺入末端区域(214)和(216)。PCR期间产物片段A(215)和B(217)将变性并且A的一些“上部”链(215a)退火(218)至B的下部链(217b)并且3’末端延伸(219)以形成(220)融合产物A-B(222)。融合产物A-B(222)可通过外部引物(200)和(206)的过量进一步扩增。在一些实施方案中，从尾巴(203)和(205)形成的融合产物(222)的区域可包括一个或更多个引物结合位点用于后续分析，诸如高通量测序。
策略1的变化形式在图3A-3C中显示为策略1(a)。如以上，在同一反应混合物中进行的PCR中片段A(300)利用引物(304)和(306)扩增并且片段B’(302)利用引物(308)和(312)扩增。外部引物(304)和(312)如以上使用，且内部引物(308)具有尾巴(310)；然而，并非尾巴(310)与引物(306)上相应的尾巴互补，而是其与片段A末端上的区段，即引物(306)与之互补的相同的区段互补。PCR制备(315)片段A和B，此处B与B’(302)相同，添加有通过引物(308)的尾巴(310)生成的区段(316)。如以上，随着温度循环继续(特别地由于内部引物用尽)，片段A的上部片段退火(318)至片段B的下部片段并延伸以制备融合产物A-B(320)，其可使用引物(304)和(312)进一步扩增。
可与本发明一起使用的PCA的另一个实施方案(“策略2”)显示在图4A-4C。该实施方案与图2A-2C的实施方案相似，除了外部引物(404)和(414)分别具有允许融合产物用预定引物进一步扩增的尾巴(408)和(418)。如以下更充分的讨论的，该实施方案很适合用于多重的扩增。片段A’(400)用分别具有尾巴(408)和(410)的引物(404)和(406)扩增，以制备片段A，并且片段B’(402)用分别具有尾巴(416)和(418)的引物(412)和(414)扩增，以制备(420)片段B。选择内部引物(406和412)的尾巴(410和416)以彼此互补。片段A和B的末端通过由尾巴(408、410、416和418，分别地)生成的区段(422、424、426和428)增长。与前述实施方案一样，片段A的上部链退火(430)至片段B的下部链并延伸(432)以形成(434)融合产物A-B(436)，其可利用与引物(404和414)相同但不具有尾巴的引物(438和440)进一步扩增(437)。
如以上所述，图4A-4C的实施方案可用于多重PCA反应，其显示在图5A-5D中。在PCR中这些片段A’(501)、B’(502)、C’(503)、和D’(504)在共同的反应混合物中使用用于片段A’的(506和508)、用于片段B’的(514和516)、用于片段C’的(522和524)、和用于片段D’的(530和532)引物组扩增。所有的引物具有尾巴：外部引物(506、516、522和532)各具有尾巴(分别地512、520、526和536)，其不仅允许片段扩增还允许随后的融合产物扩增。尾巴(512)和(520)的序列可分别地与尾巴(526)和(536)的序列相同或不同。在一个实施方案中，尾巴(512、520、526和536)的序列是相同的。内部引物(518和510)的尾巴彼此互补(511)；同样的，内部引物(528和534)的尾巴彼此互补(513)。以上PCR生成片段A(541)、B(542)、C(543)和D(544)，其进一步退火(546)至彼此以形成复合物(548和550)，复合物(548和550)延伸以分别地形成融合产物A-B(552)和C-D(554)。
图5E和5F显示了以上实施方案的概括，其中多个不同的靶核酸(560)A1’、A2’、…AK’连接至相同的靶核酸X’(562)以形成(564)多种融合产物X-A1、X-A2、…X-AK(566)。当靶核酸X为淋巴细胞的重组序列的区段时，该实施方案特别地感兴趣，其可被用作针对其源自的淋巴细胞的标签。在一方面，X为克隆型，诸如B细胞或T细胞的V(D)J区域的区段。在一个实施方案中，多个靶核酸A1、A2、…AK融合入其起源细胞的克隆型。在另一个实施方案中，此类多个为2至1000之间；且在另一个实施方案中，其为2至100之间；且在另一个实施方案中，其为2至10之间。在这些实施方案的PCA反应中，内部引物(568)的浓度可大于各种Ai核酸的内部引物浓度以使得有足够数量的X扩增子与Ai扩增子的很多链退火。融合产物(566)从反应混合物中提取(例如通过常规的双链DNA纯化技术，诸如从Qiagen等可得的)并测序。可选择外部引物的序列以允许无需进一步处理直接用于集群形成，以用于测序系统诸如Genome Analyzer(Illumina,San Diego,CA)。在一方面，X可为克隆型(对于淋巴细胞)或包含序列标签并且A1、A2、…AK可为感兴趣的特定基因或转录物。测序融合产物后，每个细胞的基因表达水平可制成表和/或绘图，如在图1B中显示的。
除了在平行意义上的多重的PCA反应以同时生成多个二元融合产物之外，如图6A-6E所示，PCA反应可在串连意义上多重以组装多亚单位融合产物。如在图6A中所示，片段A’(601)、B’(602)和C’(603)用用于A’的(606和608)、用于B’的(610和612)和用于C’的(614和616)引物组在共同的PCR混合物中扩增。所有的引物具有尾巴：(i)选择外部引物(606和616)的尾巴(620和630)用于外部片段A’和C’的扩增及显示在图6E中的三段式融合产物A-B-C(662)的进一步扩增；(ii)内部引物(608和610)的尾巴(622和624)彼此互补；及(iii)内部引物(614和612)的尾巴(628和626)彼此互补。PCR生成(632)片段A(641)、B(642)和C(643)，其在反应中形成(644)分别包含片段LS1和LS2的复合体(646和648)，复合体(646和648)转而延伸以形成(650)融合产物A-B(652)和B-C(654)。这些融合产物变性并且一些通过共同的B片段(656)彼此交叉退火(658)以形成复合体，其延伸(660)以形成融合产物A-B-C(662)。
利用瓣状内切核酸酶反应制备融合产物
在一些实施方案中，包含序列标签和靶核酸的融合产物可如在图1I中所示利用瓣状内切核酸酶反应制备。形成有单细胞和单一同质序列标签的反应器后，调整条件(例如温度升高以激活释放标签的内切核酸酶)以使得在各反应器中制备分子(1102)。每个分子(1102)包含引物结合位点(1101)、序列标签(1103)(对反应器独特的)、和能够退火至寡核苷酸(1104)的区段(1105)，寡核苷酸(1104)的每一个包含对靶多核苷酸例如(1107)特异的部分(1109)。在本文寡核苷酸(1104)被称作“辅助寡核苷酸(helperoligonucleotides)”。随着分子(1102)从同质序列标签释放，包含分子(1102)、寡核苷酸(1104)和靶核酸(1107)的瓣状结构(1111)形成。选择条件以使得在瓣状内切核酸酶存在时瓣状结构(1111)被裂解，释放靶核酸(1107)的5’部分(1113)并留下可连接(1114)至瓣状结构(1111)的分子(1102)的3’末端的末端。连接(1114)后形成融合产物(1115)，其可通过在对引物结合位点(1101)特异的引物(1106)和对在靶核酸上选择的位点特异的引物(1108)的存在进行PCR来扩增(1116)。
图1I展示了用于在图1H中显示的实施方案的反应物。形成作为反应的一部分的所有微团共有的反应物包括(i)对含有序列标签的分子(1122)(在图1H中也被称作1102)的引物结合位点(1101)特异的引物(1117)；(ii)从同质序列标签释放的分子(1122)，且其包含对反应器独特的序列标签(1103)；(iii)寡核苷酸(1118)(在图1I中的o1、o2、…ok且在图1H中还总称作1104，或被称作辅助寡核苷酸)，其每一个包含对靶核酸特异的5’部分(1109)和对分子(1122)的部分(1105)特异的3’部分以对各个不同的靶核酸形成瓣状结构(1111)；及(iv)靶核酸特异的引物(1119)(在图1I中的p1、p2、…pk且在图1H中还总称作(1108))。
用于进行以上反应的瓣状内切核酸酶在通过引用并入本文的以下参考文献中公开：美国专利6,255,081；Matsui等人J.Biol.Chem.,274(26):18297-18309(1999)；Olivier,Mutation Research,573:103-110(2005)；Fors等人Pharmacogenomics,9(1):37-47(1999)等。
在一方面，以上实施方案可使用以下步骤执行：(a)提供许多反应器，每一个在扩增混合物中包含群体的单细胞、第一同质序列标签和第二同质序列标签，扩增混合物含有用于扩增许多中的每个靶核酸的引物对；(b)在辅助寡核苷酸的存在下提供来自同质序列标签的可扩增的序列标签以使得在靶核酸的链的5’末端形成瓣状结构，其中各瓣状结构的辅助寡核苷酸包含与靶核酸的一条链互补的5’部分和与可扩增的序列标签或其产物互补的3’部分；(c)用瓣状内切核酸酶裂解瓣状结构以提供靶核酸的链上的与可扩增的序列标签可连接的5’末端；(d)将可扩增的序列标签连接至各瓣状结构的靶核酸的链的可连接的5’末端；(e)扩增各靶核酸的链和可扩增的序列标签以形成包含序列标签的扩增子；及(f)对来自反应器的扩增子测序以通过掺入扩增子的序列标签来鉴定来自群体的各细胞的靶核酸。
随机基因组区段作为同质序列标签
在一些实施方案中，同质序列标签包含要被鉴定的细胞的基因组DNA的随机区段或要被鉴定的细胞的转录组的随机区段。在一些实施方案中，“转录组”意思是存在于细胞中的转录物的总集；在一些实施方案中，“转录组”意思是存在于细胞的细胞质中的转录物的总集。在一些实施方案中，RNA转录组通过由逆转录酶逆转录转录组的步骤转化成DNA。还有实施方案中，此类随机区段通过由具有不连续回文识别序列的限制性内切核酸酶的亚组消化细胞DNA生成。这一亚组的酶在本文被称作“位点切除”限制性内切核酸酶，且其以以下特性为特征：(i)不连续的回文识别序列；(ii)两个切除位点，其一个在识别序列的上游且其另一个在识别序列的下游；及(iii)确定长度的切除序列的产生，所述切除序列包含识别位点。示例的位点切除限制性内切核酸酶如下：
名称              识别序列*
AlfI (10/12)GCANNNNNNTGC(12/10)
BdaI (10/12)TGANNNNNNTCA(12/10)
BplI (8/13)GAGNNNNNCTC(13/8)
FalI (8/13)AAGNNNNNCTT(13/8)
*依照New England Biolab的命名约定。
双链DNA(dsDNA)环(702)具有识别识别位点(706)的限制性内切核酸酶活性和连接酶活性以使得在分子的环状状态(702)和线性状态(714)之间存在平衡(700)(图7)。每当dsDNA环(702)如此以单拷贝提供时，其二选一的以环状形式(702)和以线性形式(714)存在。内切核酸酶活性(710)裂解dsDNA环(702)以生成线性dsDNA分子(714)并且连接活性(712)催化末端(713)和(715)之间的磷酸二酯键重新形成。根据本发明的此实施方案，反应混合物中的dsDNA环(702)以一定浓度提供给反应器(诸如，乳液中的微团)以使得一部分反应器的每个反应器包含仅1个dsDNA环(702)。dsDNA环(702)包含引物结合位点(704)和(705)和任选地第二限制性内切核酸酶识别位点(706)，其例如可被热稳定的内切核酸酶识别以使结构线性化(718)用于后续扩增。在相同的反应器中，细胞DNA(725)用位点切除限制性内切核酸酶(726)消化以制备不同长度的链(未显示)和切除产物(727)。孵育后，形成包含来自环(702)的DNA和将充当序列标签的随机片段(728)的环状DNA产物(718)。dsDNA环经由限制性位点(708)的消化(730)后，产生的线性结构可通过如以上所述的PCA反应的方式与感兴趣的靶多核苷酸缀合，例如使用对引物结合位点(704)和(705)特异的通用引物(732)和(734)。
每个反应器多个序列标签
在一些实施方案中，在包含单细胞的反应器中可使用多于一个序列标签。例如，在一些实施方案中，可选择反应器或微团，其每个包含释放附加至双链靶核酸的一条链的序列标签的第一同质序列标签和释放附加至双链靶核酸的另一条链的序列标签的第二同质序列标签。此类实施方案如以上所述可基于PCR或瓣状内切核酸酶反应。例如，图1J显示了使用瓣状内切核酸酶反应的两序列标签实施方案。生成包含一部分微团(例如1231)具有第一同质序列标签和单细胞，一部分微团(例如1233)具有第二同质序列标签和单细胞，及一部分微团(例如1235)具有第一和第二同质序列标签和单细胞的乳液(1230)。以下显示针对包含第一和第二同质序列标签的微团(1235)的1种靶核酸(1218)的瓣状内切核酸酶反应(1232)。选择条件以使得靶核酸(1218)变性为链Si(1220)和其互补链Si’(1221)，其后两条链结合其各自的反应组成部分以形成第一瓣状结构(1224)和第二瓣状结构(1226)。在瓣状内切核酸酶和连接酶的存在下，独特序列标签(1225)附加至链Si(1220)并且不同的独特序列标签(1227)附加至其互补链Si’(1221)。产生的融合产物可在PCR中进一步扩增(1240)。
单细胞分析
如以上所述，在本发明的一方面，来自群体的细胞被置于各自包含单细胞的反应器中。这可通过本领域已知的多种大规模单细胞反应器平台完成，例如Clarke等人美国专利公布2010/0255471；Mathies等人美国专利公布2010/0285975；Edd等人美国专利公布2010/0021984；Colston等人美国专利公布2010/0173394；Love等人国际专利公布WO2009/145925；Muraguchi等人美国专利公布2009/0181859；Novak等人Angew.Chem.Int.Ed.,50:390-395(2011)；Chen等人Biomed Microdevices,11:1223-1231(2009)等，其通过引用并入本文。在一方面，细胞被置入微孔阵列的孔，反应诸如PCA反应于此处进行；在另一方面，细胞被置入油包水乳液的微团中，于此处微团充当反应器。通过微流体装置例如Mathies等人(在以上引用)或Edd等人(在以上引用)生成的微团反应器为特别感兴趣的，因为大小一致的微团可以以与团块乳化方法相比较低的对细胞的剪切力和压力生成。在以下参考文献中发现在微团中乳化，包括进行扩增反应诸如PCR的组成成分和技术，其通过引用并入：Becher,“Emulsions:Theory andPractice,”(Oxford University Press,2001)；Griffiths和Tawfik,美国专利6,489,103；Tawfik和Griffiths,Nature Biotechnology,16:652-656(1998)；Nakano等人J.Biotechnology,102:117-124(2003)；Dressman等人Proc.Natl.Acad.Sci.,100:8817-8822(2003)；Dressman等人，美国专利8,048,627；Berka等人，美国专利7,842,457和8,012,690；Diehl等人,Nature Methods,3:551-559(2006)；Williams等人,Nature Methods,3:545-550(2006)；Zeng等人,Analytical Chemistry,82(8):3183-3190(2010)；Micellula DNAEmulsion&Purification Kit instructions(EURx,Gdansk,Poland,2011)等。在一个实施方案中，同质序列标签(例如珠)的混合物和反应混合物逐滴地加入生物相容性油(例如轻矿物油，Sigma)的旋转的混合物并允许乳化。在另一个实施方案中，同质序列标签和反应混合物逐滴地加入到生物相容性油的横向流(cross-flow)。所用的油可以补充有一种或更多种生物相容性乳液稳定剂。这些乳液稳定剂可包括Atlox 4912、Span 80、和其他的公认的和市场上可买到的合适的稳定剂。在一些实施方案中，乳液为热稳定的以允许热循环，例如至至少94℃、至少95℃、或至少96℃。优选地，形成的液滴的大小在从约5微米至约500微米、更优选地从约10微米至约350微米、更加优选地从约50至250微米、及最优选地从约100微米至约200微米之间变化。有利地，横向流流体混合允许液滴形成和液滴大小一致性的控制。
在一些实施方案中，微团制备成具有一致的体积分布以使得此类反应器中的可得的反应物生成相似扩增的靶核酸和序列标签。即，差异巨大的反应器体积例如微团体积可导致扩增失败和/或差异巨大的扩增程度。此种失败和差异会妨碍进行群体的个体细胞中的靶核酸的定量比较例如基因表达的差异，或增加其难度。在一方面，制备具有有30％或更小的变异系数(CV)的体积分布的微团。在一些实施方案中，微团具有有20％或更小的CV的体积分布。
在置入反应器中之前，可将样品的细胞和同质序列标签悬浮于反应混合物中。在一方面，反应混合物为PCA反应混合物且与具有至少一对内部(或连接)引物和至少一对外部引物的PCR反应混合物基本上相同。反应混合物可包括一种或更多种任选组分，包括但不限于耐热性的限制性内切核酸酶以从同质序列标签释放加序列标签的引物；一种或更多种蛋白酶抑制剂；裂解剂以促进分离细胞靶核酸的释放，例如Brown等人,Interface,5:S131-S138(2008)；等。在一些实施方案中，裂解细胞的步骤可通过在进行扩增反应之前在非离子型洗涤剂例如0.1％Tween X-100的存在下加热细胞至95℃或更高的温度并持续一段时间来完成。在一些实施方案中，提高温度的此类一段时间可以是从10至20分钟。或者裂解细胞的步骤可通过在非离子型洗涤剂例如0.1％Tween X-100的存在下，一个或更多个加热和冷却的循环例如96℃持续15min接着10℃持续10min来完成。
在一些实施方案中，微团反应器在微流体装置中生成并分选，诸如在图1K中显示的，其很多特征在通过引用并入的Chen等人(在以上引用)中公开。以一定浓度提供包含细胞(1302)和同质序列标签(1304)的水性反应混合物(1306)于储液池(1300)中，以保证在选择的操作条件下形成包含单细胞和单一同质序列标签的微团。反应混合物(1306)流经通道(1305)进入接合点(1307)，此处其与来自通道(1308)和(1309)的油流汇合。调整三股流体的流速和压力以使得水性微团在接合点(1307)处形成，并且由来自通道(1308)和(1309)的混合油流运输经过通道(1311)并最终通过询问区域(1312)，在此处各微团的存在、不存在或一种或更多种预定的特征被确定。预定的特征可包括微团中细胞或颗粒的存在或不存在及微团中一种或更多种同质序列标签的存在或不存在。在一些实施方案中，此类特征的检测可利用特异地结合至同质序列标签和/或至细胞的不同的荧光探针来进行。例如，可用一种或更多种具有第一发射特性的荧光标记的抗体标记细胞并用一种或更多种具有第二发射特性的荧光标记的寡核苷酸探针标记同质序列标签。关联询问区域(1312)的检测器操作地关联效应区域(1313)，此处当微团到达效应区域(1313)时基于在询问区域(1312)检测到的信号对微团施加作用力。引导微团选择性的流经不同通道的作用力可以是声学的、光学的等。在一个实施方案中，依照在Chen等人(在以上引用)中所教导的施加声学的力(1314)以引导包含单细胞和单一同质序列标签两者的微团(1320)进入通道3(1342)，只包含一个或更多个细胞的微团(1316)进入通道1(1344)，及剩余的微团(1318)进入通道2(1346)。
无疑很多其他的微流体装置构造可被使用来生成包含单细胞和预定数目的同质序列标签例如一种同质序列标签、二种同质序列标签的微团，或通过电穿孔等选择性的合并微团来选择性的向微团添加反应物，例如Zagoni等人，第2章,Methods of Cell Biology,102:25-48(2011)；Brouzes，第10章，Methods of Cell Biology,102:105-139(2011)；Wiklund等人，第14章，Methods of Cell Biology,102:177-196(2011)；Le Gac等人，第7章，Methods of Molecular Biology,853:65-82(2012)等。
核酸测序技术
任何用于测序核酸的高通量技术可用于本发明的方法。DNA测序技术包括利用标记的终止剂或引物及在平板或毛细管中凝胶分离的双脱氧测序反应(Sanger法)；利用可逆地终止的标记的核苷酸的合成测序；焦磷酸测序；454测序；利用等位基因特异的与标记的克隆的文库杂交随后连接的合成测序；聚合步骤期间标记的核苷酸掺入的实时监控；聚合酶克隆测序(polony sequencing)、SOLiD测序等。如此这些测序方法可用来测序感兴趣的靶核酸的融合产物及基于T-细胞受体(TCR)和/或B-细胞受体(BCR)的克隆型。在本发明的一方面，使用的测序的高通量方法包括在固体表面上空间地分离个体分子，在其上平行地对分子测序的步骤。此类固体表面可包括无孔表面(诸如在Solexa测序中，例如Bentley等人，Nature,456:53-59(2008)或在全基因组测序中，例如Drmanac等人，Science,327:78-81(2010))；孔阵列，其可包含结合于珠或颗粒的模板(诸如用454，例如Margulies等人，Nature,437:376-380(2005)或用Ion Torrent测序，美国专利公布2010/0137143或2010/0304982)、微型机械膜(诸如用SMRT测序例如Eid等人，Science,323:133-138(2009))、或珠阵列(如用SOLiD测序或用聚合酶克隆测序，例如Kim等人，Science,316:1481-1414(2007))。在另一方面，此类方法包括在其在固体表面上被空间地分离之前或在之后扩增被分离的分子。之前扩增可包括基于乳液的扩增，诸如乳液PCR、或滚环扩增。特别感兴趣的是基于Solexa的测序，其中个体的模板分子在固体表面上在空间上被分离，之后其通过桥式PCR被平行地扩增以形成各自的无性系群体或群集，并然后测序，依照在Bentley等人(在以上引用)和在生产商说明书(例如TruSeqTM Sample Preparation Kit and Data Sheet,Illumina,Inc.,San Diego,CA,2010)中；并还在以下通过引用并入的参考文献：美国专利6,090,592、6,300,070、7,115,400、和EP0972081B1中所描述。在一个实施方案中，个体分子置于固体表面并在其上扩增形成群集，以至少105个群集每cm2的密度、或以至少5×105每cm2的密度、或以至少106个群集每cm2的密度。在一个实施方案中，使用的测序化学反应具有相对高的出错率。在此类的实施方案中，通过此类化学法产生的平均质量评分是序列读取长度的单调下降函数。在一个实施方案中，此类的下降相当于序列读取的0.5％在位置1-75中具有至少1个错误；序列读取的百分1在位置76-100中具有至少1个错误；及序列读取的2％在位置101-125中具有至少1个错误。
在一些实施方案中，多重PCR用于扩增核酸混合物的成员，特别地包括重组免疫分子诸如T细胞受体、B细胞受体、或其部分的混合物。用于进行此类免疫分子的多重PCR的指导在以下参考文献中找到，其通过引用并入：Morley，美国专利5,296,351；Gorski，美国专利5,837,447；Dau，美国专利6,087,096；Von Dongen等人，美国专利公布2006/0234234；欧洲专利公布EP 1544308B1；Faham等人，美国专利公布2010/0151471；Han，美国专利公布2010/0021896；Robins等人，美国专利公布2010/033057等。此类扩增技术容易被本领域普通技术人员改进以提供本发明的外部引物和连接引物。
虽然本发明通过参考几个特定的实例实施方案描述，本领域技术人员能认识到，可对其进行很多改变而不偏离本发明的思想和范围。除以上讨论的那些之外，本发明可适用于多种传感器装置和其他主题。
定义
除非本文另有特别地定义，本文使用的核酸化学、生物化学、遗传学、和分子生物学的术语和符号遵循本领域标准论文和教科书的那些，例如Kornberg和Baker,DNA Replication，第二版(W.H.Freeman,New York,1992)；Lehninger,Biochemistry，第二版(Worth Publishers,New York,1975)；Strachan和Read,Human Molecular Genetics，第二版(Wiley-Liss,New York,1999)；Abbas等人，Cellular and Molecular Immunology，第六版(Saunders,2007)。
“扩增子”意思是多核苷酸扩增反应的产物，即多核苷酸的无性系群体，其可以是单链的或双链的多核苷酸，其是从一条或更多条起始序列复制而来。一条或更多条起始序列可以是同一序列的一个或更多个拷贝，或其可以是不同序列的混合物。在一些实施方案中，扩增子通过单起始序列的扩增形成。扩增子可通过其产物包含一种或更多种起始或靶核酸的复制链的多种扩增反应制备。在一方面，产生扩增子的扩增反应为“模板驱动的”，其中是核苷酸或寡核苷酸的反应物的碱基配对在模板多核苷酸中具有互补物，其为反应产物的生成所需。在一方面，模板驱动的反应为使用核酸聚合酶的引物延伸或使用核酸连接酶的寡核苷酸连接。此类反应包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)、线性聚合酶反应、基于核酸序列的扩增(NASBA)、滚环扩增等，在以下通过引用并入本文的参考文献中公开：Mullis等人，美国专利4,683,195、4,965,188、4,683,202、4,800,159(PCR)；Gelfand等人，美国专利5,210,015(用“taqman”探针的实时PCR)；Wittwer等人，美国专利6,174,670；Kacian等人，美国专利5,399,491(“NASBA”)；Lizardi，美国专利5,854,033；Aono等人，日本专利公布JP 4-262799(滚环扩增)；等。在一方面，本发明的扩增子通过PCR产生。扩增反应可以是“实时”扩增，如果检测化学可用使得允许随着扩增反应过程测量反应产物，例如以下描述的“实时PCR”或在Leone等人，Nucleic Acids Research,26:2150-2155(1998)和相似参考文献中描述的“实时NASBA”。如本文所用，术语“扩增(amplifying)”意思是进行扩增反应。“反应混合物”或“扩增混合物”意思是包含用于进行反应的所有所需反应物的溶液，其可包括但不限于缓冲剂以使在反应期间保持pH在选择的水平、盐、辅助因子、清除剂等。
“试剂盒(kit)”指用于递送用于执行本发明的方法的材料或反应物的任何的递送系统。在本发明的方法的背景下，此类递送系统包括允许反应物(例如在适当容器中的引物、酶、内部标准等)和/或支持材料(例如，缓冲液、用于进行检验的书面说明书等)从一个地点到另一个地点的贮藏、运输、或递送的系统。例如，试剂盒包括包含相关反应物和/或支持材料的一个或更多个的外壳(enclosures)(例如盒)。此类内容物可一起或各自地被递送至预期的接收者。例如，第一个容器可包含用于在检验中使用的酶，而第二个容器包含引物。
“连接(ligation)”意思是在模板驱动的反应中，在两个或更多个核酸例如寡核苷酸和/或多核苷酸的末端之间形成共价键或键合(linkage)。键或键合的性质可很广泛变化并且连接可酶促地或用化学法进行。如本文所用，连接通常酶促地进行以在一个寡核苷酸的末端核苷酸的5’碳和另一个寡核苷酸的3’碳之间形成磷酸二酯键。多种模板驱动的连接反应在以下参考文献中被描述，其通过引用并入：Whitely等人，美国专利号4.883,750；Letsinger等人，美国专利号5,476,930；Fung等人，美国专利号5,593,826；Kool，美国专利号5,426,180；Landegren等人，美国专利号5,871,921；Xu和Kool,Nucleic Acids Research,27:875-881(1999)；Higgins等人，Methodsin Enzymology,68:50-71(1979)；Engler等人，The Enzymes.15:3-29(1982)；及Namsaraev，美国专利公布2004/0110213。
“微流体装置”意思是一个或更多个室、端口、和通道互相连接并流体连通的集成系统并且被设计用来进行分析反应或过程，单独地或与提供支持功能诸如样品导入、流体和/或反应物驱动方式、温度控制、检测系统、数据收集和/或整合系统等的设备或仪器合作。微流体装置还可包括阀、泵、和内壁上专门功能的涂料，例如为防止样品成分或反应物的吸附，通过电渗促进反应物移动等。此类装置通常组装于固体基质中或为固体基质，其可以是玻璃、塑料、或其他固体聚合材料，并且通常具有平面的形式以便检测和监测样品和反应物的移动，尤其地通过光学的或电化学的方法。微流体装置的特征通常具有少于数百平方微米的横截面尺寸并且通道通常具有毛细的尺寸，例如具有从约500μm至约0.1μm的最大横截面尺寸。微流体装置通常具有在从1μL至几nL例如10-100nL范围的体积容量。微流体装置的制造和操作在本领域被熟知，如通过以下通过引用并入的参考文献所例证：Ramsey，美国专利6,001,229、5,858,195、6,010,607、和6,033,546；Soane等人，美国专利5,126,022和6,054,034；Nelson等人，美国专利6,613,525；Maher等人，美国专利6,399,952；Ricco等人，国际专利公布WO 02/24322；Bjornson等人，国际专利公布WO 99/19717；Wilding等人，美国专利5,587,128、5,498,392；Sia等人，Electrophoresis,24:3563-3576(2003)；Unger等人，Science,288:113-116(2000)；Enzelberger等人，美国专利6,960,437。
“聚合酶链式反应”或“PCR”指用于通过DNA的互补链的同时引物延伸，特定DNA序列体外扩增的反应。换句话说，PCR是用于制备两侧是引物结合位点的靶核酸的多拷贝或复制链的反应，此类反应包括以下步骤的一个或更多个重复：(i)靶核酸变性；(ii)引物退火至引物结合位点；及(iii)在核苷三磷酸的存在下通过核酸聚合酶延伸引物。通常，反应通过对热循环装置中每个步骤最佳化的不同温度循环。特定的温度、在每个步骤持续的时间、和在步骤之间的变化速度取决于很多因素，这些因素为本领域普通技术人员所熟知，例如通过以下参考文献所例证的：Innis等人，编辑，PCR Protocols(Academic Press,1990)；McPherson等人，编辑，PCR:A Practical Approach和PCR2:A Practical Approach(IRL Press,Oxford，分别地1991和1995)。例如，在利用Taq DNA聚合酶的常规PCR中，双链的靶核酸可在温度>90℃下变性，引物在50-75℃范围的温度下退火，并且引物在72-78℃范围的温度下延伸。用于PCR的通常的扩增混合物包括在0.1和0.5μM之间的浓度的至少一种正向引物和至少一种反向引物；在100-300μM之间的浓度的dNTP；DNA聚合酶及盐(例如10-50mM KCl或NaCl、和1-6mM MgCl2)；和缓冲剂(例如pH 8.3-8.8的10-50mMTris-HCl)。反应体积范围从数百纳升例如200nL至数百μL例如200μL。术语“PCR”包括反应的派生形式，包括但不限于RT-PCR、实时PCR、巢式PCR、定量PCR、多重PCR等。使用的PCR的特别形式可由本领域技术人员从申请的上下文中辨别。“逆转录PCR”或“RT-PCR”指之前先进行将靶RNA转化成互补的单链DNA的逆转录反应的PCR，互补的单链DNA然后被扩增，例如Tecott等人，美国专利5,168,038，该专利通过引用被并入本文。“实时PCR”意思是其反应产物即扩增子的量随着反应进行被监测的PCR。有很多形式的实时PCR，其区别主要在于用于监测反应产物的检测化学反应，例如Gelfand等人，美国专利5,210,015(“taqman”)；Wittwer等人，美国专利6,174,670和6,569,627(嵌入染料)；Tyagi等人，美国专利5,925,517(分子信标)；这些专利通过引用并入本文。用于实时PCR的检测化学反应在Mackay等人，Nucleic Acids Research,30:1292-1305(2002)中综述，也通过引用并入本文。“巢式PCR”指两阶段PCR，其中第一PCR的扩增子成为用于使用新的引物对的第二PCR的样品，新引物对的至少之一结合至第一扩增子的内部位置。如本文所用，提及巢式扩增反应的“初始引物”意思是用于生成第一扩增子的引物，并且“第二引物”意思是用于生成第二或巢式扩增子的一条或更多条引物。“多重PCR”意思是其中多个靶序列(或单靶序列和一种或更多种参考序列)在同一反应混合物中同时进行的PCR，例如Bernard等人，Anal.Biochem.,273:221-228(1999)(双色实时PCR)。通常，对扩增的每个序列使用不同的引物对。通常地多重PCR中靶序列的数目在从2至50、或从2至40、或从2至30的范围。“定量PCR”意思是被设计以测量样品或样本(sample or specimen)中一种或更多种特定靶序列丰度的PCR。定量PCR不仅包括此类靶序列的绝对定量还包括相对定量。使用一种或更多种参考序列或内部标准进行定量测量，其可分别或与靶序列一起测试。参考序列可以是样品或样本内源的或外源的，并且在后一种情况下，可包括一种或更多种竞争性模板。通常内源的参考序列包括以下基因的转录物的区段：β-肌动蛋白、GAPDH、β2-微球蛋白、核糖体RNA等。用于定量PCR的技术为本领域普通技术人员所熟知，如在通过引用并入的以下参考文献中所例证：Freeman等人，Biotechniques,26:112-126(1999)；Becker-Andre等人，Nucleic AcidsResearch,17:9437-9447(1989)；Zimmerman等人，Biotechniques,21:268-279(1996)；Diviacco等人，Gene,122:3013-3020(1992)；Becker-Andre等人，Nucleic Acids Research,17:9437-9446(1989)；等。
“引物”意思是天然的或合成的寡核苷酸，与多核苷酸模板形成双链体后，能够充当核酸合成的起始点并从其3’端沿着模板延伸以使延伸的双链体形成。引物的延伸通常用核酸聚合酶诸如DNA或RNA聚合酶进行。在延伸过程中添加的核苷酸的序列由模板多核苷酸的序列决定。通常引物由DNA聚合酶延伸。引物通常具有在从14至40个核苷酸范围的长度，或在从18至36个核苷酸范围的长度。引物在多种核酸扩增反应中使用，例如，使用单引物的线性扩增反应，或使用两条或更多条引物的聚合酶链式反应。选择用于特定应用的引物的长度和序列的指导为本领域普通技术人员所熟知，如由通过引用并入的以下参考文献所证实的：Dieffenbach,editor,PCR Primer:A Laboratory Manual,第二版(Cold Spring Harbor Press,New York,2003)。
“序列读取”意思是通过测序技术生成由序列或数据流确定的核苷酸序列，这种确定例如通过与该技术关联的base-calling软件例如来自DNA测序平台供应商的base-calling软件的方法进行。序列读取通常包括对序列中各核苷酸的质量得分。通常，序列读取通过例如用DNA聚合酶或DNA连接酶沿着模板核酸延伸引物来进行。数据通过记录与此类延伸有关的信号诸如光学的、化学的(例如pH变化)、或电信号生成。此类原始信号被转化成序列读取。
“序列标签”(或“标签”)或“条形码(barcode)”意思是附加于多核苷酸或模板分子的寡核苷酸且被用来鉴定和/或追踪反应或一系列反应中的多核苷酸或模板。序列标签可附加于多核苷酸或模板的3’-或5’-端或其可插入至此类多核苷酸或模板的内部以形成线性缀合物，本文中有时被称作“加标签的多核苷酸”或“加标签的模板”或“标签-多核苷酸缀合物”、“标签-分子缀合物”等。序列标签可在大小和组成上差异很大，通过引用并入本文的以下参考文献提供了选择适用于特别的实施方案的序列标签组的指导：Brenner，美国专利5,635,400；Brenner和Macevicz，美国专利7,537,897；Brenner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,97:1665-1670(2000)；Church等人，欧洲专利公布0303459；Shoemaker等人，Nature Genetics,14:450-456(1996)；Morris等人，欧洲专利公布0799897A1；Wallace，美国专利5,981,179；等。序列标签的长度和组成可区别很大，并且特定长度和/或组成的选择取决于若干因素，包括但不限于：标签是如何用来生成读数的，例如通过杂交反应或通过酶促反应诸如测序；标签是否被标记，例如用荧光染料等；要清楚的鉴定一组多核苷酸等需要的可区别的寡核苷酸标签的数目，及为了确保可靠的鉴定例如避免交叉杂交或源于测序错误的错误鉴定，一组标签必须得如何不同。在一方面，序列标签可以每个具有在分别地从2至36个核苷酸、或从4至30个核苷酸、或从8至20个核苷酸、或从6至10个核苷酸范围的长度。在一方面，使用序列标签组，其中一组的每个序列标签具有以至少两个碱基区别于同一组的每一个其他标签的独特的核苷酸序列；在另一方面，使用序列标签组，其中一组的每个标签的序列以至少三个碱基区别于同一组的每个其他标签。

Claims (28)

1.一种分析群体的单细胞的多个靶核酸的方法，该方法包括以下步骤：
提供多个反应器，所述多个反应器各自含有在扩增混合物中的所述群体的单细胞和单一同质序列标签，所述扩增混合物包含用于扩增所述多个中的每个靶核酸的引物对；
从所述同质序列标签提供可扩增的序列标签；
扩增所述靶核酸和所述可扩增的序列标签以形成包含序列标签的扩增子；及
对来自所述反应器的所述扩增子测序以通过掺入所述扩增子的所述序列标签鉴定来自所述群体的每个细胞的所述靶核酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述扩增步骤通过聚合酶链式反应进行。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述提供所述可扩增的序列标签的步骤包括从所述同质序列标签释放所述可扩增的序列标签。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述释放所述可扩增的序列标签的步骤通过由耐热性的限制性内切核酸酶从所述同质序列标签裂解所述可扩增的序列标签进行。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述可扩增的序列标签的每一个为加序列标签的引物。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述可扩增的序列标签的每一个为两侧为引物结合位点的序列标签，且其中所述扩增混合物还包括能在PCR中扩增所述可扩增的序列标签的引物对。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述提供所述可扩增的序列标签的步骤包括通过EXPAR生成所述可扩增的序列标签。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述同质序列标签为包含多个所述加序列标签的引物的滚环扩增子。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述同质序列标签为具有多个加序列标签的引物附着于其的珠。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述反应器为乳液的微团。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述微团在微流体装置中生成。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述微团具有有30％或更小的变异系数的体积分布。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述单细胞的所述群体来自同一样品。
14.根据权利要求1所述的方法，还包括在所述扩增步骤之前在各所述反应器中裂解所述单细胞的步骤。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述同质序列标签包含随机基因组区段。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述同质序列标签包含随机转录组区段。
17.一种分析群体的各细胞的多个靶核酸的方法，所述方法包括以下步骤：
提供多个反应器，所述多个反应器各自包含在聚合酶循环组装(PCA)反应混合物中的单细胞和单一同质序列标签，所述同质序列标签包含至少一条加序列标签的引物，且所述PCA反应混合物包含对所述多个靶核酸特异的外部引物对和一对或更多对连接引物，其中所述外部引物或所述连接引物的至少之一为所述同质序列标签的加序列标签的引物；
在所述反应器中进行PCA反应以使得同质序列标签释放或产生加序列标签的引物并且使得所述靶核酸和所述加序列标签的引物的融合产物在所述反应器中生成；及
对来自所述反应器的所述融合产物测序以鉴定所述群体中各细胞的所述靶核酸。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述多个反应器为油包水乳液的水性微团。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述油包水乳液通过微流体装置生成。
20.根据权利要求17所述的方法，其中所述靶核酸为转录组的转录物。
21.根据权利要求17所述的方法，其中所述同质序列标签为具有多个加序列标签的引物附着于其的珠。
22.根据权利要求17所述的方法，还包括在所述扩增步骤之前在各所述反应器中裂解所述单细胞的步骤。
23.一种分析群体的单细胞的多个靶核酸的方法，所述方法包括以下步骤：
提供多个反应器，所述多个反应器各自包含在扩增混合物中的所述群体的单细胞、第一同质序列标签和第二同质序列标签，所述扩增混合物包含用于扩增所述多个中的每个靶核酸的引物对；
在辅助寡核苷酸的存在下从所述同质序列标签提供可扩增的序列标签以使得在所述靶核酸的链的5’末端形成瓣状结构；
用瓣状内切核酸酶裂解所述瓣状结构以在所述靶核酸的链上提供可连接至可扩增的序列标签的5’末端；
将所述可扩增的序列标签连接至所述靶核酸的链的可连接的5’末端；
扩增所述各靶核酸的链和所述可扩增的序列标签以生成包含序列标签的扩增子；及
对来自所述反应器的所述扩增子测序以通过掺入所述扩增子的所述序列标签来鉴定来自所述群体的各细胞的所述靶核酸。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述多个反应器为油包水乳液的水性微团。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述油包水乳液通过微流体装置生成。
26.根据权利要求23所述的方法，其中所述靶核酸为转录组的转录物。
27.根据权利要求23所述的方法，其中所述同质序列标签为具有多个加序列标签的引物附着于其的珠。
28.根据权利要求23所述的方法，还包括在扩增步骤之前在各所述反应器中裂解所述单细胞的步骤。
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