FR3052462A1 - Variants d'une adn polymerase de la famille polx - Google Patents

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FR3052462A1
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dna polymerase
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Thomas Ybert
Marc Delarue
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Institut Pasteur de Lille
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Institut Pasteur de Lille
DNA Script SAS
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Abstract

L'invention concerne des variants d'une ADN polymérase de la famille polX capable de synthétiser une molécule d'acide nucléique sans brin matrice, ou d'un fragment fonctionnel d'une telle polymérase, comprenant au moins une mutation d'un résidu à au moins une position particulière, et des utilisations de ces variants, notamment pour la synthèse de molécules d'acide nucléiques comprenant des nucléotides modifiés en 3'-OH.

Description

Variants d’une ADN polymérase de la famille polX
Introduction
La présente invention relève du domaine de l’amélioration des enzymes. La présente invention est relative à un variant amélioré d’une ADN polymérase de la famille polX, un acide nucléique codant pour ce variant, la production de ce variant dans une cellule hôte, son utilisation pour la synthèse d’une molécule d’acide nucléique sans brin matrice et un kit pour la synthèse d’une molécule d’acide nucléique sans brin matrice.
La synthèse chimique de fragments d’acide nucléique est une technique largement utilisée dans les laboratoires (Adams et al., 1983, J. Amer. Chem. Soc. 105 :661 ; Froehler et al., 1983, Tetrahedron Lett. 24 :3171). Elle permet d’obtenir de manière rapide des molécules d’acide nucléique comprenant la séquence de nucléotides voulue. A l’inverse des enzymes qui effectuent la synthèse dans le sens 5’ vers 3’, la synthèse chimique s’effectue dans le sens 3’ vers 5’. La synthèse chimique connaît cependant certaines limites. En effet, elle nécessite l’utilisation de multiples solvants et réactifs. En outre, elle ne permet d’obtenir que des fragments courts d’acide nucléique, qu’il est ensuite nécessaire d’assembler entre eux pour obtenir les brins d’acides nucléiques finaux souhaités.
Une solution alternative mettant en œuvre des enzymes pouvant réaliser la réaction de couplage entre nucléotides à partir d'un fragment d'acide nucléique initial (amorce) et en l'absence de brin matrice a été développée. Plusieurs enzymes de type polymérase semblent adaptées à ce genre de méthodes de synthèse.
Il existe un très grand nombre d’ADN polymérases capables de catalyser la synthèse d’un brin d’acide nucléique, en présence ou non d’un brin matrice. Ainsi, les ADN polymérases de la famille polX sont impliquées dans un large éventail de processus biologiques, en particulier dans les mécanismes de réparation de l’ADN ou de correction des erreurs apparaissant dans les séquences d’ADN. Ces enzymes sont capables d’introduire des nucléotides dans les brins d’acide nucléique ayant subi des excisions suite à l’identification d’erreurs dans la séquence. Les ADN polymérases de la famille polX regroupent les ADN polymérases β (Pol β), λ (Pol λ), μ (Pol μ), IV de levure (Pol IV) et la desoxyribonucléotidyl-transferase terminale (TdT). La
TdT notamment est très utilisée dans les procédés de synthèse enzymatique de molécules d’acide nucléique.
Cependant, ces ADN polymérases ne permettent le plus souvent que l’incorporation de nucléotides naturels. Dans tous les cas, les ADN polymérases naturelles perdent de leur activité catalytique en présence de nucléotides non naturels, et notamment des nucléotides modifiés en 3ΌΗ, présentant un encombrement stérique plus important que les nucléotides naturels.
Or, l’utilisation de nucléotides modifiés peut s’avérer utile pour certaines applications spécifiques. Π a donc été nécessaire de développer des enzymes capables de catalyser la synthèse d’un brin d’acide nucléique en incorporant de tels nucléotides. Des variants d’ADN polymérase ont ainsi été développés, dans le but de fonctionner avec des nucléotides comportant des modifications structurales importantes.
Les variants actuellement disponibles ne donnent cependant pas entièrement satisfaction, notamment du fait de leur faible activité, compatible seulement avec la synthèse enzymatique à l’échelle du laboratoire. Π existe donc un besoin en ADN polymérases capables de synthétiser, si possible à l’échelle industrielle, un acide nucléique en l’absence de brin matrice et en utilisant des nucléotides modifiés. Résumé de l’invention
La présente invention lève certains verrous technologiques qui empêchent l’utilisation à l’échelle industrielle d’ADN polymérases pour la synthèse enzymatique d’acides nucléiques.
La présente invention propose ainsi des variants d’ADN polymérases de la famille polX capables de synthétiser un acide nucléique en l’absence de brin matrice et aptes à utiliser des nucléotides modifiés. Les variants développés présentent des capacités d’incorporation de nucléotides modifiés très supérieures à celles des ADN polymérases naturelles dont ils sont dérivés. En particulier, les variants d’ADN polymérases objet de la présente invention sont particulièrement efficaces pour l’incorporation de nucléotides présentant des modifications au niveau du sucre. En effet, les inventeurs ont développé des variants présentant un volume de poche catalytique accru par rapport à celui des ADN polymérases dont ils sont issus, favorisant l’incorporation de nucléotides modifiés plus encombrants que les nucléotides naturels. Plus particulièrement, les variants d’ADN polymérases de la famille polX objets de la présente invention comprennent au moins une mutation sur un acide aminé intervenant directement au niveau de la cavité catalytique de l’enzyme, ou permettant la déformation des contours de cette cavité afin d'accommoder l’encombrement stérique dû aux modifications présentes au niveau des nucléotides. Par exemple, les mutations introduites permettent l’élargissement de la cavité catalytique de l’enzyme dans laquelle vient se loger l’extrémité 3’-OH des nucléotides modifiés. De manière alternative ou additionnelle, les mutations réalisées permettent l’inflation ou augmentation du volume de la cavité catalytique, l'accroissement de l’accès à la poche catalytique par les nucléotides modifiés en 3’-OH et/ou confèrent la flexibilité nécessaire à la structure de l’enzyme pour lui permettre d’accommoder des modifications stériquement importantes des nucléotides modifiés en 3’-OH. Grâce à de telles mutations, une fois la polymérase fixée au fragment d’acide nucléique à allonger, le nucléotide modifié pénètre au cœur de la poche catalytique dont l’accès est élargi et y adopte une conformation spatiale optimale, une liaison phosphodiester entre l’extrémité 3’-OH du dernier nucléotide du brin d’acide nucléique et l’extrémité 5’-triphosphate du nucléotide modifié se créant. L’invention a donc pour objet un variant d’une ADN polymérase de la famille polX capable de synthétiser une molécule d’acide nucléique sans brin matrice, ou un variant d’un fragment fonctionnel d’une telle polymérase, ledit variant comprenant au moins une mutation d’un résidu à au moins une position sélectionnée dans le groupe consistant en M330, T331, G332, G333, F334, K338, H342, D343, V344, D345, F346, A397, D399 D434, V436, A446, L447, L448, G449, W450, G452, Q455, F456, E457, R458, R461, N474, E491, D501, Y502, 1503, P505, R508, N509 et A510, ou un résidu fonctionnellement équivalent, les positions indiquées étant déterminées par alignement avec SEQ ID N°l.
Dans un mode de réalisation particulier, le variant est capable de synthétiser un brin d’ADN ou un brin d’ARN.
La présente invention concerne notamment un variant d’une ADN polymérase de la famille polX et notamment d’une Pol IV de levure, Pol μ ou TdT sauvage, et comprenant la ou les mutations sélectionnées. Dans un exemple de réalisation particulier, le variant selon la présente invention est un variant de la TdT de séquence SEQ ID N°1 ou une séquence homologue qui présente au moins 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% d’identité avec la séquence de la SEQ ID No 1, et porte la ou les mutations sélectionnées. L’invention concerne également un acide nucléique codant un variant d’une ADN polymérase de la famille polX selon la présente invention, une cassette d’expression comprenant un acide nucléique selon la présente invention et un vecteur comprenant un acide nucléique ou une cassette d’expression selon la présente invention. L’acide nucléique codant pour le variant de la présente invention peut être celui de la forme mature ou de la forme précurseur de l’ADN polymérase selon la présente invention.
La présente invention concerne également l’utilisation d’un acide nucléique, d’une cassette d’expression ou d’un vecteur selon la présente invention pour transformer ou transfecter une cellule hôte. Elle concerne en outre une cellule hôte comprenant un acide nucléique, une cassette d’expression ou un vecteur codant une ADN polymérase de la famille polX selon la présente invention. Elle concerne l’utilisation d’un tel acide nucléique, d’une telle cassette d’expression, d’un tel vecteur ou d’une telle cellule hôte pour produire un variant d’une ADN polymérase de la famille polX selon la présente invention.
Elle concerne également un procédé de production d’un variant d’une ADN polymérase de la famille polX selon la présente invention comprenant la transformation ou la transfection d’une cellule hôte par un acide nucléique, une cassette d’expression ou un vecteur selon la présente invention, la mise en culture de la cellule hôte transformée/transfectée dans des conditions de culture permettant l’expression de l’acide nucléique codant ledit variant, et optionnellement la récolte du variant d’une ADN polymérase de la famille polX produit par la cellule hôte.
La cellule hôte peut être procaryote ou eucaryote. Notamment, la cellule hôte peut être un microorganisme, de préférence une bactérie, une levure ou un champignon. Dans un mode de réalisation, la cellule hôte est une bactérie, de préférence E. coli. Dans autre un mode de réalisation, la cellule hôte est une levure, de préférence P. pastoris ou K. lactis. Dans un autre mode de réalisation, la cellule hôte est une cellule de mammifère, de préférence une cellule COS7 ou CHO. L’invention concerne également l’utilisation d’un variant d’une ADN polymérase de la famille polX selon la présente invention, pour synthétiser une molécule d’acide nucléique sans brin matrice, à partir de nucléotides modifiés en 3’-OH. Bien entendu, le variant d’ADN polymérase de la famille polX selon la présente invention peut également être utilisé, dans le contexte de l’invention, pour synthétiser une molécule d’acide nucléique sans brin matrice, à partir de nucléotides non modifiés ou d’un mélange de nucléotides modifiés et non modifiés. L’invention propose également un procédé de synthèse enzymatique d’une molécule d’acide nucléique sans brin matrice, selon lequel on met en contact un brin amorce avec au moins un nucléotide, préférentiellement un nucléotide modifié en 3’-OH, en présence d’un variant d’une ADN polymérase de la famille polX selon l’invention. La mise en œuvre du procédé peut notamment être réalisée en utilisant un variant purifié, un milieu de culture d’une cellule hôte transformée pour exprimer ledit variant, et/ou un extrait cellulaire d’une telle cellule hôte. L’invention a également pour objet un kit pour la synthèse enzymatique d’une molécule d’acide nucléique sans brin matrice comprenant au moins un variant d’une ADN polymérase de la famille polX selon l’invention, des nucléotides, préférentiellement des nucléotides modifiés en 3’-OH, et optionnellement au moins un brin amorce, ou amorce nucléotidique, et/ou un tampon réactionnel.
Description des figures
Figure 1 : Gel SDS-PAGE de fractions d’un variant de TdT selon un exemple de réalisation de l’invention (M : Marqueur de poids moléculaire ; 1 : Centrifugat avant chargement ; 2 : Centrifugat après chargement ; 3 : Tampon de lavage après chargement ; 4 : Elution fraction 3 mL ; 5 : Elution fraction 30 mL ; 6 : Rassemblement pic d’élution ; 7 : Concentration) ;
Figure 2 : Alignement des séquences d’acides aminés des ADN polymérases Pol μ d’Homo sapiens (UniProtKB Q9NP87), Pol μ de Pan troglodytes (UniProtKB H2QUI0), Pol μ de Mus musculus (UniProtKB Q924W4), TdT de Canis lupus familiaris (UniProtKB F1P657), TdT de Mus musculus (UniProtKB Q3UZ80), TdT de Gallus gallus (UniProtKB P36195) et TdT d’Homo sapiens (UniProtKB P04053) obtenu au moyen du logiciel d’alignement en ligne Mutalin (http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html) ;
Figure 3 : Comparaison de l’activité d’une TdT sauvage tronquée de séquence SEQ ID N°3 et de plusieurs variants de cette TdT tronquée comprenant différentes substitutions données par le tableau 1, en présence d’une amorce préalablement marquée radioactivement en 5’ et de nucléotides modifiés 3'-0-amino-2',3'-dideoxyadenosine-5'-triphosphate (gel ONH2) ou nucléotides modifiés 3'-biot-EDA-2',3'-dideoxyadenosine-5'-triphosphate (gel Biot-EDA) ; sur gel SDS-PAGE (No : pas d’enzyme présente ; wt : TdT sauvage tronquée de séquence SEQ ID N°3; DSi : Variants i définis dans le tableau 1).
Description détaillée de l’invention Définitions
Les acides aminés sont représentés dans ce document par le code à une lettre ou à trois lettres selon la nomenclature suivante : A : Ala (alanine) ; R : Arg (arginine) ; N : Asn (asparagine) ; D : Asp (acide aspartique) ; C : Cys (cystéine) ; Q : Gin (glutamine) ; E : Glu (acide glutamique) ; G : Gly (glycine) ; H : His (histidine) ; I : Ile (isoleucine) ; L : Leu (leucine) ; K : Lys (lysine) ; M : Met (méthionine) ; F : Phe (phénylalanine) ; P : Pro (proline) ; S : Ser (sérine) ; T : Thr (thréonine) ; W : Trp (tryptophane) ; Y : Tyr (tyrosine) ; V : Val (valine).
Par « pourcentage d’identité » entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucléotides ou de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Le meilleur alignement ou alignement optimal est l'alignement pour lequel le pourcentage d’identité entre les deux séquences à comparer, comme calculé ci- après, est le plus élevé. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par fenêtre de comparaison pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981) (Ad. App. Math. 2 : 482), au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970) (J. Mol. Biol. 48 : 443), au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 2444), au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics
Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), au moyen du logiciel d’alignement en ligne Mutalin (http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html ; 1988, Nucl. Acids Res.. 16 (22), 10881-10890). Le pourcentage d’identité entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale par fenêtre de comparaison dans laquelle la région de la séquence d'acide nucléique ou d'acides aminés à comparer peut comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d’identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou le résidu d'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d’identité entre ces deux séquences.
Les variants objets de la présente invention sont décrits en fonction de leurs mutations sur des résidus spécifiques, dont les positions sont déterminées par alignement avec, ou référence à, la séquence enzymatique SEQ ID N°l. Dans le contexte de l’invention, tout variant portant ces mêmes mutations sur des résidus fonctionnellement équivalents est également visé. Par « résidu fonctionnellement équivalent », on entend un résidu dans une séquence d’une ADN polymérase de la famille polX de séquence homologue à SEQ ID N°1 et présentant un rôle fonctionnel identique. Les résidus fonctionnellement équivalents sont identifiés en ayant recours à des alignements de séquences, par exemple au moyen du logiciel d’alignement en ligne Mutalin (http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/mulUilin.html ; 1988, Nucl. Acids Res.. 16 (22), 10881-10890). Après alignement, les résidus fonctionnellement équivalents se trouvent à des positions homologues sur les différentes séquences considérées. Les alignements de séquences et l’identification de résidus fonctionnellement équivalents peuvent se faire entre n’importe quelles ADN polymérases de la famille polX et leurs variants naturels, y compris inter-espèces. A titre d’exemple, le résidu L40 de la TdT humaine (UniProtKB P04053) est fonctionnellement équivalent au résidu M40 de la TdT de poulet (UniProtKB P36195) et au résidu V40 de la Polp de Pan troglodytes (UniProtKB H2QUI0), lesdits résidus étant considérés après alignement des séquences (figure 2).
Par « fragment fonctionnel » est entendu un fragment d’ADN polymérase de la famille polX présentant l’activité ADN polymérase. Le fragment peut comprendre 100, 200, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380 ou plus acides aminés consécutifs d’une ADN polymérase de la famille polX. Préférentiellement le fragment comporte 380 acides aminés consécutifs d’une ADN polymérase de la famille polX consistant en le fragment catalytique de ladite enzyme.
Les termes «mutant» et «variant» peuvent être utilisés de manière interchangeable pour faire référence à des polypeptides dérivés d’ADN polymérases de la famille polX, ou dérivés de fragments fonctionnels de telles ADN polymérases, et notamment d’une TdT telle que la TdT murine selon la séquence SEQID N 0 1, et comprenant une altération, à savoir une substitution, une insertion et / ou délétion, à une ou plusieurs positions et ayant une activité d’ADN polymérases. Les variants peuvent être obtenus par diverses techniques bien connues dans l'art. En particulier, des exemples de techniques de modification de la séquence d'ADN codant pour la protéine de type sauvage, comprennent, mais sans s'y limiter, la mutagenèse dirigée, la mutagenèse aléatoire et la construction d'oligonucléotides synthétiques.
Le terme «modification» ou «mutation» tel qu'utilisé ici par rapport à une position ou un résidu d’acide aminé signifie que l'acide aminé dans la position considéré a été modifié par rapport à l'acide aminé de la protéine de type sauvage de référence. De telles modifications comprennent les substitution, délétion et / ou insertion d'un ou plusieurs acides aminés, et notamment 1 à 5, là 4, 1 à 3, 1 à 2 acides aminés, à une ou plusieurs positions, et notamment à 1, 2, 3, 4, 5 ou plus positions.
Le terme «substitution», en relation avec une position ou un résidu d'acides aminés, signifie que l'acide aminé dans la position particulière a été remplacé par un autre acide aminé que celui dans l’ADN polymérase sauvage ou parente. De préférence, le terme "substitution" désigne le remplacement d'un résidu d'acide aminé par un autre choisi parmi les 20 résidus naturels d'acides aminés standards, les résidus d'acide aminé d'origine naturelle rares (par exemple, l'hydroxyproline, l'hydroxylysine, l'allohydroxylysine, la 6-N-methylysine, la N-éthylglycine, la N-méthylglycine, la N-ethylasparagine, l'allo-isoleucine, la N-méthylisoleucine, la N-méthylvaline, la pyroglutamine, l'acide aminobutyrique, ornithine), et les résidus d'acide aminé non naturels rares, souvent fabriqués synthétiquement (par exemple, la norleucine, la norvaline et cyclohexyl-alanine). De préférence, le terme "substitution" désigne le remplacement d'un résidu d'acide aminé par un autre choisi parmi les 20 résidus d'acides aminés standards d'origine naturelle (G, P, A, V, L, I, M, C, F, Y, W, H, K, R, Q, N, E, D, S et T). La substitution peut être une substitution conservatrice ou non conservatrice. Les substitutions conservatrices se font au sein d’un même groupe d’acides aminés, parmi les aminés basiques (arginine, lysine et histidine), les acides aminés acides (acide glutamique et acide aspartique), les acides aminés polaires (glutamine et asparagine), les acides aminés hydrophobes (méthionine, leucine, isoleucine et valine), les acides aminés aromatiques (phénylalanine, tryptophane et tyrosine) et les petits acides aminés (glycine, alanine, serine et thréonine). Dans le présent document, la terminologie suivante est utilisée pour désigner une substitution: R454F indique que le résidu d'acide aminé en position 454 de la SEQ Π) N °1 (arginine, R) est remplacé par une phénylalanine (F). N474S/T/N/Q signifie que le résidu d'acide aminé en position 474 (Asparagine, N) peut être remplacé par une sérine (S), une thréonine (T), une asparagine (N) ou une glutamine (Q). Le signe "+" indique une combinaison de substitutions. L’invention a trait à des variants d’ADN polymérases de la famille polX (EC 2.7.7.7 ; Advances in Protein Chemistry, Vol. 71,401-440) capables de synthétiser une molécule d’acide nucléique sans brin matrice, et notamment un brin d’ADN ou d’ARN. Les ADN polymérases de la famille polX comprennent notamment l’ADN polymérase Ροΐβ (UniProt P06746 chez humain ; Q8K409 chez la souris), la Polo, la Ροΐλ (UniProt Q9UGP5 chez humain ; Q9QUG2 et Q9QXE2 chez la souris) et la Ροΐμ (UniProt Q9NP87 chez humain ; Q9JIW4 chez la souris), la Pol4 (UniProt A7TER5 chez la levure Vanderwaltozyma polyspora ; P25615 chez la levure Saccharomyces cerevisiae), et les Désoxyribonucléotidyl-transférase terminale ou TdT (EC 2.7.7.31 ; UniProt P04053 chez humain ; P09838 chez la souris). L’invention a plus particulièrement pour objet un variant d’ADN polymérase de la famille polX capable de synthétiser une molécule d’acide nucléique sans brin matrice, ou un variant d’un fragment fonctionnel d’une telle polymérase, ledit variant comprenant au moins une mutation d’un résidu à au moins une position sélectionnée dans le groupe consistant en M330, T331, G332, G333, F334, K338, H342, D343, V344, D345, F346, A397, D399, D434, V436, A446, L447, L448, G449, W450, G452, Q455, F456, E457, R458, R461, N474, E491, D501, Y502, 1503, P505, R508, N509 et A510, ou un résidu fonctionnellement équivalent, les positions indiquées étant déterminées par alignement avec, ou référence à, la séquence SEQ ID N°l.
Dans un mode de réalisation, le variant est capable de un brin d’ADN et/ou un brin d’ARN.
Par « comprendre au moins une mutation » ou « comprenant au moins une mutation », on entend que le variant présente une ou plusieurs mutations telles qu’indiquées par rapport à la séquence polypeptidique SEQ ID N°l, mais qu’il peut présenter d’autres modifications, notamment des substitutions, des délétions ou des additions. D’une manière générale, la mutation d’un ou plusieurs résidus aux positions ci-dessus permet l’élargissement de la poche catalytique (en ciblant par exemple les positions W450, D434, D435, H342, D343, T331, D399, R461, et/ou R508), l’accroissement de l’accessibilité à la poche catalytique (en ciblant par exemple les positions R458, E455, A397, K338, et/ou N509), et/ou confère une plus grande flexibilité à la structure de l’enzyme lui permettant de recevoir des nucléotides modifiés présentant un encombrement stérique important (en ciblant par exemple les positions V436, F346, V344, F334, M330, L448, E491, E457 et/ou N474).
Les variants objets de la présente invention peuvent être des variants de Pol IV, Pol μ, Ροΐβ, Ροΐλ ou de TdT, préférentiellement des variants de Pol IV, Pol μ, ou TdT. De manière alternative, les variants peuvent être des variants d’enzymes chimères, combinant par exemple des portions de séquences différentes d’au moins deux ADN polymérases de la famille polX.
Dans un mode de réalisation particulier, le variant présente au moins 60% d’identité avec la séquence selon SEQ ID N°l, préférentiellement au moins 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% et moins de 100% d’identité avec la séquence selon SEQ ID N°l.
Selon l’invention, la mutation peut consister en une substitution, une délétion ou une addition d’un ou plusieurs résidus d’acide aminé. Dans le cas de délétion, l’annotation X est utilisée, qui indique que le codon codant pour le résidu considéré est remplacé par un codon STOP, tous les acides aminés suivant ainsi que le résidu en question sont donc supprimés. Ainsi, la mutation D501X signifie que l’enzyme se termine au niveau du résidu précédent l’acide aspartique (D) à la position 501, c’est-à-dire la leucine (L) en position 500, tous les résidus au-delà ayant été supprimés. L’annotation 0 désigne par contre une simple délétion ponctuelle du résidu considéré. Ainsi, la mutation D5O10 signifie que l’acide aspartique (D) à la position 501 a été supprimé.
Préférentiellement, le variant selon l’invention comprend au moins une mutation d’un résidu à au moins une position sélectionnée dans le groupe consistant en T331, G332, G333, F334, D343, L447, L448, G449, W450, G452, Q455, E457 et R508, ou un résidu fonctionnellement équivalent, les positions indiquées étant déterminées par alignement avec SEQ ID N°l.
Dans un mode de réalisation particulier, le variant comprend en outre au moins une mutation d’un résidu dans au moins la région semi-conservée de séquence X1X2GGFR1R2GKX3X4 (SEQ ID N°4), dans laquelle
Xi représente un résidu choisi parmi Μ, I, V, L X2 représente un résidu choisi parmi T, A, M, Q X3 représente un résidu choisi parmi Μ, K, E, Q, L, S, P, R, D X4 représente un résidu choisi parmi T, I, M, F, K, V, Y, E, Q, H, S, R, D.
Préférentiellement, ledit variant présente au moins une substitution d’un résidu à au moins une position Ri, R2 et/ou K de la région semi-conservée de séquence SEQ ID N°4.
Dans un autre mode de réalisation particulier, le variant comprend en outre au moins une mutation d’un résidu dans au moins une région semi-conservée de séquence X1X2LGX3X4GSR1X5X6ER2 (SEQ ID N°5) dans laquelle
Xi représente un résidu choisi parmi A, C, G, S
X2 représente un résidu choisi parmi L, T, R
X3 représente un résidu choisi parmi W, Y
X4représente un résidu choisi parmi T, S, I X5 représente un résidu choisi parmi Q, L, H, F, Y, N, E, D ou 0
Xô représente un résidu choisi parmi F, Y
Préférentiellement, ledit variant présente au moins une substitution d’un résidu à au moins une position S, Ri et/ou E de la région semi-conservée de séquence SEQ ID N°5.
Dans un autre mode de réalisation particulier, le variant comprend en outre au moins une mutation d’un résidu dans au moins une région semi-conservée de séquence LX1YX2X3PX4X5RNA (SEQ ID N°6) dans laquelle
Xi représente un résidu choisi parmi D, E, S, P, A, K X2 représente un résidu choisi parmi I, L, Μ, V, A, T X3 représente un résidu choisi parmi E, Q, P, Y, L, K, G, N X4 représente un résidu choisi parmi W, S, V, E, R, Q, T, C, K, H X5 représente un résidu choisi parmi E, Q, D, H, L.
Préférentiellement, ledit variant présente au moins une délétion du résidu à la position Xi et/ou au moins une substitution au niveau des positions R et/ou N de la région semi-conservée de séquence SEQ ID N°6.
Dans un mode de réalisation particulier, le variant comprend une substitution d’un résidu à au moins une position sélectionnée dans le groupe consistant en K338, H342, A397, S453, E457, N474, D501, Y502, 1503, R508 et N509, ou un résidu fonctionnellement équivalent, préférentiellement une substitution d’un résidu à au moins une position sélectionnée dans le groupe consistant en A397, E457, N474, D501, Y502 et 1503, ou un résidu fonctionnellement équivalent, les positions indiquées étant déterminées par alignement avec SEQ ID N°l. L’invention concerne de préférence un variant d’une ADN polymérase de la famille polX comprenant au moins une substitution parmi le groupe consistant en K338A/C/G/S/T/N, H342A/C/G/S/T/N, A397R/H/K/D/E, S453A/C/G/S/T, E457G/N/S7T, N474S/T/N/Q, D501A/G/X, Y502A/G/X, I503A/G/X, R508A/C/G/S/T, N509A/C/G/S/T.
Avantageusement, le variant comprend une combinaison de substitutions sélectionnées dans le groupe mentionné ci-dessus. La combinaison peut consister en 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 substitutions sélectionnées dans ce groupe. L’invention a plus particulièrement pour objet des variants d’une ADN polymérase de la famille polX capables de synthétiser une molécule d’acide nucléique, tel qu’un brin d’ADN ou d’ARN sans brin matrice, ou d’un fragment fonctionnel d’une telle polymérase, lesdits variants comprenant au moins une combinaison de mutations décrites dans le tableau 1, les positions indiquées étant déterminées par alignement avec SEQ ID N°l.
Tableau 1 : Exemples de combinaisons de mutations de variants d’ADN polymérase de la famille polX
Dans un mode de réalisation particulier, le variant est une construction chimérique d’ADN polymérases de la famille polX. Par « construction chimérique », on entend une enzyme chimère constituée par l’apport, et notamment la fusion ou la conjugaison, d’une ou plusieurs séquences déterminées d’une enzyme membre de la famille polX en remplacement d’une ou plusieurs séquences homologues dans le variant d’ADN polymérase considéré.
Ainsi, l’invention propose un variant de la TdT de séquence SEQ ID N°1 comprenant, outre une ou plusieurs mutations ponctuelles à l’une et/ou l’autre des positions ci-dessus, une substitution des résidus compris entre les positions C378 à L406, ou les résidus fonctionnellement équivalents, par les résidus H363 à C390 de la polymérase Polp de séquence SEQ ID N°2, ou les résidus fonctionnellement équivalents.
De manière alternative ou additionnelle, les variants objets de la présente invention peuvent présenter une délétion d’un ou plusieurs résidus successifs d’acides aminés au niveau de la partie N-terminale. Ces délétions peuvent notamment cibler un ou des domaines enzymatiques impliqués dans la liaison avec d’autres protéines et/ou impliqués dans la localisation cellulaire. Par exemple la séquence polypeptidique de la TdT comprend en N-terminal un domaine BRCT d’interaction avec d’autres protéines telles que Ku70/80 et un domaine de localisation au niveau du noyau (NLS).
Dans un mode de réalisation particulier de la présente invention, le variant est un variant de la TdT de séquence SEQ ID N°1 présentant, outre une ou plusieurs des mutations décrites ci-dessus, une suppression des résidus 1-129 correspondant à l’extrémité N-terminale de la TdT sauvage.
Dans certains cas particuliers, les stratégies de mutagénèse peuvent être guidées par des informations connues telles que les séquences de variants naturels, la comparaison de séquence avec des protéines liées, des propriétés physiques, l’étude d’une structure tridimensionnelle ou de simulations informatique impliquant plusieurs entités.
La présente invention concerne un acide nucléique codant un variant d’une ADN polymérase de la famille polX capable de synthétiser une molécule d’acide nucléique sans brin matrice selon la présente invention. La présente invention concerne également une cassette d’expression d’un acide nucléique selon la présente invention. Elle concerne en outre un vecteur comprenant un acide nucléique ou une cassette d’expression selon la présente invention. Le vecteur peut être sélectionné parmi un plasmide et un vecteur viral. L’acide nucléique codant pour le variant d’ADN polymérase peut être de l’ADN (ADNc ou ADNg), de l’ARN, un mélange des deux. Π peut être sous forme simple chaîne ou en duplexe ou un mélange des deux. Π peut comprendre des nucléotides modifiés, comprenant par exemple une liaison modifiée, une base purique ou pyrimidique modifiée, ou un sucre modifié. Π peut être préparé par toutes méthodes connues de l’homme du métier, dont la synthèse chimique, la recombinaison, la mutagenèse, etc...
La cassette d’expression comprend tous les éléments nécessaires à l’expression du variant d’une ADN polymérase de la famille polX capable de synthétiser une molécule d’acide nucléique sans brin matrice selon la présente invention, notamment les éléments nécessaires à la transcription et à la traduction dans la cellule hôte. La cellule hôte peut être procaryote ou eucaryote. En particulier, la cassette d’expression comprend un promoteur et un terminateur, facultativement un amplificateur. Le promoteur peut être procaryote ou eucaryote. Des exemples de promoteurs procaryotes préférés sont les suivants : Lacl, LacZ, pLacT, ptac, pARA, pBAD, les promoteurs d’ARN polymérase de bactériophage T3 or T7, le promoteur de la polyhèdrine, le promoteur PR ou PL du phage lambda. Des exemples de promoteurs eucaryotes préférés sont les suivants : promoteur précoce du CMV, promoteur de la thymidine kinase de HSV, promoteur précoce ou tardif de SV40, le promoteur de la métallothionéine-L de souris, et les régions LTR de certains rétrovirus. De manière générale, pour le choix d'un promoteur adapté, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à l'ouvrage de Sambrook et al. (1989) ou encore aux techniques décrites par Fuller et al. (1996; Immunology in Current Protocols in Molecular Biology).
La présente invention concerne un vecteur portant un acide nucléique ou une cassette d’expression codant pour un variant d’une ADN polymérase de la famille polX capable de synthétiser une molécule d’acide nucléique sans brin matrice selon la présente invention. Le vecteur est de préférence un vecteur d’expression, c’est-à-dire qu’il comprend les éléments nécessaires à l’expression du variant dans la cellule hôte. La cellule hôte peut être un procaryote, par exemple E. coli, ou un eucaryote. L’eucaryote peut être un eucaryote inférieur comme une levure (par exemple, P. Pastoris ou K. lactis) ou un champignon (par exemple du genre Aspergillus) ou un eucaryote supérieur comme une cellule d’insecte (Sf9 ou Sf21 par exemple), de mammifère ou de plante. La cellule peut être une cellule mammifère, par exemple COS (lignée cellulaire de singe vert) (par exemple, COS 1 (ATCC CRL-1650), COS 7 (ATCC CRL-1651), CHO (US 4,889,803 ; US 5,047,335, CHO-K1 (ATCC CCL-61)), des cellules de souris et des cellules humaines. Dans un mode de réalisation particulier, la cellule est non-humaine et non-embryonnaire. Le vecteur peut être un plasmide, un phage, un phagemide, un cosmide, un virus, un YAC, un BAC, un plasmide pTi d’Agrobacterium, etc... Le vecteur peut comprendre de préférence un ou plusieurs éléments sélectionnés parmi une origine de réplication, un site de clonage multiple et un gène de sélection. Dans un mode de réalisation préféré, le vecteur est un plasmide. Des exemples non-exhaustifs de vecteurs procaryotes sont les suivants : pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pbs, pDIO, phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pBR322, et pRIT5 (Pharmacia), pET (Novagen). Des exemples non-exhaustifs de vecteurs eucaryotes sont les suivants : pWLNEO, pSV2CAT, pPICZ, pcDNA3.1 (+) Hyg (Invitrogen), pOG44, pXTl, pSG (Stratagene); pSVK3, pBPV, pCI-neo (Stratagene), pMSG, pSVL (Pharmacia); et pQE-30 (QLAexpress). Les vecteurs viraux peuvent être de manière non-exhaustive des adénovirus, des AAV, des HSV, des lentivirus, etc... De préférence, le vecteur d’expression est un plasmide ou un vecteur viral.
La séquence codant le variant selon la présente invention peut comprendre ou ne pas comprendre de peptide signal. Dans le cas où elle n’en comprend pas, une méthionine peut être éventuellement ajoutée à l’extrémité N-terminale. Dans une autre alternative, un peptide signal hétérologue peut être introduit. Ce peptide signal hétérologue peut être dérivé d’un procaryote tel que E. coli ou d’un eucaryote, notamment une cellule mammifère, d’insecte ou d’une levure.
La présente invention concerne l’utilisation d’un polynucléotide, d’une cassette d’expression ou d’un vecteur selon la présente invention pour transformer ou transfecter une cellule. La présente invention concerne une cellule hôte comprenant un acide nucléique, une cassette d’expression ou un vecteur codant un variant d’une ADN polymérase de la famille polX capable de synthétiser une molécule d’acide nucléique sans brin matrice et son utilisation pour produire un variant d’une ADN polymérase de la famille polX capable de synthétiser une molécule d’acide nucléique sans brin matrice recombinant selon la présente invention. Le terme « cellule hôte » englobe les cellules filles résultant de la culture ou de la croissance de cette cellule. Dans un mode de réalisation particulier, la cellule est non-humaine et non-embryonnaire. Elle concerne également une méthode de production d’un variant d’une ADN polymérase de la famille polX capable de synthétiser une molécule d’acide nucléique sans brin matrice recombinant selon la présente invention comprenant la transformation ou transfection d’une cellule par un polynucléotide, une cassette d’expression ou un vecteur selon la présente invention ; la mise en culture de la cellule transfectée/transformée ; et la récolte du variant d’une ADN polymérase de la famille polX capable de synthétiser une molécule d’acide nucléique sans brin matrice produit par la cellule. Dans un mode de réalisation alternatif, la méthode de production d’un variant d’une ADN polymérase de la famille polX capable de synthétiser une molécule d’acide nucléique sans brin matrice recombinant selon la présente invention comprenant la fourniture d’une cellule comprenant un polynucléotide, une cassette d’expression ou un vecteur selon la présente invention ; la mise en culture de la cellule transfectée/transformée ; et la récolte du variant d’une ADN polymérase de la famille polX capable de synthétiser une molécule d’acide nucléique sans brin matrice produit par la cellule. En particulier, la cellule peut être transformée/transfectée de manière transitoire ou stable par l’acide nucléique codant le variant. Cet acide nucléique peut être contenu dans la cellule sous forme d’épisome ou sous forme chromosomique. Les méthodes de production de protéines recombinantes sont bien connues par l’homme du métier. Par exemple, on peut citer les modes spécifiques décrits dans US 5,004,689, EP 446 582, Wang et al. (Sci. Sin. B 24:1076-1084, 1994 et Nature 295, page 503) pour une production dans E. coli, et JAMES et al. (Protein Science (1996), 5:331-340) pour une production en cellules mammifères.
Les variants d’ADN polymérase selon la présente invention sont particuliers intéressants pour la synthèse d’acides nucléiques sans brin matrice. Plus particulièrement, les variants selon l’invention présentent une poche catalytique accrue particulièrement adaptée pour la synthèse d’acide nucléique au moyen de nucléotides modifiés présentant un encombrement plus important que les nucléotides naturels. Les variants selon l’invention peuvent notamment permettre d’incorporer dans un brin d’acide nucléique des nucléotides modifiés tels que ceux décrits dans la demande W02016/034807. L’invention a donc également pour objet une utilisation d’un variant d’une ADN polymérase de la famille polX selon la présente invention, pour synthétiser une molécule d’acide nucléique sans brin matrice, à partir de nucléotides modifiés en 3’-OH, et notamment ceux décrits dans la demande W02016034807. L’invention a également pour objet un procédé de synthèse enzymatique d’une molécule d’acide nucléique sans brin matrice, selon lequel on met en contact un brin amorce avec au moins un nucléotide, préférentiellement un nucléotide modifié en 3’-OH, en présence d’un variant d’une ADN polymérase de la famille polX selon l’invention.
De manière avantageuse, les variants selon l’invention peuvent être utilisés pour mettre en œuvre le procédé de synthèse décrit dans la demande WO2015/159023. L’invention a également pour objet un kit pour la synthèse enzymatique d’une molécule d’acide nucléique sans brin matrice comprenant au moins un variant d’une ADN polymérase de la famille polX selon l’invention, des nucléotides, préférentiellement des nucléotides modifiés en 3’-OH, et optionnellement au moins une amorce nucléotidique.
Toutes les références citées dans cette description sont incorporées par référence dans la présente demande. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront mieux à la lecture des exemples suivants donnés bien entendu à titre illustratif et non limitatif.
Exemples
Exemple 1 - Génération, production et purification de variants d’ADN polymérase de la famille polX selon l’invention Génération des souches productrices
Le gène tronqué de la TdT de souris a été généré à partir du plasmide pET28b dont la construction est décrite dans [Boulé et al., 1998, Mol. Biotechnol., 10, 199-208]. La séquence correspondante SEQ ID N°3 (correspondant à SEQ ID N°1 tronquée des 120 premiers acides aminés) a été amplifiée en utilisant les amorces suivantes: ♦ T7-pro: TAATACGACTCACTATAGGG (SEQ ID N°7) ❖ T7-ter: GCTAGTTATTGCTCAGCGG (SEQ ID N°8) selon des techniques d’amplification PCR et de biologie moléculaire usuelles. Elle a été clonée dans un plasmide pET32 pour donner le vecteur pET32- SEQ ID N°3.
Le plasmide pET32- SEQ ID N°3 a d’abord été séquencé puis transformé dans les souches E. coli commerciales BL21 (DE3) (Novagen). Les colonies capables de pousser sur boites kanamycine/chloramphénicol ont été isolées et notées Ec- SEQ ID N°3 Génération des variants
Le vecteur pET32- SEQ ID N°3 a été utilisé comme vecteur de départ. Des amorces comportant la mutation ponctuelle (ou dans certains cas les mutations ponctuelles si celles-ci sont suffisamment proches) ont été générés à partir de l’outil en ligne d’Agilent : (http://www.genomies.agilent.conn/primerDesign Program.ispl
Le kit QuickChange II (Agilent) a été utilisé pour générer les plasmides des variants comportant la/les mutation(s) désirée(s). Le protocole de mutagénèse donner par le fabriquant a été respecté scrupuleusement afin d’obtenir un plasmide pET32-DSi (i est le numéro du variant considéré donné par le tableau 1). A la fin de la procédure, le plasmide pET32-DSx a été d’abord séquencé puis transformé dans les souches E. coli commerciales BL21 (DE3) (Novagen). Les colonies capables de pousser sur boites kanamycine/chloramphénicol ont été isolées et notées Ec-DSx.
Production
Les cellules Ec- SEQ ID N°3 et Ec-DSx ont été mises en préculture dans un erlen de 250 mL contenant 50 mL de milieu LB auquel ont été ajoutées des quantités appropriées de kanamycine et chloramphénicol. La culture a été incubée à 37°C sous agitation durant toute une nuit. La préculture a ensuite été utilisée pour ensemencer un erlen de 5 L contenant 2 L de milieu LB additionné des quantités appropriées de kanamycine et chloramphénicol. La densité optique (DO) de départ était de 0,01. La culture a été incubée à 37°C sous agitation. La DO a été régulièrement mesurée jusqu’à atteindre une valeur comprise entre 0,6 et 0,9. Une fois cette valeur atteinte, 1 mL d’isopropyl β-D-l-thiogalactopyranoside 1 M a été ajouté au milieu de culture. La culture a été de nouveau incubée à 37°C jusqu’au lendemain. Les cellules ont alors été récoltées par centrifugation sans excéder les 5 000 rpm. Les différents culots obtenus ont été rassemblés dans un culot unique au cours de lavage avec du tampon de lyse (20 mM Tris-HC1, pH 8.3,0.5 M NaCI). Le culot de cellules a été congelé à -20°C. Π peut être conservé ainsi durant plusieurs mois.
Extraction
Le culot de cellule congelé lors de l’étape précédente a été décongelé dans un bain-marie porté entre 25 et 37°C. Une fois entièrement décongelé il a été re-suspendu dans environ 100 mL de tampon de lyse. Une attention particulière a été portée à la re-suspension qui doit aboutir à une solution très homogène et notamment à l’absence totale d'agrégats. Ainsi re-suspendue, les cellules ont été lysées à l’aide d’une presse de French sous une pression de 14 000 psi. Le lysat recueillit a été centrifugé à haute vitesse, 10 000 g durant lh à lh30. Le centrifugat a été filtré sur filtre 0,2 μΜ et recueilli dans un tube de volume suffisant.
Purification
La TdT a été purifiée sur colonne d’affinité. Des colonnes 5 mL His-Trap Crude (GE Life Sciences) ont été utilisées avec des pompes péristaltiques (Peristaltic Pump - MINIPULS® Evolution, Gilson). Dans un premier temps la colonne a été équilibrée à l’aide de 2 à 3 CV (volume de colonne) de tampon de lyse. Le centrifugat de l’étape précédente a alors été chargé sur la colonne à une vitesse comprise entre 0,5 et 5 mL/min environ. Une fois la totalité de centrifugat chargée, la colonne a été lavée à l’aide de 3 CV de tampon de lyse puis 3 CV de tampon de lavage (20 mM Tris-HCl, pH 8.3, 0.5 M NaCI, 60 mM imidazol). A la fin de cette étape le tampon d’élution (20 mM Tris-HCl, pH 8.3, 0.5 M NaCI, 1 M imidazol) a été injecté dans la colonne à environ 0,5 à 1 ml/min pour un volume total de 3 CV. Durant toute la phase d’élution la sortie de colonne a été collectée par fractions de 1 mL. Ces fractions ont été analysées par SDS-PAGE afin de déterminer quelles sont les fractions contenant le pic d’élution. Une fois déterminées, celles-ci ont été rassemblées dans une fraction unique et dialysée contre du tampon de dialyse (20 mM Tris-HCl, pH 6.8, 200 mM NaCI, 50 mM MgOAc, 100 mM [NH4]2S04. La TdT a alors été concentrée (Filtres à centrifuger Amicon Ultra-30, Merk Millipore) jusqu’à une concentration finale de 5 à 15 mg/mL. La TdT concentrée a été congelée à -20°C pour le stockage à long terme après addition de 50% glycérol. Durant l’intégralité de la phase de purification, des aliquotes des différents échantillons ont été prélevés (environ 5 pL) pour une analyse en gel SDS-PAGE dont les résultats sont présentés par la figure 1.
Exemple 2 - Alignement de séquences entre différentes polymérases de la famille des Pol X susceptibles d’être utilisées pour la création de variants selon l’invention
Différentes ADN polymérases de la famille des Pol X ont été alignées en utilisant le logiciel d’alignement en ligne Mutalin (http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html, accédé le 04/04/2016).
Tableau 2 : Séquences alignées
Les alignements obtenus sont présentés à la figure 2.
Exemple 3 - Etude d’activité des variants en présence de substrats non naturels L’activité de différents variants selon l’invention a été déterminée par l’essai suivant. Les résultats ont été comparés à ceux obtenus avec l’enzyme naturelle dont chacun des variants est issu.
Test d’activité
Tableau 3 : Mélange réactionnel
L’amorce utilisée, de séquence 5’-AAAAAAAAAAGGGG-3’ (SEQ ID N°14), a été préalablement marquée radioactivement en 5’ au moyen d’un protocole standard de marquage impliquant l’enzyme PNK (NEB) et l’usage d’ATP radioactif (PerkinElmer).
Le tampon lOx constitué de 250 mM Tris-HCl pH 7,2, 80 mM MgCh, 3,3 mM ZnS04 a été utilisé.
Les nucléotides modifiés utilisés sont des 3'-0-amino-2',3'-dideoxynucléotides-5'-triphosphate (ONH2, Firebird Biosciences) ou des 3'-biot-EDA-2',3'-dideoxynucléotides-5'-triphosphate (Biot-EDA, Jena Biosciences), tels que 3'-0-amino-2',3'-dideoxyadenosine-5'-triphosphate ou 3'-biot-EDA-2',3'-dideoxyadenosine-5'-triphosphate par exemple. Le groupement 3’-0-amino est un groupement plus volumineux fixé sur l’extrémité 3’-OH. Le groupement 3’-biot-EDA est un groupement extrêmement volumineux et non flexible fixé sur l'extrémité 3’-OH.
Les performances d’incorporation d’un nucléotide modifié données par les variants listés dans le table 1, par rapport à la TdT naturelle (SEQ ID N°3) ont été évaluées en réalisant des tests d’activité simultanés, pour lesquels seuls l’enzyme varie.
Les réactifs ont été ajoutés dans l’ordre donné dans le tableau 3 ci-dessus puis incubés à 37°C pendant 90min. La réaction a alors été stoppée par l’ajout de bleu formamide (formamide 100%, 1 à 5 mg de bleu de bromophénol; Simga)
Gel et radiograyhie
Un gel dénaturant de polyacrylamide 16% (Biorad) a été utilisé pour l’analyse du test d’activité précédent. Le gel a été préalablement coulé et laissé à polymériser. Il a ensuite été monté sur une cuve à électrophorèse de dimensions appropriées remplie de tampon TBE (Sigma). Les différents échantillons ont été directement chargés sur le gel sans pré-traitement.
Le gel a alors été soumis à une différence de potentiel de 500 à 2 000 V durant 3 à 6 heures. Une fois la migration satisfaisante, le gel a été désincarné puis transféré dans une cassette d’incubation. Un écran phosphore (Amersham) a été utilisé pendant 10 à 60 min pour la révélation effectuée à l’aide d’un instrument Typhoon (GE Life Sciences) préalablement paramétré avec un mode de détection adéquat. Résultats
Les résultats comparatifs des deux enzymes utilisées sont présentés par la figure 3.
Plus précisément, sur le premier gel (Incorporation ONH2), la TdT naturelle (colonne wt) est incapable d'incorporer les nucléotides modifiés 3'-0-amino-2',3'-dideoxyadenosine-5'-triphosphate comme le montre la comparaison avec le contrôle négatif (colonne No).
Parmi les différents variants, 3 groupes différents peuvent être observés :
Un premier groupe de variants (colonnes DS7 à DS34) est capables d'une incorporation à 50% environ.
Un second groupe de variants (colonnes DS46 à DS73) est capables d'une incorporation à plus de 95%, parfois plus de 98%.
Un troisième groupe de variants (colonnes DS83 à DS 106) est capable d’une incorporation entre 60 et 80%.
Sur le second gel (Incorporation Biot-EDA), la TdT naturelle (colonne wt) est également incapable d'incorporer les nucléotides modifiés 3'-biot-EDA-2',3'-dideoxyadenosine-5'-triphosphate comme le montre la comparaison avec le contrôle négatif (colonne No).
Parmi les différents variants, 3 groupes différents peuvent être observés :
Un premier groupe de variants (colonnes DS7 à DS34) est capable d'une incorporation entre 5 et 10% environ.
Un second groupe de variants (colonnes DS46 à DS73) est capable d'une incorporation à plus de 30%, parfois plus de 40%.
Un troisième groupe de variants (colonnes DS83 à DS 106) est capable d'une incorporation entre 10 et 25%.
Ces résultats confirment que les variants de TdT selon l’invention sont tous capables d'utiliser comme substrat des nucléotides modifiés, notamment en 3'-OH, contrairement à l'enzyme sauvage. De manière particulièrement avantageuse, certains variants présentent des taux d'incorporation très élevés et cela même en présence de nucléotides portant des modifications tendant à augmenter de manière très importante l’encombrement stérique dudit nucléotide.

Claims (22)

  1. REVENDICATIONS
    1. Variant d’une ADN polymérase de la famille polX capable de synthétiser une molécule d’acide nucléique sans brin matrice, ou d’un fragment fonctionnel d’une telle polymérase, ledit variant comprenant au moins une mutation d’un résidu à au moins une position sélectionnée dans le groupe consistant en M330, T331, G332, G333, F334, K338, H342, D343, V344, D345, F346, A397, D399, D434, V436, A446, L447, L448, G449, W450, G452, Q455, F456, E457, R458, R461, N474, E491, D501, Y502, B03, P505, R508, N509 et A510, ou un résidu fonctionnellement équivalent, les positions indiquées étant déterminées par alignement avec SEQ ID N°l.
  2. 2. Variant d’une ADN polymérase de la famille polX selon la revendication 1, ledit variant étant capable de synthétiser un brin d’ADN et/ou un brin d’ARN.
  3. 3. Variant d’une ADN polymérase de la famille polX selon la revendication 1 ou 2, ledit variant étant un variant de Pol IV, Pol μ, ou de la désoxyribonucléotidyl-transférase terminale (TdT).
  4. 4. Variant d’une ADN polymérase de la famille polX selon l’une des revendications précédentes, et présentant au moins 60% d’identité avec la séquence selon SEQ ID N°l, préférentiellement au moins 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% d’identité avec la séquence selon SEQ ID N°l.
  5. 5. Variant d’une ADN polymérase de la famille polX selon l’une des revendications précédentes, dans lequel au moins une mutation consiste en une substitution, une délétion ou une addition d’un ou plusieurs résidus d’acide aminé.
  6. 6. Variant d’une ADN polymérase de la famille polX selon l’une des revendications précédentes, ledit variant comprenant au moins une mutation d’un résidu à au moins une position sélectionnée dans le groupe consistant en T331, G332, G333, F334, D343, L447, L448, G449, W450, G452, Q455, E457, R461 et R508, ou un résidu fonctionnellement équivalent, les positions indiquées étant déterminées par alignement avec SEQ ID N°l.
  7. 7. Variant d’une ADN polymérase de la famille polX selon l’une des revendications précédentes, ledit variant présentant au moins une mutation d’un résidu dans au moins une région semi-conservée de séquence (i) X1X2GGFR1R2GKX3X4 (SEQ ID N°4), dans laquelle Xi représente un résidu choisi parmi Μ, I, V, L X2 représente un résidu choisi parmi T, A, M, Q X3 représente un résidu choisi parmi Μ, K, E, Q, L, S, P, R, D X4 représente un résidu choisi parmi T, I, M, F, K, V, Y, E, Q, H, S, R, D (ii) X1X2LGX3X4GSR1X5X6ER2 (SEQ ID N°5) dans laquelle Xi représente un résidu choisi parmi A, C, G, S X2 représente un résidu choisi parmi L, T, R X3 représente un résidu choisi parmi W, Y X4représente un résidu choisi parmi T, S, I X5 représente un résidu choisi parmi Q, L, H, F, Y, N, E, D ou 0 Xô représente un résidu choisi parmi F, Y (iii) LX1YX2X3PX4X5RNA (SEQ ID N°6) Xi représente un résidu choisi parmi D, E, S, P, A, K X2 représente un résidu choisi parmi I, L, Μ, V, A, T X3 représente un résidu choisi parmi E, Q, P, Y, L, K, G, N X4 représente un résidu choisi parmi W, S, V, E, R, Q, T, C, K, H X5 représente un résidu choisi parmi E, Q, D, H, L.
  8. 8. Variant d’une ADN polymérase de la famille polX selon la revendication 7, ledit variant présentant au moins une substitution d’un résidu à au moins une position Ri, R2 et/ou K de la région semi-conservée de séquence SEQ ID N°4 ; et/ou au moins une substitution d’un résidu à au moins une position S, RI et/ou E de la région semi-conservée de séquence SEQ ID N°5 ; et/ou une délétion du résidu à la position XI et/ou au moins une substitution au niveau des positions R et/ou N de la région semi-conservée de séquence SEQ ID N°6.
  9. 9. Variant d’une ADN polymérase de la famille polX selon l’une des revendications précédentes, ledit variant comprenant une substitution d’un résidu à au moins une position sélectionnée dans le groupe consistant en K338, H342, A397, S453, E457, R461, N474, D501, Y502,1503, R508 et N509, ou un résidu fonctionnellement équivalent, préférentiellement une substitution d’un résidu à au moins une position sélectionnée dans le groupe consistant en A397, E457, R461, N474, D501, Y502 et 1503, ou un résidu fonctionnellement équivalent, les positions indiquées étant déterminées par alignement avec SEQ ID N°l.
  10. 10. Variant d’une ADN polymérase de la famille polX selon la revendication 9, dans lequel les substitutions sur les positions K338, H342, A397, S453, E457, R461, N474, D501, Y502,1503, R508 et N509 sont sélectionnées parmi le groupe consistant en K338A/C/G/S/T/N, H342A/C/G/S/T.N, A397R/H/K/D/E, S453A/C/G/S/T, E457G/N/S/T, N474S/T/N/Q, D501A/G/X, Y502A/G/X, I503A/G/X, R508A/C/G/S/T, N509A/C/G/S/T..
  11. 11. Variant d’une ADN polymérase de la famille polX selon l’une des revendications précédentes dans laquelle le variant comprend ou présente une substitution, délétion, combinaisons de substitutions et/ou de délétions listées dans le tableau 1, les positions indiquées étant déterminées par alignement avec SEQ ID N°l.
  12. 12. Variant d’une ADN polymérase de la famille polX selon l’une des revendications précédentes, ledit variant étant un variant de la TdT de séquence SEQ ID N° 1 et comprenant en outre une substitution des résidus compris entre les positions C378 à L406, ou les résidus fonctionnellement équivalents par les résidus H363 à C390 de la polymérase Ροΐμ de séquence SEQ ID N°2, ou les résidus fonctionnellement équivalents.
  13. 13. Acide nucléique codant un variant d’une ADN polymérase de la famille polX selon l’une des revendications 1 à 12.
  14. 14. Cassette d’expression d’un acide nucléique selon la revendication 13.
  15. 15. Vecteur comprenant un acide nucléique selon la revendication 13 ou une cassette d’expression selon la revendication 14.
  16. 16. Cellule hôte comprenant un acide nucléique selon la revendication 13 ou une cassette d’expression selon la revendication 14 ou un vecteur selon la revendication 15.
  17. 17. Utilisation d’un acide nucléique selon la revendication 13, d’une cassette d’expression selon la revendication 14, d’un vecteur selon la revendication 15 ou d’une cellule selon la revendication 16, pour produire un variant d’une ADN polymérase de la famille polX selon l’une quelconque des revendications 1-12.
  18. 18. Procédé de production d’un variant d’une ADN polymérase de la famille polX selon l’une quelconque des revendications 1-12, selon lequel on cultive une cellule hôte selon la revendication 16 dans des conditions de culture permettant l’expression de l’acide nucléique codant ledit variant, et optionnellement on récupère ledit variant ainsi exprimé à partir du milieu de culture ou desdites cellules hôtes.
  19. 19. Utilisation d’un variant d’une ADN polymérase de la famille polX selon l’une quelconque des revendications 1-12, pour synthétiser une molécule d’acide nucléique sans brin matrice, à partir de nucléotides modifiés en 3’-OH.
  20. 20. Utilisation selon la revendication 19, pour synthétiser un brin d’ADN ou un brin d’ARN.
  21. 21. Procédé de synthèse enzymatique d’une molécule d’acide nucléique sans brin matrice, selon lequel on met en contact un brin amorce avec au moins un nucléotide, préférentiellement un nucléotide modifié en 3’-OH, en présence d’un variant d’une ADN polymérase de la famille polX selon l’une quelconque des revendications 1-12.
  22. 22. Kit pour la synthèse enzymatique d’une molécule d’acide nucléique sans brin matrice comprenant au moins un variant d’une ADN polymérase de la famille polX selon l’une quelconque des revendications 1-12, des nucléotides, préférentiellement des nucléotides modifiés en 3’-OH, et optionnellement au moins une amorce nucléotidique.
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