JP2021510074A - ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼの改変体およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、テンプレートなしで核酸配列を酵素的に合成するための、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)の改変体およびその使用に関する。より詳細には、本発明は、決定されたおよび制御された配列を有する核酸分子を合成するための、改変ヌクレオチドの組み込みに適したそのような改変体に関する。
固相ホスホルアミダイト化学に基づく核酸のデノボ化学合成のための方法は、過去40年間にわたって、主に使用されかつ改良されてきた。その技術は、固体支持体マトリクスに結合された、成長しているオリゴヌクレオチド鎖上に、1サイクルあたり1個の塩基を付加する、4工程の鎖伸長サイクルからなる。その技術は、過去数十年間の間に核酸を合成する一般に好まれる方法であったが、この技術は、いくつかの顕著な限界がある:それは、多数の溶媒および試薬の使用を要求し、化学反応効率における限界に起因して、合成オリゴヌクレオチドの長さは、代表的には、150〜200塩基を超えない。さらに、これらの短いフラグメントは、所望のDNA配列を提供するためにさらにアセンブリされる必要がある。
制御された配列を有するポリヌクレオチドのデノボ合成のための、テンプレートを使用しないTdTに関して研究することによって、本発明者らは、上記TdTの触媒ドメインのいくつかの標的としたアミノ酸残基を具体的に改変して、このような改変TdTの能力をポリヌクレオチドの合成のために改善し得ることを発見した。より詳細には、本発明者らは、改変ヌクレオチドを用いるとしても、特注の核酸を合成する全体的なコストを低減するようにもたらす、標的としたアミノ酸置換(複数可)を有する改変TdTを開発した。上記改変TdTは、野生型TdTと比較して、1個またはこれより多くの標的としたアミノ酸置換を示し得る。より詳細には、上記改変TdTは、少なくとも、1個またはこれより多くの標的としたアミノ酸置換(複数可)を有する触媒ドメインのアミノ酸配列(配列番号2)を示す。本発明のテンプレート非依存性ポリメラーゼは、ポリヌクレオチドを、より速く、より安価に、および/またはより良好な品質で合成することを可能にする。
DNAポリメラーゼファミリーは、それらの配列相同性および結晶構造に基づいて7つのファミリーに分けられる。それらの中で、PolXファミリーのポリメラーゼは、複製ポリメラーゼからターミナルトランスフェラーゼ酵素までの広く種々のポリメラーゼを代表する。PolXファミリーのポリメラーゼは、非常に広い範囲の真核生物にわたって存在する。PolXファミリーのポリメラーゼは、多種多様な生物学的プロセスに、特に、DNA損傷修復機構またはエラー修正機構に関わっている。そのPolXファミリーは、ポリメラーゼβ(Pol β)、μ(Pol μ)、λ(Pol λ)、酵母由来のIV(Pol IV)およびターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)に再編成する。TdTは、DNA修復および維持機構に天然に関わっている。特に、TdTは、テンプレート鎖の非存在下ですら、ヌクレオチド重合活性を保存する特有の能力を有する。特異的条件においてかつ天然のヌクレオチドを用いると、TdTは、数百ヌクレオチドを有するDNAフラグメントを、いかなる相補鎖の非存在下でも伸長できる。しかし、野生型TdTは、糖−改変ヌクレオチドを効率的に組み込むことが完全にできない。
本明細書で使用される場合、用語「変異体(mutant)」および「改変体(variant)」とは、配列番号2に由来し、かつ改変または変更、すなわち、1個またはこれより多くの(例えば、数個の)位置において置換、挿入、および/または欠失を含みかつテンプレートなしのポリメラーゼ活性および1種またはこれより多くの改変ターミネーターヌクレオチドを組み込む能力の両方を有するポリペプチドをいうために、交換可能に使用され得る。その改変体は、当該分野で周知の種々の技術によって得られ得る。特に、野生型タンパク質をコードするDNA配列を変更するための技術の例としては、部位特異的変異誘発、ランダム変異誘発および合成オリゴヌクレオチド構築が挙げられるが、これらに限定されない。変異誘発活性は、タンパク質の、または本発明の場合には、ポリメラーゼの配列中の1または数個のアミノ酸を欠失、挿入、または置換することにある。標的としたアミノ酸は、そのポリメラーゼの配列全体に沿って付随または分布され得る。例えば、特異的モチーフまたは構造的特徴は、標的とされ得る。
本発明は、所定の配列のポリヌクレオチド(例えば、DNAまたはRNA)を、テンプレート鎖を使用せずに合成するために使用され得るTdT酵素の改変体を提供する。本発明のTdT改変体は、改変ヌクレオチド、およびより詳細には、3’O−改変ヌクレオチドが、ポリヌクレオチド合成の酵素媒介性方法において使用されることを可能にする。
1つの実施形態において、TdTの改変体は、そのN末端、C末端または両方の末端に任意のタイプのタグ化ペプチド(例えば、His−タグ配列)をさらに含む。上記タグ化ペプチドは、精製、同定、発現の増大、分泌性または触媒活性の増大のために使用され得る。このような種々のタグが、文献中に広範に記載され、従って、当業者に公知の全てのタグが、本発明によって網羅されることは、理解される。
本発明によれば、TdTの改変体は、改変ヌクレオチド、好ましくは改変3’O−ヌクレオチドおよびより好ましくは3’O−ブロックヌクレオチドを組み込み得る。
−O−Z
を結合しており、
ここで−Zは、−C(R’)2−O−R”、−C(R’)2−N(R”)2、−C(R’)2−N(H)R”、−C(R’)2−S−R”および−C(R’)2−Fのうちのいずれかであり、ここで各R”は、除去可能な保護基であるか、その保護基の一部であり;各R’は独立して、is 水素原子、アルキル、置換されたアルキル、アリールアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、複素環式、アシル、シアノ、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシもしくはアミド基、または連結基を通じて結合された検出可能な標識であり;ただし、いくつかの実施形態において、このような置換基は、10個までの炭素原子および/または5個までの酸素もしくは窒素ヘテロ原子を有するか;または(R’)2は、式=C(R”’)2のアルキリデン基を表し、ここで各R”’は、同じであっても異なっていてもよく、水素およびハロゲン原子を含む基ならびにアルキル基から選択されるが、ただしいくつかの実施形態において、各R’”のアルキルは、1〜3個の炭素原子を有し;ここでその分子が反応して、各R”がHに交換される中間体を生じ得るか、あるいはZは、−(R’)2−Fであり、そのFは、OH、SHまたはNH2、好ましくはOHに交換され、その中間体は、水性条件下で解離して、遊離3’−OHを有する分子を生じる;ただしここでZは、−C(R’)2−S−R”であり、両方のR’基は、Hではない。ある種の実施形態において、その改変ヌクレオチドまたはヌクレオシドのR’は、アルキルまたは置換されたアルキルであるが、ただしこのようなアルキルまたは置換されたアルキルは、1〜10個の炭素原子および0〜4個の酸素または窒素ヘテロ原子を有する。ある種の実施形態において、その改変ヌクレオチドまたはヌクレオシドの−Zは、式−C(R’)2−N3のものである。ある種の実施形態において、Zは、アジドメチル基である。
本発明の目的は、Ybert et al, WO2015/159023; Jensen et al, Biochemistry, 57: 1821−1832 (2018); Hiatt et al, 米国特許第5808045号に記載されるような、核酸の合成のために使用され得るTdTの改変体を提供することである。より詳細には、本発明の目的は、改変ヌクレオチドを開始核酸鎖に付加するために適したTdTの改変体を提供することである。次いで、そのブロッキング基は、改変ヌクレオチドの新たな付加を可能にするために除去され得る。
a.固体支持体に連結された核酸分子を提供する工程;
b.以前の核酸分子と、可逆的ターミネーター改変ヌクレオチドおよび本発明に従うTdTの改変体とを反応させる工程;
を包含する。
a.固体支持体に連結された核酸分子を提供する工程;
b.可逆的改変ヌクレオチドおよび本発明に従うTdTの改変体を添加する工程;
c.その固体支持体からの1またはいくつかの試薬の第1の除去工程;
d.その可逆的改変ヌクレオチドの可逆的部分を、さらなるその後の伸長のために、その可逆的部分を脱保護するために反応させる工程;
e.その固体支持体からの1またはいくつかの試薬の第2の除去工程;
f.必要に応じておよび最後に、その核酸分子をその固体支持体から切断する工程、
を包含する。
a. 上記フラグメントの一方の末端へXiヌクレオチドを伸長させる段階であって、Xは、1〜5の間、好ましくは1〜3の間であることが可能であり、iは、そのサイクル数であり、n+Xiのヌクレオチドを含むフラグメントを得ることを可能にし(第1段階として公知)であり、以下のステージを含む段階:
− 第1の支持体に、開始核酸フラグメントまたは伸長の過程にある核酸フラグメント(n個のヌクレオチドを含む)の第1の末端を結合させる第1のステージ、
− TdTの改変体に必要な試薬を添加するステージ、
− TdTの改変体が上記核酸フラグメントの第2の末端にXiヌクレオチドを付加するステージであって、Xは、1〜5の間、好ましくは1〜3の間であり、iは、そのサイクル数であるステージ、
− その反応媒体から望ましくない試薬を除去する必要に応じたステージ、
− 上記第1の支持体から、n+Xiヌクレオチドを含む上記フラグメントを解離させるステージ、
− n+Xiヌクレオチドを含む上記フラグメントを移動させる第1のステージ、
b. n+Xiヌクレオチドを含む正確な配列を有するフラグメントを精製する段階(第2段階として公知)であって、以下の連続するステージを含む段階:
− 第2の支持体に、n+Xiヌクレオチドを含む上記フラグメントを、その第1段階の間に付加されたXiヌクレオチドを有するそれらの末端によって結合させる第2のステージ、
− その第2の支持体に結合していなかったフラグメントを除去するステージ、
− n+Xiヌクレオチドを含む上記フラグメントを上記第2の支持体から解離させるステージ、
− 上記反応媒体から、望ましくない残留試薬を除去する必要に応じたステージ;
c. n+Xiヌクレオチドを含む正確な配列を有するフラグメントを増幅する、好ましくは酵素により増幅する(例えば、PCRによって)必要に応じた段階(第3段階として公知)であって、以下の連続するステージを含む段階:
− 増幅に必要な試薬を添加するステージ、
− n+Xiヌクレオチドを含むフラグメントの乗算係数(multiplication factor)Yiによる乗算のステージ(必要に応じて、そのプロセスを可能にするサブステージから構成される)であって、iは、サイクル数であり、Yは1〜4×1010の間、好ましくは1〜1×109の間であることが可能であるステージ、
− n+Xiヌクレオチドを含むフラグメントを移動させるステージ、
を含み、各サイクルは、酵素による付加および酵素による増幅と適合性の反応媒体(例えば、水性媒体)中で行われ、その合成プロセスはまた、そのi回の伸長サイクルの全ての最後に、乗算係数Yfによる、最終増幅するステージを含む。
また、本発明の目的は、本発明の改変体をコードする核酸分子を提供することである。本明細書で使用される場合、「核酸分子」とは、ヌクレオシドのポリマーを指す。一実施形態において、その核酸はDNAである。代替の実施形態において、その核酸はRNAである。代替の実施形態において、その核酸はXNAである。
核酸合成、オリゴヌクレオチド合成、プローブ合成、タグ化、核酸増幅、アプタマー、治療用核酸分子、創薬ターゲットおよび検証、疾患診断、代謝工学、データ格納、収穫物改良、ライブラリーデザイン、シーケンシングプール、核酸標識もしくは結合、または核酸分子が関わる任意の他の適用のために使用されるべきTdTの改変体の使用が、本明細書で記載される。
本発明の改変体は、公知の対照標準すなわち野生型TdTをコードするポリヌクレオチドを変異させ、次いで、これを従来の分子生物学技術を使用して発現させることによって、生成され得る。例えば、マウスTdT遺伝子(配列番号1)は、従来の分子生物学技術を使用して、例えば、Stemmer et al, Gene, 164: 49−53 (1995); Kodumal et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 101: 15573−15578 (2004)などによって記載されるプロトコールを使用して、合成フラグメントからアセンブリされ得るか、またはそれは、Boule et al, Mol. Biotechnology, 10: 199−208 (1998)、もしくはBentolila et al, EMBO J., 14: 4221−4229 (1995)などによって記載されるプロトコールを使用して、マウス細胞から直接クローニングされ得る。
本発明の特定の局面は、必要に応じて、開始フラグメント、1種またはこれより多くの可逆的ターミネーターヌクレオチド、さらなる酵素および切断反応において使用される試薬から選択される1種またはこれより多くの構成要素の任意の組み合わせとともに、本発明にまたは本発明の任意の特定の局面に従うTdTの改変体を含む組成物およびTdTの改変体を含むキットの使用に関する。上記キットは、酵素による核酸合成の方法において使用され得る。
発現株生成
TdTマウス遺伝子を、[Boule et al., 1998, Mol. Biotechnol. 10, 199−208]に記載されるpET28プラスミドから生成した。配列番号4の配列(Tag TdT)を、標準的な分子生物学技術を通じて、以下のプライマーを使用することによって増幅した:
そのpCTdTベクターを、出発ベクターとして使用する。1またはいくつかの点変異を含む特異的プライマーを、Agilentオンラインソフトウェアから生成した(http://www.genomics.agilent.com:80/primerDesignProgram.jsp)。市販のキットQuickChange II(Agilent)を使用して、標的とした変異を含む所望の改変ポリメラーゼを生成した。実験手順は、供給者のプロトコールに従った。そのDSiまたはDSi’改変体をコードする得られたプラスミドを、pDSiまたはpDSi’と称する(ここでiは、表1または表2に示される改変体の番号である)。その異なるpDSiまたはpDSi’ベクターの生成後に、それらの各々を配列決定した。正確な配列を有するベクターを、E.coliプロデューサー株(先に記載されるとおり)において形質転換した。カナマイシンLB−アガープレート上で成長し得るコロニーを単離し、Ec−DSiまたはEc−DSi’と称する。
Ec−CTdTおよびEc−DSiまたはEc−DSi’株を使用して、適切な量のカナマイシンを補充した50mLのLB培地を含む250mL フラスコ(erlen)に接種した。37℃で一晩成長させた後、適切な容積のこれら前培養物を使用して、カナマイシンを有する2L LB培地を含む5L フラスコに接種した。その5L培養物の初期ODは、0.01であるように選択する。そのフラスコを強力な撹拌下で37℃に置き、その異なる培養物のODを、定期的にチェックする。0.6〜0.9の間で構成されるODに達した後に、各フラスコに、1mLの1M IPTG(イソプロピルβ−D−1−チオガラクトピラノシド, Sigma)を添加することによって補充する。そのフラスコを、撹拌へと戻して37℃の制御された温度の下に置く。一晩の発現後に、その細胞を、いくつかのペレットで採取する。その同じ改変体を発現するペレットをプールし、−20℃で、最終的には数カ月間貯蔵する。
以前に調製したペレットを、30〜37℃ ウォーターバス中で解凍する。いったん完全に解凍すると、ペレットを、50mM tris−HCL(Sigma) pH7.5、150mM NaCl(Sigma)、0.5mM メルカプトエタノール(Sigma)、5% グリセロール(Sigma)、20mM イミダゾール(Sigma)およびプロテアーゼカクテルインヒビターの100mLのための1錠(Thermofisher)から構成される溶解緩衝液中に再懸濁する。早過ぎる溶解および凝集物の残留を回避するために、再懸濁を注意深く行う。再懸濁した細胞を、完全な色の均一性が得られるまで数サイクルのフレンチプレスによって溶解する。使用される通常の圧力は、14,000psiである。次いで、溶解物を1時間〜1時間30分、10,000rpmにおいて遠心分離する。遠心分離物を、0.2μmフィルタに通して、カラム精製の前にいかなるデブリをも除去する。
1工程アフィニティ手順を使用して、その生成し、抽出したポリメラーゼ酵素を精製する。Ni−NTAアフィニティカラム(GE Healthcare)を使用して、そのポリメラーゼを結合させる。最初に、そのカラムを15カラム容積の50mM tris−HCL(Sigma) pH7.5、150mM NaCl Sigma)および20mM イミダゾール(Sigma)で洗浄および平衡化している。平衡化した後に、ポリメラーゼをそのカラムに結合させる。次いで、洗浄緩衝液(50mM tris−HCL(Sigma) pH7.5、500mM NaCl(Sigma)および20mM イミダゾール(Sigma)から構成される)を、15カラム容積にわたってそのカラムに適用する。洗浄後、そのポリメラーゼを、50mM tris−HCL(Sigma) pH7.5、500mM NaCl(Sigma)および0.5M イミダゾール(Sigma)で溶離する。目的のポリメラーゼの最高濃度に相当する画分を集め、1つのサンプルにプールする。そのプールした画分を、透析緩衝液(20mM Tris−HCl, pH6.8、200mM NaCl、50mM MgOAc、100mM [NH4]2SO4)に対して透析する。その透析物を、その後、濃縮フィルタ(Amicon Ultra−30, Merk Millipore)の助けを借りて濃縮する。濃縮した酵素を、最終50% グリセロールを添加した小さなアリコートで分配し、次いで、それらアリコートを−20℃で凍結し、長期間貯蔵する。その精製した酵素の5μLの種々の画分を、SDS−PAGEゲルで分析する。
活性試験
実施例1に従って生成、発現および精製した表1からの改変体DS11、DS29、DS173、DS659、DS874の伸長成績を、以下のアッセイによって評価する。その結果は全て、互いとおよびその野生型TdT酵素(配列番号1)とおよびいかなるポリメラーゼ酵素をも欠くコントロールチューブと比較する。
その分析は、ポリアクリルアミドゲル分析が関わっている。活性試験からのサンプルを、ポリアクリルアミド 16%(biorad)変性ゲルによって分析する。ゲルを、ガラスプレートの内部にポリアクリルアミドを注ぎ、それを重合させることによって、その分析直前に作製する。そのガラスプレート内部のゲルを、電気泳動工程のためにTBE緩衝液(Sigma)を満たした適合するタンクに取り付ける。その分析されるべきサンプルを、そのゲルの頂部に載せる。500〜2,000Vの電圧を、そのゲルの頂部と底部との間に、3〜6時間室温において印加する。そのサンプル標的サイズに従って一旦移動したら、システムを取り外し、ゲル蛍光を、Typhoon機器(GE Life Sciences)を使用してスキャンする。画像獲得の後に、ImageJソフトウェア(imagej.nih.gov/ij/)を使用して、その改変ヌクレオチドの組み込みのパーセンテージを分析する。
活性試験
実施例1に従って生成、発現および精製した表2からの改変体DS928およびDS950の伸長成績を、以下のアッセイによって評価した。その結果は全て、以前の研究から得た参照改変体(配列番号9)とおよびいかなるポリメラーゼ酵素をも欠くコントロールチューブと比較した。
5’−TTTTTTTTTTTTAAATAAGG−3’(配列番号8)。
分析には、液体クロマトグラフィーおよび質量分析計検出および定量(LC/MS)を使用した。活性試験からのサンプルを、LC/MSによって分析した。サンプルを、そのLC/MS機器に載せ、標準的なオリゴヌクレオチド分離法を行った。データの獲得に続いて、デコンボリューションおよびスペクトル計算を行った。
Claims (16)
- (i)残基C302または機能的に等価な残基に相当する位置において少なくとも1個のアミノ酸置換を有する、配列番号2に示されるアミノ酸配列または機能的に等価な配列を含み、ここで前記位置は、配列番号1に示されるアミノ酸配列を参照することによって番号付けされる、(ii)テンプレートなしに核酸フラグメントを合成し得る、および(iii)前記核酸フラグメントに改変ヌクレオチドを組み込み得る、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)の改変体。
- 前記置換は、C302G/R/P/A/V/S/N/Q/Dから、好ましくはC302G/Rから選択される、請求項1に記載のTdTの改変体。
- 前記改変体は、M192、L260、R336、D379、R454およびE457から選択される残基、機能的に等価な残基に相当する位置で少なくとも1個のアミノ酸置換をさらに含む、請求項1または2に記載のTdTの改変体。
- 前記改変体は、M192、L260、R336、D379、R454およびE457から選択される残基に相当する位置で、少なくとも2個のアミノ酸置換、好ましくは少なくとも3個の、より好ましくは少なくとも4個の、さらにより好ましくは少なくとも5個の、およびより好ましくは6個のアミノ酸置換をさらに含む、請求項3に記載のTdTの改変体。
- 前記置換は、M192R/Q/G/A/V/D/N/H/E、L260P/M/E/N/F/K/D/A/G、R336N/L/K/H/G/D/A/P、D379V/A/G/N/E/R/H/K/T、R454P/N/A/L/K/H/G/D、およびE457N/T/S/L/V/K/H/G/Dから選択され、好ましくはM192R/Q、L260P、R336L/N、D379V、R454P/NおよびE457N/L/T/Sから選択される、請求項3または4に記載のTdTの改変体。
- 前記改変体は、T340、G413、H416、E418、W450、およびA510から選択される残基、または機能的に等価な残基に相当する位置で、好ましくはT340S/N/Q/C/G/M/K/D、G413L/S/P/R、H416D、E418A/V、W450Y/F/P/L/I/V/A/G/E、およびA510V/T/Gから選択される少なくとも1個の置換をさらに含む、前記請求項のいずれか1項に記載のTdTの改変体。
- 前記改変体は、L181、A237、L260、T340、G413、H416、E418、W450、R480およびA510から選択される残基、または機能的に等価な残基に相当する位置で少なくとも1個の置換を、好ましくは置換の組み合わせL181F+A237V+R480Kおよび/もしくはG413L/S+H416D+E418A、または機能的に等価な残基をさらに含む、前記請求項のいずれか1項に記載のTdTの改変体。
- 前記改変体は、配列番号2、または機能的に等価な配列のN末端および/またはC末端において、Hisタグ配列のようなタグ配列をさらに含む、前記請求項のいずれか1項に記載のTdTの改変体。
- 前記改変体は、少なくとも、表1で開示される置換の組み合わせから選択される置換の組み合わせ、または機能的に等価な残基を含む、前記請求項のいずれか1項に記載のTdTの改変体。
- 請求項1〜9のいずれかに定義されるとおりのTdTの改変体をコードする核酸分子。
- 請求項10に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
- 請求項10に記載の核酸分子または請求項11に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- 請求項1〜9のいずれかに定義されるとおりのTdTの改変体を生成するためのプロセスであって、ここで請求項12に記載の宿主細胞は、前記改変体をコードする前記核酸の発現を可能にする培養条件下で培養され、前記改変体は、必要に応じて回収される、プロセス。
- 3’O−改変ヌクレオチドを用いて、テンプレートなしに核酸分子を合成するための、請求項1〜9のいずれかに定義されるとおりのTdTの改変体の使用。
- テンプレートなしで核酸分子を合成するためのプロセスであって、前記プロセスは、核酸プライマーと、少なくとも1個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも1個の3’O−改変ヌクレオチド、および請求項1〜9のいずれかに定義されるとおりのTdTの改変体の両方とを接触させる工程を包含するプロセス。
- 請求項1〜9のいずれかに定義されるとおりのTdTの改変体、および1種またはこれより多くのヌクレオチド、好ましくは、1種またはこれより多くの3’O−改変ヌクレオチド、ならびに必要に応じて少なくとも1種の核酸プライマーを含む、ヌクレオチド組み込み反応を行うためのキット。
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