JP2023506760A - ポリヌクレオチドのテンプレートフリー酵素合成のためのキメラ末端デオキシヌクレオチド転移酵素 - Google Patents

Abstract

本発明は、異なる種からのバリアントに由来するキメラである末端デオキシヌクレオチド転移酵素を使用するポリヌクレオチドの酵素的テンプレートフリー合成のための組成物及び方法に関する。【選択図】なし

Description

広範囲の長さの予め決まった配列の高度に精製された安価なポリヌクレオチドの使用は、ゲノム及び診断配列決定、多重核酸増幅、治療用抗体開発、合成生物学、核酸ベースの治療薬、ＤＮＡオリガミ、ＤＮＡベースのデータ保存などを含む多くの技術の中心となっている。最近、例えばＹｂｅｒｔ等の国際特許公開第２０１５／１５９０２３号；Ｈｉａｔｔ等の米国特許第５７６３５９４号；Ｊｅｎｓｅｎ等，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５７：１８２１－１８３２（２０１８）など、実証された酵素の効果と穏やかな非毒性反応条件の利点のため、化学ベース合成法を、末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）などのテンプレートフリーのポリメラーゼを使用する酵素ベース法で補足し又はこれに置き換えることに関心が集まっている。酵素ベース合成法における殆どのアプローチは、ポリヌクレオチド生成物において所望の配列を得るために、可逆的にブロックされたヌクレオシドトリホスフェートの使用を必要とする。残念ながら、天然のＴｄＴは、未修飾ヌクレオシドトリホスフェートと比較して効率が低下した修飾ヌクレオシドトリホスフェートを取り込んでいる。従って、多くの研究が、例えばＣｈａｍｐｉｏｎ等の米国特許出願公開第２０１９／０２１１３１５号；Ｙｂｅｒｔ等の国際特許公開第２０１７／２１６４７２号など、修飾ヌクレオシドトリホスフェートのより優れた取り込み効率、並びに成長鎖の異なる３’配列間の取り込み変動の低減、製造可能性の改善などの他の性能特性を備えた新しいＴｄＴバリアントの開発に向けられている。

上記に鑑みると、新ＴｄＴバリアントなどの新しいテンプレートフリーポリメラーゼと、使用方法が、改善された安定性と可逆的にブロックされたヌクレオシドトリホスフェートの取り込みのために利用可能ならば、テンプレートフリー酵素ベースのポリヌクレオチド合成の分野は進歩するであろう。

本発明は、ポリヌクレオチドのテンプレートフリー酵素合成のための方法及び組成物に関する。本発明は、異なる種に由来するアミノ酸配列を含み、可逆的にブロックされたヌクレオシドトリホスフェートをポリヌクレオチドに取り込む際の改善された効率、安定性の改善、製造可能性の改善、又は配列特異的取り込み率の変動の減少を含む一又は複数の改善を示すデオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）バリアントのキメラであるＴｄＴバリアントとその組成物を含む。本発明はまた予め決まった配列のポリヌクレオチドを合成するためにそのようなキメラＴｄＴバリアントを使用する方法及びキットを含む。

より特定的には、本発明は、式：
Ｂ_１－Ｂ_２－Ｂ_３
［上式中、
Ｂ_１は、ＢＲＣＴ様領域を持たない第一の種のＴｄＴのアミノ酸セグメントであり、そのＮ末端からそのＶＳＣモチーフとそのＫＭＴモチーフの間のアミノ酸位置まで伸び、ここで、Ｂ_１はそのＦＭＲモチーフにメチオニン又は機能的に同等の残基の置換を、Ｂ_１がＧＧＦＲＲモチーフを含む場合は常にそのＧＧＦＲＲモチーフに第二のアルギニン又は機能的に同等の残基の置換を、並びにＢ_１がＶＳＣモチーフを含む場合は常にそのＶＳＣモチーフにバリン若しくはセリン若しくはシステイン又は機能的に同等の残基の一又は複数の置換をそれぞれ含み；
Ｂ_２は、Ｂ_１のＣ末端から第二の種のＴｄＴのＣ末端まで、又はＢ_３が一又は複数のアミノ酸を含む場合は常にＢ_３のＮ末端まで伸びる第二の種のＴｄＴのアミノ酸セグメントであり、ここで、Ｂ_２は、Ｂ_２がＶＳＣモチーフを含む場合は常にそのＶＳＣモチーフにバリン若しくはセリン若しくはシステイン又は機能的に同等の残基の一又は複数の置換を、Ｂ_２がＧＧＦＲＲモチーフを含む場合は常にそのＧＧＦＲＲモチーフに第二のアルギニン又は機能的に同等の残基の置換を、Ｂ_２がＴＧＳＲモチーフを含む場合は常にそのＴＧＳＲモチーフにアルギニン又は機能的に同等の残基の置換を、並びにＢ_２がＦＥＲモチーフを含む場合は常にそのＦＥＲモチーフにグルタミン酸又は機能的に同等の残基の置換を含み；且つ
Ｂ_３は、０から７０個のアミノ酸を含み、第三の種のＴｄＴのＣ末端からＢ_２のＣ末端アミノ酸まで伸びる第三の種のＴｄＴのアミノ酸セグメントであり、ここで、Ｂ_３は、Ｂ_３がＴＧＳＲモチーフを含む場合は常にそのＴＧＳＲモチーフにアルギニン又は機能的に同等の残基の置換を、並びにＢ_３がＦＥＲモチーフを含む場合は常にそのＦＥＲモチーフにグルタミン酸又は機能的に同等の残基の置換を含み；
ここで、キメラＴｄＴバリアントは、（ｉ）テンプレートなしで核酸断片を合成することができ、（ｉｉ）３’－Ｏ－ブロックヌクレオシドトリホスフェートを核酸断片に取り込むことができ；
且つ、Ｂ_１、Ｂ_２及びＢ_３は、キメラＴｄＴバリアントが３５０から４１０個のアミノ酸を有するように選択される］
によって定まるアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント同一であるアミノ酸配列を含むキメラ末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）バリアントに関する。

本発明はまた、式：
Ｊ_１－Ｊ_２－Ｊ_３
［上式中、
Ｊ_１は、ＢＲＣＴ様領域を持たないマウスＴｄＴのアミノ酸セグメントであり、そのＮ末端からＶＳＣモチーフとＫＭＴモチーフの間のアミノ酸位置まで伸び、ここで、Ｊ_１はＦＭＲモチーフにメチオニン又は機能的に同等の残基の置換を、Ｊ_１がＧＧＦＲＲモチーフを含む場合は常にそのＧＧＦＲＲモチーフに第二のアルギニン又は機能的に同等の残基の置換を、並びにＪ_１がＶＳＣモチーフを含む場合は常にそのＶＳＣモチーフにバリン若しくはセリン若しくはシステイン又は機能的に同等の残基の一又は複数の置換をそれぞれ含み；
Ｊ_２は、ＶＳＣモチーフとＫＭＴモチーフとの間に位置するアミノ酸位置からＴＧＳＲモチーフのアミノ酸位置まで伸びる非マウスＴｄＴのアミノ酸セグメントであり、ここで、アミノ酸セグメントは、Ｊ_２がＧＧＦＲＲモチーフを含む場合は常にそのＧＧＦＲＲモチーフに第二のアルギニン又は機能的に同等の残基の置換を、並びにＪ_２がＶＳＣモチーフを含む場合は常にそのＶＳＣモチーフにバリン若しくはセリン若しくはシステイン又は機能的に同等の残基の一又は複数の置換を含み；且つ
Ｊ_３は、ＴＧＳＲモチーフのアミノ酸位置からそのＣ末端アミノ酸まで伸びるマウスＴｄＴのアミノ酸セグメントであり、ここで、Ｊ_３は、Ｊ_３がＴＧＳＲモチーフを含む場合は常にそのＴＧＳＲモチーフにアルギニン又は機能的に同等の残基の置換を、並びにＪ_３がＦＥＲモチーフを含む場合は常にそのＦＥＲモチーフにグルタミン酸又は機能的に同等の残基の置換を含み；
ここで、キメラＴｄＴバリアントは、（ｉ）テンプレートなしで核酸断片を合成することができ、（ｉｉ）３’－Ｏ－ブロックヌクレオシドトリホスフェートを核酸断片に取り込むことができ；
且つ、Ｊ_１、Ｊ_２及びＪ_３は、キメラＴｄＴバリアントが３５０から４１０個のアミノ酸を有するように選択される］
によって定まるアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント同一であるアミノ酸配列を含むキメラ末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）バリアントに関する。

幾つかの実施態様では、本発明のキメラＴｄＴバリアントは、三つの隣接セグメント、すなわちＢＲＣＴ様断片を持たないＮ末端セグメント、内部セグメント及びＣ末端セグメントを含み、ここで、Ｎ末端セグメントとＣ末端セグメントはそれぞれ第一の種のＴｄＴに由来し、内部セグメントは第二の種のＴｄＴに由来する。幾つかの実施態様では、Ｎ末端セグメントと内部セグメントとの間の境界はＶＳＣモチーフにあり、内部セグメントとＣ末端セグメントとの間の境界はＴＧＳＲモチーフにある。他の実施態様では、Ｎ末端セグメントと内部セグメントとの間の境界はＫＭＴモチーフにあり、内部セグメントとＣ末端セグメントとの間の境界はＴＧＳＲモチーフにある。他の実施態様では、Ｎ末端セグメントと内部セグメントとの間の境界はＶＳＣモチーフにあり、内部セグメントとＣ末端セグメントとの間の境界はＫＭＴモチーフにある。ここで使用される場合、示されたモチーフにおけるセグメント間の境界の出現は、境界がモチーフ内に、或いはモチーフのＮ末端アミノ酸からＮ末端方向に１から１５アミノ酸までに、或いはモチーフのＣ末端アミノ酸からＣ末端方向に１から１５アミノ酸までに位置しうることを意味する。幾つかの実施態様では、そのような境界位置は、モチーフのＮ末端アミノ酸からＮ末端方向に１から１０アミノ酸、又はモチーフのＣ末端アミノ酸からＣ末端方向に１から１０アミノ酸でありうる。幾つかの実施態様では、そのような境界位置は、モチーフのＮ末端アミノ酸からＮ末端方向に１から５アミノ酸、又はモチーフのＣ末端アミノ酸からＣ末端方向に１から５アミノ酸でありうる。幾つかの実施態様では、上記のキメラＴｄＴバリアントのＮ末端セグメントとＣ末端セグメントは、それぞれ、マウスＴｄＴバリアントに由来する。幾つかの実施態様では、そのようなマウスセグメントは、表２に記載されるように、一又は複数の変異、或いは複数の変異を受ける。

幾つかの実施態様では、本発明は、以下に記載される単離されたキメラＴｄＴバリアントを含む。

一態様では、本発明は、（ａ）遊離３’－ヒドロキシルを有するイニシエーターを提供する工程；及び（ｂ）（ｉ）伸長条件下で、遊離３’－Ｏ－ヒドロキシルを有するイニシエーター又は伸長断片を３’－Ｏ－ブロックヌクレオシドトリホスフェート及びキメラＴｄＴバリアントと接触させて、イニシエーター又は伸長断片が３’－Ｏ－ブロック（且つ任意選択的に塩基保護）ヌクレオシドトリホスフェートの取り込みにより伸長されて３’－Ｏ－ブロック伸長断片を形成し、且つ（ｉｉ）伸長断片をデブロックして遊離３’－ヒドロキシルを有する伸長断片を形成するサイクルを、ポリヌクレオチドが合成されるまで繰り返す工程を含む、本発明のキメラＴｄＴバリアントを使用してポリヌクレオチドを合成する方法に関する。

本発明は更にａ）請求項１から２０の何れか一項に記載のキメラＴｄＴバリアント、ｂ）一又は複数のヌクレオチド、好ましくは一又は複数の３’－Ｏ－ブロックヌクレオシドトリホスフェート、及びｃ）任意選択的に、少なくとも一種の核酸プライマーを含む、ヌクレオチド取り込み反応を実施するためのキットに関する。

図１は、本発明のＴｄＴバリアントを使用するテンプレートフリー酵素核酸合成法の工程を図式的に示している。

本発明のキメラＴｄＴバリアントの構造を図式的に示している。

図３Ａ－３Ｂは、ＴｄＴバリアントＭ２７、Ｍ５７及びＭ５９での合成中に異なる三量体配列（又は「コドン」）で発生する欠失の割合を示すデータを示している。 上記

本発明は、様々な変形例及び代替形態に適しているが、その詳細は、図面に例として示され、詳しく記載される。意図は、本発明を記載された特定の実施態様に限定することではないことを理解されたい。本発明の精神及び範囲内に入る全ての変形例、均等物、及び代替物を包含することが意図される。本発明の態様に関するガイダンスは、当業者によく知られている多くの入手可能な参考文献及び論文に見出される。

本発明は、キメラＴｄＴバリアントと、３’－Ｏ－可逆的ブロックヌクレオシドトリホスフェートを使用する所与の（又は同等に、予め決まった、又はユーザーが決定した）配列のポリヌクレオチドのテンプレートフリー又はテンプレート非依存性の合成におけるそれらの使用に関する。本発明のＴｄＴバリアントは、二以上の異なる生物種、通常は異なる哺乳動物種からの複数のアミノ酸セグメントを含むという意味で「キメラ」である。幾つかの実施態様では、アミノ酸セグメントの複数とは２又は３であり、幾つかの実施態様では、そのようなセグメントは、２つの異なる種から、また他の実施態様では３つの異なる種から選択されうる。すなわち、幾つかの実施態様では、２つ又は３つのセグメントが２つの異なる種から得られる。３つのセグメントが２つの異なる種に由来する場合は常に、第一の種の２つのセグメントが、得られるキメラＴｄＴバリアントのＮ末端とＣ末端にあり、第二の種のＴｄＴセグメントはそれらの間に挟まれている。何れの場合も、選択されたセグメントは、３’－Ｏ－可逆的ブロックヌクレオシドトリホスフェートに対するキメラＴｄＴバリアントの取り込み活性を高めるアミノ酸置換を以下に示される位置に有するＴｄＴバリアントからのものである。幾つかの実施態様では、異なる種からのセグメント間の境界の位置と本発明のキメラＴｄＴバリアントにおけるアミノ酸置換の位置は、全てのＴｄＴタンパク質、特に哺乳動物ＴｄＴタンパク質のアミノ酸配列において生じ、科学文献においてよく知られているか又はここで定義される複数の配列モチーフとの関連で定義される。本発明のキメラＴｄＴバリアントにおけるアミノ酸セグメントの順序付けは、天然ＴｄＴに見出される配列モチーフの順序及び数を維持する。すなわち、各天然ＴｄＴには、ある順序と数の配列モチーフがある（例えば、Ｎ末端からＣ末端へ：ＦＭＲ、ＶＳＣ、ＧＧＦＲＲ、ＫＭＴ、ＴＧＳＲ、ＦＥＲなど）。本発明の各キメラＴｄＴバリアントは、同じ順序及び数のそのような配列モチーフを有する。

３つの異なる種からの３つのセグメントを含む本発明のキメラＴｄＴバリアントの幾つかの実施態様について図２に示されるように、Ｂ_１は種１のＴｄＴバリアント（２００）、Ｂ_２は種２のＴｄＴバリアント（２０２）、及びＢ_３は種３のＴｄＴバリアント（２０４）由来である。本発明のキメラＴｄＴは、例えばＤｅｌａｒｕｅ等，ＥＭＢＯ Ｊ．，２１（３）：４２７－４３９（２００２）のように野生型又は天然に生じるＴｄＴにある約１３０アミノ酸を典型的には含むＮ末端ＢＲＣＴ様セグメントを含んでいない。すなわち、本発明の全てのキメラＴｄＴバリアントは、それらのＢＲＣＴ様セグメント分、Ｎ末端が切断されている。幾つかの実施態様では、Ｂ_１セグメントのＮ末端アミノ酸は、一般的な配列アラインメントツール、例えば、Ｍｕｌｔａｌｉｎ（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，９（５）：６１４－６１５（１９９３））を使用して、その配列を、配列番号：２の切断型マウスＴｄＴ又は同様の配列とアラインメントすることによって、全長ＴｄＴから容易に決定される。矢印（２０６ａ、２０６ｂ、２０８ａ及び２０８ｂ）で示されるように、セグメントＢ_１とＢ_２の間及びセグメントＢ_２とＢ_３の間の境界は、示された配列モチーフの位置によって定義され（且つ矢印によって示され）る示された領域内の異なるキメラＴｄＴバリアントに対して異なりうる：Ｂ_１－Ｂ_２境界はＶＳＣモチーフとＫＭＴモチーフの間の任意のアミノ酸位置に位置し得、Ｂ_２－Ｂ_３境界はＤＲＲモチーフ（又は均等にＣ末端から約７０アミノ酸のアミノ酸位置）とキメラＴｄＴバリアントのＣ末端の間の任意のアミノ酸位置に位置しうる。すなわち、幾つかの実施態様では、セグメントＢ_３は、ゼロのアミノ酸を含みうるか、言い換えれば、実施態様が２つの異なる種からの２つのセグメントのみからなるように存在しない場合がある。

ここで使用される周知のＴｄＴ配列モチーフには、（全長マウスＴｄＴ、例えば、配列番号：１に関して測定される）３３０－３４０アミノ酸セグメントに又はその近くに位置するＧＧＦＲＲ（又はＴＧＧＦＲＲＧ）モチーフと（再び、全長マウスＴｄＴ、例えば、配列番号：１に関して測定される）４５０－４６０アミノ酸セグメントに又はその近くに位置するＴＳＧＲモチーフが含まれる。これらと更なる配列モチーフＦＲＭ（配列番号：１に関して１８５－１９５アミノ酸セグメントの近くに位置）、ＶＳＣ（配列番号：１に関して２９５－３０５アミノ酸セグメントの近くに位置）、ＫＭＴ（配列番号：１に関して３３５－３４５アミノ酸セグメントの近くに位置）及びＦＥＲ（配列番号：１に関して４５０－４６５アミノ酸セグメントの近くに位置）が本発明の幾つかの実施態様を定めるために使用される。或いは、ＫＭＴモチーフにおけるアミノ酸置換は、（配列番号：１に関してアミノ酸セグメント３４－３４５に又はその近くに位置する）ＧＧＦＲＲモチーフとＧＨＤモチーフとの間のセグメント内のアミノ酸置換として同等に定義されうる。幾つかの実施態様では、ＫＭＴモチーフは、代替的に、例えばＤｅｌａｒｕｅ等（上に引用）など、ＴＧＧＦＲＲＧモチーフとＧＨＤモチーフ（非包括的）との間のアミノ酸セグメントとして定義されうる。他の実施態様では、ＫＭＴモチーフは、ＫＭＴ、ＫＫＩ、ＫＫＭ、ＫＥＦ、ＫＫＶ、ＫＫＬ及びＫＫＴからなる群から選択される、ＴＧＧＦＲＲＧモチーフとＧＨＤモチーフとの間の３アミノ酸セグメントである。幾つかの実施態様では、ＦＭＲモチーフは、ＦＭＲ、ＦＬＲ及びＹＭＲからなる群から選択される１８５－２００アミノ酸セグメント（配列番号：１に関して）に又はその近くに位置する３アミノ酸セグメントである。幾つかの実施態様では、ＶＳＣモチーフは、ＶＳＣ、ＩＤＣ、ＩＳＳ、ＴＳＹ、ＳＫＡ、ＳＫＰ、ＳＲＡ及びＡＳＣからなる群から選択されるアミノ酸セグメント２９５－３０５（配列番号：１に関して）に又はその近くに位置する３アミノ酸セグメントである。幾つかの実施態様では、ＴＧＳＲモチーフは、ＴＧＳＲ、ＴＧＳＰ及びＳＧＳＲからなる群から選択されるアミノ酸セグメント４４５－４６０（配列番号：１に関して）に又は近くに位置する４アミノ酸セグメントである。幾つかの実施態様では、ＦＥＲモチーフは、ＦＥＲ及びＦＧＲからなる群から選択されるアミノ酸セグメント４５４－４６０（配列番号：１に関して）に又はその近くに位置する３アミノ酸セグメントである。配列モチーフに関して使用される場合、幾つかの実施態様では、「近く」又は「に」という用語は、示された範囲又はモチーフの１５アミノ酸以内、或いは示された範囲又はモチーフの１０アミノ酸以内を意味する。様々なモチーフの位置はＴｄＴの種毎に異なりうるが、ＴｄＴアミノ酸配列に沿ったモチーフの順序は全ての種に対して同じであり、配列モチーフのペア間の相対的間隔（アミノ酸単位で）は、次の表１に選択されたモチーフに対して示されているように、高度に保存されている。従って、モチーフは、本発明のキメラＴｄＴを作製するアミノ酸セグメントを定義するための有用なマイルストーンである。

幾つかの実施態様では、本発明のキメラＴｄＴバリアントは、式：
Ｂ_１－Ｂ_２－Ｂ_３
によって定まるアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント同一であるアミノ酸配列を有し、上式中、

Ｂ_１は、ＢＲＣＴ様領域を持たない第一の種のＴｄＴのアミノ酸セグメントであり、そのＮ末端からそのＶＳＣモチーフとそのＫＭＴモチーフの間のアミノ酸位置まで伸び、ここで、Ｂ_１はそのＦＭＲモチーフにメチオニン又は機能的に同等の残基の置換を、Ｂ_１がＧＧＦＲＲモチーフを含む場合は常にそのＧＧＦＲＲモチーフに第二のアルギニン（Ｎ末端からＣ末端）又は機能的に同等の残基の置換を、並びにＢ_１がＶＳＣモチーフを含む場合は常にそのＶＳＣモチーフにバリン若しくはセリン若しくはシステイン又は機能的に同等の残基の一又は複数の置換をそれぞれ含み；

Ｂ_２は、Ｂ_１のＣ末端から第二の種のＴｄＴのＣ末端まで、又はＢ_３が一又は複数のアミノ酸を含む場合は常にＢ_３のＮ末端まで伸びる第二の種のＴｄＴのアミノ酸セグメントであり、ここで、Ｂ_２は、Ｂ_２がＶＳＣモチーフを含む場合は常にそのＶＳＣモチーフにバリン若しくはセリン若しくはシステイン又は機能的に同等の残基の一又は複数の置換を、Ｂ_２がＧＧＦＲＲモチーフを含む場合は常にそのＧＧＦＲＲモチーフに第二のアルギニン又は機能的に同等の残基の置換を、Ｂ_２がＴＧＳＲモチーフを含む場合は常にそのＴＧＳＲモチーフにアルギニン又は機能的に同等の残基の置換を、並びにＢ_２がＦＥＲモチーフを含む場合は常にそのＦＥＲモチーフにグルタミン酸又は機能的に同等の残基の置換を含み；且つ

Ｂ_３は、０から７０個のアミノ酸を含み、第三の種のＴｄＴのＣ末端からＢ_２のＣ末端アミノ酸まで伸びる第三の種のＴｄＴのアミノ酸セグメントであり、ここで、Ｂ_３は、Ｂ_３がＴＧＳＲモチーフを含む場合は常にそのＴＧＳＲモチーフにアルギニン又は機能的に同等の残基の置換を、並びにＢ_３がＦＥＲモチーフを含む場合は常にそのＦＥＲモチーフにグルタミン酸又は機能的に同等の残基の置換を含み；且つ、キメラＴｄＴバリアントは、（ｉ）テンプレートなしで核酸断片を合成することができ、（ｉｉ）３’－Ｏ－ブロックヌクレオシドトリホスフェートを核酸断片に取り込むことができ；且つ、Ｂ_１、Ｂ_２及びＢ_３は、キメラＴｄＴバリアントが３５０から４１０個のアミノ酸を有するように選択される。

幾つかの実施態様では、上に記載したキメラＴｄＴバリアントは、配列番号：２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２７、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０及び４１からなる群のアミノ酸配列から選択されるＢ_１、Ｂ_２及びＢ_３セグメントを有し、ここで、各Ｂ_１セグメントは、（ｉ）ＦＭＲモチーフ内のメチオニン又はその機能的に同等の残基の置換が、配列番号：２、３、４、６、７、８、１１、１２及び１３に関して６３位；配列番号：５に関して６２位；配列番号：９に関して６４位；配列番号：１０、２６、２８、２９、３０、３２、３３、３４、３６、３７、３８及び３９に関して６１位；配列番号：１４に関して６６位；配列番号：１５に関して４７位；配列番号：２７、３１、３５及び４０に関して４８位にあり；（ｉｉ）ＶＳＣモチーフ内のバリン又はその機能的に同等の残基の置換が、配列番号：２、３、４、６、７、８、１１及び１２に関して１７１位；配列番号：５、３２、３３、３４、３６、３７、３８、３９及び４１に関して１７０位；配列番号：９に関して１７２位；配列番号：１０、２８、２９、３０、３２、３３、３４、３６、３７、３８、３８及び４１に関して１６９位；配列番号：１３に関して１８０位；配列番号：１４に関して１７４位；配列番号：１５に関して１５４位；配列番号：２６に関して１６８位；配列番号：２７、３５及び４０に関して１５６位；配列番号：３１に関して１５７位にあり；（ｉｉｉ）前記ＶＳＣモチーフ内のセリン又はその機能的に同等の残基の置換が、配列番号：２、３、４、６、７、８、１１及び１２に関して１７２位；配列番号：５に関して１７１位；配列番号：９に関して１７３位；配列番号：１０、２８、２９、３０に関して１７０位；配列番号；１３に関して１８１位；配列番号：１４に関して１７５位；及び配列番号：１５に関して１５５位；配列番号：２６に関して１６９位及び配列番号：２７、３１、３５及び４０に関して１５７位にあり；（ｉｖ）前記ＶＳＣモチーフ内のシステイン又はその機能的に同等の残基の置換が、配列番号：２、３、４、６、７、８、１１及び１２に関して１７３位；配列番号：５に関して１７２位；配列番号：９に関して１７４位；配列番号：１０、２８、２９、３０、３２、３３、３４、３７、３８、３９及び４１に関して１７１位；配列番号：１３に関して１８２位；配列番号：１４に関して１７６位；配列番号：２６に関して１７０位；配列番号：２７、３１、３５、３６及び４０に関して１５８位；及び配列番号：１５に関して１５６位にあり；且つ各Ｂ_２セグメントは、前記ＧＧＦＲＲモチーフ内の第二のアルギニン又はその機能的に同等の残基の置換が、配列番号：２、３、４、６、７、８、１１及び１２に関して２０７位；配列番号：５に関して２０６位；配列番号：９に関して２０８位；配列番号：１０、２８、２９、３０、３２、３３、３４、３６、３７、３８、３９及び４１に関して２０５位；配列番号：２６に関して２０４位；配列番号：２７、３１、３５及び４０に関して１９２位；配列番号：１３に関して２１６位；配列番号：１４に関して２１０位；配列番号：１５に関して１９０位にあり；且つ、各Ｂ_３セグメント（又は幾つかの実施態様ではＢ_２セグメント）は、（ｉ）前記ＴＧＳＲモチーフのアルギニン又は機能的に同等の残基の置換が、配列番号：２、７、８、１２及び３３に関して３２５位；配列番号：３、４、２９及び３２に関して３２４位；配列番号：５に関して３２０位；配列番号：６に関して３３１位；配列番号：９及び２６に関して３２６位；配列番号：２８、３０に関して３２７位；配列番号：１０に関して３２３位；配列番号：１１及び１４に関して３２８位；配列番号：１３に関して３３８位；配列番号：２７、３１に関して３１４位；配列番号：３５に関して３１０位；配列番号：３１に関して３１１位；配列番号：３２に関して３２１位；配列番号：３３、３４に関して３２２位；配列番号：３６、３７、３８、３９及び４１に関して３２３位；配列番号：４０に関して３０９位；及び配列番号：１５に関して３０８位にあり；且つ（ｉｉ）ＦＥＲモチーフのグルタミン酸又は機能的に同等の残基の置換が、配列番号：２、７、８及び１２に関して３２８位；配列番号：３、４及び２９に関して３２７位；配列番号：５に関して３２３位；配列番号：６に関して３３４位；配列番号：９及び２６に関して３２９位；配列番号：１０、３６、３７、３８、３９及び４１に関して３２６位；配列番号：１１及び１４に関して３３１位；配列番号：１３に関して３４１位；配列番号：２７に関して３１７位；配列番号：２８及び３０に関して３３０位；配列番号：４０に関して３１２位；配列番号：３５に関して３１３位；配列番号：３１に関して３１４位；配列番号：３２に関して３２４位；配列番号：３３及び３４に関して３２５位：及び配列番号：１５に関して３１１位にある。

幾つかの実施態様では、本発明のキメラＴｄＴバリアントは、（ｉ）Ｒ又はＱであるＦＭＲモチーフにおけるメチオニン又は機能的に同等の残基の置換；（ｉｉ）Ｌ又はＮであるＧＧＦＲＲモチーフの第二のアルギニン又は機能的に同等の残基の置換；及び（ｉｉｉ）Ｇ、Ｒ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｓ、Ｎ、Ｑ、又はＤであり、或いは幾つかの実施態様ではＧ又はＲであるＶＳＣモチーフにおけるシステイン又は機能的に同等の残基の置換；（ｉｖ）Ｐ、Ｎ又はＡである前記ＴＧＳＲモチーフにおけるアルギニン又は機能的に同等の残基の置換；及び（ｖ）Ｎ、Ｌ、Ｔ、又はＳである前記ＦＥＲモチーフにおけるグルタミン酸又は機能的に同等の残基の置換を含む。

幾つかの実施態様では、上記の同一性パーセント値は、示されたＢ_１－Ｂ_２－Ｂ_３アミノ酸配列と少なくとも８０パーセントの同一性であり；幾つかの実施態様では、上記の同一性パーセント値は、示されたＢ_１－Ｂ_２－Ｂ_３アミノ酸配列と少なくとも９０パーセントの同一性であり；幾つかの実施態様では、上記の同一性パーセント値は、示されたＢ_１－Ｂ_２－Ｂ_３アミノ酸配列と少なくとも９５パーセントの同一性であり；幾つかの実施態様では、上記の同一性パーセント値は少なくとも９７パーセントの同一性であり；幾つかの実施態様では、上記の同一性パーセント値は少なくとも９８パーセントの同一性であり；幾つかの実施態様では、上記の同一性パーセント値は少なくとも９９パーセントの同一性である。

幾つかの実施態様では、キメラＴｄＴバリアントは、Ｂ_１及びＢ_３が上記のようにマウスＴｄＴバリアントに由来し、Ｂ_２が上記のようにウシＴｄＴバリアントに由来する、マウス及びウシＴｄＴバリアントのキメラを含む。特に、本発明のキメラＴｄＴバリアントは、マウスＴｄＴバリアントＭ５３（配列番号：２１）とウシＴｄＴバリアントＭ５４（配列番号：２２）から得られたＢ_１、Ｂ_２及びＢ_３セグメントを含みうる。幾つかのそのようなキメラＴｄＴバリアントでは、Ｂ_１及びＢ_３はＭ５３に由来し、Ｂ_２はＭ５４に由来する。

幾つかの実施態様では、キメラ末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）バリアントは、アミノ酸の３つのセグメント、すなわち（ａ）Ｎ末端からＶＳＣモチーフの位置まで伸びる（そのＢＲＣＴ様断片を持たない）マウスＴｄＴのＮ末端セグメント、（ｂ）ＶＳＣモチーフの位置からＴＧＳＲモチーフのＮ末端方向の約５－１５アミノ酸まで（又はＴＧＳＲモチーフの位置まで）伸びる非マウスＴｄＴの中央又は内部セグメント、及び（ｃ）ＴＧＳＲモチーフからＮ末端方向に５－１５アミノ酸の位置からマウスＴｄＴセグメントのＣ末端まで伸びるマウスＴｄＴからのＣ末端セグメントを含む。

幾つかの実施態様では、キメラ末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）バリアントは、式：
Ｊ_１－Ｊ_２－Ｊ_３
によって定まるアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント同一であるアミノ酸配列を含み、上式中、

Ｊ_１は、ＢＲＣＴ様領域を持たないマウスＴｄＴのアミノ酸セグメントであり、そのＮ末端からそのＶＳＣモチーフとそのＫＭＴモチーフの間のアミノ酸位置まで伸び、ここで、Ｊ_１はＦＭＲモチーフにメチオニン又は機能的に同等の残基の置換を、Ｊ_１がＧＧＦＲＲモチーフを含む場合は常にそのＧＧＦＲＲモチーフに第二のアルギニン又は機能的に同等の残基の置換を、並びにＪ_１がＶＳＣモチーフを含む場合は常にＶＳＣモチーフにバリン若しくはセリン若しくはシステイン又は機能的に同等の残基の一又は複数の置換をそれぞれ含み；

Ｊ_２は、ＶＳＣモチーフとＫＭＴモチーフとの間に位置するアミノ酸位置からＴＧＳＲモチーフのアミノ酸位置まで伸びる非マウスＴｄＴのアミノ酸セグメントであり、ここで、アミノ酸セグメントは、Ｊ_２がＧＧＦＲＲモチーフを含む場合は常にそのＧＧＦＲＲモチーフに第二のアルギニン又は機能的に同等の残基の置換を、Ｊ_２がＶＳＣモチーフを含む場合は常にそのＶＳＣモチーフにバリン若しくはセリン若しくはシステイン又は機能的に同等の残基の一又は複数の置換を含み；且つ

Ｊ_３は、ＴＧＳＲモチーフのアミノ酸位置からそのＣ末端アミノ酸まで伸びるマウスＴｄＴのアミノ酸セグメントであり、ここで、Ｊ_３は、Ｊ_３がＴＧＳＲモチーフを含む場合は常にそのＴＧＳＲモチーフにアルギニン又は機能的に同等の残基の置換を、Ｊ_３がＦＥＲモチーフを含む場合は常にそのＦＥＲモチーフにグルタミン酸又は機能的に同等の残基の置換を含み；ここで、キメラＴｄＴバリアントは、（ｉ）テンプレートなしで核酸断片を合成することができ、（ｉｉ）３’－Ｏ－ブロックヌクレオシドトリホスフェートを核酸断片に取り込むことができる。上記のように、Ｊ_１、Ｊ_２及びＪ_３は、キメラＴｄＴバリアントが３５０から４１０個のアミノ酸を有するように選択される。

幾つかの実施態様では、そのようなキメラＴｄＴバリアントは、式：
Ｊ_１－Ｊ_２－Ｊ_３
によって定まるアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント同一であるアミノ酸配列を含み、上式中、

Ｊ_１は、配列番号：４２、７１、７３又は８２から選択されるアミノ酸配列を有するアミノ酸セグメントであり；

Ｊ_２は、それぞれ３５位にアルギニンの置換を有する、配列番号：４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９又は７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアミノ酸セグメントであり；且つ

Ｊ_３は、配列番号：４３に関して１２位にアルギニン及び１５位にグルタミン酸の置換を有する、配列番号：４３のアミノ酸配列、或いは配列番号：７２のアミノ酸配列を有するアミノ酸セグメントであり；ここで、キメラＴｄＴバリアントは、（ｉ）テンプレートなしで核酸断片を合成することができ、（ｉｉ）３’－Ｏ－ブロックヌクレオシドトリホスフェートを核酸断片に取り込むことができる。

幾つかの実施態様では、Ｊ_１は、配列番号：８２のアミノ酸配列を有するアミノ酸セグメントであり；Ｊ_２は、配列番号：５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６２及び６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアミノ酸セグメントであり；且つＪ_３は、配列番号：４３に関して１２位にアルギニン及び１５位にグルタミン酸の置換を有する、配列番号：４３のアミノ酸配列、或いは配列番号：７２のアミノ酸配列を有するアミノ酸セグメントである。

幾つかの実施態様では、配列番号：４２のアミノ酸配列は、６３位にメチオニンの置換を更に有し；配列番号：４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９及び７０のアミノ酸配列はそれぞれ１位にシステインの置換を更に有し；且つ配列番号：４３のアミノ酸配列は３８位にアルギニンの置換を更に有する。

更なる実施態様では、６３位でのメチオニンの置換はＲ又はＱであり、３５位でのアルギニンの置換はＬ又はＮであり、１位でのシステインの置換はＧ又はＲである。

幾つかの実施態様では、Ｊ_２は、配列番号：５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６９又は７０などの哺乳動物のＴｄＴから選択されるアミノ酸配列を有するアミノ酸セグメントである。幾つかの実施態様では、Ｊ_２は、配列番号：５８などのウシＴｄＴから選択されるアミノ酸セグメントである。

更なる実施態様では、配列番号：４２のアミノ酸配列は、１７位にアラニン、５２位にロイシン、５７位にグリシン、６３位にメチオニン及び１０８位にアラニンの置換を更に有する。

幾つかの実施態様では、上記の同一性パーセント値は、示されたＪ_１－Ｊ_２－Ｊ_３アミノ酸配列と少なくとも８０パーセントの同一性であり；幾つかの実施態様では、上記の同一性パーセント値は、示されたＪ_１－Ｊ_２－Ｊ_３アミノ酸配列と少なくとも９０パーセントの同一性であり；幾つかの実施態様では、上記の同一性パーセント値は、示されたＪ_１－Ｊ_２－Ｊ_３アミノ酸配列と少なくとも９５パーセントの同一性であり；幾つかの実施態様では、上記の同一性パーセント値は、示されたＪ_１－Ｊ_２－Ｊ_３アミノ酸配列と少なくとも９７パーセントの同一性であり；幾つかの実施態様では、上記の同一性パーセント値は、示されたＪ_１－Ｊ_２－Ｊ_３アミノ酸配列と少なくとも９８パーセントの同一性であり；幾つかの実施態様では、上記の同一性パーセント値は、示されたＪ_１－Ｊ_２－Ｊ_３アミノ酸配列と少なくとも９９パーセントの同一性である。

上記実施態様の発明は、上記キメラＴｄＴバリアントＪ_１－Ｊ_２－Ｊ_３が、以下に記載されるように、一般的なサーマルシフトアッセイに基づき、Ｍ５７（配列番号：２３）などの以前のＴｄＴバリアントよりも高い熱安定性を有しているという本出願人による発見に部分的に基づいている。幾つかの実施態様では、そのような熱安定性の増加は、１－２℃の範囲にある。

更なる実施態様では、キメラＴｄＴバリアントは、式：
Ｒ_１－Ｒ_２－Ｒ_３
によって定まるアミノ酸配列と少なくとも９０パーセント同一であるアミノ酸配列を含み、上式中、

Ｒ_１は、Ｎ末端からＶＳＣモチーフの位置まで伸びるＢＲＣＴ様断片を持たないマウスＴｄＴのアミノ酸セグメントであり；

Ｒ_２は、ＶＳＣモチーフの位置からＴＧＳＲモチーフの位置まで伸びる非マウスＴｄＴのアミノ酸セグメントであり、Ｒ_２のＧＧＦＲＲモチーフの第二のアルギニンは置換されており；且つ

Ｒ_３は、ＴＧＳＲモチーフの位置からＣ末端まで伸びるマウスＴｄＴのアミノ酸セグメントであり、ＴＧＳＲモチーフのアルギニンが置換され、Ｒ_３のＦＥＲモチーフのグルタミン酸が置換されており；且つキメラＴｄＴバリアントは、（ｉ）テンプレートなしで核酸断片を合成することができ、（ｉｉ）３’－Ｏ－ブロックヌクレオシドトリホスフェートを核酸断片に取り込むことができる。

幾つかの実施態様では、Ｒ_１のＣ末端アミノ酸は、ＶＳＣモチーフの第二のアミノ酸であり；Ｒ_２のＮ末端アミノ酸はＶＳＣモチーフの第三のアミノ酸であり；Ｒ_２のＣ末端アミノ酸はＴＧＳＲモチーフからＮ末端方向に５から１０アミノ酸の領域にある。

幾つかの実施態様では、上記の同一性パーセント値は、示されたＲ_１－Ｒ_２－Ｒ_３アミノ酸配列と少なくとも９５パーセントの同一性であり；幾つかの実施態様では、上記の同一性パーセント値は、少なくとも９７パーセントの同一性であり；幾つかの実施態様では、上記の同一性パーセント値は、少なくとも９８パーセントの同一性であり；幾つかの実施態様では、上記の同一性パーセント値は、少なくとも９９パーセントの同一性である。

幾つかの実施態様では、キメラＴｄＴバリアントは、マウスＴｄＴ由来の少なくとも一つのアミノ酸セグメントとウシＴｄＴ由来の少なくとも一つのアミノ酸配列を含む。そのようなキメラＴｄＴバリアントには、配列番号：７４（ＨｉｓタグなしのＭ５７－Ｎ２７－８－１３ｃ７）、配列番号：７５（Ｈｉｓタグなしの４６－５５７）、配列番号：７６（Ｈｉｓタグなしの４６－３４２）、配列番号：７７（Ｈｉｓタグなしの４６－５７１）、配列番号：７８（ＨｉｓタグなしのＭ９２）、配列番号：７９（ＨｉｓタグなしのＭ９３）、配列番号：８０（ＨｉｓタグなしのＭ９４）及び配列番号：８１（ＨｉｓタグなしのＭ８８）を含むＴｄＴが含まれる。本出願人は、以下に記載されるように、一般的なサーマルシフトアッセイに基づいて、上記キメラＴｄＴバリアントが、Ｍ５７（配列番号：２３）などの以前のＴｄＴバリアントよりも高い熱安定性を有していることを発見した。幾つかの実施態様では、そのような熱安定性の増加は、１－２℃の範囲にある。

本発明のキメラＴｄＴバリアントは、選択されたアミノ酸の変異を追加的に受ける複数の異なる種由来のアミノ酸セグメントを含みうる。例えば、次の種のＴｄＴから構築されたキメラＴｄＴバリアントは、次の表に記載されるように、一以上の、又は複数の変異を受けうる：

本発明のキメラＴｄＴバリアントは、示された置換の存在を条件として、特定された配列番号における所与のセグメントの配列同一性パーセントを有するアミノ酸セグメントを含みうる。幾つかの実施態様では、このように記載される本発明のキメラＴＤＴバリアントと特定された配列番号との間の配列差の数及びタイプは、置換、欠失及び／又は挿入に起因し得、置換、欠失及び／又は挿入されたアミノ酸は、任意のアミノ酸を含みうる。幾つかの実施態様では、そのような欠失、置換及び／又は挿入は、天然に生じるアミノ酸のみを含む。幾つかの実施態様では、置換は、Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１８５：８６２－８６４（１９７４）に記載されているように、保存的又は同義のアミノ酸変化のみを含む。つまり、アミノ酸の置換は、その同義アミノ酸セットのメンバー間でのみ起こりうる。幾つかの実施態様では、用いられうる同義アミノ酸のセットは、表３Ａに示される。

幾つかの実施態様では、用いられうる同義アミノ酸のセットは、表３Ｂに示される。

［ヌクレオチド取り込み活性の測定］
本発明のバリアントによるヌクレオチド取り込みの効率は、例えば、Ｂｏｕｌｅ等（以下に引用）；Ｂｅｎｔｏｌｉｌａ等（以下に引用）；及びＨｉａｔｔ等の米国特許第５８０８０４５（後者は、ここに出典明示により援用される）に記載されるような、伸長、又はエロンゲーションアッセイによって測定されうる。簡潔に述べれば、そのようなアッセイの一形態では、遊離３’－ヒドロキシルを有する蛍光標識オリゴヌクレオチドを、ＴｄＴ伸長条件下で可逆的にブロックされたヌクレオシドトリホスフェートの存在下で予め決まった期間にわたって、試験されるバリアントＴｄＴと反応させ、その後に伸長反応を停止させ、伸長産物と非伸長イニシエーターオリゴヌクレオチドの量を、ゲル電気泳動による分離後に定量する。そのようなアッセイにより、バリアントＴｄＴの取り込み効率を、他のバリアントの効率又は野生型若しくは参照ＴｄＴ若しくは他のポリメラーゼの効率と容易に比較することができる。幾つかの実施態様では、バリアントＴｄＴ効率の尺度は、等価なアッセイにおける野生型ＴｄＴを使用した伸長産物の量に対するバリアントＴｄＴを使用した伸長産物の量の比（百分率として与えられる）でありうる。

幾つかの実施態様では、次の特定の伸長アッセイを使用して、ＴｄＴの取り込み効率を測定することができる：使用されるプライマーは次の通りである：
５’－ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＧＧＧ－３’（配列番号：２０）
また、プライマーは、５’端にＡＴＴＯ蛍光色素を有する。使用される代表的な改変ヌクレオチド（表４にｄＮＴＰとして示す）には、３’－Ｏ－アミノ－２’，３’－ジデオキシヌクレオチド－５’－トリホスフェート（ＯＮＨ２，Ｆｉｒｅｂｉｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、例えば３’－Ｏ－アミノ－２’，３’－ジデオキシアデノシン－５’－トリホスフェートなどが含まれる。試験されるそれぞれの異なるバリアントについて、一つのチューブを反応に使用する。試薬を、水から開始し、ついで、表４の順でチューブに添加する。３７℃で３０分後、ホルムアミド（Ｓｉｇｍａ）の添加によって反応を停止させる。

活性緩衝液は、例えば、ＣｏＣｌ_２を補充したＴｄＴ反応緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから入手可能）を含む。

アッセイの生成物を、一般的なポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析する。例えば、上記アッセイの生成物は、１６パーセントのポリアクリルアミド変性ゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）において分析されうる。ゲルは、分析直前に、ポリアクリルアミドをガラスプレートの内側に注ぎ、それを重合させることによって作製される。ガラスプレート内側のゲルを、電気泳動工程のためのＴＢＥ緩衝液（Ｓｉｇｍａ）を満たした適合タンクにマウントする。分析される試料を、ゲルの上部にロードする。５００から２０００Ｖの電圧を、ゲルの上部と下部との間に室温において３から６時間印加する。分離後、ゲルの蛍光を、例えば、Ｔｙｐｈｏｏｎスキャナー（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してスキャンする。ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）又はその同等物を使用してゲル画像を解析して、改変ヌクレオチドの取り込み率を計算する。

［ヘアピン完了アッセイ］ 一態様では、本発明は、ＴｄＴバリアントなどのポリメラーゼが、ポリヌクレオチド（すなわち、「試験ポリヌクレオチド」）の３’末端上にｄＮＴＰを取り込む能力を測定する方法を含む。一つのそのような方法は、試験ポリヌクレオチドに、それが実質的に一本鎖のみであるが、ＴｄＴバリアントなどのポリメラーゼを用いて伸長させると、一本鎖ループと二本鎖ステムを含む安定なヘアピン構造を形成する反応条件下で、遊離３’ヒドロキシルを提供することを含み、それにより、二本鎖ポリヌクレオチドの存在によって３’末端の伸長の検出が可能になる。二本鎖構造は、限定されないが、二本鎖構造中への挿入時に優先的に蛍光を発する蛍光色素、伸長したポリヌクレオチド上のアクセプター（又はドナー）と新たに形成されたヘアピンステムと三重鎖を形成するオリゴヌクレオチド上のドナー（又はアクセプター）との間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、両方が試験ポリヌクレオチドに結合し、ヘアピン形成時にＦＲＥＴ近傍にもたらされるＦＲＥＴアクセプター及びドナーなどを含む様々な方法で検出されうる。幾つかの実施態様では、単一ヌクレオチドによる伸長後の試験ポリヌクレオチドのステム部分は、４から６塩基対長の範囲にあり；他の実施態様では、そのようなステム部分は４から５塩基対長であり；更に他の実施態様では、そのようなステム部分は４塩基対長である。幾つかの実施態様では、試験ポリヌクレオチドの長さは、１０から２０ヌクレオチドの範囲であり；他の実施態様では、試験ポリヌクレオチドの長さは、１２から１５ヌクレオチドの範囲である。幾つかの実施態様では、伸長のないステムと伸長を伴うステムとの間の融解温度の差を最大にするヌクレオチドを用いて試験ポリヌクレオチドを伸長させることが有利又は簡便であり；従って、幾つかの実施態様では、試験ポリヌクレオチドは、ｄＣ又はｄＧを用いて伸長される（従って、試験ポリヌクレオチドは、ステム形成に適切な相補的ヌクレオチドを有するように選択される）。

ヘアピン完了アッセイのための例示的な試験ポリヌクレオチドには、ｄＧＴＰを用いた伸長によって完了するｐ８７５（５’－ＣＡＧＴＴＡＡＡＡＡＣＴ）（配列番号：１６）；ｄＣＴＰを用いた伸長によって完了するｐ８７６（５’－ＧＡＧＴＴＡＡＡＡＣＴ）（配列番号：１７）；及びｄＧＴＰを用いた伸長によって完了するｐ８７７（５’－ＣＡＧＣＡＡＧＧＣＴ）（配列番号：１８）が含まれる。そのような試験ポリヌクレオチドのための例示的な反応条件は、２．５－５μＭの試験ポリヌクレオチド、１：４０００希釈のＧｅｌＲｅｄ（登録商標）（Ｂｉｏｔｉｕｍ，Ｉｎｃ．，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡの挿入色素）、２００ｍＭのカコジラートＫＯＨ（ｐＨ６．８）、１ｍＭのＣｏＣｌ_２、０－２０％のＤＭＳＯ、並びに所望の濃度の３’ＯＮＨ_２ ｄＧＴＰ及びＴｄＴを含みうる。ヘアピンの完了は、３６０ｎｍに設定した励起フィルターセットと６３５ｎｍに設定した発光フィルターセットを使用した反応温度２８－３８℃でのＴＥＣＡＮリーダーなどの一般的な蛍光光度計を使用して、ＧｅｌＲｅｄ（登録商標）色素の蛍光の増加によってモニターされうる。

本発明のこの態様の幾つかの実施態様では、ＴｄＴバリアントは、次の工程によってヌクレオシドトリホスフェートをテンプレートなしで取り込むその能力について試験されうる：（ａ）遊離３’－ヒドロキシルを有する試験ポリヌクレオチド、ＴｄＴバリアント、及びヌクレオシドトリホスフェートを、試験ポリヌクレオチドが一本鎖であるが、ヌクレオシドトリホスフェートの取り込み時に、二本鎖ステム領域を有するヘアピンを形成する条件下で組み合わせる工程、及び（ｂ）ＴｄＴバリアントがヌクレオシドトリホスフェートを取り込む能力の尺度として、形成された二本鎖ステム領域の量を検出する工程。幾つかの実施態様では、ヌクレオシドトリホスフェートは、３’－Ｏ－ブロックヌクレオシドトリホスフェートである。

［ＴｄＴバリアントの安定性の測定］
タンパク質の安定性の増加は、様々な方法で測定することができる。蛍光ベースのサーマルシフトアッセイは、その単純さと低コストのため、このような測定に対して特に有用である。サーマルシフトアッセイとタンパク質安定性の測定へのそれらの応用を記載する例示的な参考文献は、次の通りである：Ｐａｎｔｏｌｉａｎｏ等，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，６（６）：４２９－４４０（２００１）；Ｈｕｙｎｈ等，Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，７９：２８．９．１－２８．９．１４；Ｅｒｉｃｓｓｏｎ等，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３５７：２８９－２９８（２００６）；Ｎｉｅｓｅｎ等，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２（９）：２２１２－２２２１（２００７）；及びＰａｎｔｏｌｉａｎｏ等の米国特許第６０２０１４１号（後者は出典明示によりここに援用される）。このようなアッセイの概念的基礎は、疎水性蛍光プローブへの曝露により、フォールドタンパク質とアンフォールドタンパク質を区別できることである。このようなプローブは水溶液でクエンチされるが、アンフォールディングタンパク質の露出した疎水性内部に優先的に結合し、クエンチングが急激に減少するため、容易に検出される蛍光発光を温度の関数として研究することができる。熱的に誘発されたアンフォールディングは、フォールド状態とアンフォールド状態の間に鋭い遷移がある典型的な二状態モデルに従う不可逆的なアンフォールディングプロセスであり、融解温度（Ｔｍ）は、タンパク質アンフォールディング遷移の温度の中間点として定義される。このようないわゆる「サーモフルオロ」法で得られる融解温度は、円二色性（ＣＤ）、濁度測定、及び示差走査熱量測定など、タンパク質安定性を測定するために使用される他の生物物理学的方法によって決定された値と、幾つかのタンパク質についてよく相関することが示されている。

室温での低蛍光は、十分に折り畳まれたタンパク質を示す。蛍光発光は温度の上昇と共に増加し、タンパク質の協調的なアンフォールディングを表すシグモイド曲線を生じる。得られたシグモイド曲線をボルツマン方程式に当てはめて、アンフォールディング遷移の中間点で起こる融解温度を特定することができる；或いは、Ｔｍは、温度の関数として蛍光発光の一次導関数（－ｄＦ／ｄＴ）をプロットすることによって簡単に同定され、ここで、Ｔｍは曲線の最小値に対応する（Ｈｕｙｎｈ等（上に引用））。

様々な蛍光色素を使用することができ、直接又はアッセイキットのパーツとして市販されている。例示的な蛍光色素はＳＹＰＲＯオレンジである。一般的なリアルタイムＰＣＲ装置は、温度制御と蛍光検出に使用できる。典型的には、緩衝液、塩濃度と組成、及びその他の添加剤、例えばＤＭＳＯの選択は、ＴｄＴバリアントを使用したＤＮＡ合成反応の取り込み又はカップリング条件に対応してなされる。例示的なカップリング条件を以下に与える。

上記のように、幾つかの実施態様では、Ｎ切断ＴｄＴバリアントの特定の位置での安定化アミノ酸置換（又は同等に、安定化アミノ酸）は、安定化アミノ酸置換を除いて、同じアミノ酸配列のＴｄＴの融解温度に対して少なくとも１℃だけ前記ＴｄＴバリアントの融解温度を上昇させるアミノ酸置換であり、融解温度は蛍光ベースのサーマルシフトアッセイによって決定される。幾つかの実施態様では、そのようなアッセイは、ＳＹＰＲＯオレンジ色素を使用する。また更なる実施態様では、そのようなアッセイの反応条件は、カップリング反応条件を含む。更なる実施態様では、そのような安定化アミノ酸置換は、ＴｄＴバリアントの融解温度を１．５℃上昇させる。

幾つかの実施態様では、融解温度は、次の溶液中でのサーマルシフトアッセイを用いて測定される：ＳＹＰＲＯオレンジ色素を含む０．５カコジラートＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７．４）。色素及びタンパク質濃度の幾つかの常套的最適化が、アッセイのために行われる場合があり、例えばそのような最適化のガイダンスは、上で引用した参考文献、特にＨｕｙｎｈ等（上で引用）に提供されている。

［テンプレートフリー酵素合成］
ポリヌクレオチドのテンプレートフリー酵素合成は、例えば、Ｙｂｅｒｔ等の国際特許公開第２０１５／１５９０２３号；Ｙｂｅｒｔ等の国際特許公開第２０１７／２１６４７２号；Ｈｙｍａｎの米国特許第５４３６１４３号；Ｈｉａｔｔ等の米国特許第５７６３５９４号；Ｊｅｎｓｅｎ等，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５７：１８２１－１８３２（２０１８）；Ｍａｔｈｅｗｓ等，Ｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＤＯＩ：０．１０３９／ｃ６ｏｂ０１３７１ｆ（２０１６）；Ｓｃｈｍｉｔｚ等，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔ．，１（１１）：１７２９－１７３１（１９９９）など、３’－Ｏ－ブロックデオキシヌクレオシドトリホスフェート（３’－Ｏ－ブロックｄＮＴＰ）の取り込みにおける効率の向上又は温度安定性の向上などのような改善された特性を有するように改変されたそのバリアントを含む、末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）などのテンプレートフリーポリメラーゼを使用する様々な既知のプロトコルによって行うことができる。

幾つかの実施態様では、酵素によるＤＮＡ合成法は、図１に示されるなど、予め決まったヌクレオチドが各サイクルで付加される、工程の反復サイクルを含む。例えば、遊離３’－ヒドロキシル基（１０３）を有する、固体支持体（１０２）に結合したイニシエーターポリヌクレオチド（１００）が提供される。イニシエーターポリヌクレオチド（１００）（又はその後のサイクルで伸長されたイニシエーターポリヌクレオチド）に、イニシエーターポリヌクレオチド（１００）（又は伸長されたイニシエーターポリヌクレオチド）の３’末端上に３’－Ｏ－保護ｄＮＴＰを酵素的に取り込むのに効果的な条件（１０４）下で、３’－Ｏ－保護ｄＮＴＰ及びＴｄＴバリアントを付加する。この反応により、その３’－ヒドロキシルが保護された伸長したイニシエーターポリヌクレオチド（１０６）が産生される。伸長したイニシエーターポリヌクレオチドが競合配列を含む場合、３’－Ｏ－保護基が除去され、すなわち脱保護され、所望の配列が元のイニシエーターポリヌクレオチドから切断される。そのような切断は、様々な一本鎖切断技術のうちの何れかを使用して、例えば、元のイニシエーターポリヌクレオチド内の予め決まった位置に切断可能なヌクレオチドを挿入することによって、行うことができる。例示的な切断可能なヌクレオチドは、ウラシルＤＮＡグルコシラーゼによって切断されるウラシルヌクレオチドでありうる。伸長したイニシエーターポリヌクレオチドが完了した配列を含まない場合、３’－Ｏ－保護基が除去されて遊離３’－ヒドロキシル（１０３）を露出させ、伸長したイニシエーターポリヌクレオチドがヌクレオチド付加及び脱保護の別のサイクルに供される。

ここで使用される場合、ヌクレオチド又はヌクレオシドの３’－ヒドロキシルなどの特定の基に関しての「保護」及び「ブロック」という用語は、交換可能に使用され、特定の基に化学的又は酵素的プロセス中に基への化学変化を防ぐ部分が共有結合していることを意味するものである。特定の基がヌクレオシドトリホスフェートの３’－ヒドロキシル、又は３’保護（又はブロック）－ヌクレオシドトリホスフェートが取り込まれた伸長断片（又は「伸長中間体」）である場合は常に、防止される化学変化は、酵素カップリング反応による伸長断片（又は「伸長中間体」）の更なる、若しくはその後の、伸長である。

幾つかの実施態様では、各合成工程において３’－Ｏ－可逆的ブロックｄＮＴＰの存在下でＴｄＴを使用して、ヌクレオチドの整列配列をイニシエーター核酸にカップリングする。幾つかの実施態様では、オリゴヌクレオチドを合成する方法は、（ａ）遊離３’－ヒドロキシルを有するイニシエーターを提供する工程；（ｂ）伸長条件下、遊離３’－ヒドロキシルを有するイニシエーター又は伸長中間体をＴｄＴと、３’－Ｏ－ブロックヌクレオシドトリホスフェートの存在下で反応させて３’－Ｏ－ブロック伸長中間体を産生する工程；（ｃ）伸長中間体をデブロックして遊離３’－ヒドロキシルを有する伸長中間体を産生する工程；及び（ｄ）ポリヌクレオチドが合成されるまで工程（ｂ）及び（ｃ）を繰り返す工程を含む。（時折、「伸長中間体」は、「エロンゲーション断片」とも称される）。幾つかの実施態様では、イニシエーターは、例えば、その５’末端が固体支持体に結合されたオリゴヌクレオチドとして提供される。また、上記の方法は、反応、すなわち伸長工程後、並びにデブロッキング工程後に、洗浄工程を含みうる。例えば、反応工程は、予め決まったインキュベーション期間、又は反応時間後に、例えば洗浄によって、非取り込みヌクレオシドトリホスフェートを除去するサブ工程を含みうる。そのような予め決まったインキュベーション期間又は反応時間は、数秒間、例えば、３０秒から数分、例えば、３０分でありうる。

また、上記方法は、反応、又は伸長工程後、並びにデブロッキング工程後に、キャッピング工程並びに洗浄工程を含みうる。上記のように、幾つかの実施態様では、非伸長遊離３’－ヒドロキシルが、キャッピングされた鎖の如何なる更なる伸長も防止する化合物と反応させるキャッピング工程が含まれうる。幾つかの実施態様では、そのような化合物は、ジデオキシヌクレオシドトリホスフェートでありうる。他の実施態様では、遊離３’－ヒドロキシルを有する非伸長鎖は、３’－エキソヌクレアーゼ活性、例えば、ＥｘｏＩでの処理によって分解されうる。例えば、Ｈｙｍａｎの米国特許第５４３６１４３号を参照のこと。同様に、幾つかの実施態様では、デブロックが失敗した鎖は、鎖を除去するか、更なる伸長に不活性になるように処理されうる。

オリゴヌクレオチドの連続合成を含む幾つかの実施態様では、キャッピングが等モル量の複数のオリゴヌクレオチドの産生を防止しうるので、キャッピング工程は望ましくない場合がある。キャッピングがない場合、配列には欠失エラーが均一に分布するが、複数のオリゴヌクレオチドのそれぞれが等モル量で存在する。これは、非伸長断片がキャッピングされる場合にはそうではない。

幾つかの実施態様では、伸長又はエロンゲーション工程のための反応条件は、次を含みうる：２．０μＭの精製ＴｄＴ；１２５－６００μＭの３’－Ｏ－ブロックｄＮＴＰ（例えば、３’－Ｏ－ＮＨ_２－ブロックｄＮＴＰ）；約１０から約５００ｍＭのカコジル酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５と７．５の間）、及び約０．０１から約１０ｍＭの二価カチオン（例えば、ＣｏＣ１_２又はＭｎＣ１_２）、ここで、エロンゲーション反応は、５０μＬの反応体積中、室温から４５℃までの範囲内の温度において３分間実施されうる。３’－Ｏ－ブロックｄＮＴＰが３’－Ｏ－ＮＨ_２－ブロックｄＮＴＰである実施態様では、デブロッキング工程のための反応条件は、次を含みうる：７００ｍＭのＮａＮＯ_２；１Ｍの酢酸ナトリウム（酢酸を用いて４．８－６．５の範囲のｐＨに調整）、ここで、デブロッキング反応は、５０μＬの体積中、室温から４５℃までの範囲内の温度において３０秒間から数分間実施されうる。

特定の適用に応じて、デブロッキング及び／又は切断工程は、様々な化学的又は物理的条件、例えば、光、熱、ｐＨ、特定の化学結合を切断することができる酵素などの特異的試薬の存在を含みうる。３’－Ｏ－ブロッキング基と対応するデブロッキング条件の選択における指針は、出典明示により援用される次の参考文献に見出されうる：米国特許第５８０８０４５号；米国特許第８８０８９８８号；国際特許公開第９１／０６６７８号；及び以下に引用した参考文献。幾つかの実施態様では、切断剤（しばしば、デブロッキング試薬又はデブロッキング剤とも呼ばれる）は、化学的切断剤、例えば、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）などである。別の実施態様では、切断剤は、３’－ホスフェートブロッキング基を切断しうる酵素切断剤、例えば、ホスファターゼなどでありうる。デブロッキング剤の選択が、使用される３’－ヌクレオチドブロッキング基のタイプ、一又は複数のブロッキング基が使用されるかどうか、イニシエーターが生細胞若しくは生物又は固体支持体などに結合されるかどうか（これは穏やかな処理に必要）などに依存することが当業者には理解される。例えば、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）などのホスフィンを使用して３’Ｏ－アジドメチル基を切断することができ、パラジウム錯体を使用して３’Ｏ－アリル基を切断することができ、或いは、亜硝酸ナトリウムを使用して３’Ｏ－アミノ基を切断することができる。特定の実施態様では、切断反応は、ＴＣＥＰ、パラジウム錯体又は亜硝酸ナトリウムを含む。

上述の通り、幾つかの実施態様では、オルソゴナルなデブロッキング条件を使用して除去されうる二以上のブロッキング基を用いることが望ましい。次の例示的なブロッキング基の対（表５）を、上述したもののような並行合成実施態様で使用できる。他のブロッキング基の対又は二を超えて含む基が、本発明のこれらの実施態様での使用に対して利用可能でありうると理解される。

生細胞でオリゴヌクレオチドを合成するには、穏やかなデブロッキング又は脱保護条件、すなわち細胞膜を破壊せず、タンパク質を変性させず、重要な細胞機能に干渉しない等の条件が必要である。幾つかの実施態様では、脱保護条件は、細胞生存に適合する生理学的条件の範囲内にある。そのような実施態様では、酵素的脱保護が、生理学的条件下で実施されうるので望ましい。幾つかの実施態様では、特異的な酵素的に除去可能なブロッキング基が、その除去に特異的な酵素に関連する。例えば、エステル又はアシルベースのブロッキング基は、アセチルエステラーゼなどのエステラーゼ又は類似の酵素を用いて除去され得、リン酸ブロッキング基は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼなどの３’ホスファターゼを用いて除去されうる。例として、３’－Ｏ－ホスフェートは、１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．５）、１０ｍＭのＭｇＣ１_２、５ｍＭの２－メルカプトエタノール、及び１単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼの溶液での処理によって除去されうる。反応は、３７℃の温度において１分間進行する。

「３’－ホスフェートブロック」又は「３’－ホスフェート保護」ヌクレオチドは、３’位のヒドロキシル基がホスフェート含有部分の存在によってブロックされているヌクレオチドを指す。本発明に係る３’－ホスフェートブロックヌクレオチドの例は、ヌクレオチジル－３’－ホスフェートモノエステル／ヌクレオチジル－２’，３’－環状ホスフェート、ヌクレオチジル－２’－ホスフェートモノエステル及びヌクレオチジル－２’又は３’－アルキルホスフェートジエステル、並びにヌクレオチジル－２’又は３’－ピロリン酸である。置換が脱リン酸化を妨げずホスファターゼによって遊離３’－ＯＨを生じる限り、チオホスフェート又はそのような化合物の他のアナログをまた使用することができる。

３’－Ｏ－エステル保護ｄＮＴＰ又は３’－Ｏ－ホスフェート保護ｄＮＴＰの合成及び酵素的脱保護の更なる例は 次の文献に記載されている：Ｃａｎａｒｄ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９２：１０８５９－１０８６３（１９９５）；Ｃａｎａｒｄ等，Ｇｅｎｅ，１４８：１－６（１９９４）；Ｃａｍｅｒｏｎ等，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１６（２３）：５１２０－５１２６（１９７７）；Ｒａｓｏｌｏｎｊａｔｏｖｏ等，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１８（４＆５）：１０２１－１０２２（１９９９）；Ｆｅｒｒｅｒｏ等，Ｍｏｎａｔｓｈｅｆｔｅ ｆｕｒ Ｃｈｅｍｉｅ，１３１：５８５－６１６（２０００）；Ｔａｕｎｔｏｎ－Ｒｉｇｂｙ等，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，３８（５）：９７７－９８５（１９７３）；Ｕｅｍｕｒａ等，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３０（２９）：３８１９－３８２０（１９８９）；Ｂｅｃｋｅｒ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４２（５）：９３６－９５０（１９６７）；Ｔｓｉｅｎ，国際特許公開第１９９１／００６６７８号。

ここで使用される場合、「イニシエーター」（又は「開始断片」、「イニシエーター核酸」、「イニシエーターオリゴヌクレオチド」などのような等価な用語）は、ＴｄＴなどのテンプレートフリーポリメラーゼによって更に伸長させることができる、遊離３’末端を有する短いオリゴヌクレオチド配列を指す。一実施態様では、開始断片はＤＮＡ開始断片である。別の実施態様では、開始断片はＲＮＡ開始断片である。一実施態様では、開始断片は、３から１００のヌクレオチド、特に、３から２０のヌクレオチドを有する。一実施態様では、開始断片は一本鎖である。別の実施態様では、開始断片は二本鎖である。特定の実施態様では、５’－一級アミンを用いて合成したイニシエーターオリゴヌクレオチドを、製造者のプロトコルを使用して電磁ビーズに共有結合させうる。同様に、３’－一級アミンを用いて合成したイニシエーターオリゴヌクレオチドを、製造者のプロトコルを使用して電磁ビーズに共有結合させうる。本発明の実施態様で実現可能な様々な他の化学結合が当該分野で、例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｂｒｏｃｈｕｒｅ，“Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ａｔｔａｃｈｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｔｏ Ｓｏｌｉｄ Ｓｕｐｐｏｒｔｓ，”ｖ．６（２０１４）；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２版（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２００８）；及び類似の文献で周知である。

本発明において用いられる多くの３’－Ｏ－ブロックｄＮＴＰは、販売者から購入されるか、公開された技術、例えば、米国特許第７０５７０２６号；国際特許公開第２００４／００５６６７号、国際公開第９１／０６６７８号；Ｃａｎａｒｄ等，Ｇｅｎｅ（上で引用）；Ｍｅｔｚｋｅｒ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：４２５９－４２６７（１９９４）；Ｍｅｎｇ等，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１４：３２４８－３２５２（３００６）；米国特許出願公開第２００５／０３７９９１号を使用して合成されうる。幾つかの実施態様では、改変ヌクレオチドは、プリン又はピリミジン塩基と、３’炭素原子が構造：
－Ｏ－Ｚ
の基に結合しているように、除去可能な３’－ＯＨブロッキング基が共有結合的に結合したリボース又はデオキシリボース糖部分とを含む改変ヌクレオチド又はヌクレオシド分子を含み、ここで、－Ｚは、－Ｃ（Ｒ’）_２－Ｏ－Ｒ’’、－Ｃ（Ｒ’）_２－Ｎ（Ｒ’’）_２、－Ｃ（Ｒ’）_２－Ｎ（Ｈ）Ｒ’’、－Ｃ（Ｒ’）_２－Ｓ－Ｒ’’、及び－Ｃ（Ｒ’）_２－Ｆのうちの何れかであり、各Ｒ’’は、除去可能な保護基であるか又はその一部であり；各Ｒ’は、独立して、水素原子、アルキル、置換アルキル、アリールアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、アシル、シアノ、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ若しくはアミド基、又は連結基を介して結合した検出可能な標識であり；但し、幾つかの実施態様では、そのような置換基は、１０個までの炭素原子及び／又は５個までの酸素若しくは窒素ヘテロ原子を有し；或いは、（Ｒ’）_２は、式＝Ｃ（Ｒ’’’）_２の基を示し、ここで、各Ｒ’’’は、同一でも異なっていてもよく、水素原子及びハロゲン原子並びにアルキル基を含む群から選択され、但し、幾つかの実施態様では、各Ｒ’’’のアルキルは、１から３の炭素原子を有し；且つ分子が反応して、各Ｒ’’がＨと交換されるか、或いはＺが－（Ｒ’）_２－Ｆである場合、ＦがＯＨ、ＳＨ、又はＮＨ_２、好ましくはＯＨと交換される中間体を生成してよく、該中間体は水性条件下で解離して遊離３’－ＯＨを有する分子が得られ；但し、Ｚが－Ｃ（Ｒ’）_２－Ｓ－Ｒ’’である場合、両方のＲ’基はＨではない。所定の実施態様では、改変ヌクレオチド又はヌクレオシドのＲ’は、アルキル又は置換アルキルであり、但し、そのようなアルキル又は置換アルキルは、１から１０個の炭素原子と０から４個の酸素又は窒素ヘテロ原子を有する。所定の実施態様では、改変ヌクレオチド又はヌクレオシドの－Ｚは、式－Ｃ（Ｒ’）_２－Ｎ３である。所定の実施態様では、Ｚはアジドメチル基である。

幾つかの実施態様では、Ｚは、２００以下の分子量を有するヘテロ原子を持つか持たない切断可能な有機部分である。他の実施態様では、Ｚは、１００以下の分子量を有するヘテロ原子を持つか持たない切断可能な有機部分である。他の実施態様では、Ｚは、５０以下の分子量を有するヘテロ原子を持つか持たない切断可能な有機部分である。幾つかの実施態様では、Ｚは、２００以下の分子量を有するヘテロ原子を持つか持たない酵素的に切断可能な有機部分である。他の実施態様では、Ｚは、１００以下の分子量を有するヘテロ原子を持つか持たない酵素的に切断可能な有機部分である。他の実施態様では、Ｚは、５０以下の分子量を有するヘテロ原子を持つか持たない酵素的に切断可能な有機部分である。他の実施態様では、Ｚは、２００以下の分子量を有する酵素的に切断可能なエステル基である。他の実施態様では、Ｚは、３’－ホスファターゼによって除去可能なホスフェート基である。幾つかの実施態様では、次の３’－ホスファターゼの一又は複数を、製造者の推奨プロトコルを用いて使用してもよい：Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、仔ウシ腸アルカリホスファターゼ、組換えエビアルカリホスファターゼ（例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡから入手可能）。

更なる特定の実施態様では、３’－ブロックヌクレオチドトリホスフェートは、３’－Ｏ－アジドメチル、３’－Ｏ－ＮＨ_２又は３’－Ｏ－アリル基の何れかによってブロックされる。

更に他の実施態様では、本発明の３’－Ｏ－ブロッキング基には、３’－Ｏ－メチル、３’－Ｏ－（２－ニトロベンジル）、３’－Ｏ－アリル、３’－Ｏ－アミン、３’－Ｏ－アジドメチル、３’－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブトキシエトキシ、３’－Ｏ－（２－シアノエチル）、及び３’－Ｏ－プロパルギルが含まれる。

幾つかの実施態様では、３’－Ｏ－保護基は、電気化学的に不安定な基である。すなわち、保護基の脱保護又は切断は、切断を生じる保護基近傍の電気化学的条件を変えることによって達成される。電気化学的条件のそのような変化は、電圧差又は光などの物理的量を変化させ又は印加して補助種を活性化し、次に、ｐＨの増減のような保護基の部位で電気化学的条件の変化を引き起こすことによって、もたらされうる。幾つかの実施態様では、電気化学的に不安定な基には、例えば、ｐＨが予め決まった値に変化するときは常に切断されるｐＨ感受性保護基が含まれる。他の実施態様では、電気化学的に不安定な基には、例えば、保護基の部位で電圧差を増加又は減少させることによって、還元又は酸化条件が変化するときは常に直接切断される保護基が含まれる。

ポリヌクレオチド鎖伸長の過程での二次構造の形成を低減し又は排除するために、多種多様な保護基（又は同等に「塩基保護部分」）を用いることができる。一般に、塩基保護基を除去するための条件は、３’－Ｏ－ブロッキング基を除去するための条件とオルソゴナルである。特に、３’－Ｏ－ブロッキング基の除去又はデブロッキング条件が酸性である場合、塩基保護基は塩基不安定性であるように選択されうる。このような状況下では、例えばＢｅａｕｃａｇｅ及びＩｙｅｒ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４８（１２）：２２２３－２３１１（１９９２）におけるように酸不安定性５’－Ｏ－トリチル保護単量体の使用のため、ホスホロアミダイト合成化学において多くの塩基不安定性保護基が開発されてきた。特に、ホスホロアミダイト化学のためのアシル及びアミジン保護基は、本発明の実施態様において利用可能である（例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ及びＩｙｅｒ（上に引用）の表２及び表３の保護基）。幾つかの実施態様では、塩基保護基は、Ｂｅｕｃａｇｅ及びＩｙｅｒ（上に引用）の表２に記載されているようなアミジンである。一般に、塩基保護３’－Ｏ－ブロックヌクレオシドトリホスフェート単量体は、以下の実施例に記載されるような、文献に記載された方法の常套的な変更によって合成されうる。

幾つかの実施態様では、塩基保護基は、デオキシアデノシントリホスフェートの６－窒素、デオキシグアノシントリホスフェートの２－窒素、及び／又はデオキシシチジントリホスフェートの４－窒素に結合している。幾つかの実施態様では、塩基保護基は、示された窒素の全てに結合している。幾つかの実施態様では、デオキシアデノシントリホスフェートの６－窒素に結合した塩基保護基は、ベンゾイル、フタロイル、フェノキシアセチル、及びメトキシアセチルからなる群から選択され；デオキシグアノシントリホスフェートの２－窒素に結合した塩基保護基は、イソブチリル、イソブチリルオキシエチレン、アセチル、４－イソプロピル－フェノキシアセチル、フェノキシアセチル、及びメトキシアセチルからなる群から選択され；且つデオキシシチジントリホスフェートの前記４－窒素に結合した塩基保護基は、ベンゾイル、フタロイル、アセチル、及びイソブチリルからなる群から選択される。

幾つかの実施態様では、デオキシアデノシントリホスフェートの６－窒素に結合した保護基は、ベンゾイルであり；デオキシグアノシントリホスフェートの２－窒素に結合した塩基保護基は、イソブトリル又はジメチルホルムアミジンであり；且つデオキシシチジントリホスフェートの４－窒素に結合した塩基保護基はアセチルである。

幾つかの実施態様では、デオキシアデノシントリホスフェートの６－窒素に結合した塩基保護基は、フェノキシアセチルであり；デオキシグアノシントリホスフェートの２－窒素に結合した塩基保護基は、４－イソプロピル－フェノキシアセチル又はジメチルホルムアミジンであり；且つデオキシシチジントリホスフェートの４－窒素に結合した塩基保護基は、アセチルである。

幾つかの実施態様では、塩基保護部分は除去され（すなわち、生成物が脱保護され）、生成物が同じ反応において固体支持体から切断される。例えば、イニシエーターは、塩基不安定性の塩基保護部分を同時に除去する、１ＭのＫＯＨ又は同様の試薬（アンモニア、水酸化アンモニウム、ＮａＯＨなど）での処理によって切断されてポリヌクレオチド生成物を放出しうるリボウリジンを含みうる。

塩基保護ｄＮＴＰが用いられる場合、上記の方法は、塩基保護部分を除去する工程を更に含み得、これは、アシル又はアミジン保護基の場合、（例えば）濃縮アンモニアでの処理を含みうる。

［バリアントＴｄＴの産生］
本発明のバリアントは、既知の参照又は野生型ＴｄＴコード化ポリヌクレオチドを変異させ、ついで、一般的な分子生物学技術を使用してそれを発現させることにより産生されうる。例えば、切断型マウスＴｄＴ酵素をコードするマウスＴｄＴ遺伝子（配列番号：２）は、一般的な分子生物学技術を使用し、例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ等，Ｇｅｎｅ，１６４：４９－５３（１９９５）；Ｋｏｄｕｍａｌ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０１：１５５７３－１５５７８（２００４）などに記載のプロトコルを使用して合成断片から構築されうるか、Ｂｏｕｌｅ等，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１９９－２０８（１９９８）、又はＢｅｎｔｏｌｉｌａ等，ＥＭＢＯ Ｊ．，１４：４２２１－４２２９（１９９５）などに記載のプロトコルを使用して、マウス細胞から直接クローン化されうる。

例えば、単離したＴｄＴ遺伝子を、ｐＥＴ３２（Ｎｏｖａｇｅｎ）などの発現ベクターに挿入してベクターｐＣＴｄＴを得ることができ、これをついで使用し、一般的なプロトコルを使用してバリアントＴｄＴタンパク質を作製し発現させることができる。正しい配列を有するベクターを大腸菌産生株において形質転換させうる。

形質転換された株を、一般的な技術を使用してペレットに培養し、それからＴｄＴタンパク質を抽出する。例えば、以前に調製したペレットを３０から３７℃の水浴中で解凍する。完全に解凍した時点で、ペレットを、５０ｍＭのｔｒｉｓ－ＨＣＬ（Ｓｉｇｍａ）（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ）、０．５ｍＭのメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、５％のグリセロール（Ｓｉｇｍａ）、２０ｍＭのイミダゾール（Ｓｉｇｍａ）、及び１００ｍＬ用のプロテアーゼカクテル阻害剤１タブ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）からなる溶解緩衝液に再懸濁する。早すぎる溶解と凝集物の残存を回避するために慎重な再懸濁を実施する。再懸濁した細胞を、フルカラーの均一性が得られるまで、数サイクルのフレンチプレスによって溶解する。使用される通常の圧力は１４０００ｐｓｉである。ついで、ライセートを、１００００ｒｐｍで１時間から１時間３０分間遠心分離する。カラム精製前に遠心分離物を０．２μｍフィルターに通してデブリを除去する。

ＴｄＴタンパク質は、一段階親和性法で遠心分離物から精製されうる。例えば、Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティーカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ポリメラーゼを結合させる。最初に、カラムを、１５カラム体積の５０ｍＭのｔｒｉｓ－ＨＣＬ（Ｓｉｇｍａ）（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ）及び２０ｍＭのイミダゾール（Ｓｉｇｍａ）で洗浄し平衡化する。平衡化後にポリメラーゼはカラムに結合する。ついで、５０ｍＭのｔｒｉｓ－ＨＣＬ（Ｓｉｇｍａ）（ｐＨ７．５）、５００ｍＭのＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ）及び２０ｍＭのイミダゾール（Ｓｉｇｍａ）からなる洗浄緩衝液を、１５カラム体積のカラムに適用する。洗浄後、ポリメラーゼを、５０ｍＭのｔｒｉｓ－ＨＣＬ（Ｓｉｇｍａ）（ｐＨ７．５）、５００ｍＭのＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ）及び０．５Ｍのイミダゾール（Ｓｉｇｍａ）で溶出させる。最高濃度の対象のポリメラーゼに対応する画分を回収し、単一試料にプールする。プールした画分を、透析緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＭｇＯＡｃ、１００ｍＭの［ＮＨ４］２ＳＯ４）に対して透析する。透析液をその後に濃縮フィルター（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－３０，Ｍｅｒｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濃縮する。濃縮した酵素を、少量のアリコートに分配し、最終５０％のグリセロールを添加し、ついで、そのアリコートを－２０℃に凍結し、長期間保存する。５μＬの精製した酵素の様々な画分を、ＳＤＳＰＡＧＥゲルで分析する。

幾つかの実施態様では、ＴｄＴバリアントは、共有結合又は非共有結合を含むリンカー部分；アミノ酸タグ（例えば、ポリアミノ酸タグ、ポリＨｉｓタグ、６Ｈｉｓタグなど）；化合物（例えば、ポリエチレングリコール）；タンパク質－タンパク質結合ペア（例えば、ビオチン－アビジン）；アフィニティーカップリング；キャプチャープローブ；又はこれらの任意の組み合わせを含むリンカー部分に作用可能に連結されうる。リンカー部分は、ＴｄＴバリアントから分離されうるか、又はＴｄＴバリアントの一部になりうる。本発明のＴｄＴバリアントと共に使用するための例示的なＨｉｓタグは、ＭＡＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＳＥＮＬＹＦＱＴＧＳＳＧ－（配列番号：１９）である。タグリンカー部分は、ヌクレオチド結合活性、又はＴｄＴバリアントの触媒活性を妨害しない。

上記のプロセス、又は同等のプロセスは、活性及び／又は保存に必要であるか有用である、塩、ｐＨ緩衝液、担体化合物などの様々な試薬と混合されうる単離ＴｄＴバリアントをもたらす。

［本発明の方法を実施するためのキット］
本発明は、本発明の方法を実施するための様々なキットを含む。一態様では、本発明のキットは、ここに記載のテンプレートフリー酵素的ポリヌクレオチド合成を実施するのに適切な製剤中に又は別個に提供される場合は複数の製剤中に本発明の一又は複数のキメラＴｄＴバリアントを含む。また、そのようなキットは、３’－Ｏ－保護ｄＮＴＰの成長中の鎖へのテンプレートフリー付加又は取り込みを最適にするための反応条件を提供する合成緩衝液を各ＴｄＴバリアントに対して含みうる。幾つかの実施態様では、ＴｄＴバリアントのそれぞれは、別々に、同じ又は異なる製剤に、別々の容器に提供され得、他の実施態様では、ＴｄＴバリアントの幾つか又は全てが、共通の製剤にそれらの混合物で提供されうる。幾つかの実施態様では、本発明のキットは、３’－Ｏ－可逆的保護ｄＮＴＰを更に含む。そのような実施態様では、３’－Ｏ－可逆的保護ｄＮＴＰは、３’－Ｏ－アミノ－ｄＮＴＰ又は３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＮＴＰを含みうる。更なる実施態様では、キットは、次の品目の一又は複数を、別個に又は前記品目と一緒に含みうる：（ｉ）ここに記載の脱保護又はデブロッキング工程を実施するための脱保護又はデブロッキング試薬、（ｉｉ）イニシエーターが結合した固体支持体、（ｉｉｉ）完成したポリヌクレオチドを固体支持体から遊離させるための切断試薬、（ｉｖ）酵素付加又はカップリング工程の終了時に未反応の３’－Ｏ－可逆的保護ｄＮＴＰを除去するための洗浄試薬又は緩衝液、及び（ｖ）合成後のプロセシング試薬、例えば精製カラム、脱塩試薬、溶出試薬など。

上記の品目（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）に関して、所定のイニシエーター及び切断試薬は相伴う。例えば、イノシン切断性ヌクレオチドを含むイニシエーターには、エンドヌクレアーゼＶ切断試薬が相伴い得；ニトロベンジル光切断性リンカーを含むイニシエーターには、光切断性リンカーの切断に適切な光源が相伴い得；ウラシルを含むイニシエーターには、ウラシルＤＮＡグルコシラーゼ切断試薬が相伴いうる等である。

実施例１：３’－Ｏ－保護デオキシヌクレオシドトリホスフェートを取り込む活性が増強されたキメラマウス－ウシＴｄＴバリアント
この実施例では、マウスＴｄＴバリアントＭ５３（配列番号：２１）とウシＴｄＴバリアントＭ５４（配列番号：５４）から構築されたマウス－ウシキメラＴｄＴバリアントＭ５７（配列番号：２３）及びＭ５９（配列番号：２４）を、マウスＴｄＴバリアントＭ２７（配列番号：２５）と比較することにより、ｄＮＴＰ取り込みにおける配列特異的多様性について試験した。つまり、Ｍ５７とＭ５９を、成長する鎖の三つの３’末端ヌクレオチドの関数として３’－Ｏ－ブロックｄＮＴＰを取り込むその効率について試験した。試験では、２４の５２量体ランダム配列ポリヌクレオチドを、対照としてのマウスＴｄＴバリアントＭ２７と共に各キメラＴｄＴバリアント（Ｍ５７及びＭ５９）によって合成した。合成は二通り行った。２４の５２量体を、可能な各４量体が、ほぼその予想される頻度、つまり１／２５６、すなわち約４又は５の発生頻度で全体（２４×５２の有効配列）で表されるように選択した。

［合成条件］ ２倍濃縮ｄＮＴＰ－ＯＮＨ２（１ｍＭ）、ＤＭＳＯ（２０％）、補因子（４ｍＭのＣｏＣｌ_２）及び２倍濃縮変異体（３２μＭ）を含むプレミックスを、ＴＹ １×緩衝液０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０で別々に調製した。Ｍ５９対Ｍ２７反応に対しては、Ｔｗｅｅｎ２０をヌクレオチドプレミックスに２×で添加した。２４の配列（５２量体）を、３７℃においてＭ２７とＭ５９又はＭ５７の何れかを用いて二通り合成した。伸長時間は４分に設定した。合成は、５００ｐｍｏｌのｄＩ樹脂（Ｒ１３３）とｗｗＰＴＦＥメンブランを備えたフィルタープレート（Ｐａｌｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を使用して実施した。ＴＹ １×緩衝液には、２００ｍＭのカコジル酸カリウム（ｐＨ６．８）、５ｍＭのＭｇＣｌ２が含まれている。ｄＩ樹脂Ｒ１３３は、アミノ官能基を介して１０Ｔ－ｄＩ－Ｔ初期ＤＮＡ（イニシエーターＤＮＡ）とカップリングさせたＣＮＢｒセファロース樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）であり、リンカーはＣ１２である。従って、樹脂に結合した全配列は、５ＡｍＭＣ１２／ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ／ｄＩ／Ｔ（配列番号：８３）である。

［合成後のプロセシング］ 合成後、最初の洗浄を実施した（１×１００μＬ／ウェルのＨ２Ｏ、３×１００μＬ／ウェルのＳＤＳ／ＤＴＴ、３×１００μＬ／ウェルのＨ２Ｏ）。Ｍ５７対Ｍ２７プレートに対しては、ＳＤＳ／ＤＴＴ洗浄を実施しなかった。次に、真空にしてプレートを２０００ｇで２分間遠心分離することにより残りの液体を除去した直後に、３×５０μＬの洗浄を、Ｍ５９対Ｍ２７プレートに対してＴＨ１緩衝液１×で又はＭ５７対Ｍ２７プレートに対してＷＬＥ１緩衝液１×で実施した。合成鎖を樹脂から除去する切断は直後に実施した。ｄＩ切断に対しては、樹脂を１μＭの社内ＥｎｄｏＶと共に５０μＬの反応容量（Ｍ５９対Ｍ２７プレートに対しては１７３ｍＭのＮａＣｌと５０ｍＭのＭｇＣｌ２を含む１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．９）、又はＭ５７対Ｍ２７プレートに対しては５０ｍＭのＫＣｌと１５ｍＭのＭｇＣｌ２を含む１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．９））で４２℃、１２５０ｒｐｍで３０分間インキュベートし、ついで２０００ｇで２分間遠心分離した。樹脂を、Ｍ５９対Ｍ２７プレートに対しては２５μＬのＴＨ１緩衝液１×で又はＭ５７対Ｍ２７プレートに対してはＷＬＥ１緩衝液１×で洗浄し、４２℃、１２５０ｒｐｍで更に２分間インキュベートし、２０００ｇで２分間再び遠心分離した。回収した濾液を９６ウェルＰＣＲプレートに移し、必要に応じて－２０℃で保存した。最後に、７５μＬ未満を各ウェルから収集した。ＴＨ１緩衝液は、１０ｍＭのＴｒｉｓ、１７０ｍＭのＮａＣｌ、５０のＭｇＣｌ２（ｐＨ８）を含んでいる。ＷＬＥ１緩衝液は、１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．９）、５０ｍＭのＫＣｌ、及び１５ｍＭのＭｇＣｌ２を含んでいる。

［ＤＮＡ沈殿］ ０．５μＬのグリコーゲンとＮａＡｃ（３Ｍ）ｐＨ５．２（７．５μＬ）をウェル毎に加え、簡潔に振盪した。ウェル当たり７５μＬのイソプロパノールを加え、４℃において３４２８ｇで１時間１５分遠心分離した。上清を吸引し、各ウェルに２０μＬだけを残した。１８０μＬの新たに調製したエタノール８０％をウェル毎に添加し、４℃において３４２８ｇで３０分間で遠心分離した。上清の除去と洗浄を再び繰り返した。遠心分離後、ウェル当たり１０μＬだけを残してＳｐｅｅｄｖａｃで３５℃において３０分間乾燥させた。乾燥したＤＮＡを１５μＬの水ＭＢグレードに再懸濁させ、その後濃度を測定した。

［ライブラリー調製］ ライブラリーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ １ ９６ｒｘｎｓ（ｏｚｙｍｅ ＳＷ１００９６）のＡｃｃｅｌ－ＮＧＳ １Ｓ Ｐｌｕｓ ＤＮＡライブラリーキットを使用して調製した。ライブラリーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（ｏｚｙｍｅ ＳＷ１６０２４）の１Ｓ Ｐｌｕｓインデクシングキットを使用してインデックス付けした。

図３Ａ及び３Ｂは、シークエンシングデータから得られた結果を示す。図３Ａでは、異なる３量体配列の後に生じる欠失の頻度（パーセンテージ）が、マウスＴｄＴバリアントＭ２７（配列番号：２５）及びマウス－ウシキメラＴｄＴバリアントＭ５７（配列番号：２３）について比較されている。図３Ｂでは、異なる３量体配列の後に生じる欠失の頻度が、マウスＴｄＴバリアントＭ２７（配列番号：２５）及びマウス－ウシキメラＴｄＴバリアントＭ５９（配列番号：２４）について比較されている。読みやすくするために、最初の４つの３量体を除いて、データバーの一つおきのペアのみがその対応する３量体で標識されていることに留意のこと。先のＴｄＴバリアント（Ｍ２７で例示）とキメラＴｄＴバリアント（Ｍ５７及びＭ５９で例示）の重要な違いは、合成されているポリヌクレオチドにおいて、特にトリプレットＣＣＡ及びＣＴＡの出現について（それぞれ図３Ａ及び３Ｂの３００及び３０２）、キメラＴｄＴバリアントＭ５７及びＭ５９による欠失の配列特異的挿入の最小化である。これらのトリプレットの両方について、Ｍ５７又はＭ５９の何れかのトリプレット後の欠失率は、約２５％であり、又はＭ２７からの率よりも少ない。

［定義］
アミノ酸は、次の命名法に従うそれらの１文字コード又は３文字コードによって表される：Ａ：アラニン（Ａｌａ）；Ｃ：システイン（Ｃｙｓ）；Ｄ：アスパラギン酸（Ａｓｐ）；Ｅ：グルタミン酸（Ｇｌｕ）；Ｆ：フェニルアラニン（Ｐｈｅ）；Ｇ：グリシン（Ｇｌｙ）；Ｈ：ヒスチジン（Ｈｉｓ）；Ｉ：イソロイシン（Ｉｌｅ）；Ｋ：リジン（Ｌｙｓ）；Ｌ：ロイシン（Ｌｅｕ）；Ｍ：メチオニン（Ｍｅｔ）；Ｎ：アスパラギン（Ａｓｎ）；Ｐ：プロリン（Ｐｒｏ）；Ｑ：グルタミン（Ｇｌｎ）；Ｒ：アルギニン（Ａｒｇ）；Ｓ：セリン（Ｓｅｒ）；Ｔ：スレオニン（Ｔｈｒ）；Ｖ：バリン（Ｖａｌ）；Ｗ：トリプトファン（Ｔｒｐ）及びＹ：チロシン（Ｔｙｒ）。

二以上の異なるＴｄＴにおけるアミノ酸位置に関して「機能的に同等」とは、（ｉ）それぞれの位置のアミノ酸がＴｄＴの活性において同じ機能的役割を果たし、且つ（ｉｉ）アミノ酸がそれぞれのＴｄＴのアミノ酸配列における相同のアミノ酸位置で生じることを意味する。配列アラインメント及び／又は分子モデリングに基づいて、二以上の異なるＴｄＴのアミノ酸配列に位置的に同等又は相同なアミノ酸残基を同定することが可能である。幾つかの実施態様では、機能的に同等のアミノ酸位置は、進化的に関連する種の、例えば属、科などが関連するＴｄＴのアミノ酸配列間で保存されている配列モチーフに属する。そのような保存された配列モチーフの例は、Ｍｏｔｅａ等，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１８０４（５）：１１５１－１１６６（２０１０）；Ｄｅｌａｒｕｅ等，ＥＭＢＯ Ｊ．，２１：４２７－４３９（２００２）；及び類似の文献に記載されている。

タンパク質に関して「単離された」は、そのような化合物が、同定され、その自然環境の成分又は不均一の反応混合物から分離され、及び／又は回収されたことを意味する。自然環境又は反応混合物の夾雑成分は、タンパク質の機能を妨害するであろう材料であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性又は非タンパク質性の溶質を含みうる。幾つかの実施態様では、本発明のタンパク質は、（１）Ｌｏｗｒｙ法によって決定した場合に、９５重量％を超え、最も好ましくは、９９重量％を超えるタンパク質まで、（２）スピニングカップシークエネーターの使用によって少なくとも１５残基のＮ末端又は内部アミノ酸配列を得るのに十分な程度まで、或いは（３）クーマシー・ブルー若しくは好ましくは銀染色を使用する還元又は非還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥによって均一になるまで、精製される。組換え法によって製造される場合、本発明の単離されたタンパク質は、タンパク質の自然環境のうちの少なくとも一つの成分が存在しないので、組換え細胞内のインサイツの本発明のタンパク質を含みうる。通常は、本発明の単離されたタンパク質は、少なくとも一の精製工程によって調製される。

「キット」は、本発明の方法を実施するための材料又は試薬を送達するための任意の送達系を指す。反応アッセイの文脈において、そのような送達系は、反応試薬（例えば、適切な容器中の一又は複数のＴｄＴバリアント、反応緩衝液、３’－Ｏ－保護ｄＮＴＰ、脱保護試薬、イニシエーターが結合した固体支持体など）及び／又は補助材料（例えば、緩衝液、アッセイを実施するための文書の説明書など）のある場所から別の場所への貯蔵、輸送、又は送達を可能にする系及び／又は化合物（希釈剤、界面活性剤、担体など）を含む。例えば、キットは、関連する反応試薬及び／又は補助材料を含む一又は複数の筐体（例えば、箱）を含む。そのような内容物は、意図されたレシピエントに一緒に又は別個に送達されうる。例えば、第一の容器は、合成法での使用のための一又は複数のＴｄＴバリアントを含み得、第二又は更なる容器は、脱保護剤、イニシエーターを含む固体支持体、３’－Ｏ－保護ｄＮＴＰなどを含みうる。

互換的に使用される「変異体」又は「バリアント」は、一又は複数の位置での特定された配列に対して、修飾又は改変、例えば置換、挿入、及び／又は欠失を含む、例えば、配列番号：２などの特定された（通常は野生型又は天然の）アミノ酸配列に由来するポリペプチドを指す。そのような変異体又はバリアントは、通常、テンプレートフリーポリメラーゼ活性と、一又は複数の可逆的ブロックヌクレオシドトリホスフェート前駆体を取り込む能力の両方を有している。バリアントは、当該分野で周知の様々な技術によって得ることができる。特に、野生型タンパク質をコードするＤＮＡ配列を改変するための技術の例には、限定されないが、部位特異的変異誘発、ランダム変異誘発及び合成オリゴヌクレオチド構築などが含まれる。変異誘発活性は、タンパク質又は本発明の場合はポリメラーゼの配列における一又は数個のアミノ酸の欠失、挿入、又は置換からなる。

「配列同一性」は、二つのポリペプチド配列又は二つのポリヌクレオチド配列などの二つの配列の間の一致（例えば、同一のアミノ酸残基）の数（又は通常、百分率で表される分率）を指す。配列同一性は、配列ギャップを最小にしながら重複と同一性が最大になるように整列させたときの配列を比較することによって決定される。特に、配列同一性は、二つの配列の長さに応じて、多くの数学的なグローバル又はローカルアラインメントアルゴリズムのうちの何れかを使用して決定されうる。類似の長さの配列は、全長にわたって配列を最適に整列させるグローバルアラインメントアルゴリズム（例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ，１９７０）を使用して整列させることが好ましい一方、実質的に異なる長さの配列は、ローカルアラインメントアルゴリズム（例えば、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ，１９８１）又はＡｌｔｓｃｈｕｌアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９７；Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，２００５））を使用して整列させることが好ましい。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、当該分野の技量の範囲内にある様々な方法で、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／又はｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｅｍｂｏｓｓ／などのインターネットウェブサイトで利用可能な公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して、達成することができる。当業者は、比較されている配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するために適切なパラメーターを決定することができる。ここでの目的のために、アミノ酸配列同一性パーセント値は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用して二つの配列の最適なグローバルアラインメントを作り出すペアワイズ配列アラインメントプログラムＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅを使用して生成された値を指し、ここで全ての検索パラメーターはデフォルト値に設定され、すなわち、スコアリング行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップオープン＝１０、ギャップ伸長＝０．５、エンドギャップペナルティ＝偽、エンドギャップオープン＝１０、及びエンドギャップ伸長＝０．５である。

「ポリヌクレオチド」又は「オリゴヌクレオチド」は、互換的に使用され、それぞれ、ヌクレオチド単量体の線状ポリマー又はそのアナログを意味する。ポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドを構成する単量体は、ワトソン・クリック型の塩基対形成、塩基スタッキング、又はフーグスティーン若しくは逆フーグスティーン型の塩基対形成などの規則的な単量体対単量体の相互作用パターンによって天然ポリヌクレオチドに特異的に結合することができる。そのような単量体及びそのヌクレオシド間結合は、天然に生じうるか、そのアナログ、例えば、天然に生じるアナログ又は天然には生じないアナログでありうる。天然には生じないアナログには、ＰＮＡ、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合、フルオロフォアなどの標識の結合を可能にする連結基を含む塩基、又はハプテンなどが含まれうる。オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの使用が酵素的プロセシング、例えばポリメラーゼによる伸長、リガーゼによるライゲーションなどを必要とする場合は常に、当業者は、前記例では、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが任意の又は幾つかの位置にヌクレオシド間結合、糖部分、又は塩基の所定のアナログを含まないと理解するであろう。ポリヌクレオチドは、典型的には、それらが通常「オリゴヌクレオチド」と呼ばれる場合、数個の単量体単位、例えば、５－４０個から、数千の単量体単位までのサイズ範囲である。ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドが文字（大文字又は小文字）の配列、例えば「ＡＴＧＣＣＴＧ」などによって表される場合は常に、別段の指示がない限り又は文脈から明白でない限り、ヌクレオチドが左から右に５’→３’の順序であり、且つ「Ａ」がデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」がデオキシシチジンを示し、「Ｇ」がデオキシグアノシンを示し、「Ｔ」がチミジンを示し、「Ｉ」がデオキシイノシンを示し、「Ｕ」がウリジンを示すと理解される。他に断りのない限り、用語法及び原子番号付けの慣習は、Ｓｔｒａｃｈａｎ及びＲｅａｄ，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２（Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９９）に開示のものに従う。通常、ポリヌクレオチドは、ホスホジエステル結合によって連結された４つの天然ヌクレオシド（例えば、ＤＮＡについては、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、又はＲＮＡについてはそれらのリボース対応物）を含む；しかしながら、それらは、例えば、改変された塩基、糖、又はヌクレオシド間結合を含む非天然ヌクレオチドアナログをまた含みうる。酵素が活性のために特異的なオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド基質要件、例えば、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖などを有する場合、特に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）などの専門書及び類似の文献からのガイダンスを用いての、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド基質に適切な組成の選択は、十分に当業者の知識の範囲内にあることが当業者には明らかである。同様に、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドは、一本鎖形態又は二本鎖形態（すなわち、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド及びそのそれぞれの相補鎖の二重鎖）の何れかを指しうる。用語使用法の文脈から、どの形態が意図されるのか又は両方の形態が意図されるのかは当業者には明らかであろう。

「プライマー」は、ポリヌクレオチドテンプレートと二重鎖を形成した際に、核酸合成の開始点として作用することができ、伸長した二重鎖が形成されるようにテンプレートに沿ってその３’末端から伸長される、天然又は合成のオリゴヌクレオチドを意味する。通常、核酸ポリメラーゼ、例えばＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼなどを用いてプライマーの伸長は実施される。伸長過程において付加されるヌクレオチドの配列は、テンプレートポリヌクレオチドの配列によって決定される。通常、プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。プライマーは、通常、１４から４０ヌクレオチドの範囲、又は１８から３６ヌクレオチドの範囲の長さを有する。プライマーは、様々な核酸増幅反応、例えば、単一プライマーを使用する線形増幅反応、又は、二以上のプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応において用いられる。特定の適用のためのプライマーの長さ及び配列の選択のためのガイダンスは、出典明示により援用される次の文献によって証明されているように、当業者に周知である：Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ編，ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００３）。

「置換」は、あるアミノ酸残基が別のアミノ酸残基で置き換えられることを意味する。好ましくは、「置換」という用語は、アミノ酸残基の、天然に生じる標準的な２０種のアミノ酸残基、稀に天然に生じるアミノ酸残基（例えば、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、アロヒドロキシリジン、６－Ｎ－メチルリジン、Ｎ－エチルグリシン、Ｎ－メチルグリシン、Ｎ－エチルアスパラギン、アロ－イソロイシン、Ｎ－メチルイソロイシン、Ｎ－メチルバリン、ピログルタミン、アミノ酪酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン）、及びしばしば合成的に作製される天然に生じないアミノ酸残基（例えば、シクロヘキシル－アラニン）から選択される別のアミノ酸残基による置き換えを指す。好ましくは、「置換」という用語は、あるアミノ酸残基の、天然に生じる標準的な２０種のアミノ酸残基から選択される別のものによる置き換えを指す。符号「＋」は、置換の組み合わせを示す。

アミノ酸は、ここでは、次の命名法に従ってその１文字又は３文字コードによって表される：Ａ：アラニン（Ａｌａ）；Ｃ：システイン（Ｃｙｓ）；Ｄ：アスパラギン酸（Ａｓｐ）；Ｅ：グルタミン酸（Ｇｌｕ）；Ｆ：フェニルアラニン（Ｐｈｅ）；Ｇ：グリシン（Ｇｌｙ）；Ｈ：ヒスチジン（Ｈｉｓ）；Ｉ：イソロイシン（Ｉｌｅ）；Ｋ：リジン（Ｌｙｓ）；Ｌ：ロイシン（Ｌｅｕ）；Ｍ：メチオニン（Ｍｅｔ）；Ｎ：アスパラギン（Ａｓｎ）；Ｐ：プロリン（Ｐｒｏ）；Ｑ：グルタミン（Ｇｌｎ）；Ｒ：アルギニン（Ａｒｇ）；Ｓ：セリン（Ｓｅｒ）；Ｔ：スレオニン（Ｔｈｒ）；Ｖ：バリン（Ｖａｌ）；Ｗ：トリプトファン（Ｔｒｐ）及びＹ：チロシン（Ｔｙｒ）。

本明細書では、次の用語法を使用して置換を命名する：Ｌ２３８Ａは、親配列の２３８位のアミノ酸残基（ロイシン、Ｌ）がアラニン（Ａ）に変えられていることを示す。Ａ１３２Ｖ／Ｉ／Ｍは、親配列の１３２位のアミノ酸残基（アラニン、Ａ）が次のアミノ酸のうちの一つによって置換されていることを示す：バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、又はメチオニン（Ｍ）。置換は、保存的置換又は非保存的置換でありうる。保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン、アスパラギン及びスレオニン）、疎水性アミノ酸（メチオニン、ロイシン、イソロイシン、システイン及びバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）、及び小アミノ酸（グリシン、アラニン及びセリン）のグループ内にある。

タンパク質のアミノ酸配列に関する「野生型」は、天然に見出されるアミノ酸配列を意味する。

ＴｄＴバリアントのアミノ酸配列に関してここで使用される「モチーフ」は、異なる種、特に進化的に関連する種のＴｄＴのアミノ酸配列間で保存されている（しかし同一ではない場合がある）特定の位置でのＴｄＴアミノ酸配列の部分配列又はセグメントを意味する。そのような保存された配列モチーフの例は、Ｍｏｔｅａ等，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１８０４（５）：１１５１－１１６６（２０１０）；Ｄｅｌａｒｕｅ等，ＥＭＢＯ Ｊ．，２１：４２７－４３９（２００２）；及び類似の文献に記載されている。例示的なＴｄＴモチーフには（Ｎ末端からＣ末端に順序付けて）、ＦＭＲ、ＶＳＣ、ＧＧＦＲＲ、ＫＭＴ、ＧＨＤ、ＴＧＳＲ、ＦＥＲなどが含まれる。ここで参照されるように、配列モチーフは、最も一般的な配列の出現又はコンセンサス配列、例えば「ＴＧＳＲ」によって識別され、但し、そのような命名は、Ｍｕｌｔａｌｉｎ（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，９（５）：６１４－６１５（１９９３））などの一般的なアラインメントツールを使用してＴＧＳＲと整列する他の部分配列を除外することを意味するものではない。例えば、「ＴＧＳＲモチーフ」への言及は、マウスのセグメント「ＴＧＳＲ」と整列するフクロネズミＴｄＴのセグメント「ＳＧＳＲ」を含む。幾つかの実施態様では、配列モチーフは、配列の発現セットとして定義される。例えば、幾つかの実施態様では、ＦＭＲモチーフは、ＦＭＲ、ＦＬＲ及びＹＭＲからなる群の配列からなる。

この開示は、示された特定の形態の範囲に限定されることは意図されないが、ここに記載されるバリエーションの代替物、変形態様、及び均等物を包含することは意図される。更に、開示の範囲は、この開示に鑑みて、当業者に自明でありうる他のバリエーションを完全に包含する。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。

Claims (22)

1. 式：
   Ｂ_１－Ｂ_２－Ｂ_３
   ［上式中、
   Ｂ_１は、ＢＲＣＴ様領域を持たない第一の種のＴｄＴのアミノ酸セグメントであり、そのＮ末端からそのＶＳＣモチーフとそのＫＭＴモチーフの間のアミノ酸位置まで伸び、ここで、Ｂ_１はそのＦＭＲモチーフにメチオニン又は機能的に同等の残基の置換を、Ｂ_１がＧＧＦＲＲモチーフを含む場合は常にそのＧＧＦＲＲモチーフに第二のアルギニン又は機能的に同等の残基の置換を、並びにＢ_１がＶＳＣモチーフを含む場合は常にそのＶＳＣモチーフにバリン若しくはセリン若しくはシステイン又は機能的に同等の残基の一又は複数の置換をそれぞれ含み；
   Ｂ_２は、Ｂ_１のＣ末端から第二の種のＴｄＴのＣ末端まで、又はＢ_３が一又は複数のアミノ酸を含む場合は常にＢ_３のＮ末端まで伸びる第二の種のＴｄＴのアミノ酸セグメントであり、ここで、Ｂ_２は、Ｂ_２がＶＳＣモチーフを含む場合は常にそのＶＳＣモチーフにバリン若しくはセリン若しくはシステイン又は機能的に同等の残基の一又は複数の置換を、Ｂ_２がＧＧＦＲＲモチーフを含む場合は常にそのＧＧＦＲＲモチーフに第二のアルギニン又は機能的に同等の残基の置換を、Ｂ_２がＴＧＳＲモチーフを含む場合は常にそのＴＧＳＲモチーフにアルギニン又は機能的に同等の残基の置換を、並びにＢ_２がＦＥＲモチーフを含む場合は常にそのＦＥＲモチーフにグルタミン酸又は機能的に同等の残基の置換を含み；且つ
   Ｂ_３は、０から７０個のアミノ酸を含み、第三の種のＴｄＴのＣ末端からＢ_２のＣ末端アミノ酸まで伸びる第三の種のＴｄＴのアミノ酸セグメントであり、ここで、Ｂ_３は、Ｂ_３がＴＧＳＲモチーフを含む場合は常にそのＴＧＳＲモチーフにアルギニン又は機能的に同等の残基の置換を、並びにＢ_３がＦＥＲモチーフを含む場合は常にそのＦＥＲモチーフにグルタミン酸又は機能的に同等の残基の置換を含み；
   ここで、キメラＴｄＴバリアントは、（ｉ）テンプレートなしで核酸断片を合成することができ、（ｉｉ）３’－Ｏ－ブロックヌクレオシドトリホスフェートを核酸断片に取り込むことができ；
   且つ、Ｂ_１、Ｂ_２及びＢ_３は、キメラＴｄＴバリアントが３５０から４１０個のアミノ酸を有するように選択される］
   によって定まるアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント同一であるアミノ酸配列を含むキメラ末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）バリアント。
2. （ｉ）Ｂ_１の前記ＦＭＲモチーフにおけるメチオニン又は機能的に同等の残基の前記置換は、Ｒ又はＱであり；Ｂ_１がＧＧＦＲＲモチーフを含む場合は常にＢ_１の前記ＧＧＦＲＲモチーフにおける前記第二のアルギニン又は機能的に同等の残基の前記置換は、Ｌ又はＮであり；並びにＢ_１がＶＳＣモチーフを含む場合は常にＢ_１の前記ＶＳＣモチーフにおけるシステイン又は機能的に同等の残基の前記置換は、Ｇ又はＲであり；
   （ｉｉ）Ｂ_２がＶＳＣモチーフを含む場合は常にＢ_２の前記ＶＳＣモチーフにおけるシステイン又は機能的に同等の残基の前記置換は、Ｒ又はＱであり；Ｂ_２がＧＧＦＲＲモチーフを含む場合は常にＢ_２の前記ＧＧＦＲＲモチーフにおける前記第二のアルギニン又は機能的に同等の残基の前記置換は、Ｌ又はＮであり；Ｂ_２がＴＧＳＲモチーフを含む場合は常にＢ_２の前記ＴＧＳＲモチーフにおけるアルギニン又は機能的に同等の残基の前記置換は、Ｐ、Ｎ又はＡであり；並びにＢ_２がＦＥＲモチーフを含む場合は常にＢ_２の前記ＦＥＲモチーフにおけるグルタミン酸又は機能的に同等の残基の前記置換は、Ｎ、Ｌ、Ｔ、又はＳであり；且つ
   （ｉｉｉ）Ｂ_３がＴＧＳＲモチーフを含む場合は常にＢ_３の前記ＴＧＳＲモチーフにおけるアルギニン又は機能的に同等の残基の前記置換は、Ｐ、Ｎ、又はＡであり；並びにＢ_３がＦＥＲモチーフを含む場合は常にＢ_３の前記ＦＥＲモチーフにおけるグルタミン酸又は機能的に同等の残基の前記置換は、Ｎ、Ｌ、Ｔ又はＳである、
   請求項１に記載のキメラＴｄＴバリアント。
3. 前記第一の種のＴｄＴ及び前記第三の種のＴｄＴが同じである、請求項１又は２に記載のキメラＴｄＴバリアント。
4. 前記アミノ酸セグメントＢ_１、Ｂ_２及びＢ_３のそれぞれは、配列番号：２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０及び４１からなる群から選択される配列のアミノ酸セグメントと少なくとも９０パーセント同一のアミノ酸配列を有し、ここで、
   前記ＦＭＲモチーフにおける前記メチオニン又はその機能的に同等の残基の前記置換は、配列番号：２、３、４、６、７、８、１１、１２及び１３に関して６３位；配列番号：５に関して６２位；配列番号：９に関して６４位；配列番号：１０、２６、２８、２９、３０、３２、３３、３４、３６、３７、３８及び３９に関して６１位；配列番号：１４に関して６６位；配列番号：１５に関して４７位；並びに配列番号：２７、３１、３５及び４０に関して４８位にあり；
   前記ＶＳＣモチーフにおける前記バリン又はその機能的に同等の残基の前記置換は、配列番号：２、３、４、６、７、８、１１、及び１２に関して１７１位；配列番号：５、３２、３３、３４、３６、３７、３８、３９及び４１に関して１７０位；配列番号：９に関して１７２位；配列番号：１０、２８、２９、３０、３２、３３、３４、３６、３７、３８、３８及び４１に関して１６９位；配列番号：１３に関して１８０位；配列番号：１４に関して１７４位；配列番号：１５に関して１５４位；配列番号：２６に関して１６８位；配列番号：２７、３５及び４０に関して１５６位；配列番号：３１に関して１５７位にあり；
   前記ＶＳＣモチーフにおける前記セリン又はその機能的に同等の残基の前記置換は、配列番号：２、３、４、６、７、８、１１及び１２に関して１７２位；配列番号：５に関して１７１位；配列番号：９に関して１７３位；配列番号：１０、２８、２９、３０に関して１７０位；配列番号：１３に関する１８１位；配列番号：１４に関して１７５位；配列番号：１５に関して１５５位；配列番号：２６に関して１６９位、並びに配列番号：２７、３１、３５及び４０に関して１５７位にあり；
   前記ＶＳＣモチーフにおける前記システイン又はその機能的に同等の残基の前記置換は、配列番号：２、３、４、６、７、８、１１及び１２に関して１７３位；配列番号：５に関して１７２位；配列番号：９に関して１７４位；配列番号：１０、２８、２９、３０、３２、３３、３４、３７、３８、３９及び４１に関して１７１位；配列番号：１３に関して１８２位；配列番号：１４に関して１７６位；配列番号：２６に関して１７０位；配列番号：２７、３１、３５、３６及び４０に関して１５８位；並びに配列番号：１５に関して１５６位にあり；
   前記ＧＧＦＲＲモチーフにおける前記第二のアルギニン又はその機能的に同等の残基の前記置換は、配列番号：２、３、４、６、７、８、１１及び１２に関して２０７位；配列番号：５に関して２０６位；配列番号：９に関して２０８位；配列番号：１０、２８、２９、３０、３２、３３、３４、３６、３７、３８、３９及び４１に関して２０５位；配列番号：２６に関して２０４位；配列番号：２７、３１、３５及び４０に関して１９２位；配列番号：１３に関して２１６位；配列番号：１４に関して２１０位；並びに配列番号：１５に関して１９０位にあり；
   前記ＴＧＳＲモチーフにおける前記アルギニン又は機能的に同等の残基の前記置換は、配列番号：２、７、８、１２及び３３に関して３２５位；配列番号：３、４、２９及び３２に関して３２４位；配列番号：５に関して３２０位；配列番号：６に関して３３１位；配列番号：９及び２６に関して３２６位；配列番号：２８、３０に関して３２７位；配列番号：１０に関して３２３位；配列番号：１１及び１４に関して３２８位；配列番号：１３に関して３３８位；配列番号：２７、３１に関して３１４位；配列番号：３５に関して３１０位；配列番号：３１に関して３１１位；配列番号：３２に関して３２１位；配列番号：３３、３４に関して３２２位；配列番号：３６、３７、３８、３９及び４１に関して３２３位；配列番号：４０に関して３０９位；並びに配列番号：１５に関して３０８位にあり；且つ
   前記ＦＥＲモチーフにおける前記グルタミン酸又は機能的に同等の残基の前記置換は、配列番号：２、７、８及び１２に関して３２８位；配列番号：３、４及び２９に関して３２７位；配列番号：５に関して３２３位；配列番号：６に関して３３４位；配列番号：９及び２６に関して３２９位；配列番号：１０、３６、３７、３８、３９及び４１に関して３２６位；配列番号：１１及び１４に関して３３１位；配列番号：１３に関して３４１位；配列番号：２７に関して３１７位；配列番号：２８及び３０に関して３３０位；配列番号：４０に関して３１２位；配列番号：３５に関して３１３位；配列番号：３１に関して３１４位；配列番号：３２に関して３２４位；配列番号：３３及び３４に関して３２５位；並びに配列番号：１５に関して３１１位にある、
   請求項１から３の何れか一項に記載のキメラＴｄＴバリアント。
5. （ｉ）Ｂ_１の前記ＦＭＲモチーフにおけるメチオニン又は機能的に同等の残基の前記置換は、Ｒ又はＱであり；Ｂ_１がＧＧＦＲＲモチーフを含む場合は常にＢ_１の前記ＧＧＦＲＲモチーフにおける前記第二のアルギニン又は機能的に同等の残基の前記置換は、Ｌ又はＮであり；並びにＢ_１がＶＳＣモチーフを含む場合は常にＢ_１の前記ＶＳＣモチーフにおけるシステイン又は機能的に同等の残基の前記置換は、Ｇ又はＲであり；
   （ｉｉ）Ｂ_２がＶＳＣモチーフを含む場合は常にＢ_２の前記ＶＳＣモチーフにおけるシステイン又は機能的に同等の残基の前記置換は、Ｒ又はＱであり；Ｂ_２がＧＧＦＲＲモチーフを含む場合は常にＢ_２の前記ＧＧＦＲＲモチーフにおける前記第二のアルギニン又は機能的に同等の残基の前記置換は、Ｌ又はＮであり；Ｂ_２がＴＧＳＲモチーフを含む場合は常にＢ_２の前記ＴＧＳＲモチーフにおけるアルギニン又は機能的に同等の残基の前記置換は、Ｐ、Ｎ又はＡであり；並びにＢ_２がＦＥＲモチーフを含む場合は常にＢ_２の前記ＦＥＲモチーフにおけるグルタミン酸又は機能的に同等の残基の前記置換は、Ｎ、Ｌ、Ｔ、又はＳであり；且つ
   （ｉｉｉ）Ｂ_３がＴＧＳＲモチーフを含む場合は常にＢ_３の前記ＴＧＳＲモチーフにおけるアルギニン又は機能的に同等の残基の前記置換は、Ｐ、Ｎ、又はＡであり；並びにＢ_３がＦＥＲモチーフを含む場合は常にＢ_３の前記ＦＥＲモチーフにおけるグルタミン酸又は機能的に同等の残基の前記置換は、Ｎ、Ｌ、Ｔ又はＳである、
   請求項４に記載のキメラＴｄＴバリアント。
6. 前記ＦＭＲモチーフの前記メチオニンの前記置換は、Ｒ又はＱであり；前記ＶＳＣモチーフの前記バリンの前記置換はＡであり；前記ＶＳＣモチーフの前記セリンの前記置換はＥであり；前記ＶＳＣモチーフの前記システインの前記置換は、Ｇ又はＲであり；前記ＧＧＦＲＲモチーフの前記第二のアルギニンの前記置換は、Ｌ又はＮであり；前記ＴＧＳＲモチーフの前記アルギニンの前記置換は、Ｐ、Ｎ又はＡであり；並びに前記ＦＥＲモチーフの前記グルタミン酸の前記置換は、Ｎ、Ｌ、Ｔ又はＳである、請求項４に記載のキメラＴｄＴバリアント。
7. 前記第一及び第二の種のＴｄＴがそれぞれ哺乳動物のＴｄＴである、請求項１から６の何れか一項に記載のキメラＴｄＴバリアント。
8. 前記第一の種のＴｄＴと前記第二の種のＴｄＴが、それぞれ、マウス、ウシ、ヒト、フクロネズミ、ハネジネズミ、イヌ、モグラ、ナキウサギ、ハリネズミ、ツパイ、カモノハシ、トビネズミ及びピューマからなる群から選択される種の各ＴｄＴである、請求項７に記載のキメラＴｄＴバリアント。
9. 前記第一の種のＴｄＴがマウスであり、前記第二の種のＴｄＴがウシである、請求項８に記載のキメラＴｄＴバリアント。
10. 前記第一の種のＴｄＴが配列番号：２１のアミノ酸配列を有し、前記第二の種のＴｄＴが配列番号：２２のアミノ酸配列を有する、請求項９に記載のキメラＴｄＴバリアント。
11. 配列番号：２３のアミノ酸配列を有する、請求項１０に記載のキメラＴｄＴバリアント。
12. 配列番号：２４のアミノ酸配列を有する、請求項１０に記載のキメラＴｄＴバリアント。
13. 前記３’－Ｏ－修飾ヌクレオシドトリホスフェートが、３’－Ｏ－ＮＨ_２－ヌクレオシドトリホスフェート、３’－Ｏ－アジドメチル－ヌクレオシドトリホスフェート、３’－Ｏ－アリル－ヌクレオシドトリホスフェート、又は３’－Ｏ－（２－ニトロベンジル）－ヌクレオシドトリホスフェートである、請求項１から１２の何れか一項に記載のキメラＴｄＴバリアント。
14. 式：
    Ｊ_１－Ｊ_２－Ｊ_３
    ［上式中、
    Ｊ_１は、ＢＲＣＴ様領域を持たないマウスＴｄＴのアミノ酸セグメントであり、そのＮ末端からＶＳＣモチーフとＫＭＴモチーフの間のアミノ酸位置まで伸び、ここで、Ｊ_１はＦＭＲモチーフにメチオニン又は機能的に同等の残基の置換を、Ｊ_１がＧＧＦＲＲモチーフを含む場合は常にそのＧＧＦＲＲモチーフに第二のアルギニン又は機能的に同等の残基の置換を、並びにＪ_１がＶＳＣモチーフを含む場合は常にそのＶＳＣモチーフにバリン若しくはセリン若しくはシステイン又は機能的に同等の残基の一又は複数の置換をそれぞれ含み；
    Ｊ_２は、ＶＳＣモチーフとＫＭＴモチーフとの間に位置するアミノ酸位置からＴＧＳＲモチーフのアミノ酸位置まで伸びる非マウスＴｄＴのアミノ酸セグメントであり、ここで、アミノ酸セグメントは、Ｊ_２がＧＧＦＲＲモチーフを含む場合は常にそのＧＧＦＲＲモチーフに第二のアルギニン又は機能的に同等の残基の置換を、並びにＪ_２がＶＳＣモチーフを含む場合は常にそのＶＳＣモチーフにバリン若しくはセリン若しくはシステイン又は機能的に同等の残基の一又は複数の置換を含み；且つ
    Ｊ_３は、ＴＧＳＲモチーフのアミノ酸位置からそのＣ末端アミノ酸まで伸びるマウスＴｄＴのアミノ酸セグメントであり、ここで、Ｊ_３は、Ｊ_３がＴＧＳＲモチーフを含む場合は常にそのＴＧＳＲモチーフにアルギニン又は機能的に同等の残基の置換を、並びにＪ_３がＦＥＲモチーフを含む場合は常にそのＦＥＲモチーフにグルタミン酸又は機能的に同等の残基の置換を含み；
    ここで、キメラＴｄＴバリアントは、（ｉ）テンプレートなしで核酸断片を合成することができ、（ｉｉ）３’－Ｏ－ブロックヌクレオシドトリホスフェートを核酸断片に取り込むことができ；
    且つ、Ｊ_１、Ｊ_２及びＪ_３は、キメラＴｄＴバリアントが３５０から４１０個のアミノ酸を有するように選択される］
    によって定まるアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント同一であるアミノ酸配列を含むキメラ末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）バリアント。
15. （ｉ）前記アミノ酸セグメントＪ_１は、配列番号：４２、７１、７３又は８２から選択されるアミノ酸配列を含み；並びに配列番号：４２のアミノ酸配列は、６３位にメチオニンの置換を有し、（ｉｉ）前記アミノ酸セグメントＪ_２は、配列番号：４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、及び７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、それぞれが３５位にアルギニンの置換を有し、並びにそれぞれが１位にシステインの置換を有し、且つ（ｉｉｉ）前記アミノ酸セグメントＪ_３は、１２位にアルギニン、１５位にグルタミン酸の置換、及び３８位にアルギニンの置換を有する配列番号：４３のアミノ酸配列；又は配列番号：７２のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載のキメラＴｄＴバリアント。
16. ６３位でのメチオニンの前記置換がＲ又はＱであり、３５位でのアルギニンの前記置換がＬ又はＮであり、並びに１位でのシステインの前記置換がＧ又はＲである、請求項１５に記載のキメラＴｄＴバリアント。
17. 配列番号：４２の前記アミノ酸配列が、１７位にアラニン、５２位にロイシン、５７位にグリシン、６３位にメチオニン及び１０８位にアラニンの置換を更に有する、請求項１５又は１６に記載のキメラＴｄＴバリアント。
18. 前記非マウスＴｄＴがウシＴｄＴである、請求項１４から１７の何れか一項に記載のキメラＴｄＴバリアント。
19. 前記キメラＴｄＴバリアントが、配列番号：７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０及び８１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１８に記載のキメラＴｄＴバリアント。
20. 前記３’－Ｏ－修飾ヌクレオシドトリホスフェートが、３’－Ｏ－ＮＨ_２－ヌクレオシドトリホスフェート、３’－Ｏ－アジドメチル－ヌクレオシドトリホスフェート、３’－Ｏ－アリル－ヌクレオシドトリホスフェート、又は３’－Ｏ－（２－ニトロベンジル）－ヌクレオシドトリホスフェートである、請求項１４から１９の何れか一項に記載のキメラＴｄＴバリアント。
21. 予め決まった配列を有するポリヌクレオチドを合成する方法であって、
    ａ）遊離３’－ヒドロキシルを有するイニシエーターを提供する工程；及び
    ｂ）（ｉ）伸長条件下で、遊離３’－Ｏ－ヒドロキシルを有するイニシエーター又は伸長断片を３’－Ｏ－ブロックヌクレオシドトリホスフェート及び末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）バリアントと接触させて、イニシエーター又は伸長断片が３’－Ｏ－ブロックヌクレオシドトリホスフェートの取り込みにより伸長されて３’－Ｏ－ブロック伸長断片を形成し、且つ（ｉｉ）伸長断片をデブロックして遊離３’－ヒドロキシルを有する伸長断片を形成するサイクルを、ポリヌクレオチドが合成されるまで繰り返す工程
    を含み、ＴｄＴバリアントが請求項１から２０の何れか一項に記載のキメラＴｄＴバリアントである、方法。
22. ａ）請求項１から２０の何れか一項に記載のキメラＴｄＴバリアント、ｂ）一又は複数のヌクレオチド、好ましくは一又は複数の３’－Ｏ－ブロックヌクレオシドトリホスフェート、及びｃ）任意選択的に、少なくとも一種の核酸プライマーを含む、ヌクレオチド取り込み反応を実施するためのキット。

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