CN113423841A - 细胞和生物分子上的直接寡核苷酸合成 - Google Patents

细胞和生物分子上的直接寡核苷酸合成 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于在生物分子或活细胞或固定的细胞上直接合成寡核苷酸的方法。在一些实施方案中，无模板酶促合成以以下连续循环在生物条件下实现：(i)酶促添加3’‑O‑封闭的核苷三磷酸和(ii)使掺入的核苷酸酶促去封闭以再生游离的3’羟基。本发明在单细胞cDNA文库构建和分析中具有应用。

Description

细胞和生物分子上的直接寡核苷酸合成
在生物和医学科学中，存在许多可以通过使用核酸标签或条形码来促进生物分子或细胞的大规模分析的实例，例如，Brenner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,97:1665-1670(2000)；Brenner等人，美国专利7537897；Brenner等人，美国专利8476018；McCloskey等人，美国专利公布2007/0020640；Kinde等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,108:9530-9535(2011)；Fu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,108:9026-9031(2011)；Nolan，美国专利公布2016/0251697；Zheng等人，Nature Comm.,8:14049(2017)。
通常，这样的寡核苷酸标记物通过以下附接：(1)通过“取样标记(labeling bysampling)”(也称为“随机标记”)，其中一大组寡核苷酸标记物被预合成并且用于与靶生物体或生物分子的小得多的群体形成缀合物以给出具有独特的标记物的生物体或生物分子的缀合物群体，例如，Brenner等人，美国专利7,537,897；或Fu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(以上引用的)；或者(2)通过多于一个预合成的寡核苷酸亚单位(subunit)的“拆分和混合(split and mix”)”杂交以给出全部具有实质上独特的(substantially unique)标记物的生物体或生物分子群体，例如，Nolan(以上引用的)；或Seelig等人，美国专利公布2016/0138086。这些过程中使用了预合成的标签或标签亚单位，因为寡核苷酸合成一直以化学方法，诸如亚磷酰胺化学为主，这需要与生物体(biological organisms)和生物分子不相容的苛刻的非水性条件。
如果能够在生物体或生物分子上直接寡核苷酸合成，为这样的生物体或生物分子提供寡核苷酸标记物，诸如独特且耐用的条形码或标签用于跟踪和分选，这将是高度期望的。这样的标记，特别地当与下一代测序技术偶联时，将是用于对许多生物过程进行大规模的基于细胞的分析的有价值的工具。
发明概述
本发明涉及用于在生物分子和生物细胞上直接合成寡核苷酸的方法，所述方法包括将这样的方法应用于单细胞分析，诸如单细胞转录物组分析。
在一些实施方案中，本发明涉及在生物细胞或生物分子上合成寡核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供含有具有游离3’-羟基的起始子的生物细胞或生物分子；(b)重复以下步骤的多于一个循环：(i)在延长条件下，使具有游离3’-O-羟基的起始子或延长的片段与3’-O-封闭的核苷三磷酸和不依赖模板的DNA聚合酶接触，使得起始子或延长的片段通过掺入3’-O-封闭的核苷三磷酸延长以形成3’-O-封闭的延长的片段，和(ii)使延长的片段去封闭以形成具有游离3’-羟基的延长的片段，从而在生物细胞或生物分子上合成预定序列的寡核苷酸。在一些实施方案中，这样的步骤在维持生物细胞，特别是哺乳动物细胞处于存活状态的条件下进行。在一些实施方案中，去封闭步骤在维持生物细胞，特别是哺乳动物细胞处于存活状态的条件下酶促进行。
在一些实施方案中，本发明涉及生成具有细胞特异性寡核苷酸条形码的细胞特异性cDNA文库的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在细胞群体中每个细胞的细胞表面膜上合成独特的寡核苷酸条形码，以形成条形码编码的细胞的群体；(b)将每个条形码编码的细胞分离到反应器中；(c)裂解每个反应器中的条形码编码的细胞；(4)在每个反应器中进行逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)，以产生具有细胞特异性寡核苷酸条形码的cDNA文库。在一些实施方案中，合成步骤通过本发明的无模板酶促合成方法进行。在一些实施方案中，RT-PCR反应包括通过聚合酶循环扩增反应将条形码附接至cDNA。
在一些实施方案中，本发明涉及生成各自具有细胞特异性寡核苷酸条形码的细胞特异性cDNA文库的方法，所述方法包括以下步骤：(a)通过将mRNA与附接至珠的捕获寡核苷酸杂交来捕获单细胞的mRNA，其中捕获寡核苷酸与mRNA的区段互补，并且其中捕获寡核苷酸通过5’-末端附接至珠并且具有游离3’-羟基；(b)将捕获寡核苷酸的3’末端使用捕获的mRNA作为模板用逆转录酶延伸，以形成细胞特异性cDNA文库；(c)通过无模板酶促合成，在珠的每个cDNA上合成独特的细胞特异性寡核苷酸条形码。在一些实施方案中，独特的细胞特异性条形码或珠特异性条形码是随机序列寡核苷酸，并且合成这样的条形码的步骤通过“拆分和混合”程序用无模板酶促合成进行。
在一些实施方案中，本发明涉及用预定核苷酸序列延伸一个或更多个天然多核苷酸的方法，所述方法包括：在TdT反应条件下，在反应混合物中提供一个或更多个天然多核苷酸，天然多核苷酸具有游离的3’-羟基；以及通过以下步骤的重复循环用预定序列的核苷酸来延伸一个或更多个天然多核苷酸：(i)使具有游离3’-O-羟基的天然多核苷酸或延长的天然多核苷酸与3’-O-封闭的核苷三磷酸和TdT变体接触，使得天然多核苷酸或延长的天然多核苷酸通过掺入3’-O-封闭的核苷三磷酸延长，以形成3’-O-封闭的延长的天然多核苷酸，和(ii)使延长的天然多核苷酸去封闭以形成具有游离3’-羟基的延长的天然多核苷酸，从而在天然多核苷酸上合成预定序列的寡核苷酸。
本发明的这些以上特征方面以及其他方面在许多图示的实施方式和应用中例示，其中一些在附图中示出，并且在随后的权利要求部分中表征。然而，以上概述并不意图描述本发明的每个图示实施方案或每个实施方式。
附图简述
图1A图示了使用TdT的无模板酶促核酸合成方法的步骤。
图1B-图1C示出了本发明用于在cDNA分子的3’末端上直接合成寡核苷酸的一种实施方案。
图1D-图1F示出了通过应用图1B-图1C中示出的方法，在固体支持物(例如珠或平面阵列)上生成加标签的cDNA文库。
图1G示出了使用寡核苷酸标记的抗体来鉴定蛋白的空间分布的实施方案。
图1H示出了使用固定的具有DNA标记物的寡核苷酸和抗体来鉴定基因表达和蛋白分布二者的实施方案。
图1I示出了通过多于一个加标签步骤将空间测序分析聚焦在感兴趣的特定表面区域上的实施方案。
图2A-图2D示出了在活细胞或固定且透化的细胞上直接合成寡核苷酸标签的本发明的实施方案。
图3A示出了起始子寡核苷酸通过亲脂性锚与细胞表面膜的附接。
图3B示出了锚定在细胞的细胞膜表面中的起始子上独特的分子条形码的“拆分和混合”合成。
图3C示出了微流体处理条形码编码的细胞以生成每个文库包括细胞特异性条形码的单细胞特异性cDNA文库。
图4A示出了从单细胞扩增特定基因的程序。
图4B示出了从单细胞扩增完全的cDNA文库的程序(模板转换)。
图4C示出了通过聚合酶循环扩增(PCA)将细胞特异性条形码附接至cDNA序列的程序。
图5示出了用于生成条形码编码的单细胞cDNA文库的替代方法。
图6示出了嵌合酶促/化学合成的探针。
发明详述
这里更详细地公开了本发明的一般原理，特别地通过实例的方式，诸如在附图中示出并详细描述的那些。然而，应该理解的是，意图并不是将本发明限制于所描述的特定实施方案。本发明适用于各种修改和替代形式，其细节在若干实施方案中示出。意图是覆盖落入本发明的原理和范围内的所有修改、等同物和替代物。
除非另外指出，否则本发明的实践可以采用有机化学、分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学和生物化学的常规技术和描述，这些都在本领域的技术内。这样的常规技术可以包括但不限于制备和使用合成肽、合成多核苷酸、单克隆抗体，核酸克隆、扩增、测序和分析以及相关技术。这样的常规技术的方案可以见于来自制造商的产品文献和标准实验室手册中，诸如Genome Analysis:A Laboratory Manual Series(第I-IV卷)；PCR Primer:A Laboratory Manual；和Molecular Cloning:A Laboratory Manual(全部来自ColdSpring Harbor Laboratory Press)；Lutz和Bornscheuer，编辑，Protein EngineeringHandbook(Wiley-VCH,2009)；Hermanson，Bioconjugate Techniques，第2版(AcademicPress,2008)；以及类似的参考文献。
本发明涉及用于使用无模板酶促寡核苷酸合成技术在细胞或生物分子上直接合成寡核苷酸的方法。这样的技术可以直接应用于从其天然环境中提取的生物分子(例如DNA或RNA)、通过附接起始子修饰的生物分子(例如蛋白)或合成产生的生物分子(例如核酸、多糖、多肽等)。这样的技术可以应用于酶促反应的温和条件是必要的或有用的任何情况。特别地，无模板酶促合成技术可以用于杂合化学-酶促多核苷酸合成(hybrid chemical-enzymatic polynucleotide synthesis)，其中将前体多核苷酸化学合成，然后将前体通过酶促添加在化学合成的苛刻条件下可能改变或不能存活的组分(诸如标记的核苷酸)来进一步修饰。这样的杂合合成方法可以包括核苷酸或其类似物的化学添加和酶添加之间的几种改变。这样的杂合合成技术可以将酶促合成与多种不同的化学合成方法配对，包括但不限于亚磷酰胺、磷酸二酯、磷酸三酯、亚磷酸三酯、氢膦酸酯化学，例如Narang，编辑，Synthesis and applications of DNA and RNA(Academic Press,Inc.,1987)。
在一些实施方案中，无模板酶促合成技术需要存在具有游离3’-羟基的起始子寡核苷酸，所述起始子寡核苷酸可以是生物分子的一部分(在cDNA的多核苷酸的情况下)，或者所述起始子寡核苷酸可以通过多种化学技术例如使用容易地可得的点击化学反应容易地添加(在细胞膜蛋白、抗体等的情况下)。在起始子可用的情况下，酶促寡核苷酸合成可以通过以下的重复循环来实现：(i)在3’-O-封闭的核苷三磷酸存在的情况下使用无模板聚合酶诸如末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)用单个核苷酸来延伸具有游离3’-羟基的起始子(或先前延伸的链)，和(ii)使最近掺入的3’-O-封闭的核苷酸去封闭，以再生新的可延伸的3’-羟基。继续循环，直至合成具有期望序列的寡核苷酸。在一些实施方案中，独特的寡核苷酸条形码可以通过“拆分和混合”合成策略在生物细胞(诸如哺乳动物细胞)群体上直接合成。在一些实施方案中，可以包括加帽步骤，其中使非延伸的游离羟基与阻止加帽链任何进一步延伸的化合物反应。在一些实施方案中，这样的化合物可以是双脱氧核苷三磷酸。在其他实施方案中，具有游离3’-羟基的非延伸链可以通过将其用3’-外切核酸酶活性，例如用Exo I处理来降解，如由Jensen等人，Biochemistry，57:1821-1832(2018)描述的。
在一些实施方案中，本发明涉及在生物细胞或生物分子上合成寡核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供含有具有游离3’-羟基的起始子的生物细胞或生物分子；(b)重复多于一个循环的以下步骤：(i)在延长条件下使具有游离3’-O-羟基的起始子或延长的片段与3’-O-封闭的核苷三磷酸和不依赖模板的DNA聚合酶接触，使得起始子或延长的片段通过掺入3’-O-封闭的核苷三磷酸延长以形成3’-O-封闭的延长的片段，和(ii)使延长的片段去封闭以形成具有游离3’-羟基的延长的片段，从而在生物细胞或生物分子上合成预定序列的寡核苷酸。在一些实施方案中，提供生物细胞，并且酶促进行去封闭。在一些实施方案中，3’-O-封闭的核苷三磷酸是3’-磷酸核苷三磷酸，并且去封闭步骤通过用3’-磷酸酶活性处理所述3’-O-封闭的延长的片段来进行。在一些实施方案中，3’-磷酸酶活性由T4多核苷酸激酶、重组虾碱性磷酸酶或牛小肠碱性磷酸酶提供。在一些实施方案中，3’-O-封闭的核苷三磷酸是3’-酯-核苷三磷酸，并且去封闭步骤通过用酯酶活性处理所述3’-O-封闭的延长的片段来进行。在一些实施方案中，酯酶活性是脂肪酶活性，诸如蛋白酶K活性。在一些实施方案中，3’-O-封闭的核苷三磷酸是3’-乙酰基核苷三磷酸，并且去封闭步骤通过用乙酰酯酶活性处理所述3’-O-封闭的延长的片段来进行。在一些实施方案中，不依赖模板的DNA聚合酶是末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)变体，所述变体具有与SEQ ID NO 2-15的任一个氨基酸序列至少60％相同的氨基酸序列，在SEQ ID NO:2的位置207位处或SEQ ID NO 3-15的氨基酸序列中功能等同位置处的第一精氨酸处和SEQ ID NO:2的325处或SEQ ID NO3-15的氨基酸序列中功能等同位置处的第二精氨酸处的取代，其中变体TdT(i)能够在没有模板的情况下合成核酸片段，并且(ii)能够将3’-O-修饰的核苷酸掺入到核酸片段的游离3’-羟基上。
在一些实施方案中，本发明用于在存活细胞上合成寡核苷酸的方法可以通过以下步骤进行：(a)提供具有游离3’-羟基的起始子，所述起始子被附接至细胞的细胞表面分子或被锚定在细胞的细胞表面膜中；(b)在生物条件下重复多于一个循环的以下步骤：(i)使具有游离3’-O-羟基的起始子或延长的片段与3’-O-封闭的核苷三磷酸和不依赖模板的DNA聚合酶接触，使得起始子或延长的片段通过掺入3’-O-封闭的核苷三磷酸延长以形成3’-O-封闭的延长的片段，和(ii)使延长的片段酶促去封闭以形成具有游离3’-羟基的延长的片段，从而合成预定序列的寡核苷酸。
以上过程示于图1B-图1C中，该图示出了其中cDNA具有在其3’末端上合成的寡核苷酸的实施方案。这样的cDNA可以从例如分离在反应室中的单细胞获得。细胞特异性(或室特异性)寡核苷酸可以在这样的cDNA上合成。然后，可以将这些反应室的内容物组合，并且通过大规模序列分析来分析寡核苷酸-cDNA缀合物，以提供例如细胞群体的单细胞转录物组分析，或者暴露于相同条件的同一反应器的一组细胞的转录物组分析。使具有3’-聚T部分(104)的引物(102)与信使RNA(mRNA)(100)的聚A区域退火，并且使用常规方案用逆转录酶延伸(108)以形成cDNA(113)(SEQ ID NO:16)。引物(102)还具有提供了将所得延伸产物(即cDNA)附接至固体支持物的工具(means)的部分(106)。多种这样的附接工具是可用的，包括但不限于可以与附接至固体支持物的互补链退火的5’寡核苷酸尾、可以与附接至固体支持物的点击化学反应对的成员反应以形成共价键的互补成员、可以与附接至固相支持物的非核酸结合对的成员形成复合物以形成非共价键的互补成员，附接至固相支持物的非核酸结合对的成员的实例是生物素和链霉抗生物素蛋白。回到图1B，以上附接模式中的两种用固体支持物(120a)来示出，该支持物(120a)具有通过其3’末端附接的互补寡核苷酸(112)，并且该支持物(120a)通过与延伸的引物(102)的部分(106)形成杂交体(hybrid)来捕获cDNA(113)，以及用替代支持物(120b)来示出，该支持物(120b)具有附接的结合对的成员(114a)(诸如，链霉抗生物素蛋白)，并且捕获其互补成员(例如，生物素)。附接至cDNA的结合对的成员不需要寡核苷酸尾(106)的存在；然而，在一些实施方案中，这样的寡核苷酸(106)可以包括可用于从固体支持物上裂解最终产品的核苷酸或核苷酸序列，例如存在通过USER处理裂解的尿嘧啶，或限制性内切核酸酶诸如切口酶的识别序列。
在cDNA可裂解地或可释放地附接至固体支持物，使其3’-羟基游离之后，酶促合成可以进行，以在游离的3’末端上生成预定序列的寡核苷酸，这在图1C中图解地示出。在链(123)(SEQ ID NO:16)附接至固体支持物(例如，经由结合对附接至120b)之后，将其在允许TdT催化由cDNA的3’-羟基和引入的3’-O-封闭的核苷酸的三磷酸形成磷酯键的条件下暴露于包含无模板聚合酶(诸如TdT)和3’-O-封闭的核苷三磷酸的反应混合物中，从而掺入所期望寡核苷酸的第一核苷酸。延伸反应的3’-氧封闭的核苷三磷酸在图中显示为“3’-O-封闭的dYTP”。将所得产物的3’-O-封闭的羟基用合适的去封闭剂去封闭(122)，以形成具有游离3’-羟基的延伸的cDNA(125)。如将在下文更全面讨论的，对于不同的实施方案，封闭基团的选择及其去除方法可以广泛不同。对于特定实施方案的这样的选择在普通从业者的技能范围内，通过评估因素诸如期望的合成速度、期望的合成产率、被标记的靶生物分子或细胞的脆性(fragililty)，特别地生物相容的酶促去封闭是否更期望或者更苛刻的化学去封闭是否可接受等。使用期望的寡核苷酸的连续核苷酸重复循环(126)，直至寡核苷酸的合成完成。在一些实施方案中，包括另外的步骤，诸如一个或更多个洗涤步骤，或去除3’-O-封闭的-dYTP的步骤。在合成完成之后，可将寡核苷酸标记的cDNA从固体支持物取出，用于进一步分析或使用。在一些实施方案中，cDNA可以保留在固体支持物上用于进一步分析或使用。
在一些实施方案中，寡核苷酸可以通过类似于图1C的过程的过程在其他生物分子诸如抗体上合成，条件是该生物分子具有附接的起始子序列。
图1D-图1E示出了如何可以将以上方法与商购可得的聚T珠一起用于构建固相cDNA文库，例如DynabeadsTM寡(dT)磁珠，Bosnes等人，ThermoFisher Application Note(2017)。将聚T珠(150)与包含聚A RNA(152)的细胞提取物或裂解物在允许珠的聚T区段与RNA的聚A区段杂交的条件下组合，之后杂交的聚T区段在逆转录反应中延伸。在去除RNA模板(156)之后，得到固相cDNA文库(158)，然后可以将该固相cDNA文库(158)根据图1B和图1C的方法进行处理(160)以合成条形码、引物结合位点等(162)，以允许进一步分析cDNA。这样的条形码可以独特地指定特定样品，诸如患者样品，或者如下文进一步描述的，这样的条形码可以独特地指定单细胞。
在一些实施方案中，本发明涉及生成各自具有寡核苷酸标记物的cDNA文库的方法，所述方法包括以下步骤：(a)通过将mRNA与附接至一个或更多个固体支持物的捕获寡核苷酸杂交来捕获mRNA，其中捕获寡核苷酸与mRNA的区段互补，并且其中捕获寡核苷酸通过5’-末端附接至一个或更多个固体支持物，并且含有具有游离3’-羟基的3’-末端；(b)将捕获寡核苷酸的3’末端使用捕获的mRNA作为模板用逆转录酶延伸，以在一个或更多个固体支持物上形成cDNA文库；和(c)通过无模板酶促合成在一个或更多个固体支持物的每个cDNA上合成寡核苷酸标记物。在一些实施方案中，合成步骤包括重复以下的循环：(i)在延长条件下使所述cDNA与3’-O-封闭的核苷三磷酸和不依赖模板的DNA聚合酶接触，使得具有游离3’-羟基的所述cDNA或延长的cDNA通过掺入3’-O-封闭的核苷三磷酸延长，以形成3’-O-封闭的延长的cDNA，和(ii)使延长的cDNA去封闭，以形成具有游离3’-羟基的延长的cDNA。在一些实施方案中，每个所述循环还包括将具有游离3’-羟基的所述cDNA或延长的cDNA拆分到单独的反应混合物中，其中具有游离3’-羟基的所述cDNA或延长的cDNA被不同种类的核苷三磷酸延长以形成所述延长的cDNA，之后将单独的反应混合物的所述延长的cDNA组合。在一些实施方案中，捕获步骤包括在珠上捕获单细胞的mRNA以形成是细胞特异性cDNA文库的cDNA文库，并且其中寡核苷酸标记物是独特的细胞特异性寡核苷酸条形码。在一些实施方案中，合成独特的细胞特异性条形码的步骤通过拆分和混合合成方法实现。
寡核苷酸的无模板酶促合成
通常，无模板(或等同地，“不依赖模板的”)酶促DNA合成的方法包括重复循环步骤，诸如图1A中示出的，其中在每个循环中，预定的核苷酸与起始子或生长链偶联。无模板酶促合成的一般要素在以下参考文献中描述：Ybert等人，国际专利公布WO/2015/159023；Ybert等人，国际专利公布WO/2017/216472；Hyman，美国专利5436143；Hiatt等人，美国专利5763594；Jensen等人，Biochemistry，57：1821-1832(2018)；Mathews等人，Organic&Biomolecular Chemistry，DOI:0.1039/c6ob01371f(2016)；Schmitz等人，Organic Lett.,1(11):1729-1731(1999))。
提供了例如，附接至固体支持物(1020)的起始子多核苷酸(1000)，所述起始子多核苷酸具有游离3’-羟基基团(1030)。在对将3’-O-保护的-dNTP酶促掺入到起始子多核苷酸(1000)(或延长的起始子多核苷酸)的3’末端有效的条件(1040)下，向起始子多核苷酸(1000)(或随后循环中的延长的起始子多核苷酸)添加3’-O-保护的-dNTP和无模板聚合酶诸如TdT或其变体(例如Ybert等人，WO/2017/216472；Champion等人，WO2019/135007)。该反应产生其3’-羟基被保护的伸长的起始子多核苷酸(1060)。如果延长的序列不完整，那么实施另一个添加循环(1080)。如果延长的起始子多核苷酸包含完整的序列，那么3’-O-保护基团可以被去除，或者去保护，并且期望的序列可以从原始起始子多核苷酸裂解(1100)。这样的裂解可以使用多种单链裂解技术中的任一种来进行，例如，通过在原始起始子多核苷酸内的预定位置处插入可裂解核苷酸来进行。示例性可裂解核苷酸可以是被尿嘧啶DNA糖基化酶裂解的尿嘧啶核苷酸。如果延长的起始子多核苷酸不包含完整的序列，那么3’-O-保护基团被去除以暴露游离3’-羟基(1030)，并且使延长的起始子多核苷酸经历另一循环的核苷酸添加和去保护。
如本文使用的，“起始子”(或等同术语，诸如，“起始片段”、“起始子核酸”、“起始子寡核苷酸”等)通常是指可以被无模板聚合酶(诸如TdT)进一步延长的具有游离3’-末端的短寡核苷酸序列。在一种实施方案中，起始片段是DNA起始片段。在另一种实施方案中，起始片段是RNA起始片段。在一些实施方案中，起始片段具有3个与100个之间的核苷酸，特别地3个与20个之间的核苷酸。在一些实施方案中，起始片段是单链的。在替代实施方案中，起始片段是双链的。在一些实施方案中，起始子可以包含具有游离羟基(TdT可以将3’-O-保护的dNTP偶联至其上)的非核酸化合物，例如Baiga，美国专利公布US2019/0078065和US2019/0078126。
回到图1A，在一些实施方案中，在每个合成步骤中在存在3’-O-保护的dNTP的情况下使用无模板聚合酶(诸如TdT)将核苷酸的有序序列偶联至起始子核酸上。在一些实施方案中，合成寡核苷酸的方法包括以下步骤：(a)提供具有游离3’-羟基的起始子；(b)在延伸条件下使具有游离3’-羟基的起始子或延伸中间体与无模板聚合酶在存在3’-O-保护的核苷三磷酸的情况下反应，以产生3’-O-保护的延伸中间体；(c)使延伸中间体去保护以产生具有游离3’-羟基的延伸中间体；和(d)重复步骤(b)和(c)，直至多核苷酸被合成。(有时术语“延伸中间体”和“延长片段”可互换使用)。在一些实施方案中，起始子以例如通过其5’末端附接至固体支持物的寡核苷酸提供。以上方法还可以包括在反应或延伸步骤之后以及去保护步骤之后的洗涤步骤。例如，反应步骤可以包括在预定孵育时间段或反应时间之后去除未掺入的核苷三磷酸(通过例如洗涤)的子步骤。这样的预定孵育时间段或反应时间可以是几秒钟(a few seconds)，例如30秒，至数分钟(several minutes)，例如30分钟。
当合成支持物上的多核苷酸序列包括反向互补子序列时，二级分子内结构或跨分子结构可以通过在反向互补区域之间形成氢键来产生。在一些实施方案中，选择环外胺的碱基保护部分，使得被保护的氮的氢不能够参与氢键结合，从而防止形成这样的二级结构。即，可以采用碱基保护部分来防止氢键(诸如在正常碱基配对中，例如在核苷A与T之间以及在核苷G与C之间形成的氢键)的形成。在合成结束时，碱基保护部分可以被去除，并且多核苷酸产物可以从固体支持物上裂解，例如通过将多核苷酸产物从其起始子上裂解。
没有碱基保护的3’-O-封闭的dNTP可以从商业供应商处购买，或者使用公开的技术合成，例如美国专利7057026；Guo等，Proc.Natl.Acad.Sci.,105(27):9145-9150(2008)；Benner，美国专利7544794和8212020；国际专利公布WO2004/005667、WO91/06678；Canard等人，Gene(本文引用)；Metzker等人，Nucleic Acids Research,22:4259-4267(1994)；Meng等人，J.Org.Chem.,14:3248-3252(3006)；美国专利公布2005/037991。具有碱基保护的3’-O-封闭的dNTP可以如下描述地合成。
当采用碱基保护的dNTP时，图1A的以上方法还可以包括步骤(e)去除碱基保护部分，在酰基或脒保护基团的情况下，该步骤可以(例如)包括用浓氨处理。
以上方法还可以包括一个或更多个加帽步骤以及在反应或延伸步骤之后以及去保护步骤之后的洗涤步骤。如以上提及的，在一些实施方案中，可以包括加帽步骤，其中非延伸的游离3’-羟基与阻止加帽链任何进一步延伸的化合物反应。在一些实施方案中，这样的化合物可以是双脱氧核苷三磷酸。在其他实施方案中，具有游离3’-羟基的非延伸链可以通过将其用3’-外切核酸酶活性，例如Exo I处理来降解。例如，参见Hyman，美国专利5436143。同样，在一些实施方案中，未能够被去封闭的链可以被处理以去除该链或使其对进一步的延伸呈惰性。
在一些实施方案中，用于延伸或延长步骤的反应条件可以包括以下：2.0μM纯化的TdT；125-600μM 3’-O-封闭的dNTP(例如3’-O-NH2-封闭的dNTP)；约10mM至约500mM的二甲胂酸钾缓冲液(6.5与7.5之间的pH)和约0.01mM至约10mM的二价阳离子(例如CoC12或MnC12)，其中延长反应可在50μL的反应体积，在RT至45℃范围内的温度进行3分钟。在其中3’-O-封闭的dNTP是3’-O-NH2-封闭的dNTP的实施方案中，用于去封闭步骤的反应条件可以包括以下：700mM NaNO2；1M乙酸钠(用乙酸调节至pH在4.8-6.5的范围内)，其中去封闭反应可以在50μL体积，在RT至45℃范围内的温度进行30秒至数分钟(several minutes)。
根据特定的应用，去封闭和/或裂解的步骤可以包括多种化学或物理条件，例如光、热、pH、特定试剂诸如能够裂解特定的化学键的酶的存在。选择3’-O-封闭基团和对应的去封闭条件的指导可以见于以下参考文献中，这些参考文献通过引用并入：Benner，美国专利7544794和8212020；美国专利5808045；美国专利8808988；国际专利公布WO91/06678；以及下文引用的参考文献。在一些实施例中，裂解剂(有时也称为去封闭试剂或去封闭剂)是化学裂解剂，诸如，例如二硫苏糖醇(DTT)。在替代实施方案中，裂解剂可以是酶促裂解剂，诸如，例如，可以裂解3’-磷酸封闭基团的磷酸酶。本领域技术人员将理解，去封闭剂的选择取决于所使用的3’-核苷酸封闭基团的类型、是否使用一个或多于一个封闭基团、起始子是否被附接至活细胞或生物体或固体支持物等，这些都需要温和的处理。例如，膦诸如三(2-羧乙基)膦(TCEP)可以用于裂解3’O-叠氮甲基基团，钯络合物可以用于裂解3’O-烯丙基基团，或亚硝酸钠可以用于裂解3’O-氨基基团。在特定实施方案中，裂解反应包括TCEP、钯络合物或亚硝酸钠。
如以上所述，在一些实施方案中，期望采用可以使用正交去封闭条件去除的两个或更多个封闭基团。以下示例性封闭基团对可以用于并行合成实施方案(表1)。应当理解，其他的封闭基团对，或者包含多于两个的基团可以可用于在本发明的这些实施方案中使用。
表1：封闭基团对
3’-O-NH2 3’-O-叠氮甲基
3’-O-NH2 3’-O-烯丙基
3’-O-NH2 3’-O-磷酸
3’-O-叠氮甲基 3’-O-烯丙基
3’-O-叠氮甲基 3’-O-磷酸
3’-O-烯丙基 3’-O-磷酸
在活细胞上合成寡核苷酸需要温和的去封闭或去保护条件，即不会破坏细胞膜、使蛋白变性、干扰关键细胞功能等的条件。在一些实施方案中，去保护条件在与细胞存活相容的生理条件范围内。在这样的实施方案中，酶促去保护是期望的，因为它可以在生理条件下进行。在一些实施方案中，特定的酶促可去除的封闭基团与特定的酶相关联以将其去除。例如，基于酯的或基于酰基的封闭基团可以用酯酶诸如乙酰酯酶或类似的酶去除，并且磷酸封闭基团可以用3’磷酸酶诸如T4多核苷酸激酶去除。通过实例的方式，3’-O-磷酸可以通过用100mM Tris-HCl(pH 6.5)、10mM MgC12、5mM 2-巯基乙醇和一个单位T4多核苷酸激酶的溶液处理来去除。反应在37℃的温度进行1分钟。
“3'-磷酸封闭的”或“3’-磷酸保护的”核苷酸是指其中3’-位置的羟基基团被含磷酸部分的存在封闭的核苷酸。根据本发明的3’-磷酸封闭的核苷酸的实例是核苷酸基-3'-磷酸单酯/核苷酸基-2',3'-环磷酸、核苷酸基-2'-磷酸单酯和核苷酸基-2'或3'-烷基磷酸二酯(nucleotidyl-2'or 3'-alkylphosphate diester)，以及核苷酸基-2'或3'-焦磷酸。也可以使用这样的化合物的硫代磷酸酯或其他类似物，条件是取代不阻止磷酸酶去磷酸化产生游离的3’-OH。
3’-O-酯保护的dNTP或3’-O-磷酸保护的dNTP的合成和酶促去保护的另外的实例在以下参考文献中描述：Canard等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,92:10859-10863(1995)；Canard等人，Gene,148:1-6(1994)；Cameron等人，Biochemistry,16(23):5120-5126(1977)；Rasolonjatovo等人，Nucleosides&Nucleotides,18(4&5):1021-1022(1999)；Ferrero等人，Monatshefte fur Chemie,131:585-616(2000)；Taunton-Rigby等人，J.Org.Chem.,38(5):977-985(1973)；Uemura等人，Tetrahedron Lett.,30(29):3819-3820(1989)；Becker等人，J.Biol.Chem.,242(5):936-950(1967)；Tsien，国际专利公布WO1991/006678。
在一些实施方案中，修饰的核苷酸包括包含嘌呤碱基或嘧啶碱基和以下核糖或脱氧核糖糖部分的修饰的核苷酸或核苷分子，所述核糖或脱氧核糖糖部分具有与其共价附接的可去除的3’-OH封闭基团以使得3’碳原子已附接以下结构的基团：
-O-Z
其中–Z是–C(R’)2-O-R”、-C(R’)2-N(R”)2、-C(R’)2-N(H)R”、-C(R’)2-S-R”和-C(R’)2-F中的任一个，其中每个R”是可去除的保护基团或可去除的保护基团的一部分；每个R’独立地是氢原子、烷基、取代的烷基、芳基烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环、酰基、氰基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基或酰氨基(amido)基团或通过连接基团附接的可检测的标记物；条件是在一些实施方案中，这样的取代基具有多达10个碳原子和/或多达5个氧或氮杂原子；或者(R’)2代表式＝C(R”’)2的基团，其中每个R”’可以是相同的或不同的并且选自包括氢原子和卤素原子以及烷基基团的组，条件是在一些实施方案中，每个R’”的烷基具有1个至3个碳原子；并且其中分子可以反应以产生中间体，在所述中间体中每个R”被交换为H，或当Z是–(R’)2-F时，F被交换为OH、SH或NH2，优选地OH，所述中间体在水性条件下解离以提供具有游离3’-OH的分子；条件是，当Z是-C(R’)2-S-R”时，两个R’基团均不是H。在某些实施方案中，修饰的核苷酸或核苷的R’是烷基或取代的烷基，条件是，这样的烷基或取代的烷基具有1个至10个碳原子和0至4个氧或氮杂原子。在某些实施方案中，修饰的核苷酸或核苷的-Z是式-C(R’)2-N3。在某些实施方案中，Z是叠氮甲基基团。
在一些实施方案中，Z是具有或不具有杂原子的具有200或更小分子量的可裂解有机部分。在其他实施方案中，Z是具有或不具有杂原子的具有100或更小分子量的可裂解有机部分。在其他实施方案中，Z是具有或不具有杂原子的具有50或更小分子量的可裂解有机部分。在一些实施方案中，Z是具有或不具有杂原子的具有200或更小分子量的酶促可裂解有机部分。在其他实施方案中，Z是具有或不具有杂原子的具有100或更小分子量的酶促可裂解有机部分。在其他实施方案中，Z是具有或不具有杂原子的具有50或更小分子量的酶促可裂解有机部分。在其他实施方案中，Z是具有200或更小分子量的酶促可裂解酯基团。在其他实施方案中，Z是可被3’-磷酸酶去除的磷酸基团。在一些实施方案中，以下3’-磷酸酶中的一种或更多种可以根据制造商推荐的方案使用：T4多核苷酸激酶、牛小肠碱性磷酸酶、重组虾碱性磷酸酶(例如，从New England Biolabs,Beverly,MA可得的)。
在另外的实施方案中，3’-封闭的核苷酸三磷酸被3’-O-叠氮甲基、3’-O-NH2或3’-O-烯丙基基团封闭。
在仍其他实施方案中，本发明的3’-O-封闭基团包括3’-O-甲基、3’-O-(2-硝基苄基)、3’-O-烯丙基、3’-O-胺、3’-O-叠氮甲基、3’-O-叔丁氧基乙氧基、3’-O-(2-氰乙基)和3’-O-炔丙基。
在一些实施方案中，3’-O-保护基团是电化学不稳定基团。即，保护基团的去保护或裂解通过改变保护基团附近的电化学条件(其导致裂解)来实现。电化学条件的这样的改变可以通过改变或施加物理量(诸如电压差或光)来激活辅助物质而引起，这继而引起保护基团位置处的电化学条件的改变，诸如pH值的增加或减少。在一些实施方案中，电化学不稳定基团包括例如每当pH改变至预定值时被裂解的对pH敏感的保护基团。在其他实施方案中，电化学不稳定基团包括每当还原或氧化条件(例如通过增加或减少保护基团位置处的电压差)改变时被直接裂解的保护基团。
在一些实施方案中，酶促合成方法采用对于3’-O-修饰的核苷三磷酸显示出增加的掺入活性的TdT变体。例如，这样的TdT变体可以使用Champion等人的美国专利10435676中描述的技术生产，该专利通过引用并入本文。在一些实施方案中，采用了TdT变体，所述TdT变体具有与SEQ ID NO:2至少60％相同的氨基酸以及位置207处的第一精氨酸的取代和位置325处的第二精氨酸的取代或其功能等同残基。在一些实施方案中，采用了末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)变体，所述末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)变体具有与选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQID NO:15的氨基酸序列至少60％相同的氨基酸序列，具有相对于SEQ ID NO 2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 12和SEQ ID NO 13在位置207处、相对于SEQ ID NO 5在位置206处、相对于SEQ ID NO 8和SEQ ID NO 10在位置208处、相对于SEQ ID NO 11在位置205处、相对于SEQ ID NO 14在位置216处和相对于SEQ ID NO 15在位置210处的精氨酸(“第一精氨酸”)的取代；以及相对于SEQ ID NO 2、SEQID NO 9和SEQ ID NO 13在位置325处、相对于SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4在位置324处、相对于SEQ ID NO 5在位置320处、相对于SEQ ID NO 6和SEQ ID NO 8在位置331处、相对于SEQ ID NO 11在位置323处、相对于SEQ ID NO 12和SEQ ID NO 15在位置328处和相对于SEQ ID NO 14在位置338处的精氨酸(“第二精氨酸”)的取代；或其功能等同残基；其中TdT变体(i)能够在没有模板的情况下合成核酸片段，并且(ii)能够将3’-O-修饰的核苷酸掺入到核酸片段的游离3'-羟基上。在一些实施方案中，以上同一性百分比值是与所指示的SEQID NO的至少80％同一性；在一些实施方案中，以上同一性百分比值是与所指示的SEQ IDNO的至少90％同一性；在一些实施方案中，以上同一性百分比值是与所指示的SEQ ID NO的至少95％同一性；在一些实施方案中，以上同一性百分比值是至少97％同一性；在一些实施方案中，以上同一性百分比值是至少98％同一性；在一些实施方案中，以上同一性百分比值是至少99％同一性。如本文使用的，用于比较参考序列和变体序列的同一性百分比值不包括包含变体序列的取代的明确指定的氨基酸位置；即，同一性关系百分比是在参考蛋白序列和变体中包含取代的明确指定位置之外的变体蛋白序列之间的关系。因此，例如，如果参考序列和变体序列各自包含100个氨基酸，并且变体序列在位置25和81处具有突变，那么同源性百分比将是关于位置1-24、26-80和82-100。
关于(ii)，这样的3’-O-修饰的核苷酸可以包含3’-O-NH2-核苷三磷酸、3’-O-叠氮甲基核苷三磷酸、3’-O-烯丙基核苷三磷酸、3’O-(2-硝基苄基)-核苷三磷酸或3’-O-炔丙基核苷三磷酸。
在一些实施方案中，如表2中示出的，以上TdT变体在第一精氨酸和第二精氨酸处具有取代。
表2：TdT变体
Figure BDA0003209408300000171
在一些实施方案中，用于与本发明方法一起使用的另外的TdT变体包括甲硫氨酸、半胱氨酸或谷氨酸中的一个或更多个另外的取代，如表1中示出的。
可以用于本发明方法的另外的特定TdT变体列于表3中。表2的TdT变体DS1001至DS1018中的每一个都包含与SEQ ID NO 2至少60％相同的氨基酸序列，并且包含在指示位置处的取代。在一些实施方案中，TdT变体DS1001至DS1018包含与SEQ ID NO 2至少80％相同的氨基酸序列，并且包含在指示位置处的取代；在一些实施方案中，TdT变体DS1001至DS1018包含与SEQ ID NO 2至少90％相同的氨基酸序列，并且包含在指示位置处的取代；在一些实施方案中，TdT变体DS1001至DS1018包含与SEQ ID NO 2至少95％相同的氨基酸序列，并且包含在指示位置处的取代；在一些实施方案中，TdT变体DS1001至DS1018包含与SEQID NO 2至少97％相同的氨基酸序列，并且包含在指示位置处的取代；在一些实施方案中，TdT变体DS1001至DS1018包含与SEQ ID NO 2至少98％相同的氨基酸序列，并且包含在指示位置处的取代；在一些实施方案中，TdT变体DS1001至DS1018包含与SEQ ID NO 2至少99％相同的氨基酸序列，并且包含在指示位置处的取代。
表3：用于与本发明方法一起使用的特定TdT变体
Figure BDA0003209408300000181
Figure BDA0003209408300000191
Figure BDA0003209408300000201
如以上描述的本发明的TdT变体各自包含与指定SEQ ID NO具有序列同一性百分比的氨基酸序列，经历指示的取代的存在。在一些实施方案中，以这种方式描述的本发明的TdT变体与指定的SEQ ID NO之间的序列差异的数目和类型可能是由于取代、缺失和/或插入，并且被取代、缺失和/或插入的氨基酸可以包含任何氨基酸。在一些实施方案中，这样的缺失、取代和/或插入仅包含天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，取代仅包含保守的或同义的氨基酸改变，如Grantham,Science,185:862-864(1974)中描述的。即，氨基酸的取代仅能够发生在其同义氨基酸组的成员之间。在一些实施方案中，可以采用的同义氨基酸组列于表4A中。
表4A：氨基酸同义组I
Figure BDA0003209408300000202
在一些实施方案中，可以采用的同义氨基酸组列于表4B中。
表4B:氨基酸同义组II
Figure BDA0003209408300000211
在生物分子上合成寡核苷酸
可以根据本发明在其上合成寡核苷酸的生物分子包括但不限于多核苷酸、肽、蛋白、聚糖、多糖等。事实上，起始子可以附接的任何生物分子或其他材料都可以具有通过本发明方法在其上合成的寡核苷酸。如上所述，对于多核苷酸，诸如cDNA、基因组片段等，多种不同的起始子附接方案可用，包括导致起始子与生物分子或表面之间共价键的方案和导致起始子与生物分子或表面之间非共价键的方案，诸如在起始子与附接至表面或生物分子的另一互补寡核苷酸之间形成双链体，或者在捕获部分与其互补部分，诸如生物素和链霉抗生物素蛋白之间形成复合物。
已经合成了寡核苷酸的多核苷酸可以以多种方式从固体支持物上分离。与捕获寡核苷酸杂交的起始子可以简单地从捕获寡核苷酸解链或去杂交，或者双链体可以被设计为包括限制性内切核酸酶或切口酶识别位点。在起始子被共价附接至表面的实施方案中，几种技术可用于裂解单链，例如在起始子的预定位置处插入尿嘧啶，Delort等人，NucleicAcids Research,13:319-335(1985)。
寡核苷酸起始子可以使用熟知的技术，诸如在以下参考文献中描述的技术附接至蛋白，诸如抗体上：Hermanson(以上引用的)；Baskin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,104(43):16793-16797(2007)；Gong等人，Bioconjugate Chemistry,27:217-225(2016)；Horisawa,Frontiers in Physiology,5:1-6(2014)；Jewett等人，Chem.Soc.Rev.,39(4):1272-1279(2010)；美国专利5665539；等。
一旦起始子被附接，则可以进行酶促合成来使起始子延伸。在一些实施方案中，蛋白可逆地附接至固体支持物上，然后合成。与多核苷酸一样，这样的附接可以是共价或非共价的。如果蛋白是重组蛋白，附接可以通过肽标签，诸如聚组氨酸标签的方式或类似方法。在一些实施方案中，蛋白可以通过捕获并结合至被附接至固体支持物上的抗体上而固定在固体支持物上。
在生物细胞上合成寡核苷酸
长期以来，单细胞测量的价值一直被认为用于评估以其他方式将从整体测量中检测不到的罕见亚群，所述整体测量仅提供来自许多细胞的细胞参数的平均值，例如，DiCarlo等人，Methods in Molecular Biology,853:1-9(2012)。因此，已经开发了一系列用于高通量单细胞分析的技术，例如Shapiro等人，Nature Reviews Genetics,14:618-630(2013)中综述的。许多这些技术中的常见方法已经包括通过将群体中的细胞随机分布到进行分析的小反应体积中来形成包含单细胞的反应器。虽然这样的随机方法允许处理“主体(bulk)”混合物中的细胞，但该方法仅允许有限地控制最终在小体积中的细胞数目，例如Koster等人，LabChip,8:1110-1115(2008)，因此通常起始群体中细胞的浓度越高，最终具有两个或更多细胞的小体积的数目就越大。由于成功的单细胞分析取决于每个反应体积中仅具有一个细胞，因此选择起始群体的非常低的细胞浓度以避免出现细胞双重体(doublets)。不幸的是，这在这样随机分离步骤的下游进行的分析中造成了显著的低效率。当细胞特异性条形码通过将携带细胞的液滴与携带也随机分布在液滴中的条形码编码的珠的液滴聚结而递送至细胞时，这个问题会加剧。因此，在细胞上直接合成独特的条形码的技术的可用性将消除将单个珠递送至单细胞的要求。
本发明的方法可以应用于宽范围的生物细胞，包括但不限于哺乳动物细胞、酵母细胞、细菌细胞、原生动物细胞、真菌细胞、植物细胞等。在一些实施方案中，本发明的方法应用于哺乳动物细胞。这样的哺乳动物细胞可以不含组织，例如白细胞，或者这样的细胞可以是已经分解的组织结合细胞。在活细胞上合成寡核苷酸期间，选择反应条件以使细胞维持在存活状态。这样的条件(本文有时称为“生物条件”或“存活条件”或“细胞存活条件”)包括将细胞设置和维持在反应混合物中，所述反应混合物包含允许跨细胞膜的渗透压平衡的生理盐溶液、6.8至7.8的范围内的pH和15℃至41℃的范围内的温度。在一些实施方案中，采用25℃至38℃的范围内的温度。生理盐溶液可以在水性溶剂中包括在0.8％-1.0％(w/v)的范围内的浓度的钠、钙和/或钾离子。例如，蒸馏水中0.9％(w/v)的氯化钠是常见的生理盐溶液。应当理解，这样的生理条件是平均的，并且在本发明的特定实施方式中，例如在去保护步骤中，可能存在与这样的条件的短暂偏差，而不会对细胞或生物分子造成显著损害。同样，应当理解，一些生物细胞，例如嗜热生物体可以在以上提及的那些条件之外的条件下存活。
将起始子附接至细胞。生成独特的细胞标记物的第一步是将起始子附接至靶群体的细胞上。这使用多种常规技术来实现，包括但不限于将起始子附接至对细胞表面标志物特异性的一种或更多种抗体上，将起始子整合到对细胞表面标志物特异性的适配体中，使用点击化学技术将起始子直接附接至细胞表面蛋白上，生成具有插入靶细胞的膜的5’-亲脂性尾的起始子。这样的标记技术的实例在以下参考文献中描述：Weber等人，Biomacromolecules,15:4621-4626(2014)；Borisenko等人，Nucleic Acids Research,37(4):e28(2009)；Sano等人，Science,258:120-122(1992)；Kazane等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,109(10):3731-3736(2012)；Nikic等人，Nature Protocols,10:780-791(2015)；Baskin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,104(43):16793-16797(2007)；Jewitt等人，Chem.Soc.Rev.,39(4):1272-1279(2010)；Li等人，Chem.Sci.,8:2107(2017)。
细胞的“拆分和混合”条形码编码。在一些实施方案中，本发明提供了用于对细胞进行独特条形码编码的方法，所述细胞是活细胞、固定细胞或固定且透化的细胞。例如，在测试或筛选化合物的生物作用，诸如基因表达的改变时，细胞群体已经被暴露于不同的剂或化合物。这样的细胞的样品可以在存活的情况下测试基因表达(例如细胞表面分子的基因表达)的改变，或者这样的细胞可以被固定且透化，并且测试细胞蛋白和mRNA二者的表达的改变。在一些实施方案中，蛋白表达可以使用一种或更多种蛋白特异性抗体来监测，每种抗体连接至不同的起始子，该起始子可以使用本发明的酶促合成方法延伸。在一些实施方案中，mRNA表达可以使用可以如图1B-图1C中描述的延伸的生成cDNA的mRNA特异性引物来监测。在合成条形码之后(无论在测试之前还是之后)，它们可以通过例如扩增、分离和测序来收获和被制成表，如图2B中针对抗体携带的条形码示出的。这样的测量类似于基于条形码亚单位杂交的更繁琐的条形码编码方案，例如在Nolan的美国专利公布2016/0251697中描述的。因此，在一些实施方案中，本发明可以用于测量大细胞群体的单细胞上的多于一个表位的分布。
类似于在以上描述的珠的情况下添加独特的细胞标签，本发明也可以用于在设置在平面表面上的组织切片中的基因表达的空间模式的情况下附接独特的位置标签，如图1F中示出的。将组织切片放置在寡核苷酸平面阵列上、鉴定和成像组织特征(诸如细胞边界)、使组织细胞透化、实现逆转录酶反应以产生附接至平面阵列的cDNA文库的程序公开于Stahl等人，Science,353:78-82(2016)；和Frisen等人，美国专利9593365和10030261；和类似的参考文献中，这些参考文献通过引入并入本文。简言之，参考图1F，提供了平面阵列(164)，该平面阵列(164)具有通过其5’末端附接的具有受控密度的寡核苷酸(180)的均匀涂层，其中寡核苷酸(以放大示图(165)示出)包含用于随后的cDNA扩增和操作的区段(166)诸如引物结合位点，包含分子标签的任选的区段(167)(有时称为“独特的分子标识符”或UMI)，其甚至在扩增之后也有助于cDNA分子的定量，以及其允许捕获从细胞释放的mRNA的区段(168)诸如聚T区段。UMI(167)可以包括随机核苷酸区段。寡核苷酸(180)可以使用常规技术批量制造，并且在单个步骤中应用于平面阵列(164)的表面。不需要不同种类的寡核苷酸，例如，具有不同位置标签的寡核苷酸。区段(167)还可以包括可裂解接头或可裂解核苷酸，用于释放cDNA进行分析，诸如通过测序进行分析。在阵列(164)上设置组织的切片或薄层(181)(例如100-1000μm厚)，然后对其进行处理(169)(i)以鉴定感兴趣的特征，诸如细胞或子组织，并且记录和/或将这样的信息与平面阵列(164)上的位置相关联，和(ii)使组织中的细胞透化，使得mRNA被释放并允许扩散至寡核苷酸并且被寡核苷酸(180)捕获。使用图像信息定义阵列(164)上的区域，在这些区域中，在cDNA上合成共同位置标签。处理可以包括用组织特异性或生物分子特异性化合物或染料染色。位置标签允许批量收获cDNA并测序，但是通过它们的位置标签与特定区域相关联。在以上步骤(i)和(ii)之后，应用逆转录酶反应的试剂，以便使用捕获的mRNA(170)作为模板合成cDNA(171)，以产生空间cDNA文库阵列。然后取出组织切片(181)，留下阵列(164)，其表面附接有不同cDNA的模式。不同位置处的不同cDNA可以通过喷墨递送用于标签的合成试剂，将位置标签附接至来自多于一个位置的cDNA样品来鉴定和定量，这在图1E中通过合成位置(182)在cDNA模式(175)上的叠加来示出。在一些实施方案中，这样的多于一个位置可以是至少100个位置，或至少1000个位置，或至少10,000个位置；在其他实施方法中，这样的多于一个位置可以在10个至50,000个位置；或10个至10,000个位置；或10个到至1000个位置的范围内。喷墨递送系统的设计和控制的指导是本领域技术人员熟知的，并且可以见于美国专利公布US2003/0170698和美国专利6306599；6323043；7276336；7534561；以及类似的参考文献中。可选地，可以采用电极阵列，其中合成步骤，诸如电化学敏感的保护基团，例如3’-O-叠氮甲基的去保护，可以通过改变阵列中电极的电势来实现，例如Montgomery，美国专利6093302、6444111和6280595；Gindilis，美国专利9339782；Maurer等人，美国专利9267213；Maurer等人，PLosOne，December 2006，第1期，e34；Fomina等人，LabChip，16:2236-2244(2016)；Kavusi等人，美国专利9075041；Johnson等人，美国专利9874538和9910008；Gordon等人，美国专利6251595；Levine等人,IEEE J.Solid State Circuits,43:1859-1871(2008)；等。
选择位置标签(173)(例如足够长)以独特地鉴定每个感兴趣的位置或区域。可以添加另外的区段(174)以有助于对cDNA(171)的操作和测序。在一些实施方案中，本发明的这种应用可以通过以下步骤来进行：(a)提供包含捕获探针的均匀涂层的阵列，每个捕获探针包含捕获区段；(b)使组织样品与阵列接触，并且允许组织样品的核酸与捕获探针的捕获结构域相互作用，使得核酸被捕获；(c)处理组织样品以鉴定组织样品的不同区域；(d)由与捕获结构域相互作用的核酸产生核酸分子；(e)在核酸分子上酶促合成位置标签；(f)确定与和捕获结构域相互作用的核酸相关的区域；和(e)将所确定的区域与cDNA相关联。在一些实施方案中，来自组织样品的核酸分子是RNA。在其他实施方案中，来自组织样品的核酸分子可以是基因组DNA。在其他实施方案中，来自组织样品的核酸分子可以是mRNA。
类似地，如图1G中示出的，组织样品中的蛋白的空间分布可以通过使用具有可释放寡核苷酸条形码的抗体来鉴定，所述可释放寡核苷酸条形码包含聚A区域和抗体识别区域，即识别抗体对其是特异性的蛋白的抗体条形码。在一些实施方案中，抗体可以携带两个标签；如以上描述的抗体条形码和荧光标记物(所述荧光标记物将有助于组织的光学分析以及随后抗体位置与感兴趣的组织结构或蛋白分布相关联)。如以上，提供了具有通过其5’末端附接的寡核苷酸(1180)的均匀涂层的平面阵列(1164)，其中寡核苷酸(以放大图(1165)示出)任选地包含用于随后的抗体条形码扩增和操作的区段(1166)诸如引物结合位点，包含分子标签的任选区段(1167)(有时称为“独特的分子标识符”或UMI)，其甚至在扩增之后也有助于抗体分子的定量，以及允许捕获从结合的抗体释放的抗体条形码(1183)(SEQID NO:18)的区段(1168)诸如聚T区段。释放可以通过抗体条形码与抗体之间的接头中的化学不稳定键，诸如二硫键部分来实现。UMI(1167)可以包括随机核苷酸区段。不需要不同种类的寡核苷酸，例如，具有不同位置标签的寡核苷酸，因为它们随后使用本发明的方法合成。区段(1164)还可以包括可裂解接头或可裂解核苷酸，用于释放抗体条形码进行分析，诸如通过测序进行分析。在阵列(1164)上设置组织的切片或薄层(1181)(例如100-1000μm厚)，然后对其进行处理(1169)(i)以鉴定感兴趣的特征，诸如细胞或子组织，并且记录和/或将这样的信息与平面阵列(1164)上的位置相关联，和(ii)使组织中的细胞透化，使得抗体可以接近靶蛋白并且使得释放的抗体条形码可以扩散至寡核苷酸并且被寡核苷酸(1180)捕获。使用图像信息定义阵列(1164)上的区域，在这些区域中，在抗体条形码上合成共同位置标签。如以上，位置标签允许批量收获抗体条形码并测序，但是通过它们的位置标签与特定区域相关联。在以上步骤(i)和(ii)之后，应用逆转录酶反应的试剂，以便使用捕获的抗体条形码(1170)作为模板，合成抗体条形码(1171)的互补物，正如以上的mRNA那样。然后取出组织切片(1181)，留下表面附接有不同的cDNA模式的阵列(1164)。不同位置处的不同cDNA可以通过喷墨递送用于位置标签的合成试剂将位置标签附接至来自常规位置的抗体条形码的样品来鉴定和定量。与cDNA一样，选择抗体条形码上的位置标签(1173)(例如，足够长)来独特地鉴定每个感兴趣的位置或区域。
类似地，如图1H中示出的，组织切片中的基因表达和蛋白分布的空间模式可以通过使用平面阵列来鉴定，所述平面阵列包括寡核苷酸和具有标识符(即鉴定抗体对其是特异性的蛋白的抗体特异性DNA序列)的DNA标记的抗体的组合。简言之，参考图1H，提供了平面阵列(3164)，所述平面阵列(3164)具有通过其5’末端附接的寡核苷酸(3180)的均匀涂层，以及抗体(3191)的均匀涂层，所述抗体(3191)的均匀涂层包括可以附接至抗体(3191)的一个或更多个氨基酸的DNA标记物(3190)。控制平面阵列(3164)上每种寡核苷酸(3180)和抗体(3191)的密度，使得寡核苷酸的密度是预定的，并且每种抗体(即具有不同特异性的抗体)的密度是预定的。如以上，寡核苷酸(3180)(以放大图(3165)示出)包含用于随后的cDNA扩增和操作的区段(3166)诸如引物结合位点，包含分子标签的任选区段(3167)(有时称为“独特的分子标识符”或UMI)，所述分子标签甚至在扩增之后也促进cDNA分子的定量，以及允许捕获从细胞释放的mRNA的区段(3168)诸如聚T区段。UMI(3167)可以包括随机核苷酸区段。抗体(3191)(以放大图(3165)示出)包含DNA标记物(3190)(附接至抗体的一个或更多个氨基酸)和包含鉴定抗体对其是特异性的蛋白的序列标识符的区段(3192)。在阵列(3164)上设置组织的切片或薄层(3181)(例如100-1000μm厚)，然后对其进行处理(3169)(i)以鉴定感兴趣的特征，诸如细胞或子组织，并且记录和/或将这样的信息与平面阵列(3164)上的位置相关联，和(ii)使组织中的细胞透化，使得mRNA和蛋白被释放并允许扩散至寡核苷酸和抗体(分别为3180和3191)并且被寡核苷酸和抗体(分别为3180和3191)捕获。可以使用图像信息定义阵列(3164)上的区域，在这些区域中，在cDNA或抗体DNA上合成共同位置标签。处理可以包括用组织特异性或生物分子特异性化合物或染料染色。位置标签允许批量收获cDNA和附接至抗体的DNA并测序，但是通过它们的位置标签与组织的特定区域相关联。在以上步骤(i)和(ii)之后，应用逆转录酶反应的试剂，以便使用捕获的mRNA(3170)作为模板合成cDNA(3171)。将结合至与固定抗体(3192)相同的分子(3193)的二级抗体(3197)应用于阵列，以便形成捕获夹心(如在夹心ELISA测定中)。二级抗体(3197)包括附接至一个或更多个氨基酸的DNA标记物(3194)和包含序列标识符的区段(3195)，该序列标识符鉴定抗体对其是特异性的蛋白。固定抗体(3191)的标识符区段(3192)和二级抗体的标识符区段(3195)可以相同或不同，但是与识别相同蛋白(3193)的抗体对相关并对其进行鉴定。此外，固定抗体的DNA标记物(3190)和二级抗体的DNA标记物(3194)的3’区域是互补的，以便在聚合酶延长步骤期间合成DNA抗体链(3196)。然后取出组织切片(3181)，留下表面附接有不同的cDNA和抗体DNA的模式的阵列(3164)。不同位置处的不同cDNA和抗体DNA可以通过喷墨递送合成试剂将位置标签(3173)和操作区段(3174)附接至来自常规位置的cDNA和抗体DNA的样品来鉴定和定量。
图1I示出了用于将分析聚焦在特别感兴趣的阵列(164)的特定表面区域(即，子区域)上的实施方案。在遵循通过图1F描述的程序之后，第一次(pass)测序分析(4169)可以揭示感兴趣的特定表面区域(4172)将需要更好的空间测序分辨率。使用同一阵列但具有偏移间距的合成试剂的第二次喷墨递送(4170)用于在未被初始合成位置(4182)加标签的区域中生成另外的合成位置(4183)。在这个另外的加标签步骤期间，合成了与初始位置标签(4173)相比的不同位置标签(4175)。可以添加另外的区段(4174和4176)以促进DNA的操作和测序。有趣的是，在同一阵列(4171)上合成试剂的随后次的喷墨递送可以通过增加测序的空间分辨率来进行以进一步改进分析。此外，这种聚焦分析方法可以同样好地应用于寡核苷酸阵列(图1F)或寡核苷酸和抗体阵列(图1H)。
尽管图1F-图1I需要使用附接至固体表面的捕获寡核苷酸阵列，但是本发明的方法允许在组织上直接合成，而不一定要求感兴趣的分析物(例如，mRNA或抗体条形码)扩散至附接至阵列的捕获探针并被捕获。在一些实施方案中，位置标签的合成可以在有或没有预先透化的情况下直接在组织切片上进行。通过实例的方式，这样的实施方案可以在以下步骤中实现：(a)将多于一种抗体在结合条件下设置在组织切片上，每种抗体能够特异性结合至多于一种蛋白中不同的一种，每种不同的抗体具有可释放地附接的抗体条形码，该抗体条形码包含具有游离3’-羟基的起始子；(b)在组织切片上的预定位置处重复多于一个循环的以下步骤：(i)使具有游离3’-O-羟基的起始子或延长的片段与3’-O-封闭的核苷三磷酸和不依赖模板的DNA聚合酶接触，使得起始子或延长的片段通过掺入3’-O-封闭的核苷三磷酸延长以形成3’-O-封闭的延长的片段，和(ii)使延长的片段酶促去封闭以形成具有游离3’-羟基的延长的片段，从而在每个不同位置处的可释放附接的抗体条形码上合成不同位置标签，以形成位置标签-抗体条形码缀合物；(c)释放位置标签-抗体条形码缀合物；以及(d)对释放的位置标签-抗体条形码缀合物进行测序，以确定组织切片中多于一种蛋白的空间分布。在一些实施方案中，可以包括使组织切片的细胞透化的步骤，以使细胞内蛋白靶暴露或在细胞内mRNA上直接合成位置标签。
图1F-图1I中描述的实施方案可以通过以下步骤实现：(a)从设置在固体表面上的组织切片捕获生物分子，其中每个生物分子包含或可以被修饰以包含鉴定所捕获的生物分子并具有游离3’-羟基的寡核苷酸；(b)在固体表面上的多于一个不同位置处的寡核苷酸的游离3’-羟基上通过无模板酶促合成来合成位置标签；和(c)将寡核苷酸测序以确定生物分子在组织切片中的空间分布。在一些实施方案中，释放寡核苷酸的另外的步骤使用例如在以上引用的参考文献中描述的常规连接化学和方案来实现。在一些实施方案中，生物分子是多核苷酸，诸如mRNA、RNA、抗体条形码、蛋白等。生物分子可以被附接至固体表面的互补寡核苷酸或附接至固体表面的抗体捕获。在后一种情况下，在捕获蛋白生物分子之后，可以将抗体结合对(诸如在ELISA中使用的)应用于固体表面。在一些实施方案中，结合对的一种或两种抗体可以具有可以合成位置标签的寡核苷酸条形码。
图2A-图2D示出了实施方案的以上概念，其中选择的蛋白(或表位)的表达使用特异性抗体结合化合物测量，并且所有或选择的基因的表达使用对所有mRNA或选择的mRNA特异性的引物测量。在这两类探针中，附接的寡核苷酸标记物可以鉴定它特异性结合的化合物，以及用作酶促合成的起始子。图2A示出了用于实现“拆分和混合”标签合成过程的实施方案。存活细胞群体(200)与一组抗体(204)组合，每种抗体都用寡核苷酸(202)标记，寡核苷酸(202)既能鉴定抗体(并且因此也能鉴定其靶蛋白)，又能用作起始子。将细胞(200)在共同容器(206)中组合，并且然后分布(通常以相等的部分)至多孔阵列(212)，并且进入四个孔210a-210d中的一个孔中，其中进行一个酶促延长循环，例如，210a中的一个A延伸，210b中的一个G延伸，210c中的一个C延伸，和210d中的一个T延伸。在使添加的核苷酸去封闭之后，收获细胞(200)，并且在共同容器(206)中再次组合。随着每次核苷酸添加，产生长度增加的随机核苷酸标签，使得随着n次添加，生成4n个标签。为了使对细胞的操作和可能的损伤最小化，如果群体(200)的大小是已知的，那么循环的次数可以被限制为确保细胞具有独特标签的高概率但使细胞损伤或损失最小化的次数。例如，如果群体(200)由106个细胞组成，那么10-11个循环产生1-4×106种独特的标签。在一些实施方案中，实施许多个循环以确保每个细胞以99％或更高的概率携带独特的寡核苷酸标签。在一些实施方案中，在实施了许多个循环以基本上给予所有细胞独特的寡核苷酸标签(218)后，然后可以收获标签并通过大规模测序进行分析(并且例如，可以将每个细胞中每种蛋白和每种基因的表达制成表)。如图2B中示出的，附接至抗体或引物的初始寡核苷酸可以包括用于分子操作的其他区段。例如，抗体(230)上的寡核苷酸(232)可以包含区段(234)，该区段(234)可以包括用于鉴定抗体(230)特异性的代码以及用于随后操作(诸如用于PCR扩增)的另外的序列。寡核苷酸(232)还包含具有游离3’-羟基的区段(236)，该区段(236)用作用于核苷酸添加的初始循环的起始子。在对附接的标签核苷酸(238和239)进行许多个循环之后，可以在没有拆分或混合的情况下添加另外的核苷酸，以便附接共同区段(235)，例如引物序列，以允许操作和分析标签和蛋白或基因鉴定序列。在一些实施方案中，这可以通过扩增附接的寡核苷酸以形成扩增子(233)来完成，然后可以通过高通量DNA测序来分析(231)扩增子(233)。
如以上提及的，细胞可以用类似的随机条形码标记，该随机条形码不是由随机核苷酸序列组成，而是由随机均聚物区段序列组成，其中每个均聚物区段包含与最近邻均聚物区段不同种类的核苷酸。这样的条形码编码方案的优点是不必使用3’-封闭的dNTP；因此，不需要去封闭步骤，这使得合成过程更简单，并且对细胞的存活力的潜在损伤更小。这样的条形码中使用的均聚物区段的长度可以广泛不同。在一些实施方案中，选择包括反应持续时间的条件，使得均聚物区段的平均长度在1个至100个核苷酸的范围内；在其他实施方案中，均聚物区段的平均长度在1个至25个核苷酸的范围内；并且在仍其他实施方案中，均聚物区段的平均长度在1个至10个核苷酸的范围内。
与本发明一起使用的结合化合物可以包括各种各样的组合物，所述组合物特异性结合至预定细胞成分，并且可以附接用于生成鉴定寡核苷酸的起始子。图2C和图2D示出了可以与存活细胞(图2C)和与已经固定且透化以允许接近细胞内成分的细胞(图2D)一起使用的不同类型的结合化合物的范围。通常存活细胞中只有暴露于细胞外环境的细胞抗原和/或成分是可接近的(240)。因此，在一些实施方案中，结合化合物包括用如以上描述的起始子寡核苷酸(242)或膜探针(244)标记的抗体结合化合物，该抗体对预定细胞表面蛋白(例如243a、243b、243c)是特异性的，该膜探针(244)包括插入细胞表面膜(245)的膜特异性组分(248)诸如亲脂性部分和起始子寡核苷酸(246)。如图2D中示出的，固定且透化的细胞(280)通过透化步骤中产生的孔(281)提供对细胞内RNA(286)和细胞内蛋白质(284)的接近，所述细胞内RNA(286)和细胞内蛋白质(284)可以分别被包括杂交探针的结合化合物(例如285)和抗体结合化合物(287)靶向。在一些实施方案中，结合化合物可以包括基因组DNA的杂交探针。
在一些实施方案中，将具有游离3’-羟基的起始子寡核苷酸通过使用常规技术(例如，如以下参考文献中公开的)用亲脂性部分衍生化起始子寡核苷酸的5’末端稳定地插入到靶细胞的细胞表面膜中：Weber等人，Biomacromolecules,15:4621-4626(2014)；Bunge等人，Langmuir,23(8):4455-4464(2007)；Borjesson等人，J.Amer.Chem.Soc.,131(8):2831-2839(2009)；Bunge等人，J.Phys.Chem.B,113(51):16425-16434(2009)；以及类似的文献。特别感兴趣的是Weber(以上引用)公开的技术，该技术需要插入互补的寡核苷酸对，每对寡核苷酸对用亲脂性部分将该对的一种寡核苷酸在其5’末端(较长的起始子寡核苷酸)上并且另一种寡核苷酸在其3’末端(较短的支持寡核苷酸)上进行衍生化。杂交对在细胞膜中非常稳定，这将使合成期间的损失最小化。
如图3A中示出的，在一些实施方案中，起始子寡核苷酸(300)包含具有游离3’羟基的寡核苷酸(302)和5’末端处的亲脂性部分(304)。这样的起始子能够稳定地插入到细胞表面膜的脂双层中，游离3’-羟基可用于延伸。将起始子寡核苷酸(300)与靶细胞(306)在允许起始子寡核苷酸(300)通过其亲脂性部分插入(310)细胞表面膜(312)使得寡核苷酸的游离3’-羟基可用于合成的条件(308)下组合。然后细胞(314)可以通过本发明的方法经历起始子的酶促延伸(310)。
在一些实施方案中，起始子的酶促延伸(310)可以用于通过“拆分和混合”合成策略在细胞(314)上生成独特的细胞特异性条形码，如图3B中示出的。将具有起始子的细胞汇集在容器(322)中，之后进行连续循环的核苷酸添加。将容器(322)中的细胞分布(323)在四个反应室(324a-324d)中，其中将3’-O-封闭的dA、dG、dC或dT分别添加至附接的起始子的游离3’-羟基，之后使这样添加的核苷酸去封闭，使其为下一个添加循环做准备。在一些实施方案中，将容器(322)中的细胞在反应室之间均等分布；然而，在替代实施方案中，容器(322)中的细胞可以在反应容器(234a-324d)之间不均等地分布，以偏向在特定位置处出现核苷酸。在其他实施方案中，可以在反应室(324a-324d)中进行多于一个添加循环，从而例如添加两个或更多个核苷酸。反应室(324a-324d)在固体结构(326)中以孔图示，但是它们可以包括单独的反应容器，诸如单独的反应管。在一些实施方案中，反应室(324a-324d)可以包括24孔、48孔、96孔、384孔或1536孔的常规微孔板中的孔。在更大容量的微孔板(例如96孔)中，可以并行进行多种合成，例如，同时对多个样品进行条形码编码和分析。在一些实施方案中，在核苷酸添加和去保护的循环之后，将室(324a-324d)中的细胞混合(328)，使得在下一个核苷酸添加步骤中，混合物中的每个细胞具有均等的添加A、C、G或T的概率。在这样的实施方案中，通过这样的“拆分和混合”步骤，可以在锚定在细胞膜中的起始子上生成独特的随机序列寡核苷酸。这种“拆分和混合”步骤可以继续(330)，直至添加的随机序列寡核苷酸足够长，以使容器(322)中群体的每个细胞与独特的序列缔合。在一些实施方案中，在形成独特的条形码之后(332)，可以在没有拆分和混合的情况下合成共同序列的另外的核苷酸。这样的共同序列可以包括引物结合位点等，用于操作或扩增条形码以用于随后分析。然后所得的条形码编码的细胞(336)可以用于应用，诸如单细胞转录物组分析，如图3C中示出的。用基于珠的条形码编码进行大规模单细胞转录物组分析的指南公开于以下参考文献中：Kolodziejczyk等人，Molecular Cell,58:610-620(2015)；Saliba等人，NucleicAcids Research,42(14):8845-8860(2014)；Church等人，美国专利公布3013/0274117；Macosko等人，Cell,161:1202-1214(2015)；Klein等人，Cell,161:1187-1201(2015)；等。通常，技术包括以下步骤：(i)捕获或分离单细胞，(ii)将单细胞裂解，(iii)将RNA逆转录以制备cDNA，(iv)将cDNA扩增，以及(v)测序。这样的技术还可以包括将细胞特异性条形码附接至cDNA的步骤，特别地通过生成包含单细胞和单个携带条形码的珠的液滴。
在一些实施方案中，可以在存活细胞上通过附接包含均聚物区段的序列的标签来合成独特的寡核苷酸标签。在一些实施方案中，本发明涉及在存活细胞上合成寡核苷酸条形码的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供具有游离3’-羟基的起始子，所述起始子被附接至细胞的细胞表面分子或被锚定在细胞的细胞表面膜中；(b)在生物条件下重复多于一个循环的以下步骤：在延长条件下使具有游离3’-O-羟基的起始子或延长的片段与核苷三磷酸和不依赖模板的DNA聚合酶接触，使得起始子或延长的片段通过均聚物区段延长以形成具有游离3’-羟基的延长的片段，其中在第一步之后的每个步骤中添加的核苷三磷酸的种类与前一步骤(the immediately preceding step)中的种类不同。在一些实施方案中，每个循环还包括去除未掺入的核苷三磷酸的步骤。在一些实施方案中，延长条件包括产生具有在1个至100个核苷酸的范围内的平均长度的均聚物区段的所述核苷三磷酸的浓度、温度和反应时间。在一些实施方案中，包含均聚物区段的独特寡核苷酸标签使用拆分-和-混合(split-and-mix)程序产生。
单细胞分析
在本发明的一些实施方案中，来自群体的细胞被设置在各自包含单个细胞的反应器中。这可以通过本领域已知的各种大规模单细胞反应器平台来实现，例如Clarke等人，美国专利公布2010/0255471；Mathies等人，美国专利公布2010/0285975；Edd等人，美国专利公布2010/0021984；Colston等人，美国专利公布2010/0173394；Love等人，国际专利公布WO2009/145925；Muraguchi等人，美国专利公布2009/0181859；Novak等人，Angew.Chem.Int.编辑，50:390-395(2011)；Chen等人，Biomed Microdevices,11:1223-1231(2009)；等，所述文献通过引用并入本文。在一方面，将细胞设置在微孔阵列的孔中，在那里发生反应，诸如PCA反应；在另一方面，将细胞设置在油包水乳液的胶束中，在那里胶束充当反应器。由微流体装置生成的胶束反应器，例如Mathies等人(以上引用的)或Edd等人(以上引用的)，是特别令人感兴趣的，因为与主体乳化过程相比，均匀尺寸的胶束可以在细胞上用较低的剪切和应力生成。用于乳化的组合物和技术，包括在胶束中进行扩增反应，诸如PCR，见于以下参考文献中，所述参考文献通过引用并入本文：Becher,“Emulsions:Theory and Practice,”(Oxford University Press,2001)；Griffiths和Tawfik，美国专利第6,489,103号；Tawfik和Griffiths,Nature Biotechnology,16:652-656(1998)；Nakano等人，J.Biotechnology,102:117-124(2003)；Dressman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,100:8817-8822(2003)；Dressman等人，美国专利第8,048,627号；Berka等人，美国专利第7,842,457号和第8,012,690号；Diehl等人，Nature Methods,3:551-559(2006)；Williams等人，Nature Methods,3:545-550(2006)；Zeng等人，AnalyticalChemistry,82(8):3183-3190(2010)；Micellula DNA Emulsion&Purification Kitinstructions(EURx,Gdansk,Poland,2011)；等。在一种实施方案中，将均质序列标签(homogeneous sequence tag)(例如珠)和反应混合物的混合物逐滴添加到生物相容性油(例如，轻质矿物油，Sigma)的旋转混合物中，并且允许乳化。在另一种实施方案中，将均质序列标签和反应混合物逐滴添加到生物相容性油的错流中。所使用的油可以补充有一种或更多种生物相容性乳液稳定剂。这些乳液稳定剂可以包括Atlox4912、Span 80和其他公认的和商购可得的合适稳定剂。在一些实施方案中，乳液是热稳定的，以允许热循环，例如，至至少94℃、至少95℃或至少96℃。在一些实施方案中，形成的液滴的尺寸范围为约5微米至约500微米。在一些实施方案中，液滴在约10微米至约350微米、或约50微米至250微米、或约100微米至约200微米的范围内形成。有利地，错流流体混合允许控制液滴形成和液滴尺寸的均匀性。
在一些实施方案中，产生具有均匀的体积分布的胶束，使得在这样的反应器中可用的试剂产生类似扩增的靶核酸和序列标签。即，广泛不同的反应器体积，例如胶束体积，可能导致扩增失败和/或广泛不同的扩增程度。这样的失败和变异将妨碍或增加对群体中单独细胞中的靶核酸例如基因表达差异进行定量比较的难度。在一方面，产生具有30％或更少的变异系数(CV)的体积分布的胶束。在一些实施方案中，胶束具有20％或更少的CV的体积分布。
样品细胞和均质序列标签可以悬浮在反应混合物中，然后设置到反应器中。在一方面，反应混合物是PCA反应混合物，并且基本上与PCR反应混合物相同，具有至少一对内部(或连接)引物和至少一对外部引物。反应混合物可以包含一种或更多种任选的组分，包括但不限于热稳定限制性内切核酸酶；一种或更多种蛋白酶抑制剂；促进分离细胞靶核酸释放的裂解剂，例如Brown等人，Interface,5:S131-S138(2008)；等。在一些实施方案中，裂解细胞的步骤可以通过在进行扩增反应之前，在非离子去污剂例如0.1％Tween X-100存在的情况下将细胞加热至95℃或以上的温度持续一定时间段来完成。在一种实施方案中，这样的升高温度的时间段可以是10-20分钟。可选地，裂解细胞的步骤可以通过在非离子去污剂例如0.1％Tween X-100存在的情况下的一个或更多个加热和冷却循环，例如96℃持续15min，随后10℃持续10min来完成。在一些实施方案中，将胶束反应器在微流体装置中生成和分选，如下文更全面描述的。
单细胞转录物组分析
在图3C中，对于一些实施方案，条形码编码的细胞(340)可以使用基于液滴的微流体装置(345)制备用于转录物组分析，该微流体装置(345)将条形码编码的单细胞封装到水性胶束中，并且将含细胞的胶束与一系列含试剂的胶束聚结以用于构建cDNA文库。可选地，含细胞的胶束可以使用非微流体方法，诸如在Abate等人，国际专利公布WO2019/139650中公开的方法产生，并且试剂可以被递送至这样的胶束中。在其细胞表面膜中嵌入了起始子-条形码缀合物(344)的细胞(340)被设置在水性溶液(342)中的室(343)中，水性溶液(342)可以具有维持细胞完整性的pH、盐浓度和其他必要成分。细胞(340)和水性溶液(342)从室(343)通过通路(351)被驱入汇合处(junction)(353)，在汇合处，汇合的油流(oil flow)(350)引起水性胶束(346)的形成，其中一些包含单细胞。这样的基于液滴的微流体装置可以使用熟知的设计和技术来构建。例如，以下参考文献为这样的微流体装置的设计和实施提供了指导：Zare等人，Ann.Rev.Biomed.Eng.,12:187-201(2010)；Link，美国专利公布2012/0309002；Shapiro等人，Nature Reviews Genetics,14:618-630(2013)；Kim等人，Anal.Chem.,90:1273-1279(2018)；Abate等人，美国专利公布2017/0009274；Zagnoni等人，第2章，Methods in Cell Biology,102:25-48(2011)；Zheng等人，Nature Comm.,8:14049(2016)；Link等人，美国专利公布2008/0014589；等。
使含细胞的胶束(346)在汇合处(352)处与油流(354)中的试剂胶束(348)聚结。试剂胶束(348)包含裂解试剂，用于分解细胞表面膜以使mRNA暴露用于转录和扩增。这样聚结的结果是胶束(356)，其在流过通路(360)期间孵育，通路(360)的长度被设计为提供足够的通过时间，以使胶束(348)携带的裂解试剂完成细胞的裂解，并且产生准备用于逆转录和扩增的细胞裂解物(358)。裂解试剂描述于以下参考文献中：Tang等人，Nature Protocol,5(3):doi:10.1038/nprot.2009.236；Thronhill等人，Prenatal Diagnosis,21:490-497(2001)；Kim等人，Fertility和Sterility,92:814-818(2009)；等。用于与PCA反应一起使用的示例性裂解条件如下：1)细胞在H2O中在96℃持续15min，随后在10℃持续15min；2)200mMKOH，50mM二硫苏糖醇，加热至65℃持续10min；3)对于4μL基于蛋白酶的裂解缓冲液：将1μL的17μMSDS与3μL的125μg/mL蛋白酶K组合，随后在37℃孵育60min，然后在95℃持续15min(使蛋白酶K失活)；4)对于10μL基于去污剂的裂解缓冲液：2μL H2O、2μL 250ng/μL聚A、2μL10mM EDTA、2μL 250mM二硫苏糖醇、2μL 0.5％N-月桂基肌氨酸盐溶液。单细胞分析平台、孵育时间、裂解缓冲液和/或PCA反应其他组分、它们的浓度、反应体积等是本领域普通技术人员针对特定应用而优化的设计选择。在一种实施方案中，采用了由Kim等人，Anal.Chem.,90:1273-1279(2018)公开的碱性裂解缓冲液。这样的缓冲液包含20mM NaOH、60％(v/v)PeG-200和2％(v/v)Triton X-100，并且可以通过RT-PCR试剂的缓冲能力来中和。
在裂解之后，胶束(358)中的细胞裂解物在汇合处(368)处与来自油流(364)的试剂胶束(362)聚结。试剂胶束包含逆转录酶和PCR反应组分。在一些实施方案中，这样的组分可以包含来自商业RT-PCR试剂盒，例如，ThermoFisher Invitrogen SuperScript IV One-Step RT-PCR系统的成分。在一些实施方案中，这样的组分可以包括模板转换转录组分，例如Trombetta等人，Curr.Protocol Mol.Biol.,107:4.22.1-4.22.17(2014)。在聚结之后，将液滴收集在温度控制装置，诸如热循环仪中，该装置允许逆转录酶的热变性以及cDNA和条形码的随后PCR。逆转录反应的不同实施方案示于图4A和4B中。在图4A中，聚T引物(402)与mRNA(400)退火并延伸(406)以形成第一DNA链(405)(SEQ ID NO:17)。在去除mRNA模板(400)之后，基因特异性引物(408)被退火并延伸以完成cDNA。引物(408)可以包含5’尾(410)，其包括共同序列，诸如引物结合位点，用于随后的操作和测序准备。在图4B中，示出了可以用于产生单细胞cDNA文库的模板转换方案，例如，Zhu等人，Biotechniques,30(4):892-897(2001)。模板(422)与mRNA(420)退火，并且用逆转录酶诸如MMLV延伸(424)，在到达RNA模板的末端之后，在第一cDNA链的3’末端无模板添加选择的核苷酸(426)。这允许衔接子((428)退火至无模板添加物，并且延伸(432)以产生第二链来完成cDNA(430)。衔接子(428)的5’区段可以被设计为包括用于随后扩增和高通量测序准备的共同序列。
在一些实施方案中，在模板转换逆转录之后，在每个胶束中进行聚合酶循环组装反应。聚合酶循环组装(PCA)反应允许多于一个核酸片段在片段退火和聚合酶延伸的一个或更多个循环中融合在一起形成单个融合产物，例如Xiong等人，FEBS Micro biol.Rev.,32:522-540(2008)。PCA反应以许多形式发生。在一种感兴趣的形式中，PCA遵循在共同反应体积中发生的多于一个聚合酶链式反应(PCR)，其中每个组成PCR包括至少一个连接引物，该连接引物允许来自所得扩增子的链退火至来自反应中的另一扩增子的链并延伸形成融合产物或融合产物的前体。多种形式的PCA(以及不同的替代名称)是熟知的片段组装和基因合成方法，其几种形式公开于以下参考文献中：Yon等人，Nucleic Acids Research,17:4895(1989)；Chen等人，J.Am.Chem.Soc.,116:8799-8800(1994)；Stemmer等人，Gene,164:49-53(1995)；Hoover等人，Nucleic Acids Research,30:c43(2002)；Xiong等人，Biotechnology Advances,26:121-134(2008)；Xiong等人，FEBS Microbiol.Rev.,32:522-540(2008)；等。
图4C示出了使用PCA将相同的细胞特异性条形码附接至每个cDNA。“X”DNA(462)可以是侧翼为引物结合位点的酶促合成的条形码序列。引物(470)和(471)分别与条形码和cDNA上的共同序列退火，并且它们具有互补的5’尾。
将多种不同的靶核酸，诸如cDNA(460)，g1、g2、...gn，连接至相同的条形码核酸X(462)以形成(464)多于一个融合产物X-g1、X-g2、X-gK(566)。在一些实施方案中，这样的多于一个融合产物在2与10000之间；并且在另一种实施方案中，它在2与1000之间；在另一种实施方案中，它在2与100之间。在这些实施方案的PCA反应中，内部引物(468)的浓度可以大于多种gi核酸的内部引物(例如471)的浓度，使得存在足够量的X扩增子与gi扩增子的许多链退火。根据本发明的方法，可以从聚结胶束的反应混合物中提取融合产物(466)并测序。
在一些实施方案中，用于生成具有细胞特异性条形码的cDNA文库的方法可以包括以下步骤：(a)在群体的每个细胞上合成独特的寡核苷酸条形码以形成条形码编码的细胞群体；(b)将条形码编码的细胞设置在多于一个反应器中，每个反应器在聚合酶循环组装(PCA)反应混合物中包含单个条形码编码的细胞，其中PCA反应混合物包含一对外部引物和一对或更多对连接引物，该连接引物对条形码编码的细胞和寡核苷酸条形码中的多于一个靶核酸是特异性的；(c)在反应器中进行PCA反应，使得在反应器中形成靶核酸和寡核苷酸条形码的融合产物；和(d)对来自反应器的融合产物进行测序，以鉴定群体中每个细胞的靶核酸。
单细胞转录物组分析的替代应用示于图5中。在该实施方案中，将细胞(没有条形码)(502)与聚T珠(也没有条形码)(504)混合，并且设置在微流体装置(508)的室(500)的水性混合物中。如以上提及的，也可以应用不依赖于微流体装置的方法，例如，Abate等人，国际专利公布WO2019/139650。水性混合物被迫通过通路(506)在汇合(510)处进入油流(512)，使得形成水性液滴，其中一些(516)包含一个细胞(517a)和一个珠(517b)。然后，这样的液滴在汇合(520)处与包含细胞裂解试剂的液滴(518)聚结，形成液滴(522)，在液滴(522)中，细胞被裂解，释放聚A RNA，聚A RNA退火至附接至珠(517b)的聚T引物。在适当的孵育以释放期望的细胞成分(诸如mRNA)之后，然后包含裂解物的液滴在汇合(530)处与包含逆转录酶试剂(诸如逆转录酶、适当的盐和缓冲液系统)的液滴(528)聚结，所述缓冲液系统可以抵消或改变由裂解反应施加的条件(例如高pH)。收集(532)所得液滴(531)，并且孵育，使得聚A RNA退火至珠(517b)的聚T引物，并且用作聚T区段逆转录酶延伸的模板，以形成共价附接至珠(517b)的单细胞cDNA文库。然后可以从液滴中收集珠(517b)，并且将珠组合并经历“拆分和混合”合成，以添加独特的条形码和另外的序列，诸如引物结合位点，用于如以上描述的随后操作，诸如复制和准备高通量测序。
显然，可以采用许多其他微流体装置配置来产生包含单细胞和预定数目的均质序列标签(例如，一个均质序列标签、两个均质序列标签)的胶束，或者通过选择性聚结胶束、通过电穿孔等来选择性地向胶束添加试剂，例如Zagoni等人，第2章，Methods of CellBiology,102:25-48(2011)；Brouzes，第10章，Methods of Cell Biology,102:105-139(2011)；Wiklund等人，第14章，Methods of Cell Biology,102:177-196(2011)；Le Gac等人，第7章，Methods of Molecular Biology,853:65-82(2012)；等。
使细胞或组织固定和透化
在一些实施方案中，与包含核酸杂交探针的结合化合物和/或蛋白特异性结合化合物偶联的起始子可以被导向细胞内靶，诸如细胞内蛋白、信使RNA和/或基因组DNA。在一些实施方案中，使细胞固定和透化，以应用对这样的细胞内靶特异性的结合化合物。细胞的固定和透化可以通过常规方案，诸如用于流式细胞术的方案进行。通常，这样的方案包括用固定剂处理细胞的步骤，随后是用透化剂处理细胞的步骤。固定步骤通常固定细胞内的细胞靶，同时保留细胞和亚细胞结构，并且允许抗体和/或杂交探针不受阻碍地接近所有细胞和亚细胞区室。宽范围的固定剂是商购可得的，并且方法的正确选择将取决于被检查的靶的性质和所使用的抗体和/或杂交探针的特性。固定方法通常分为两类：有机溶剂和交联试剂。有机溶剂诸如醇和丙酮去除脂质并且使细胞脱水，同时使蛋白沉淀在细胞结构上。交联试剂(诸如多聚甲醛)通常通过游离氨基基团形成分子间桥，从而产生连接抗原的网络。交联剂比有机溶剂更好地保存细胞结构，但是可能降低某些细胞组分的抗原性，并且需要增加透化步骤，以允许抗体和/或杂交探针接近细胞内靶。示例性固定和透化步骤包括但不限于甲醇-丙酮固定(在冷却的甲醇中在-20℃固定10分钟；用冷却的丙酮在-20℃透化1min)；多聚甲醛-triton固定(在3％-4％多聚甲醛中固定10-20min；用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗；用0.5％Triton X-100透化2-10min)；多聚甲醛-甲醇固定(在3％-4％多聚甲醛中固定10-20min；用PBS冲洗；用冷却甲醇在-20℃透化5-10min)。透化剂包括但不限于去污剂saponin、Triton X-100、Tween-20、NP40。透化剂还可以包括蛋白酶，诸如蛋白酶K、链球菌溶血素O等。
用于使用者指定应用的嵌合酶促和化学合成的多核苷酸
医学和生物学中经常使用的产品包括可以在各种情况下使用的组分和必须为特定应用重新提供的组分，后一种组分有时被称为“使用者指定的”或“使用者决定的”组分。许多核酸试剂都具有这种特性。特别地，标记的杂交探针的共同组分可以批量生产，并且作为试剂盒提供给使用者，为了获得可操作的测定，必须提供特定的组分，例如，与感兴趣的核酸靶杂交的探针的靶特异性组分。以上述形式提供的示例性技术包括但不限于Taqman探针、CRISPR指导序列、各种类型的PCR探针等，其可以使用本发明的方法构建为预先存在的化学合成的寡核苷酸和酶促使用者指定的寡核苷酸的组合。图6是包含taqman探针或taqman探针的前体的这样的嵌合产物的简单实例。包含具有由其5’末端附接的起始子寡核苷酸(604)的固体支持物(602)的产物(600)可以使用有机化学技术集中地大量产生，因为这些组分用于每个特异性探针设计中。在该实施方案中，起始子寡核苷酸包括可裂解核苷酸“X”(605)和远离“X”的包含部分“R1”(603)的核苷酸，所述“R1”(603)可以是标记物，诸如荧光供体或猝灭剂，或可以用于附接供体或受体标记物的反应性基团，诸如点击化学对的成员。在一些实施方案中，将R1附接至碱基上，例如环外胺。产物(600)可以是用于使用者产生对他特别感兴趣的靶具有特异性的taqman探针的试剂盒的组分。对于产物(600)的起始子寡核苷酸的3’末端，使用者可以合成序列特异性延伸(608)，其可以包括具有部分“R2”(607)的核苷酸，所述“R2”(607)可以是与R1一起操作的互补供体或猝灭剂，或者R2可以是允许这样的标记物容易附接的反应性基团，诸如与R1的成员正交的点击化学对的成员。在合成完成之后，可以将延伸的寡核苷酸从支持物(602)上裂解下来(610)，得到taqman探针(614)和可以弃去的用过的支持物(612)。
可以制备用于提供单指导RNA(single guide RNA，sgRNA)的类似试剂盒：i)具有附接的起始子序列的珠，其中包含T7启动子；ii)客户购买具有珠的试剂盒，在起始子末端上合成其最喜欢的靶特异性序列+20-25nt的5’支架结构域；iii)合成完成后，(a)将互补的3’支架结构域退火至仍然附接至珠的寡核苷酸上，(b)允许引物延伸以生成dsDNA，和(c)允许逆转录生成sgRNA分子。
试剂盒
本发明包括用于进行本发明的方法的试剂盒。在一些实施方案中，“试剂盒”是指用于递送用于进行本发明的方法的材料或试剂的任何递送系统。在反应测定的情况下，这样的递送系统包括允许反应试剂(例如，适当的容器中的探针、酶等)和/或支持材料(例如，缓冲液，用于进行测定的书面说明等)的储存、从一个位置至另一个位置运输或递送的系统。例如，试剂盒包括含有相关反应试剂和/或支持材料的一种或更多种外罩(例如盒子)。这些内含物可以一起或单独地被递送到预期的接收者。例如，第一容器可以包含用于测定的酶，而第二容器包含探针。
在一些实施方案中，本发明的试剂盒包括无模板聚合酶。在一些实施方案中，无模板聚合酶是末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)或其变体。在一些这样的试剂盒中，无模板聚合酶包括3’-O-封闭的核苷酸。在用于延伸多核苷酸或cDNA的试剂盒的另外的实施方案中，试剂盒可以包括具有起始子的固体支持物。
在一些实施方案中，用于合成随机寡核苷酸条形码的本发明的试剂盒包括TdT或其变体、3’-O-封闭的核苷三磷酸、用于进行延伸和去封闭反应以拆分和混合合成条形码的微孔阵列。
在一些实施方案中，试剂盒可以包括微流体装置，用于处理单细胞和用于向其递送试剂。
在一些实施方案中，试剂盒可以包括一种或更多种具有附接的寡核苷酸的固体支持物，用于进行在cDNA上合成独特的寡核苷酸条形码的方法。在一些实施方案中，这样的一种或更多种固体支持物包含珠；在其他实施方案中，这样的一种或更多种固体支持物包括平面支持物，该平面支持物具有用捕获寡核苷酸包被的表面。
定义
除非本文另外明确定义，否则本文使用的核酸化学、生物化学、遗传学和分子生物学的术语和符号遵循本领域的标准论文和教科书中的那些，例如，Kornberg和Baker,DNAReplication，第2版(W.H.Freeman,New York,1992)；Lehninger,Biochemistry，第2版(Worth Publishers,New York,1975)；Strachan和Read,Human Molecular Genetics，第2版(Wiley-Liss,New York,1999)。
如本文使用的“扩增(amplify)”、“扩增(amplifies)”、“扩增(amplified)”、“扩增(amplification)”通常是指藉以制成靶多核苷酸或其一部分的一个或更多个拷贝的任何过程。扩增多核苷酸(例如DNA和/或RNA)的多种方法是可用的，本文描述了其中的一些实例。扩增可以是线性的、指数的，或者在多阶段扩增过程中包括线性和指数两个阶段。扩增方法可以包括温度的改变，诸如热变性步骤，或者可以是不需要热变性的等温过程。“扩增子”意指多核苷酸扩增反应的产物；即从一个或更多个起始序列复制的可以是单链或双链的多核苷酸的克隆群体。“扩增”意指通过进行扩增反应产生扩增子。一个或更多个起始序列可以是同一序列的一个或更多个拷贝，或者它们可以是不同序列的混合物。优选地，扩增子通过扩增单个起始序列形成。扩增子可以通过多种扩增反应产生，扩增反应的产物包括一个或更多个起始核酸或靶核酸的复制物(replicate)。在一方面，产生扩增子的扩增反应是“模板驱动的”，因为反应物(核苷酸或寡核苷酸)的碱基配对在模板多核苷酸中具有产生反应产物所需的互补序列。在一方面，模板驱动的反应是用核酸聚合酶进行引物延伸或用核酸连接酶进行寡核苷酸连接。这样的反应包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)、线性聚合酶反应、基于核酸序列的扩增(NASBA)、滚环扩增等，所述反应公开于通过引用并入本文的以下参考文献中：Mullis等人，美国专利4,683,195；4,965,188；4,683,202；4,800,159(PCR)；Gelfand等人，美国专利5,210,015(用“taqman”探针的实时PCR)；Wittwer等人，美国专利6,174,670；Kacian等人，美国专利5,399,491(“NASBA”)；Lizardi，美国专利5,854,033；Aono等人，日本专利公布JP 4-262799(滚环扩增)；等。在一方面，本发明的扩增子由PCR产生。如果允许随着扩增反应的进行测量反应产物的检测化学可用，那么扩增反应可以是“实时”扩增，例如下文描述的“实时PCR”，或在Leone等人，Nucleic Acids Research,26:2150-2155(1998)和类似的参考文献中描述的“实时NASBA”。如本文使用的，术语“扩增”意指进行扩增反应。“反应混合物”意指包含进行反应所需的所有反应物的溶液，反应混合物可以包括但不限于在反应期间将pH维持在选择水平的缓冲剂、盐、辅因子、清除剂等。
在一些实施方案中，“结合化合物”意指寡核苷酸标签可以与其附接用于鉴定能够特异性结合至非核酸配体的任何分子。结合化合物包括但不限于抗体或来源于抗体的化合物，例如Fab片段。非核酸配体包括但不限于蛋白。在一些实施方案中，结合化合物附接至(例如共价附接至)固体支持物的表面。在一些实施方案中，寡核苷酸标签可释放地附接至结合化合物；即，它们通过包括键的连接附接，该键可以通过预定条件，例如光、高pH、低pH、特定氧化还原条件、特定电势等选择性地裂解。
提及两种或更多种不同TdT中的氨基酸位置时，“功能等同”意指(i)各自位置处的氨基酸在TdT的活性中发挥相同的功能作用，和(ii)氨基酸出现在各自TdT的氨基酸序列中的同源氨基酸位置处。基于序列比对和/或分子建模鉴定两种或更多种不同TdT的氨基酸序列中的在位置上等同或同源的氨基酸残基是可能的。在一些实施方案中，功能等同的氨基酸位置属于在进化相关物种(例如属、科等)的TdT的氨基酸序列中是保守的序列基序。这样的保守序列基序的实例在Motea等人，Biochim.Biophys.Acta.1804(5):1151-1166(2010)；Delarue等人，EMBO J.,21:427-439(2002)；以及类似的文献中描述。
在本文可互换使用的“微流体”装置或“纳米流体”装置，各自意指用于捕获、移动、混合、分配或分析小体积流体的集成系统，所述流体包含样品(其继而可以包含或包括感兴趣的细胞或分子分析物)、试剂、稀释剂、缓冲液等。通常，提及“微流体”和“纳米流体”表示装置尺寸和处理的流体体积的不同规模。在一些实施方案中，微流体装置的特征具有小于几百平方微米的横截面尺寸，并且具有毛细管尺寸的通路或通道，例如具有约500μm至约0.1μm的最大横截面尺寸。在一些实施方案中，微流体装置具有在1μL至几nL(a few nL)，例如10-100nL的范围内的体积容量。纳米流体装置中对应特征或结构的尺寸通常比微流体装置的尺寸小1至3个数量级。本领域技术人员将从特定应用的情况中知道哪种维度将是相关的。在一些实施方案中，微流体或纳米流体装置具有一个或更多个室、端口和通道，所述室、端口和通道互连并且处于流体连通，并且被设计用于单独或与提供支持功能的设备或仪器合作执行一种或更多种分析反应或过程，所述支持功能例如样品引入、流体和/或试剂驱动装置(诸如正压或负压、声能等)、温度控制、检测系统、数据收集和/或集成系统等。在一些实施方案中，微流体和纳米流体装置还可包括阀、泵、过滤器和内壁上的专门功能涂层，例如以防止样品组分或反应物的吸附、促进通过电渗的试剂移动等。这样的装置可以作为集成装置制造在固体基质中，所述固体基质可以是玻璃、塑料或其他固体聚合物材料，并且可以具有易于检测和监测样品和试剂移动的平面形式，特别是通过光学或电化学方法。在一些实施方案中，这种装置是在一次使用之后即可丢弃的。在一些实施方案中，微流体和纳米流体装置包含形成和控制液滴的移动、混合、分配和分析的装置，所述液滴诸如浸没在不混溶流体诸如轻油中的水性液滴。微流体和纳米流体装置的制造和操作是本领域熟知的，如由通过引用并入本文的以下参考文献例示：Ramsey，美国专利6,001,229；5,858,195；6,010,607；和6,033,546；Soane等人，美国专利5,126,022和6,054,034；Nelson等人，美国专利6,613,525；Maher等人，美国专利6,399,952；Ricco等人，国际专利公布WO 02/24322；Bjornson等人，国际专利公布WO 99/19717；Wilding等人，美国专利5,587,128；5,498,392；Sia等人，Electrophoresis，24：3563-3576(2003)；Unger等人，Science，288：113-116(2000)；Enzelberger等人，美国专利6,960,437；Cao，“Nanostructures&Nanomaterials:Synthesis,Properties&Applications,”(Imperial College Press,London,2004)；Haeberle等人,LabChip,7:1094-1110(2007)；Cheng等人,Biochip Technology(CRCPress,2001)；等。
可互换使用的“突变体”或“变体”是指来源于本文描述的天然或参考TdT多肽并且在一个或更多个位置处包含修饰或改变，即取代、插入和/或缺失的多肽。变体可以通过本领域熟知的各种技术获得。特别地，用于改变编码野生型蛋白的DNA序列的技术的实例包括但不限于定点诱变、随机诱变、序列改组和合成寡核苷酸构建。诱变活性包括在蛋白序列中或者在聚合酶的发明的情况下缺失、插入或取代一个或数个(several)氨基酸。以下术语用于指定取代：L238A表示参考序列或野生型序列的位置238处的氨基酸残基(亮氨酸，L)被改变为丙氨酸(A)。A132V/I/M表示亲本序列的位置132处的氨基酸残基(丙氨酸，A)被以下氨基酸之一取代：缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)或甲硫氨酸(M)。取代可以是保守的或非保守的取代。保守取代的实例在以下组内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺、天冬酰胺和苏氨酸)、疏水性氨基酸(甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、半胱氨酸和缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸)。
“聚合酶链式反应”或“PCR”意指通过DNA的互补链的同时引物延伸使特定DNA序列体外扩增的反应。换言之，PCR是用于对侧翼为引物结合位点的靶核酸制造多个拷贝或复制物的反应，这样的反应包括以下步骤的一次或更多次重复：(i)使靶核酸变性，(ii)将引物退火至引物结合位点，和(iii)在存在核苷三磷酸的情况下，通过核酸聚合酶延伸引物。通常，将反应在热循环仪中通过为每个步骤优化的不同温度进行循环。特定的温度、每个步骤的持续时间以及步骤之间的改变速率取决于本领域普通技术人员熟知的许多因素，例如由以下参考文献例示的：McPherson等人，编辑，PCR:A Practical Approach and PCR2:APractical Approach(IRL Press,Oxford,分别于1991和1995年)。例如，在使用Taq DNA聚合酶的常规PCR中，双链靶核酸可以在>90℃的温度变性，引物在范围为50℃-75℃的温度退火，并且引物在范围为72℃-78℃的温度延伸。反应体积通常范围为在几百纳升(例如200nL)至几百μL(例如200μL)。
“引物”意指能够在与多核苷酸模板形成双链体后充当核酸合成的起始点并且从其3'末端沿模板延伸，使得形成延伸的双链体的天然或合成的寡核苷酸。在延伸过程期间添加的核苷酸的序列由模板多核苷酸的序列决定。通常引物通过DNA聚合酶延伸。引物通常具有在14个至36个核苷酸的范围内的长度。
“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用并且均意指核苷酸单体的线性聚合物。构成多核苷酸和寡核苷酸的单体能够通过单体与单体相互作用的常规模式，诸如沃森-克里克型的碱基配对特异性结合至天然多核苷酸。这样的单体及其核苷间键可以是天然存在的，或者可以是其类似物，例如天然存在的或非天然存在的类似物。非天然存在的类似物可以包含硫代磷酸酯核苷间连键、锁核酸、包含允许附接标记物(诸如荧光团或半抗原)的连接基团的碱基或其他寡核苷酸等。每当使用寡核苷酸或多核苷酸需要酶促加工，诸如通过聚合酶延伸、通过连接酶连接等时，本领域普通技术人员将理解，在那些情况下，寡核苷酸或多核苷酸在任何或一些位置处将不包含核苷间连接、糖部分或碱基的某些类似物。通常多核苷酸的尺寸范围为几个单体单元例如5-40(此时多核苷酸通常被称为“寡核苷酸”)至数千个单体单元。除非另外指定或从上下文明显的，每当多核苷酸或寡核苷酸以字母(大写或小写)序列诸如“ATGCCTG”表示时，应该理解的是该核苷酸从左至右是5’→3’的顺序，并且“A”表示脱氧腺苷，“C”表示脱氧胞苷，“G”表示脱氧鸟苷，并且“T”表示胸苷，“I”表示脱氧肌苷，“U”表示尿苷。除非另外说明，否则术语和原子编号惯例将遵循在Strachan和Read，Human Molecular Genetics 2(Wiley-Liss,New York,1999)中公开的那些。通常多核苷酸包含由磷酸二酯键连接的四种天然核苷(例如，脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷(对于DNA)或它们的核糖对应物(对于RNA))；然而，它们还可包含非天然的核苷酸类似物，例如包含修饰的碱基、糖或核苷间连键。本领域技术人员将认识到，酶的活性何时对特定的寡核苷酸或多核苷酸底物，例如单链DNA、RNA/DNA双链体等有要求，并且将能够选择适当的组合物，特别地在论文，例如Sambrook等人，Molecular Cloning，第2版(Cold SpringHarbor Laboratory,New York,1989)和类似的参考文献的指导下。如本文使用的，“天然多核苷酸”意指没有非天然磷酸连接、糖或碱基的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的聚合物。在一些实施方案中，天然多核苷酸不包括具有保护基团(诸如环外胺保护基团)、接头(包括用于将标记物附接至碱基上的基团)或标记物、捕获部分等的多核苷酸。在一些实施方案中，天然多核苷酸可以是从自然界提取的多核苷酸、没有保护基团的化学或酶促合成的多核苷酸，或者是附接至支持物或附接有标记物、接头或反应性部分的前述多核苷酸中的任一种。
“序列同一性”是指两个序列(诸如两个多肽序列或两个多核苷酸序列)之间匹配(例如相同的氨基酸残基)的数目(或分数，通常以百分比表示)。序列同一性可以通过将序列对齐使得重叠和同一性最大化同时使序列空位最小化时对序列进行比较来确定。特别地，序列同一性可以使用许多数学全局或局部比对算法中的任何一种来确定，这取决于两个序列的长度。相似长度的序列优选地使用全局比对算法(例如，Needleman和Wunsch算法；Needleman和Wunsch，1970)进行比对，该算法将序列在整个长度上最优地对齐，而明显不同长度的序列优选地使用局部比对算法(例如，Smith和Waterman算法(Smith和Waterman，1981)或Altschul算法(Altschul等人，1997；Altschul等人，2005)进行比对。以确定氨基酸序列同一性百分比为目的的比对可以以本领域技术人员技术能力范围内的各种方式，例如，使用可在互联网网站诸如http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/或ttp://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/上可得的公开可得的计算机软件来实现。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适参数，包括在被比较序列的全长上实现最大对齐所需的任何算法。出于本文的目的，％氨基酸序列同一性值是指使用成对序列比对程序EMBOSS Needle生成的值，该程序EMBOSS Needle使用Needman-Wunsch算法产生两个序列的最佳全局比对，其中所有检索参数被设置为默认值，即评分矩阵＝BLOSUM62，空位开放＝10，空位延伸＝0.5，末端空位罚分＝假，末端空位开放＝10并且末端空位延伸＝0.5。
“序列标签”(或“标签”)或“条形码”意指附接至多核苷酸或模板分子并且用于在一个反应或一系列反应中识别和/或跟踪多核苷酸或模板的寡核苷酸。序列标签可以附接至多核苷酸或模板的3’或5’末端，或者它可以插入到这样的多核苷酸或模板的内部以形成线性缀合物，有时在本文中称为“加标签的多核苷酸”、“加标签的模板”、“标签-多核苷酸缀合物”、“标签-分子缀合物”等。序列标签的尺寸和组成可以广泛变化；通过引用并入本文的以下参考文献提供了选择适于特定实施方案的序列标签组的指导：Brenner，美国专利第5,635,400号；Brenner和Macevicz，美国专利第7,537,897号；Brenner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,97:1665-1670(2000)；Church等人，欧洲专利公布0 303 459；Shoemaker等人，Nature Genetics,14:450-456(1996)；Morris等人，欧洲专利公布0799897A1；Wallace，美国专利第5,981,179号；等。序列标签的长度和组成可以广泛变化，并且特定长度和/或组成的选择取决于数个因素，包括但不限于标签如何用于例如通过杂交反应或通过酶促反应，诸如测序生成读出；它们是否例如用荧光染料等被标记；明确鉴定一组多核苷酸所需的可区分的寡核苷酸标签的数目等，以及为了确保可靠的鉴定，一组标签必须有多不同，例如没有交叉杂交或来自测序错误的错误鉴定。在一方面，序列标签可以各自分别具有2个至36个核苷酸、或4个至30个核苷酸、或8个至20个核苷酸、或6个至10个核苷酸的范围内的长度。在一方面，使用其中一组中的每个序列标签具有与同一组中每个其他标签的核苷酸序列相差至少两个碱基的独特的核苷酸序列的序列标签组；在另一方面，使用其中一组中的每个标签的序列与同一组中每个其他标签的序列相差至少三个碱基的序列标签组。
“取代”意指一种氨基酸残基被另一种氨基酸残基替代。优选地，术语“取代”是指一种氨基酸残基被选自以下的另一种氨基酸残基替代：天然存在的20种标准氨基酸残基、罕见的天然存在的氨基酸残基(例如羟脯氨酸、羟赖氨酸、别羟赖氨酸、6-N-甲基赖氨酸、N-乙基甘氨酸、N-甲基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、别异亮氨酸、N-甲基异亮氨酸、N-甲基缬氨酸、焦谷氨酰胺、氨基丁酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸)和通常合成获得的非天然存在的氨基酸残基(例如环己基-丙氨酸)。优选地，术语“取代”是指一种氨基酸残基被选自天然存在的20种标准氨基酸残基的另一种氨基酸残基替代。符号“+”指示取代的组合。氨基酸在本文中由它们的单字母或三字母代码根据以下命名法表示：A：丙氨酸(Ala)；C：半胱氨酸(Cys)；D：天冬氨酸(Asp)；E：谷氨酸(Glu)；F：苯丙氨酸(Phe)；G：甘氨酸(Gly)；H：组氨酸(His)；I：异亮氨酸(Ile)；K：赖氨酸(Lys)；L：亮氨酸(Leu)；M：甲硫氨酸(Met)；N：天冬酰胺(Asn)；P：脯氨酸(Pro)；Q：谷氨酰胺(Gln)；R：精氨酸(Arg)；S：丝氨酸(Ser)；T：苏氨酸(Thr)；V：缬氨酸(Val)；W：色氨酸(Trp)和Y：酪氨酸(Tyr)。在本文件中，使用以下术语指定取代：L238A表示亲本序列的位置238处的氨基酸残基(亮氨酸，L)被改变为丙氨酸(A)。A132V/I/M表示亲本序列的位置132处的氨基酸残基(丙氨酸，A)被以下氨基酸之一取代：缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)或甲硫氨酸(M)。取代可以是保守的或非保守的取代。保守取代的实例在以下组内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺、天冬酰胺和苏氨酸)、疏水性氨基酸(甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、半胱氨酸和缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸)。
“转录物组”意指在特定细胞、细胞集合、样品或组织类型中产生的所有(或几乎所有)基因转录物的集合。在一些实施方案中，转录物组包含细胞、细胞集合、样品或组织类型的所有或几乎所有的聚A信使RNA(mRNA)。
在一些实施方案中，提及细胞、组织或生物体的“存活”意指细胞、组织或生物体能够生长、被培养或进一步增殖。在一些实施方案中，存活细胞是活的，并且在经历至少一个循环的附接的起始子寡核苷酸的无模板酶促延长之后，能够有丝分裂或减数分裂并且进一步生长。术语“存活细胞”可以包括存活的真核细胞、原核细胞或病毒。在一些实施方案中，“存活细胞”意指存活的真核细胞；并且在其他实施方案中，“存活细胞”意指存活的哺乳动物细胞。如本文使用的术语“存活条件”是对细胞存活力没有实质性有害影响的物理化学反应条件(例如温度、盐浓度、溶剂等)。在一些实施方案中，应当理解，为了存活力，特定细胞类型将需要另外的反应混合物组分，例如维生素、氨基酸等；即，如本文使用的，“存活条件”是指细胞存活力的必要条件，但不是每种细胞类型存活力的充分条件。在一些实施方案中，存活条件包括具有在0.8％至1.0％(w/v)的范围内的浓度的生理盐，特别地钠、钙和/或钾，在6.8-7.8的范围内的pH，在15℃-41℃的范围内的温度的水性反应混合物。
序列表
<110> DNA斯克瑞普特公司
<120> 细胞和生物分子上的直接寡核苷酸合成
<130> B2906PC00
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 510
<212> PRT
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> TDT酶
<400> 1
Met Asp Pro Leu Gln Ala Val His Leu Gly Pro Arg Lys Lys Arg Pro
1 5 10 15
Arg Gln Leu Gly Thr Pro Val Ala Ser Thr Pro Tyr Asp Ile Arg Phe
20 25 30
Arg Asp Leu Val Leu Phe Ile Leu Glu Lys Lys Met Gly Thr Thr Arg
35 40 45
Arg Ala Phe Leu Met Glu Leu Ala Arg Arg Lys Gly Phe Arg Val Glu
50 55 60
Asn Glu Leu Ser Asp Ser Val Thr His Ile Val Ala Glu Asn Asn Ser
65 70 75 80
Gly Ser Asp Val Leu Glu Trp Leu Gln Leu Gln Asn Ile Lys Ala Ser
85 90 95
Ser Glu Leu Glu Leu Leu Asp Ile Ser Trp Leu Ile Glu Cys Met Gly
100 105 110
Ala Gly Lys Pro Val Glu Met Met Gly Arg His Gln Leu Val Val Asn
115 120 125
Arg Asn Ser Ser Pro Ser Pro Val Pro Gly Ser Gln Asn Val Pro Ala
130 135 140
Pro Ala Val Lys Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr
145 150 155 160
Leu Asn Asn Tyr Asn Gln Leu Phe Thr Asp Ala Leu Asp Ile Leu Ala
165 170 175
Glu Asn Asp Glu Leu Arg Glu Asn Glu Gly Ser Cys Leu Ala Phe Met
180 185 190
Arg Ala Ser Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Pro Ile Thr Ser Met
195 200 205
Lys Asp Thr Glu Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Ser Ile
210 215 220
Ile Glu Gly Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Ala Lys Ala Val
225 230 235 240
Leu Asn Asp Glu Arg Tyr Lys Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe
245 250 255
Gly Val Gly Leu Lys Thr Ala Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg
260 265 270
Thr Leu Ser Lys Ile Gln Ser Asp Lys Ser Leu Arg Phe Thr Gln Met
275 280 285
Gln Lys Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Asn
290 295 300
Arg Pro Glu Ala Glu Ala Val Ser Met Leu Val Lys Glu Ala Val Val
305 310 315 320
Thr Phe Leu Pro Asp Ala Leu Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg
325 330 335
Gly Lys Met Thr Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Glu
340 345 350
Ala Thr Glu Asp Glu Glu Gln Gln Leu Leu His Lys Val Thr Asp Phe
355 360 365
Trp Lys Gln Gln Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Asp Ile Leu Glu Ser Thr
370 375 380
Phe Glu Lys Phe Lys Gln Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His
385 390 395 400
Phe Gln Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu Asp His Gly Arg Val His
405 410 415
Ser Glu Lys Ser Gly Gln Gln Glu Gly Lys Gly Trp Lys Ala Ile Arg
420 425 430
Val Asp Leu Val Met Cys Pro Tyr Asp Arg Arg Ala Phe Ala Leu Leu
435 440 445
Gly Trp Thr Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala
450 455 460
Thr His Glu Arg Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Arg
465 470 475 480
Thr Lys Arg Val Phe Leu Glu Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala
485 490 495
His Leu Gly Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
500 505 510
<210> 2
<211> 381
<212> PRT
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 截短的小鼠序列
<400> 2
Asn Ser Ser Pro Ser Pro Val Pro Gly Ser Gln Asn Val Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ala Val Lys Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu
20 25 30
Asn Asn Tyr Asn Gln Leu Phe Thr Asp Ala Leu Asp Ile Leu Ala Glu
35 40 45
Asn Asp Glu Leu Arg Glu Asn Glu Gly Ser Cys Leu Ala Phe Met Arg
50 55 60
Ala Ser Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Pro Ile Thr Ser Met Lys
65 70 75 80
Asp Thr Glu Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Ser Ile Ile
85 90 95
Glu Gly Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Ala Lys Ala Val Leu
100 105 110
Asn Asp Glu Arg Tyr Lys Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly
115 120 125
Val Gly Leu Lys Thr Ala Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr
130 135 140
Leu Ser Lys Ile Gln Ser Asp Lys Ser Leu Arg Phe Thr Gln Met Gln
145 150 155 160
Lys Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Asn Arg
165 170 175
Pro Glu Ala Glu Ala Val Ser Met Leu Val Lys Glu Ala Val Val Thr
180 185 190
Phe Leu Pro Asp Ala Leu Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly
195 200 205
Lys Met Thr Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Glu Ala
210 215 220
Thr Glu Asp Glu Glu Gln Gln Leu Leu His Lys Val Thr Asp Phe Trp
225 230 235 240
Lys Gln Gln Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Asp Ile Leu Glu Ser Thr Phe
245 250 255
Glu Lys Phe Lys Gln Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His Phe
260 265 270
Gln Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu Asp His Gly Arg Val His Ser
275 280 285
Glu Lys Ser Gly Gln Gln Glu Gly Lys Gly Trp Lys Ala Ile Arg Val
290 295 300
Asp Leu Val Met Cys Pro Tyr Asp Arg Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly
305 310 315 320
Trp Thr Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr
325 330 335
His Glu Arg Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Arg Thr
340 345 350
Lys Arg Val Phe Leu Glu Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His
355 360 365
Leu Gly Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
370 375 380
<210> 3
<211> 380
<212> PRT
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 牛截短的(催化结构域)：
<400> 3
Asp Tyr Ser Ala Thr Pro Asn Pro Gly Phe Gln Lys Thr Pro Pro Leu
1 5 10 15
Ala Val Lys Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Lys Thr Thr Leu
20 25 30
Asn Asn Tyr Asn His Ile Phe Thr Asp Ala Phe Glu Ile Leu Ala Glu
35 40 45
Asn Ser Glu Phe Lys Glu Asn Glu Val Ser Tyr Val Thr Phe Met Arg
50 55 60
Ala Ala Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Thr Ile Ile Ser Met Lys
65 70 75 80
Asp Thr Glu Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Cys Ile Ile
85 90 95
Glu Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu
100 105 110
Asn Asp Glu Arg Tyr Gln Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly
115 120 125
Val Gly Leu Lys Thr Ser Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Ser
130 135 140
Leu Ser Lys Ile Met Ser Asp Lys Thr Leu Lys Phe Thr Lys Met Gln
145 150 155 160
Lys Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Thr Arg
165 170 175
Ala Glu Ala Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Trp Ala
180 185 190
Phe Leu Pro Asp Ala Phe Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly
195 200 205
Lys Lys Ile Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ser
210 215 220
Ala Glu Asp Glu Glu Gln Leu Leu Pro Lys Val Ile Asn Leu Trp Glu
225 230 235 240
Lys Lys Gly Leu Leu Leu Tyr Tyr Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu
245 250 255
Lys Phe Lys Leu Pro Ser Arg Gln Val Asp Thr Leu Asp His Phe Gln
260 265 270
Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu His His Gln Arg Val Asp Ser Ser
275 280 285
Lys Ser Asn Gln Gln Glu Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp
290 295 300
Leu Val Met Cys Pro Tyr Glu Asn Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp
305 310 315 320
Thr Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Ile Arg Arg Tyr Ala Thr His
325 330 335
Glu Arg Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys
340 345 350
Arg Val Phe Leu Lys Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu
355 360 365
Gly Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
370 375 380
<210> 4
<211> 380
<212> PRT
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 人类截短的
<400> 4
Asp Tyr Ser Asp Ser Thr Asn Pro Gly Pro Pro Lys Thr Pro Pro Ile
1 5 10 15
Ala Val Gln Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu
20 25 30
Asn Asn Cys Asn Gln Ile Phe Thr Asp Ala Phe Asp Ile Leu Ala Glu
35 40 45
Asn Cys Glu Phe Arg Glu Asn Glu Asp Ser Cys Val Thr Phe Met Arg
50 55 60
Ala Ala Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Thr Ile Ile Ser Met Lys
65 70 75 80
Asp Thr Glu Gly Ile Pro Cys Leu Gly Ser Lys Val Lys Gly Ile Ile
85 90 95
Glu Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu
100 105 110
Asn Asp Glu Arg Tyr Gln Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly
115 120 125
Val Gly Leu Lys Thr Ser Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr
130 135 140
Leu Ser Lys Val Arg Ser Asp Lys Ser Leu Lys Phe Thr Arg Met Gln
145 150 155 160
Lys Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Thr Arg
165 170 175
Ala Glu Ala Glu Ala Val Ser Val Leu Val Lys Glu Ala Val Trp Ala
180 185 190
Phe Leu Pro Asp Ala Phe Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly
195 200 205
Lys Lys Met Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ser
210 215 220
Thr Glu Asp Glu Glu Gln Leu Leu Gln Lys Val Met Asn Leu Trp Glu
225 230 235 240
Lys Lys Gly Leu Leu Leu Tyr Tyr Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu
245 250 255
Lys Leu Arg Leu Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His Phe Gln
260 265 270
Lys Cys Phe Leu Ile Phe Lys Leu Pro Arg Gln Arg Val Asp Ser Asp
275 280 285
Gln Ser Ser Trp Gln Glu Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp
290 295 300
Leu Val Leu Cys Pro Tyr Glu Arg Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp
305 310 315 320
Thr Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His
325 330 335
Glu Arg Lys Met Ile Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys
340 345 350
Arg Ile Phe Leu Lys Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu
355 360 365
Gly Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
370 375 380
<210> 5
<211> 376
<212> PRT
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 鸡1截短的
<400> 5
Gln Tyr Pro Thr Leu Lys Thr Pro Glu Ser Glu Val Ser Ser Phe Thr
1 5 10 15
Ala Ser Lys Val Ser Gln Tyr Ser Cys Gln Arg Lys Thr Thr Leu Asn
20 25 30
Asn Cys Asn Lys Lys Phe Thr Asp Ala Phe Glu Ile Met Ala Glu Asn
35 40 45
Tyr Glu Phe Lys Glu Asn Glu Ile Phe Cys Leu Glu Phe Leu Arg Ala
50 55 60
Ala Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Pro Val Thr Arg Met Lys Asp
65 70 75 80
Ile Gln Gly Leu Pro Cys Met Gly Asp Arg Val Arg Asp Val Ile Glu
85 90 95
Glu Ile Ile Glu Glu Gly Glu Ser Ser Arg Ala Lys Asp Val Leu Asn
100 105 110
Asp Glu Arg Tyr Lys Ser Phe Lys Glu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val
115 120 125
Gly Val Lys Thr Ser Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Leu Arg Thr Val
130 135 140
Glu Glu Val Lys Ala Asp Lys Thr Leu Lys Leu Ser Lys Met Gln Arg
145 150 155 160
Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Ser Lys Ala
165 170 175
Glu Ala Asp Ala Val Ser Ser Ile Val Lys Asn Thr Val Cys Thr Phe
180 185 190
Leu Pro Asp Ala Leu Val Thr Ile Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly Lys
195 200 205
Lys Ile Gly His Asp Ile Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Gln Arg
210 215 220
Glu Asp Asp Glu Leu Leu His Lys Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Asp Ile
225 230 235 240
Ile Glu Ser Thr Phe Val Lys Glu Gln Ile Pro Ser Arg His Val Asp
245 250 255
Ala Met Asp His Phe Gln Lys Cys Phe Ala Ile Leu Lys Leu Tyr Gln
260 265 270
Pro Arg Val Asp Asn Ser Ser Tyr Asn Met Ser Lys Lys Cys Asp Met
275 280 285
Ala Glu Val Lys Asp Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val Ile Thr
290 295 300
Pro Phe Glu Gln Tyr Ala Tyr Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly Ser Arg
305 310 315 320
Gln Phe Gly Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Arg Lys Met
325 330 335
Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Arg Lys Arg Val Phe Leu
340 345 350
Lys Ala Gly Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly Leu Asp Tyr
355 360 365
Val Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
370 375
<210> 6
<211> 387
<212> PRT
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 负鼠截短的
<400> 6
Ser Ala Asn Pro Asp Pro Thr Ala Gly Thr Leu Asn Ile Leu Pro Pro
1 5 10 15
Thr Thr Lys Thr Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Ile
20 25 30
Asn Asn His Asn Gln Arg Phe Thr Asp Ala Phe Glu Ile Leu Ala Lys
35 40 45
Asn Tyr Glu Phe Lys Glu Asn Asp Asp Thr Cys Leu Thr Phe Met Arg
50 55 60
Ala Ile Ser Val Leu Lys Cys Leu Pro Phe Glu Val Val Ser Leu Lys
65 70 75 80
Asp Thr Glu Gly Leu Pro Trp Ile Gly Asp Glu Val Lys Gly Ile Met
85 90 95
Glu Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Leu Glu Val Gln Ala Val Leu
100 105 110
Asn Asp Glu Arg Tyr Gln Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly
115 120 125
Val Gly Leu Lys Thr Ala Asp Lys Trp Tyr Arg Met Gly Phe Arg Thr
130 135 140
Leu Asn Lys Ile Arg Ser Asp Lys Thr Leu Lys Leu Thr Lys Met Gln
145 150 155 160
Lys Ala Gly Leu Cys Tyr Tyr Glu Asp Leu Ile Asp Cys Val Ser Lys
165 170 175
Ala Glu Ala Asp Ala Val Ser Leu Leu Val Gln Asp Ala Val Trp Thr
180 185 190
Phe Leu Pro Asp Ala Leu Val Thr Ile Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly
195 200 205
Lys Glu Phe Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ala
210 215 220
Glu Lys Glu Gln Glu Asp Gln Leu Leu Gln Lys Val Thr Asn Leu Trp
225 230 235 240
Lys Lys Gln Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Ile Glu Ser Thr Phe
245 250 255
Glu Asp Leu Lys Leu Pro Ser Arg Lys Ile Asp Ala Leu Asp His Phe
260 265 270
Gln Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu Tyr His His Lys Glu Asp Lys
275 280 285
Arg Lys Trp Glu Met Pro Thr Gly Ser Asn Glu Ser Glu Ala Lys Ser
290 295 300
Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val Val Cys Pro Tyr Asp Arg Tyr
305 310 315 320
Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Ser Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp
325 330 335
Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Lys Lys Met Met Leu Asp Asn His
340 345 350
Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Lys Ile Phe Leu Lys Ala Lys Ser Glu
355 360 365
Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly Leu Glu Tyr Ile Gln Pro Ser Glu
370 375 380
Arg Asn Ala
385
<210> 7
<211> 381
<212> PRT
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 新的截短的鼩鼱
<400> 7
Asp Cys Pro Ala Ser His Asp Ser Ser Pro Gln Lys Thr Glu Ser Ala
1 5 10 15
Ala Val Gln Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu
20 25 30
Asn Asn His Asn His Ile Phe Thr Asp Ala Phe Glu Ile Leu Ala Glu
35 40 45
Asn Cys Glu Phe Arg Glu Asn Glu Gly Ser Tyr Val Thr Tyr Met Arg
50 55 60
Ala Ala Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Ser Ile Ile Ser Met Lys
65 70 75 80
Asp Thr Glu Gly Ile Pro Cys Leu Ala Asp Lys Val Lys Cys Val Ile
85 90 95
Glu Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu
100 105 110
Asn Asp Glu Arg Tyr Lys Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly
115 120 125
Val Gly Leu Lys Thr Ala Glu Lys Trp Phe Arg Leu Gly Phe Arg Thr
130 135 140
Leu Ser Gly Ile Met Asn Asp Lys Thr Leu Lys Leu Thr His Met Gln
145 150 155 160
Lys Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Thr Arg
165 170 175
Ala Glu Ala Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Trp Ala
180 185 190
Phe Leu Pro Asp Ala Ile Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly
195 200 205
Lys Lys Val Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Glu Ala
210 215 220
Thr Glu Glu Gln Glu Gln Gln Leu Leu His Lys Val Ile Thr Phe Trp
225 230 235 240
Glu Lys Glu Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Tyr Glu Ser Thr Phe
245 250 255
Glu Lys Leu Lys Met Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His Phe
260 265 270
Gln Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu His Arg Glu Cys Val Asp Asp
275 280 285
Gly Thr Ser Ser Gln Leu Gln Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val
290 295 300
Asp Leu Val Val Cys Pro Tyr Glu Cys Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly
305 310 315 320
Trp Thr Gly Ser Pro Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr
325 330 335
His Glu Arg Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr
340 345 350
Lys Arg Lys Phe Leu Ser Ala Asp Ser Glu Glu Asp Ile Phe Ala His
355 360 365
Leu Gly Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
370 375 380
<210> 8
<211> 387
<212> PRT
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 蟒截短的
<400> 8
Glu Lys Tyr Gln Leu Pro Glu Asp Glu Asp Arg Ser Val Thr Ser Asp
1 5 10 15
Leu Asp Arg Asp Ser Ile Ser Glu Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr
20 25 30
Leu Lys Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Thr Asp Ala Phe Glu Ile Leu Ala
35 40 45
Glu Asn Tyr Glu Phe Asn Glu Asn Lys Gly Phe Cys Thr Ala Phe Arg
50 55 60
Arg Ala Ala Ser Val Leu Lys Cys Leu Pro Phe Thr Ile Val Gln Val
65 70 75 80
His Asp Ile Glu Gly Val Pro Trp Met Gly Lys Gln Val Lys Gly Ile
85 90 95
Ile Glu Asp Ile Ile Glu Glu Gly Glu Ser Ser Lys Val Lys Ala Val
100 105 110
Leu Asp Asn Glu Asn Tyr Arg Ser Val Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe
115 120 125
Gly Val Gly Leu Lys Thr Ser Asp Lys Trp Tyr Arg Met Gly Leu Arg
130 135 140
Thr Leu Glu Glu Val Lys Arg Asp Lys Asn Leu Lys Leu Thr Arg Met
145 150 155 160
Gln Lys Ala Gly Phe Leu His Tyr Asp Asp Leu Thr Ser Cys Val Ser
165 170 175
Lys Ala Glu Ala Asp Ala Ala Ser Leu Ile Val Gln Asp Val Val Trp
180 185 190
Lys Ile Val Pro Asn Ala Ile Val Thr Ile Ala Gly Gly Phe Arg Arg
195 200 205
Gly Lys Gln Thr Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Val Pro Gly
210 215 220
Ser Lys Gln Glu Glu Glu Glu Leu Leu His Thr Val Ile Asp Ile Trp
225 230 235 240
Lys Lys Gln Glu Leu Leu Leu Tyr Tyr Asp Leu Ile Glu Ser Thr Phe
245 250 255
Glu Asp Thr Lys Leu Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His Phe
260 265 270
Gln Lys Cys Phe Ala Ile Leu Lys Val His Lys Glu Arg Glu Asp Lys
275 280 285
Gly Asn Ser Ile Arg Ser Lys Ala Phe Ser Glu Glu Glu Ile Lys Asp
290 295 300
Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val Val Val Pro Phe Glu Gln Tyr
305 310 315 320
Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly Ser Thr Gln Phe Glu Arg Asp
325 330 335
Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Lys Lys Met Met Leu Asp Asn His
340 345 350
Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Lys Ile Phe Leu Asn Ala Ala Ser Glu
355 360 365
Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly Leu Asp Tyr Leu Glu Pro Trp Glu
370 375 380
Arg Asn Ala
385
<210> 9
<211> 381
<212> PRT
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 截短的犬
<400> 9
Asp Tyr Thr Ala Ser Pro Asn Pro Glu Leu Gln Lys Thr Leu Pro Val
1 5 10 15
Ala Val Lys Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu
20 25 30
Asn Asn Tyr Asn Asn Val Phe Thr Asp Ala Phe Glu Val Leu Ala Glu
35 40 45
Asn Tyr Glu Phe Arg Glu Asn Glu Val Phe Ser Leu Thr Phe Met Arg
50 55 60
Ala Ala Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Thr Ile Ile Ser Met Lys
65 70 75 80
Asp Thr Glu Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Gln Val Lys Cys Ile Ile
85 90 95
Glu Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu
100 105 110
Asn Asp Glu Arg Tyr Gln Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly
115 120 125
Val Gly Leu Lys Thr Ser Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr
130 135 140
Leu Ser Lys Ile Lys Ser Asp Lys Ser Leu Lys Phe Thr Pro Met Gln
145 150 155 160
Lys Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Thr Arg
165 170 175
Ala Glu Ala Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Gly Ala
180 185 190
Phe Leu Pro Asp Ala Phe Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly
195 200 205
Lys Lys Met Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ser
210 215 220
Thr Asp Glu Asp Glu Glu Gln Leu Leu Pro Lys Val Ile Asn Leu Trp
225 230 235 240
Glu Arg Lys Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe
245 250 255
Glu Lys Leu Lys Leu Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His Phe
260 265 270
Gln Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu His His Gln Arg Val Asp Gly
275 280 285
Gly Lys Cys Ser Gln Gln Glu Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val
290 295 300
Asp Leu Val Met Cys Pro Tyr Glu Arg Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly
305 310 315 320
Trp Thr Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Ser
325 330 335
His Glu Arg Lys Met Ile Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr
340 345 350
Lys Lys Ile Phe Leu Lys Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His
355 360 365
Leu Gly Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
370 375 380
<210> 10
<211> 382
<212> PRT
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 截短的鼹鼠
<400> 10
Gly Asp Cys Pro Ala Ser His Asp Ser Ser Pro Gln Lys Thr Glu Ser
1 5 10 15
Ala Ala Val Gln Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr
20 25 30
Leu Asn Asn His Asn His Ile Phe Thr Asp Ala Phe Glu Ile Leu Ala
35 40 45
Glu Asn Cys Glu Phe Arg Glu Asn Glu Gly Ser Tyr Val Thr Tyr Met
50 55 60
Arg Ala Ala Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Ser Ile Ile Ser Met
65 70 75 80
Lys Asp Thr Glu Gly Ile Pro Cys Leu Ala Asp Lys Val Lys Cys Val
85 90 95
Ile Glu Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val
100 105 110
Leu Asn Asp Glu Arg Tyr Lys Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe
115 120 125
Gly Val Gly Leu Lys Thr Ala Glu Lys Trp Phe Arg Leu Gly Phe Arg
130 135 140
Thr Leu Ser Gly Ile Met Asn Asp Lys Thr Leu Lys Leu Thr His Met
145 150 155 160
Gln Lys Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Thr
165 170 175
Arg Ala Glu Ala Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Trp
180 185 190
Ala Phe Leu Pro Asp Ala Ile Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg
195 200 205
Gly Lys Lys Val Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Glu
210 215 220
Ala Thr Glu Glu Gln Glu Gln Gln Leu Leu His Lys Val Ile Thr Phe
225 230 235 240
Trp Glu Lys Glu Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Tyr Glu Ser Thr
245 250 255
Phe Glu Lys Leu Lys Met Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His
260 265 270
Phe Gln Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu His Arg Glu Cys Val Asp
275 280 285
Asp Gly Thr Ser Ser Gln Leu Gln Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg
290 295 300
Val Asp Leu Val Val Cys Pro Tyr Glu Cys Arg Ala Phe Ala Leu Leu
305 310 315 320
Gly Trp Thr Gly Ser Pro Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala
325 330 335
Thr His Glu Arg Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys
340 345 350
Thr Lys Arg Lys Phe Leu Ser Ala Asp Ser Glu Glu Asp Ile Phe Ala
355 360 365
His Leu Gly Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
370 375 380
<210> 11
<211> 379
<212> PRT
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 鼠兔截短物
<400> 11
Glu Tyr Ser Ala Asn Pro Ser Pro Gly Pro Gln Ala Thr Pro Ala Val
1 5 10 15
Tyr Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu Asn Asn
20 25 30
His Asn His Ile Phe Thr Asp Ala Phe Glu Ile Leu Ala Glu Asn Tyr
35 40 45
Glu Phe Lys Glu Asn Glu Gly Cys Tyr Val Thr Tyr Met Arg Ala Ala
50 55 60
Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Thr Ile Val Ser Met Lys Asp Thr
65 70 75 80
Glu Gly Ile Pro Cys Leu Glu Asp Lys Val Lys Ser Ile Met Glu Glu
85 90 95
Ile Ile Glu Glu Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu Ser Asp
100 105 110
Glu Arg Tyr Gln Cys Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly
115 120 125
Leu Lys Thr Ser Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Ser Leu Ser
130 135 140
Asn Ile Arg Leu Asp Lys Ser Leu Lys Phe Thr Gln Met Gln Lys Ala
145 150 155 160
Gly Phe Arg Tyr Tyr Glu Asp Ile Val Ser Cys Val Thr Arg Ala Glu
165 170 175
Ala Glu Ala Val Asp Val Leu Val Asn Glu Ala Val Arg Ala Phe Leu
180 185 190
Pro Asp Ala Phe Ile Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly Lys Lys
195 200 205
Ile Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Glu Leu Thr Glu
210 215 220
Glu Asp Glu Gln Gln Leu Leu His Lys Val Met Asn Leu Trp Glu Lys
225 230 235 240
Lys Gly Leu Leu Leu Tyr His Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu Lys
245 250 255
Leu Lys Gln Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His Phe Gln Lys
260 265 270
Cys Phe Leu Ile Phe Lys Leu Tyr His Glu Arg Val Gly Gly Asp Arg
275 280 285
Cys Arg Gln Pro Glu Gly Lys Asp Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu
290 295 300
Val Met Cys Pro Tyr Glu Cys His Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr
305 310 315 320
Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Ser His Glu
325 330 335
Arg Lys Met Ile Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Arg
340 345 350
Val Phe Leu Gln Ala Glu Asn Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly
355 360 365
Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
370 375
<210> 12
<211> 384
<212> PRT
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 截短的刺猬
<400> 12
Asp Ala Ser Phe Gly Ser Asn Pro Gly Ser Gln Asn Thr Pro Pro Leu
1 5 10 15
Ala Ile Lys Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Ser Leu
20 25 30
Asn Asn Cys Asn His Ile Phe Thr Asp Ala Leu Asp Ile Leu Ala Glu
35 40 45
Asn His Glu Phe Arg Glu Asn Glu Val Ser Cys Val Ala Phe Met Arg
50 55 60
Ala Ala Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Thr Ile Ile Ser Met Lys
65 70 75 80
Asp Thr Lys Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Ala Lys Cys Val Ile
85 90 95
Glu Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Ile Leu
100 105 110
Asn Asp Glu Arg Tyr Gln Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly
115 120 125
Val Gly Leu Lys Thr Ser Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr
130 135 140
Leu Asn Lys Ile Met Ser Asp Lys Thr Leu Lys Leu Thr Arg Met Gln
145 150 155 160
Lys Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Ala Lys
165 170 175
Ala Glu Ala Asp Ala Val Ser Val Leu Val Gln Glu Ala Val Trp Ala
180 185 190
Phe Leu Pro Asp Ala Met Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly
195 200 205
Lys Lys Leu Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ala
210 215 220
Thr Glu Glu Glu Glu Gln Gln Leu Leu Pro Lys Val Ile Asn Phe Trp
225 230 235 240
Glu Arg Lys Gly Leu Leu Leu Tyr His Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe
245 250 255
Glu Lys Leu Lys Leu Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His Phe
260 265 270
Gln Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu His Leu Gln His Val Asn Gly
275 280 285
Val Gly Asn Ser Lys Thr Gly Gln Gln Glu Gly Lys Asn Trp Lys Ala
290 295 300
Ile Arg Val Asp Leu Val Met Cys Pro Tyr Glu Arg Arg Ala Phe Ala
305 310 315 320
Leu Leu Gly Trp Thr Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg
325 330 335
Phe Ala Thr His Glu Arg Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr
340 345 350
Asp Lys Thr Lys Arg Ile Phe Leu Lys Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile
355 360 365
Phe Ala His Leu Gly Leu Asp Tyr Ile Asp Pro Trp Glu Arg Asn Ala
370 375 380
<210> 13
<211> 381
<212> PRT
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 截短的树鼩
<400> 13
Asp His Ser Thr Ser Pro Ser Pro Gly Pro Gln Lys Thr Pro Ala Leu
1 5 10 15
Ala Val Gln Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu
20 25 30
Asn Asn Cys Asn Arg Val Phe Thr Asp Ala Phe Glu Thr Leu Ala Glu
35 40 45
Asn Tyr Glu Phe Arg Glu Asn Glu Asp Ser Ser Val Ile Phe Leu Arg
50 55 60
Ala Ala Ser Val Leu Arg Ser Leu Pro Phe Thr Ile Thr Ser Met Arg
65 70 75 80
Asp Thr Glu Gly Leu Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Cys Val Ile
85 90 95
Glu Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Asn Ala Val Leu
100 105 110
Asn Asp Glu Arg Tyr Lys Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly
115 120 125
Val Gly Leu Lys Thr Ser Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr
130 135 140
Leu Ser Arg Val Arg Ser Asp Lys Ser Leu His Leu Thr Arg Met Gln
145 150 155 160
Gln Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Ala Ser Cys Val Thr Arg
165 170 175
Ala Glu Ala Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Gly Ala
180 185 190
Phe Leu Pro Asp Ala Leu Val Thr Ile Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly
195 200 205
Lys Lys Thr Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ser
210 215 220
Thr Glu Glu Lys Glu Glu Glu Leu Leu Gln Lys Val Leu Asn Leu Trp
225 230 235 240
Glu Lys Lys Gly Leu Leu Leu Tyr Tyr Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe
245 250 255
Glu Lys Leu Lys Thr Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His Phe
260 265 270
Pro Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu His His Gln Arg Val Asp Gly
275 280 285
Asp Lys Pro Ser Gln Gln Glu Gly Lys Ser Trp Lys Ala Ile Arg Val
290 295 300
Asp Leu Val Met Cys Pro Tyr Glu Arg His Ala Phe Ala Leu Leu Gly
305 310 315 320
Trp Thr Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr
325 330 335
His Glu Arg Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr
340 345 350
Lys Arg Val Phe Leu Lys Ala Glu Ser Glu Glu Asp Ile Phe Ala His
355 360 365
Leu Gly Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
370 375 380
<210> 14
<211> 394
<212> PRT
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 截短的鸭嘴兽
<400> 14
Leu Thr Asn Ser Ala Pro Ile Asn Cys Met Thr Glu Thr Pro Ser Leu
1 5 10 15
Ala Thr Lys Gln Val Ser Gln Tyr Ala Cys Glu Arg Arg Thr Thr Leu
20 25 30
Asn Asn Cys Asn Gln Lys Phe Thr Asp Ala Phe Glu Ile Leu Ala Lys
35 40 45
Asp Phe Glu Phe Arg Glu Asn Glu Gly Ile Cys Leu Ala Phe Met Arg
50 55 60
Ala Ile Ser Val Leu Lys Cys Leu Pro Phe Thr Ile Val Arg Met Lys
65 70 75 80
Asp Ile Glu Gly Val Pro Trp Leu Gly Asp Gln Val Lys Ser Ile Ile
85 90 95
Glu Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Ser Val Lys Ala Val Leu
100 105 110
Asn Asp Glu Arg Tyr Arg Ser Phe Gln Leu Phe Asn Ser Val Phe Glu
115 120 125
Val Gly Leu Thr Asp Asn Gly Glu Asn Gly Ile Ala Arg Gly Phe Gln
130 135 140
Thr Leu Asn Glu Val Ile Thr Asp Glu Asn Ile Ser Leu Thr Lys Thr
145 150 155 160
Thr Leu Ser Thr Ser Leu Trp Asn Tyr Leu Pro Gly Phe Leu Tyr Tyr
165 170 175
Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Ala Lys Glu Glu Ala Asp Ala Val Tyr
180 185 190
Leu Ile Val Lys Glu Ala Val Arg Ala Phe Leu Pro Glu Ala Leu Val
195 200 205
Thr Leu Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly Lys Lys Ile Gly His Asp Val
210 215 220
Asp Phe Leu Ile Ser Asp Pro Glu Ser Gly Gln Asp Glu Gln Leu Leu
225 230 235 240
Pro Asn Ile Ile Lys Leu Trp Glu Lys Gln Glu Leu Leu Leu Tyr Tyr
245 250 255
Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu Lys Thr Lys Ile Pro Ser Arg Lys
260 265 270
Val Asp Ala Met Asp His Phe Gln Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu
275 280 285
His His Gln Lys Val Asp Ser Gly Arg Tyr Lys Pro Pro Pro Glu Ser
290 295 300
Lys Asn His Glu Ala Lys Asn Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val
305 310 315 320
Met Cys Pro Phe Glu Gln Tyr Ala Tyr Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly
325 330 335
Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Lys
340 345 350
Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Lys Ile
355 360 365
Phe Leu Lys Ala Glu Ser Glu Glu Asp Ile Phe Thr His Leu Gly Leu
370 375 380
Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
385 390
<210> 15
<211> 384
<212> PRT
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 截短的跳鼠
<400> 15
Ser Ser Glu Leu Glu Leu Leu Asp Val Ser Trp Leu Ile Glu Cys Met
1 5 10 15
Gly Ala Gly Lys Pro Val Glu Met Thr Gly Arg His Gln Leu Val Lys
20 25 30
Gln Thr Phe Cys Leu Pro Gly Phe Ile Leu Gln Asp Ala Phe Asp Ile
35 40 45
Leu Ala Glu Asn Cys Glu Phe Arg Glu Asn Glu Ala Ser Cys Val Glu
50 55 60
Phe Met Arg Ala Ala Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Pro Ile Ile
65 70 75 80
Ser Val Lys Asp Thr Glu Gly Ile Pro Trp Leu Gly Gly Lys Val Lys
85 90 95
Cys Val Ile Glu Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys
100 105 110
Ala Leu Leu Asn Asp Glu Arg Tyr Lys Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser
115 120 125
Val Phe Gly Val Gly Leu Lys Thr Ala Glu Arg Trp Phe Arg Met Gly
130 135 140
Phe Arg Thr Leu Ser Thr Val Lys Leu Asp Lys Ser Leu Thr Phe Thr
145 150 155 160
Arg Met Gln Lys Ala Gly Phe Leu His Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys
165 170 175
Val Thr Arg Ala Glu Ala Glu Ala Val Ser Val Leu Val Gln Gln Ala
180 185 190
Val Val Ala Phe Leu Pro Asp Ala Leu Val Ser Met Thr Gly Gly Phe
195 200 205
Arg Arg Gly Lys Lys Ile Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser
210 215 220
Pro Glu Ala Thr Glu Glu Glu Glu Gln Gln Leu Leu His Lys Val Thr
225 230 235 240
Asn Phe Trp Glu Gln Lys Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Asp His Val Glu
245 250 255
Ser Thr Phe Glu Lys Cys Lys Leu Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu
260 265 270
Asp His Phe Gln Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu Tyr Arg Glu Arg
275 280 285
Val Asp Ser Val Lys Ser Ser Gln Gln Glu Gly Lys Gly Trp Lys Ala
290 295 300
Ile Arg Val Asp Leu Val Met Cys Pro Tyr Glu Cys Arg Ala Phe Ala
305 310 315 320
Leu Leu Gly Trp Thr Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg
325 330 335
Tyr Ala Thr His Glu Arg Lys Met Arg Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr
340 345 350
Asp Lys Thr Lys Arg Val Phe Leu Lys Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile
355 360 365
Phe Ala His Leu Gly Leu Glu Tyr Ile Glu Pro Leu Glu Arg Asn Ala
370 375 380
<210> 16
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 在本发明的方法中产生的示例性cDNA (图1B)
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(32)
<223> n是a、c、g、t或u
<400> 16
tttttttnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nn 32
<210> 17
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 图4A的过程中产生的示例性cDNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> n是a、c、g、t或u
<400> 17
tttttttttt ttttn 15
<210> 18
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 抗体条形码
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(13)
<223> n是a、c、g、t或u
<400> 18
aaaaaaannn nnn 13

Claims (25)

1.一种在存活细胞上合成具有预定序列的寡核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供具有游离3’-羟基的起始子，所述起始子被附接至所述细胞的细胞表面分子或被锚定在所述细胞的细胞表面膜中；
b)在生物条件下重复以下步骤的多于一个循环：(i)使具有游离3’-O-羟基的所述起始子或延长的片段与3’-O-封闭的核苷三磷酸和不依赖模板的DNA聚合酶接触，使得所述起始子或延长的片段通过掺入3’-O-封闭的核苷三磷酸延长以形成3’-O-封闭的延长的片段，和(ii)使所述延长的片段去封闭以形成具有游离3’-羟基的延长的片段，从而合成预定序列的寡核苷酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述3’-O-封闭的核苷三磷酸是3’-磷酸核苷三磷酸，并且所述去封闭步骤通过用3’-磷酸酶活性处理所述3’-O-封闭的延长的片段来进行。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述3’-磷酸酶活性由T4多核苷酸激酶、重组虾碱性磷酸酶或牛小肠碱性磷酸酶提供。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述3’-O-封闭的核苷三磷酸是3’-酯封闭的核苷三磷酸，并且所述去封闭步骤通过用酯酶活性处理所述3’-O-酯封闭的延长的片段来进行。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物条件包括pH在6.8至7.8的范围内的缓冲生理盐和在15℃至41℃的范围内的温度。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述存活细胞是哺乳动物细胞。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述起始子包括具有共价附接至5’末端的亲脂性锚的寡核苷酸，其中所述亲脂性锚稳定地插入所述存活细胞的细胞表面膜中。
8.一种生成具有细胞特异性寡核苷酸条形码的cDNA文库的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在生物条件下，在细胞群中每个细胞的细胞表面膜上合成独特的寡核苷酸条形码，以形成条形码编码的细胞的群体；
(b)将每个条形码编码的细胞分离到反应器中；
(c)裂解每个反应器中的条形码编码的细胞；
(4)在每个反应器中进行逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)，以产生具有细胞特异性寡核苷酸条形码的cDNA文库。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述合成步骤包括(a)将起始子附接至所述群体的每个所述细胞的所述细胞表面膜上，和(b)重复以下循环：(i)在生物条件下，使具有游离3’-O-羟基的所述起始子或延长的片段与3’-O-封闭的核苷三磷酸和不依赖模板的DNA聚合酶接触，使得所述起始子或延长的片段通过掺入3’-O-封闭的核苷三磷酸延长以形成3’-O-封闭的延长的片段，和(ii)使所述延长的片段去封闭以形成具有游离3’-羟基的延长的片段。
10.根据权利要求9所述的方法，其中每个所述循环还包括在将所述细胞的所述群体拆分到单独的反应混合物中，在所述单独的反应混合物中，所述起始子或延长的片段被不同种类的核苷三磷酸延长以形成所述延长的片段，之后将单独的反应混合物的所述细胞组合。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的方法，其中所述反应器是油包水乳液的胶束。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述胶束由微流体装置产生。
13.根据权利要求9至12中任一项所述的方法，其中来自所述反应器的所述cDNA被组合并通过高通量DNA测序进行分析。
14.一种用预定核苷酸序列延伸一个或更多个天然多核苷酸的方法，所述方法包括：
在TdT反应条件下，在反应混合物中提供一个或更多个天然多核苷酸，所述天然多核苷酸具有游离3’-羟基；和
通过以下步骤的重复循环，用预定序列的核苷酸延伸所述一个或更多个天然多核苷酸：(i)使具有游离3’-O-羟基的所述天然多核苷酸或延长的天然多核苷酸与3’-O-封闭的核苷三磷酸和TdT变体接触，使得所述天然多核苷酸或所述延长的天然多核苷酸通过掺入3’-O-封闭的核苷三磷酸延长，以形成3’-O-封闭的延长的天然多核苷酸，和(ii)使所述延长的天然多核苷酸去封闭以形成具有游离3’-羟基的延长的天然多核苷酸，从而在所述天然多核苷酸上合成预定序列的寡核苷酸。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述预定核苷酸序列包括至少多于一种不同种类的核苷酸。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述预定核苷酸序列对于每个天然多核苷酸是独特的。
17.根据权利要求14至16中任一项所述的方法，其中每个所述循环还包括将所述天然多核苷酸或延长的天然多核苷酸拆分到单独的反应混合物中，在所述单独的反应混合物中，所述天然多核苷酸或延长的天然多核苷酸被不同种类的核苷三磷酸延长以形成所述延长的天然多核苷酸，之后将所述单独的反应混合物的所述延长的天然多核苷酸组合。
18.一种生成各自具有寡核苷酸标记物的cDNA文库的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)通过将mRNA与附接至一个或更多个固体支持物的捕获寡核苷酸杂交来捕获所述mRNA，其中所述捕获寡核苷酸与所述mRNA的区段互补，并且其中所述捕获寡核苷酸通过5’-末端附接至所述一个或更多个固体支持物，并且含有具有游离3’-羟基的3’-末端；
(b)将所述捕获寡核苷酸的3’末端使用捕获的mRNA作为模板用逆转录酶延伸，以在所述一个或更多个固体支持物上形成cDNA文库；
(c)通过无模板酶促合成在所述一个或更多个固体支持物的cDNA上合成寡核苷酸标记物。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述捕获步骤包括在珠上捕获单细胞的mRNA以形成是细胞特异性cDNA文库的所述cDNA文库，并且其中所述寡核苷酸标记物是独特的细胞特异性寡核苷酸条形码。
20.根据权利要求18或19所述的方法，其中所述合成所述独特的细胞特异性条形码的步骤通过拆分和混合合成方法实现。
21.根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中所述一个或更多个固体支持物是具有与其附接的所述捕获寡核苷酸的固体表面，其中所述捕获步骤包括捕获置于所述固体表面上的透化组织切片的mRNA，以形成保存所述组织切片的cDNA的空间分布的空间cDNA文库阵列。
22.根据权利要求18至21中任一项所述的方法，其中所述合成步骤包括在所述空间cDNA文库阵列上的多于一个不同预定位置的每一个处合成独特的位置标签，以形成位置标签-cDNA缀合物。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述方法还包括释放和测序所述位置标签-cDNA缀合物以确定所述mRNA在所述组织切片中的空间分布的步骤。
24.根据权利要求21至23中任一项所述的方法，其中所述固体表面包括与其附接的结合化合物，用于捕获预定非核酸配体。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述结合化合物包括一种或更多种抗体，每种抗体对所述预定非核酸配体之一具有预定特异性，每种不同类型的抗体都具有附接的可释放的寡核苷酸条形码，藉由所述寡核苷酸条形码可以鉴定所述抗体。
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