KR101441950B1 - 노로바이러스 검출 방법 및 그를 위한 재조합벡터와 재조합단백질의 생산방법 - Google Patents

노로바이러스 검출 방법 및 그를 위한 재조합벡터와 재조합단백질의 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식중독균 유발미생물로 알려진 노로바이러스의 검출을 위한 재조합벡터, 그리고 그 벡터를 이용한 재조합단백질의 생산방법 및, 그를 이용한 노로바이러스의 검출방법에 관한 것이다.
본 발명의 노로바이러스 검출용 재조합단백질 생산을 위한 재조합 벡터는, 노로바이러스 세포외막단백질(Norovirus Norwalk capsid protein) VP1 중 P1 도메인 또는 P2 도메인 중 어느 하나를 코딩하는 유전자와 목적단백질을 코딩하는 유전자를 포함하여 상기 유전자가 융합된 형태로 발현되도록 제작되는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명의 노로바이러스 검출용 재조합단백질 생산방법은, 상기 재조합 벡터로 대장균을 형질전환하고, 이로부터 노로바이러스 분자 진단용 재조합단백질을 제조하는 것을 특징으로 한다.

Description

노로바이러스 검출 방법 및 그를 위한 재조합벡터와 재조합단백질의 생산방법{Norovirus detection method, and the preparing method of recombinant vector and recombinant protein for the detection}
본 발명은 식중독균 유발미생물로 알려진 노로바이러스의 검출을 위한 재조합벡터, 그리고 그 벡터를 이용한 재조합단백질의 생산방법 및, 그를 이용한 노로바이러스의 검출방법에 관한 것이다. 더 구체적으로는 노로바이러스 세포외막단백질(Norovirus Norwalk capsid protein) 유전자를 포함하는 재조합 벡터(recombinant vector)로 형질전환된 미생물을 배양하고, 이로부터 검체진단용 재조합단백질을 제조하는 방법과, 그를 이용한 노로바이러스의 검출방법에 관한 것이다.
본 발명의 노로바이러스 세포외막단백질을 포함한 재조합단백질의 제조방법은 아미노말단(N-termini) 혹은 카복시말단(C-termini)에 6개의 히스티딘(histidine) 유전자를 포함하는 재조합 벡터와 노로바이러스 세포외막단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 벡터로 동시에 형질전환된 재조합미생물을 배양하고, 이로부터 재조합단백질을 수득하고 고순도로 정제하는 단계를 포함한다. 또한, 상기 제조방법에 의해 생산된 재조합단백질을 이용하여 식중독 유발세균인 노로바이러스를 검출하는 방법을 포함한다.
본 발명에 의하면 재조합 대장균을 이용한 재조합 세포외막단백질의 생산 시 제조 수율이 향상되는 장점이 있으며, 상기 방법으로 제조된 재조합단백질을 이용하여 노로바이러스를 용이하게 검출할 수 있다. 본 발명의 재조합단백질을 이용하면, 기존의 노로바이러스 검출용 항체를 대체할 수 있을 것으로 기대한다.
노로바이러스는 RNA 바이러스로서 비세균성 급성 위장염을 일으키는 것으로 알려져 있다. 이 바이러스는 세계적으로 약 90%의 위장염을 유발하는 것으로 보고되어 있으며, 오염된 식료품과 물을 섭취한 경우 전염된다. 이는 비교적 최근에 알려진 신종 병원체이며 집단 식중독의 가장 주요한 원인체로 보고되어 있다.
일반적으로 노로바이러스는 두 개의 세포외막단백질을 포함하고 있는 것으로 밝혀져 있는데, 그중 VP1 도메인은 크기가 약 58-60 kDa이며 VP2 도메인과 연결되어 있다. 이 VP1 도메인은 바이러스가 숙주세포에 침투할 때 부착성에 매우 중요한 부위로 알려져 있다. 특히, VP1 도메인은 유연한 힌지(flexible hinge)와 연결되어 P1, P2, S 도메인으로 구성되어 있다. S 도메인은 20면체(icosahedral) 형성에 매우 중요한 역할을 하는 것으로 보고되어 있으며, P 도메인은 다시 P1과 P2 도메인으로 나눌 수 있다. P2 도메인은 노로바이러스 외막단백질 중 가장 최외각에 위치하고 있으며 6개의 beta-barrel 구조를 가지고 있는 것으로 컴퓨터 모델링기법, 시퀀스분석기법, 돌연변이기법과 X-ray crystalography 방법 등을 통해서 밝혀졌다. 최근 연구 결과에 따르면 HBGA(histo-blood group antigen) 결합부위가 P2 도메인에 위치하고 있는 것으로 확인되었다. 또한, 상기에서 기술한 방법들을 이용하여 P 도메인의 기능이 상세히 밝혀졌는데 두 개의 P 도메인이 모노머(monomer) 형태로 존재하고 있는 것이 확인되었다.
최근 노로바이러스의 세포외막단백질에 대해서 시퀀스분석을 통하여, 많은 트립신(trypsin)과 키모트립신(chymotripsin) 절단부위(cleavage site)가 전체 단백질 내부에 포함되어 있고, P 도메인은 세포 내 절단효소에 의해서 가수분해가 되지 않음이 밝혀졌다.
노로바이러스의 세균학적 특징으로는 발병된 환자를 매개로 하여 사람-사람 간에 전파되거나 토사물과 배설물을 함유한 공기를 통해서도 전염이 가능하기 때문에 집단발병이 일어나기 쉽다. 또한 감염된 환자는 증상이 없는 상태에서 2주 정도 활동하기 때문에 확산의 원인이 되기도 한다. 더 심각한 문제는 냉장, 냉동 온도에서도 수개월에서 수년까지 감염력이 유지되는 점이다. 또한, 다양한 유전자변이를 통해서 변종이 생겨 백신 개발에 많은 어려움이 있다. 식중독균 유발 유해 미생물인 노로바이러스는 크기가 매우 작고, 동물세포 배양이 어렵고 유전적 항원적 특징이 매우 다양하여 미량의 오염으로도 질병 유발이 가능하고 오염된 식품 중에 존재하는 방해물질로 인하여 측정과 검출이 매우 어렵다.
일반적인 노로바이러스 검출방법으로 전자현미경, EIA, ELISA 방법이 사용되어 왔으며, 가장 일반적인 검출방법으로는 RT-PCR, real-time PCR, NASBA, 서던블롯법(Southern blot) 등이 광범위하게 이용되고 있다. 전자현미경을 사용하여 확인할 경우 약 106 particles/mL, EIA와 ELISA의 경우 약 105-106 particles/mL까지 검출이 가능하다. 이에 반해 RT-PCR을 사용하여 검출할 경우 약 2-10 molecules/reaction, real-time PCR의 경우 약 20-100 molecules/reaction의 LOT(limit of detection) 효율을 가진다.
하지만, PCR 기반의 검출방법의 한계는 노로바이러스를 검출하기 위한 프라이머와 프로브의 디자인이다. 대부분의 노로바이러스가 유전적 다양성(genetic diversity)을 가지고 있기 때문이다. 광범위하게 사용되고 있는 RT-PCR 방법의 경우, 여러 가지의 프라이머(primer)와 프로브(probe)가 필요하게 된다. 이 방법은 증폭(amplification)과정을 거쳐 여러 번의 반응이 필요하게 된다. 최근에는 SYBR green, TaqMan 프로브를 이용하여 한 단계 반응만으로도 노로바이러스를 검출할 수 있는 방법이 보고되었다(Kageyama et al., 2003; Loisy et al., 2005, Pang et al., 2004). 하지만 RT-PCR 방법은 노로바이러스 검출 민감도는 좋으나, 매우 비싸며 시간이 많이 걸리는 점이 단점으로 지적되고 있다. 또한, 숙련된 분석자들만이 재현성 있는 결과를 도출할 수 있다.
최근에는 기존의 PCR 기반 방법의 한계를 극복한 새로운 개념의 multiplexed real-time PCR 방법이 소개되었다(Richards et al., 2004; Mohamed et al., 2006). 이 방법을 사용하여 검출할 경우 민감도와 특이성이 향상된 결과를 얻을 수 있다. 상기에서 설명한 PCR 기반의 노로바이러스 검출방법과는 대조적으로, 상업화된 ELISA kit가 출시되기도 하였다(Burton-MacLeod et al., 2004; de Bruin et al., 2006). 예를 들면, SRSV(II)-AD(Denka Seiken Co. Ltd., Tokyo, Japan)와 RIDEIA NLV(DakoCytomation Ltd., Ely, United Kingdom) kits가 대표적 예가 될 수 있다.
환자샘플 228명을 대상으로 RIDEIA NLV를 사용하여 검출할 경우 약 80.3%의 노로바이러스를 검출할 수 있었으며, 이에 반해 IDEIA NLV GI/GII 방법을 이용하여 검출할 경우 약 60.6%의 효율을 나타내었다(Castriciano et al., 2007). RIDASCREEN norovirus EIA 방법은 monoclonal antibody와 polyclonal antibody를 동시에 사용해야 하기 때문에 매우 비싼 단점이 있다.
그러나 상기와 같은 다양한 항체기술 및 이을 이용한 노로바이러스 검출기술이 개발되었음에도 불구하고, 현재의 친화성 항체를 사용하는 면역방법기술은 칩 표면의 복잡한 화학적 처리 방법 및 비특이적인 단백질 결합 등의 큰 단점을 가지고 있으며, 또한 그 결합력이 약할 뿐 아니라 많은 화학물질에 영향을 받을 수 있기 때문에 여러 단백질-단백질 상호작용 검사 시 제한점이 많아 실용화가 어려우며, 항체를 칩 혹은 마이크로웰(microwell) 위에 고정하기 위해서는 높은 순도가 요구되어 복잡한 정제공정이 포함되어야 하므로 경제성이 떨어지는 단점도 가지고 있다.
하지만, 최근 게놈 프로젝트들이 완료되어 감에 따라 생명현상의 기본이 되는 유전자와 이로부터 생성되는 단백질에 대한 관심이 고조되고 있다. 현재 10여만 개로 예측되는 인간 유전자 중, 1만여 개의 기능이 밝혀져 있고, 이러한 유전자들은 대부분 질환과 직접적인 연관이 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 식중독을 포함한 대부분의 알려진 질병이 유전자 수준이 아닌 단백질 수준에서 유발되기 때문에, 현재까지 개발되었거나 개발 중에 있는 의약품의 95% 이상이 단백질을 타깃으로 하고 있다. 따라서 특정 단백질 및 리간드에 상호작용 하는 생체분자의 기능을 밝히고, 단백질 기능분석 및 네트워크 분석을 통하여 얻어진 자료를 바탕으로 고전적인 방법으로는 불가능하였던 질병에 대한 선예방 후치료 개념의 새로운 패러다임의 분석기법이 필요하게 되었다.
따라서, 복합기능(multiplexed)의 질병유발 단백질 혹은 세포의 실시간 검출이 가능하고 고인지능(high and accurate recognition ability)을 가진 리셉터의 개발이 절실한 실정이다.
상기와 같은 배경에서 안출된 본 발명의 목적은 노로바이러스를 용이하게 검출할 수 있을 뿐 아니라 기존의 노로바이러스 검출용 항체를 대체할 수 있는 재조합단백질의 제조방법을 제공하는 데 있다. 아울러 재조합단백질의 생산 시 우수한 제조수율을 갖도록 하는 것을 목적으로 한다.
상기와 같은 목적으로 개발된 본 발명은 노로바이러스 세포외막단백질 유전자를 포함하는 재조합 벡터(recombinant vector)로 형질전환된 미생물을 배양하고, 이로부터 노로바이러스 분자 진단용 재조합단백질을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 노로바이러스 세포외막단백질을 포함한 재조합단백질의 제조방법은 6개의 히스티딘(histidine) 유전자를 포함하는 재조합 벡터와 노로바이러스 세포외막단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 벡터로 동시에 형질전환된 재조합미생물을 배양하고 이로부터 재조합단백질을 수득하는 단계를 포함한다.
본 발명의 노로바이러스 검출용 재조합단백질 생산을 위한 재조합 벡터는, 노로바이러스 세포외막단백질(Norovirus Norwalk capsid protein) VP1 중 P1 도메인 또는 P2 도메인 중 어느 하나를 코딩하는 유전자와 목적단백질을 코딩하는 유전자를 포함하여 상기 유전자가 융합된 형태로 발현되도록 제작되는 것을 특징으로 한다.
이때 상기 목적단백질은 6개의 히스티딘인 것을 특징으로 한다.
또한 P1 도메인을 포함하는 재조합단백질의 발현을 유도하기 위한 재조합 벡터의 제조에 사용하는 정방향 프라이머는 서열목록 1로 구성되고, 역방향 프라이머는 서열목록 2로 구성되는 것을 특징으로 한다.
또한 P2 도메인을 포함하는 재조합단백질의 발현을 유도하기 위한 재조합 벡터의 제조에 사용하는 정방향 프라이머는 서열목록 3으로 구성되고, 역방향 프라이머는 서열목록 4로 구성되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 노로바이러스 검출용 재조합단백질 생산방법은, 상기 재조합 벡터로 대장균을 형질전환하고, 이로부터 노로바이러스 분자 진단용 재조합단백질을 제조하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 노로바이러스 검출 방법은 상기 제조된 재조합단백질을 이용하여 단백질과 단백질 간의 반응, 단백질과 반응리간드 간의 반응, 목적리간드와 반응단백질 간의 반응 또는 목적리간드와 반응리간드 간의 반응을 검출하는 것을 특징으로 한다.
상기 반응리간드는 단백질이나 펩타이드와 반응하는 저분자량의 생체물질, 펩티드, 탄수화물, 앱타머, 지방산 또는 지질인 것을 특징으로 한다.
또한 상기 반응단백질은 효소 또는 항체인 것을 특징으로 한다.
또한 상기 목적리간드는 단백질이나 펩타이드와 반응하는 저분자량의 화합물, 핵산, 펩티드, 탄수화물, 앱타머, 지방산 또는 지질인 것을 특징으로 한다.
또한 상기 반응 검출은 표지 혹은 비표지 항체를 이용하여 수행하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의하면, 재조합 대장균을 이용한 재조합 세포외막단백질의 생산 시, 제조수율이 향상되는 장점이 있으며, 상기 방법으로 제조된 재조합단백질을 이용하여 기존의 노로바이러스 검출용 항체를 대체하여 노로바이러스를 검출할 수 있다.
도 1은 본 발명에 사용된 노로바이러스 세포외막단백질(VP1) 중 P1 도메인을 코딩하는 유전자합성 결과이다(DNA는 서열목록 5로, 아미노산은 서열목록 6으로 첨부함).
도 2는 본 발명에 사용된 노로바이러스 세포외막단백질(VP1) 중 P2 도메인을 코딩하는 유전자합성 결과이다(DNA는 서열목록 7로, 아미노산은 서열목록 8로 첨부함).
도 3은 본 발명에 사용된 6개의 히스티딘유전자를 포함하고 노로바이러스 세포 외막단백질 P1과 P2 유전자를 포함하는 재조합 DNA의 PCR 결과이다.
도 4는 본 발명에 사용된 6개의 히스티딘유전자를 포함하고 노로바이러스 세포외막단백질 P1 유전자를 포함하는 재조합 DNA의 시퀀싱 결과이다(서열목록 9로 첨부함).
도 5는 본 발명에 사용된 6개의 히스티딘유전자를 포함하고 노로바이러스 세포외막단백질 P1 도메인을 코딩하는 유전자를 포함한 pET22-6H-P1 재조합벡터 유전자 지도이다.
도 6은 본 발명에 사용된 6개의 히스티딘유전자를 포함하고 노로바이러스 세포외막단백질 P2 유전자를 포함하는 재조합DNA의 시퀀싱 결과이다(서열목록 10으로 첨부함).
도 7은 본 발명에 사용된 6개의 히스티딘유전자를 포함하고 노로바이러스 세포외막단백질 P2 도메인을 코딩하는 유전자를 포함한 pET22-6H-P2 재조합벡터 유전자 지도이다.
도 8은 본 발명에 사용된 6개의 히스티딘유전자를 포함하고 노로바이러스 세포외막단백질 P1 유전자를 포함하는 재조합단백질을 재조합 대장균에서 발현여부를 확인한 결과이다.
도 9는 본 발명에 사용된 6개의 히스티딘유전자를 포함하고 노로바이러스 세포외막단백질 P1 유전자를 포함하는 재조합단백질의 정제결과이다.
도 10은 본 발명에 사용된 6개의 히스티딘유전자를 포함하고 노로바이러스 세포외막단백질 P2 유전자를 포함하는 재조합단백질을 재조합대장균에서 발현여부를 확인한 결과이다.
도 11은 사용된 6개의 히스티딘유전자를 포함하고 노로바이러스 세포외막단백질 P2 유전자를 포함하는 재조합단백질의 정제결과이다.
도 12는 본 발명에 사용된 6개의 히스티딘유전자를 포함하고 노로바이러스 세포외막단백질 P1, P2 유전자를 포함하는 재조합단백질의 결합력을 비교한 결과이다.
최근 노로바이러스를 포함한 식중독유발 세균에 의한 식품안전성 위협요인이 증가되고 있어 보다 안전하고 친환경적인 식품소재를 확보하기 위하여 생물학적 위해요소를 조기에 제어할 수 있는 기술개발이 절실한 실정이다. 이에 본 발명자들은 Norwalk virus의 세포외막단백질 유전자를 포함한 재조합벡터를 제조하여 재조합대장균에서 생산하고 고순도 분리정제단계를 거쳐 기존의 노로바이러스 분자진단용 항체를 대체할 수 있는 재조합단백질을 생산하기 위한 생물공정인 본 발명을 개발하였다.
실시예 1 : Norwalk virus의 세포외막단백질 VP1 도메인 중 P1, P2 도메인 유전자 합성
식중독유발균으로 알려진 노로바이러스(Norwalk virus) capsid 단백질인 VP1 도메인 중 P1와 P2 sub-domain을 타깃분자로 선정하였다. VP1 도메인은 530-555 아미노산 서열과, 약 58-60 kDa의 분자량을 가지고 있으며, 특히 VP1 도메인은 바이러스의 assembly에 매우 중요한 역할을 하는 단백질로 알려져 있고, 바이러스 파티클(particle) 형성에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되어 있다.
타깃분자로 선택한 P2 도메인은 약 127개의 아미노산 서열을 가지고 있으며 바이러스의 결합과 면역 작용(immune activity)에 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려지고 있다. P1 도메인(225-279, 406-520 아미노산 서열)은 P2 도메인과 S 도메인 중간에 위치하고 있으며, 바이러스가 숙주세포에 감염이 될 때 매우 중요한 역할을 하는 것으로 보고되고 있다.
따라서 타깃분자로 VP1 도메인들 중, P1와 P2 sub-domain을 재조합단백질로 발현 및 생산하기 위하여 재조합대장균에 맞는 코돈형태(codon usage)로 변환하여 유전자 합성을 시도하였고 각각 합성된 P1과 P2 유전자의 DNA 및 아미노산서열을 나타내었다(도 1과 도 2).
실시예 2 : Norwalk virus 세포외막단백질(P1, P2) 유전자 합성 후 PCR 분석 결과
주형(template)으로 사용할 유전자의 합성 후 PCR을 이용하여 타깃 유전자의 증폭을 시도하였다. 구체적인 PCR 반응조건은 총 용량 100 μl로 조정하여 95℃에서 5분, 55℃에서 45초, 72℃에서 1분으로 총 30회 반복수행하여 이중가닥의 세포외막단백질 유전자를 합성하였다. PCR을 수행한 후 agarose gel electrophoresis 실험을 통해서 증폭된 유전자의 크기를 확인하였으며, 도 3에 나타난 바와 같이 레인(lane) 1에서 6H-125 아미노산을 포함한 P1 도메인의 유전자를 확인하였으며, 6H-127 아미노산을 포함하는 P2 도메인의 유전자의 크기를 확인하였다(도 3).
실시예 3 : Norwalk virus 세포외막단백질(P1, P2) 유전자와 6개의 히스티딘을 포함한 재조합벡터 제작
PCR 반응을 통해 생산된 세포외막단백질 유전자를 재조합대장균에 발현시키기 위하여 재조합벡터를 제작하였다.
먼저, P1 도메인을 포함하는 재조합단백질의 발현을 유도하기 위하여 sub-cloning을 통하여 타깃유전자를 확보하고 DNA sequencing(도 4)을 통하여 DNA 서열을 확인하였다. 올바른 DNA 서열을 확인한 후 PCR을 통해 6H-P1 유전자를 코딩하는 유전자를 증폭하고 DNA 제한효소 NdeI과 XhoI으로 절단 후 동일한 DNA 제한효소로 처리된 pET22b(+) vector(Merck, Germany)에 ligation을 통해 최종 pET22-6H-P1 발현벡터를 제작하였다(도 5). 이때 사용된 forward primer(서열목록 1)와 backward primer(서열목록 2)는 다음과 같다.
Forward primer: 5'- CCC AGA ACT CAT ATG CAC CAC CAC CAC CAC CAC GCC CCT TCT GTA TAC CCC CCT GGT TTC GGA GAG GTA(이탤릭체는 DNA 제한효소 NdeI을 의미하고, 밑줄 친 서열은 6개의 히스티딘서열을 의미함)
Backward primer: 5'- ACA AAC CTA CTC GAG TCA TCG GCG CAG ACC AAG CCT ACC TCT TGC CGA GCT GGC AGT(이탤릭체는 DNA 제한효소 XhoI을 의미함)
또한, P2 도메인을 포함하는 재조합단백질의 발현을 유도하기 위하여 sub-cloning을 통하여 타깃유전자를 확보하고 DNA sequencing(도 6)을 통하여 DNA 서열을 확인하였다. 올바른 DNA 서열을 확인한 후 PCR을 통해 6H-P2 유전자를 코딩하는 유전자를 증폭하고 DNA 제한효소 NdeI과 XhoI으로 절단 후 동일한 DNA 제한효소로 처리된 pET22b(+) vector(Merck, Germany)에 ligation을 통해 최종 pET22-6H-P2 발현벡터를 제작하였다(도 7). 이때 사용된 forward primer(서열목록 3)와 backward primer(서열목록 4)는 다음과 같다.
Forward primer: 5'- CCC AGA ACT CAT ATG CAC CAC CAC CAC CAC CAC ACC ACC CCA GTT TCA TTG TCA CAT GTT GCC AAG ATA(이탤릭체는 DNA 제한효소 NdeI을 의미하고, 밑줄 친 서열은 6개의 히스티딘서열을 의미함)
Backward primer:5'- ACA AAC CTA CTC GAG TCA TAG ATG TGT TGC CTC CGT AAT ACT TGA CCC ATA ATT(이탤릭체는 DNA 제한효소 XhoI을 의미함)
실시예 4 : Norwalk virus 세포외막단백질(P1 또는 P2) 유전자와 6개의 히스티딘을 포함하는 재조합벡터를 이용한 재조합단백질 발현, 생산 및 정제 결과
먼저, P1 유전자와 6개의 히스티딘유전자를 포함하는 재조합단백질을 생산하기 위하여 대장균 BL21(DE3)와 Rosetta-Origami(DE3)를 이용하여 발현 여부를 확인하였다. 이때 재조합단백질 생산을 위해 pET22-6H-P1 재조합벡터를 사용하였으며, 예상되는 재조합단백질의 크기는 대략 14.4 kDa으로 확인되었다. 강력하고 유도 가능한 T7 프로모터를 가지고 있는 재조합 플라스미드 pET22-6H-P1로 형질 전환된 대장균 XL1-Blue(Stratagene, La Joll, Calif., 미국)에서 발현하였다.
보다 구체적으로는 형질전환된 재조합 대장균을 LB 액체 배지 100 mL가 담긴 250 mL 플라스크에 접종하여 37℃에서 배양하였다. pET22-6H-P1 재조합 플라스미드는 T7 프로모터를 가지고 있어 IPTG를 첨가하여 유전자 발현을 유도한다. 유전자 발현 유도(induction)는 분광광도계로 600 nm 파장에서 측정한 광학밀도(OD)가 0.6일 때 1 mM의 IPTG를 첨가하여 줌으로써 행하였다. 유도 발현 후 4시간 후에 배양액 전체 배양액을 4℃에서 6000 rpm으로 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 버리고 100 mL TE 버퍼(Tris-HCl 10 mM; EDTA 1 mM, pH 8.0)로 한번 씻은 후에 다시 4℃에서 6000 rpm으로 5분 동안 원심분리한 후 TE 버퍼(Tris-HCl 10 mM; EDTA 1 mM, pH 8.0) 100 mL 용액에 현탁하여 4℃에서 초음파 분쇄기(Branson Ultrasonics Co., Danbury, conn., 미국)를 이용하여 세포를 파쇄하였다.
파쇄한 용액을 4℃에서 6000 rpm으로 30분 원심분리하여 불용성 단백질을 버리고 0.2 μm 여과기로 여과하였다. 여과한 용액은 브래드포드 단백정량법(Bradford, M. et al., Anal. Biochem. 72;248-254, 1976)을 이용하여 정량 후 고정용액(40% Glycerol, PBS, pH 7.4)으로 1 mg/mL 농도로 희석하여 준비한다. 최종적으로 준비된 약 20 μL 단백질 샘플을 열처리한 후 12% acrylamide gel을 사용하여 120V에서 약 2시간 단백질 전기영동을 수행하여 단백질 발현 여부를 Coomassie Brilliant Blue staining을 통해 확인하였다(도 8).
도 8에 나타난 바와 같이 대장균 BL21(DE3)를 통해 생산할 경우 25oC 배양온도에서 많은 양의 재조합단백질이 발현됨을 확인하였다. 재조합대장균을 약 1.5L 대량배양을 통해서 생산한 후 고성능액체크로마토그래피(Bio-rad HR system)을 이용하여 고순도 정제를 수행하였다. 이때 사용한 칼럼은 밀리포아사의 칼럼을 사용하였으며 고정화수지는 IDA Excellose(바이오프로젠, 한국)를 사용하였다. 고성능액체크로마토그래피의 운전조건은 유체속도(flow rate) 4 ml/min, 샘플 부피는 약 200 ml로 조절하여 정제를 시도하였다(도 9). 도 9에 나타난 바와 같이 샘플분획에서 단일밴드의 재조합단백질을 확인하였으며 최종 0.7 mg/ml 농도로 고순도 정제를 수행하였다.
또한, P2 유전자와 6개의 히스티딘 유전자를 포함하는 재조합단백질을 생산하기 위하여 대장균 BL21(DE3)와 Rosetta-Origami(DE3)를 이용하여 발현 여부를 확인하였다. 이때 재조합단백질생산을 위해 pET22-6H-P2 재조합벡터를 사용하였으며 예상되는 재조합단백질의 크기는 대략 14.4 kDa으로 확인되었다. 강력하고 유도 가능한 T7 프로모터를 가지고 있는 재조합 플라스미드 pET22-6H-P2로 형질 전환된 대장균 XL1-Blue(Stratagene, La Joll, Calif., 미국)에서 발현하였다.
보다 구체적으로는 형질전환된 재조합 대장균을 LB 액체 배지 100 mL가 담긴 250 mL 플라스크에 접종하여 37℃에서 배양하였다. pET22-6H-P2 재조합 플라스미드는 T7 프로모터를 가지고 있어 IPTG를 첨가하여 유전자 발현을 유도한다. 유전자 발현 유도(induction)는 분광광도계로 600 nm 파장에서 측정한 광학밀도(OD)가 0.6일 때 1 mM의 IPTG를 첨가하여 줌으로써 행하였다. 유도 발현 후 4시간 후에 배양액 전체 배양액을 4℃에서 6000 rpm으로 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 버리고 100 mL TE 버퍼(Tris-HCl 10 mM; EDTA 1 mM, pH 8.0)로 한번 씻은 후에 다시 4℃에서 6000 rpm으로 5분 동안 원심분리한 후 TE 버퍼(Tris-HCl 10 mM; EDTA 1 mM, pH 8.0) 100 mL 용액에 현탁하여 4℃에서 초음파 분쇄기(Branson Ultrasonics Co., Danbury, conn., 미국)를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 파쇄한 용액을 4℃에서 6000 rpm으로 30분 원심분리하여 불용성 단백질을 버리고 0.2 μm 여과기로 여과하였다. 여과한 용액은 브래드포드 단백정량법(Bradford, M. et al., Anal. Biochem. 72;248-254, 1976)을 이용하여 정량 후 고정용액(40% Glycerol, PBS, pH 7.4)으로 1 mg/mL 농도로 희석하여 준비한다.
최종적으로 준비된 약 20 μL 단백질 샘플을 열처리한 후 12% acrylamide gel을 사용하여 120V에서 약 2시간 단백질 전기영동을 수행하여 단백질 발현 여부를 Coomassie Brilliant Blue staining을 통해 확인하였다(도 10). 도 10에 나타난 바와 같이 대장균 BL21(DE3)를 통해 생산할 경우 25oC 배양온도에서 많은 양의 재조합단백질이 발현됨을 확인하였다. 재조합대장균을 약 1.5L 대량배양을 통해서 생산한 후 고성능액체크로마토그래피(Bio-rad HR system)을 이용하여 고순도 정제를 수행하였다. 이때 사용한 칼럼은 밀리포아사의 칼럼을 사용하였으며 고정화수지는 IDA Excellose(바이오프로젠, 한국)를 사용하였다. 고성능액체크로마토그래피의 운전조건은 유체속도(flow rate)는 4 ml/min, 샘플의 부피는 약 200 ml로 조절하여 정제를 시도하였다 (도 11). 도 11에 나타난 바와 같이 샘플분획에서 단일밴드의 재조합단백질을 확인하였으며 최종 1 mg/ml 농도로 고순도 정제를 수행하였다.
실시예 5 : Norwalk virus 세포외막단백질(P1, P2) 유전자와 6개의 히스티딘을 포함하는 재조합단백질의 결합력(binding affinity) 측정
상기 방법으로 제조된 재조합단백질의 결합능을 확인하기 위하여 Norwalk virus 세포외막단백질 유전자 P1과 P2를 포함하는 재조합단백질을 농도별로 조제한 후 항체에 대한 결합력을 측정하였다. 사용한 항체는 abcam사에서 생산되는 anti-Norovirus capsid protein VP1 antibody를 1: 2000으로 희석하여 사용하였으며 결합력은 ELISA 방법을 통해 Tecan사의 microplate reader를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
도 12에 나타난 바와 같이 P2 유전자를 포함하는 재조합단백질이 P1유전자를 포함하는 재조합단백질에 비해서 높은 결합력을 확인하였다(도 12).
이상에서 살펴본 실시예를 통해서 Norwalk virus 세포외막단백질 VP1 도메인 중 P1과 P2 도메인 유전자를 포함하는 재조합단백질을 제조하고, 재조합 미생물 배양을 통해 발현, 생산, 고순도 정제가 가능함을 확인하였다. 또한, 이를 이용하여 노로바이러스 분자진단이 가능함을 확인하였다.
또한, 본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.
<110> Industry-academic cooperation foundation Daegu Hanny University <120> Norovirus detection method, and the preparing method of recombinant vector and recombinant protein for the detection <130> ula-1202 <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P1 forward primer <400> 1 cccagaactc atatgcacca ccaccaccac cacgcccctt ctgtataccc ccctggtttc 60 ggagaggta 69 <210> 2 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P1 backward primer <400> 2 acaaacctac tcgagtcatc ggcgcagacc aagcctacct cttgccgagc tggcagt 57 <210> 3 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P2 forward primer <400> 3 cccagaactc atatgcacca ccaccaccac cacaccaccc cagtttcatt gtcacatgtt 60 gccaagata 69 <210> 4 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P2 backward primer <400> 4 acaaacctac tcgagtcata gatgtgttgc ctccgtaata cttgacccat aatt 54 <210> 5 <211> 381 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P1 domain coding DNA <400> 5 atggcccctt ctgtataccc ccctggtttc ggagaggtat tggtcttttt catgtcaaaa 60 atgccaggtc ctggtgctta taatttgccc tgtctattac cacaagagta catttcacat 120 cttgctagtg aacaagcccc tactgtaggt gaggctgccc tgctccacta tgttgaccct 180 gataccggtc ggaatcttgg ggaattcaaa gcataccctg atggtttcct cacttgtgtc 240 cccaatgggg ctagctcggg tccacaacag ctgccgatca atggggtctt tgtctttgtt 300 tcatgggtgt ccagatttta tcaattaaag cctgtgggaa ctgccagctc ggcaagaggt 360 aggcttggtc tgcgccgatg a 381 <210> 6 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P1 domain Amino acid <400> 6 Met Ala Pro Ser Val Tyr Pro Pro Gly Phe Gly Glu Val Leu Val Phe 1 5 10 15 Phe Met Ser Lys Met Pro Gly Pro Gly Ala Tyr Asn Leu Pro Cys Leu 20 25 30 Leu Pro Gln Glu Tyr Ile Ser His Leu Ala Ser Glu Gln Ala Pro Thr 35 40 45 Val Gly Glu Ala Ala Leu Leu His Tyr Val Asp Pro Asp Thr Gly Arg 50 55 60 Asn Leu Gly Glu Phe Lys Ala Tyr Pro Asp Gly Phe Leu Thr Cys Val 65 70 75 80 Pro Asn Gly Ala Ser Ser Gly Pro Gln Gln Leu Pro Ile Asn Gly Val 85 90 95 Phe Val Phe Val Ser Trp Val Ser Arg Phe Tyr Gln Leu Lys Pro Val 100 105 110 Gly Thr Ala Ser Ser Ala Arg Gly Arg Leu Gly Leu Arg Arg 115 120 125 <210> 7 <211> 387 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P2 domain coding DNA <400> 7 atgaccaccc cagtttcatt gtcacatgtt gccaagataa gagggacctc caatggcact 60 gtaatcaacc ttactgaatt ggatggcaca ccctttcacc cttttgaggg ccctgccccc 120 attgggtttc cagacctcgg tggttgtgat tggcatatca atatgacaca gtttggccat 180 tctagccaga cccagtatga tgtagacacc acccctgaca cttttgtccc ccatcttggt 240 tcaattcagg caaatggcat tggcagtggt aattatgttg gtgttcttag ctggatttcc 300 cccccatcac acccgtctgg ctcccaagtt gacctttgga agatccccaa ttatgggtca 360 agtattacgg aggcaacaca tctatga 387 <210> 8 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P2 domain Amino acid <400> 8 Met Thr Thr Pro Val Ser Leu Ser His Val Ala Lys Ile Arg Gly Thr 1 5 10 15 Ser Asn Gly Thr Val Ile Asn Leu Thr Glu Leu Asp Gly Thr Pro Phe 20 25 30 His Pro Phe Glu Gly Pro Ala Pro Ile Gly Phe Pro Asp Leu Gly Gly 35 40 45 Cys Asp Trp His Ile Asn Met Thr Gln Phe Gly His Ser Ser Gln Thr 50 55 60 Gln Tyr Asp Val Asp Thr Thr Pro Asp Thr Phe Val Pro His Leu Gly 65 70 75 80 Ser Ile Gln Ala Asn Gly Ile Gly Ser Gly Asn Tyr Val Gly Val Leu 85 90 95 Ser Trp Ile Ser Pro Pro Ser His Pro Ser Gly Ser Gln Val Asp Leu 100 105 110 Trp Lys Ile Pro Asn Tyr Gly Ser Ser Ile Thr Glu Ala Thr His Leu 115 120 125 <210> 9 <211> 408 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 6H-P1 <400> 9 catatgcacc accaccacca ccacgcccct tctgtatacc cccctggttt cggagaggta 60 ttggtctttt tcatgtcaaa aatgccaggt cctggtgctt ataatttgcc ctgtctatta 120 ccacaagagt acatttcaca tcttgctagt gaacaagccc ctactgtagg tgaggctgcc 180 ctgctccact atgttgaccc tgataccggt cggaatcttg gggaattcaa agcataccct 240 gatggtttcc tcacttgtgt ccccaatggg gctagctcgg gtccacaaca gctgccgatc 300 aatggggtct ttgtctttgt ttcatgggtg tccagatttt atcaattaaa gcctgtggga 360 actgccagct cggcaagagg taggcttggt ctgcgccgat gactcgag 408 <210> 10 <211> 412 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 6H-P2 <400> 10 catatgcacc accaccacca ccacaccacc ccagtttcat tgtcacatgt tgccaagata 60 agagggacct ccaatggcac tgtaatcacc ttactgaatt ggatggcaca ccctttcacc 120 cttttgaggg ccctgccccc attgggtttc cagacctcgg tggttgtgat tggcatatca 180 atatgacaca gtttggccat tctagccaga cccagtatga tgtagacacc acccctgaca 240 cttttgtccc ccatcttggt tcaattcagg caaatggcat tggcagtggt aattatgttg 300 gtgttcttag ctggatttcc ccccatcaca cccgtctggc tcccaagttg acctttggaa 360 gatccccaat tatgggtcaa gtattacgga ggcaacacat ctatgactcg ag 412

Claims (10)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 노로바이러스 세포외막단백질(Norovirus Norwalk capsid protein) VP1 중 P1 도메인 또는 P2 도메인 중 어느 하나를 코딩하는 유전자와 목적단백질인 6개의 히스티딘을 코딩하는 유전자를 포함하여 상기 유전자가 융합된 형태로 발현되도록 제작되되,
    이때 P1 도메인을 포함하는 재조합단백질의 발현을 유도하기 위한 재조합 벡터의 제조에 사용하는 정방향 프라이머는 서열목록 1로 구성되고, 역방향 프라이머는 서열목록 2로 구성되며,
    P2 도메인을 포함하는 재조합단백질의 발현을 유도하기 위한 재조합 벡터의 제조에 사용하는 정방향 프라이머는 서열목록 3으로 구성되고, 역방향 프라이머는 서열목록 4로 구성되는 것을 특징으로 하는,
    노로바이러스 검출용 재조합단백질 생산을 위한 재조합 벡터.
  4. 삭제
  5. 제3항의 재조합 벡터로 대장균을 형질전환하고, 이로부터 노로바이러스 분자 진단용 재조합단백질을 제조하는 것을 특징으로 하는, 노로바이러스 검출용 재조합단백질 생산방법.
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