JP4325450B2 - 希少糖の特異的定量法 - Google Patents
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Description
本発明は、希少糖と特異的に反応するポリペプチドを用いる希少糖の定量法に関する。
従来の単糖特に希少糖の定量法は、各希少糖のカラム中における移動速度の差を利用しておこなういわゆるHPLC分析が用いられてきた。希少糖の定量法は、希少糖の用途開発をはじめ希少糖生産の制御や各種の希少糖を使用した製品管理などに重要な技術である。
図１０に記載されるアミノ酸配列は、非特許文献１に基づくALBPの配列である。
Burland,V., et al. Analysis of the Escherichia coli genome VI: DNA sequence of the region from 92.8 through 100 minutes（JOURNAL Nucleic Acids Res. 23 (12), 2105-2119 (1995)）
図１０に記載されるアミノ酸配列は、非特許文献１に基づくALBPの配列である。
Burland,V., et al. Analysis of the Escherichia coli genome VI: DNA sequence of the region from 92.8 through 100 minutes（JOURNAL Nucleic Acids Res. 23 (12), 2105-2119 (1995)）
一般に単糖の定量はHPLCなどの機器分析で行われる他、いわゆるバイオセンサーとしては生物反応を利用して行う。本発明は、バイオセンサーとしての開発であり、従来よりも微量で短時間に特異的に多くの試料を測定できる希少糖の特異的定量法を提供することを目的とする。
本発明は、特定の希少糖であるＤ−アロースに特異的に結合する蛋白質（ポリペプチド）を用いてＤ−アロースを測定する方法の特異性と感度の増大を行うこと、そして、希少糖Ｄ−プシコースを酵素的にＤ−アロースへ導くことで特異的に希少糖Ｄ−プシコースを測定するという全く新しい原理によるものである。本発明の希少糖の特異的定量法は、D-アロースと結合する蛋白質を用いてD-アロースを定量する方法を基盤とし、L-ラムノースイソメラーゼなどを用いることでD-プシコース等を測定する方法の原理をも開発したものである。
本発明は、以下の（１）〜（４）の希少糖の定量方法を要旨とする。
（１）D-アロースが結合することによって変化する下記のポリペプチドの有する吸光度、またはD-アロースが結合したときD-アロース−下記のポリペプチドの結合体が作り出す蛍光を測定し、そのシグナル量に基づき被験試料中のD-アロース量を定量することを特徴とする希少糖の定量方法。
記
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、かつ、D-アロースを菌内に取り込む活性を有するポリペプチド、および
（ｂ）（ａ）のポリペプチドの有するアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、D-アロースを菌内に取り込む活性を有するポリペプチドからなる群から選ばれるポリペプチド。
（２）上記のポリペプチドが、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、かつ、D-アロースを菌内に取り込む活性を有するポリペプチド、および
（ｂ）（ａ）のポリペプチドの有するアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、D-アロースを菌内に取り込む活性を有するポリペプチドからなる群から選ばれるポリペプチドをコードするＤＮＡをＧＳＴベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体を培養液中で培養し、該ポリペプチドを該培養物中に生成・蓄積させ、該培養物中より採取する該リコンビナントポリペプチドである（１）の希少糖の定量方法。
（３）被験試料中のD-アロース量が、被験試料中のD-プシコースを、L-ラムノースイソメラーゼを該試料に作用させることにより、D-アロースに変換したものの量である（１）または（２）の希少糖の定量方法。
（４）被験試料中のD-アロース量が、被験試料中のD-フラクトースを、D-タガトース ３ エピメラーゼとL-ラムノースイソメラーゼを該試料に同時に作用させることにより、D-アロースに変換したものの量である（１）ないし（３）のいずれかの希少糖の定量方法。
（１）D-アロースが結合することによって変化する下記のポリペプチドの有する吸光度、またはD-アロースが結合したときD-アロース−下記のポリペプチドの結合体が作り出す蛍光を測定し、そのシグナル量に基づき被験試料中のD-アロース量を定量することを特徴とする希少糖の定量方法。
記
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、かつ、D-アロースを菌内に取り込む活性を有するポリペプチド、および
（ｂ）（ａ）のポリペプチドの有するアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、D-アロースを菌内に取り込む活性を有するポリペプチドからなる群から選ばれるポリペプチド。
（２）上記のポリペプチドが、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、かつ、D-アロースを菌内に取り込む活性を有するポリペプチド、および
（ｂ）（ａ）のポリペプチドの有するアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、D-アロースを菌内に取り込む活性を有するポリペプチドからなる群から選ばれるポリペプチドをコードするＤＮＡをＧＳＴベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体を培養液中で培養し、該ポリペプチドを該培養物中に生成・蓄積させ、該培養物中より採取する該リコンビナントポリペプチドである（１）の希少糖の定量方法。
（３）被験試料中のD-アロース量が、被験試料中のD-プシコースを、L-ラムノースイソメラーゼを該試料に作用させることにより、D-アロースに変換したものの量である（１）または（２）の希少糖の定量方法。
（４）被験試料中のD-アロース量が、被験試料中のD-フラクトースを、D-タガトース ３ エピメラーゼとL-ラムノースイソメラーゼを該試料に同時に作用させることにより、D-アロースに変換したものの量である（１）ないし（３）のいずれかの希少糖の定量方法。
従来の単糖特に希少糖の定量法は、各希少糖のカラム中における移動速度の差を利用しておこなういわゆるHPLC分析が用いられてきた。本発明においては、バイオセンサーとしての開発であり、従来よりも微量で短時間に特異的に多くの試料を測定できる。また、本発明は、バイオセンサーを用いて希少糖を定量する方法を提供することができる。
バイオテクノロジーに関連し、単糖、特に希少糖の各種分野における利用上、生産管理、生産管理などに利用することができる。
バイオテクノロジーに関連し、単糖、特に希少糖の各種分野における利用上、生産管理、生産管理などに利用することができる。
D-アロースが結合したときシグナルを作りだすポリペプチド
大腸菌E.ColiにはD-アロースを特異的に結合するAllose-binding protein (ALBP)が存在することが報告されている（Ulrika Magnusson et al., J. Biol. Chem., Vol. 277, 14077-14084, 2002）。ALBP遺伝子はGenbank上のＤＮＡ（大腸菌ゲノム）においてはALBP-genome.mhtの３１７９４から３２７３５ｂｐまでの部分に対応している。
Allose-binding protein (ALBP)と同様に他の糖を特異的に結合する蛋白質の存在も知られている。Ribose-binding protein(RBP), Arabinose-binding protein(ABP), Glucose-galactose-binding protein(GBP)などが存在している。
ALBPにD-アロースが結合すると、形態変化が生じ、内在するアミノ酸（チロシン、トリプトファンなど）の配位に変化が生じるため、微弱なスペクトルの変化が生じる。その変化を２９５nmの波長の光で励起し、３３８nmの吸光度を測定することでキャッチできる。
大腸菌E.ColiにはD-アロースを特異的に結合するAllose-binding protein (ALBP)が存在することが報告されている（Ulrika Magnusson et al., J. Biol. Chem., Vol. 277, 14077-14084, 2002）。ALBP遺伝子はGenbank上のＤＮＡ（大腸菌ゲノム）においてはALBP-genome.mhtの３１７９４から３２７３５ｂｐまでの部分に対応している。
Allose-binding protein (ALBP)と同様に他の糖を特異的に結合する蛋白質の存在も知られている。Ribose-binding protein(RBP), Arabinose-binding protein(ABP), Glucose-galactose-binding protein(GBP)などが存在している。
ALBPにD-アロースが結合すると、形態変化が生じ、内在するアミノ酸（チロシン、トリプトファンなど）の配位に変化が生じるため、微弱なスペクトルの変化が生じる。その変化を２９５nmの波長の光で励起し、３３８nmの吸光度を測定することでキャッチできる。
この方法の改善方法として、微弱な変化をさらに増強する方法を考案した。それは、ALBPに蛍光蛋白質であるGreen Fluorescent Protein (GFP)を結合したFusionポリペプチドとして利用することである。
ＧＦＰはクロンテックのpGFPuvベクターのものを使った(図１０に記載されるＧＦＰのＤＮＡとアミノ酸配列参照)。このＧＦＰの１７２番目のアミノ酸の後にＡＬＢＰの２４から３１１番目までを挿入してfusion proteinを作製した。このコンストラクト作成にはＰＣＲを用い、できたコンストラクトはＱｉａｇｅｎのＰＱＥ３１ベクターに挿入した。
こうして得られたＧＦＰ−ＡＬＢＰ融合蛋白のＭｕｔａｎｔをＰＣＲを利用して作り、よりD-アロース結合によって蛍光の変化が大きいものを選択する予定である。このＭｕｔａｔｉｏｎはＥｒｒｏｒ Ｐｒｏｎｅ ＰＣＲという手法を使用している。
この手法により、D-アロースがALBPに結合した時に生じる形態変化をより大きく安定な蛍光シグナルとして取り出すことが可能であり、より感度が高く安定した定量法の開発が可能である。
（１） シグナルが、D-アロースが結合することによって変化するポリペプチドの有する吸光度である。
（２） シグナルが、D-アロースが結合したときD-アロース−ポリペプチ結合体が作り出す蛍光である。
（３） ポリペプチドが、大腸菌の膜に存在し、D-アロースを菌内に取り込む３1１アミノ酸からなるAllose-binding protein (ALBP) である。
（４） ポリペプチドが、ALBPに蛍光蛋白質（ポリペプチド）であるGreen Fluorescent Protein (GFP)を結合したポリペプチドである。
（５） ポリペプチドが、ＡＬＢＰ遺伝子を組み込んだＧＳＴベクターを保有する形質転換体を培養液中で培養し、該ポリペプチドを該培養物中に生成・蓄積させ、該培養物中より採取する該リコンビナントＡＬＢＰである。
（６） ポリペプチドが、（ａ）図１０に記載されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、かつ、D-アロースを菌内に取り込む活性を有するポリペプチド、および（ｂ）（ａ）のポリペプチドの有するアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、D-アロースを菌内に取り込む活性を有するポリペプチドからなる群から選ばれるポリペプチドである。
（７） ポリペプチドが、（ａ）図１０に記載されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、かつ、D-アロースを菌内に取り込む活性を有するポリペプチド、および（ｂ）（ａ）のポリペプチドの有するアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、D-アロースを菌内に取り込む活性を有するポリペプチドからなる群から選ばれるポリペプチドをコードするＤＮＡをＧＳＴベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体を培養液中で培養し、該ポリペプチドを該培養物中に生成・蓄積させ、該培養物中より採取する該リコンビナントＡＬＢＰである。
ＧＦＰはクロンテックのpGFPuvベクターのものを使った(図１０に記載されるＧＦＰのＤＮＡとアミノ酸配列参照)。このＧＦＰの１７２番目のアミノ酸の後にＡＬＢＰの２４から３１１番目までを挿入してfusion proteinを作製した。このコンストラクト作成にはＰＣＲを用い、できたコンストラクトはＱｉａｇｅｎのＰＱＥ３１ベクターに挿入した。
こうして得られたＧＦＰ−ＡＬＢＰ融合蛋白のＭｕｔａｎｔをＰＣＲを利用して作り、よりD-アロース結合によって蛍光の変化が大きいものを選択する予定である。このＭｕｔａｔｉｏｎはＥｒｒｏｒ Ｐｒｏｎｅ ＰＣＲという手法を使用している。
この手法により、D-アロースがALBPに結合した時に生じる形態変化をより大きく安定な蛍光シグナルとして取り出すことが可能であり、より感度が高く安定した定量法の開発が可能である。
（１） シグナルが、D-アロースが結合することによって変化するポリペプチドの有する吸光度である。
（２） シグナルが、D-アロースが結合したときD-アロース−ポリペプチ結合体が作り出す蛍光である。
（３） ポリペプチドが、大腸菌の膜に存在し、D-アロースを菌内に取り込む３1１アミノ酸からなるAllose-binding protein (ALBP) である。
（４） ポリペプチドが、ALBPに蛍光蛋白質（ポリペプチド）であるGreen Fluorescent Protein (GFP)を結合したポリペプチドである。
（５） ポリペプチドが、ＡＬＢＰ遺伝子を組み込んだＧＳＴベクターを保有する形質転換体を培養液中で培養し、該ポリペプチドを該培養物中に生成・蓄積させ、該培養物中より採取する該リコンビナントＡＬＢＰである。
（６） ポリペプチドが、（ａ）図１０に記載されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、かつ、D-アロースを菌内に取り込む活性を有するポリペプチド、および（ｂ）（ａ）のポリペプチドの有するアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、D-アロースを菌内に取り込む活性を有するポリペプチドからなる群から選ばれるポリペプチドである。
（７） ポリペプチドが、（ａ）図１０に記載されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、かつ、D-アロースを菌内に取り込む活性を有するポリペプチド、および（ｂ）（ａ）のポリペプチドの有するアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、D-アロースを菌内に取り込む活性を有するポリペプチドからなる群から選ばれるポリペプチドをコードするＤＮＡをＧＳＴベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体を培養液中で培養し、該ポリペプチドを該培養物中に生成・蓄積させ、該培養物中より採取する該リコンビナントＡＬＢＰである。
被験試料としては広範なものが対象になる。単純な糖液をはじめ、血液などの体液、細胞・臓器や植物などからの抽出液、培養液、あるいは河川の水や湖水、海水など自然環境に存在する液体、工業排水など人間社会から産出される液体など、対象を選ばない。ただし蛋白質を多く含む試料については脱蛋白質処理が必要であるなど、前処理を要する可能性がある。
希少糖Ｄ−プシコースを酵素的にＤ−アロースへ導くことで特異的に希少糖Ｄ−プシコースを測定するという原理について説明する。
Ｄ−アロースに特異的に結合するポリペプチドが見いだされ、そのポリペプチドを用いるＤ−アロースの定量方法は、酵素反応による個々の単糖の連結という生産面での体系化が可能となった図６で示される連携図でのＤ−アロースの存在位置を確認し、Ｌ−ラムノースイソメラーゼの新規触媒反応を含めて全ての異性化反応が整理されＬ−ラムノースイソメラーゼの新規触媒反応を含めて全ての異性化反応が整理された図７、図８、図９を参考にして、追加する酵素の種類を決定することができる。
図面によると、Ｌ−ラムノースイソメラーゼが単糖の多くを基質とすることが理解できる。活性の大小はあるものの、Ｌ−ラムノースイソメラーゼが触媒することが確認された異性化反応は図７中太い線で示したものである。一方、異性化反応が確認できなかったものは、太い点線で示した４種であることが一目瞭然に理解できる。
また、は図８、図９に示すように、これも活性の大小はあるものの、ペントースおよびテトロースにおける全異性化活性を持つことを示している。
Ｄ−アロースに特異的に結合するポリペプチドが見いだされ、そのポリペプチドを用いるＤ−アロースの定量方法は、酵素反応による個々の単糖の連結という生産面での体系化が可能となった図６で示される連携図でのＤ−アロースの存在位置を確認し、Ｌ−ラムノースイソメラーゼの新規触媒反応を含めて全ての異性化反応が整理されＬ−ラムノースイソメラーゼの新規触媒反応を含めて全ての異性化反応が整理された図７、図８、図９を参考にして、追加する酵素の種類を決定することができる。
図面によると、Ｌ−ラムノースイソメラーゼが単糖の多くを基質とすることが理解できる。活性の大小はあるものの、Ｌ−ラムノースイソメラーゼが触媒することが確認された異性化反応は図７中太い線で示したものである。一方、異性化反応が確認できなかったものは、太い点線で示した４種であることが一目瞭然に理解できる。
また、は図８、図９に示すように、これも活性の大小はあるものの、ペントースおよびテトロースにおける全異性化活性を持つことを示している。
この方法はタガトースエピメラーゼを追加することで、新たなD-フラクトースの定量にも使用可能である。被験試料中のD-アロース量が、被験試料中のD-フラクトースを、D-タガトース ３ エピメラーゼとL-ラムノースイソメラーゼを該試料に同時に作用させることにより、D-アロースに変換したものの量である。
本願発明の詳細を実施例で説明する。本願発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
希少糖Ｄ−アロースやＤ−プシコース以外にも各種の糖質を含む試料中から、各希少糖を特異的に定量する。
Allose-binding protein (ALBP)によるアロースの定量
目的：ＡＬＢＰは大腸菌の膜に発現し、D-アロースを菌内に取り込む３1１アミノ酸からなる蛋白質である。Kim(J. of Bacteriology, 1997)によってD-アロースのＡＬＢＰに対する結合実験がおこなわれており、D-アロースが結合することによって吸光度が変化することを報告している。
現在、D-アロースをはじめとした希少糖を用いた実験が行われているが、希少糖定量の簡易な方法はまだないため、今回、ＡＬＢＰによってD-アロースの定量ができるかどうか検討した。
Allose-binding protein (ALBP)によるアロースの定量
目的：ＡＬＢＰは大腸菌の膜に発現し、D-アロースを菌内に取り込む３1１アミノ酸からなる蛋白質である。Kim(J. of Bacteriology, 1997)によってD-アロースのＡＬＢＰに対する結合実験がおこなわれており、D-アロースが結合することによって吸光度が変化することを報告している。
現在、D-アロースをはじめとした希少糖を用いた実験が行われているが、希少糖定量の簡易な方法はまだないため、今回、ＡＬＢＰによってD-アロースの定量ができるかどうか検討した。
方法：（１）ＡＬＢＰ遺伝子のクローニング：ALBPのリコンビナント蛋白を合成するためにGenbankよりＡＬＢＰ遺伝子の配列を検索し、膜移行シグナル部分を除いてプライマーを作成した。大腸菌であるＤＨ５αからゲノムＤＮＡを抽出し、このプライマーを用いてＡＬＢＰ遺伝子をＰＣＲにて増幅し、ＧＳＴベクター(Amersham Pharmacia)に挿入した。このベクターをＢＬ２１菌にトランスフォームし、得られたコロニーからＤＮＡを抽出し、シークエンスにてインサートを確認した。
（２）リコンビナント蛋白の合成：ＡＬＢＰ遺伝子を組み込んだＧＳＴベクターをトランスフォームした大腸菌を培養し、ＩＰＴＧによってＡＬＢＰ蛋白合成を誘導した。この培養液からＧＳＴmini-purification kit(Amersham pharmacia)を用いてＡＬＢＰ−ＧＳＴ融合蛋白を精製した。この蛋白をprescission proteaseを用いてカラム内で切断し、リコンビナントＡＬＢＰ蛋白のみを得た。
（３）リコンビナントＡＬＢＰ蛋白の希少糖結合実験（スペクトラム解析）：ＡＬＢＰ蛋白にD-アロースが結合すると蛋白の吸光度をシフトが起こることが報告されている。今回の実験では我々のリコンビナント蛋白がD-アロース結合によって吸光度のシフトを起こすかどうか、またこの吸光度シフトはD-アロースに特異的であるかどうか検討した。リコンビナントＡＬＢＰ蛋白に終濃度５ｍＭとなるように各種糖(D-アロース, D-プシコース, D-グルコース, D-マンノース, D-フラクトース, D-ガラクトース, D- マンニトール, D-ソルビトール, アリトール, D-キシリトール)を加え、Phosphate buffer中で２５度１時間インキュベートした。このサンプルの吸光度スペクトラムをＦＰ−６３００蛍光分光光度計で測定した。
（４）リコンビナントＡＬＢＰ蛋白による実験サンプル中のD-アロース検出：現在、希少糖の動物に対する生理作用を研究するためにラットなどの実験動物や培養細胞系にD-アロースをはじめとする希少糖を投与して実験を行っている。これらの系において投与された動物中（たとえば血液）や細胞培養系でのD-アロースを検出できるかどうか検討した。我々が実験に用いているＰＣ１２細胞の培養液（ＤＭＥＭ培地、１０％ＦＢＳ、５％ＦＣＳ、抗生物質）100ulに最終濃度５ｍＭまたは１０ｍＭとなるようにD-アロース、またはD-グルコースを加えた。この培養液に100ulの６０％ perchloric acidを加え、氷上で１５分放置した。遠心後に150μlの上清に270μlの３Ｍ ＫＯＨを加え、サンプルを中和し、このサンプルの１部を実験に使用し、ＡＬＢＰ蛋白を加えて、吸光度スペクトラムの変化を測定した。
（５）リコンビナントＡＬＢＰ蛋白によるD-アロースの定量：ＡＬＢＰがD-アロースのみに特異的に結合することによって吸光度変化がおこることがわかったので、定量が可能であるかどうか検討した。１．５μMのＡＬＢＰに終濃度０−５μMとなるように各種糖(D-アロース、D-プシコース、D-マンノース、D-フラクトース、D-グルコース)をくわえ、phosphate buffer中で２５度で１時間インキュベートした。このサンプルの吸光度をＦＰ−６３００蛍光分光光度計で測定した。
（２）リコンビナント蛋白の合成：ＡＬＢＰ遺伝子を組み込んだＧＳＴベクターをトランスフォームした大腸菌を培養し、ＩＰＴＧによってＡＬＢＰ蛋白合成を誘導した。この培養液からＧＳＴmini-purification kit(Amersham pharmacia)を用いてＡＬＢＰ−ＧＳＴ融合蛋白を精製した。この蛋白をprescission proteaseを用いてカラム内で切断し、リコンビナントＡＬＢＰ蛋白のみを得た。
（３）リコンビナントＡＬＢＰ蛋白の希少糖結合実験（スペクトラム解析）：ＡＬＢＰ蛋白にD-アロースが結合すると蛋白の吸光度をシフトが起こることが報告されている。今回の実験では我々のリコンビナント蛋白がD-アロース結合によって吸光度のシフトを起こすかどうか、またこの吸光度シフトはD-アロースに特異的であるかどうか検討した。リコンビナントＡＬＢＰ蛋白に終濃度５ｍＭとなるように各種糖(D-アロース, D-プシコース, D-グルコース, D-マンノース, D-フラクトース, D-ガラクトース, D- マンニトール, D-ソルビトール, アリトール, D-キシリトール)を加え、Phosphate buffer中で２５度１時間インキュベートした。このサンプルの吸光度スペクトラムをＦＰ−６３００蛍光分光光度計で測定した。
（４）リコンビナントＡＬＢＰ蛋白による実験サンプル中のD-アロース検出：現在、希少糖の動物に対する生理作用を研究するためにラットなどの実験動物や培養細胞系にD-アロースをはじめとする希少糖を投与して実験を行っている。これらの系において投与された動物中（たとえば血液）や細胞培養系でのD-アロースを検出できるかどうか検討した。我々が実験に用いているＰＣ１２細胞の培養液（ＤＭＥＭ培地、１０％ＦＢＳ、５％ＦＣＳ、抗生物質）100ulに最終濃度５ｍＭまたは１０ｍＭとなるようにD-アロース、またはD-グルコースを加えた。この培養液に100ulの６０％ perchloric acidを加え、氷上で１５分放置した。遠心後に150μlの上清に270μlの３Ｍ ＫＯＨを加え、サンプルを中和し、このサンプルの１部を実験に使用し、ＡＬＢＰ蛋白を加えて、吸光度スペクトラムの変化を測定した。
（５）リコンビナントＡＬＢＰ蛋白によるD-アロースの定量：ＡＬＢＰがD-アロースのみに特異的に結合することによって吸光度変化がおこることがわかったので、定量が可能であるかどうか検討した。１．５μMのＡＬＢＰに終濃度０−５μMとなるように各種糖(D-アロース、D-プシコース、D-マンノース、D-フラクトース、D-グルコース)をくわえ、phosphate buffer中で２５度で１時間インキュベートした。このサンプルの吸光度をＦＰ−６３００蛍光分光光度計で測定した。
結果：
（１）ＡＬＢＰ遺伝子のクローニング：大腸菌ＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲには下記のプライマーを用いた。
ALBP-FWD 5’ GCGCTGGATCCGCCGCCGAATATGCTGTCGTATTG 3’
ALBP-RVS 5’ AGTTTTCTCGAGTGACCAGGATTGAATCGA 3’
ＰＣＲの条件は９５度５分の後、９５度３０秒、５５度３０秒、７２度１．１分を３５回繰り返した。ＰＣＲ後のサンプルの１部をアガロースゲルにて電気泳動し、期待される大きさ（約９００ｂｐ）のバンドを確認した（図１）。このＰＣＲ産物をＧＳＴベクターにクローニング後にＢＬ２１大腸菌にトランスフォームし、得られたコロニーからＤＮＡを抽出して塩基配列を決定したところ、ＡＬＢＰ遺伝子であることが確認された。
（２）リコンビナントＡＬＢＰ蛋白発現と精製：トランスフォーメーションで得られたコロニーをＬＢ液体培地で培養し、ＩＰＴＧを加えることによってＡＬＢＰ−ＧＳＴ融合蛋白発現を誘導した。この培養液から融合蛋白のみをカラムを使って精製し、prescission protease処理によってＧＳＴを除き、ＡＬＢＰ蛋白のみを回収した。サンプルは１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。融合蛋白はＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で約５６ｋＤａのバンドであるが、prescission protease処理にてＧＳＴを除いたＡＬＢＰのみのサンプルでは３０ｋＤaのシングルバンドとなっている（図２）。
（３）リコンビナントＡＬＢＰ蛋白の希少糖結合実験（スペクトラム解析）：各種糖とリコンビナントＡＬＢＰをインキュベートし、吸光度を蛍光分光光度計で測定した。吸光度測定にはサンプルを295nmで励起後に310-410nmのスペクトルを解析した。
その結果、D-アロースを加えたときには約350nm付近にあった吸光度のPEAKはより短波長（紫外方向、約340nm付近）へのシフトが認められ、さらにこのピークの高さも高くなった。しかし、他の糖を加えた時にはシフトがみとめられず、ALBPがD-アロースを加えた時にのみ吸光度変化が認められた。このことからD-アロースのみがＡＬＢＰに特異的に結合することによって吸光度の変化が起こったことが示唆された。（図３）
（４）リコンビナントＡＬＢＰ蛋白による実験サンプル中のD-アロース検出：ＰＣ１２細胞の培養に使用する培養液中に加えられた希少糖（D-アロース）またD-グルコースが検出できるかどうかを蛍光分光光度計を使って実験を行った。その結果、細胞培養液にD-グルコースを加えた場合は吸光度のピークはシフトしなかったが、D-アロースを加えた場合は今までの実験と同様、吸光度ピークの紫外方向へのシフトが認められた（図４）。このことは実際の実験サンプル中のD-アロースも検出できるということを示している。
（５）リコンビナントＡＬＢＰ蛋白によるD-アロースの定量：リコンビナントＡＬＢＰ蛋白に各種糖を加え、吸光度変化を測定した。測定にはサンプルを２９５nmの波長で励起し、３３８nmの吸光度を測定した。その結果、D-アロースを加えた時は他の糖を加えた時にくらべ著明に吸光度が上昇した（図５）。この変化は１μMの濃度でも大きく、比較的感度がよいことが示唆された。また今回の実験では他の糖でもわずかの吸光度変化が認められたが、スペクトラム解析では変化がなく、これはＡＬＢＰに糖が結合したことによる変化とは考えにくい。今後さらに実験条件を改善する必要がある。
（１）ＡＬＢＰ遺伝子のクローニング：大腸菌ＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲには下記のプライマーを用いた。
ALBP-FWD 5’ GCGCTGGATCCGCCGCCGAATATGCTGTCGTATTG 3’
ALBP-RVS 5’ AGTTTTCTCGAGTGACCAGGATTGAATCGA 3’
ＰＣＲの条件は９５度５分の後、９５度３０秒、５５度３０秒、７２度１．１分を３５回繰り返した。ＰＣＲ後のサンプルの１部をアガロースゲルにて電気泳動し、期待される大きさ（約９００ｂｐ）のバンドを確認した（図１）。このＰＣＲ産物をＧＳＴベクターにクローニング後にＢＬ２１大腸菌にトランスフォームし、得られたコロニーからＤＮＡを抽出して塩基配列を決定したところ、ＡＬＢＰ遺伝子であることが確認された。
（２）リコンビナントＡＬＢＰ蛋白発現と精製：トランスフォーメーションで得られたコロニーをＬＢ液体培地で培養し、ＩＰＴＧを加えることによってＡＬＢＰ−ＧＳＴ融合蛋白発現を誘導した。この培養液から融合蛋白のみをカラムを使って精製し、prescission protease処理によってＧＳＴを除き、ＡＬＢＰ蛋白のみを回収した。サンプルは１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。融合蛋白はＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で約５６ｋＤａのバンドであるが、prescission protease処理にてＧＳＴを除いたＡＬＢＰのみのサンプルでは３０ｋＤaのシングルバンドとなっている（図２）。
（３）リコンビナントＡＬＢＰ蛋白の希少糖結合実験（スペクトラム解析）：各種糖とリコンビナントＡＬＢＰをインキュベートし、吸光度を蛍光分光光度計で測定した。吸光度測定にはサンプルを295nmで励起後に310-410nmのスペクトルを解析した。
その結果、D-アロースを加えたときには約350nm付近にあった吸光度のPEAKはより短波長（紫外方向、約340nm付近）へのシフトが認められ、さらにこのピークの高さも高くなった。しかし、他の糖を加えた時にはシフトがみとめられず、ALBPがD-アロースを加えた時にのみ吸光度変化が認められた。このことからD-アロースのみがＡＬＢＰに特異的に結合することによって吸光度の変化が起こったことが示唆された。（図３）
（４）リコンビナントＡＬＢＰ蛋白による実験サンプル中のD-アロース検出：ＰＣ１２細胞の培養に使用する培養液中に加えられた希少糖（D-アロース）またD-グルコースが検出できるかどうかを蛍光分光光度計を使って実験を行った。その結果、細胞培養液にD-グルコースを加えた場合は吸光度のピークはシフトしなかったが、D-アロースを加えた場合は今までの実験と同様、吸光度ピークの紫外方向へのシフトが認められた（図４）。このことは実際の実験サンプル中のD-アロースも検出できるということを示している。
（５）リコンビナントＡＬＢＰ蛋白によるD-アロースの定量：リコンビナントＡＬＢＰ蛋白に各種糖を加え、吸光度変化を測定した。測定にはサンプルを２９５nmの波長で励起し、３３８nmの吸光度を測定した。その結果、D-アロースを加えた時は他の糖を加えた時にくらべ著明に吸光度が上昇した（図５）。この変化は１μMの濃度でも大きく、比較的感度がよいことが示唆された。また今回の実験では他の糖でもわずかの吸光度変化が認められたが、スペクトラム解析では変化がなく、これはＡＬＢＰに糖が結合したことによる変化とは考えにくい。今後さらに実験条件を改善する必要がある。
考察：
（１）今回の実験でリコンビナントALBPがD-アロースに対して特異的に結合し、吸光度のスペクトラムが変化することがわかった。この変化はD-プシコースなどの他の糖を加えたときには認められなかった。
（２）現在の方法ではALBP蛋白自身の吸光度変化を測定しているため、サンプル中に蛋白が混入すると測定値に影響がでることが予想される。そのため強酸の添加等によってサンプル中の蛋白を前もって除去する必要がある。Lager(FEBS Letter, 2003)らはribose-binding proteinを蛍光蛋白であるGFPに組み込んでnanosensorとして細胞中のriboseの検出を行っている。現在我々もALBPを組み込んだALBP-GFP nanosensorを開発中であり、このセンサーが完成すればD-アロースなどの希少糖の定量がより簡便に行えるだけでなく、細胞中に取り込まれたD-アロースを顕微鏡下で検出することも可能であると思われる。
（３）ALBPあるいは、ALBP-GFPを用いれば、D-アロースの微量定量ができるだけでなく、他の糖の定量方法にも利用できる。すなわち、D-プシコースの定量のためには、L-ラムノースイソメラーゼを試料に作用させることにより、D-プシコースをD-アロースに変換される。D-アロースはALBPに結合するのでD-アロースへの平衡は維持され、最後には全てのD-プシコースがD-アロースに変換される。従って試料中の全D-プシコースをD-アロースとして定量できる。同様に、D-フラクトースもD-タガトース ３ エピメラーゼとL-ラムノースイソメラーゼを同時に作用させることにより、D-フラクトースをD-プシコースそしてD-アロースへと変換できるので定量可能となる。
（４）ALBPを利用した方法では、以上のようにD-アロース、D-プシコース、D-フラクトースの微量定量が可能となる。これまで前２者の定量方法は皆無である。またD-フラクトースについても定量法は幾つかあるものの煩雑さや感度での問題点もある。この方法は、これらの糖の微量定量を可能にするものであり、基礎研究および応用研究を推進するにあたり大変重要な技術となりうる。
（１）今回の実験でリコンビナントALBPがD-アロースに対して特異的に結合し、吸光度のスペクトラムが変化することがわかった。この変化はD-プシコースなどの他の糖を加えたときには認められなかった。
（２）現在の方法ではALBP蛋白自身の吸光度変化を測定しているため、サンプル中に蛋白が混入すると測定値に影響がでることが予想される。そのため強酸の添加等によってサンプル中の蛋白を前もって除去する必要がある。Lager(FEBS Letter, 2003)らはribose-binding proteinを蛍光蛋白であるGFPに組み込んでnanosensorとして細胞中のriboseの検出を行っている。現在我々もALBPを組み込んだALBP-GFP nanosensorを開発中であり、このセンサーが完成すればD-アロースなどの希少糖の定量がより簡便に行えるだけでなく、細胞中に取り込まれたD-アロースを顕微鏡下で検出することも可能であると思われる。
（３）ALBPあるいは、ALBP-GFPを用いれば、D-アロースの微量定量ができるだけでなく、他の糖の定量方法にも利用できる。すなわち、D-プシコースの定量のためには、L-ラムノースイソメラーゼを試料に作用させることにより、D-プシコースをD-アロースに変換される。D-アロースはALBPに結合するのでD-アロースへの平衡は維持され、最後には全てのD-プシコースがD-アロースに変換される。従って試料中の全D-プシコースをD-アロースとして定量できる。同様に、D-フラクトースもD-タガトース ３ エピメラーゼとL-ラムノースイソメラーゼを同時に作用させることにより、D-フラクトースをD-プシコースそしてD-アロースへと変換できるので定量可能となる。
（４）ALBPを利用した方法では、以上のようにD-アロース、D-プシコース、D-フラクトースの微量定量が可能となる。これまで前２者の定量方法は皆無である。またD-フラクトースについても定量法は幾つかあるものの煩雑さや感度での問題点もある。この方法は、これらの糖の微量定量を可能にするものであり、基礎研究および応用研究を推進するにあたり大変重要な技術となりうる。
希少糖の定量法は、希少糖の用途開発をはじめ希少糖生産の制御や各種の希少糖を使用した製品管理などに重要な技術である。
Claims (4)
- D-アロースが結合することによって変化する下記のポリペプチドの有する吸光度、またはD-アロースが結合したときD-アロース−下記のポリペプチドの結合体が作り出す蛍光を測定し、そのシグナル量に基づき被験試料中のD-アロース量を定量することを特徴とする希少糖の定量方法。
記
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、かつ、D-アロースを菌内に取り込む活性を有するポリペプチド、および
（ｂ）（ａ）のポリペプチドの有するアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、D-アロースを菌内に取り込む活性を有するポリペプチドからなる群から選ばれるポリペプチド。 - 上記のポリペプチドが、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、かつ、D-アロースを菌内に取り込む活性を有するポリペプチド、および
（ｂ）（ａ）のポリペプチドの有するアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、D-アロースを菌内に取り込む活性を有するポリペプチドからなる群から選ばれるポリペプチドをコードするＤＮＡをＧＳＴベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体を培養液中で培養し、該ポリペプチドを該培養物中に生成・蓄積させ、該培養物中より採取する該リコンビナントポリペプチドである請求項１の希少糖の定量方法。 - 被験試料中のD-アロース量が、被験試料中のD-プシコースを、L-ラムノースイソメラーゼを該試料に作用させることにより、D-アロースに変換したものの量である請求項１または２の希少糖の定量方法。
- 被験試料中のD-アロース量が、被験試料中のD-フラクトースを、D-タガトース ３ エピメラーゼとL-ラムノースイソメラーゼを該試料に同時に作用させることにより、D-アロースに変換したものの量である請求項１ないし３のいずれかの希少糖の定量方法。
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