FR3033172A1 - - Google Patents

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Nadia Kadi
Mihai Luchian Azoitei
Yih-En A Ban
Daniela Grabs-Rothlisberger
Alexander Pisarchik
Alexandre Zanghellini
Eric Althoff
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Abstract

La présente description fournit de nouveaux polypeptides présentant une activité de 3-butèn-2-ol déshydratase, des polypeptides présentant une activité catalytique dans la conversion du 3-méthyl-3-butèn-2-ol en isoprène, et des données de structure cristalline pour l'un de ces polypeptides. Des procédés de fabrication et d'utilisation des polypeptides et de leurs données de structure cristalline apparentées sont également fournis.

Description

POLYPEPTIDES MUTANTS ET LEURS UTILISATIONS REFERENCE CROISEE A DES DEMANDES APPARENTEES [1] La présente demande revendique le bénéfice de la demande U.S. provisoire n° 62/126 279, déposée le 27 février 2015, dont le contenu est ici incorporée par référence dans son intégralité. LISTE DE SÉQUENCES [2] La présente demande contient une liste de séquences qui a été déposée par voie électronique sous format ASCII et est ici incorporée par référence dans son intégralité. Ladite copie ASCII, créée le 15 juillet 2015, est nommée 12444.0235-00 SL.txt et sa taille est de 1 439 337 bytes. DOMAINE [3] La présente description fournit de nouveaux polypeptides présentant une activité catalytique dans la conversion du 3-butèn-2-ol en butadiène, des polypeptides ayant une activité catalytique dans la conversion du 3-méthy1-3- butèn-2-ol en isoprène, et des données de structure cristalline pour l'un de ces polypeptides. Des procédés de production et d'utilisation des polypeptides et de leurs données de structure cristalline apparentées sont également fournis. ARRIERE-PLAN [004] Le 1,3-butadiène (désigné ci-après butadiène) est un important monomère pour la production de caoutchoucs synthétiques comprenant le caoutchouc styrène-butadiène (SBR), le polybutadiène (PB), le latex styrène-butadiène (SBL), les résines d'acrylonitrile-butadiène-styrène (ABS), le caoutchouc à base de nitrile, et l'adiponitrile, qui est utilisé dans la fabrication du Nylon-66 (White, Chemico-Biological Interactions, 2007, 166, 10-14). Le butadiène est habituellement produit en tant que co-produit du processus de vapocraquage, distillé en un flux de butadiène brut et purifié par distillation extractive (White, Chemico-Biological Interactions, 2007, 166, 10-14). A l'échelle industrielle, 95 % de la production mondiale de butadiène s'effectuent via le processus de vapocraquage utilisant des matières premières d'origine pétrochimique telles que le naphta. Le butadiène a également été préparé, entre autres procédés, par la 1 déshydrogénation de n-butane et de n-butène (processus Houdry) et la déshydrogénation oxydative du n-butène (processus 0x0-D ou 0-X-D) (White, Chemico-Biological Interactions, 2007, 166, 10-14). Ces procédés sont associés à des coûts de production élevés et de faibles rendements (White, Chemico- Biological Interactions, 2007, 166, 10-14). [005] L'isoprène est un important monomère pour la production d'élastomères spéciaux notamment les fixations/supports de moteur, les gants chirurgicaux, les rubans élastiques, les balles de golf et les chaussures. Les copolymères en bloc styrène-isoprène forment un composant essentiel des formulations adhésives sensibles à la pression fondues à chaud et le cis-poly-isoprène est utilisé dans la fabrication des pneus (Whited et al., Industrial Biotechnology, 2010, 6(3), 152 - 163). Les fabricants d'articles en caoutchouc dépendent soit du caoutchouc naturel importé provenant de de l'hévéa brésilien soit de polymères de caoutchouc synthétiques dérivés du pétrole (Whited et al., 2010, supra). [006] Etant donné la dépendance à l'égard des matières premières pétrochimiques et les étapes catalytiques qui consomment beaucoup d'énergie, la biotechnologie offre une approche alternative à la synthèse du butadiène et de l'isoprène via la biocatalyse. La biocatalyse est l'utilisation de catalyseurs biologiques, tels que des enzymes, pour effectuer des transformations biochimiques de composés organiques. En conséquence, il existe un besoin pour des procédés durables de production de butadiène et d'isoprène, lesdits procédés étant basés sur la biocatalyse (Jang et al, Biotechnology & Bioengineering, 2012, 109(10), 2437 - 2459). Les matières premières d'origine biologique et celles d'origine pétrochimiques sont des matériaux de départ acceptables pour les processus de biocatalyse. RÉSUMÉ [007] La présente description fournit de nouveaux polypeptides recombinants qui peuvent catalyser la déshydratation du 3-butèn-2-ol en 1,3-butadiène et celle du 3-méthy1-3-butèn-2-ol en isoprène. Ces nouveaux polypeptides ont de nombreuses applications industrielles dans la biosynthèse des polymères. Pour améliorer leur activité catalytique, l'un de ces polypeptides a été cristallisé et les données de structure cristalline respectives sont présentées ici. Ces données de structure cristalline peuvent être utilisées pour la modélisation de nouvelles 2 enzymes améliorées créées artificiellement, présentant une activité de LDH souhaitée. [8] La linalol déshydratase (EC 4.2.1.127; LDH) est une enzyme bifonctionnelle unique qui catalyse naturellement la déshydratation du linalol en myrcène et l'isomérisation du linalol en géraniol. La LDH peut également catalyser la conversion du 3-méthy1-3-butèn-2-ol en isoprène. Voir le document PCT/US2013/045430, publié sous la référence W0/2013/188546 et la publication de brevet US n°20150037860 incorporés ici par référence dans leur intégralité. L'isoprène peut également être synthétisé par d'autres procédés. Voir les publications de brevets US n°20150037860 et 20130217081, incorporés ici par référence dans leur intégralité. [9] On a découvert que la LDH de Castellaniella defragrans (cdLD) peut également convertir le 3-butèn-2-ol en 1,3-butadiène, bien qu'en faibles rendements. Sont fournis ici de nouveaux polypeptides présentant des propriétés avantageuses dans la synthèse industrielle du 1,3-butadiène, par rapport à celles de la cdLD de type sauvage. Ces polypeptides présentent une activité 3-butèn-2- ol déshydratase supérieure et également, une activité supérieure dans la catalyse de la conversion du 3-méthy1-3-butèn-2-ol en isoprène. [10] La présente description présente également la structure cristalline de l'apo cdLD, mise en évidence par cristallographie aux rayons X. Des cristaux d'apo cdLD purifiés ont été obtenus et la structure tridimensionnelle de cette enzyme a été élucidée pour la première fois et confirmée de façon indépendante. L'élucidation de ces données de structure cristalline permet une meilleure compréhension de l'activité enzymatique de la cdLD et la conception intelligente de nombreuses améliorations de celle-ci, ainsi que le développement de divers substrats et inhibiteurs. [11] Certains modes de réalisation fournissent un polypeptide comprenant une séquence d'acides aminés présentant une homologie de séquence d'acides aminés d'au moins 90% avec SEQ ID NO: 1, dans lequel ladite séquence 30 d'acides aminés comprend au moins une, de préférence, une à cinq mutations aux positions X suivantes de SEQ ID NO: 1 R1_95X96R97-98X99R100-122X123R124-186X187R188-203X204R205-211X212R213- 272X273X274X275R276-323X324R325-327X328R329-R359X360R361-365X366R367- 381X382R383-398, dans laquelle : 3 X98 est muté en un acide aminé différent choisi parmi L et des acides aminés équivalents ; X99 est muté en un acide aminé différent choisi parmi L et des acides aminés équivalents ; X123 est muté en un acide aminé différent choisi parmi I et des acides aminés équivalents ; X187 est muté en un acide aminé différent choisi parmi M et des acides aminés équivalents ; X204 est muté en un acide aminé différent choisi parmi I et des acides aminés équivalents ; X212 est muté en un acide aminé différent choisi parmi F, Y, et des acides aminés équivalents ; X273 est muté en un acide aminé différent choisi parmi C et des acides aminés équivalents ; X274 est muté en un acide aminé différent choisi parmi F et des acides aminés équivalents ; X275 est muté en un acide aminé différent choisi parmi I et des acides aminés équivalents ; X324 est muté en un acide aminé différent choisi parmi L, E, et des acides aminés équivalents ; X328 est muté en un acide aminé différent choisi parmi V et des acides aminés équivalents ; X380 est muté en un acide aminé différent choisi parmi Y et des acides aminés équivalents ; X388 est muté en un acide aminé différent choisi parmi V, C, G, et des acides aminés équivalents ; X382 est muté en un acide aminé différent choisi parmi W et des acides aminés équivalents ; et chaque R est identique à l'acide aminé correspondant dans SEQ ID NO: 1. Dans un autre mode de réalisation, l'homologie avec SEQ ID NO: 1 est d'au moins 91, d'au moins 92, d'au moins 93, d'au moins 94, d'au moins 95, d'au moins 96, d'au moins 97, d'au moins 98 ou d'au moins 99 %. [012] Dans un autre mode de réalisation, le polypeptide du paragraphe précédent est tel que ladite séquence d'acides aminés présente une homologie de séquence d'acides aminés d'au moins 91 % avec SEQ ID NO: 1, de 4 préférence une homologie de séquence d'acides aminés d'au moins 92 % avec SEQ ID NO: 1, de préférence une homologie de séquence d'acides aminés d'au moins 93 % avec SEQ ID NO: 1, de préférence une homologie de séquence d'acides aminés d'au moins d'au moins 94% avec SEQ ID NO: 1, de préférence 5 une homologie de séquence d'acides aminés d'au moins 95 % avec SEQ ID N°; de préférence une homologie de séquence d'acides aminés d'au moins 96 % avec SEQ ID NO: 1, de préférence une homologie de séquence d'acides aminés d'au moins 97 % avec SEQ ID NO: 1, de préférence une homologie de séquence d'acides aminés d'au moins 98% avec SEQ ID NO: 1, ou de préférence une 10 homologie de séquence d'acides aminés d'au moins 99 % avec SEQ ID NO: 1. [013] Un autre mode de réalisation fournit le polypeptide selon les deux paragraphes précédents, dans lequel ladite séquence d'acides aminés comprend l'une des mutations spécifiées à l'une des positions suivantes spécifiées de SEQ ID NO: 1 15 Ri _95X98R97-98X99R100-122X123R124-186X187R188-203X2O4R205-211X212R213- 272X273X274X275 R276-323X324R325-327X328R329-R359X360R361-365X366R367- 381X382R383-398, dans laquelle : X98 est muté en un acide aminé différent choisi parmi L et des acides aminés équivalents - 20 X99 est muté en un acide aminé différent choisi parmi L et des acides aminés équivalents X123 est muté en un acide aminé différent choisi parmi I et des acides aminés équivalents X187 est muté en un acide aminé différent choisi parmi M et des acides 25 aminés équivalents X204 est muté en un acide aminé différent choisi parmi I et des acides aminés équivalents X212 est muté en un acide aminé différent choisi parmi F, Y, et des acides aminés équivalents 30 X273 est muté en un acide aminé différent choisi parmi C et des acides aminés équivalents X274 est muté en un acide aminé différent choisi parmi F et des acides aminés équivalents5 X275 est muté en un acide aminé différent choisi parmi I et des acides aminés équivalents ; X324 est muté en un acide aminé différent choisi parmi L, E, et des acides aminés équivalents ; X328 est muté en un acide aminé différent choisi parmi V et des acides aminés équivalents ; X360 est muté en un acide aminé différent choisi parmi Y et des acides aminés équivalents ; X366 est muté en un acide aminé différent choisi parmi V, C, G, et des acides aminés équivalents ; X382 est muté en un acide aminé différent choisi parmi W et des acides aminés équivalents ; et chaque R est identique à l'acide aminé correspondant dans SEQ ID NO: 1 Ces positions énumérées sont désignées ci-après comme les positions spécifiées et ces mutations énumérées sont désignées ci-après comme les mutations spécifiées. [014] Dans un autre mode de réalisation, le polypeptide selon les paragraphes précédents de ce RÉSUMÉ est tel que ladite séquence d'acides aminés comprend deux des mutations spécifiées à deux des positions spécifiées. [015] Dans un autre mode de réalisation, le polypeptide selon les paragraphes précédents de ce RÉSUMÉ est tel que ladite séquence d'acides aminés comprend trois des mutations spécifiées à trois des positions spécifiées. [16] Dans un autre mode de réalisation, le polypeptide selon les paragraphes précédents de ce RÉSUMÉ est tel que ladite séquence d'acides aminés comprend quatre des mutations spécifiées à quatre des positions spécifiées. [17] Dans un autre mode de réalisation, le polypeptide selon les paragraphes précédents de ce RÉSUMÉ est tel que ladite séquence d'acides aminés comprend cinq des mutations spécifiées à cinq des positions spécifiées. [18] Dans un autre mode de réalisation, le polypeptide selon les paragraphes 30 précédents de ce RÉSUMÉ est tel que X96 est muté en un acide aminé différent choisi parmi L et des acides aminés équivalents. [19] Dans un autre mode de réalisation, le polypeptide selon les paragraphes précédents de ce RÉSUMÉ est tel que X99 est muté en un acide aminé différent choisi parmi L et des acides aminés équivalents. 6 3033 172 [20] Dans un autre mode de réalisation, le polypeptide selon les paragraphes précédents de ce RÉSUMÉ est tel que X123 est muté en un acide aminé différent choisi parmi I et des acides aminés équivalents. [21] Dans un autre mode de réalisation, le polypeptide selon les paragraphes 5 précédents de ce RÉSUMÉ est tel que X187 est muté en un acide aminé différent choisi parmi M et des acides aminés équivalents. [22] Dans un autre mode de réalisation, le polypeptide selon les paragraphes précédents de ce RÉSUMÉ est tel que X204 est muté en un acide aminé différent choisi parmi I et des acides aminés équivalents. 10 [023] Dans un autre mode de réalisation, le polypeptide selon les paragraphes précédents de ce RÉSUMÉ est tel que X212 est muté en un acide aminé différent choisi parmi F, Y, et des acides aminés équivalents. [24] Dans un autre mode de réalisation, le polypeptide selon les paragraphes précédents de ce RÉSUMÉ est tel que X273 est muté en un acide aminé différent 15 choisi parmi Cet des acides aminés équivalents. [25] Dans un autre mode de réalisation, le polypeptide selon les paragraphes précédents de ce RÉSUMÉ est tel que X274 est muté en un acide aminé différent choisi parmi F et des acides aminés équivalents. [26] Dans un autre mode de réalisation, le polypeptide selon les paragraphes 20 précédents de ce RÉSUMÉ est tel que X275 est muté en un acide aminé différent choisi parmi I et des acides aminés équivalents. [27] Dans un autre mode de réalisation, le polypeptide selon les paragraphes précédents de ce RÉSUMÉ est tel que X324 est muté en un acide aminé différent choisi parmi L, E, et des acides aminés équivalents. 25 [028] Dans un autre mode de réalisation, le polypeptide selon les paragraphes précédents de ce RÉSUMÉ est tel que X328 est muté en un acide aminé différent choisi parmi V et des acides aminés équivalents. [29] Dans un autre mode de réalisation, le polypeptide selon les paragraphes précédents de ce RÉSUMÉ est tel que X360 est muté en un acide aminé différent choisi parmi Y et des acides aminés équivalents. [30] Dans un autre mode de réalisation, le polypeptide selon les paragraphes précédents de ce RÉSUMÉ est tel que X366 est muté en un acide aminé différent choisi parmi V, C, G, et des acides aminés équivalents. 7 [31] Dans un autre mode de réalisation, le polypeptide selon les paragraphes précédents de ce RÉSUMÉ est tel que X382 est muté en un acide aminé différent choisi parmi W et des acides aminés équivalents. [32] Dans un autre mode de réalisation, le polypeptide selon les paragraphes précédents de ce RÉSUMÉ est tel qu'il comprend les quatre mutations suivantes : V1231, V2041, M274F et V2751 ; de préférence, il comprend uniquement ces quatre mutations. [33] Dans un autre mode de réalisation, le polypeptide selon les paragraphes précédents de ce RÉSUMÉ est tel qu'il comprend les cinq mutations suivantes : 10 V1231, V2041, M274F, V2751 et F382W; de préférence, il comprend uniquement ces cinq mutations. [34] Dans un autre mode de réalisation, le polypeptide selon les paragraphes précédents de ce RÉSUMÉ est tel qu'il comprend les deux mutations suivantes : V2751 et F382W ; de préférence, il comprend uniquement ces deux mutations. 15 [035] Dans un autre mode de réalisation, le polypeptide selon les paragraphes précédents de ce RÉSUMÉ est tel qu'il comprend les quatre mutations suivantes : A324L, V2751, V1231 et V2041 ; de préférence, il comprend uniquement ces quatre mutations. [36] Dans un autre mode de réalisation, le polypeptide selon les paragraphes 20 précédents de ce RÉSUMÉ est tel qu'il comprend les deux mutations suivantes : A324L et S366G ; de préférence, il comprend uniquement ces deux mutations. [37] Dans un autre mode de réalisation, le polypeptide selon les paragraphes précédents de ce RÉSUMÉ est tel qu'il comprend les deux mutations suivantes : M274F et F96L ; de préférence, il comprend uniquement ces deux mutations. 25 [038] Dans un autre mode de réalisation, le polypeptide selon les paragraphes précédents de ce RÉSUMÉ est tel qu'il comprend les deux mutations suivantes : M274F et Y99L ; de préférence, il comprend uniquement ces deux mutations. [39] Dans un autre mode de réalisation, le polypeptide selon les paragraphes précédents de ce RÉSUMÉ est tel qu'il comprend les deux mutations suivantes : 30 F382W et L212Y ; de préférence, il comprend uniquement ces deux mutations. [40] Dans un autre mode de réalisation, le polypeptide selon les paragraphes précédents de ce RÉSUMÉ est tel qu'il comprend les deux mutations suivantes : F382W et A273C. 8 [41] Dans un autre mode de réalisation, le polypeptide selon les paragraphes précédents de ce RÉSUMÉ est tel qu'il comprend les deux mutations suivantes : F382W et L328V ; de préférence, il comprend uniquement ces deux mutations. [42] Dans un autre mode de réalisation, le polypeptide selon les paragraphes 5 précédents de ce RÉSUMÉ est tel qu'il comprend les deux mutations suivantes : F382W, L328V et 1187M; de préférence, il comprend uniquement ces trois mutations. [43] Dans un autre mode de réalisation, le polypeptide selon les paragraphes précédents de ce RÉSUMÉ est tel qu'il comprend les trois mutations suivantes : 10 V2041, M274F et V275I ; de préférence, il comprend uniquement ces trois mutations. [44] Dans un autre mode de réalisation, le polypeptide selon les paragraphes précédents de ce RÉSUMÉ est tel qu'il comprend les trois mutations suivantes : V1231, M274F et V275I ; de préférence, il comprend uniquement ces trois 15 mutations. [45] Dans un autre mode de réalisation, le polypeptide selon les paragraphes précédents de ce RÉSUMÉ est tel qu'il comprend les trois mutations suivantes : V1231, V2041 et V275I ; de préférence, il comprend uniquement ces trois mutations. 20 [046] Dans un autre mode de réalisation, le polypeptide selon les paragraphes précédents de ce RÉSUMÉ est tel qu'il comprend les trois mutations suivantes : V1231, V2041 et M274F; de préférence, il comprend uniquement ces trois mutations. [47] Dans un autre mode de réalisation, le polypeptide selon les paragraphes 25 précédents de ce RÉSUMÉ est tel qu'il comprend les trois mutations suivantes : M274F, V275I et A324L ; de préférence, il comprend uniquement ces trois mutations. [48] Dans un autre mode de réalisation, le polypeptide selon les paragraphes précédents de ce RÉSUMÉ est tel qu'il comprend les trois mutations suivantes : 30 M274F, V275I et F382W ; de préférence, il comprend uniquement ces trois mutations. [49] Dans un autre mode de réalisation, le polypeptide selon les paragraphes précédents de ce RÉSUMÉ est tel qu'il comprend les quatre mutations suivantes : M274F, V275I, R360Y et F382W. 9 [50] Dans un autre mode de réalisation, le polypeptide selon les paragraphes précédents de ce RÉSUMÉ est tel qu'il comprend les deux mutations suivantes : V275I et A324L ; de préférence, il comprend uniquement ces deux mutations. [51] Dans un autre mode de réalisation, le polypeptide selon les paragraphes 5 précédents de ce RÉSUMÉ est tel qu'il comprend les deux mutations suivantes : R360Y et F382W ; de préférence, il comprend uniquement ces deux mutations. [52] Dans un autre mode de réalisation, le polypeptide selon les paragraphes précédents de ce RÉSUMÉ est tel qu'il comprend une étiquette His (His-tag) C-terminale. 10 [053] Dans un autre mode de réalisation, le polypeptide selon les paragraphes précédents de ce RÉSUMÉ est tel qu'il est dépourvu d'une étiquette périplasmique. [054] Dans un autre mode de réalisation, le polypeptide selon les paragraphes précédents de ce RÉSUMÉ est tel que le polypeptide a une activité dans la 15 catalyse de la déshydratation du 3-butèn-2-ol en 1,3-butadiène et/ou dans la catalyse de la déshydratation du 3-méthy1-3-butèn-2-ol en isoprène qui est d'au moins 80 % de celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8, augmentée d'un facteur 1,5 environ ou supérieur par rapport à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8, de préférence d'un facteur 2 20 environ ou supérieur par rapport à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8, de préférence d'un facteur 2,5 environ ou supérieur par rapport à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8, de préférence d'un facteur 3 environ ou supérieur par rapport à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7, ou 8, de préférence d'un facteur 3,5 environ ou supérieur 25 par rapport à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8, de préférence d'un facteur 4 environ ou supérieur par rapport à celle d'un polypeptide constitué deSEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8, de préférence d'un facteur 4,5 environ ou supérieur par rapport à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8 ou de préférence d'un facteur 5 environ ou supérieur par rapport à celle d'un 30 polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8, et dans lequel ladite activité est observée dans au moins un essai d'activité. Dans un autre mode de réalisation, ladite activité spécifique est mesurée avec une protéine purifiée et est observée dans au moins un essai d'activité spécifique. Dans un autre mode de réalisation, ladite activité dans la catalyse de la déshydratation du 3-butèn-2-ol en 10 ,3-butadiène et/ou dans la catalyse de la déshydratation du 3-méthy1-3-butèn-2- ol en isoprène est observée dans au moins un type de cellules non bactériennes. Dans un autre mode de réalisation, ladite activité dans la catalyse de la déshydratation du 3-butèn-2-ol en 1,3-butadiène et/ou dans la catalyse de la déshydratation du 3-méthy1-3-butèn-2-ol en isoprène est observée dans au moins un type de bactérie. Dans un autre mode de réalisation, ladite activité dans la catalyse de la déshydratation du 3-butèn-2-ol en 1,3-butadiène et/ou dans la catalyse de la déshydratation du 3-méthy1-3-butèn-2-ol en isoprène est observée dans plus d'un type de bactérie. Dans un autre mode de réalisation, les bactéries sont une souche d'E. Coll. Dans un autre mode de réalisation, les bactéries sont Origami2(DE3) ou BL21 (DE3). [055] Des modes de réalisation pour un dérivé de l'un quelconque des polypeptides selon les paragraphes précédents de ce RÉSUMÉ sont également fournis. [056] Des modes de réalisation pour un polynucléotide comprenant, constitué de ou constitué essentiellement d'un acide nucléique codant pour l'un quelconque des polypeptides ou dérivés selon les paragraphes précédents de ce RÉSUMÉ, de préférenceavec une optimisation des codons, sont également fournis. Dans un autre mode de réalisation, le polynucléotide est une molécule d'ADN ou une molécule d'ARN. Dans un autre mode de réalisation, the polynucléotide comprend en outre un promoteur lié fonctionnellement à la séquence d'acide nucléique codant pour le polypeptide ou dérivé. [57] Des modes de réalisation pour un vecteur d'expression recombinant comprenant une molécule d'ADN telle que décrite dans l'un quelconque des paragraphes précédents concernant un nucléotide sont également fournis. [58] Des modes de réalisation pour une cellule hôte qui est transformée ou transduite avec une molécule d'ADN telle que décrite dans l'un quelconque des paragraphes précédents concernant un nucléotide ou avec un vecteur d'expression recombinant selon le paragraphe précédent sont également fournis.
Dans un autre mode de réalisation, la cellule est telle que la molécule d'ADN ou le vecteur d'expression recombinant est intégré dans un chromosome de la cellule. [59] Des modes de réalisation pour un organisme, de préférence un microorganisme, comprenant une molécule d'ADN hétérologue codant pour un polypeptide selon l'un quelconque des paragraphes précédents concernant un 11 3033 172 polypeptide du présent RÉSUMÉ sont également fournis. Dans un autre mode de réalisation, le microorganisme est une bactérie ou un champignon. Dans un autre mode de réalisation, le microorganisme est une bactérie E. Coli ou une bactérie Castellaniella defragrans. 5 [060] Des modes de réalisation pour un animal ou une plante transgénique comprenant une molécule d'ADN hétérologue codant pour un polypeptide selon l'un quelconque des paragraphes précédents concernant un polypeptide du présent RÉSUMÉ, sont également fournis. [61] Des modes de réalisation pour un vecteur comprenant une molécule 10 d'ADN selon l'un quelconque des paragraphes précédents concernant une molécule d'ADN du présent RÉSUMÉ sont également fournis. [62] Certains modes de réalisation fournissent un procédé de production d'un polypeptide selon l'un quelconque des paragraphes précédents concernant un polypeptide du présent RÉSUMÉ, le procédé comprenant : 15 (i) la préparation d'une construction d'expression qui comprend un polynucléotide selon l'un quelconque des paragraphes précédents concernant un polynucléotide du présent RÉSUMÉ, avec une séquence codant pour le polypeptide selon l'un quelconque des paragraphes précédents concernant un polypeptide du présent RÉSUMÉ, liée 20 fonctionnellement à une ou plusieurs séquences nucléotidiques régulatrices ; (ii) la transfection ou la transformation d'une cellule hôte appropriée avec la construction d'expression ; (iii) l'expression du polypeptide recombinant dans ladite cellule hôte ; et (iv) l'isolement ou la purification du polypeptide recombinant à partir de ladite cellule hôte ou 25 l'utilisation de la cellule hôte obtenue telle quelle ou sous forme d'extrait cellulaire. [63] Un autre mode de réalisation fournit un procédé de fabrication d'un polypeptide présentant une activité d'au moins 80 % ou une activité améliorée, dans la catalyse de la déshydratation du 3-butèn-2-ol en 1,3-butadiène et/ou dans 30 la catalyse de la déshydratation du 3-méthy1-3-butèn-2-ol en isoprène par rapport à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8, le procédé comprenant la préparation d'un polypeptide selon l'un quelconque des paragraphes concernant un polypeptide du présent RÉSUMÉ. 12 [064] Sont également fournis comme modes de réalisation, des compositions comprenant un ou plusieurs polypeptides selon l'un quelconque des paragraphes précédents du présent RÉSUMÉ. Dans un autre mode de réalisation, la composition comprend de plus le polypeptide de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8. Dans un autre mode de réalisation, l'une quelconque de ces compositions comprend un ou plusieurs, de préférence plus d'un dans certains modes de réalisation, polypeptides selon l'un quelconque des paragraphes du présent RÉSUMÉ concernant un polypeptide, présentant une activité d'au moins 80 % ou une activité accrue, dans la catalyse de la déshydratation du 3-butèn-2-ol en 1,3- butadiène et/ou dans la catalyse de la déshydratation du 3-méthy1-3-butèn-2-ol en isoprène, par rapport à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8. Dans certains de ces modes de réalisation, le polypeptide de référence est dépourvu d'une étiquette périplasmique. Dans certains de ces modes de réalisation, le polypeptide de référence a une étiquette His. Dans certains de ces modes de réalisation, le polypeptide de référence est dépourvu d'une étiquette périplasmique et a une étiquette His. Des modes de réalisation pour ces compositions comprenant en outre le 3-butèn-2-ol et/ou le 3-méthy1-3-butèn-2-ol sont également fournis. Dans d'autres modes de réalisation, ces compositions comprennent en outre du 1,3-butadiène et/ou de l'isoprène. [065] Dans un autre mode de réalisation est également fournie une composition qui comprend un produit à base de caoutchouc, polymérisé à partir de 1,3-butadiène produit en présence d'un polypeptide selon l'un quelconque des paragraphes concernant un polypeptide du présent RÉSUMÉ. Dans un mode de réalisation est également fournie une composition qui comprend (en outre) un produit à base de caoutchouc, polymérisé à partir d'isoprène produit en présence d'un polypeptide selon l'un quelconque des paragraphes concernant un polypeptide du présent RÉSUMÉ. [066] Dans un autre mode de réalisation est également fournie une composition comprenant un copolymère polymérisé à partir de 1,3-butadiène produit en présence d'un polypeptide selon l'un quelconque des paragraphes concernant un polypeptide du présent RÉSUMÉ. Dans un mode de réalisation apparenté est également fournie une composition qui comprend (en outre) un produit de copolymère polymérisé à partir d'isoprène produit en présence d'un polypeptide 13 selon l'un quelconque des paragraphes concernant un polypeptide du présent RÉSUMÉ. [67] Dans un autre mode de réalisation est également fournie une composition comprenant un produit à base de plastique, polymérisé à partir de 1,3-butadiène produit en présence d'un polypeptide selon l'un quelconque des paragraphes concernant un polypeptide du présent RÉSUMÉ. Dans ce mode de réalisation est également fournie une composition qui comprend (en outre) un produit à base de plastique, polymérisé à partir d'isoprène produit en présence d'un polypeptide selon l'un quelconque des paragraphes concernant un polypeptide du présent RÉSUMÉ. [68] Dans un autre mode de réalisation est également fourni un anticorps capable de se lier à un polypeptide selon l'un quelconque des paragraphes concernant un polypeptide du présent RÉSUMÉ. [69] Un autre mode de réalisation fournit une protéine de fusion comprenant un polypeptide selon l'un quelconque des paragraphes concernant un polypeptide du présent RÉSUMÉ. [70] Un autre mode de réalisation fournit un complexe comprenant un polypeptide selon l'un quelconque des paragraphes concernant un polypeptide du présent RÉSUMÉ, et ledit complexe comprenant éventuellement en outre du 3- butèn-2-ol. Un autre mode de réalisation fournit un complexe comprenant un polypeptide selon l'un quelconque des paragraphes concernant un polypeptide du présent RÉSUMÉ, ledit complexe comprenant en outre éventuellement du 3- méthy1-3-butèn-2-ol. [71] Un autre mode de réalisation fournit une composition comprenant du 3- butèn-2-ol et un moyen de production de 1,3-butadiène. [72] Un autre mode de réalisation fournit une composition comprenant un substrat et un moyen de production enzymatique de 1,3-butadiène à partir dudit substrat. [73] Un autre mode de réalisation fournit un procédé de production de 1,330 butadiène comprenant : une étape de conversion enzymatique de 3-butèn-2-ol en 1,3-butadiène ; et la mesure et/ou la récolte du 1,3-butadiène ainsi produit. [74] Un autre mode de réalisation fournit un contenant et un moyen de production de 1,3-butadiène. 14 [75] Un autre mode de réalisation fournit un procédé de conception d'un polypeptide présentant au moins 80 % d'activité ou une activité accrue, dans la catalyse de la déshydratation du 3-butèn-2-ol en 1,3-butadiène par rapport à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8, le procédé comprenant la mutation d'un moyen de conversion enzymatique du 3-butèn-2-ol en 1,3- butadiène. [76] Un autre mode de réalisation fournit une composition comprenant du 3- méthy1-3-butèn-2-ol et un moyen de production d'isoprène. [77] Un autre mode de réalisation fournit une composition comprenant un substrat et un moyen de production enzymatique d'isoprène à partir dudit substrat. [78] Un autre mode de réalisation fournit un procédé de production d'isoprène comprenant: une étape de conversion enzymatique de 3-méthy1-3-butèn-2-ol en isoprène; et la mesure et/ou la récolte de l'isoprène ainsi produit. [79] Un autre mode de réalisation fournit un contenant et un moyen de production d'isoprène. [80] Un autre mode de réalisation fournit un procédé de conception d'un polypeptide présentant une activité d'au moins 80 % ou une activité accrue, dans la catalyse de la déshydratation du 3-méthy1-3-butèn-2-ol en isoprène par rapport à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8, le procédé comprenant la mutation d'un moyen de conversion enzymatique du 3-méthy1-3- butèn-2-ol en isoprène. [081] Un autre mode de réalisation fournit un cristal ayant les coordonnées indiquées dans l'Annexe I dans le groupe spatial P2(1) avec les paramètres cellulaires a=133,18 A, b=110,83 A, c=162,20 A, qui est produit à partir d'un polypeptide constitué de la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO: 5 avec jusqu'à 2 % de variation dans une dimension cellulaire quelconque. Dans un autre mode de réalisation, il est prévu que le même cristal soit produit à partir d'un polypeptide constitué de la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO: 8 (SEQ ID NO: 5 sans étiquette His). [082] Un autre mode de réalisation fournit un cristal ayant les coordonnées indiquées dans l'Annexe I dans le groupe spatial P2(1) avec les paramètres 15 3033 172 cellulaires a=133,18 A, b=110,83 A, c=162,20 A, qui est produit à partir d'un polypeptide constitué de la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO: 5. Dans un autre mode de réalisation, il est prévu que le même cristal soit produit à partir d'un polypeptide constitué de la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO: 8 (SEQ ID 5 NO: 5 sans étiquette His). [083] Un autre mode de réalisation fournit un cristal selon les cristaux décrits dans les paragraphes précédents, qui diffracte les rayons X pour la détermination des coordonnées atomiques du cristal à une résolution entre 48,16 A et 2,54 A. [084] Un autre mode de réalisation fournit un cristal selon les cristaux décrits 10 dans le paragraphe précédent, qui comprend un site actif comprenant un ou plusieurs résidus choisis parmi ceux du tableau suivant, marqués selon SEQ ID NO: 1 selon les coordonnées de l'Annexe 1 : Position Type de résidu Chaîne 65 ASP C 66 PHE C 71 TYR C 89 VAL A 91 LYS A 92 TYR A 96 PHE A 151 MET A 155 HIS A 197 CYS A 198 GLU A 203 PHE A 205 GLN A 206 CYS A 209 VAL A 266 TYR A 267 THR A 270 TRP A 319 VAL A 321 LEU A 325 PHE A 367 LEU A 368 LEU A 372 LEU A [085] Un autre mode de réalisation fournit un cristal selon l'un quelconque des cristaux décrits dans les paragraphes précédents, qui comprend un pont disulfure 15 entre les résidus Cys74 et Cys127 d'un polypeptide de SEQ ID NO: 5. Un autre mode de réalisation fournit un cristal selon l'un quelconque des cristaux décrits 16 3033 172 dans les paragraphes précédents, qui comprend un pont disulfure entre les résidus Cys74 et Cys127 d'un polypeptide de SEQ ID NO: 8, dans lequel les numéros des résidus sont en rapport avec SEQ ID NO: 1. [86] Un autre mode de réalisation fournit un co-cristal comprenant le cristal 5 selon l'un quelconque des cristaux décrits dans les paragraphes précédents, lié à un substrat tel que le linalol, le 3-butèn-2-ol ou le 3-méthy1-3-butèn-2-ol. [87] Un autre mode de réalisation fournit un procédé d'identification d'un substrat ou d'un inhibiteur de LDH, comprenant l'une quelconque ou plusieurs des étapes suivantes : (a) obtention d'un cristal ou des coordonnées d'un cristal, d'un 10 polypeptide comprenant SEQ ID NO: 5 ou 8, le cristal étant dans un groupe spatial P2(1), avec des dimensions cellulaires unitaires d'environ a=133,18 A, d'environ b=110,83 A, d'environ c=162,20 A ; (b) l'obtention ou la détermination de la structure tridimensionnelle dudit polypeptide en utilisant le cristal du point (a) par un procédé de diffraction de rayons X ; (c) la présentation de la structure 15 tridimensionnelle dudit complexe sur un ordinateur en entrant lesdites données de structure cristalline dudit polypeptide, l'ordinateur comprenant un logiciel pour générer ladite structure tridimensionnelle et pour identifier un substrat ou un inhibiteur ; et (d) la sélection d'un substrat ou d'un inhibiteur du site actif dudit polypeptide. Dans certains modes de réalisation apparentés, le substrat est choisi 20 parmi le linalol, le 3-butèn-2-ol et le 3-méthy1-3-butèn-2-ol. [88] Une autre mode de réalisation fournit un procédé de conception d'un substrat ou d'un inhibiteur de LDH, le procédé comprenant l'une quelconque ou plusieurs des étapes suivantes : (a) obtention d'un cristal ou des coordonnées d'un cristal, dans un groupe spatial P2(1) avec les paramètres cellulaires 25 a=133,18 A, b=110,83 A, c=162,20 A, d'un complexe constitué d'un polypeptide de SEQ ID NO: 5 ou 8 lié à un substrat ou un inhibiteur sur son site de liaison ; (b) l'obtention ou la détermination de la structure tridimensionnelle du complexe en utilisant le cristal obtenu au point (a) par un procédé de diffraction de rayons X pour obtenir les coordonnées atomiques de la structure ; (c) la fourniture sur un 30 ordinateur des coordonnées atomiques de la structure tridimensionnelle du complexe ; et (d) l'utilisation d'un programme exécuté par l'ordinateur pour concevoir un composé chimique prédit comme se liant au polypeptide de SEQ ID NO: 5 ou 8 au niveau du site de liaison du substrat ou de l'inhibiteur et agissant comme un substrat ou inhibant une LDH, sur la base de ladite structure 17 tridimensionnelle. Dans un mode de réalisation apparenté, la conception comprend la conception rationnelle de novo d'un médicament et/ou la conception informatique d'une protéine. Dans un mode de réalisation apparenté, la conception comprend l'utilisation d'un logiciel de docking et le criblage d'une ou plusieurs bases de données de molécules qui s'adaptent au site de liaison du substrat sur le polypeptide de SEQ ID NO: 5 ou 8. Dans certains modes de réalisation apparentés, le substrat est choisi parmi le linalol, le 3-butèn-2-ol et le 3-méthy1-3-butèn-2-ol. Dans certains modes de réalisation apparentés, la conception rationnelle d'un médicament et/ou la conception informatique d'une protéine est basée sur les interactions entre un ou plusieurs résidus du site actif prédit du polypeptide de SEQ ID NO: 5 ou 8 et le linalol, le 3-buten-2-ol ou le 3- méthy1-3-butèn-2-ol. Dans certains modes de réalisation, un ou plusieurs des résidus suivants (numérotés en relation avec SEQ ID NO: 1) font partie du site actif : Position Type de résidu Chaîne 65 ASP C 66 PHE C 71 TYR C 89 VAL A 91 LYS A 92 TYR A 96 PHE A 151 MET A 155 HIS A 197 CYS A 198 GLU A 203 PHE A 205 GLN A 206 CYS A 209 VAL A 266 TYR A 267 THR A 270 TRP A 319 VAL A 321 LEU A 325 PHE A 367 LEU A 368 LEU A 372 LEU A [089] Un autre mode de réalisation fournit un procédé selon l'un quelconque des procédés décrits dans les précédents procédés associés au cristal, comprenant 18 en outre l'un ou plusieurs de : (e) la synthèse ou l'obtention du composé ; et (f) l'évaluation du composé pour déterminer sa capacité à effectuer une ou plusieurs activités parmi (1) la liaison du polypeptide de SEQ ID NO: 5 ou 8, (2) la compétition avec le linalol, le 3-butèn-2-ol ou le 3-méthy1-3-butèn-2-ol pour la liaison du polypeptide de SEQ ID NO: 5 ou 8, (3) l'inhibition de la LDH, ou (4) la déshydratation par le polypeptide de SEQ ID NO: 5 ou 8. [90] Un autre mode de réalisation fournit un procédé de préparation du cristal du polypeptide de SEQ ID NO: 5 ou 8 selon l'un quelconque des paragraphes précédents, qui comprend : (a) la fourniture d'une solution ayant ledit polypeptide, dans un tampon approprié tel qu'un tampon Tris pH environ 8 à environ 20 mM, NaCI à environ 150 mM, glycérol à environ 5 % ; (b) le mélange de la solution avec une solution de cristallisation comprenant du P8000 à environ 10 °/(:), de l'éthylène glycol à environ 20 °/0, du Na-l-glutamate à environ 0,02 M, de la dl-alanine à environ 0,02M, de la glycine à environ 0,02 M, de la dl-lysine HCI à environ 0,02 M, de la dl-sérine à environ 0,02 M ; et (c) l'incubation du mélange dans des conditions et pendant une durée suffisante pour favoriser la production du cristal du polypeptide de SEQ ID NO: 5 ou 8. [91] Un autre mode de réalisation fournit un procédé de préparation du cocristal selon les paragraphes précédents relatifs au co-cristal du présent RÉSUMÉ, qui comprend les étapes de : (a) fourniture d'une solution ayant ledit polypeptide, dans un tampon approprié tel qu'un tampon Tris environ pH 8 à environ 20 mM, NaCI à environ 150 mM, glycérol à environ 5 % ; (b) mélange de la solution avec une solution de cristallisation comprenant du P8000 à environ 10 °/(:), de l'éthylène glycol à environ 20 °/(:), du Na-l-glutamate à environ 0,02 M, de la dl-alanine à environ 0,02M, de la glycine à environ 0,02 M, de la dl-lysine HCI à environ 0,02 M, de la dl-sérine à environ 0,02 M ; et (c) incubation du mélange dans des conditions et pendant une durée suffisante pour produire le co-cristal du polypeptide lié audit substrat, tel que le linalol, le 3-butèn-2-ol ou le 3-méthy1-3- buten-2-ol. [092] Un autre mode de réalisation fournit un procédé d'identification d'un composé qui se lie au polypeptide de SEQ ID NO: 5 ou 8, comprenant : (a) l'obtention d'un cristal comprenant une protéine constituée de SEQ ID NO: 5 ou 8, dans un groupe spatial P2(1) avec les paramètres cellulaires a=133,18 À, b=110,83 A, c=162,20 A ; (b) la détermination de la structure tridimensionnelle 19 dudit polypeptide par diffraction de rayons X pour obtenir les coordonnées atomiques de l'Annexe I ; (c) la mise en contact de la structure du polypeptide définie par les coordonnées atomiques de l'Annexe I ou un sous-groupe de celle-ci avec un composé de test ; et (d) la détection d'une interaction entre le composé et les coordonnées atomiques, où une interaction favorisée du point de vue énergétique entre le composé de test et les coordonnées atomiques est indicative d'un composé qui se lie audit polypeptide. [93] Un autre mode de réalisation fournit un cristal tel que défini dans l'un quelconque des paragraphes précédents relatif au cristal, dans lequel les coordonnées atomiques définissent une ou plusieurs régions telles qu'indiquées dans le Tableau 3. [94] Un autre mode de réalisation fournit un polypeptide selon l'un quelconque des paragraphes précédents relatif au polypeptide du présent RÉSUMÉ, le polypeptide ayant une activité dans la catalyse de la déshydratation du 3-méthyl- 3-butèn-2-ol en isoprène qui est d'au moins 80 % de celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8, augmentée d'un facteur 1,5 environ ou supérieur par rapport à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8, de préférence d'un facteur 2 environ ou supérieur par rapport à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8, de préférence d'un facteur 2,5 environ ou supérieur par rapport à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8, de préférence d'un facteur 3 environ ou supérieur par rapport à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8, de préférence d'un facteur 3,5 environ ou supérieure par rapport à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8, de préférence d'un facteur 4 environ ou supérieure par rapport à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8, de préférence d'un facteur 4,5 environ ou supérieur par rapport à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8, ou de préférence d'un facteur 5 environ ou supérieur par rapport à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8, ou de préférence d'un facteur 15 environ ou supérieur par rapport à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1,4, 5, 7 ou 8, et dans lequel ladite activité est observée dans au moins un essai d'activité ou de préférence d'un facteur 55 environ ou supérieur par rapport à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8, de 20 préférence d'un facteur 30 environ ou supérieur par rapport à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8, et dans lequel ladite activité est observée dans un moins un essai d'activité. Dans certains modes de réalisation apparentés, ladite activité dans la catalyse de la déshydratation du 3- méthy1-3-butèn-2-ol en isoprène est observée dans au moins un type de cellules non bactériennes. Dans certains autres modes de réalisation apparentés, ladite activité dans la catalyse de la déshydratation du 3-méthy1-3-butèn-2-ol en isoprène est observée dans au moins un type de bactérie. Dans certains autres modes de réalisation apparentés, ladite activité dans la catalyse de la déshydratation du 3-méthy1-3-butèn-2-ol en isoprène est observée dans plus d'un type de bactérie. Dans certains modes de réalisation apparentés, les bactéries sont une souche d'E. Coll. Dans certains modes de réalisation apparentés, les bactéries sont Origami2(DE3) ou BL21 (DE3). [95] Un autre mode de réalisation fournit une composition comprenant du 3- méthy1-3-butèn-2-ol et un moyen pour produire de l'isoprène. [96] Un autre mode de réalisation fournit une composition comprenant un substrat et un moyen pour produire enzymatiquement de l'isoprène à partir dudit substrat. [97] Un autre mode de réalisation fournit un procédé de production d'isoprène 20 comprenant : une étape de conversion enzymatique de 3-méthy1-3-butèn-2-ol en isoprène ; et la mesure et/ou la récolte de l'isoprène ainsi produit. [98] Un autre mode de réalisation fournit un appareil comprenant un contenant 25 et un moyen pour produire de l'isoprène. [99] Un autre mode de réalisation fournit un procédé de conception d'un polypeptide présentant une activité d'au moins 80 % ou une activité améliorée, dans la catalyse de la déshydratation du 3-méthy1-3-butèn-2-ol en isoprène par rapport à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8, le 30 procédé comprenant la mutation d'un moyen pour convertir de façon enzymatique le 3-méthy1-3-butèn-2-ol en isoprène. [0100] Un autre mode de réalisation fournit un polypeptide comprenant l'une quelconque ou plusieurs des séquences pour chacun des mutants identifiés dans l'Annexe 3. Un autre mode de réalisation fournit un polypeptide comprenant l'une 21 quelconque ou plusieurs des séquences pour chacun des mutants identifiés dans le Tableau 9. [0101] Un autre mode de réalisation fournit un procédé de production d'une enzyme qui a une activité améliorée dans la catalyse de la déshydratation du 3- butèn-2-ol en 1,3-butadiène et/ou dans la catalyse de la conversion du 3-méthy1- 3-butèn-2-ol en isoprène comprenant : l'identification de groupes fonctionnels d'acides aminés réactifs et de la géométrie de groupe fonctionnel pour catalyser ladite réaction, construisant ainsi un site actif ; la construction d'un ensemble de rotamères d'acides aminés à partir d'une banque structurale dans lequel les rotamères intègrent lesdits groupes fonctionnels et ladite géométrie de groupe fonctionnel ; l'identification informatique d'un placement de site actif dans un ensemble de squelettes de protéines candidates par un algorithme de hachage, où l'ensemble de rotamères d'acides aminés comprenant ledit placement de site actif est positionné sur un squelette de protéine candidate de sorte que le site actif satisfasse à la stéréochimie de la protéine et conserve une géométrie catalytique ; la sélection informatique d'une séquence d'acides aminés pour s'adapter au squelette identifié et au site actif placé, identifiant ainsi une enzyme hypothétique ; la production de l'enzyme hypothétique et la confirmation de l'activité dans la catalyse de la déshydratation du 3-butèn-2-ol en 1,3-butadiène et/ou dans la catalyse de la conversion du 3-méthy1-3-butèn-2-ol en isoprène. Dans un mode de réalisation, ce procédé est exécuté selon une ou plusieurs des techniques de conception informatique des enzymes décrites dans le brevet US n° 8 340 951. [0102] Un autre mode de réalisation fournit un procédé de production d'isoprène, de myrcène et/ou de 1,3-butadiène biodérivé, comprenant la culture ou la croissance d'une cellule hôte ou d'un organisme selon l'un quelconque des paragraphes précédents du présent RÉSUMÉ dans des conditions et pendant une durée suffisante pour produire de l'isoprène, du myrcène et/ou du 1,3-butadiène biodérivé. [0103] Un autre mode de réalisation fournit un milieu de culture comprenant de l'isoprène, du myrcène et/ou du 1,3-butadiène biodérivé, lesdits isoprène, myrcène et/ou 1,3-butadiène biodérivés ayant un rapport isotopique de carbone-12, carbone-13 et carbone-14 qui reflète une source d'absorption du dioxyde de carbone atmosphérique. Dans certains modes de réalisation, ledit milieu de 22 culture est séparé d'une cellule hôte ou d'un organisme selon l'un quelconque des paragraphes précédents du présent RÉSUMÉ. [0104] Un autre mode de réalisation fournit de l'isoprène, du myrcène, et/ou du 1,3-butadiène biodérivé ayant un rapport isotopique de carbone-12, carbone-13 et carbone-14 qui reflète une source d'absorption du dioxyde de carbone atmosphérique, de préférence produit par la culture d'une cellule hôte ou d'un organisme selon l'un quelconque des paragraphes précédents du présent résumé. Dans certains modes de réalisation, ledit isoprène, myrcène, et/ou 1,3-butadiène biodérivé de la revendication 115, ledit isoprène, myrcène, et/ou 1,3- butadiène biodérivé ayant une valeur Fm d'au moins 80 °/(:), d'au moins 85 °/(:), d'au moins 90 °/(:), d'au moins 95 % ou d'au moins 98 %. Certains modes de réalisation fournissent une composition comprenant ledit isoprène, myrcène, et/ou 1,3-butadiène biodérivé selon l'un quelconque des paragraphes précédents du présent RÉSUMÉ et un composé autre que ledit isoprène, myrcène, et/ou 1,3- butadiène biodérivé. Dans certains modes de réalisation desdites compositions, ledit composé autre que ledit isoprène, myrcène, et/ou 1,3-butadiène biodérivé est une quantité trace d'une partie cellulaire d'une cellule hôte ou d'un organisme selon l'un quelconque des paragraphes du présent résumé. [0105] Certains modes de réalisation fournissent un polymère à base biologique comprenant de l'isoprène, du myrcène et/ou du 1,3-butadiène biodérivé selon l'un quelconque des paragraphes précédents du présent RÉSUMÉ. [0106] Certains modes de réalisation fournissent une résine à base biologique comprenant de l'isoprène, du myrcène et/ou du 1,3-butadiène biodérivé selon l'un quelconque des paragraphes précédents du présent RÉSUMÉ. [0107] Certains modes de réalisation fournissent un produit moulé obtenu par moulage d'un polymère à base biologique selon l'un quelconque des paragraphes précédents du présent RÉSUMÉ. [0108] Certains modes de réalisation fournissent un procédé de production d'un polymère à base biologique selon la revendication 119, comprenant la réaction chimique de l'isoprène, du myrcène et/ou du 1,3-butadiène biodérivé selon l'un quelconque des paragraphes précédents du présent RÉSUMÉ avec lui-même ou un autre composé dans une réaction produisant un polymère. 23 [0109] Certains modes de réalisation fournissent un produit moulé obtenu par moulage d'une résine à base biologique selon l'un quelconque des paragraphes précédents du présent RÉSUMÉ. [0110] Certains modes de réalisation fournissent un procédé de production d'une résine à base biologique selon l'un quelconque des paragraphes précédents du présent RÉSUMÉ, comprenant la réaction chimique dudit isoprène, myrcène, et/ou 1,3-butadiène biodérivé avec lui-même ou un autre composé dans une réaction produisant une résine. [0111] Un mode de réalisation fournit un cristal comprenant les coordonnées indiquées dans l'Annexe 2 dans le groupe spatial P2(1) avec les paramètres cellulaires a=88,7 A, b=111,22 A, c=120,42 A qui est produit à partir d'un polypeptide constitué de la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO: 9 avec une variation allant jusqu'à 2 % dans une dimension cellulaire. Un mode de réalisation fournit une composition comprenant ledit cristal. Dans certains modes de réalisation, ledit cristal diffracte des rayons X pour la détermination des coordonnées atomiques du cristal à une résolution entre 2,67 A et 2,60 A. Dans des modes de réalisation, ledit cristal comprend un ion métallique, de préférence, le zinc. [0112] Certains modes de réalisation fournissent un co-cristal comprenant le cristal tel que défini dans le paragraphe [0111] lié à un substrat tel que le linalol, le 3-butèn-2-ol et le 3-méthy1-3-butèn-2-ol. [0113] Certains modes de réalisation fournissent un procédé d'identification d'un substrat ou d'un inhibiteur de LDH, comprenant une quelconque ou plusieurs des étapes suivantes : (a) l'obtention d'un cristal ou des coordonnées d'un cristal, d'un polypeptide comprenant SEQ ID NO: 8 ou 9, le cristal étant dans un groupe spatial P2(1) avec les paramètres cellulaires a=88,7 A, b=111,22 A, c=120,42 A; (b) l'obtention ou la détermination de la structure tridimensionnelle dudit polypeptide en utilisant le cristal du point (a) par un procédé de diffraction de rayons X; (c) l'affichage de la structure tridimensionnelle dudit complexe sur un ordinateur en entrant lesdites données de structure cristalline dudit polypeptide, l'ordinateur comprenant un logiciel pour générer ladite structure tridimensionnelle et pour identifier un substrat ou un inhibiteur ; et (d) la sélection d'un substrat ou d'un inhibiteur du site actif dudit polypeptide. 24 [0114] Certains modes de réalisation fournissent un procédé de conception d'un substrat ou d'un inhibiteur de LDH, le procédé comprenant une ou plusieurs des étapes suivantes : (a) obtention d'un cristal ou des coordonnées d'un cristal, dans un groupe spatial P2(1), avec des paramètres cellulaires a=88,7 A, b=111,22 A, c=120,42 A d'un complexe constitué de un polypeptide de SEQ ID NO: 8 ou 9 lié au substrat ou inhibiteur sur son site de liaison ; (b) l'obtention ou la détermination de la structure tridimensionnelle du complexe en utilisant le cristal obtenu au point (a) par un procédé de diffraction de rayons X pour obtenir les coordonnées atomiques de la structure ; (c) la fourniture sur un ordinateur des coordonnées atomiques de la structure tridimensionnelle du complexe ; et (d) l'utilisation d'un programme exécuté par l'ordinateur pour concevoir un composé chimique prédit comme se liant au polypeptide de SEQ ID NO: 8 ou 9 au niveau du site de liaison du substrat ou de l'inhibiteur et agissant comme un substrat ou inhibant LDH, sur la base de ladite structure tridimensionnelle. Dans certains modes de réalisation dudit procédé, la conception comprend la conception rationnelle de novo d'un médicament et/ou la conception informatique d'une protéine. [0115] Dans d'autres modes de réalisation dudit procédé, la conception comprend l'utilisation d'un logiciel de docking et le criblage d'une ou plusieurs bases de données de molécules qui s'adaptent au site de liaison du substrat sur le 20 polypeptide de SEQ ID NO: 8 ou 9. [0116] Certains modes de réalisation fournissent un procédé selon le paragraphe [0114], comprenant en outre l'un quelconque ou plusieurs parmi : (e) la synthèse ou l'obtention du composé ; et (f) l'évaluation du composé pour sa capacité à réaliser l'un ou plusieurs parmi (1) la liaison du polypeptide de SEQ ID NO: 8 ou 25 9, (2) la compétition avec le linalol, le 3-butèn-2-ol ou le 3-méthy1-3-butèn-2-ol pour la liaison du polypeptide de SEQ ID NO: 8 ou 9, (3) l'inhibition de la LDH, ou (4) la déshydratation par le polypeptide de SEQ ID NO: 8 ou 9. [0117] Dans certains modes de réalisation, le procédé du paragraphe [0114], dans lequel la conception rationnelle d'un médicament et/ou la conception informatique 30 d'uneprotéine est basé(e) sur les interactions entre un ou plusieurs des résidus (site actif prédictif) du polypeptide de SEQ ID NO: 8 ou 9 et le linalol, le 3-butèn-2- ol ou le 3-méthy1-3-butèn-2-ol. [0118] Certains modes de réalisation fournissent un procédé de préparation du cristal du polypeptide de SEQ ID NO: 8 ou 9 selon le paragraphe [0111], qui 25 3033 172 comprend : (a) la fourniture d'une solution ayant ledit polypeptide, dans un tampon approprié tel qu'environ 10 mM de Tris (environ pH 9,0), environ 350 mM de NaCI, et environ 2 mM de ditiothréitol, (b) le mélange de volumes égaux de la solution avec une solution de cristallisation comprenant environ 61 mM MES + 5 environ 39 mM d'imidazole (environ pH 6,5), environ 13,2 % (p/v) de PEG 8000; environ 26,4 °A) (v/v) d'éthylène glycol ; environ 20 mM chacun de L-Naglutamate ; alanine (racémique) ; glycine ; lysine HCI (racémique) ; sérine (racémique) et, éventuellement, environ 0,05 % (v/v) de 3-butèn-2-ol ; et (c) l'incubation du mélange dans des conditions et pendant une durée suffisante pour 10 favoriser la production du cristal du polypeptide de SEQ ID NO: 8. [0119] Certains modes de réalisation fournissent un procédé de préparation du co-cristal selon le paragraphe [0112], qui comprend les étapes de : (a) fourniture d'une solution ayant ledit polypeptide, dans un tampon approprié tel que Tris à environ 10 mM (environ pH 9,0), NaCI à environ 350 mM et ditiothréitol à environ 15 2 mM; (b) le mélange de volumes égaux de la solution avec une solution de cristallisation comprenant MES à environ 61 mM + environ 39 mM d'imidazole (environ pH 6,5), environ 13,2 °A) (p/v) de PEG 8000; environ 26,4 °A) (v/v) d'éthylène glycol; environ 20 mM chacun de L-Na-glutamate ; alanine (racémique) ; glycine ; lysine HCI (racémique) ; sérine (racémique) et, éventuellement, du 3- butèn-2-ol à environ 0,05 % (v/v) ; et (c) l'incubation du mélange dans des conditions et pendant une durée suffisante pour favoriser la production du cocristal dudit polypeptide lié audit substrat, tel que le linalol, le 3-butèn-2-ol ou le 3- méthy1-3-butèn-2-ol. [0120] Certains modes de réalisation fournissent un procédé d'identification d'un composé qui se lie au polypeptide de SEQ ID NO: 8 ou 9, comprenant : (a) l'obtention d'un cristal comprenant une protéine constituée de SEQ ID NO: 9, le cristal étant dans un groupe spatial P2(1) avec les paramètres cellulaires a=88,7 À, b=111,22 A, c=120,42 A ; (b) la détermination de la structure tridimensionnelle dudit polypeptide par diffraction de rayons X pour obtenir les coordonnées atomiques de l'Annexe 2; (c) la mise en contact de la structure polypeptidique définie par les coordonnées atomiques de l'Annexe 2, ou un sous-groupe de celle-ci avec un composé de test ; et (d) la détection d'une interaction entre le composé et les coordonnées atomiques, une interaction favorisée sur le 26 plan énergétique entre le composé de test et les coordonnées atomiques étant indicative d'un composé qui se lie audit polypeptide. [0121] Certains modes de réalisation fournissent le cristal selon le paragraphe [0111], les coordonnées atomiques définissant une ou plusieurs régions telles qu'indiquées dans le Tableau 3. [0122] Certains modes de réalisation fournissent un cristal selon l'un quelconque des paragraphes [0111] à [0121], dans lequel le cristal est obtenu à partir d'un polypeptide comprenant SEQ ID NO: 8. [0123] Certains modes de réalisation fournissent un cristal comprenant les coordonnées de l'Annexe 1 ou de l'Annexe 2, de préférence le cristal étant préparé à partir d'un polypeptide comprenant SEQ ID NO: 8. [0124] Certains modes de réalisation fournissent un cristal ayant la même structure tridimensionnelle que l'une quelconque des structures tridimensionnelles représentées par les coordonnées de l'Annexe 1 ou l'Annexe 2, de préférence, le cristal étant préparé à partir d'un polypeptide comprenant SEQ ID NO: 8. [0125] Certains modes de réalisation fournissent un co-cristal comprenant le cristal tel que défini dans le paragraphe [0124] lié à un substrat, tel que le linalol, le 3-butèn-2-ol et le 3-méthy1-3-butèn-2-ol. [0126] Certains modes de réalisation fournissent un procédé d'identification d'un substrat ou d'un inhibiteur de LDH, comprenant l'une quelconque ou plusieurs des étapes suivantes : (a) l'obtention d'un cristal tel que décrit dans le paragraphe [0124] ; (b) l'obtention ou la détermination de la structure tridimensionnelle dudit polypeptide en utilisant le cristal du point (a) par un procédé de diffraction de rayons X; (c) l'affichage de la structure tridimensionnelle dudit complexe sur un ordinateur en entrant lesdites données de structure cristalline dudit polypeptide, l'ordinateur comprenant un logiciel pour générer ladite structure tridimensionnelle et pour identifier un substrat ou un inhibiteur ; et (d) la sélection d'un substrat ou d'un inhibiteur du site actif dudit polypeptide. [0127] Certains modes de réalisation fournissent un procédé de conception d'un substrat ou d'un inhibiteur de LDH, le procédé comprenant l'une quelconque ou plusieurs des étapes suivantes : (a) l'obtention d'un cristal tel que décrit dans le paragraphe [0124], d'un complexe constitué d'un polypeptide comprenant SEQ ID NO: 8 lié au substrat ou à un inhibiteur sur son site de liaison ; (b) l'obtention ou la détermination de la structure tridimensionnelle du complexe en utilisant le cristal 27 3033 172 obtenu au paragraphe (a) par un procédé de diffraction de rayons X pour obtenir les coordonnées atomiques de la structure ; (c) la fourniture sur un ordinateur, des coordonnées atomiques de la structure tridimensionnelle du complexe ; et (d) l'utilisation d'un programme exécuté par l'ordinateur pour concevoir un composé 5 chimique prédit comme se liant au polypeptide de SEQ ID NO: 8 sur le site de liaison du substrat ou de l'inhibiteur et agissant comme un substrat ou inhibant la LDH, sur la base de ladite structure tridimensionnelle. [0128] Certains modes de réalisation fournissent un procédé selon les paragraphes [0126]-[0127], dans lequel la conception comprend la conception 10 rationnelle de novo d'un médicament et/ou la conception informatique d'une protéine. [0129] Certains modes de réalisation fournissent un procédé selon les paragraphes [0126]-[0127], dans lequel la conception comprend l'utilisation d'un logiciel de docking et le criblage d'une ou plusieurs bases de données de 15 molécules qui s'adaptent au site de liaison du substrat sur le polypeptide de SEQ ID NO: 8. [0130] Certains modes de réalisation fournissent un procédé selon les paragraphes [0126]-[0127], comprenant en outre l'une quelconque ou plusieurs parmi : (e) la synthèse ou l'obtention du composé ; et (f) l'évaluation du composé 20 pour sa capacité à réaliser l'un ou plusieurs parmi (1) la liaison du polypeptide comprenant SEQ ID NO: 8, (2) la compétition avec le linalol, le 3-butèn-2-ol ou le 3-méthy1-3-butèn-2-ol pour la liaison du polypeptide de SEQ ID NO: 8, (3) l'inhibition de la LDH, ou (4) la déshydratation par le polypeptide de SEQ ID NO: 8 25 [0131] Certains modes de réalisation fournissent un procédé selon le paragraphe [0128], dans lequel la conception rationnelle d'un médicament et/ou la conception informatique d'une protéine est basé(e) sur les interactions entre un ou plusieurs des résidus (site actif prédictif) du polypeptide de SEQ ID NO: 8 et le linalol, le 3- butèn-2-ol ou le 3-méthy1-3-butèn-2-ol. 30 [0132] Certains modes de réalisation proposent un procédé de préparation d'un cristal selon le paragraphe [0124], qui comprend : (a) la fourniture d'une solution ayant ledit polypeptide, dans un tampon approprié tel que Tris à environ 20 mM environ pH 8, NaCI à environ 150 mM, glycérol à environ 5 % ; (b) le mélange de la solution avec une solution de cristallisation 28 comprenant du P8000 à environ 10 % ; de l'éthylène glycol à environ 20 % ; du Na-l-glutamate à environ 0,02 M, de la dl-alanine à environ 0,02 M, de la glycine à environ 0,02 M, de la dl-lysine HCI à environ 0,02 M, de la dl-sérine à environ 0,02 M ; ou (a) la fourniture d'une solution ayant ledit polypeptide, dans un tampon approprié tel que Tris à environ 10 mM (environ pH 9,0), NaCI à environ 350 mM et ditiothréitol à environ 2 mM; (b) le mélange de volumes égaux de la solution avec une solution de cristallisation comprenant MES à environ 61 mM + environ 39 mM d'imidazol (environ pH 6,5), environ 13,2 % (p/v) de PEG 8000; environ 26,4 % (v/v) d'éthylène glycol ; environ 20 mM chacun de L-Na-glutamate ; alanine (racémique) ; glycine ; lysine HCI (racémique) ; sérine (racémique) et éventuellement, 3-butèn-2-ol à environ 0,05 % (v/v) ; et (c) l'incubation du mélange dans des conditions et pendant une durée suffisante pour favoriser la production du cristal selon le paragraphe [0124]. [0133] Certains modes de réalisation fournissent un procédé de préparation du co-cristal selon le paragraphe [0124], qui comprend les étapes de : (a) fourniture d'une solution ayant ledit polypeptide, dans un tampon approprié tel que Tris à environ 20 mM environ pH 8, NaCI à environ 150 mM, glycérol à environ 5 % ; (b) le mélange de la solution avec une solution de cristallisation comprenant du PEG 8000 à environ 10 °/(:), de l'éthylène glycol à environ 20 °/(:), du Na-l-glutamate à environ 0,02 M, de la dl-alanine à environ 0,02 M, de la glycine à environ 0,02 M, de la dl-lysine HCI à environ 0,02 M, de la dl-sérine à environ 0,02 M ; et (c) l'incubation du mélange dans des conditions et pendant une durée suffisante pour favoriser la production du co-cristal dudit polypeptide lié audit substrat, tel que le linalol, le 3-butèn-2-ol ou le 3-méthy1-3-butèn-2-ol. [0134] Certains modes de réalisation fournissent un procédé d'identification d'un composé qui se lie à un polypeptide comprenant SEQ ID NO: 8, comprenant : (a) l'obtention d'un cristal selon le paragraphe [0124] ; (b) la détermination de la structure tridimensionnelle dudit polypeptide par diffraction de rayons X pour obtenir les coordonnées atomiques de l'Annexe 1 ou 2 ; (c) la mise en contact de la structure polypeptidique définie par les coordonnées atomiques de l'Annexe 1 ou 2, ou un sous-groupe de celles-ci avec un composé de test ; et (d) la détection d'une interaction entre le composé et les coordonnées atomiques, une interaction 29 favorisée sur le plan énergétique entre le composé de test et les coordonnées atomiques étant indicative d'un composé qui se lie audit polypeptide. [0135] Certains modes de réalisation fournissent un procédé d'amélioration d'une ou plusieurs des activités catalytiques d'une LDH ou d'un fragment de celle-ci, le 5 procédé comprenant une ou plusieurs des étapes suivantes : (a) l'obtention d'un cristal tel que décrit dans l'un quelconque des paragraphes précédents ; (b) l'obtention ou la détermination de la structure tridimensionnelle de la LDH en utilisant le cristal obtenu au point (a) éventuellement par un procédé de diffraction de rayons X pour obtenir les coordonnées atomiques de la structure ; 10 (c) la fourniture à un ordinateur des coordonnées atomiques de la structure tridimensionnelle du complexe ; et (d) l'utilisation d'une conception informatique ou d'un logiciel exécuté par l'ordinateur pour concevoir une LDH ou un fragment de celle-ci, ayant une ou plusieurs activités catalytiques améliorées, sur la base de ladite structure tridimensionnelle. Dans certains modes de réalisation, lesdites 15 coordonnées comprennent des coordonnées choisies parmi l'Annexe 1 et l'Annexe 2. [0136] Certains modes de réalisation fournissent un procédé de production d'une enzyme qui a une activité accrue dans la catalyse de la déshydratation du 3- butèn-2-ol en 1,3-butadiène et/ou dans la catalyse de la conversion du 3-méthyl- 20 3-butèn-2-ol en isoprène comprenant : l'identification de groupes fonctionnels d'acides aminés réactifs et de la géométrie de groupe fonctionnel pour catalyser ladite réaction, construisant ainsi un site actif ; la construction d'un ensemble de rotamères d'acides aminés à partir d'une banque structurale dans laquelle les rotamères intègrent lesdits groupes fonctionnels et ladite géométrie de groupe 25 fonctionnel ; l'identification informatique d'un placement de site actif dans un ensemble de squelettes de protéines candidates par un algorithme de hachage, où l'ensemble de rotamères d'acides aminés comprenant ledit placement de site actif est placé sur un squelette de protéine candidate de sorte que le site actif satisfasse à la stéréochimie de la protéine et conserve une géométrie catalytique ; 30 la sélection informatique d'une séquence d'acides aminés s'adaptant au squelette identifié et au site actif placé, identifiant ainsi une enzyme hypothétique ; la production de l'enzyme hypothétique et la confirmation de l'activité dans la catalyse de la déshydratation du 3-butèn-2-ol en 1,3-butadiène et/ou dans la catalyse de la conversion du 3-méthy1-3-butèn-2-ol en isoprène. Dans certains 30 modes de réalisation, ladite enzyme est améliorée à partir d'une LDH/cdLD décrite ici. [0137] Pour ce qui concerne tous les modes de réalisation ci-dessus et les revendications, il entre également dans le cadre de la présente description tous les modes de réalisation qui fournissent « une identité de séquence d'acides aminés d'au moins X % avec SEQ ID NO: 1 » à la place de « une homologie de séquence d'acides aminés d'au moins X % avec SEQ ID NO: 1 », X étant l'un quelconque des % utilisés dans la présente description et les revendications dans le contexte de l'homologie de séquence. [0138] L'exemple suivant est proposé à cet égard, mais de nombreux autres modes de réalisation existent pour les modes de réalisation dans lesquels le terme « homologie » est remplacé par « identité », dans lesquels certains modes de réalisation fournissent un polypeptide comprenant une séquence d'acides aminés présentant une identité de séquence d'acides aminés d'au moins 90 % avec SEQ ID NO: 1, ladite séquence d'acides aminés comprenant au moins une, de préférence une à cinq mutations sur les positions X suivantes de SEQ ID NO: 1 R1_96X96R97-98X99R100-122X123R124-186X187R188-203X204 R205-211X212R213- 272X273X274X275 R276-323X324 R325-327X328R329-R359X360R361-365X366R367- 381X382R383-398, dans laquelle : X96 est muté en un acide aminé différent choisi parmi L et des acides aminés équivalents ; X99 est muté en un acide aminé différent choisi parmi L et des acides aminés équivalents ; X123 est muté en un acide aminé différent choisi parmi I et des acides aminés équivalents ; X167 est muté en un acide aminé différent choisi parmi M et des acides aminés équivalents ; X204 est muté en un acide aminé différent choisi parmi I et des acides aminés équivalents ; X212 est muté en un acide aminé différent choisi parmi F, Y, et des acides aminés équivalents ; X273 est muté en un acide aminé différent choisi parmi C et des acides aminés équivalents ; 31 X274 est muté en un acide aminé différent choisi parmi F et des acides aminés équivalents ; X275 est muté en un acide aminé différent choisi parmi I et des acides aminés équivalents ; X324 est muté en un acide aminé différent choisi parmi L, E, et des acides aminés équivalents ; X328 est muté en un acide aminé différent choisi parmi V et des acides aminés équivalents ; X380 est muté en un acide aminé différent choisi parmi Y et des acides aminés équivalents ; X388 est muté en un acide aminé différent choisi parmi V, C, G, et des acides aminés équivalents ; X382 est muté en un acide aminé différent choisi parmi W et des acides aminés équivalents ; et chaque R est identique à l'acide aminé correspondant dans SEQ ID NO: 1. Dans un autre mode de réalisation, l'identité avec SEQ ID NO: 1 est d'au moins 91, au moins 92, au moins 93, au moins 94, au moins 95, au moins 96, au moins 97, au moins 98 ou au moins 99 %. [0139] D'autres objets, caractéristiques et avantages des procédés, systèmes et compositions décrits apparaîtront de la description détaillée suivante. On comprendra toutefois que la description détaillée et les exemples spécifiques, tout en indiquant des modes de réalisation spécifiques, sont donnés à titre d'illustration uniquement car divers changements et modifications dans l'esprit et le cadre de l'invention proposée ici apparaîtront à l'homme du métier à partir de cette description détaillée.
BREVE DESCRIPTION DES DESSINS [0140] L'homme du métier comprendra que les dessins décrits ci-dessous sont présentés à des fins d'illustration uniquement. Les dessins ne sont destinés en aucune manière à limiter le cadre des présents enseignements. [0141] Le brevet ou le dossier de demande contient au moins un dessin en couleur. Des copies de ce brevet ou de la publication de la demande de brevet comportant un/des dessin(s) en couleur seront fournies par l'United States Patent and Trademark Office (Office américain des brevets et des marques) sur demande et paiement de la taxe nécessaire. 32 3033 172 [0142] Figure 1 : aperçu de l'architecture structurale de cdLD, sur la base de la structure de haute résolution obtenue par cristallographie aux rayons X. FIG. lA : disposition symétrique pentamérique observée dans la structure cristalline. FIG. 1 B: monomère de cdLD avec structure secondaire soulignée. Les hélices alpha 5 sont en rouge, les brins bêta en jaune et les boucles en vert. cdLD adopte un repliement a/a(6) en tonneau. Les hélices intérieures du revêtement du tonneau sont marquées. [0143] Figure 2: emplacement du site actif hypothétique à l'interface entre la sous-unité A et la sous-unité E. Planche verte : chaîne A. Brun clair : chaîne B. 10 Les chaînes latérales revêtant le site actif hypothétique sont soulignées. Les groupes polaires dans le site actif sont en rose. On notera le pont disulfure distal (barres saumon) sur le côté gauche de la chaîne A. La vue est orientée face à l'entrée dans la cavité du site actif. [0144] Figure 3: représentation de la structure secondaire de cdLD (SEQ ID NO: 15 87) assignée par le programme DSSP et représentée avec Polyview. Les hélices (0, 310 et CI) sont représentées en cylindres rouges, les brins avec les flèches vertes et les boucles en fils bleus. Les hélices ont été numérotées de façon consécutive de la région N-terminale à C-terminale. [0145] Figure 4: butadiène produit par des mutants de cdLD périplasmiques 20 sélectionnés obtenus à partir du schéma de stabilisation. [0146] Figure 5: production de butadiène par certains mutants du deuxième groupe de banques de saturation de site. [0147] Figure 6: production de butadiène par des mutants formés sur le haut de A324 L. 25 [0148] Figure 7: production de butadiène par des mutants formés sur la base de M274F. [0149] Figure 8: production de butadiène par des mutants formés sur la base de S366V. [0150] Figure 9: production de butadiène par des mutants formés sur la base de 30 V275I. [0151] Figure 10: production de butadiène par des mutants formés sur la base de F382W. 33 [0152] Figure 11 : production de butadiène par certains mutants périplasmiques purifiés de cdLD. [0153] Figure 12: FIG. 12A, production de butadiène à partir de 3-butèn-2-ol (10 mM) ; et FIG. 12B, production d'isoprène à partir de 3-méthy1-3-butèn-2-ol (10 mM), par certains mutants purifiés. [0154] Figure 13: production relative de butadiène par des mutants combinatoires (essai à 1 m1). [0155] Figure 14: production relative de butadiène par des mutants combinatoires (essai à 1 m1). [0156] Figure 15: essai de butadiène avec des mutants cyto-cdLD purifiés. Seuls deux clones qui présentaient une amélioration significative de l'activité spécifique par rapport à cdLD de type sauvage sont présentés. [0157] Figure 16: disposition pentamérique des monomères de protéine cdLD dans l'unité de cristal asymétrique. Chaque chaîne de polypeptide a une couleur 15 unique. [0158] Figure 17: FIG. 17A, densité électronique associée au site actif hypothétique de cdLD. La grille bleue est la carte 2Fo-Fc à 1,5 sigma et en vert, la carte Fo-Fc à 3,0 sigma ; FIG. 17B: bande en coupe et représentation de surface du site actif hypothétique. L'atome de zinc modélisé est une sphère gris-foncé et 20 tous les acides aminés dans les 6 A du zinc sont présentées en structures en bâton. Une flèche noire indique la position et la direction du canal étroit accessible au solvant. DESCRIPTION DETAILLEE [0159] Toutes les références mentionnées sont incorporées par référence dans 25 leur intégralité. [0160] Sauf indication contraire, tous les termes techniques et scientifiques utilisés ici ont la même signification que celle communément admise par l'homme du métier auquel est destiné la présente description. Sauf indication contraire, les techniques utilisées ou envisagées ici sont des méthodologies standard bien 30 connues de l'homme du métier. La mise en pratique de la présente description fera appel, sauf indication contraire, à des techniques classiques de microbiologie, de culture tissulaire, de biologie moléculaire, de chimie, de biochimie et de technique d'ADN recombinant qui entrent dans les compétences 34 de l'homme du métier. Les matériaux, procédés et exemples sont purement illustratifs et non limitatifs. Les données suivantes sont présentées à titre d'illustration et ne sont pas destinées à limiter le cadre de la description. [0161] De nombreuses modifications et autres modes de réalisation de la description présentée ici apparaîtront à l'homme du métier auquel la présente description est destinée, en profitant des enseignements présentés dans les descriptions précédentes et les dessins associés. Par conséquent, on comprendra que la description ne se limite pas aux modes de réalisation spécifiques décrits et que des modifications et autres modes de réalisation sont destinés à être inclus dans le cadre des revendications en annexe. Bien que des termes spécifiques soient utilisés ici, ils sont employés dans un sens général et descriptif uniquement et non à des fins restrictives. [0162] Les unités, préfixes et symboles peuvent être mentionnés sous leur forme admise dans le SI. Sauf indication contraire, les acides nucléiques sont mentionnés de gauche à droite dans l'orientation 5' à 3'; les séquences d'acides aminés sont mentionnées de gauche à droite dans l'orientation amino à carboxy, respectivement. Les intervalles numériques incluent les nombres définissant l'intervalle. Les acides aminés peuvent être nommés ici soit par les trois lettres symboliques communément admise, soit par des symboles d'une lettre recommandés par la Commission de Nomenclature Biochimique IUPAC-IUB. De même, les nucléotides peuvent être désignés par leurs codes à lettre unique communément admis. Les termes définis ci-dessous sont plus complètement définis en référence à la spécification dans son ensemble. [0163] Dans la présente description et les revendications, on utilise les codes classiques à une lettre et trois lettres pour les résidus d'acides aminés. Pour faciliter la référence, les polypeptides décrits ici sont décrits en utilisant la nomenclature suivante : acide(s) aminé(s) d'origine : position(s) : acide(s) aminé(s) substitué(s) (par ex., A324L, où A est remplacé par L en position 324 d'acide aminé). Toute la numérotation s'effectue par référence à la numérotation du polypeptide de type sauvage de SEQ ID NO: 1 [0164] Dans la présente description et les revendications, l'activité du polypeptide revendiqué est mesurée par rapport à celle du polypeptide de SEQ ID NO: NO : 1, 4, 5, 7 ou 8, sauf indication contraire. La numérotation des mutations de chaque polypeptide décrit est déterminée par rapport à celle de la protéine de SEQ ID35 NO: 1 (cdLD de pleine longueur avec deux méthionines). L'homologie du polypeptide avec cdLD de type sauvage de SEQ ID NO: 1 est déterminée sans prendre en compte la présence ou l'absence d'une étiquette périplasmique, la présence d'une ou deux méthionines initiales et la présence ou l'absence d'une étiquette poly-His. [0165] Dans certains modes de réalisation, les nombres exprimant des quantités d'ingrédients, des propriétés telles que le poids moléculaire, les conditions réactionnelles et les résultats, etc., utilisés pour décrire et revendiquer certains modes de réalisation de la présente description doivent être compris comme étant modifiés dans certains cas par le terme « environ ». Dans certains modes de réalisation, le terme « environ » est utilisé pour indiquer qu'une valeur comprend l'écart type de la moyenne pour le dispositif ou le procédé qui est employé pour déterminer la valeur. Dans certains modes de réalisation, les paramètres numériques indiqués dans la spécification (dans laquelle les revendications sont incorporées dans leur intégralité) sont des approximations qui peuvent varier en fonction des propriétés souhaitées que l'on cherche à obtenir par un mode de réalisation particulier. Dans certains modes de réalisation, les paramètres numériques doivent être interprétés à la lumière du nombre de chiffres significatifs rapportés et en appliquant les principes d'arrondissement habituels. Bien que les intervalles numériques et les paramètres définissant le large cadre de certains modes de réalisation de la présente description soient des approximations, les valeurs numériques définies dans les exemples spécifiques sont rapportées aussi précisément que possible. Les valeurs numériques présentées dans certains modes de réalisation de la présente description peuvent contenir certaines erreurs résultant de l'écart type trouvé dans les mesures de test respectives. L'énumération des intervalles de valeur de ce document est principalement destinée à servir à un procédé abrégé de désignation individuelle de chaque valeur séparée entrant dans cet intervalle. Sauf indication contraire, chaque valeur individuelle est incluse dans la spécification comme si elle avait été mentionnée individuellement dans le présent document. [0166] Tel qu'il est utilisé ici, le terme « butadiène » ayant la formule moléculaire C4H6 et une masse moléculaire de 54,09 g/mole (nom IUPAC buta-1,3-diène), est utilisé de façon interchangeable avec le 1,3-butadiène, le bi-éthylène, l'érythrène, le divinyle, le vinyléthylène. Le butadiène est un gaz liquéfié incolore, non corrosif, 36 présentant une légère odeur aromatique ou de type essence. Le butadiène est à la fois explosif et inflammable en raison de son bas point d'éclair. [0167] L'expression « variants modifiés de façon conservative » s'applique à la fois aux séquences d'acides aminés et d'acide nucléique. Concernant les séquences d'acide nucléique particulières, les variants modifiés de façon conservative désignent des acides nucléiques qui codent pour des variants identiques ou des variants modifiés de façon conservative des séquences d'acides aminés. Compte tenu de la dégénérescence du code génétique, un grand nombre d'acides nucléiques fonctionnellement identiques code pour une protéine donnée. Par exemple, les codons GCA, GCC, GCG et GCU codent tous pour l'acide aminé alanine. Par conséquent, sur chaque position où une alanine est spécifiée par un codon, le codon peut être modifié en l'un quelconque des codons correspondants décrits sans modifier le polypeptide codé. Ces variations d'acide nucléique sont des « variations silencieuses » et représentent une espèce de variation modifiée de façon conservative. Chaque séquence d'acide nucléique du présent document, qui code pour un polypeptide décrit également toute variation silencieuse possible de l'acide nucléique. L'homme du métier comprendra que chaque codon dans un acide nucléique (excepté AUG, qui est habituellement le seul codon pour la méthionine ; une exception étant Micrococcus rubens, pour lequel GTG est le codon de la méthionine (Ishizuka, et al., (1993) J. Gen. Microbiol. 139: 425-32) peut être modifié pour donner une molécule fonctionnellement identique. En conséquence, chaque variation silencieuse d'un acide nucléique qui code pour un polypeptide de la présente description est implicite dans chaque séquence polypeptidique décrite et est incorporée ici par référence. [0168] Pour ce qui est des séquences d'acides aminés, l'homme du métier comprendra que des substitutions, délétions ou additions individuelles à une séquence d'acide nucléique, de peptide, de polypeptide ou deprotéine qui modifie, ajoute ou supprime un acide aminé individuel ou un petit pourcentage d'acides aminés dans la séquence codée est un « variant modifié de façon conservative » lorsque la modification entraîne la substitution d'un acide aminé avec un acide aminé chimiquement similaire. Par conséquent, un nombre quelconque de résidus d'acides aminés peut être ainsi modifié. Les variants modifiés de façon conservative assurent une activité biologique équivalente à celle de la séquence 37 polypeptidique non modifiée de laquelle ils sont dérivés. Des tableaux de substitution conservative fournissant des acides aminés fonctionnellement similaires, nommé ici également « acides aminés équivalents » sont bien connus dans l'art. [0169] Les termes « comprendre », « avoir » et « inclure » sont des verbes de liaison à terminaison ouverte. Toute forme ou temps d'un ou plusieurs de ces verbes, tels que « comprend », « comprenant », « a », « ayant », « inclut » et « incluant » sont également à terminaison ouverte. Par exemple, tout procédé qui « comprend », « a » ou « inclut » une ou plusieurs étapes n'est pas limité en ce qu'il possède uniquement cette étape ou plusieurs et peut également couvrir d'autres étapes non énumérées. De même, toute composition qui « comprend », « a » ou « inclut » une ou plusieurs caractéristiques n'est pas limitée en ce qu'elle possède uniquement cette caractéristique ou plusieurs et peut couvrir d'autres caractéristiques non énumérées. Tous les procédés décrits ici peuvent être réalisés dans tout ordre approprié sauf indication contraire mentionnée dans ce document ou si le contexte indique clairement le contraire. L'utilisation d'un exemple quelconque et de tous les exemples, ou d'éléments de langage illustratifs (par ex. « tel que ») fournis par rapport à certains modes de réalisation du présent document est destinée simplement à mieux éclairer la présente description et ne constitue pas une limite du cadre de la présente description par ailleurs revendiquée. Aucun élément de langage de la description ne doit être considéré comme indiquant comme essentiel pour la mise en pratique de la présente description, un élément non revendiqué. [0170] Telle qu'elle est utilisée ici, l'expression « constitué essentiellement de » signifie l'inclusion de séquences supplémentaires à un polynucléotide ou polypeptide en question, les séquences supplémentaires n'affectant pas matériellement la fonction basique des séquences polynucléotidiques ou polypeptidiques revendiquées. [0171] L'« optimisation de codon » est le processus de modification d'une séquence nucléotidique d'une manière qui améliore son expression, la teneur en G/C, la structure secondaire de l'ARN et la traduction dans des cellules eucaryotes, sans modifier la séquence d'acides aminés qu'elle code. L'utilisation d'un codon modifié s'effectue souvent pour modifier l'efficacité traductionnelle et/ou optimiser la séquence codante pour l'expression dans un hôte souhaité ou 38 pour optimiser l'utilisation du codon dans une séquence hétérologue pour l'expression dans un hôte particulier. L'utilisation de codon dans les régions codantes des polynucléotides de la présente description peut être analysée statistiquement en utilisant des logiciels disponibles dans le commerce tels que « Codon Preference » disponible auprès de l'Université du Wisconsin Genetics Computer Group. Voir Devereaux, et al., (1984) Acide nucléiques Res. 12: 387395) ou MacVector 4.1 (Eastman Kodak Co., New Haven, Conn.). Par conséquent, la présente description fournit une fréquence d'utilisation de codon caractéristique de la région codante d'au moins l'un des polynucléotides de la présente description. Le nombre de polynucléotides (3 nucléotides par acide aminé) qui peut être utilisé pour déterminer une fréquence d'utilisation de codon peut être tout nombre entier de 3 jusqu'au nombre de polynucléotides de la présente description tel que proposé ici. Eventuellement, les polynucléotides seront des séquences de pleine longueur. Un exemple de nombre de séquences pour l'analyse statistique peut être d'au moins 1, 5, 10, 20, 50 ou 100. [0172] Le terme « cristal » désigne une structure (tel qu'un agrégat solide tridimensionnel (3D)) dans lequel les faces planes se croisent à des angles définis et dans lequel il existe une structure régulière (telle qu'une structure interne) des espèces chimiques constitutives. Le terme « cristal » désigne en particulier une forme de cristal physique solide tel qu'un cristal préparé expérimentalement. Eventuellement, le cristal de cdLD peut comprendre une ou plusieurs molécules qui se lient au site actif de cdLD ou imprègnent d'une autre façon le cristal ou sont co-cristallisées avec la cdLD. [0173] Le terme « dérivé » englobe les termes « provenant de », « obtenu » ou « susceptible d'être obtenu à partir de » et « isolé de ». [0174] Les « acides aminés équivalents » peuvent être déterminés sur la base soit de leur homologie structurale avec les acides aminés pour lesquels ils sont substitués, soit des résultats de tests comparatifs d'activité biologique entre les diverses variants susceptibles d'être générés. A titre d'exemple non restrictif, la liste ci-dessous résume les substitutions possibles souvent susceptibles d'être réalisées sans entraîner de modification significative de l'activité biologique du variant correspondant : 1) Alanine (A), Sérine (S), Thréonine (T), Valine (V), Glycine (G) et Proline (P) ; 39 3033 172 2) Acide aspartique (D), acide glutamique (E) ; 3) Asparagine (N), glutamine (Q) ; 4) Arginine (R), Lysine (K), Histidine (H) ; 5) Isoleucine (I), Leucine (L), Méthionine (M), Valine (V) et 5 6) Phénylalanine (F), Tyrosine (Y), Tryptophane (W). Voir également, Creighton, Protéines, W.H. Freeman et Co. (1984). [0175] Lorsque l'on effectue ces changements/substitutions, l'indice hydropathique des acides aminés peut également être pris en compte. L'importance de l'indice hydropathique de l'acide aminé pour conférer une 10 fonction biologique interactive sur une protéine est généralement comprise dans l'art (Kyte and Doolittle, (1982) J Mol Biol. 157(1) : 105-32). Il est admis que le caractère hydropathique relatif de l'acide aminé contribue à la structure secondaire de la protéine obtenue qui définit elle-même l'interaction de la protéine avec d'autres molécules, par exemple, des enzymes, substrats, récepteurs, ADN, 15 anticorps, antigènes et autres. [0176] On sait dans l'art que certains acides aminés peuvent être remplacés par d'autres acides aminés ayant un indice ou score hydropathique similaire et donnent toujours une protéine présentant une activité biologique similaire, c'est-à-dire obtiennent toujours une protéine biologique fonctionnellement équivalente. A 20 chaque acide aminé est attribué un indice hydropathique sur la base de son hydrophobie et de ses caractéristiques de charge (Kyte et Doolittle, ibid). Il s'agit de : isoleucine (+4,5) ; valine (+4,2) ; leucine (+3,8) ; phénylalanine (+2,8) ; cystéine/cystine (+2,5) ; méthionine (+1,9) ; alanine (+1,8) ; glycine (-0,4) ; thréonine (-0,7) ; sérine (-0,8) ; tryptophane (-0,9) ; tyrosine (-1,3) ; proline (-1,6) ; 25 histidine (-3,2) ; glutamate (-3,5) ; glutamine (-3,5) ; aspartate (-3,5) ; asparagine (-3,5) ; lysine (-3,9) et arginine (-4,5). Lorsque l'on effectue ces changements, la substitution des acides aminés dont les indices hydropathiques se situe dans les limites de +2 est préférée, ceux qui se situent dans les limites de +1 sont particulièrement préférés et ceux dans les limites de +0,5 sont même plus 30 particulièrement préférés. [0177] On comprendra dans l'art que la substitution d'acides aminés similaires peut s'effectuer efficacement sur la base de l'hydrophilie. Le brevet U.S. n°4 554 101 indique que l'hydrophilie moyenne locale la plus importante d'une 40 protéine, dirigée par l'hydrophilie de ses acides aminés adjacents, est corrélé à une propriété biologique de la protéine. [0178] Comme le détaille le brevet U.S. n° 4 554 101, les valeurs d'hydrophilie suivantes ont été attribuées aux résidus d'acides aminés : arginine (+3,0) ; lysine (+3,0) ; aspartate (+3,0 + 0,1) ; glutamate (+3,0 + 0,1) ; sérine (+0,3) ; asparagine (+0,2) ; glutamine (+0,2) ; glycine (0) ; thréonine (-0,4) ; proline (-0,5 + 0,1) ; alanine (-0,5) ; histidine (-0,5) ; cystéine (-1,0) ; méthionine (-1,3) ; valine (-1,5) ; leucine (-1,8) ; isoleucine (-1,8) ; tyrosine (-2,3) ; phénylalanine (-2,5) ; tryptophane (-3,4). [0179] Dans des modes de réalisation spécifiques, la substitution est une alanine pour l'acide aminé natif sur la/les position(s) indiquée(s). La/les séquence(s) d'acide nucléique codant pour la protéine ou le polypeptide variant(e) sont également englobés. [0180] Le terme « endogène » en référence à un polynucléotide ou une protéine désigne un polynucléotide ou une protéine qui est présent(e) à l'état naturel dans la cellule hôte. [0181] Telle qu'il est utilisé ici, le terme « expression » désigne le processus par lequel un polypeptide est produit sur la base de la séquence d'acide nucléique d'un gène. Le processus comprend à la fois la transcription et la traduction. [0182] Un « vecteur d'expression » tel qu'il est utilisé ici désigne une construction d'ADN comprenant une séquence d'ADN qui est liée fonctionnellement à une séquence de contrôle appropriée capable d'affecter l'expression de l'ADN dans un hôte approprié. Ces séquences de contrôle peuvent comprendre un promoteur pour effectuer la transcription, une séquence opératrice éventuelle pour contrôler la transcription, une séquence codant pour des sites de liaison aux ribosomes sur l'ARNm appropriés, des agents d'amplification et des séquences qui commandent la fin de la transcription et de la traduction. [0183] Des exemples de « systèmes d'expression » utilisés habituellement comprennent des systèmes recombinants de baculovirus, lentivirus, protozoires (par ex., le parasite eucaryote Leishmania tarentolae), des systèmes d'expression microbiens comprenant des systèmes à base de levures (par ex. Pichia Pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Yaerobia lipolytica, Hansenula polymorpha, Aspergillus et Trichoderma Fungi) et à base de bactéries (par ex. E. Coli, Pseudomonas fluorescens, Lactobacillus, Lactococcus, Bacillus megaterium, 41 Bacillus Subtilis, Brevibacillus, Corynebacterium glutamicum), des cellules d'ovaires de hamster de Chine (CHO), CHOK1SVNSO (Lonza), BHK (cellules rénales de bébé hamster), PerC.6 ou Per.C6 (e.g., Percivia, Crucell), différentes lignées de cellules HEK 293, Expi293FTM (Life Technologies), GenScript's YeastHIGH Tm Technology (GenScript), la lignée de cellules précurseurs neuronales humaines AGE1.HN (Probiogen) et d'autres cellules de mammifères, des cellules de plantes (par ex., maïs, alfalfa et tabac), des cellules d'insecte, des oeufs, des algues et des animaux transgéniques (par ex., souris, rats, chèvres, moutons, cochons, vaches). Les avantages et inconvénients de ces divers systèmes ont été passés en revue dans la littérature et sont connus de l'homme du métier. [0184] Un « gène » désigne un segment d'ADN qui est impliqué dans la production d'un polypeptide et comprend des régions précédant et suivant les régions codantes ainsi que les séquences intermédiaires (introns) entre des segments codants individuels (exons). [0185] Une « souche hôte » ou « cellule hôte » désigne un hôte approprié pour un vecteur d'expression ou une construction d'ADN comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide selon la description. Spécifiquement, les souches hôtes peuvent être des cellules bactériennes, des cellules de mammifères, des cellules d'insecte et d'autres systèmes de clonage ou « systèmes d'expression ». Dans un mode de réalisation de la description, une « cellule hôte » désigne à la fois les cellules et les protoplastes créés à partir des cellules d'une souche microbienne. On comprendra que ces termes sont destinés à désigner non seulement la cellule en question particulière mais la descendance de cette cellule.
Comme certaines modifications peuvent survenir dans les générations successives en raison de mutations ou d'influences environnementales, cette descendance peut en fait ne pas être identique à la cellule parente mais est toujours incluse dans le cadre de l'expression « cellule hôte » telle qu'utilisée ici. [0186] Le terme « hétérologue » en référence à un polynucléotide ou une protéine désigne un polynucléotide ou une protéine/un polypeptide qui n'est pas présent(e) à l'état naturel. Dans certains modes de réalisation, la protéine est une protéine industrielle importante d'un point de vue commercial. Il est prévu que le terme engloble des protéines qui sont codées par des gènes existant à l'état naturel, des gènes mutés et/ou des gènes synthétiques. 42 [0187] Un polynucléotide ou un polypeptide ayant un certain pourcentage (par ex., au moins 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 °/0) d'identité de séquence avec une autre séquence signifie, lorsqu'elles sont alignées, le pourcentage de bases ou de résidus d'acides aminés qui sont les mêmes lorsque l'on compare les deux séquences. Lorsqu'un pourcentage d'identité de séquence est utilisé en référence aux protéines, il est reconnu que les positions de résidus qui ne sont pas identiques diffèrent souvent par des substitutions d'acides aminés conservatives lorsque des résidus d'acides aminés sont remplacés par d'autres résidus d'acides aminés ayant des propriétés chimiques similaires (par ex., charge ou hydrophobie) et donc, ne modifient pas les propriétés fonctionnelles de la molécule. Lorsque les séquences diffèrent en termes de substitutions conservatives, le pourcentage d'identité de séquence peut être ajusté vers le haut pour corriger la nature conservative de la substitution et ce processus donne une « homologie de séquence » par ex. d'au moins 90 °/0, 91 °/(:), 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%. Les moyens pour réaliser cet ajustement sont bien connus dans l'art. Habituellement, cela comprend la détermination du score d'une substitution conservative comme étant partielle plutôt qu'un mésappariement total, ce qui augmente le pourcentage d'identité de séquence. Ainsi par exemple, lorsqu'on attribue à un acide aminé identique, un score de 1 et à une substitution non conservative, un score de zéro, une substitution conservative reçoit un score entre zéro et 1. La détermination du score des substitutions conservatives est calculée par ex., selon l'algorithme de Meyers et Miller, (1988) Computer Applic. Biol. Sci. 4: 11-17, par ex., tel que mis en application dans le programme PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Calif., USA). Cet alignement et le pourcentage d'homologie ou d'identité peut être déterminé en utilisant un logiciel approprié connu dans l'art, par exemple ceux décrits dans CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel et al. (eds) 1987, Supplément 30, paragraphe 7.7.18). Ces programmes peuvent comprendre le programme GCG Pileup, FASTA (Pearson et al. (1988) Proc. Natl, Acad. Sci USA 85: 2444-2448), et BLAST (BLAST Manual, Altschul et al., Nat'l Cent. Biotechnol. Inf., Natl Lib. Med. (NCIB NLM NIH), Bethesda, Md., et Altschul et al., (1997) NAR 25: 3389-3402). Un autre program d'alignement est ALIGN Plus (Scientific and Educational Software, Pa.), utilisant des paramètres par défaut. Un autre logiciel de séquences qui utilise le programme de recherche 43 3033 172 de données TFASTA est disponible dans le logiciel Sequence, Version 6.0 (Genetics Computer Group, Université du Wisconsin, Madison, Wis.). [0188] Le terme « introduit » dans le contexte de l'insertion d'une séquence d'acide nucléique dans une cellule, signifie « transfection », ou « transformation » 5 ou « transduction » et inclut une référence à l'incorporation d'une séquence d'acide nucléique dans une cellule eucaryote ou procaryote dans laquelle la séquence d'acide nucléique peut être incorporée dans le génome de la cellule (par ex., chromosome, plasmide, plastide ou ADN mitochondrial), converti en un réplicon autonome ou exprimé de façon provisoire (par ex., ARNm transfecté). 10 [0189] Telle qu'elle est utilisée ici, l'expression « séquence nucléotidique » ou « séquence d'acide nucléique » désigne une séquence d'oligonucléotide ou de polynucléotide et ses variants, homologues, fragments et dérivés. La séquence nucléotidique peut être d'origine génomique, synthétique ou recombinante et peut être double brin ou simple brin, représentant le brin sens ou anti-sens. Telle 15 qu'elle est utilisée ici, l'expression « séquence nucléotidique » comprend un ADN génomique, un ADNc, un ADN synthétique et un ARN. [0190] L'expression « acide nucléique » englobe un ADN, ADNc, ARN, des hétéroduplexes et des molécules synthétiques capables de coder pour un polypeptide. L'ARN comprend Les ARNm, ARN, ARNi, ARNsi, ARNc et ARN 20 autocatalytique. Les acides nucléiques peuvent être simple brin ou double brin et il peut y avoir des modifications chimiques. Les termes « acide nucléique » et « polynucléotide » sont utilisés de façon interchangeable. Comme le code génétique est dégénéré, plusieurs codons peuvent être utilisés pour coder pour un acide aminé particulier et les présentes compositions et procédés 25 comprennent des séquences nucléotidiques qui codent pour une séquence d'acides aminés particulière. Un acide nucléique comprend une séquence nucléotidique qui comprend habituellement des nucléotides comprenant une base A, G, C, T ou U. Toutefois, les séquences nucléotidiques peuvent comprendre d'autres bases telles que, de manière non restrictive, l'inosine, la méthylycytosine, 30 la méthylinosine, la méthyladénosine et/ou la thio-uridine, sans se limiter à celles- ci. [0191] L'homme du métier comprendra que les séquences d'acide nucléique englobées par la description sont également définies par la capacité à s'hybrider dans des conditions d'hybridation stringentes avec les séquences d'acide 44 nucléique codant pour les polypeptides cités en exemple. Un acide nucléique peut s'hybrider à une autre séquence d'acide nucléique lorsqu'une forme à brin simple de l'acide nucléique peut s'anneler à l'autre acide nucléique dans des conditions appropriées de température et de force ionique de la solution. Les conditions d'hybridation et de lavage sont bien connues dans l'art (Sambrook, et al. (Molecular cloning : a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory ; 4ème édition, 2012). Une hybridation dans des conditions hautement stringentes signifie que les conditions relatives à la température et la force ionique sont choisies de telle sorte qu'elles permettent à une hybridation d'être maintenue entre deux fragments d'ADN complémentaires. Sur une base purement illustrative, les conditions hautement stringentes de l'étape d'hybridation servant à définir les fragments de polynucléotide décrits ci-dessus sont avantageusement les suivantes. [0192] Une hybridation d'ADN-ADN ou d'ADN-ARN est réalisée en deux étapes : (1) préhybridation à 42 °C pendant trois heures dans un tampon phosphate (20 mM, pH 7,5) contenant 5 X SSC (1 X SSC correspond à une solution de 0,15 M NaCI + 0,015 M citrate de sodium), 50 % de formamide, 7 % de dodécylsulfate de sodium (SDS), 10 X solution de Denhardt, 5 % de sulfate de dextran et 1 % d'ADN de sperme de saumon ; (2) hybridation primaire pendant 20 heures à une température dépendant de la longueur de la sonde (à savoir : 42 °C pour une sonde >100 nucléotides de longueur) suivie de deux lavages de 20 minutes à 20 °C dans 2 X SSC + 2 % SDS, un lavage de 20 minutes à 20 °C dans 0,1 X SSC + 0,1 % SDS. Le dernier lavage est réalisé dans 0,1 X SSC + 0,1 % SDS pendant 30 minutes à 60 °C pour une sonde >100 nucléotides de longueur. Les conditions d'hybridation hautement stringentes décrites ci-dessus pour un polynucléotide de taille définie peuvent être adaptées par l'homme du métier pour des oligonucléotides plus longs ou plus courts, selon les procédures décrites par Sambrook, et al. (Molecular cloning : a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory ; 3ème édition, 2001). [0193] Les conditions stringentes peuvent également être obtenues avec l'addition d'agents déstabilisants tels que le formamide. [0194] L'expression « lié fonctionnellement » et ses variantes concernent la fusion chimique ou la liaison ou l'association d'une stabilité suffisante pour résister aux conditions rencontrées dans les procédés d'incorporation de nucléotides utilisés, 45 entre une combinaison de différents composés, molécules ou autres entités telles que, de manière non restrictive : entre une polymérase mutante et un groupement rapporteur (par ex., colorant fluorescent ou nanoparticle) ; entre un nucléotide et un groupement rapporteur (par ex., colorant fluorescent) ; ou entre un promoteur et une séquence codante, si elle commande la transcription de la séquence. [0195] Un « promoteur » est une séquence régulatrice qui est impliquée dans la liaison de l'ARN polymérase pour initier la transcription d'un gène. Le promoteur peut être un promoteur inductible ou un promoteur constitutif. Un exemple de promoteur utilisé ici est un promoteur T7 qui est un promoteur inductible. [0196] Une « étiquette périplasmique » ou une « séquence leader périplasmique » est une séquence d'acides aminés qui, lorsqu'elle est fixée à/présente sur la terminaison N d'une protéine/d'un peptide, dirige la protéine/le peptide vers le périplasme bactérien, où la séquence est souvent retirée par une peptidase signal. La sécrétion d'une protéine/un peptide dans le périplasme peut augmenter la stabilité des protéines/peptides exprimés de façon recombinante. Un exemple d'étiquette périplasmique décrit ici est présenté en tant que SEQ ID NO: 3. [0197] Le terme « recombinant », lorsqu'il est utilisé en référence à une cellule, un acide nucléique, une protéine ou un vecteur, indique que la cellule, l'acide nucléique, la protéine ou le vecteur a été modifié par l'introduction d'un « acide nucléique hétérologue » ou une protéine ou l'altération d'un acide nucléique ou d'une protéine natif/native, ou que la cellule provient d'une cellule ainsi modifiée. Ainsi par exemple, les cellules recombinantes expriment des gènes que l'on ne trouve pas dans la forme native (non recombinante) de la cellule ou expriment des gènes natifs qui sont par ailleurs exprimés de façon anormale, sous-exprimés ou pas du tout exprimés. [0198] Une « séquence signal » ou un « peptide signal » désigne une séquence d'acides aminés liée à la partie de la terminaison N d'une protéine, ce qui facilite la sécrétion de la forme mature de la protéine hors de la cellule. La définition d'une séquence signal est une séquence fonctionnelle. La forme mature de la protéine extracellulaire est dépourvue de la séquence signal qui est clivée pendant le processus de sécrétion. [0199] Un « marqueur sélectif » désigne un gène capable d'expression dans un hôte qui permet la sélection de ces hôtes contenant un acide nucléique ou un vecteur introduit. Des exemples de marqueurs sélectionnables comprennent, de 46 manière non restrictive, des antimicrobiens (par ex., hygromycine, bléomycine ou chloramphénicol) et/ou des gènes qui confèrent un avantage métabolique tel qu'un avantage nutritionnel à la cellule hôte. [0200] Une structure qui se « conforme substantiellement » à un groupe donné de coordonnées atomiques est une structure dans laquelle au moins environ 50 % de la structure a un RMSD de moins d'environ 1,5 ANG pour les atomes de squelette dans les éléments de structure secondaire dans chaque domaine, et de manière davantage préférée, moins d'environ 1,3 ANG pour les atomes de squelette dans les éléments de structure secondaire dans chaque domaine, et de manière davantage préférée, moins d'environ 1,0 ANG, moins d'environ 0,7 ANG, moins d'environ 0,5 ANG, et de manière préférée entre toutes, moins d'environ 0,3 ANG pour les atomes de squelette dans les éléments de structure secondaire dans chaque domaine. Dans un mode de réalisation davantage préféré, une structure qui se conforme substantiellement à un groupe donné de coordonnées atomiques est une structure dans laquelle au moins environ 75 % de la structure a la valeur RMSD indiquée et de manière davantage préférée, au moins environ 90 % de cette structure a la valeur RMSD indiquée et de manière préférée entre toutes, environ 100 % de cette structure a la valeur RMSD indiquée. [0201] Dans un mode de réalisation encore davantage préféré, la définition ci- dessus de « se conforme substantiellement » peut être étendue de façon à comprendre des atomes des chaînes latérales d'acides aminés. Telle qu'elle est utilisée ici, la phrase « chaînes latérales d'acides aminés communes » désigne des chaînes latérales d'acides aminés qui sont communes à la fois à la structure qui se conforme à un groupe donné de coordonnées atomiques et à la structure qui est effectivement représentée par ces coordonnées atomiques. [0202] L'expression « sous le contrôle transcriptionnel » est une expression bien comprise dans l'art qui indique que la transcription d'une séquence polynucléotidique, généralement une séquence d'ADN dépend du fait qu'elle est liée fonctionnellement à un élément qui contribue à l'initiation de la transcription ou la favorise. [0203] L'expression « sous le contrôle traductionnel » est une expression bien comprise dans l'art qui indique un processus de régulation qui survient après qu'un ARNm a été formé. 47 [0204] Telle qu'elle est utilisée ici, l'expression « cellule transformée » comprend des cellules qui ont été transformées ou transduites par l'utilisation de techniques d'ADN recombinant. La transformation s'effectue habituellement par insertion d'une ou plusieurs séquences nucléotidiques dans une cellule. La séquence nucléotidique insérée peut être une « séquence nucléotidique hétérologue », c'est-à-dire une séquence qui n'est pas naturelle pour la cellule qui doit être transformée, telle qu'une protéine de fusion. [0205] Tels qu'ils sont utilisés ici, les termes « transformée », « transformée de façon stable » et « transgénique » utilisés en référence à une cellule signifie que la cellule a une séquence d'acide nucléique non native (par ex., hétérologue) intégrée dans son génome ou en tant que plasmide épisomal qui est conservé sur de multiples générations. [0206] Des « variants » désignent à la fois des polypeptides et des acides nucléiques. Le terme « variant » peut être utilisé de façon interchangeable avec le terme « mutant ». Les variants comprennent des insertions, substitutions, transversions, troncatures et/ou inversions sur un ou plusieurs sites dans la séquence d'acides aminés ou la séquence nucléotidique, respectivement, d'une séquence parente. Les variants d'acides nucléiques peuvent comprendre des séquences qui sont complémentaires à des séquences qui sont capables de s'hybrider aux séquences nucléotidiques présentées ici. Par exemple, une séquence variante est complémentaire à des séquences capables de s'hybrider dans des conditions stringentes (par ex., 50 °C et 0,2 .X SSC (1 X SSC=0,15 M NaCI, 0,015 M de citrate de sodium, pH 7,0)) aux séquences nucléotidiques présentées ici. Plus particulièrement, le terme variant englobe des séquences qui sont complémentaires aux séquences qui sont capables de s'hybrider dans des conditions hautement stringentes (par ex., 65 °C et 0,1 X SSC) aux séquences nucléotidiques présentées ici. [0207] Le terme « vecteur » tel qu'il est utilisé ici, est destiné à désigner une molécule d'acide nucléique capable de transporter un autre acide nucléique auquel il a été lié. Un type de vecteur est un « plasmide » qui fait référence à une boucle d'ADN double brin circulaire dans laquelle des segments d'ADN supplémentaires peuvent être liés. Un autre type de vecteur est un vecteur viral dans lequel des segments d'ADN supplémentaires peuvent être liés dans le génome viral. Certains vecteurs sont capables de réplication autonome dans une 48 cellule hôte dans laquelle ils sont introduits (par ex., vecteurs bactériens ayant une origine de réplication bactérienne et des vecteurs épisomaux de mammifères). D'autres vecteurs (par ex., des vecteurs non épisomaux de mammifères) peuvent être intégrés dans le génome d'une cellule hôte par introduction dans la cellule hôte et sont ainsi répliqués avec le génome de l'hôte. En outre, certains vecteurs sont capables de diriger l'expression des gènes auxquels ils sont liés fonctionnellement. Ces vecteurs sont désignés ici « vecteurs d'expression recombinants » (ou simplement, « vecteurs d'expression »). En général, les vecteurs d'expression utiles dans les techniques d'ADN recombinant se présentent souvent sous la forme de plasmides. Dans la présente spécification, les termes « plasmide » et « vecteur » peuvent être utilisés de façon interchangeable car le plasmide est la forme de vecteur la plus fréquemment utilisée. Toutefois, les modes de réalisation revendiqués sont destinés à comprendre ces autres formes de vecteurs d'expression tels que des vecteurs viraux (par ex., des rétrovirus défectifs pour la réplication, des adénovirus et des virus adéno-associés) qui ont des fonctions équivalentes. Les vecteurs comprennent également des vecteurs de clonage, des vecteurs navettes, des plasmides, des particules de phage, des cassettes et autres. [0208] Nous ferons référence à présent en détail à divers modes de réalisation décrits. [0209] La découverte selon laquelle la cdLD est capable de catalyser la déshydratation du 3-butèn-2-ol en 1,3-butadiène est décrite ici. Les résultats positifs obtenus avec la cdLD pour la catalyse de cette réaction avec la compétence catalytique relativement faible présentée par cette enzyme de type sauvage (WT) ont entraîné plusieurs tentatives d'amélioration de l'activité de la cdLD. Une structure cristalline ou un modèle d'homologie est une aide significative pour l'optimisation de l'enzyme. Toutefois, une recherche deltaBLAST dans la base de données des séquences de protéine de la Protein Data Bank (PDB) a révélé que la cdLD ne présente pas d'homologie détectable avec une séquence quelconque pour laquelle un modèle structural est disponible. En conséquence, la présente description dévoile également la structure cristalline de l'apo cdLD, élucidée ici par cristallographie aux rayons X. Des cristaux d'apo cdLD purifiés ont été obtenus, la structure tridimensionnelle de cette enzyme a été élucidée pour la première fois et les résultats ont été confirmés de façon 49 3033 172 indépendante. Une structure apo de cdLD a ensuite été affinée avec succès à 2,54 A avec une valeur R de R=21,6 ()/0 et Ribre=26,9 %. Les détails de cette procédure peuvent être trouvés dans la partie Exemples de la présente description. 5 [0210] La présente description a élucidé plusieurs domaines dans la cdLD. La cdLD a cristallisé dans un groupe spatial P21. La cdLD adopte une disposition pentamérique présentant une symétrie axiale de facteur 5 dans l'unité asymétrique (chaîne marquée A à E). Chaque monomère adopte un repliement en tonneau 0/0(6), un repliement relativement inhabituel que l'on peut voir sur la 10 Figure 1. Un élément apparent et notable dans la structure cristalline est qu'un pont disulfure est formé entre Cys74 et Cys127 de chaque sous-unité (numération de la structure cristalline). Une recherche de l'homologie structurale à l'aide du programme DALI donne divers homologues structuraux. L'alignement structural entre cdLD monomère et certains des candidats de DALI révèle que les enzymes 15 qui sont structurellement homologues à cdLD ont tous leurs sites actifs au « haut » du tonneau avec les résidus catalytiques soutenus par les hélices internes qui revêtent l'intérieur du tonneau (hélices 4, 7, 9, 11, 13, 14) et les boucles reliant ces hélices aux hélices externes du tonneau. Conformément aux autres enzymes qui adoptent un repliement similaire, cdLD présente une fente 20 marquée dans cette même région alors que le reste de la sous-unité est complètement exposé au solvant de façon étroitement compacte. Par conséquent, nous avons émis l'hypothèse selon laquelle la position probable du site actif de la cdLD responsable de l'activité catalytique observée est située dans cette région. Contrairement à la plupart des homologues structuraux de cdLD, ce 25 site actif hypothétique est formé à l'interface entre des sous-unités, par exemple, A et B sur la FIGURE 1. La boucle 62-77 (numérotation de la structure cristalline) de la sous-unité B dépasse et ferme la poche formée par le haut du tonneau de la sous-unité A, voir la FIGURE 2. [0211] L'élucidation des données de structure cristalline de cdLD permet de mieux 30 comprendre l'activité enzymatique de la cdLD et la conception intelligente de nombreuses améliorations de celle-ci ainsi que le développement de divers composés qui font office de substrats ou d'inhibiteurs de la cdLD ou des polypeptides décrits ici. 50 3033 172 [0212] Dans un mode de réalisation, la description a identifié les résidus catalytiques de la cdLD. En conséquence, la description propose des composés qui se lient au site catalytique de la cdLD et qui sont identifiés en utilisant les données structurales décrites ici et/ou un procédé approprié quelconque décrit ici. 5 Les composés candidats identifiés en utilisant les données structurales décrites ici peuvent être tout composé approprié, comprenant les composés existants à l'état naturel, les composés conçus de novo, les composés générés à partir d'une banque, des agents imitant le 3-butane-2-01 (3B20) et des analogues de ceux-ci et comprennent des composés organiques, de nouvelles entités chimiques, entre 10 autres. [0213] L'homme du métier peut utiliser l'un des multiples procédés permettant de cribler des entités (qu'elles soient chimiques ou protéines) pour leur capacité à s'associer avec la cdLD ou les polypeptides décrits ici. Des logiciels spécialisés peuvent également aider au processus de sélection des entités. Ceux-ci 15 comprennent : GRID (Goodford, « A Computational Procedure for Determining Energetically Favorable Binding Sites on Biologically Important Macromolécules », J. Med. Chem., 28, pp. 849-857 (1985)). GRID est disponible auprès d'Oxford University, Oxford, UK ; MCSS (Miranker et al., « Functionality. Maps of Binding Sites: A Multiple Copy Simultaneous Search Method. » Proteins: Structure, 20 Function and Genetics, 11, pp. 29-34 (1991)). MCSS est disponible auprès de Molecular Simulations, San Diego, Calif. ; AUTODOCK (Goodsell et al., « Automated Docking of Substrates to Proteins by Simulated Annealing », Proteins: Structure, Function, and Genetics, 8, pp. 195-202 (1990)). AUTODOCK est disponible auprès de Scripps Research Institute, La Jolla, Calif. ; & DOCK 25 (Kuntz et al., « A Geometric Approach to Macromolecule-Ligand Interactions », J. Mol. Biol., 161, pp. 269-288 (1982)). DOCK est disponible auprès de l'Université de Californie, San Francisco, Calif. [0214] Dans un autre mode de réalisation, la description concerne un procédé de synthèse ou d'obtention d'un composé candidat conçu ou criblé pour la liaison à 30 cdLD ou l'un des polypeptides décrits ici puis la détermination de la capacité du composé candidat à interagir avec l'une quelconque de ces protéines. [0215] Dans un autre mode de réalisation, la description concerne les sous-groupes des coordonnées atomiques énumérées dans l'Annexe I et les sous-groupes qui se conforment substantiellement à celles-ci. Les sous-groupes 51 3033 172 préférés définissent une ou plusieurs régions de cdLD choisies parmi celles énumérées dans le Tableau 3 et la FIGURE 3. [0216] La présente invention fournit également des sous-groupes des coordonnées atomiques énumérées dans l'Annexe I. Les coordonnées 5 mentionnées ici comprennent les coordonnées cartésiennes dérivées des équations mathématiques associées aux schémas obtenus sur la diffraction d'un faisceau monochromatique de rayons X par les atomes d'une protéine ou d'un complexe de protéines sous forme cristalline. Les données de diffraction sont utilisées pour calculer une carte de densité électronique des motifs répétitifs du 10 cristal. Les cartes de densité électronique sont ensuite utilisées pour établir les positions des atomes individuels de la molécule ou du complexe moléculaire. Dans un mode de réalisation est fourni un support de stockage de données lisible sur une machine, comprenant un matériau de stockage de données codé avec des données lisibles par une machine qui, lorsqu'il est utilisé par une machine 15 programmée avec des instructions pour utiliser lesdites données, affiche une représentation graphique tridimensionnelle comprenant une cdLD ou un polypeptide décrit ici. [0217] On comprendra qu'un groupe de coordonnées structurelles pour un polypeptide est un groupe de points relatifs qui définissent une forme en trois 20 dimensions. Il est donc possible qu'un groupe de coordonnées entièrement différentes puissent définir une forme similaire ou identique. En outre, de légères variations dans les coordonnées individuelles auront peu d'effet sur la forme globale. Ces groupes de coordonnées sont également des modes de réalisation dans le cadre de la présente description. 25 [0218] Les variations des coordonnées peuvent être générées grâce à des manipulations mathématiques des coordonnées structurelles. Par exemple, les coordonnées structurelles définies dans l'Annexe I pourraient être manipulées par des permutations cristallographiques des coordonnées structurelles, un fractionnement des coordonnées structurelles, des additions ou soustractions de 30 nombres entiers aux groupes de coordonnées structurelles, une inversion des coordonnées structurelles ou toute combinaison de ceux-ci. [0219] En variante, une modification de la structure cristalline due à des mutations, additions, substitutions, et/ou délétions d'acides aminés ou d'autres changements dans l'un quelconque des composants qui constituent le cristal 52 pourrait également constituer des variations dans les coordonnées structurelles. Ces variants sont également des modes de réalisation dans le cadre de la présente description. [0220] Dans un mode de réalisation, les coordonnées structurelles définies ici peuvent également être utilisées pour aider à obtenir des informations structurales sur une autre molécule cristallisée ou un complexe moléculaire. On peut y parvenir par l'une quelconque des nombreuses techniques bien connues, comprenant le remplacement moléculaire. Par exemple, un procédé est également proposé pour utiliser le remplacement moléculaire afin d'obtenir des informations structurales sur une protéine dont la structure est inconnue, comprenant les étapes de : génération d'un schéma de diffraction des rayons X d'un cristal de la protéine dont la structure est inconnue ; génération d'une carte de densité électronique tridimensionnelle de la protéine dont la structure est inconnue du schéma de diffraction des rayons X en utilisant au moins une partie des coordonnées structurelles définies ici comme un modèle de remplacement moléculaire. [0221] En utilisant le remplacement moléculaire, tout ou partie des coordonnées structurales de cdLD fournies par la présente description (et définies sur les figures en annexe) peuvent être utilisées pour déterminer la structure d'une autre molécule cristallisée ou d'un autre complexe moléculaire plus rapidement et efficacement qu'en essayant de déterminer la structure initialement. Une utilisation particulière comprend l'utilisation avec d'autres protéines structurellement similaires. Le remplacement moléculaire assure une estimation précise des phases d'une structure inconnue. Les phases sont un facteur dans les équations utilisées pour résoudre les structures cristallines qui ne peuvent pas être déterminées directement. L'obtention de valeurs précises pour les phases, par des procédés autres que le remplacement moléculaire est un processus qui prend du temps et implique des cycles itératifs d'approximations et d'affinement et gêne largement la solution des structures cristallines. Toutefois, lorsque la structure cristalline d'une protéine contenant au moins une partie homologue a été résolue, les phases de la structure connue assurent une estimation satisfaisante des phases pour la structure inconnue. Par conséquent, ce procédé comprend la génération d'un modèle préliminaire d'une molécule ou d'un complexe moléculaire dont les coordonnées structurelles sont inconnues, en orientant et positionnant la 53 partie pertinente de la cdLD selon les figures jointes dans la cellule unitaire du cristal de la molécule ou du complexe moléculaire inconnu pour mieux prendre en compte le schéma de diffraction de rayons X observé du cristal de la molécule ou du complexe moléculaire dont la structure est inconnue. Les phases peuvent alors être calculées à partir de ce modèle et combinées avec les amplitudes de schéma de diffractions de rayons X observées pour générer une carte de densité électronique de la structure dont les coordonnées sont inconnues. Celle-ci peut elle-même être soumise à l'élaboration d'un modèle bien connu et des techniques d'affinement de structure pour donner une structure finale précise de la molécule cristallisée ou du complexe moléculaire inconnus (Lattman, « Use of the Rotation and Translation Functions », dans Meth. Enzymol., 115, pp. 55-77 (1985) ; Rossmann, éd., « The Molecular Replacement Method », Int. Sci. Rev. Ser., N° 13, Gordon & Breach, New York (1972)). [0222] Les coordonnées structurelles de la cdLD telles que fournies par la présente description sont utiles pour résoudre la structure des polypeptides qui présentent des substitutions, additions et/ou délétions d'acides aminés par rapport à la cdLD présente à l'état naturel. Ces polypeptides peuvent éventuellement être cristallisés dans un co-complexe avec un ligand, tel qu'un inhibiteur ou un analogue de substrat. Les structures cristallines d'une série de ces complexes peuvent ensuite être résolues par remplacement moléculaire et comparées à celles de la cdLD. Les sites potentiels de modification dans les divers sites de liaison de l'enzyme peuvent ensuite être identifiés. Cette information fournit un outil supplémentaire pour déterminer les interactions de liaison les plus efficaces, telles que par exemple, des interactions hydrophobes accrues entre cdLD et un ligand. Il est à noter que le ligand peut être le ligand naturel de la protéine ou peut être un substrat ou un inhibiteur potentiel de la protéine. [0223] Dans la présente description et les revendications, les polypeptides nouvellement décrits qui présentent une activité accrue dans la catalyse de la déshydratation du 3-butèn-2-ol en 1,3-butadiène et/ou dans la catalyse du 3- méthy1-3-butèn-2-ol en isoprène sont décrits et revendiqués. Dans certains modes de réalisation, ledit accroissement peut être observé in vivo. Dans d'autres modes de réalisation, ledit accroissement peut être observé dans le polypeptide purifié, auquel cas l'accroissement désigne un accroissement de l'activité spécifique. Dans certains modes de réalisation, il est prévu que les polypeptides améliorés 54 présentent ladite activité accrue, qu'ils aient ou non une étiquette périplasmique et/ou une étiquette poly-His C-terminal. Dans d'autres modes de réalisation, il est également envisagé que les polypeptides améliorés présentent une activité accrue par rapport à cdLD de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8. On comprendra que des variants modifiés de façon conservative des polypeptides spécifiés ici entrent également dans le cadre de la présente description. [0224] Ci-après est présentée la relation entre des mutations qui peuvent être présentes dans les polypeptides décrits ici et des modifications souhaitables des propriétés (par rapport à celles du polypeptide de type sauvage de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8). [0225] Activité améliorée in vivo dans la catalyse de la déshydratation du 3-butèn2-01 en 1,3-butadiène [0226] Certains modes de réalisation fournissent des polypeptides présentant une activité améliorée dans la catalyse de la déshydratation du 3-butèn-2-ol en 1,3- butadiène, par rapport au polypeptide de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8. L'activité améliorée dans la catalyse de la déshydratation du 3-butèn-2-ol en 1,3-butadiène peut être mesurée par tout procédé connu de l'homme du métier. Dans un mode de réalisation, l'activité améliorée dans la catalyse de la déshydratation du 3- butèn-2-ol en 1,3-butadiène d'un polypeptide décrit ici désigne une activité accrue dans la catalyse de la déshydratation du 3-butèn-2-ol en 1,3-butadiène d'une culture de cellules bactériennes exprimant ledit polypeptide, par rapport à un extrait de cellule bactérienne exprimant un polypeptide de type sauvage de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8. [0227] Dans certains modes de réalisation, l'activité dans la catalyse de la déshydratation du 3-butèn-2-ol en 1,3-butadiène est d'au moins 80 % de celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8, accrue d'un facteur 1,5 environ ou supérieur par rapport à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8, de préférence, d'un facteur 2 environ ou supérieur par rapport à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8 ; de préférence d'un facteur 2,5 environ ou supérieur par rapport à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8, de préférence, d'un facteur 3 environ ou supérieur par rapport à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1, 4, 7 ou 8, de préférence, d'un facteur 3,5 environ ou supérieur par rapport à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8, de préférence, d'un facteur 4 55 environ ou supérieur par rapport à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8, de préférence, d'un facteur 4,5 environ ou supérieur par rapport à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8, ou de préférence, d'un facteur 5 environ ou supérieur par rapport à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8, et l'activité étant observée dans au moins un essai d'activité. [0228] Dans certains modes de réalisation, l'accroissement dans la catalyse de la déshydratation du 3-butèn-2-ol en 1,3-butadiène est observé dans au moins un type de cellules non bactériennes exprimant un polypeptide de SEQ ID NO: 1,4, 5, 7 ou 8. Dans certains modes de réalisation, l'accroissement dans la catalyse de la déshydratation du 3-butèn-2-ol en 1,3-butadiène est observée dans au moins un type de bactérie. Dans certains modes de réalisation, l'accroissement dans la catalyse de la déshydratation du 3-butèn-2-ol en 1,3-butadiène est observé dans plus d'un type de bactérie. Dans certains modes de réalisation, les bactéries sont une souche d'E. Coll. Dans certains modes de réalisation, les bactéries sont Origami2(DE3). Dans certains modes de réalisation, les bactéries sont BL21 (DE3). [0229] Activité spécifique améliorée dans la catalyse de la déshydratation du 3- butèn-2-ol en 1,3-butadiène [0230] Certains modes de réalisation fournissent des polypeptides présentant une activité spécifique améliorée dans la catalyse de la déshydratation du 3-butèn-2-ol en 1,3-butadiène, par rapport au polypeptide de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8. L'activité spécifique améliorée dans la catalyse de la déshydratation du 3-butèn-2- ol en 1,3-butadiène peut être mesurée par tout procédé connu de l'homme du métier. Dans un mode de réalisation, l'activité spécifique améliorée dans la catalyse de la déshydratation du 3-butèn-2-ol en 1,3-butadiène d'un polypeptide décrit ici désigne une activité spécifique accrue dans la catalyse de la déshydratation du 3-butèn-2-ol en 1,3-butadiène du polypeptide purifié, par rapport à celle du polypeptide purifié de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8. [0231] Dans certains modes de réalisation, l'activité spécifique dans la catalyse de la déshydratation du 3-butèn-2-ol en 1,3-butadiène est d'au moins 80 % de celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8, accrue d'un facteur 1,5 environ ou supérieur par rapport à celle d'un polypeptide consistant en SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8, de préférence, d'un facteur 2 environ ou supérieur par rapport 56 à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8; de préférence d'un facteur 2,5 environ ou supérieur par rapport à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8 : de préférence, d'un facteur 3 environ ou supérieur par rapport à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8, de préférence, d'un facteur 3,5 environ ou supérieur par rapport à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8, de préférence, d'un facteur 4 environ ou supérieur par rapport à celle d'un polypeptide consistant en SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8, de préférence, d'un facteur 4,5 environ ou supérieur par rapport à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8, ou de préférence, d'un facteur 5 environ ou supérieur par rapport à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8, et l'activité étant observée dans au moins un essai d'activité spécifique. [0232] Dans certains modes de réalisation, l'accroissement dans la catalyse de la déshydratation du 3-butèn-2-ol en 1,3-butadiène est observé dans des polypeptides purifiés à partir d'au moins un type de cellules non bactériennes exprimant un polypeptide de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7, ou 8. Dans certains modes de réalisation, l'accroissement dans la catalyse de la déshydratation du 3-butèn-2-ol en 1,3-butadiène est observée dans des polypeptides purifiés à partir d'au moins un type de bactérie. Dans certains modes de réalisation, l'accroissement dans la catalyse de la déshydratation du 3-butèn-2-ol en 1,3-butadiène est observé dans des polypeptides purifiés à partir de plus d'un type de bactérie. Dans certains modes de réalisation, les bactéries sont une souche d'E. coli. Dans certains modes de réalisation, les bactéries sont Origami2(DE3). Dans certains modes de réalisation, les bactéries sont BL21 (DE3). [0233] On comprendra que des modes de réalisation supplémentaires englobent des polypeptides lorsqu'il peut être avantageux d'introduire des mutations ponctuelles supplémentaires (par ex., des délétions, insertions, inversions, substitutions) dans l'un quelconque des polypeptides décrits ici. [0234] L'un quelconque des polypeptides décrits ici peut contenir ou être dépourvu d'une étiquette périplasmique N-terminale. Dans certains modes de réalisation, l'étiquette périplasmique (SEQ ID NO: 3) est la séquence soulignée dans la protéine de SEQ ID NO: 1. Dans un mode de réalisation, le polypeptide peut contenir une étiquette C-terminale. Dans certains modes de réalisation, l'étiquette C-terminale est une étiquette poly-histidine constituée de six histidines 57 (SEQ ID NO: 10), avec ou sans acides aminés supplémentaires, tels que dans SEQ ID NO: 4 et 5. Dans certains modes de réalisation, le polypeptide contient à la fois une étiquette périplasmique et une étiquette C-terminale. Dans certains modes de réalisation, le polypeptide contient uniquement une étiquette périplasmique. Dans certains modes de réalisation, le polypeptide contient une étiquette C-terminale. Dans l'un quelconque de ces modes de réalisation, l'étiquetteC-terminale peut être une étiquette poly-histidine. Dans certains modes de réalisation, l'étiquette C-terminale est celle de SEQ ID NO: 6. [0235] Dans un mode de réalisation, la séquence d'acides aminés du polypeptide est celle de l'un quelconque des polypeptides énumérés dans la liste de séquences dans la partie Exemples. Dans des modes de réalisation apparentés, le polypeptide est dépourvu de l'étiquette poly-His. Dans des modes de réalisation apparentés, le polypeptide est dépourvu de l'étiquette périplasmique. Dans des modes de réalisation apparentés, le polypeptide est dépourvu de l'étiquette périplasmique et de l'étiquette poly-His qui peut être celle de SEQ ID NO: 6 ou juste HHHHHH (His6) (SEQ ID NO: 10). [0236] Des dérivés des polypeptides décrits ici sont également fournis. [0237] Dans un mode de réalisation, les polypeptides dérivés sont des polypeptides qui ont été modifiés, par exemple par conjugaison ou formation de complexes avec d'autres fractions chimiques, par une modification posttraductionnelle (par ex. phosphorylation, acétylation et autres), une modification de la glycosylation (par ex. addition, retrait ou modification de la glycosylation), et/ou l'inclusion/la substitution de séquences d'acides aminés supplémentaires comme on le comprend dans l'art. [0238] Des séquences d'acides aminés supplémentaires peuvent comprendre des séquences d'acides aminés partenaires de fusion qui créent une protéine de fusion. A titre d'exemple, les séquences d'acides aminés partenaires de fusion peuvent aider à la détection et/ou la purification de la protéine de fusion isolée. Les exemples non restrictifs comprennent les partenaires de fusion se liant au métal (par ex. poly-histidine), la protéine se liant au maltose (MBP), la protéine A, la glutathion S-transférase (GST), les séquences de protéines fluorescentes (par ex. GFP), les étiquettes épitopes telles que myc, FLAC et les étiquettes hémagglutinine. 58 [0239] D'autres dérivés envisagés par les modes de réalisation incluent, de manière non restrictive, une modification des chaînes latérales, l'incorporation d'acides aminés non naturels et/ou leurs dérivés pendant la synthèse du peptide ou de la protéine et l'utilisation d'agents de réticulation et d'autres procédés qui imposent des contraintes conformationnelles sur les polypeptides et fragments décrits. [0240] Les modes de réalisation englobent également des molécules d'acide nucléique codant pour des parents des polypeptides décrits. Le terme « parent » des séquences d'acide nucléique codant pour le polypeptide décrit comprend les séquences qui codent pour les polypeptides décrits ici mais qui diffèrent de façon conservative en raison de la dégénérescence du code génétique. Les polypeptides alléliques qui se développent ultérieurement par culture peuvent être identifiés en utilisant des techniques de biologie moléculaire bien connues, telles que la réaction de polymérase en chaîne (PCR) et des techniques d'hybridation telles qu'indiquées ci-dessous. Les séquences d'acide nucléique parentes comprennent également des séquences d'acide nucléique obtenues de façon synthétique qui ont été générées, par exemple, en utilisation la mutagénèse dirigée mais qui codent toujours pour les polypeptides décrits. [0241] L'homme du métier comprendra en outre que des changements peuvent être introduits par mutation des séquences d'acide nucléique entraînant ainsi des changements dans la séquence d'acides aminés des polypeptides codés, sans modifier l'activité biologique des protéines. Par conséquent, des molécules d'acide nucléique parentes peuvent être créées en introduisant une ou plusieurs substitutions de nucléotide, additions de nucléotide et/ou délétions de nucléotide dans la séquence d'acide nucléique correspondante décrite ici, de sorte qu'une ou plusieurs substitutions d'acides aminés, additions d'acides aminés ou délétions d'acides aminés soient introduites dans la protéine codée. Des mutations peuvent être introduites par des techniques standard telles que la mutagénèse dirigée et la mutagénèse médiée par PCR. Ces séquences d'acide nucléique parentes sont également englobées dans les présents modes de réalisation. [0242] Alternativement, des variants de séquences d'acide nucléique peuvent être produits en introduisant des mutations de façon aléatoire dans tout ou partie de la séquence codante, par ex. par mutagenèse par saturation et les mutants obtenus peuvent être criblés pour déterminer la capacité à conférer une activité 59 accrue ou une activité spécifique accrue dans la catalyse de la déshydratation du 3-butèn-2-ol en 1,3-butadiène pour identifier des mutants qui conservent l'activité accrue des polypeptides décrits ici. Après la mutagénèse, la protéine codée peut être exprimée de façon recombinante et l'activité de la protéine peut être déterminée en utilisant des techniques d'essai standard, comprenant celles décrites ici. [0243] Acide nucléiques [0244] Avec les polypeptides décrits ici et leur séquence d'acides aminés telle que décrite ici, l'homme du métier peut déterminer des polynucléotides appropriés qui codent pour ces polypeptides. L'homme du métier comprendra rapidement que compte tenu de la dégénérescence du code génétique, il existe de multiples séquences nucléotidiques codant pour les polypeptides décrits ici. La séquence du gène du polynucléotide peut être déduite d'une séquence polypeptidique par l'utilisation du code génétique. Des logiciels tels que « BackTranslate » (GCGTM Package, Acclerys, Inc. San Diego, Calif.) peuvent être utilisés pour convertir une séquence de peptide en la séquence nucléotidique correspondante codant pour le peptide. En outre, des variants synthétiques des séquences polynucléotidiques codant pour les polypeptides décrits ici peuvent être conçues de façon à être exprimées dans un type de cellule quelconque, procaryote ou eucaryote. [0245] En conséquence, certains modes de réalisation concernent des polynucléotides comprenant ou essentiellement constitués d'une séquence d'acide nucléique codant pour un polypeptide tel que décrit ci-dessus et dans d'autres parties du présent document. Dans certains modes de réalisation, la séquence d'acide nucléique est une séquence d'ADN (par ex., une séquence d'ADNc). Dans d'autres modes de réalisation, la séquence d'acide nucléique est une séquence d'ARN. Dans certains modes de réalisation, l'acide nucléique est un ADNc codant pour l'un quelconque des polypeptides décrits ici. Les séquences nucléotidiques codant pour le polypeptide peuvent être préparées par toute technologie appropriée bien connue de l'homme du métier, incluant, de manière non restrictive, une technologie d'ADN recombinant et une synthèse chimique. Les polynucléotides synthétiques peuvent être préparés par des synthétiseurs de polynucléotides automatiques disponibles dans le commerce. [0246] Un aspect concerne des molécules d'acide nucléique isolées ou recombinantes comprenant des séquences d'acide nucléique codant pour les 60 polypeptides décrits ici ou des parties biologiquement actives de celles-ci, ainsi que des molécules d'acide nucléique suffisantes pour être utilisées comme sondes d'hybridation pour identifier des molécules d'acide nucléiques codant pour des protéines présentant des régions d'homologie de séquence avec les polypeptides décrits ici. Les molécules d'acide nucléique qui sont des fragments de ces séquences d'acide nucléique codant pour des polypeptides sont également englobées dans les modes de réalisation. Un « fragment » désigne une partie de la séquence d'acide nucléique codant pour une partie d'un polypeptide. Dans certains modes de réalisation, un fragment de séquence d'acide nucléique peut coder pour une partie biologiquement active d'un polypeptide ou il peut être un fragment qui peut être utilisés comme sonde d'hybridation ou une amorce de PCR en utilisant des procédés bien connus de l'homme du métier. [0247] Dans certains modes de réalisation, l'acide nucléique a été soumis à une optimisation de codon pour l'expression de l'un quelconque des polypeptides décrits ici. [0248] Dans d'autres modes de réalisation, l'acide nucléique est une sonde qui peut être un oligonucléotide ou un polynucléotide simple brin ou double brin, marqué de façon appropriée afin de détecter des séquences complémentaires de polynucléotides codant pour les polypeptides décrits ici tels que dans des puces, ou une technique de Northern blot ou Southern blot. Les procédés de détection d'acides nucléiques marqués hybridés à un acide nucléique immobilisé sont bien connus de l'homme du métier. Ces procédés comprennent l'autoradiographie, la détection par chimioluminescence, fluorescence et colorimétrie. [0249] Dans certains modes de réalisation, le polynucléotide comprend une séquence codant pour l'un des polypeptides décrits ici, liée fonctionnellement à une séquence promoteur. Les promoteurs constitutifs ou inductibles connus dans l'art sont envisagés dans ce document. Les promoteurs peuvent être des promoteurs existant à l'état naturel ou des promoteurs hybrides qui associent des éléments de plusieurs promoteurs. Les exemples non restrictifs de promoteurs comprennent les promoteurs SV40, cytomégalovirus (CMV) et HIV-1 LTR. [0250] Dans certains modes de réalisation, le polynucléotide comprend une séquence codant pour l'un quelconque des polypeptides décrits ici, liée fonctionnellement à une séquence codant pour une autre protéine qui peut être 61 une protéine de fusion ou une autre protéine séparée par un segment de liaison. Dans certains modes de réalisation, le segment de liaison a un site de clivage de protéase tel que le facteur Xa ou la thrombine, qui permettent à la protéase en question de digérer partiellement le polypeptide de fusion décrit ici et ainsi, de libérer de celui-ci le polypeptide recombinant. Le polypeptide libéré peut ensuite être isolé du partenaire de fusion, par exemple, par séparation chromatographique consécutive. Dans certains modes de réalisation, le polynucléotide comprend une séquence codant pour l'un quelconque des polypeptides décrits ici, liée fonctionnellement à la fois à un promoteur et à une protéine de fusion. [0251] Certains autres modes de réalisation fournissent des constructions génétiques sous la forme de, ou comprenant des composants génétiques d'un plasmide, d'un bactériophage, d'un cosmide, d'une levure ou du chromosome artificiel d'une bactérie, comme on le comprendra dans l'art. Les constructions génétiques peuvent être appropriées pour la conservation et la propagation de l'acide nucléique isolé dans des bactéries ou d'autres cellules hôtes, pour la manipulation par la technologie de l'ADN recombinant et/ou l'expression (vecteurs d'expression) de l'acide nucléique ou d'un polypeptide codé tel que décrit ici. [0252] Certains autres modes de réalisation concernent des vecteurs d'expression recombinants comprenant une séquence d'ADN codant pour un ou plusieurs des polypeptides décrits ici. Dans certains modes de réalisation, le vecteur d'expression comprend une ou plusieurs desdites séquences d'ADN liées fonctionnement à un promoteur. De façon appropriée, le vecteur d'expression comprend l'acide nucléique codant pour l'un des polypeptides décrits ici, lié fonctionnellement à une ou plusieurs séquences supplémentaires. Dans certains modes de réalisation, le vecteur d'expression peut être un vecteur extra-chromosomique auto-répliquant tel qu'un plasmide ou un vecteur qui s'intègre dans un génome hôte. Des exemples non restrictifs de vecteurs d'expression viraux comprennent les vecteurs adénoviraux, les vecteurs de virus adéno- associés, les vecteurs de virus de l'herpès, les vecteurs rétroviraux, les vecteurs lentiviraux et autres. Par exemple, les vecteurs adénoviraux peuvent être des vecteurs adénoviraux de première, deuxième, troisième et/ou quatrième génération ou des vecteurs adénoviraux « gutless » (« vidés »). Des vecteurs adénoviraux peuvent être générés à des titres très élevés de particules 62 infectieuses, infecter une grande diversité de cellules, transférer efficacement des gènes à des cellules qui ne se divisent pas et sont rarement intégrés dans le génome de l'hôte, ce qui évite le risque de transformation cellulaire par mutagenèse par insertion. Le vecteur peut comprendre en outre des séquences flanquant le polynucléotide donnant un ARN qui comprend des séquences homologues aux séquences génomiques eucaryotes ou génomiques virales. Ceci permet l'introduction des polynucléotides décrits ici dans le génome d'une cellule hôte. [0253] Un vecteur de clonage intégratif peut être intégré de façon aléatoire ou sur un locus cible prédéterminé dans le/les chromosome(s) de la cellule hôte dans laquelle il doit être intégré. [0254] Des modes de réalisation spécifiques de vecteurs d'expression peuvent être trouvés à d'autres endroits de la présente description (voir ci-dessous). [0255] Certains autres modes de réalisation concernent des cellules hôtes comprenant une molécule d'ADN codant pour un polypeptide tel que décrit ici. Dans certains modes de réalisation, ces cellules hôtes peuvent être décrites comme des systèmes d'expression. Les cellules hôtes appropriées pour l'expression peuvent être des cellules procaryotes ou eucaryotes. De manière non restrictive, les cellules hôtes appropriées peuvent être des cellules de mammifères (par ex. cellules HeLa, HEK293T, Jurkat), des cellules de levure (par ex. Saccharomyces cerevisiae), des cellules d'insecte (par ex. Sf9, Trichoplusia ni) utilisées avec ou sans système d'expression de baculovirus ou des cellules bactériennes telles qu'E. cou/ (Origami2(DE3), BL21(DE3)) ou un virus hôte Vaccinia. L'introduction de constructions génétiques dans des cellules hôtes (qu'elles soient procaryotes ou eucaryotes) est bien connue dans l'art, comme le décrit par exemple Current Protocols in Molecular Biology Eds. Ausubel et al., (John Wiley & Sons, Inc. current update July 02, 2014). [0256] Un autre mode de réalisation concerne un organisme transformé ou transduit tel qu'un organisme choisi parmi des cellules de plante et d'insecte, des bactéries, levures, baculovirus, protozoaires, nématodes, algues et mammifères transgéniques (souris, rats, cochons, etc.). L'organisme transformé comprend une molécule d'ADN des modes de réalisation, une cassette d'expression comprenant la molécule d'ADN ou un vecteur comprenant la cassette d'expression qui peut être incorporée de façon stable dans le génome de l'organisme transformé. 63 [0257] Procédés de préparation des polypeptides [0258] Les polypeptides décrits ici (incluant des fragments et des dérivés) peuvent être préparés par toute procédure appropriée connue de l'homme du métier. Dans certains modes de réalisation, la protéine est une protéine recombinante. [0259] A titre d'exemple uniquement, un polypeptide recombinant peut être produit par un procédé comprenant les étapes de : (i) préparation d'une construction d'expression qui comprend un acide nucléique exprimant un ou plusieurs des polypeptides décrits ici, lié fonctionnellement à une ou plusieurs séquences nucléotidiques régulatrices ; (ii) transfection ou transformation d'une cellule hôte appropriée avec la construction d'expression ; (iii) expression d'un polypeptide/protéine recombinant(e) dans ladite cellule hôte ; et (iv) isolement du polypeptide/de la protéine recombinant(e) à partir de ladite cellule hôte ou en utilisant la cellule hôte obtenue telle quelle ou comme extrait cellulaire. [0260] Plusieurs procédés d'introduction de mutations dans des gènes, ADNc et autres polynucléotides sont connus dans l'art, comprenant l'utilisation de procédés de génération de banques déposées qui sont disponibles dans le commerce. La séquence d'ADN codant pour un polypeptide de type sauvage de SEQ ID NO: 1 (avec ou sans l'une des deux premières Met) peut être isolée d'une cellule ou d'un microorganisme quelconque produisant le polypeptide en question, en utilisant divers procédés bien connus dans l'art. Dans un mode de réalisation, l'ADNc codant pour le polypeptide de type sauvage de SEQ ID NO: 1 (avec ou sans l'une des deux premières Met) est obtenu à partir de cellules de Castellaniella defragrans, de banques d'ADNc ou autres. [0261] Dans un mode de réalisation, les mutations sont introduites dans un polypeptide de type sauvage de SEQ ID NO: 1(ou SEQ ID NO: 1 sans l'étiquette périplasmique ou SEQ ID NO: 4 ou 5) en utilisant la mutagenèse dirigée. Une fois qu'une séquence d'ADN codant pour le polypeptide de type sauvage a été isolée et que des sites de mutation souhaitables ont été identifiés, les mutations peuvent être introduites en utilisant des oligonucléotides synthétiques. Ces oligonucléotides contiennent des séquences nucléotidiques flanquant les sites de mutation souhaités ; les nucléotides mutants sont insérés pendant la synthèse de l'oligonucléotide. Dans un procédé spécifique, une coupure d'ADN simple brin, recouvrant la séquence codant pour le polypeptide, est créée dans un vecteur portant le gène codant pour le polypeptide de type sauvage de SEQ ID NO: 1 (ou 64 SEQ ID NO: 1 sans l'étiquette périplasmique ou SEQ ID NO: 4 ou 5). Ensuite, le nucléotide synthétique portant la mutation souhaitée, est annelé à une partie homologue de l'ADN simple brin. La coupure restante est ensuite remplie avec l'ADN polymérase I (fragment de Klenow) et la construction est liée en utilisant la T4 ligase. [0262] Un autre mode de réalisation pour introduire des mutations dans les séquences d'ADN codant pour le polypeptide de type sauvage SEQ ID NO: 1 (ou SEQ ID NO: 1 sans l'étiquette périplasmique ou SEQ ID NO: 4 ou 5) comprend la génération en 3 étapes d'un fragment de PCR contenant la mutation souhaitée introduite en utilisant un brin d'ADN synthétisé chimiquement comme l'une des amorces dans les réactions de PCR. A partir du fragment généré par PCR, un fragment d'ADN portant la mutation peut être isolé par clivage avec des endonucléases de restriction et réinsérées dans un plasmide d'expression. [0263] Expression des polypeptides [0264] Dans un mode de réalisation, les polypeptides sont exprimés selon les procédés décrits dans la partie Exemples de la présente description. Selon certains autres modes de réalisation, une séquence d'ADN codant pour le polypeptide produit par des procédés décrits ci-dessus ou produite par d'autres procédés connus dans l'art, peut être exprimée, sous forme enzymatique, en utilisant un vecteur d'expression qui comprend habituellement des séquences de contrôle codant pour un promoteur, un opérateur, un site de liaison ribosomique, un signal d'initiation de la traduction et éventuellement, un gène répresseur ou divers gènes activateurs. Pour chaque combinaison d'un promoteur et d'une cellule hôte, on dispose de conditions de culture qui conduisent à l'expression de la séquence d'ADN codant pour le polypeptide souhaité. Après avoir atteint la densité ou le titre cellulaire souhaité(e) de polypeptide, la culture est stoppée et le polypeptide est récupéré en utilisant des procédures connues. En variante, la cellule hôte est utilisée directement (par ex., pellet, suspension), c'est-à-dire sans isolement de la protéine recombinante. [0265] Le vecteur d'expression recombinant portant la séquence d'ADN codant pour un polypeptide tel que décrit ici peut être tout vecteur qui peut être soumis de façon appropriée à des procédures d'ADN recombinant et le choix d'un vecteur dépendra souvent de la cellule hôte dans laquelle il est introduit. Par conséquent, le vecteur peut être un vecteur se répliquant de façon autonome, c'est-à-dire un 65 vecteur qui existe comme entité extrachromosomique dont la réplication est indépendante d'une réplication chromosomique, par ex., un plasmide, un bactériophage ou un élément extrachromosomique, un minichromosome ou un chromosome artificiel. En variante, le vecteur peut être un vecteur qui, lorsqu'il est introduit dans une cellule hôte, est intégré dans le génome de la cellule hôte et répliqué conjointement avec le/les chromosome(s) dans lesquels il a été intégré. [0266] Dans le vecteur, la séquence d'ADN est habituellement liée fonctionnellement à une séquence promoteur appropriée. Le promoteur peut également être une séquence d'ADN qui présente une activité transcriptionnelle dans la cellule hôte choisie et peut être dérivé de gènes codant pour des protéines homologues ou hétérologues à la cellule hôte. Des exemples de promoteurs appropriés pour diriger la transcription de la séquence d'ADN codant pour un polypeptide tel que décrit ici, en particulier, dans un hôte bactérien, sont les promoteurs de l'opéron lac d'E. cou, les promoteurs du gène dagA de Streptomyces coelicolor, les promoteurs de Castellaniella defragrans, et autres. Pour la transcription dans un hôte fongique, des exemples de promoteurs utiles sont ceux dérivés du gène codant pour l'amylase TAKA de A. oryzae amylase, la protéinase aspartique de Rhizomucor miehei, LDH neutre de A. figer, LDH acide stable de A. figer, la glucoamylase de A. figer, la lipase de Rhizomucor miehei, la protéase alcaline de A. oryzae, la triose phosphate isomérase de A. oryzae ou l'acétamidase de A. nidulans. Les promoteurs peuvent être choisis sur la base du résultat souhaité. Les acides nucléiques peuvent être combinés à des promoteurs constitutifs, préférés pour un tissu, inductibles, ou d'autres promoteurs de l'expression dans la cellule ou l'organisme hôte. La liste de promoteurs ci-dessus n'est pas destinée à être restrictive. Tout promoteur approprié peut être utilisés dans les modes de réalisation. [0267] Dans certains modes de réalisation, le vecteur d'expression décrit peut également comprendre un terminateur de transcription approprié et chez les eucaryotes, des séquences de polyadénylation liées fonctionnellement à la séquence d'ADN codant pour le polypeptide tel que décrit ici. Les séquences de terminaison et de polyadénylation peuvent ou non être dérivées de façon appropriée des mêmes sources que le promoteur. [0268] Dans certains modes de réalisation, le vecteur peut comprendre en outre une séquence d'ADN permettant au vecteur de se répliquer dans la cellule hôte 66 en question. Les exemples de ces séquences sont les origines de réplication des plasmides pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 et pIJ702. La liste ci-dessus des origines de réplication n'est pas destinée à être restrictive. Toute origine de réplication appropriée peut être utilisée dans les modes de réalisation. [0269] Dans certains modes de réalisation, le vecteur peut également comprendre un marqueur sélectionnable. Les gènes de marqueur sélectionnable sont utilisés pour la sélection de cellules ou de tissus transformés, par ex., un gène dont le produit complète un défaut de la cellule hôte tel que les gènes dal de B. subtilis ou de B. licheniformis, ou un gène qui confère une résistance antibiotique telle qu'une résistance à l'ampicilline, à la kanamycine, au chloramphénicol ou à la tétracycline. En outre, le vecteur peut comprendre des marqueurs de sélection d'Aspergillus tels que amdS, argB, niaD et sC, un marqueur entraînant une résistance à l'hygromycine ou la sélection peut être réalisée par cotransformation. La liste ci-dessus de gènes de marqueurs sélectionnables n'est pas destinée à être restrictive. Tout gène marqueur sélectionnable peut être utilisé dans les modes de réalisation. [0270] Des milieux et conditions de culture appropriés pour les cellules hôtes décrites ci-dessus sont bien connus dans l'art. Alors que l'expression intracellulaire peut être avantageuse à certains égards, par ex., lorsque l'on utilise certaines bactéries comme cellules hôtes, il est souvent préféré que l'expression soit extracellulaire ou périplasmique. Dans certains modes de réalisation, les LDH de Castellaniella defragrans mentionnés ici comprennent une séquence pré-région/ signal/leader permettant la sécrétion de la protéase exprimée dans le milieu de culture ou le périplasme. Si on le souhaite, cette pré-région peut être remplacée par une pré-région ou une séquence signal différente, ce remplacement étant réalisé de façon appropriée par substitution des séquences d'ADN codant pour les prérégions respectives. [0271] Les procédures utilisées pour lier la construction d'ADN codant pour un polypeptide décrit, le promoteur, le terminateur et autres éléments, respectivement et pour les insérer dans des vecteurs appropriés contenant les informations nécessaires pour la réplication, sont bien connus de l'homme du métier (voir., par exemple, Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, supra). 67 [0272] Dans un mode de réalisation, les cellules décrites ici, comprenant une construction d'ADN ou un vecteur d'expression tel que défini ci-dessus, sont avantageusement utilisées dans la production recombinante d'un polypeptide tel que décrit ici. La cellule peut être transformée avec la construction d'ADN codant pour le polypeptide tel que décrit ici, de façon appropriée, en intégrant la construction d'ADN (en une ou plusieurs copies) dans le chromosome de l'hôte. Cette intégration est généralement considérée comme un avantage car la séquence d'ADN est plus susceptible d'être conservée de façon stable dans la cellule. L'intégration des constructions d'ADN dans le chromosome de l'hôte peut être réalisée selon des procédés classiques, par ex., par recombinaison homologue ou hétérologue. En variante, la cellule peut être transformée avec un vecteur d'expression tel que décrit ci-dessus en relation avec les différents types de cellules hôtes. [0273] Dans certains modes de réalisation, une cellule telle que décrite ici peut être une cellule d'un organisme supérieur tel qu'un mammifère ou un insecte, une cellule microbienne, par ex., une cellule de bactérie ou de champignon (comprenant les levures), ou autres. [0274] De manière non restrictive, les exemples de bactéries appropriées sont Castellaniella defragrans, des bactéries à gram positif telles que Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis ou Streptomyces lividans ou Streptomyces murinus, ou des bactéries à gram négatif telles que E. coll. Dans un mode de réalisation, la transformation de la bactérie peut s'effectuer par exemple par transformation de protoplaste ou en utilisant des cellules compétentes de manière en elle-même connue. [0275] Dans certains autres modes de réalisation, un organisme de levure peut être choisi parmi des espèces de Saccharomyces ou Schizosaccharomyces, par ex., Saccharomyces cerevisiae. Le champignon filamenteux peut avantageusement faire partie d'une espèce Aspergillus, par ex., Aspergillus oryzae ou Aspergillus figer. Les cellules de champignons peuvent être transformées par un processus comprenant la formation de protoplastes et la transformation des protoplastes suivie par la régénération de la paroi cellulaire 68 d'une manière en elle-même connue. Les procédures appropriées pour la transformation des cellules hôtes fongiques sont bien connues dans l'art. [0276] Dans encore un autre ensemble de modes de réalisation, la présente description concerne un procédé de production d'un polypeptide tel que décrit ici, ledit procédé comprenant la culture d'une cellule hôte telle que décrite ci-dessus dans des conditions conduisant à la production du polypeptide et à la récupération du polypeptide à partir des cellules et/ou du milieu de culture. Dans certains modes de réalisation, les cellules sont cultivées dans des conditions aérobies. Dans d'autres modes de réalisation, les cellules sont cultivées dans des conditions anaérobies. [0277] Le milieu utilisé pour cultiver les cellules peut être tout milieu classique approprié pour cultiver la cellule hôte en question et obtenir l'expression du polypeptide tel que décrit ici. Les milieux appropriés sont disponibles dans le commerce ou peuvent être préparés selon des recettes publiées (par ex., comme le décrivent les catalogues de l'American Type Culture Collection). [0278] Purification des polypeptides [0279] Le polypeptide décrit ici et sécrété à partir des cellules hôtes peut être récupéré de façon appropriée à partir du milieu de culture par des procédures bien connues, en plus de celles décrites dans la partie Exemples de la présente description, comprenant la séparation des cellules du milieu par centrifugation ou filtration, et la précipitation des composants protéinés du milieu au moyen d'un sel tel que le sulfate d'ammonium suivi par l'utilisation de procédures chromatographiques telles que la chromatographie échangeuse d'ions, la chromatographie d'affinité ou autres. [0280] Par exemple, les techniques de fermentation, de séparation et de concentration sont connues dans l'art et des procédés classiques peuvent être utilisés pour préparer la solution contenant le polypeptide concentré. Après la fermentation, un bouillon de fermentation est obtenu et les cellules microbiennes et divers solides en suspension comprenant des matériaux de fermentation bruts résiduels sont éliminés par des techniques de séparation classiques pour obtenir une solution de polypeptide. Une filtration, une centrifugation, une microfiltration, une filtration sous vide à tambour rotatif suivie d'une ultrafiltration, d'une extraction ou d'une chromatographie, ou autres sont généralement utilisées. 69 [0281] Dans certains cas, il est souhaitable de concentrer la solution contenant le polypeptide pour optimiser la récupération car l'utilisation de solutions non concentrées nécessite un temps d'incubation pour recueillir les précipités contenant le polypeptide purifié. La solution est concentrée en utilisant des techniques classiques jusqu'à ce que le taux d'enzyme souhaité soit obtenu. La concentration de la solution contenant le polypeptide enzymatique peut être obtenue par l'une quelconque des techniques décrites ci-dessus. Dans un mode de réalisation, l'évaporation rotative sous vide et/ou l'ultrafiltration sont utilisées. [0282] Dans un mode de réalisation, un « agent de précipitation » à des fins de purification doit être un composé efficace pour précipiter le polypeptide à partir de la solution concentrée de polypeptide enzymatique sous forme solide, quelle que soit sa nature, à savoir, cristalline, amorphe ou un mélange des deux. Une précipitation peut être réalisée en utilisant par exemple, un agent de précipitation de type halogénures métalliques. Les agents de précipitation halogénures métalliques comprennent : les chlorures de métal alcalin, les bromures de métal alcalin et les mélanges de deux ou plusieurs de ces halogénures métalliques. L'halogénure métallique peut être choisi dans le groupe comprenant le chlorure de sodium, le chlorure de potassium, le bromure de sodium, le bromure de potassium et les mélanges de deux ou plus de ces halogénures métalliques. Les halogénures métalliques appropriés comprennent le chlorure de sodium et le chlorure de potassium, en particulier, le chlorure de sodium, qui peuvent en outre être utilisés comme conservateurs. [0283] Dans un mode de réalisation, un agent de précipitation halogénure métallique est utilisé en une quantité efficace pour précipiter le polypeptide. La sélection d'au moins une quantité efficace et d'une quantité optimale d'halogénure métallique efficace pour entraîner une précipitation du polypeptide enzymatique ainsi que les conditions de précipitation pour une récupération maximale comprenant le temps d'incubation, le pH, la température et la concentration du polypeptide, apparaîtront rapidement à l'homme du métier après des tests de routine. [0284] Dans certains modes de réalisation, au moins environ 5 °A) p/v (poids/volume) à environ 25 % p/v d'halogénure métallique sont ajoutés à la solution concentrée de polypeptide enzymatique et habituellement, au moins 8 % p/v. Dans certains modes de réalisation, pas plus d'environ 25 °A) p/v de 70 l'halogénure métallique sont ajoutés à la solution concentrée de polypeptide enzymatique et généralement, pas plus d'environ 20 % p/v. La concentration optimale de l'agent de précipitation halogénure métallique dépendra entre autres de la nature du polypeptide spécifique et de sa concentration dans la solution concentrée de polypeptide. [0285] Un autre mode de réalisation pour effectuer la précipitation de l'enzyme consiste à utiliser des composés organiques qui peuvent être ajoutés à la solution concentrée de polypeptide enzymatique. L'agent de précipitation du composé organique peut inclure : l'acide 4-hydroxybenzoïque, des sels de métal alcalin de l'acide 4-hydroxybenzoïque, des alkylesters de l'acide 4-hydroxybenzoïque et des mélanges de deux ou plus de ces composés organiques. L'addition des agents de précipitation du composé organique peut s'effectuer avant, en même temps ou après l'addition de l'agent de précipitation halogénure métallique et l'addition à la fois des agents de précipitation, du composé organique et de l'halogénure métallique peut être réalisée séquentiellement ou simultanément. [0286] Dans certains modes de réalisation, les agents de précipitation du composé organique sont choisis dans le groupe comprenant des sels de métal alcalin de l'acide 4-hydroxybenzoïque tels que les sels de sodium ou de potassium et des alkylesters linéaires ou ramifiés de l'acide 4-hydroxybenzoïque, le groupe alkyle contenant de 1 à 12 atomes de carbone, et des mélanges de deux ou plus de ces composés organiques. Dans certains modes de réalisation, les agents de précipitation du composé organique peuvent être par exemple des alkylesters linéaires ou ramifiés de l'acide 4-hydroxybenzoïque, le groupe alkyle contenant de 1 à 10 atomes de carbone, et des mélanges de deux ou plus de ces composés organiques. Dans certains modes de réalisation, les composés organiques appropriés comprennent des alkylesters linéaire de l'acide 4- hydroxybenzoïque, le groupe alkyle contenant de 1 à 6 atomes de carbone, et des mélanges de deux ou plus de ces composés organiques. Des méthylesters de l'acide 4-hydroxybenzdique, un propylester de l'acide 4-hydroxybenzdique, un butylester de l'acide 4-hydroxybenzoïque, un éthylester de l'acide 4- hydroxybenzoïque et des mélanges de deux ou plus de ces composés organiques peuvent également être utilisés. Des composés organiques supplémentaires comprennent également, de manière non restrictive, le méthylester de l'acide 4- hydroxybenzoïque (méthyl-PARABENE) et le propylester de l'acide 4- 71 hydroxybenzoïque (propyl-PARABENE), qui sont également des agents conservateurs d'amylases. [0287] Dans certains modes de réalisation, l'addition de l'agent de précipitation de type composé organique procure l'avantage d'une flexibilité élevée des conditions de précipitation par rapport au pH, à la température, à la concentration du polypeptide, à la concentration de l'agent de précipitation et la durée d'incubation. [0288] Dans certains modes de réalisation, l'agent de précipitation de type composé organique est utilisé en une quantité efficace pour améliorer la précipitation du polypeptide enzymatique au moyen de l'agent de précipitation halogénure métallique. La sélection d'au moins une quantité efficace et d'une quantité optimale d'agent de précipitation de type composé organique ainsi que les conditions de la précipitation pour une récupération maximale comprenant la durée d'incubation, le pH, la température et la concentration du polypeptide enzymatique apparaîtront rapidement à l'homme du métier, à la lumière de la présente description, après des tests de routine. [0289] Dans certains modes de réalisation, au moins environ 0,01 % p/v de l'agent de précipitation du composé organique est ajouté à la solution concentrée de polypeptide enzymatique et généralement, au moins environ 0,02 % p/v. Dans certains modes de réalisation, pas plus d'environ 0,3 % p/v de l'agent de précipitation du composé organique est ajouté à la solution concentrée de polypeptide enzymatique et généralement, pas plus d'environ 0,2 % p/v. [0290] Dans certains modes de réalisation, la solution concentrée de polypeptide enzymatique contenant l'agent de précipitation halogénure métallique et dans un aspect, l'agent de précipitation de type composé organique, est ajusté(e) à un pH qui dépendra nécessairement du polypeptide enzymatique à purifier. Dans certains modes de réalisation, le pH est ajusté à un niveau proche du point isoélectrique (pl) du polypeptide. Par exemple, le pH peut être ajusté dans une plage d'environ 2,5 unités de pH en-dessous du pl à environ 2,5 unités de pH au-dessus du pl. [0291] Le temps d'incubation nécessaire pour obtenir un précipité du polypeptide enzymatique purifié dépend de la nature du polypeptide enzymatique spécifique, de la concentration de l'enzyme et du/des agent(s) de précipitation spécifique(s) et de sa (leur) concentration. Dans certains modes de réalisation, la durée efficace pour précipiter le polypeptide enzymatique se situe entre environ 1 à 72 environ 30 heures ; habituellement, elle ne dépasse pas environ 25 heures. En présence de l'agent de précipitation du composé organique, la durée d'incubation peut toujours être réduite à moins d'environ 10 heures et dans la plupart des cas, même d'environ 6 heures. [0292] Dans certains modes de réalisation, la température pendant l'incubation se situe entre environ 4 °C et environ 50 °C. Dans certains modes de réalisation, le procédé est réalisé à une température entre environ 10 °C et environ 45 °C, et en particulier, entre environ 20 °C et environ 40 °C. La température optimale pour induire la précipitation varie selon les conditions de la solution et le polypeptide enzymatique ou le/les agent(s) de précipitation utilisé(s). [0293] Dans certains modes de réalisation, la récupération globale du précipité de polypeptide enzymatique purifié et l'efficacité avec laquelle le processus est réalisé est améliorée en agitant la solution comprenant le polypeptide enzymatique, l'halogénure métallique ajouté et le composé organique ajouté.
Dans certains modes de réalisation, l'étape d'agitation est réalisée à la fois pendant l'addition de l'halogénure métallique et du composé organique, et pendant la période d'incubation consécutive. Des procédés d'agitation appropriés comprennent l'agitation ou le secouage mécanique, l'aération vigoureuse ou une technique similaire. [0294] Dans certains modes de réalisation, après la période d'incubation, le polypeptide enzymatique purifié est ensuite séparé des impuretés et recueilli par des techniques de séparation classiques, telles que la filtration, la centrifugation, la microfiltration, la filtration rotative sous vide, l'ultrafiltration, la filtration par pressage, la microfiltration transmembranaire, la microfiltration à écoulement transmembranaire ou autre. La microfiltration transmembranaire peut être un procédé utilisé. Dans certains modes de réalisation, une autre purification du précipité de polypeptide enzymatique purifié peut être obtenue par lavage du précipité avec de l'eau. Par exemple, le précipité de polypeptide enzymatique purifié est lavé avec de l'eau contenant l'agent de précipitation halogénure métallique, par exemple, avec de l'eau contenant l'halogénure métallique et les agents de précipitation du composé organique. [0295] Compositions [0296] Certains modes de réalisation concernent des compositions comprenant un ou plusieurs polypeptides décrits, seuls ou en combinaison avec un polypeptide 73 de type sauvage de SEQ ID NO: 1 (avec ou sans l'une des deux premières Met, avec ou sans étiquette périplasmique et avec ou sans étiquette poly-His C-terminale supplémentaire comme on le décrit ici). Dans certains modes de réalisation, la composition comprend un ou plusieurs polypeptides présentant une activité améliorée dans la catalyse de la déshydratation du 3-butèn-2-ol en 1,3- butadiène. Dans certains modes de réalisation, la composition comprend un ou plusieurs polypeptides présentant une activité spécifique améliorée accrue dans la catalyse de la déshydratation du 3-butèn-2-ol en 1,3-butadiène. Dans d'autres modes de réalisation, la composition comprend un ou plusieurs polypeptides présentant une activité améliorée et un ou plusieurs polypeptides présentant une activité spécifique accrue dans la catalyse de la déshydratation du 3-butèn-2-ol en 1,3-butadiène. [0297] Dans certains modes de réalisation, la composition peut être composée d'un ou plusieurs polypeptides décrits, obtenus (1) du commerce ; (2) de gènes clonés exprimant lesdits polypeptides ; (3) du bouillon complexe (tel que celui résultant de la croissance d'une souche microbienne ou de toute autre cellule hôte dans des milieux, dans laquelle les souches/ cellules hôtes sécrètent les polypeptides décrits dans les milieux ; (4) des lysats cellulaires de souches/cellules hôtes cultivées comme au point (3) ; et/ou (5) de tout autre matériau de la cellule hôte exprimant le polypeptide décrit. Différents polypeptides décrits dans une composition peuvent être obtenus à partir de différentes sources. [0298] Dans certains modes de réalisation, la composition comprend du 3-butèn2-ol et un ou plusieurs des polypeptides décrits ici. Dans d'autres modes de réalisation, la composition comprend en outre un polypeptide de type sauvage de SEQ ID NO: 1 (avec ou sans l'une des deux premières Met, avec ou sans étiquette périplasmique et avec ou sans étiquette poly-His C-terminale supplémentaire tel que décrit ici). [0299] Dans certains modes de réalisation, la composition comprend du 1,3-butadiène et un ou plusieurs polypeptides décrits ici. Dans d'autres modes de réalisation, la composition comprend en outre un polypeptide de type sauvage de SEQ ID NO: 1 (avec ou sans l'une des deux premièresMet, avec ou sans étiquette périplasmique et avec ou sans une étiquette poly-His C-terminale supplémentaire tel que décrit ici). 74 [0300] Dans certains modes de réalisation, la composition comprend un produit à base de caoutchouc polymérisé à partir de 1,3-butadiène produit en présence d'un polypeptide tel que décrit ici. [0301] Dans certains modes de réalisation, la composition comprend un copolymère polymérisé à partir de 1,3-butadiène produit en présence d'un polypeptide tel que décrit ici. [0302] Dans certains modes de réalisation, la composition comprend un produit à base de plastique polymérisé à partir de 1,3-butadiène produit en présence d'un polypeptide tel que décrit ici. [0303] Des anticorps capables de se lier à un polypeptide des modes de réalisation ou des parents ou des fragments de ceux-ci qui comprennent au moins l'une des mutations/modifications améliorées décrites ici sont également englobés. Des procédés de production d'anticorps sont bien connus dans l'art (voir par exemple, Harlow et Lane, (1988) Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y) et des manuels de production d'anticorps plus récents, reconnus dans l'art. [0304] Procédés d'utilisation [0305] Les polypeptides, acides nucléiques et compositions décrits ici peuvent être utilisés dans de nombreuses applications différentes. Certaines de ces applications sont décrites dans le RÉSUMÉ et/ou les revendications. [0306] Un mode de réalisation concerne un procédé de production de 1,3-butadiène comprenant la déshydratation de 3-butèn-2-ol en 1,3-butadiène en présence d'un polypeptide tel que décrit ici. [0307] Un autre mode de réalisation concerne l'utilisation d'un polypeptide tel que décrit ici dans la préparation d'un produit, le produit étant polymérisé à partir de 1,3-butadiène produit en présence du polypeptide. Dans un mode de réalisation, le produit est un produit à base de caoutchouc. Dans un mode de réalisation, le produit est un copolymère. Dans un autre mode de réalisation, le produit est une matière plastique. [0308] Un autre mode de réalisation concerne un procédé de construction d'un polypeptide décrit, ledit procédé comprenant (a) la réalisation de modifications dans la séquence d'acides aminés, chacune étant une insertion, une délétion ou une substitution d'un résidu d'acides aminés à une ou plusieurs positions de SEQ ID NO: 1 (ou SEQ ID NO: 1 sans l'étiquette périplasmique, ou SEQ ID NO: 4 ou 75 ), (b) la préparation du polypeptide résultant de ces modifications, (c) le test de l'activité de production de 1,3-butadiène du polypeptide, (d) la répétition éventuelle des étapes a)-c) de façon récursive ; et (e) la sélection d'un polypeptide ayant une activité de production améliorée de 1,3-butadiène par rapport à celle du polypeptide de type sauvage de SEQ ID NO: 1(ou SEQ ID NO: 1 sans l'étiquette périplasmique ou SEQ ID NO: 4 ou 5). [0309] Toutes les revendications dans la liste des revendications sont incorporées par référence dans leur intégralité dans la spécification comme modes de réalisation supplémentaires.
EXEMPLES [0310] Toutes les compositions et procédés décrits et revendiqués ici peuvent être produits et exécutés sans expérimentation inutile à la lumière de la présente description et des connaissances de l'homme du métier. Dans certains cas, les compositions et procédés de la présente description ont été décrits en termes de modes de réalisation ; toutefois, ces modes de réalisation ne sont en aucune manière destinée à limiter le cadre des revendications et il apparaîtra à l'homme du métier que des variantes peuvent être appliquées aux compositions et/ou procédés et dans les étapes ou dans la séquence des étapes des procédés décrits ici sans s'éloigner du concept, de l'esprit et du cadre de l'invention. Plus spécifiquement, il apparaîtra que certains composants qui sont apparentés à la fois chimiquement et physiologiquement peuvent remplacer les composants décrits ici tandis que les mêmes résultats ou des résultats similaires seront obtenus. Tous ces substituts similaires et modifications qui apparaîtront à l'homme du métier sont considérés comme étant dans l'esprit, le cadre et le concept de l'invention telle que définie dans les revendications en annexe. 1. Enzymes [0311] Quatre enzymes ont été testées pour la formation du produit de l'étape b) de la réaction suivante : étape a) isomérisation et déshydratation du substrat naturel linalol et étape b) la déshydratation du 3-butèn-2-ol en 1,3-butadiène. 76 Linalol OH a,butén Déshydratation 1..DH - H2O 'Myrcène LDH ' ,Butne Isomérisation ,OH - 1-120, Géraniol b) [0312] Les quatre enzymes étaient : la 1-linalol déshydratase/isomérase de Castellaniella defragrans, EC 4.2.1.127 abrégée ci-après cdLD, la 2-oléate hydratase d'Elizabethkingia meningoseptica et de Streptococcus Pyogenes, EC 4.2.1.53 abrégées ci-après em0H et sp0H, la 3-lycopène hydratase de Thiocapsa roseopersicina et Rubrivivax gelatinosus, EC 4.2.1.131 abrégées ci-après trLH et rgLH, et enfin, la 4-kievitone hydratase de Fusarium Phaseoli, EC 4.2.1.95 abrégée ci-après fpKH). Seule la cdLD a présenté une activité pouvant être répétée pour l'étape b). [0313] La séquence d'acides aminés de la linalol déshydratase de C. defragrans (désignée ci-après cdLD) est disponible dans des bases de données publiques (numéro d'accès gi302064203 dans la banque de données protéine NCBI) et a été rapportée par Brodkorb et al. , « Linalol dehydratase-isomerase, a bifunctional enzyme in the anaerobic degradation of monoterpenes », Journal of Biological Chemistry, Vol 285 (40), pp 30436-30442. La séquence d'acides aminés utilisée ici est reproduite ci-dessous. Il est à noter que, comme le décrivent Brodkorb et al., la séquence a le signal N-terminal MRFTLKTTAIVSAAALLAGFGPPPRAA (SEQ ID NO: 3) qui est un signal d'acheminement périplasmique bactérien. La protéine utilisée ici a également un résidu Met supplémentaire par rapport à la cdLD décrite dans la banque de données de NCBI ayant comme numéro d'accession Genbank E1XUJ2.1 77 >gi13020642031embICBW30776.11 précurseur de la linalol déshydratase-isomérase [Castellaniella defragrans] plus méthionine supplémentaire N-terminale. MMRFTLKTTAIVSAAALLAGFGPPPRAAELPPGRLATTEDYFAQQAKQAVTPDVMAQLAY MNYIDFISPFYSRGCSFEAWELKHTPQRVIKYSIAFYAYGLASVALIDPKLRALAGHDLD IAVSKMKCKRVWGDWEEDGFGTDPIEKENIMYKGHLNLMYGLYQLVTGSRRYEAEHAHLT RIIHDEIAANPFAGIVCEPDNYFVQCNSVAYLSLWVYDRLHGTDYRAATRAWLDFIQKDL IDPERGAFYLSYHPESGAVKPWISAYTTAWTLAMVHGMDPAFSERYYPRFKQTFVEVYDE GRKARVRETAGTDDADGGVGLASAFTLLLAREMGDQQLFDQLLNHLEPPAKPSIVSASLR YEHPGSLLFDELLFLAKVHAGFGALLRMPPPAAKLAGK SEQ1 : séquence d'acides aminés de cdLD de type sauvage (SEQ ID NO: 1) ; SEQ ID NO: 1 sans la première des deux premières méthionines est SEQ ID NO: 7. [0314] La séquence d'ADN ci-dessous (SEQ2) code pour la séquence d'acides aminés de la linalol déshydratase-isomérase énumérée ci-dessus en tant que SEQ 1. Elle présente une optimisation de codon pour E. cou i et est ensuite clonée dans le vecteur pARZ4 (une version modifiée du vecteur pET29). Une étiquette 6- HIS C-terminale (SEQ ID NO: 10) est ajoutée à la séquence dans le vecteur pARZ4 après un segment de liaison GS (Gly-Ser) et est incluse (en lettres minuscules) dans la séquence SEQ 2 ci-dessous. L'étiquette His totale est GSLEHHHHHH (SEQ ID NO: 6). >gi13020642031embICBW30776.11 précurseur de la linalol déshydratase-isomérase [Castellaniella defragrans] atgATGCGTTTCACATTAAAGACCACCGCGATTGTTTCTGCCGCCGCGTTATTAGCGGGT TTTGGACCACCACCTCGTGCAGCAGAATTACCTCCCGGCCGCCTTGCCACAACCGAAGAT TATTTCGCACAACAAGCAAAACAAGCTGTAACCCCGGATGTTATGGCTCAACTCGCGTAC ATGAACTATATTGATTTCATTAGCCCCTTTTATTCACGTGGATGTTCATTCGAAGCATGG GAATTGAAACACACTCCGCAGCGCGTGATTAAATACTCCATTGCATTCTATGCTTATGGC TTGGCATCTGTAGCATTAATCGACCCTAAACTGCGCGCGCTCGCCGGCCACGACTTAGAT ATTGCAGTCTCAAAAATGAAATGTAAACGTGTATGGGGAGATTGGGAAGAAGATGGTTTT GGTACAGATCCGATTGAAAAAGAAAACATTATGTATAAAGGACATCTGAACCTTATGTAT GGTCTCTATCAACTTGTTACTGGATCGCGCCGTTACGAAGCTGAACACGCTCACCTCACC CGTATTATCCACGACGAAATTGCCGCCAACCCATTCGCCGGAATCGTTTGTGAACCAGAC 78 AACTATTTTGTACAATGCAACTCTGTGGCCTATTTAAGCCTTTGGGTCTACGATCGTTTA CATGGAACTGACTACCGTGCCGCAACTCGTGCCTGGCTGGATTTTATTCAAAAAGATCTG ATTGACCCCGAACGTGGAGCTTTCTATTTGTCCTATCATCCCGAATCTGGTGCCGTCAAA CCTTGGATCAGCGCATATACAACCGCTTGGACGTTAGCTATGGTGCATGGAATGGATCCT GCCTTTTCAGAACGTTATTATCCTCGTTTTAAACAAACGTTCGTCGAAGTCTATGATGAA GGCCGTAAAGCCCGCGTACGCGAAACTGCCGGAACCGACGACGCCGATGGTGGTGTGGGT TTAGCCTCTGCGTTCACACTTTTATTAGCCCGCGAAATGGGAGATCAACAACTCTTTGAC CAACTGCTGAATCATTTAGAACCCCCTGCCAAACCAAGCATCGTTTCTGCTAGCCTCCGC TACGAACACCCAGGCAGCCTCTTATTCGACGAACTGTTATTTCTTGCCAAAGTACATGCC GGATTTGGTGCTCTGTTACGTATGCCCCCTCCTGCCGCCAAATTAGCGGGCAAAGGTTCC ctcgagcaccaccaccaccaccactga SEQ 2 : séquence ADN optimisée codant pour SEQ 1. La séquence est optimisée pour l'expression d'E. coli. Le codon de départ, le segment de liaison GS et l'étiquette His6 (SEQ ID NO: 10) sont en lettres minuscules (SEQ ID NO: 2) 2. Expression et purification des protéines [0315] a. Expression et purification de la péri-cdLD dans des cellules BL21 en présence des plasmides chaperons pKJE7, pGro7 et pTf16. [0316] Des plasmides exprimant les chaperons ont été achetés auprès de TaKaRa. Il s'agissait de pG-KJE8 (exprimant les chaperons dnaK-dnaJ-grpE groES-groEL), pGro7 (groES-groEL), pKJE7 (dnaK-dnaJ-grpE), pG-Tf2 (groESgroEL-tig) et pTf16 (tig) [0317] Des cdLD mutants périplasmiques ont été exprimés dans des cellules BL21 avec le plasmide pGro7 et purifiés par une résine d'affinité d'étiquette His. Des cellules BL21 chimiquement compétentes portant un plasmide pGro7 ont été transformées avec le vecteur pARZ4 portant la cdLD souhaitée. Au jour 1 de l'expression, une culture pendant la nuit de 10 ml de LB/KAN (50 pg/ml) avec du chloramphénicol (20 pg/ml) à 37 °C a été initiée le soir. Au jour 2, 500 ml de LB/KAN avec du chloramphénicol (20 pg/ml) ont été inoculés avec 10 ml de culture pendant la nuit. La culture a été développée jusqu'à une valeur 0D600 nm de 0,6-0,8 à 37 °C. Les cellules ont été induites pendant la nuit avec 500 pl d'IPTG 1 M à 25 °C. La culture de 500 ml a été centrifugée à 9 000 x g, à 20 °C pendant 5 minutes. Les cellules ont été remises en suspension dans 6 ml de Tris- HCI 50 mM, pH 9/150 mM de NaCI et stockées à -20 °C. 79 3033 172 [0318] 6 ml de pellet de cdLD ont été lysés avec des pointes de spatule de lysozyme, DNase I et 600 pl 10 X de réactif d'extraction de protéine Bugbuster pendant 25 minutes à température ambiante. Les cellules lysées ont été centrifugées à 12 000 x g pendant 25 minutes à 5 °C. Le surnageant a été filtré 5 avec une membrane de 0,8 pm/0,2 pm. Le surnageant a été chargé 3x sur une colonne Ni-NTA (volume de lit 1,25 ml). La colonne a été lavée avec 50 ml de Tris-HCl 50 mM, pH 9/150 mM NaCI et 50 ml de Tris-HCl 50 mM, pH 9/150 mM NaCl/20 mM imidazole. La cdLD a été éluée avec 10 ml de Tris-HCl 50 mM, pH 9/150 mM, NaCl/250 mM imidazole. 10 ml d'élution de cdLD ont été dégazés 10 avec de l'argon pendant 30 minutes et 200 pl de DTT 100 mM ont été ajoutés à l'élution. 10 ml d'élution ont été concentrés à -2 mL dans un concentrateur centrifugeuse Sartorius Vivaspin 15R. 1,5 ml de cdLD concentrée ont été dessalés avec 2 ml de Tris-HCl 80 mM dégazés, pH 9 dans une colonne de dessalage Hi-Trap. L'échantillon de 2 ml a été recouvert avec de l'argon et stocké 15 à 4 °C. La cdLD a été observée sur un gel SDS avec un poids moléculaire de -40 kDa. La concentration de 2 ml de cdLD dessalé était de -1 mg/m1 donnant -2 mg pour 500 ml de culture d'expression. [0319] b. Expression et purification de cyto-cdLD dans la souche Origami 2 (DE3) [0320] La cdLD cytoplasmique a été exprimée dans la souche Origami 2 (DE3) 20 avec le génotype suivant : A(ara-leu)7697 AlacX74 AphoA Pvull phoR araD139 ahpC galE galK rpsL Fliac+ laclq pro] (DE3) gor522::Tn10 trx13 pLysS (CamR, StrR, TetR). [0321] Les cellules Origami 2 (DE3) chimiquement compétentes, portant un plasmide pGro7 ont été transformées avec pARZ4 (un dérivé de pET24 déposé) portant la cdLD souhaitée. Au jour 1 de l'expression, des cultures de 10 ml de LB/KAN (50 pg/ml) pendant la nuit à 37 °C ont été initiées le soir. Au jour 2, 500 ml de LB/KAN ont reçu une inoculation de 10 ml de culture pendant la nuit. La culture a été cultivée jusqu'à une valeur 0D600 nm 0,6-0,8 à 37 °C. Les cellules ont été induites pendant la nuit avec 500 pl d'IPTG 1 M à 25 °C. La culture de 500 ml a été centrifugée à 9 000 x g, 20 °C pendant 5 minutes. Les cellules ont été remises en suspension dans 6 ml de Tris-HCl 50 mM, pH 9/150 mM NaCI et stockées à -20 °C. [0322] 6 ml de pellet de cdLD ont été lysés avec des pointes de spatule de lysozyme, DNase I et 600 pl 10 X réactif d'extraction de protéine Bugbuster 80 pendant 25 minutes à température ambiante. Les cellules lysées ont été centrifugées à 12 000 x g pendant 25 minutes à 5 °C. Le surnageant a été filtré avec une membrane de 0,8 pm/0,2 pm. On a chargé le surnageant 3 x sur une colonne Ni-NTA (volume de lit 1,25 ml). La colonne a été lavée avec 50 ml de Tris-HCl 50 mM pH 9/150 mM NaCI et 50 ml de Tris-HCl 50 mM, pH 9/150 mM NaCl/20 mM imidazole. La cdLD a été éluée avec 10 ml de Tris-HCl 50 mM pH 9/150 mM NaCl/250 mM imidazole. 10 ml d'élution de cdLD ont été dégazés avec de l'argon pendant 30 minutes et on a ajouté 200 pl de DTT 100 mM à l'élution. 10 ml d'élution ont été concentrés à -2 mL dans un concentrateur centrifugeuse Sartorius Vivaspin 15R. On a dessalé 1,5 ml de cdLD concentrée avec 2 ml de Tris-HCl 80 mM dégazé, pH 9 dans une colonne de dessalage Hi-Trap. L'échantillon de 2 ml a été recouvert d'argon et stocké à 4 °C. On a observé sur un gel SDS que la cdLD présentait un poids moléculaire de -40 kDa. La concentration de 2 ml de cdLD dessalée était de -1 mg/m1 donnant -2 mg pour 500 ml de culture d'expression. 3. Dosage du butadiène dans 1 ml pour la réaction de déshydratation du linalol [0323] Des cellules bactériennes transformées avec les constructions appropriées ont été prélevées de plaques LB dans 400 pl de milieu LB contenant 25 pg/mL de kanamycine dans des plaques à 96 puits profonds et incubées pendant la nuit à 37 °C en agitant vigoureusement. Le lendemain matin, on a inoculé 20 pl de cette culture pendant la nuit dans 1 ml de milieu LB contenant 25 pg/mL de kanamycine dans des plaques à 96 puits profonds, agitées à 37 °C pendant plusieurs heures. Lorsque la densité cellulaire a atteint le niveau approprié (OD de 0,6 à 600 nm), on a ajouté 0,5 pl d'IPTG 1 M dans chaque puits (concentration finale 500 pM). Les plaques ont été incubées pendant 24 h à 25 °C en agitant vigoureusement. Puis, on a transféré 900 pl de culture cellulaire dans un flacon à sertir avec 9 pl de 3-butèn-2-ol 1,1 M (concentration finale de 11 mM), scellé et incubé à température ambiante pendant 72 h. Après incubation, les échantillons ont été analysés dans une colonne Shimadzu GCMS-QP2010 Ultra with Agilent HP PLOT/Q (0,32 mm, 15 m de longueur, 20 pm de diamètre). Le programme était le suivant : la colonne a été chauffée à 90 °C pendant 1 min, puis la température a augmenté à 40 °C par minute jusqu'à atteindre 200 °C. La source d'ions a été chauffée à 230°c, interface à 180°c, admission à 250°c. 8 pl de l'espace de 81 tête du flacon à sertir ont été injectés en mode divisé avec un rapport de fractionnement de 2:1. Le flux de tête total était de 9 ml/min, débit de purge au niveau du septum de 3 ml/min et débit de colonne à 2 ml/min. Le butadiène a été détecté à 2,26 min en surveillant les ions avec m/z 39, 50 et 54 en mode SIM. Le butadiène de chaque échantillon a été comparé à l'enzyme cdLD de type sauvage présente sur chaque plaque. L'activité relative a été calculée comme un rapport entre les quantités de butadiène produites par un variant particulier et l'enzyme de type sauvage. [0324] Il s'agit de l'essai de BL21 (DE3) qui est la lignée cellulaire pour la peri10 cdLD et cyto-cd L D . 4. Dosage pour la réaction de déshydratation du linalol de type sauvage (conversion du linalol en myrcène) [0325] Les protéines purifiées ont été testées pour déterminer leur activité de déshydratase du linalol de type sauvage. On a transféré 100 pl de protéine 15 purifiée dans un tube eppendorf avec 80 pl de tampon Tris-HCI 80 mM dégazé (pH 9) ainsi que 20 pl de solution de linalol 100 mM dans du DMSO. Les réactions témoins négatives étaient constituées par des tubes sans protéine ou sans linalol (substrat). Les tubes ont été agités à température ambiante pendant 1 h, puis on a ajouté 200 pl d'acétate d'éthyle. Ce mélange a été vortexé et centrifugé pendant 20 1 min dans un dispositif de table. La phase organique a été transférée dans un flacon de CC et analysée dans une colonne Shimadzu GCMS-QP2010 Ultra with Restek Rxi-624Sil (0,32 mm, 60 m de longueur, 1,8 pm de diamètre). Le programme était le suivant : la colonne a été chauffée à 100 °C pendant 1 min, puis la température a augmenté à raison de 50 °C par minute jusqu'à atteindre 25 280 °C. La température d'injection était de 250 °C. On a injecté 8 pl de solution d'acétate d'éthyle dans un mode sans division. Le flux de tête total était de 58 ml/min et le débit de colonne était de 1,86 ml/min. Du myrcène a été détecté à 5,50 min, du linalol à 6,17 et du géraniol à 6,96 par un contrôle des ions avec m/z 69, 71 et 93 en mode SIM. 30 5. Détermination de la structure cristalline [0326] Une recherche delta-BLAST dans la banque de données des séquences de protéines de la Banque de Données des Protéines (PDB) a révélé que la cdLD ne présentait pas d'homologie détectable avec une séquence quelconque pour laquelle il existait un modèle structural. La structure cristalline de la cdLD a 82 ensuite été obtenue par deux prestataires privés : Novalix, Illkirch-France et Emerald Bio, Bainbridge-WA. Les deux sociétés ont suivi la même approche générale. [0327] La protéine exprimée à partir d'une construction ayant une séquence de cdLD de type sauvage (SEQ 1) plus une étiquette HIS a été cristallisée. Toutefois dans la structure cristalline réelle obtenue, le signal/marqueur périplasmique est clivé, le premier résidu entièrement résolu est L29 (numérotation de peri-cdLD de type sauvage) et le dernier résidu résolu est P390 (l'étiquette HIS n'ayant pas de densité visible. Il s'agit de la séquence ci-dessous (SEQ ID NO: 11) : LPPGRLATTEDYFAQQAKQAVTPDVMAQLAYMNYIDFISPFYSRGC SFEAWELKHTPQRVIKYSIAFYAYGLASVALIDPKLRALAGHDLDIAV SKMKCKRVWGDWEEDGFGTDPIEKENIMYKGHLNLMYGLYQLVT GSRRYEAEHAHLTRIIHDEIAANPFAGIVCEPDNYFVQCNSVAYLSL WVYDRLHGTDYRAATRAWLDFIQKDLIDPERGAFYLSYHPESGAV KPWISAYTTAWTLAMVHGMDPAFSERYYPRFKQTFVEVYDEGRKA RVRETAGTDDADGGVGLASAFTLLLAREMGDQQLFDQLLNHLEPP AKPSIVSASLRYEHPGSLLFDELLFLAKVHAGFGALLRMPP [0328] Trois autres constructions supplémentaires présentant des délétions N-terminales et C-terminales ont également été prises en compte mais aucune n'a donné la protéine soluble en quantités appréciables : construction 1 - délétion des résidus G1u28-Thr36 et coupe C-terminale au niveau de Arg387 ; construction 2 - délétion des résidus G1u28-11e67 ; et construction 3 - délétion des résidus G1u28- 11e67 et coupe C-terminale au niveau de Arg387 (toutes par rapport à la numérotation de cdLD de type sauvage de SEQ 1). Leurs séquences sont les suivantes : [0329] Del G1u28-Thr36 + coupe C-ter au niveau de Arg387 (SEQ ID NO: 12) >giI3020642031embICBW30776.11 précurseur de la linalol déshydratase-isomérase [Castellaniella defragrans] SIGNAL SEQ MMRFTLKTTAIVSAAALLAGFGPPPRAATEDYFAQQAKQAVTPDVM AQLAYMNYIDFISPFYSRGCSFEAWELKHTPQRVIKYSIAFYAYGLA SVALIDPKLRALAGHDLDIAVSKMKCKRVWGDWEEDGFGTDPIEKE NIMYKGHLNLMYGLYQLVTGSRRYEAEHAHLTRIIHDEIAANPFAGI VCEPDNYFVQCNSVAYLSLWVYDRLHGTDYRAATRAWLDFIQKDLI 83 DPERGAFYLSYHPESGAVKPWISAYTTAWTLAMVHGMDPAFSERY YPRFKQTFVEVYDEGRKARVRETAGTDDADGGVGLASAFTLLLAR EMGDQQLFDQLLNHLEPPAKPSIVSASLRYEHPGSLLFDELLFLAKV HAGFGALLRGSLEHHHHHH [0330] Del G1u28-1Ieu67 (SEQ ID NO: 13) >giI3020642031embICBW30776.11 précurseur de la linalol déshydratase-isomérase [Castellaniella defragrans] SIGNAL SEQ MMRFTLKTTAIVSAAALLAGFGPPPRAASPFYSRGCSFEAWELKHT PQRVIKYSIAFYAYGLASVALIDPKLRALAGHDLDIAVSKMKCKRVW GDWEEDGFGTDPIEKENIMYKGHLNLMYGLYQLVTGSRRYEAEHA HLTRIIHDEIAANPFAGIVCEPDNYFVQCNSVAYLSLWVYDRLHGTD YRAATRAWLDFIQKDLIDPERGAFYLSYHPESGAVKPWISAYTTAW TLAMVHGMDPAFSERYYPRFKQTFVEVYDEGRKARVRETAGTDD ADGGVGLASAFTLLLAREMGDQQLFDQLLNHLEPPAKPSIVSASLR YEHPGSLLFDELLFLAKVHAGFGALLRMPPPAAKLAGKGSLEHHHH HH [0331] Del G1u28-1Ieu67 + coupe C-ter au niveau de Arg387 (SEQ ID NO: 14) >giI3020642031embICBW30776.11 précurseur de la linalol déshydratase-isomérase [Castellaniella defragrans] SIGNAL SEQ MMRFTLKTTAIVSAAALLAGFGPPPRAASPFYSRGCSFEAWELKHT PQRVIKYSIAFYAYGLASVALIDPKLRALAGHDLDIAVSKMKCKRVW GDWEEDGFGTDPIEKENIMYKGHLNLMYGLYQLVTGSRRYEAEHA HLTRIIHDEIAANPFAGIVCEPDNYFVQCNSVAYLSLWVYDRLHGTD YRAATRAWLDFIQKDLIDPERGAFYLSYHPESGAVKPWISAYTTAW TLAMVHGMDPAFSERYYPRFKQTFVEVYDEGRKARVRETAGTDD ADGGVGLASAFTLLLAREMGDQQLFDQLLNHLEPPAKPSIVSASLR YEHPGSLLFDELLFLAKVHAGFGALLRGSLEHHHHHH [0332] Toutes les constructions contiennent l'étiquette périplasmique N-terminale. L'expression et la purification Ni-NTA pour les cristaux Novalix se sont déroulées 30 comme suit. Des cultures de cdLD ont été réalisées dans la bactérie BL21 (DE3) dans 1 L de milieu Power Broth. L'induction avec l'IPTG a été réalisée à 18 °C pendant la nuit. Après la centrifugation, les pellets ont été remis en suspension dans 200 ml de tampon de lyse (Tris pH 8, 20 mM, NaCI 500 mM, glycérol 10 °/(:), imidazole pH 8, 10 mM, Chaps 1%, TCEP 1 mM) pour une culture de 6 L et traités 84 par ultrasons. Après centrifugation à 53000 g, l'extrait soluble a été incubé avec environ 2 ml de billes Talon pendant la nuit. La colonne a été lavée avec un volume de 5 colonnes de tampon de lyse et l'élution a été réalisée en une étape avec du tampon d'élution (Tris pH 8, 20 mM, NaCI 500 mM, glycérol 10 °/(:), imidazole pH 8, 250 mM, Chaps 1 mM, TCEP 1 mM). Ensuite, l'échantillon a été appliqué à une colonne SEC (Hiload 16/60 S75) pré-équilibrée avec un tampon SEC (Tris, pH 8 20 mM, NaCI 150 mM, glycérol 5 %). La purification a donné en moyenne 2 mg de protéine pure de cdLD pour 6 L de culture. La protéine a ensuite été concentrée jusqu'à 6 mg/m1 dans un tampon SEC avant les essais de cristallisation. Au total, 960 conditions de cristallisation ont été testées. Les cristaux de cdLD utilisés pour la détermination de la structure ont été obtenus dans une condition de criblage Morpheus H2 (P8000 10 °/(:), éthylène glycol 20 °/(:), Na-l-glutamate 0,02 M, dl-alanine 0,02 M, glycine 0,02 M, dl-lysine HCI 0,02 M, dlsérine 0,02 M) à 295 °K. Des cristaux sont apparus en quelques jours et étaient très fins et délicats à manipuler. Grâce à l'éthylène glycol dans la liqueur mère, des cristaux ont pu être prélevés et congelés directement dans de l'azote liquide [0333] Les conditions de l'expression et de la purification des cristaux Emerald étaient les suivantes. La cdLD du plasmide fourni par Arzeda a été exprimée en tant que protéine sécrétée dans l'espace périplasmique. Les conditions de fermenation étaient les suivantes : culture de cellules E. cou portant le plasmide pARZ_cdLD (exprimant cdLD avec la séquence présentée dans le tableau ci-dessous, SEQ ID NO: 9) à l'échelle de 8 L dans des fioles agitées de 1 L de milieu LB, induites à une OD -0,600 avec 1 mM IPTG et cultivées pendant la nuit à 25 °C. Protéine cible cdLD Séquen- ce AA MMRFTLKTTAIVSAAALLAGFGPPPRAAELPPGRLATTEDYFAQQAKQAVTPDVMA QLAYMNYIDFISPFYSRGCSFEAWELKHTPQRVIKYSIAFYAYGLASVALIDPKLRALAG HDLDIAVSKMKCKRVWGDWEEDGFGTDPIEKENIMYKGHLNLMYGLYQLVTGSRR YEAEHAHLTRIIHDEIAANPFAGIVCEPDNYFVQCNSVAYLSLWVYDRLHGTDYRAAT RAWLDFIQKDLIDPERGAFYLSYHPESGAVKPWISAYTTAWTLAMVHGMDPAFSER YYPRFKQTFVEVYDEGRKARVRETAGTDDADGGVGLASAFTLLLAREMGDQQLFDQ LLNHLEPPAKPSIVSASLRYEHPGSLLFDELLFLAKVHAGFGALLRMPPPAAKLAGKHH HHHH Code couleur Marqueur His en caractères gras/soulignés, signal de sécrétion en caractères gras 85 3033 172 [0334] La pâte d'E. coi/ a été délivrée sur glace et les cellules ont été rompues par choc osmotique léger pour libérer les protéines périplasmiques. Un protocole détaillé de purification des protéines est présenté ci-dessous. En bref, la protéine a été purifiée par chromatographie Ni-IMAC en utilisant l'étiquette 5 chromatographique polyhistidine C-terminal suivi d'une chromatographie d'exclusion-diffusion. Les rendements de purification étaient d'environ 1 mg par litre de culture d'E. coi/. [0335] Initiation avec 8 L de pâte d'E. Coi/ : Libération Tampon de choc osmotique léger (MOSB) : Tris/HCI 200 mM, pH 7,5, périplasmique 20 °A (p/v) saccharose, un comprimé complet d'inhibiteur de protéase libre sans EDTA (refroidi sur glace). 1. Les pellets d'échantillon sont mis en suspension dans 800 ml (10 °A du volume de culture) de MOSB refroidi sur glace avec 400 mg de lysozyme ajouté au tampon juste avant l'utilisation. L'échantillon est agité légèrement sur glace pendant 20 minutes. 2. Après 20 minutes, 800 ml de diH20 refroidis sur glace ont été ajoutés à l'échantillon et agités légèrement pendant encore 20 minutes. 3. Les échantillons sont agglomérés via centrifugation à 5000 tr/min pendant 30 min à 4 °C. 4. Le surnageant est retiré, filtré dans filtre à flacon de 0,2 pm et purifié par chromatographie d'affinité Ni-NTA. 10 [0336] Purification des protéines : étape de purification 1 [0337] Toutes les étapes de purification sont réalisées à 4 °C. Les systèmes AKTA sont rincés soigneusement avec de l'eau puis des tampons avant l'initiation de la purification. Type de chromatographie Ni I Type de colonne utilisée HiTrap Ni chélatante Quantité de colonnes utilisées 1 x 5 ml Nouvelle ou régénérée Nouvelle Tampon A Tris 50 mM, pH 9, NaCI 0,15 M, imidazole 20 mM. préparée le 19/02/2013. Tampon B Tris 50 mM, pH 9, NaCI 0,15 M, imidazole 250 mM. préparée le 19/02/2013. 86 Tampon de lavage Tris 50 mM, pH 9, NaCI 0,15 M. Préparé le 19/02/2013 Equilibrage de colonne 4 CV A, 4 CV B, 4 CV A Système AKTA utilisé BB-AKTA 2 Volume de charge et débit 1,6 I, 1,5 ml/min Volume de lavage et débit 50 ml, 2 ml/min Gradient d'élution, début et taille de fraction 0-60 °A B en 120 minutes, 1 ml/min, fractions 5 ml. Commentaires N/A Analyse SDS-PAGE 4 à 12 °A MOPS SDS-PAGE dénaturé à 95 °A pendant 5 minutes avec 4 x colorant de charge de SDS contenant du 2-mercapto-éthanol. [0338] Purification des protéines : concentration, étape 1 (objectif de concentration : 15 mg/mi) Type de concentrateur, MWCO, vitesse de centrifugation et durée Vivaspin 20 PES, 10 kDa MWCO, 5000 à 6500 RCF, 10 à 20 minutes d'intervalle Concentration volume initiale (Nanodrop-1000) et 0,3 mg/ml, 45 ml Concentration volume finale (Nanodrop-1000) et 5,05 mg/ml, 2,2 ml [0339] Purification des protéines : purification, étape 2 Type de chromatographie SEC Type de colonne utilisée Séphacryl S-100 16/60 Quantité de colonnes utilisées 1 x 120 ml Tampon SEC Tris 10 mM, pH 9,0, NaCI 350 mM, DTT 2 mM. Préparée le 20/02/2013. Equilibrage de colonne Tampon SEC 100 %, 240 minutes à 0,5 ml/min Système AKTA utilisé BB-AKTA 2 Volume d'injection et débit 2,2 ml, 0,5 ml/min Nombre d'injections 1 x 2,2 ml Taille de fraction 3 ml Commentaires N/A Analyse SDS-PAGE 4 à 12 °A MOPS SDS-PAGE dénaturé à 95 °A pendant 5 minutes avec 4 x colorant de charge de SDS contenant du 2-mercapto-éthanol. 87 Conditions de l'analyse SDSPAGE Réduites Nombre d'aliquotes, volume, 8 x 100 pl, 1 x 50 pl à 10,28 mg/mi concentration Rendement final de protéine 8,74 mg Tampon final Tris 10 mM, pH 9,0, NaCI 350 mM, DTT 2 mM. [0340]3) Croissance et manipulation du cristal : [0341] Des cristaux pour la détermination de la structure de la cdLD ont été obtenus en utilisant le procédé de diffusion de vapeur avec 400 nL de solution de protéine (cdLD à 9,06 mg/mL dans du Tris 10 mM, pH 9,0, NaCI 350 mM, DTT 2 mM) mélangée avec 400 nL de solution de cristallisation sur un réservoir de -40 lut de solution de cristallisation. Les conditions de cristallisation appropriées pour la croissance des cristaux ont été déterminées en testant 576 conditions aléatoires de matrice creuse de divers système de criblage de cristallisation disponibles dans le commerce. De petits cristaux ont été obtenus à partir du système de criblage du commerce Morpheus (Molecular Dimensions, Newmarket UK). Le criblage Morpheus utilise des mélanges complexes d'agents de précipitation de tampons et d'additifs. Une description du criblage peut être trouvée à l'adresse : www.moleculardimensions.com/applications/upload/MD1- 47/020Morpheus%C2°/0AE.pdf. Sur la base de ces éléments de cristallisation initiale, un criblage d'optimisation a été créé, utilisant diverses concentrations des tampons Morpheus. Le cristal à partir duquel les données ont été obtenues a été cultivé à partir des composants suivants : 39,55 % (v/v) d'« EDO_P8K » Morpheus, un mélange d'éthylene glycol et de PEG 8000 10 °A) (v/v) d'acides aminés Morpheus, un mélange de L-Naglutamate ; alanine (racémique) ; glycine ; lysine HCI (racémique) ; sérine (racémique) 6,12 °A) (v/v) de MES 1,0 M et 3,88 % (v/v) imidazole 1,0 M; pH 6,5 De plus, la goutte de cristallisation qui a donné le cristal utilisé pour le recueil des données contenait également 0,05 % (v/v) de 3-butèn-2- ol. 88 3033 172 [0342] La solution de cristallisation était un « cryo direct », c'est-à-dire une solution qui serait soumise à une transition de type vitreux en un solide lors d'un refroidissement rapide dans de l'azote liquide et donc, aucun cryoprotecteur supplémentaire n'a été requis pour congeler le cristal pour le recueil de données. 5 Le cristal a été transféré sur une boucle de montage de cristal et soumis à un refroidissement flash en étant plongé dans de l'azote liquide. Toute la croissance du cristal s'est déroulée dans une pièce à température contrôlée à 16 °C. [0343] Recueil de données de diffraction de rayons X : les données ont été recueillies via un accès distant à l'Advanced Photon Source à Argonne, IL sur la 10 ligne de faisceau 21-ID-D le 18 avril 2013 en utilisant un détecteur MarMosaic 300 CCD. Les données ont été traitées et échelonnées à l'aide de XDS/XSCALE. Le recueil de données, les statistiques d'échelonnage et d'affinement sont résumées dans le tableau suivant : Paramètres Global (coque la plus élevée) Source de rayonnement APS 21-ID-D Date du recueil 18 avril 2013 ,8,4) 1,0° Cadres 250 Distance 300 mm Longueur d'ondes 0,93005 A ID cristal 244270a7, palet ID lab8-4 Groupe spatial P21 Cellule unitaire a = 88,70, b= 111,22, c = 120,42; a = 90,0, [3 = 102,72, y = 90,0 Résolution 2,60 A (2,67 A - 2,60 A) 1/0 16,17 (2,71) Intégralité 99,8 °A (99,9 %) Rmerge 7,4 % (51,4 °A) Réflections (uniques) 284619 (70173) Mutiplicité 4,06 Statistiques d'affinement Rcrist. 17,20 % Ribre 22,20 % Liaisons msd 0,011 Angles msd 1,430 Facteur B moyen 28,64 89 3033 172 [0344] Détermination de la structure des cristaux Emerald : la structure de cdLD a été résolue par remplacement moléculaire à l'aide du programme Phaser tel que mis en oeuvre dans la suite de programmes CCP4 avec un modèle de protéine représentant une structure préliminaire de la même cible créé par Novalix comme 5 modèle de recherche. La solution MR initiale a été affinée à l'aide du programme Refmac5. Le modèle de cdLD a ensuite été affiné en recourant à des cycles alternatifs de reconstitution manuelle dans Coot avec un affinement restreint avec Refmac5. Le rapport R/Rlibre final du modèle était de 17,20 %/22,20 (Yo. [0345] Comme aucun homologue structural n'est connu pour cdLD, la 10 détermination de la phase ne peut être effectuée par remplacement moléculaire, en revanche, on doit recourir à un remplacement isomorphe ou MAD/SAD. Pour les cristaux Novalix, le remplacement isomorphe n'a pas réussi, par conséquent, on a choisi Sel-met MAD pour les cristaux Novalix. Afin d'obtenir une cdLD marquée par Se-met, des cultures ont été réalisées dans un milieu M9 complété 15 avec Se-met 80 mg/m1 dans la souche de bactérie B834. Une culture initiale a été réalisée dans un milieu LB et a été utilisée pour l'inoculation de la culture M9. Ensuite, l'induction avec IPTG a été réalisée à 18 °C pendant la nuit. Un protocole de purification similaire à la cdLD native a été réalisé pour la protéine marquée par Se-met. Un rendement de purification moyen a donné environ 2 mg de cdLD 20 marquée pour 12 L de culture M9. Les cristaux utilisés pour la diffraction de MAD ont été obtenus dans les mêmes conditions que celles de la protéine native. Les cristaux de protéine native et marquée par Se-met font partie du même groupe spatial P21 mais avec 2 cellules différentes. Les cristaux de cdLD Se-met se diffractent uniquement à une résolution de 3,7 A par rapport à une résolution de 25 2,5 A pour un cristal de cdLD native. Après identification et affinement des positions de l'atome de Se, un premier modèle de cdLD a été construit à une résolution de 3,7 A avec le logiciel CCP4 suite et ShelX. Les phases ont ensuite été développées à une résolution de 2,5 A par remplacement moléculaire dans un groupe de données natif. 90 Tableau 1: données de synchrotron de la protéine native CV32 Protéine cdLD native Groupe de données CV32 Source de rayons X Proxima 1 (SOLEIL) Longueur d'ondes (A) 0,98011 Distance de détecteur 439,7 mm Oscillation 0,2° Temps d'exposition 0,2 seconde Tableau 2 : données cristallographiques Groupe de données CV32 Résolution 48,16-2,54 (dernière coque) (A) (2,69-2,54) Groupe spatial P2(1) a = 133,18 A b= 110,83A c = 162,20 A Cellule unitaire a = 90,00° f3 = 107,157° y= 90,00° Réflexions uniques 154892 Intégralité (dernière coque) (°/0) 99,0% (96,10%) Redondance 3,4 II E(I) (dernière coque) 13,84 (2,08) Rsy, (I) (dernière coque) (°/0) 7,71% (58,60%) B de « Wilson plot » 48,08 A2 [0346] Les coordonnées de cristal sont fournies dans l'Annexe 1 pour le cristal Novalix et l'Annexe 2 pour celui d'Emerald. [0347] Les statistiques pour la structure résolue des cristaux Novalix sont 5 présentées dans les Tableaux 1 et 2 6. Caractéristiques générales du modèle 3D haute résolution d'apocd LD [0348] Partie I : Novalix : cdLD adopte une disposition pentamérique associée à une symétrie axiale de facteur 5 dans l'unité asymétrique (chaîne marquée A à E). 10 Chaque monomère adopte un repliement en tonneau 0/0(6), un repliement généralement inhabituel qui peut être observé sur la FIGURE1. Dans la structure 91 cristalline, un pont disulfure est formé entre Cys74 et Cys127 de chaque sous-unité (numérotation de structure cristalline). Une recherche d'homologie structurale à l'aide du programme DALI a donné divers homologues structuraux. Un alignement structural entre le monomère de cdLD et certains des succès d'alignement DALI a révélé que les enzymes qui sont structurellement homologues à cdLD ont toutes leurs sites actifs en « haut » du tonneau, les résidus catalytiques étant soutenus par les hélices internes qui revêtent l'intérieur du tonneau (hélices 4, 7, 9, 11, 13, 14) et les boucles reliant ces hélices sont les hélices externes du tonneau. Conformément aux autres enzymes adoptant un repliement similaire, cdLD présente une fente marquée dans cette même région alors que le reste de la sous-unité est complètement exposée au solvant de façon étroitement compacte. Par conséquent, nous avons émis l'hypothèse selon laquelle la position probable du site actif de la cdLD responsable de l'activité catalytique observée est située dans cette région. Contrairement à la plupart des homologues structuraux de cdLD, ce site actif hypothétique est formé à l'interface entre des sous-unités, par exemple, A et B sur la FIGURE 1. La boucle 62-77 (numérotation de la structure cristalline) de la sous-unité B dépasse et ferme la poche formée par le haut du tonneau de la sous-unité A, voir la FIGURE 2. [0349] Ci-dessous est présentée la cartographie des résidus d'acides aminés (dans la numérotation de peri-cdLD de type sauvage) pour chaque élément structural secondaire. Une attribution de structure secondaire a été réalisée à l'aide du logiciel DSSP (noter que le terme « hélices » comprend ici a, 310 et 7). Les boucles ne sont pas comprises car elles constituent effectivement toutes les positions restantes. Voir également la FIGURE 3. 92 3033 172 Hélice Résidus de début - fin (numérotation peri-cdLD [SEQ 1]) H1 37-41 H2 43-46 H3 51-61 H4 77-82 H5 86-106 H6 108-125 H7 128-131 H8 133-136 H9 149-165 H10 172-188 H11 203-220 H12 228-236 H13 264-274 H14 279-293 Si 294-296 H15 298-300 S2 303-305 H16 321-331 H17 335-345 S3 351-353 S4 358-360 H18 368-377 H19 381-385 [0350] Tableau 3 : numéros de résidus pour chaque élément de structure secondaire (hélices H et brin S) de cdLD, sur la base de la structure cristalline de haute résolution. Les attributions de structure secondaires ont été obtenues avec DSSP 2.2.1. Les annotations d'hélice comprennent les hélices CI, 310 et O. Les 5 brins correspondent aux résidus dans la conformation étendue, qu'ils forment réellement ou non des brins 0. [0351] Partie Il : cristaux Emerald 93 3033 172 [0352] L'unité asymétrique du cristal cdLD est un pentamère présentant une symétrie axiale de facteur 5. Chaque sous-unité individuelle forme une interaction tête-queue avec une sous-unité voisine où une boucle autour de Tyr70 dépasse dans une cavité au centre du tonneau de l'hélice 6-alpha du monomère de cdLD 5 (figure du haut). A cette interface se trouve une poche étroite, de >10 A de profondeur, qui comprend le site actif hypothétique (Figure 16). [0353] Pendant l'affinement de la structure du cristal Emerald, une caractéristique de densité électronique significative a été observée dans l'ensemble des cinq 10 sous-unités entre les résidus Cys196 (cdLD de type sauvage ; mais Cys197 pour cdLD de type sauvage avec un acide aminé N-terminal supplémentaire) et Cys205 (cdLD de type sauvage ; mais Cys206 pour cdLD de type sauvage avec un acide aminé N-terminal supplémentaire). La forme de la caractéristique de densité électronique et la coordination chimique autour du site correspondaient à 15 une liaison d'ion métallique. L'ion métallique était supposé être le zinc mais l'identité réelle est inconnue. Aucun atome de zinc ou autre métal divalent n'était présent dans la solution de cristallisation, toutefois, un ion métallique pourrait avoir été transporté pendant la purification ou être présent à l'état de contaminant trace du matériel en verre. Des caractéristiques supplémentaires de faible densité 20 électronique (treillis vert sur la figure 17) ont été observées mais non modélisées. Les caractéristiques de densité électronique observées n'étaient pas conformes à celles du 3-butèn-2-ol ou des molécules d'eau individuelles. Une explication est que le 3-butèn-2-ol et/ou d'autres composants de cristallisation pourraient avoir été présents à un faible taux d'occupation et/ou dans de multiples conformations dans la fente du site actif hypothétique, empêchant l'apparition d'une densité électronique claire. 7. Mutants du site actif de cdLD sur la base des données de cristaux Novalix [0354] Sur la base de l'analyse visuelle du site actif hypothétique, une liste de groupes polaires revêtant la poche du site actif a été choisie pour effectuer en outre une mutagenèse pour évaluer leur effet sur l'activité catalytique pour la réaction de type sauvage catalysée de façon native par cdLD. La liste des résidus des sites actifs candidats et des mutations proposées qui sont censées affecter l'activité catalytique est présentée dans le Tableau 4 ci-dessous. 94 cdLD périplasmique dans BL21 avec PGro7 cdLD cytoplasmique dans Origami2(DE3) cdLD périplasmique dans BL21 avec PGro7 cdLD cytoplasmique dans Origami2(DE3) Mutant Y99F Protéin Activité Protéin e sur PAGE faible Activité avec linalol Mutant H115D Protéin e sur PAGE Activité avec linalol Protéi Activité avec linalol Y99A Y92F Y92A e sur avec faible par- H115A E198Q E198A faible 1 ne sur par- Y71F PAGE 1 linalol + : tielle D65N D65A 5+ I ou PAGE tielle Y71A + faible OUI partielle C206S 1 OUI faible 1 Y266F faible par- C206A C197S ND I OUI Y266A faible tielle C197A 1 OUI Q205L faible 1 par- Par- WT peri WT cyto Q205A : tielle tielle M151L OUI M151K M151A + 1 partielle [0355] Tableau 4. Résidus catalytique hypothétiques, activité catalytique proposée des mutations knock-out et impact sur l'expression des protéines (peri-cdLD ou cyto-cdLD) et activité catalytique pour la déshydratation du linalol en myrcène. [0356] Chaque mutant a été exprimé et testé pour déterminer son activité de déshydratase du linalol de type sauvage (exemple 4). A partir de ces résultats, on a prévu que les résidus suivants sont des résidus catalytiques candidats : CYS197, CYS206, ASP65 et GLU198. Ce sont les seuls résidus pour lesquels cdLD a été exprimé et aucune activité catalytique par rapport à la déshydratation du linalol n'a été observée. 8. cdLD mutantes entraînent une production de butadiène accrue [0357] a. Activité dans les cultures cellulaires (à savoir, activité in vivo) [0358] Environ 400 cdLD mutantes et homologues de séquence ont été criblés pour déterminer leur activité avec 3B20 comme substrat. Voir l'Annexe 3 pour les 95 séquences. Toutes les constructions ont été élaborées dans le plasmide pARZcdLD. Ce plasmide est issu du vecteur PET-29a, le gène cdLD ayant été cloné entre les sites de restriction Ndel et Xhol. Le vecteur d'expression contient le promoteur T7, un opérateur lac et une étiquette His N-terminale. Les variants de cdLD décrites ici ont été construites chez Gene9 Inc. (Cambridge, MA) avec les procédés déposés de cette société. Tous les gènes ont été synthétisés avec les surplombs suivants : CTCTTCTTAACTTTAAGAAGGAGATATACAT (en amont) et CTCGAGCATCATCATCATCATCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGGA AGAG (en aval) (SEQ ID N° 15-16, respectivement). Dix microlitres de chaque variant de cdLD ont été séparés par une enzyme de restriction Earl (New England Biolabs) et purifiés par un kit de purification par PCR Qiagen QiaQuik selon le protocole du fabricant. Ensuite, toutes les constructions ont été clonées dans pARZ-4, qui est identique au plasmide pARZ-cdLD excepté le fait que le gène cdLD est remplacé par un fragment de remplissage. Le squelette de pARZ-4 a été amplifié avec les amorces suivantes . G i bsV4 Rev (GTATATCTCCTTCTTAAAGTTA) et G i bsV3for (TGAGATCCGGCTGCTAACAAAGC) (SEQ ID N° 17-18, respectivement). Chaque réaction d'amplification par PCR contenait 30 pmoles de chaque amorce et 100 ng de matrice d'ADNe. Les amplifications ont été réalisées en utilisant l'ADN polymérase Pfu Ultra II Hotstart (Agilent, cat#600850-51). La réaction de PCR (20 pL) a été initialement chauffée à 95 °C pendant 2,5 min suivie par 30 cycles de dénaturation à 94 °C pendant 15 sec., annelage à 55 °C pendant 15 sec. et allongement à 72 °C pendant 5 min. Après l'amplification, le fragment de PCR a été purifié sur gel par le kit de purification sur bande de gel QIAGENO selon le protocole du fabricant. 1 pl du vecteur amplifié (environ 0,05 pmoles) a été mélangé avec 4 pl (env. 0,3 pmoles) de variant de cdLD et 5 pl de 2x mélange Gibson Assembly (New England Biolabs, cat# M5510AA) et incubé pendant 1 h à 50 °C. Après incubation, chaque mélange a été dilué dans de l'eau stérile (4 fois) et transformé dans des cellules compétentes XL1Blue (Agilent) selon le protocole du fabricant. Les cellules transformées ont été étalées sur de plaques LB contenant 25 pg/mL de kanamycine et incubées pendant la nuit à 37 °C. Le lendemain, les colonies ont été testées pour déterminer la présence de l'insert par PCR des colonies. Les colonies ont été prélevées et remises en suspension dans 20 pl de solution stérile de chlorure de sodium à 0,9 %. Un pl de cette solution a 96 été transféré dans le tube de PCR et amplifié avec de la Taq polymerase (New England Biolabs, cat# M0482S) et 30 pmoles d'amorces P1 (ATAGGCGCCAGCAACCGCAC) et P2 (GCAGCAGCCAACTCAGCTTC) (SEQ ID N° 19-20, respectivement). Chaque réaction de PCR (20 pL) a été chauffée initialement à 95 °C pendant 2,5 min suivi de 30 cycles de dénaturation à 94 °C pendant 15 sec., annelage à 55 °C pendant 15 sec. et allongement à 72 °C pendant 1 min. Les produits d'amplification ont été visualisés par électrophorèse sur agarose. Des clones avec les inserts corrects ont été inoculés dans les tubes de culture contenant 5 ml de LB et 25 pg/mL de kanamycine et incubés pendant la nuit à 37 °C. Le lendemain, les constructions ont été purifiées par un kit Qiagen miniprep et transformées dans des cellules compétentes BL21(DE3) (achetées chez Invitrogen). Ces cellules ont été étalées sur des plaques LB contenant 25 pg/mL de kanamycine et incubées pendant la nuit à 37 °C. [0359] Chaque mutant a été testé avec l'essai de 1 ml de butadiène (Exemple 3).
Les clones qui ont produit du butadiène à des niveaux comparables ou supérieurs à ceux de l'enzyme de type sauvage ont été cultivés à nouveau en plusieurs répliques et re-testés en utilisant le même essai avec 1 ml de butadiène. Les variants les plus intéressants ont été retransformés dans des cellules BL21 (DE3) pour éviter l'influence potentielle de mutations somatiques de l'hôte et testées également à nouveau dans un essai avec 1 ml de butadiène. Certains des résultats sont présentés sur la FIGURE4. En premier lieu, quatre clones ont présenté une amélioration marquée de la production de butadiène in vivo par rapport à l'enzyme peri-cdLD de type sauvage. Il s'agissait des clones 91 (V1231, V2041, M274F, V275I), 92 (V1231, V2041, M274F, V275I, F382W), du clone 1 (A324L) et du clone 31 (R360Y). Le clone 90 (V1231, V204I, V275I) différait du clone 91 par une seule mutation (M274F), mais n'a pas entraîné d'accroissement de la production du butadiène. [0360] Un groupe supplémentaire de mutants a été testé dans le même essai. les résultats sont présentés sur la FIGURE 5. Le mutant A324L qui faisait partie du clone 1 ci-dessus, s'est avéré à nouveau entraîner un accroissement de l'activité catalytique dans cet essai avec 1 mL de butadiène. On a également constaté que la mutation A324E avait une activité similaire. En revanche, la mutation A324C s'est révélée sans effet sur la production de butadiène. D'autres mutants qui 97 présentaient une activité accrue étaient : L328V, S366V, S366C et L212F. L'accroissement le plus élevé a été obtenu avec le mutant S366V. [0361] Plusieurs mutations supplémentaires ont été introduites dans chacun de ces mutants améliorés pour essayer d'augmenter encore leur activité. Les résultats sont présentés sur les Figures 6-8. Comme on peut le voir sur la FIGURE 6, trois clones différents présentant des doubles mutations identiques A324L et S366G ont présenté une production accrue de butadiène par rapport à leur parent (A324L) et au type sauvage. Le mutant M274F s'est avéré un producteur de butadiène moins efficace que le type sauvage. L'addition de F96L (double mutant M274F et F96L) a entraîné une augmentation de la production de butadiène (FIGURE 7). L'addition de mutations à S366V (FIGURE 8) et V275I (FIGURE 9) n'a pas amélioré la production de butadiène par rapport au taux obtenu avec le type sauvage. L'addition de la mutation L328V sur F328W (double mutant F382W-L328V) a semblé améliorer la production de butadiène (FIGURE 10). [0362] b. Activité dans les échantillons purifiés [0363] Quatre variants de cdLD ont été purifiés avec la procédure de purification standard avec marqueur His décrite dans l'Exemple 2 : type sauvage, clone 91, clone 30 et clone31. Les protéines ont été diluées à la même concentration. 250 pl de solution de protéine purifiée ont été transférés dans un flacon à sertir avec 2,5 pl de 3-butèn-2-ol 1,1 M (concentration finale de 11 mM), scellés et incubés à température ambiante pendant 72 h. Après incubation, les échantillons ont été analysés par un dispositif Shimadzu GCMS-QP2010 Ultra avec colonne Agilent HP PLOT/Q (0,32mm, 15 m de longueur, 20 pm de diamètre) comme on le décrit ci-dessus pour l'essai avec 1 ml de butadiène. Les résultats sont présentés sur la FIGURE11. Aucun des variants n'a présenté une amélioration de la production de butadiène lorsqu'ils ont été testés dans cet essai. [0364] Un autre protocole de purification a également été utilisé. A partir d'une plaque LB assez fraîche contenant le clone transformant souhaité, une colonnie (ou un petit prélèvement par grattage) a été prélevé pour inoculer 10 à 50 mL de LB complété avec l'antibiotique pertinent et la pré-culture a été incubées pendant la nuit à 37 °C, 230 tr/min. [0365] Le lendemain matin, on a préparé le milieu TB d'auto-induction (Merck / Code produit : 71491-5) en mélangeant 60 g de TB / L complémenté avec 10 mL 98 3033 172 de glycérol / L de TB et placer au micro-ondes pendant 3 + 2 minutes à pleine puissance. On laisse le TB refroidir sous la hotte avant de l'utiliser et de le répartir dans des fioles stériles. Ensuite, on centrifuge la pré-culture incubée pendant la nuit et le surnageant est éliminé. On remet en suspension la préculture dans 1 à 5 5 mL de milieu TB fraîchement préparé et on l'utilise pour inoculer 100 à 500 mL de TB distribué dans des fioles stériles, complété avec l'antibiotique approprié. Les fioles inoculées sont incubées à 28-30° C pendant au moins 20 h, à 230 tr/min. [0366] La culture principale est centrifugée au moins à 3000 g / 20 min / 4 °C et les pellets sont utilisés immédiatement. Les pellets sont remis en suspension 10 dans 10 à 20 mL de tampon A (=50 mM Tris + 150 mM NaCI + 40 mM Imidazole + 5 % glycérol - pH 8,5). [0367] Les cellules sont remises en suspension puis soniquées sur glace pendant g--.. 5 min à 35-40 % d'amplitude avec impulsions de sonication de 5" sur ON et 15" sur OFF. Les cellules soniquées sont centrifugées pendant au moins 15500 g, 15 20 min à 4 °C. Le surnageant contenant la fraction soluble des protéines a été récupéré et utilisé pour la purification de la protéine His-trap.La fraction soluble filtrée des protéines obtenues après extraction des protéines par sonication a été utilisée pour la purification de la protéine de marqueur His. Une colonne de 1 mL His-trap (CE Healthcare / Code produit : 17-5319-01) a été équilibrée avec 5- 20 10 volumes de colonne (VC) à l'aide du tampon A*. La fraction soluble des protéines a été chargée manuellement sur la colonne His-trap à l'aide d'une seringue et on a utilisé 5-10 VC de tampon A pour laver la colonne His-trap. On a utilisé 5-10 VC de tampon B** pour éluer directement la protéine de marqueur His sur une unité de filtration par centrifugation de 4 ou 20 mL (VWR / Code produit : 25 512-2850) avec un seuil correspondant (5 kD). L'unité de centrifugation a été utilisée à 3500 g / 5 °C jusqu'à un volume inférieur à 400 pL de concentré. Environ 3 mL de tampon C ont été ajoutés au concentré et l'unité de centrifugation a été utilisée à nouveau à 3500 g / 5 °C jusqu'à un volume inférieur à 400 pL. Cette étape a été réalisée pour éliminer la majeure partie de l'imidazole 30 utilisé dans le tampon B pour éluer l'étiquette His. [0368] Le concentré a été récupéré et selon la concentration de travail (=.. 2 mg/mL), le tampon C a été utilisé pour complété le volume souhaité. La concentration a été vérifiée à l'aide d'un spectrophotomètre Nanodrop. 99 3033 172 [0369]* Tampon A = 50 mM Tris + 150 mM NaCI + 40 mM Imidazole + 5% (v/v) glycérol - pH 8,5 [0370]** Tampon B = tampon A + 400 mM imidazole - pH 8,5 [0371] ' Tampon C = tampon A sans imidazole - pH 8,5 5 [0372] Les protéines purifiées ont été utilisées pour l'essai du butadiène. Un mélange réactionnel de 1 mL constitué de 2 mg/mL de chaque enzyme purifiée avec 10 mM de 3-butèn-2-ol ou 3-méthy1-3-butèn-2-ol pour la biosynthèse du 1,3-butadiène ou de l'isoprène respectivement, a été préparé dans 1,7 mL de flacon en verre serti. Les flacons ont été incubés pendant au moins 48 h à 30 °C, 170 10 tr/min.Le butadiène et l'isoprène ont été analysés par GC-MS à espace de tête en utilisant une norme authentique pour déterminer une courbe de quantification standard. [0373] Les résultats sont présentés sur la FIG.
12A. Les mutants F382W/L328V ; F382W/L328V/I187M ; et A324L/S366G présentaient tous une activité accrue de 15 in déshydratation du 3-butèn-2-ol en butadiène, par rapport à cdLD de type sauvage. [0374] Les trois mêmes mutants, purifiés de la même façon, ont également été testés pour déterminer leur capacité à produire de l'isoprène à partir du 3-méthy1- 3-butèn-2-ol. 20 [0375] Un mélange réactionnel de 1 mL constitué de 2 mg/mL de chaque enzyme purifiée avec 10 mM de 3-méthy1-3-butèn-2-ol pour la biosynthèse de l'isoprène a été préparé dans un flacon en verre serti de 1,7 mL. [0376] Les flacons ont été incubés pendant au moins 48 h à 30 °C, 170 tr/min. L'isoprène a été analysé par GC-MS à espace de tête en utilisant une norme 25 authentique pour déterminer une courbe de quantification standard. Les résultats sont présentés sur la FIG.
12B. Là encore, tous les mutants F382W/L328V ; F382W/L328V/I187M ; et A324L/S366G ont présenté une activité accrue de production d'isoprène par rapport à cdLD de type sauvage. 9. Caractérisation supplémentaire de l'activité du clone 91 30 [0377] a. Etude de l'effet de mutations individuelles dans le clone 91 [0378] Pour analyser les mutations du clone 91 qui contribuent à accroître la production de butadiène, chacune des mutations a été créée individuellement dans cdLD de type sauvage. De même, chaque mutation a été retirée individuellement du clone 91. Le choix de se concentrer sur le 91 était basé sur le 100 3033 172 fait qu'il s'agissait de l'un des clones qui s'est avéré précédemment entraîner le niveau d'activité le plus élevé. Une mutagenèse a été réalisée par PCR d'extension. Les mutations et amorces correspondantes sont énumérées dans le Tableau 5 et sur la FIGURE 6. Pour créer chaque mutant, deux fragments ont été 5 amplifiés. Le fragment de gauche a été amplifié par des amorces P1 (ATAGGCGCCAGCAACCGCAC) (SEQ ID NO: 21) et l'amorce inverse présentée dans le Tableau 5. Le fragment de droite a été amplifié par l'amorce sens présentée dans le Tableau 6 et l'amorce P2 (GCAGCAGCCAACTCAGCTTC) (SEQ ID NO: 22). Chaque réaction d'amplification par PCR contenait 30 pmoles 10 de chaque amorce et 100 ng de matrice d'ADN. Les amplifications ont été réalisées avec une ADN polymérase Pfu Ultra II Hotstart (Agilent, cat#600850- 51). Le mélange réactionnel de pCR (20 pL) a été chauffé initialement à 95 °C pendant 2,5 min suivi de 30 cycles de dénaturation à 94 °C pendant 15 sec., annelage à 55 °C pendant 15 sec. et allongement à 72 °C pendant 1 min. Après 15 amplification, le fragment de PCR a été purifié sur gel par le kit de purification sur bande de gel QIAGENO et mélangé (50 ng de chaque fragment). Ces mélanges ont servi de matrice pour la PCR d' extension par les amorces GibsV4ins-for (TTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATTAC) et GibsV3ins-rev (GGCTTTGTTAGCAGCCGGATCT) (SEQ ID N° 23-24, respectivement) pour 20 générer un fragment de gène de pleine longueur. Les conditions de PCR étaient les mêmes que celles décrites ci-dessus. Le fragment d'ADN de pleine longueur a été purifié sur gel par le kit de purification sur bande de gel QIAGENO. Ensuite, on a mélangé 4 pl (env. 0,3 pmoles) du fragment de PCR avec 1 pl du vecteur de clonage amplifié (environ 0,05 pmoles) et 5 pl de mélange 2x Gibson Assembly 25 (New England Biolabs, cat# M5510AA) et incubé pendant 1 h à 50 °C. Après l'incubation, chaque mélange a été dilué avec de l'eau stérile (4 fois) et transformé dans des cellules compétentes XL1Blue (Agilent) selon le protocole du fabricant. Les cellules transformées ont été étalées sur des plaques LB contenant 50 pg/mL de kanamycine et incubées pendant la nuit à 37 °C. Le lendemain 30 matin, les colonies ont été prélevées par grattage de la plaque. L'ADN plasmidique a été isolé avec un kit Qiagen Miniprep et transformé dans des cellules compétentes BL21 (DE3) (Invitrogen). Les transformations ont été étalées sur des plaques LB contenant 25 pg/mL de kanamycine et incubées pendant la nuit à 37 °C. Les colonies obtenues ont été prélevées dans 400 pl de milieu LB 101 contenant 50 pg/mL de kanamycine dans des plaques de 96 puits profonds et utilisées encore dans le criblage de 1 ml de butadiène (voir ci-dessus). Les clones qui ont produit le butadiène à des niveaux comparables ou supérieurs à ceux de l'enzyme de type sauvage ont été cultivés à nouveau dans plusieurs répliques et re-testés en utilisant le même essai avec 1 ml de butadiène (criblage secondaire). Variant Amorce inverse Séquence d'amorce inverse Retrait de V1231 du clone 91 123V-R ACATTTCATTTTTGAGACTGCAATATCTAAGTCGTGG Retrait de V2041 du clone 91 204V-R AGAGTTGCATTGTACAAAATAGTTGTCTGGTTCACAAAC Retrait de M274F du clone 91 274M-R ATCCATTCCATGAATCATAGCTAACGTCCAAGCGGTTGT Retrait de V275I du clone 91 275I-R GATCCATTCCATGCACGAAAGCTAACGTCCAAGCGGTTGT M274F, V275I 274F-275I-R ATCCATTCCATGAATGAAAGCTAACGTCCAAGCGGTTGT M274F M274F-R ATCCATTCCATGCACGAAAGCTAACGTCCAAGCGGTTGTA V275I V2751-R GATCCATTCCATGAATCATAGCTAACGTCCAAGCGGTTGT A324L A324L-R TAATAAAAGTGTGAATAAAGAGGCTAAACCCACACCACC R360Y R360Y-R GCCTGGGTGTTCGTAnGTAnGAGGCTAGCAGAAACGATGCTT F382W F382W-R GTAACAGAGCACCCCATCCGGCATGTACTTTGGCAAG V1231 V123I-R ACATTTCATTTTTGAAATTGCAATATCTAAGTCGTGG V2041 V204I-R CAGAGTTGCATTGAATAAAATAGTTGTCTGGTTCACAAAC [0379] Tableau 5. Séquences des amorces inverses (SEQ ID N° 25-36, respectivement, par ordre d'apparition) utilisés pour créer des mutations pour déconvoluer le clone 91 Variant Amorce sens Séquence d'amorce sens Retrait de V1231 du 123V-F TTAGATATTGCAGTCTCAAAAATGAAATGTAAACGTGTATG 102 clone 91 Retrait de V2041 du clone 91 204V-F GACAACTATTTTGTACAATGCAACTCTGTGGCCTATTT Retrait de M274F du clone 91 274M-F TGGACGTTAGCTATGATTCATGGAATGGATCCTGCCTTTTC Retrait de V275I du clone 91 275I-F TGGACGTTAGCTTTCGTGCATGGAATGGATCCTGCCTTTTC M274F, V275I 274F-275I-F TGGACGTTAGCTTTCATTCATGGAATGGATCCTGCCTTTTC M274F M274F-F GCTTGGACGTTAGCTTTCGTGCATGGAATGGATCCTGCCTT V275I V2751-F ACGTTAGCTATGATTCATGGAATGGATCCTGCCTTTTC A324L A324L-F GTGGGTTTAGCCTCTTTATTCACACTTTTATTAGCCCGCGAAA R360Y R360Y-F GTTTCTGCTAGCCTCTACTACGAACACCCAGGCAGCCT F382W F382W-F CAAAGTACATGCCGGATGGGGTGCTCTGTTACGTATGC V1231 V1 23I-F TTAGATATTGCAATTTCAAAAATGAAATGTAAACGTGTATG V2041 V204I-F GACAACTATTTTATTCAATGCAACTCTGTGGCCTATTT [0380]Tableau 6. Séquences des amorces sens (SEQ ID N° 37-48, respectivement, par ordre d'apparition) utilisées pour créer des mutations pour déconvoluer le clone 9. [0381] Un résumé des résultats de criblage est présenté dans le Tableau 7.
5 Plusieurs variants présentaient une production accrue de butadiène. Elles présentaient la combinaison de mutations suivantes : V123I/ V2041/M274F ; M274F/V275I/F382W ; V275I/A324L ; V275I ; V1231 ; et V2041. [0382] Variant Mutants Production relative de butadiène (WT=1) Ecart type 1 V2041, M274F, V2751 1,08 0,03 103 3033 172 2 V1 23I, M274F, V2751 0,74 3 V1231, V2041, V275I 0,89 0,17 4 V1 23I, V2041, M274F 1,265 0,01 M274F, V2751 0,45 0,11 6 M274F, A324L 0,55 7 M274F, R360Y 0,67 9 M274F, V2751, A324L 0,815 0,3 11 M274F, V275I, F382W 1,705 0,64 13 M274F, A324L, F382W 0,725 0,5 17 M274F, V275I, R360Y, F382W 0,905 0,42 21 V2751, A324L 1,66 0,34 23 V2751, F382W 0,84 0,07 24 V2751, A324L, R360Y 0,65 0,06 25 V2751, A324L, F382W 0,635 0,25 31 R360Y, F382W 1,235 0,47 32 M274F 0,675 0,01 33 V275I 2,135 0,33 34 A324L 1,64 0,04 35 R360Y 1,925 0,02 36 F382W 0,72 0,1 37 V1231 1,925 0,6 38 V2041 1,55 0,07 WT WT cdLD 1 0 clone 91 clone 91 1,425 0,15 [0383] Tableau 7. Production relative de butadiène par des variants périplasmiques de cdLD. [0384] b. Mutagénèse combinatoire [0385] De nombreux mutants ont été créés en combinant deux ou plusieurs des 5 mutations d'amélioration définies dans les paragraphes précédents. Plus spécifiquement, plusieurs mutations ont été imposées en sus aux mutants d'arrière-plan suivants : A324L, S366V, A324L-S366G, M274-F96L et F382WL328V. [0386] Des clones qui produisaient du butadiène à des niveaux comparables ou 10 supérieurs à ceux de l'enzyme de type sauvage ont été cultivés à nouveau dans plusieurs répliques et re-testés en utilisant le même essai de 1 ml de butadiène (criblage secondaire). Les résultats de l'essai de ces clones sont présentés sur la 104 3033 172 FIGURE 13. L'addition de la plupart des mutations testées à A324L ou S366V ne s'est pas avérée améliorer l'activité de cdLD. Beaucoup des variants ne présentaient pas de production de butadiène. Par conséquent, on a supposé que ces mutations avaient un faible potentiel combinatoire. L'association de mutations 5 (A324L et S366V) a généré un variant sans activité. En même temps, l'addition de mutations à la combinaison A324L et S366G a généré plusieurs combinaisons présentant des signes d'accroissement (addition de H84A et V1231). L'addition des mutations R170D F96L et F382W à la combinaison de M274-F96L et de la mutation I187M à la combinaison de F382W-L328V a également semblé améliorer la production de butadiène production dans l'essai avec 1 mL. Ces variants ont été testés à nouveau dans le criblage secondaire (FIGURE 14) et seule deux variants ont présenté une production supérieure de butadiène par rapport à cdLD de type sauvage : la combinaison de A324L, S366G et de F382W, L328V, I187M. [0387] Certains de ces mutants ont été purifiés comme le décrit l'Exemple 2 et re- testés pour déterminer si leur activité spécifique était supérieure à celle de cdLD. Les protéines purifiées ont été diluées à la même concentration. 250 pl de solution de protéine purifiée ont été transférés dans un flacon à sertir avec 2,5 pl de 3-butèn-2-ol 1,1 M (concentration finale de 11 mM), scellées et incubées à température ambiante pendant 72 h. Après l'incubation, les échantillons ont été analysés par un dispositif Shimadzu GCMS-QP2010 Ultra avec colonne Agilent HP PLOT/Q (0,32 mm, 15 m de longueur, 20 pm de diamètre) comme précédemment pour l'essai avec 1 ml de butadiène. Les résultats sont présentés sur la FIGURE 15. Les deux variants (combinaison de A324L, S366G et de F382W, L328V, I187M) produisent plus de butadiène que cdLD de type sauvage, avec jusqu'à 3x la quantité de butadiène produit pour le variant A324L, S366G. [0388] 10. Séquences des polypeptides décrits ici. Description abbreviated.

Claims (4)

  1. 9 REVENDICATIONS 1. Polypeptide comprenant une séquence d'acides aminés présentant une homologie de séquence d'acides aminés d'au moins 90 % avec SEQ ID NO: 1, dans lequel ladite séquence d'acides aminés comprend une à cinq mutations aux positions X suivantes de SEQ ID NO: 1 : R1_95X96R97-98X99R100-122X123R124-186X187R188-203X204 8205-211X212R213- 272X273X274X275 8276-323X3248325-327X3288329-R359X3608361-365X3668367-381X3828383-398, dans laquelle : X382 est muté en un acide aminé différent choisi parmi W et des acides aminés équivalents, éventuellement F382W : X328 est muté en un acide aminé différent choisi parmi V et des acides aminés équivalents, éventuellement L328V ; X187 est muté en un acide aminé différent choisi parmi M et des acides aminés équivalents, éventuellement I187M ; X96 est muté en un acide aminé différent choisi parmi L et des acides aminés équivalents ; X99 est muté en un acide aminé différent choisi parmi L et des acides aminés équivalents ; X123 est muté en un acide aminé différent choisi parmi I et des acides aminés équivalents ; X204 est muté en un acide aminé différent choisi parmi I et des acides aminés équivalents ; X212 est muté en un acide aminé différent choisi parmi F, Y, et des acides aminés équivalents ; 961X273 est muté en un acide aminé différent choisi parmi C et des acides aminés équivalents ; X274 est muté en un acide aminé différent choisi parmi F et des acides aminés équivalents ; X275 est muté en un acide aminé différent choisi parmi I et des acides aminés équivalents ; X324 est muté en un acide aminé différent choisi parmi L, E, et des acides aminés équivalents ; X360 est muté en un acide aminé différent choisi parmi Y et des acides aminés équivalents ; X366 est muté en un acide aminé différent choisi parmi V, C, G, et des acides aminés équivalents ; et chaque R est identique à l'acide aminé correspondant dans SEQ ID NO: 1 ; et éventuellement dans laquelle la séquence d'acides aminés comprend au moins une mutation choisie parmi F382W, L328V et 1187M, de préférence, toutes les trois, de manière davantage préférée, comprenant la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO: 462 ou SEQ ID NO: 462 sans l'étiquette périplasmique.
  2. 2. Polypeptide selon la revendication 1, dans lequel X187 est muté en un acide aminé différent choisi parmi M et des acides aminés équivalents.
  3. 3. Polypeptide selon la revendication 1, dans lequel X328 est muté en un acide aminé différent choisi parmi V et des acides aminés équivalents.
  4. 4. Polypeptide selon la revendication 1, dans lequel X382 est muté en un acide aminé différent choisi parmi W et des acides aminés équivalents. 962. Polypeptide selon la revendication 1, comprenant les deux mutations suivantes : F382W et L328V ; de préférence, comprenant uniquement ces deux mutations. 6. Polypeptide selon la revendication 1, comprenant les trois mutations suivantes : F382W, L328V et 1187M ; de préférence, comprenant uniquement ces trois mutations. 7. Polypeptide comprenant une séquence choisie parmi la liste de séquences de l'Annexe 3 (SEQ ID NO: 124-458). 8. Polypeptide comprenant une séquence choisie parmi la liste de séquences du Tableau 9 (SEQ ID NO: 4 et SEQ ID NO: 88-123). 9. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel ladite séquence d'acides aminés comprend en outre une étiquette His C-terminale (His6 ou SEQ ID NO: 6). 10. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans lequel ladite séquence d'acides aminés est dépourvue d'étiquette périplasmique (SEQ ID NO: 3). 11. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, le polypeptide ayant une activité dans la catalyse de la déshydratation du 3-butèn-2- ol en 1,3-butadiène qui est d'au moins 80 % de celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8, augmentée d'un facteur 1,5 environ ou supérieur par rapport à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8, de préférence, d'un facteur 2 environ ou supérieur par rapport à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8, de préférence d'un facteur 2,5 environ ou supérieur par rapport à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8, de préférence d'un facteur 3 environ ou supérieur par rapport 963à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7, ou 8, de préférence d'un facteur 3,5 environ ou supérieur par rapport à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8, de préférence d'un facteur 4 environ ou supérieur par rapport à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8, de préférence d'un facteur 4,5 environ ou supérieur par rapport à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8 ou de préférence d'un facteur 5 environ ou supérieur par rapport à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8, et dans lequel ladite activité est observée dans au moins un essai d'activité. 12. Polypeptide selon la revendication 11, dans lequel ladite activité dans la catalyse de la déshydratation du 3-butèn-2-ol en 1,3-butadiène est observée dans au moins un type de cellules non bactériennes. 13. Polypeptide selon la revendication 11, dans lequel ladite activité dans la catalyse de la déshydratation du 3-butèn-2-ol en 1,3-butadiène est observée dans au moins un type de bactéries. 14. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, le polypeptide ayant une activité dans la catalyse de la déshydratation du 3-butèn-2- ol en isoprène qui est d'au moins 80 % de celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8, augmentée d'un facteur 1,5 environ ou supérieur par rapport à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8, de préférence, d'un facteur 2 environ ou supérieur par rapport à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8, de préférence d'un facteur 2,5 environ ou supérieur par rapport à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8, de préférence d'un facteur 3 environ ou supérieur par rapport à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7, ou 8, de préférence 964d'un facteur 3,5 environ ou supérieur par rapport à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8, de préférence d'un facteur 4 environ ou supérieur par rapport à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8, de préférence d'un facteur 4,5 environ ou supérieur par rapport à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8 ou de préférence d'un facteur 5 environ ou supérieur par rapport à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8, ou de préférence d'un facteur 15 environ ou supérieur par rapport à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8 dans lequel ladite activité est observée dans au moins un essai d'activité ou de préférence, d'un facteur 55 environ ou supérieur par rapport à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8, de préférence, d'un facteur 30 environ ou supérieur par rapport à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8, et dans lequel ladite activité est observée dans au moins un essai d'activité. 15. Polypeptide selon la revendication 14, dans lequel ladite activité dans la catalyse de la déshydratation du 3-méthy1-3-butèn-2-ol en isoprène est observée dans au moins un type de cellules non bactériennes. 16. Polypeptide selon la revendication 14, dans lequel ladite activité dans la catalyse de la déshydratation du 3-méthyi-3-butèn-2-ol en isoprène est observée dans au moins un type de bactéries. 17. Polynucléotide comprenant, constitué de ou consitutué essentiellement d'un acide nucléique codant pour l'un quelconque des polypeptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, de préférence, avec une optimisation des codons. 965 3033 172 18. Polynucléotide selon la revendication 17, dans lequel le polynucléotide est soit une molécule d'ADN, soit une molécule d'ARN. 19. Molécule d'ADN selon la revendication 18, comprenant en outre un promoteur lié fonctionnellement à la séquence d'acide nucléique codant pour le polypeptide ou dérivé. 20. Vecteur d'expression recombinant comprenant une molécule d'ADN selon l'une quelconque des revendications 17 à 19. 21. Cellule hôte qui est transformée ou transduite avec une molécule d'ADN selon l'une quelconque des revendications 17 à 19 ou avec un vecteur d'expression recombinant selon la revendication 20. 22. Cellule selon la revendication 21, dans laquelle la molécule d'ADN ou le vecteur d'expression recombinant sont intégrés dans un chromosome de la cellule. 23. Organisme non humain, de préférence un micro-organisme, comprenant une molécule d'ADN hétérologue codant pour un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 16. 24. Animal non humain ou plante transgénique comprenant une molécule d'ADN hétérologue codant pour un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 16. 25. Micro-organisme selon la revendication 23, le micro-organisme étant une bactérie ou un champignon. 26. Procédé de production d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, le procédé comprenant : (i) la préparation d'une construction d'expression qui comprend un polynucléotide selon la revendication 17, avec une séquence codant pour le polypeptide selon 966l'une quelconque des revendications 1 à 16, liée fonctionnellement à une ou plusieurs séquences nucléotidiques régulatrices ; (ii) la transfection ou la transformation d'une cellule hôte appropriée avec la construction d'expression ; (iii) l'expression du polypeptide recombinant dans ladite cellule hôte ; et (iv) l'isolement ou la purification du polypeptide recombinant à partir de ladite cellule hôte ou l'utilisation de la cellule hôte obtenue telle quelle ou sous forme d'extrait cellulaire. 27. Procédé de fabrication d'un polypeptide présentant une activité d'au moins 80 % ou une activité améliorée, dans (i) la catalyse de la déshydratation du 3-butèn-2-ol en 1,3-butadiène et/ou (ii) la catalyse de la déshydratation du 3-méthyl-3-butèn-2-ol en isoprène, par rapport à celle d'un polypeptide constitué de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7 ou 8, le procédé comprenant la préparation d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 16. 28. Composition comprenant un ou plusieurs polypeptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 16. 29. Composition selon la revendication 28, comprenant en outre le polypeptide de SEQ ID NO: 1, avec ou sans étiquette périplasmique N-terminale et avec ou sans la première Met. 30. Composition selon l'une quelconque des revendications 28 à 29, comprenant en outre du 3-butèn-2-ol et/ou du 3-méthyl-3-butèn-2-ol. 31. Composition selon l'une quelconque des revendications 28 à 30, comprenant en outre du 1,3-butadiène et/ou de l'isoprène. 32. Composition comprenant (i) un produit à base de caoutchouc polymérisé à partir de 1,3-butadiène produit en présence d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 16 et/ou (ii) un produit à base de 967 3033 1 72 caoutchouc polymérisé à partir d'isoprène produit en présence d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 14 à 16. 33. Composition comprenant un copolymère polymérisé à partir de 1,3-butadiène produit en présence d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 16 ; et/ou un produit à base de caoutchouc polymérisé à partir de 1,3-butadiène produit en présence d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 14 à 16. 34. Composition comprenant un produit à base de plastique polymérisé à partir de 1,3-butadiène produit en présence d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 16 ; et/ou un produit à base de plastique polymérisé à partir d'isoprène produit en présence d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 14 à 16. 35. Anticorps capable se lier à un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 16. 36. Protéine de fusion comprenant un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 16. 37. Complexe comprenant un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, ledit complexe comprenant en outre éventuellement du 3- méthy1-3-butèn-2-ol. 38. Complexe comprenant un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, ledit complexe comprenant en outre éventuellement du 3- butèn-2-ol. 39. Cristal ayant les coordonnées définies dans l'Annexe I dans le groupe spatial P2(1) avec les paramètres cellulaires a=133,18 A, b=110,83 A, c=162,20 A, qui est produit à partir d'un polypeptide constitué de la séquence 968 3033 172 d'acides aminés de SEQ ID NO: 5 avec jusqu'à 2 % de variation dans une dimension cellulaire quelconque. 40. Cristal comprenant les coordonnées définies dans l'Annexe 2 dans le groupe spatial P2(1) avec les paramètres cellulaires a=88,7 A, b=111,22 A, c=120,42 A, qui est produit à partir d'un polypeptide constitué de la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO: 9 avec jusqu'à 2 % de variation dans une dimension cellulaire quelconque. 41. Procédé de production d'isoprène, de myrcène, et/ou de 1,3-butadiène biodérivé, comprenant la culture ou la croissance d'une cellule ou d'un organisme hôte selon l'une quelconque des revendications 21 à 25 dans des conditions et pendant une durée suffisante pour produire de l'isoprène, du myrcène et/ou du 1,3-butadiène biodérivé. 42. Milieu de culture comprenant de l' isoprène, du myrcène, et/ou du 1,3-butadiène biodérivé, dans lequel ledit isoprène, myrcène et/ou 1,3-butadiène biodérivé a un rapport isotopique de carbone-12, carbone-13 et carbone-14 qui reflète une source d'absorption du dioxyde de carbone atmosphérique. 43. Milieu de culture selon la revendication 42, ledit milieu de culture étant séparé d'une cellule ou d'un organisme hôte selon l'une quelconque des revendications 21 à 25. 44. Isoprène, myrcène et/ou 1,3-butadiène biodérivé ayant un rapport isotopique de carbone-12, carbone-13 et carbone-14 qui reflète une source d'absorption du dioxyde de carbone atmosphérique, produit de préférence par culture d'une cellule ou d'un organisme hôte selon l'une quelconque des revendications 21 à 25. 969. Isoprène, myrcène et/ou 1,3-butadiène biodérivé selon la revendication 44, ledit isoprène, myrcène et/ou 1,3-butadiène biodérivé ayant une valeur Fm d'au moins 80 °/(:), d'au moins 85 °/(:), d'au moins 90 °/(:), d'au moins 95 % ou d'au moins 98 %. 46. Composition comprenant l'isoprène, le myrcène, et/ou le 1,3-butadiène biodérivé selon l'une quelconque des revendications 44 à 45 et un composé autre que ledit isoprène, myrcène et/ou 1,3-butadiène biodérivé. 47. Composition selon la revendication 46, dans laquelle ledit composé autre que ledit isoprène, myrcène et/ou 1,3-butadiène biodérivé est une quantité trace d'une partie cellulaire d'une cellule hôte ou d'un organisme selon l'une quelconque des revendications 21 à 25. 48. Polymère biodérivé comprenant de l'isoprène, du myrcène, et/ou du 1,3-butadiène biodérivé selon l'une quelconque des revendications 44 à 45. 49. Résine biodérivée comprenant de l'isoprène, du myrcène, et/ou du 1,3-butadiène biodérivé selon l'une quelconque des revendications 44 à 45. 50. Produit moulé obtenu par moulage d'un polymère biodérivé selon la revendication 48. 51. Procédé de production d'un polymère biodérivé selon la revendication 48 comprenant la réaction chimique de l'isoprène, du myrcène, et/ou du 1,3-butadiène biodérivé selon la revendication 44 ou 46 avec lui-même ou avec un autre composé dans une réaction produisant un polymère. 52. Produit moulé obtenu par moulage d'une résine biodérivée selon la revendication 49. 53. Procédé de production d'une résine biodérivée selon la revendication 49 comprenant la réaction chimique dudit isoprène, myrcène, et/ou 970,3-butadiène biodérivé avec lui-même ou un autre composé dans une réaction de production de résine. 971
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