KR20180023912A - 전기화학적 바이오센서 - Google Patents

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빅토르 스테인
종 구오
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Abstract

바이오센서는 기질과 반응하여 하나 이상의 전자를 생성할 수 있는 포도당 탈수소효소와 같은 효소의 아미노산 서열을 포함하고, 효소는 표적 분자와의 결합에 대응하여 촉매적 불활성 상태에서 촉매적 활성 상태로 전환될 수 있도록 조작되었다. 표적 분자를 검출하는 방법이 제공되며, 포도당 탈수소효소와 같은 효소가 기질과 반응하여, 효소가 표적 분자와의 결합에 대응하여 촉매적 불활성 상태에서 촉매적 활성 상태로 전환된 결과로서, 하나 이상의 전자를 생성한다.

Description

전기화학적 바이오센서
본 발명은 바이오센서에 관한 것이다. 더욱 상세하게, 본 발명은 전기화학적 바이오센서 및 시료에서 하나 이상의 표적 분자의 검출에 적합한 전기화학적 활성 효소 또는 이의 단편에 관한 것이다. 바이오센서 분자는 또한 인공 세포 신호 전달 네트워크를 구축하는 것과 같은 합성 생물학 분야와 관련될 수 있다.
생물학적 시료에서 표적 분자 또는 분석물의 검출은 건강 및 질병의 진단 모니터링의 중심이다. 분석물 검출의 핵심 요건은 특이성(specificity)과 민감성(sensitivity)이며, 특히 표적 분자 또는 분석물이 생물학적 시료 내에서 제한된 양 또는 농도로 존재할 때 특히 그러하다.
일반적으로, 특이성은 분석물과 특이적으로 결합하는 단클론 항체에 의해 제공된다. 민감성은 일반적으로 특정 항체 또는 비교적 낮은 수준의 분석물의 검출을 지원하는 이차 항체에 결합된 표지(label)에 의해 제공된다. 이러한 유형의 진단 방법은 효소-결합 면역 흡착 샌드위치 분석(enzyme-linked immunosorbent sandwich assay, ELISA) 형식으로 잘 알려져 있고 널리 사용된다. 경우에 따라서, 효소 증폭은 동일한 반응을 촉진시키는 전효소 절단 반응(proenzyme cleavage reaction)의 산물을 사용하는 것에 의해서와 같이 민감성을 더욱 향상시킬 수 있다. 이러한 "자가촉매(autocatalytic)" 효소의 일부 예는 트립시노겐(trypsinogen), 펩시노겐(pepsinogen) 또는 혈액 응고 인자 XII이다. 그러나, 특이성과 관련하여, 항체는 비교적 고가이며 일부 분석물에 대해 충분한 특이성을 가지고 생산하기가 어려울 수 있다. 다클론 항체도 동일한 단점을 가지며 대규모로 생산하고 정제하는 것이 훨씬 더 어렵다.
예후 또는 진단 목적을 위해 특정 표적 분자 및 분석물을 검출하는 현재의 방법은 임상, 수술 전후 및 현장 진단 환경에서 이들의 광범위한 적용을 상당히 제한하는 다수의 제한을 갖는다. 가장 중요한 것은 대부분의 진단 분석법이, 전문적인 실험실 환경 밖에서는 거의 이용할 수 없는 정교한 생물 의학적인 기반 시설과 함께, 상당한 수준의 기술적 전문 지식 및 일련의 값비싼 특정 시약(특히, 단클론 항체)을 필요로 한다는 것이다. 예를 들어, 복잡한 생물학적 시료에서 특정 분석물을 검출하기 위한 최적의 표준인 ELISA는 고체 표면상에서의 표적 분석물의 선택적 포집에 의존하며, 이는 다시 표적 분석물에 특이적인 제 2 친화성 시약으로 검출된다. ELISA는 또한 수많은 연속적인 단계가 다양한 절차, 조작자 및 실험실에 걸쳐 상당한 변화를 가져오는 경우가 많으며 정량적 비교를 어렵게 만들기 때문에, 일반적으로 시간 소모적이고 표준화하기 어려운 광범위한 배양 및 세척 단계를 특징으로 한다.
본 발명은 치료 요법과 양립할 수 있는 짧은 시간 동안 표적 분자(예를 들어, 분석물)의 존재 또는 활성을 용이하게 검출하는 정량적이고 비교적 저렴하며 용이하게 제조되는 분자 바이오센서를 개발해야 하는 필요성을 다룬다. 이러한 바이오센서는 유전적 배경 및 관련이 없는 생리적 과정의 자연적 변동과는 상관없이 높은 특이성과 큰 통계적 신뢰도를 가지고 분자 표현형을 검증 및/또는 진단하기 위해 단독으로 또는 다중으로 적용될 수 있다. 이러한 분자 바이오센서는 표적 분자 또는 분석물이 불법 약물 또는 성능-향상 물질인 경우와 같은 그 밖의 테스트 절차에서 사용될 수 있다.
더욱 상세하게, 본 발명은 진단 결과의 분석 및 전달을 위한 현장 진단 장치와 같은 전기 장치에 통합하는데 특히 적합한 분자 바이오센서를 제공한다.
따라서, 본 발명의 목적은 표적 분자에 대한 특이성을 가지며 표적 분자의 검출에 대해 전기적 응답을 생성할 수 있는 바이오센서 분자를 제공하는 것이다.
하나의 광범위한 형태에서, 본 발명은 기질과 반응하여 하나 이상의 전자를 생성할 수 있는 효소의 아미노산 서열을 포함하는 바이오센서에 관한 것으로, 효소는 표적 분자와의 결합에 대응하여 촉매적 불활성 상태에서 촉매적 활성 상태로 전환될 수 있도록 조작되었다.
제 1 양태에서, 본 발명은 촉매적 활성 상태에 있을 때 기질 분자와 반응하여 하나 이상의 전자를 생성할 수 있는 효소의 적어도 하나의 아미노산 서열; 및 효소를 촉매적 불활성 상태에서 해제 가능하게 유지하는 적어도 하나의 이종 센서 아미노산 서열을 포함하는 바이오센서를 제공하며, 이종 센서 아미노산 서열은 표적 분자에 반응하여 효소의 아미노산 서열을 촉매적 불활성 상태에서 상기 촉매적 활성 상태로 전환시킨다. 따라서, 이종 센서 아미노산 서열은 효소의 촉매 활성을 가역적으로 조절한다. 이종 센서 아미노산 서열은 표적 분자의 존재 하에 치환됨으로써 효소를 촉매적으로 활성화시킬 수 있다. 이종 센서 아미노산 서열은 효소의 촉매 활성을 알로스테릭하게(allosterically) 조절할 수 있다.
적절하게, 적어도 하나의 효소 아미노산 서열 및 상기 적어도 하나의 이종 센서 아미노산 서열은 하나의 인접한 아미노산 서열 내에 존재하거나 또는 이의 적어도 일부를 형성한다.
특정 실시형태에서, 상기 적어도 하나의 이종 센서 아미노산 서열은 상기 적어도 하나의 효소 아미노산 서열 내의 삽입체이고, 상기 촉매적 불활성 상태와 상기 촉매적 활성 상태 사이에서 효소 아미노산 서열의 전환을 용이하게 한다.
적절하게, 이종 센서 아미노산 서열은 상기 표적 분자와 결합하여 효소의 아미노산 서열을 촉매적 불활성 상태에서 상기 촉매적 활성 상태로 전환시킨다.
일 실시형태에서, 이종 센서 아미노산 서열은 칼슘-결합 단백질의 아미노산 서열 또는 이의 단편이다. 특정 실시형태에서, 칼슘-결합 단백질은 칼모듈린(calmodulin)이다.
제 2 양태에서, 본 발명은 촉매적 활성 상태에 있을 때 기질 분자와 반응하여 하나 이상의 전자를 생성할 수 있는 효소의 적어도 하나의 아미노산 서열; 및 효소를 촉매적 불활성 상태에서 해제 가능하게 유지하도록 조작된 상기 효소의 적어도 하나의 다른 아미노산 서열을 포함하는 바이오센서를 제공하며, 상기 바이오센서는 표적 분자에 반응하여 효소의 아미노산 서열을 촉매적 불활성 상태에서 상기 촉매적 활성 상태로 전환시킨다.
적절하게, 상기 효소의 상기 적어도 하나의 다른 아미노산 서열은 하나 이상의 아미노산 서열 변이를 포함하도록 조작된다. 적절하게, 촉매적 활성 상태에 있을 때 기질 분자와 반응하여 하나 이상의 전자를 생성할 수 있는 효소의 상기 적어도 하나의 아미노산 서열 및 효소를 촉매적 불활성 상태에서 해제 가능하게 유지하도록 조작된 상기 효소의 상기 적어도 하나의 다른 아미노산 서열은 비-공유 상호 작용한다. 일 실시형태에서, 본 양태의 바이오센서는 효소를 촉매적 불활성 상태에서 해제 가능하게 유지하도록 조작된 상기 효소의 상기 적어도 하나의 다른 아미노산 서열을 치환할 수 있는 상기 효소의 또 다른 아미노산 서열을 더 포함한다. 일반적으로, 이러한 치환은 상기 효소의 상기 또 다른 아미노산 서열을, 기질과 반응하여 기능성 촉매적 활성 효소를 형성할 수 있는 효소의 상기 적어도 하나의 아미노산 서열과 비-공유 결합시킴으로써 효소의 촉매 활성을 회복시킨다. 광범위한 실시형태에서, 상기 효소의 상기 또 다른 아미노산 서열 및 기질과 반응할 수 있는 효소의 상기 적어도 하나의 아미노산 서열은, 예를 들어 표적 분자와 결합함으로써, 상기 또 다른 아미노산 서열에 의한 조작된 아미노산 서열의 치환을 용이하게 하도록 상호 작용할 수 있는 각각의 결합 모이어티를 포함한다.
제 2 양태의 특정 실시형태는 따라서 촉매적 활성 상태에 있을 때 기질 분자와 반응하여 하나 이상의 전자를 생성할 수 있는 효소의 적어도 하나의 아미노산 서열; 제 1 결합 모이어티; 및 효소를 촉매적 불활성 상태에서 해제 가능하게 유지하도록 조작된 상기 효소의 적어도 하나의 다른 아미노산 서열을 포함하는 제 1 성분; 및 상기 효소의 적어도 하나의 다른 아미노산 서열 및 제 2 결합 모이어티를 포함하는 제 2 성분을 포함하는 바이오센서를 제공하며, 상기 바이오센서는, 상기 제 1 및 제 2 결합 모이어티 간의 상호 작용이 제 2 성분의 상기 적어도 하나의 다른 아미노산 서열에 의한 제 1 성분의 상기 적어도 하나의 다른 아미노산 서열의 치환을 용이하게 함으로써, 제 1 성분의 효소를 촉매적 불활성 상태에서 촉매적 활성 상태로 전환시키도록 구성된다.
또 다른 광범위한 실시형태에서, 상기 효소의 상기 조작된 아미노산 서열 및 기질과 반응할 수 있는 효소의 상기 적어도 하나의 아미노산 서열은 처음에 상호 작용하는 각각의 결합 모이어티를 포함하고, 이러한 상호 작용은 이후 표적 분자와 결합하는 하나의 또는 또 다른 결합 모이어티에 의해 파괴된다. 이러한 상호 작용의 파괴는 상기 또 다른 아미노산 서열에 의한 조작된 아미노산 서열의 치환을 용이하게 한다.
제 2 양태의 또 다른 특정 양태는 따라서 촉매적 활성 상태에 있을 때 기질 분자와 반응하여 하나 이상의 전자를 생성할 수 있는 효소의 적어도 하나의 아미노산 서열; 제 1 결합 모이어티; 및 효소를 촉매적 불활성 상태에서 해제 가능하게 유지하도록 조작된 상기 효소의 적어도 하나의 다른 아미노산 서열을 포함하는 제 1 성분; 및 상기 효소의 적어도 하나의 다른 아미노산 서열 및 제 2 결합 모이어티를 포함하는 제 2 성분을 포함하는 바이오센서를 제공하며, 상기 바이오센서는, 상기 제 1 및 제 2 결합 모이어티 간의 상호 작용이 제 1 또는 제 2 결합 모이어티와 결합할 수 있는 표적 분자에 의해 해제되어 제 2 분자의 상기 적어도 하나의 다른 아미노산 서열에 의한 제 1 분자의 상기 적어도 하나의 다른 아미노산 서열의 치환을 용이하게 함으로써, 제 1 성분의 효소를 촉매적 불활성 상태에서 촉매적 활성 상태로 전환시키도록 구성된다.
또 다른 광범위한 실시형태에서, 제 2 양태의 바이오센서는 프로테아제 표적 분자를 검출하기에 적합하고, 따라서 일반적으로 두 개 또는 세 개의 프로테아제 절단 부위와 같은 하나 이상의 프로테아제 절단 부위를 포함한다. 바람직하게, 하나 이상의 프로테아제 절단 부위는 조작된 아미노산 서열을 치환할 수 있는 효소의 상기 또 다른 아미노산 서열에 위치한다. 상기 또 다른 아미노산 서열은 프로테아제 절단 부위에 인접하게 위치할 수 있는 프로테아제의 결합 및/또는 절단 효율을 향상시키는 서열을 더 포함할 수 있다.
바람직하게, 기질과 반응할 수 있는 효소의 상기 적어도 하나의 아미노산 서열 및 효소의 상기 또 다른 아미노산 서열은 이들 간의 결합 억제제의 프로테아제 절단 이후 상호 작용할 수 있는 각각의 결합 모이어티를 포함한다. 이러한 상호 작용은 상기 또 다른 아미노산 서열에 의한 조작된 아미노산 서열의 치환을 용이하게 한다.
제 2 양태의 또 다른 특정 양태는 따라서 촉매적 활성 상태에 있을 때 기질 분자와 반응하여 하나 이상의 전자를 생성할 수 있는 효소의 적어도 하나의 아미노산 서열; 제 1 결합 모이어티; 및 효소를 촉매적 불활성 상태에서 해제 가능하게 유지하도록 조작된 상기 효소의 적어도 하나의 다른 아미노산 서열을 포함하는 제 1 성분; 및 상기 효소의 적어도 하나의 다른 아미노산 서열 및 프로테아제 절단 부위에 의해 억제제에 연결 또는 결합된 제 2 결합 모이어티를 포함하는 제 2 성분을 포함하는 바이오센서를 제공하며, 억제제는 제 1 및 제 2 결합 모이어티 간의 상호 작용을 방지 또는 억제하고, 상기 바이오센서는, 상기 억제제가 상기 프로테아제 결합 부위를 절단하는 프로테아제 표적 분자에 의해 해제되어 제 1 및 제 2 결합 모이어티 간의 상호 작용을 촉진시켜 제 2 분자의 상기 적어도 하나의 다른 아미노산 서열에 의한 제 1 분자의 상기 적어도 하나의 다른 아미노산 서열의 치환을 용이함으로써, 제 1 성분의 효소를 촉매적 불활성 상태에서 촉매적 활성 상태로 전환시키도록 구성된다.
특정 실시형태에서, 억제제는 제 1 결합 모이어티와 실질적으로 동일한 분자이다.
제 3 양태에서, 본 발명은 촉매적 활성 상태에 있을 때 기질 분자와 반응하여 하나 이상의 전자를 생성할 수 있는 효소의 적어도 하나의 아미노산 서열; 표적 분자와 결합할 수 있는 결합 모이어티; 및 표적 분자의 부재 하에 결합 모이어티와 상호 작용하여 효소를 억제할 수 있는 적어도 하나의 효소 억제제를 포함하는 바이오센서를 제공하며, 상기 바이오센서는, 표적 분자가 상기 적어도 하나의 효소 억제제와 결합 모이어티 간의 상호 작용을 해제시킴으로써 억제제에 의한 효소의 억제를 해제시키고 효소의 아미노산 서열을 촉매적 불활성 상태에서 상기 촉매적 활성 상태로 전환시킬 수 있도록 구성된다.
제 3 양태의 실시형태는 촉매적 활성 상태에 있을 때 기질 분자와 반응하여 하나 이상의 전자를 생성할 수 있는 효소의 적어도 하나의 아미노산 서열; 프로테아제 절단 부위에 의해 효소에 연결 또는 결합된 상기 효소의 억제제; 및 제 1 성분 결합 모이어티를 포함하는 제 1 성분; 제 1 성분 결합 모이어티와 결합할 수 있는 제 2 성분 결합 모이어티; 프로테아제 아미노산 서열; 및 표적 분자와 결합할 수 있는 또 다른 제 2 성분 결합 모이어티를 포함하는 제 2 성분; 및 표적 분자의 부재 하에 상기 제 2 성분 결합 모이어티와 상호 작용할 수 있는 제 3 성분 결합 모이어티를 포함하는 제 3 성분을 포함하는 바이오센서를 제공하며, 상기 바이오 센서는, 상기 표적 분자가 제 3 성분 결합 모이어티와 상기 제 2 성분 결합 모이어티 간의 결합을 치환하여 상기 제 1 성분 결합 모이어티와 상기 제 2 성분 결합 모이어티 간의 상호 작용을 촉진시키고, 이에 따라 프로테아제가 프로테아제 절단 부위를 절단하여 억제제에 의한 효소의 억제를 제거하고 따라서 효소를 촉매적 불활성 상태에서 촉매적 활성 상태로 전환시키도록 구성된다.
위의 모든 양태에서, 효소는 산화환원효소(oxidoreductase), 바람직하게는 포도당 탈수소효소(glucose dehydrogenase)일 수 있다.
본 발명은 또한 표적 분자에 반응하는 이종 센서 아미노산 서열을 포함하는 산화환원효소, 바람직하게는 포도당 탈수소효소(GDH)를 제공하며, 표적 분자의 결합은 효소의 촉매 활성을 조절하도록 작용한다.
본 발명은 또한 효소의 촉매 활성을 방지 또는 감소시키도록 작용하는 억제 모이어티를 포함하는 산화환원효소, 바람직하게는 포도당 탈수소효소(GDH)를 제공하며, 억제 모이어티는 하나 이상의 분자의 존재 하에 치환되어 효소의 촉매 활성을 활성화시킬 수 있다.
본 발명은 또한 포도당 탈수소효소(GDH)의 제 1 단편 서열을 포함하고, 상기 효소의 제 2 단편 서열을 포함하는 폴리펩티드와 비-공유 상호 작용하여 안정한 GDH 효소를 재구성할 수 있는 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명의 또 다른 양태는 상기한 양태 중 임의의 양태의 바이오센서, 산화환원효소, GDH 효소, 또는 GDH 효소의 제 1 및 제 2 단편 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 조성물 또는 키트를 제공한다. 조성물 또는 키트는 기질 분자를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 표적 분자를 검출하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기한 양태 중 임의의 양태의 바이오센서, 산화환원효소 또는 GDH 효소 또는 GDH 효소의 제 1 및 제 2 단편 서열을 포함하는 폴리펩티드를 시료에 접촉시켜 시료 중의 표적 분자의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 유기체 내의 질병 또는 질환의 진단 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기한 양태 중 임의의 양태의 바이오센서, 산화환원효소 또는 GDH 효소 또는 GDH 효소의 제 1 및 제 2 단편 서열을 포함하는 폴리펩티드를 유기체로부터 수득된 생물학적 시료에 접촉시켜 생물학적 시료 중의 표적 분자의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하고, 표적 분자의 존재 또는 부재의 결정은 질병 또는 질환의 진단을 용이하게 한다.
유기체는 식물 및 어류, 조류 및 인간과 같은 포유동물을 포함하는 동물을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기한 양태 중 임의의 양태의 바이오센서, 산화환원효소 또는 GDH 효소 또는 GDH 효소의 제 1 및 제 2 단편 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 세포 또는 챔버를 포함하는 검출 장치를 제공한다.
적절하게, 시료는 세포 또는 챔버에 도입되어 표적 분자의 검출을 용이하게 할 수 있다.
특정 실시형태에서, 검출 장치는 표적 분자의 존재를 나타내는 전기화학, 음향 및/또는 광학 신호를 제공할 수 있다.
검출 장치는,
프로세서; 및
프로세서에 결합된 메모리를 포함함으로써 진단 대상 결과로부터 질병 진단을 더 제공할 수 있으며, 메모리는 프로세서에 의해 실행될 때,
진단 시험 결과를 분석하고 질병 또는 질환의 진단을 제공하는 기능을 포함하는 일련의 기능을 수행하는 컴퓨터 판독 가능 프로그램 코드 성분을 포함한다.
검출 장치는,
프로세서; 및
프로세서에 결합된 메모리를 포함함으로써 진단 시험 결과의 통신을 더 제공할 수 있으며, 메모리는 프로세서에 의해 실행될 때,
진달 결과를 수신 장치에 전달하는 기능; 및
선택적으로, 상기 또는 또 다른 수신 장치로부터 질병 또는 질환의 진단을 수신하는 기능을 포함하는 일련의 기능을 수행하는 컴퓨터 판독 가능 프로그램 코드 성분을 포함한다.
본 발명의 관련 양태는 상기한 양태 중 임의의 양태의 바이오센서, 또는 이의 구성 요소, 또는 본 발명의 산화환원효소 또는 GDH 효소 또는 본 발명의 GDH 효소의 제 1 또는 제 2 단편 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 분리된 핵산을 제공한다.
본 발명의 또 다른 관련 양태는 상기한 양태의 분리된 핵산을 포함하는 유전자 구조체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 관련 양태는 상기한 양태의 유전자 구조체를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 관련 양태는 재조합 단백질 바이오센서 또는 이의 구성 요소 또는 본 발명의 산화환원효소 또는 GDH 효소 또는 GDH 효소의 제 1 또는 제 2 단편 서열을 포함하는 폴리펩티드를 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 이전 양태의 숙주 세포에서 재조합 단백질 바이오센서 또는 이의 구성 요소를 생성하는 단계를 포함한다.
도 1. A. 칼코아세티쿠스(A. calcoaceticus) PQQ-GDH의 구조 및 칼모듈린 삽입 부위의 동정. (A) PQQ 및 포도당과 복합체를 이루는 효소의 리본 표현. PQQ 보조 인자는 볼 및 스틱 표현으로 표시되어 있는 반면, 포도당은 원자 색으로 착색되어 있다. 결합된 Ca2 +는 공간 채움 개체로 표시되어 있다. β-시트는 각각의 숫자로 표시되고 시트 3의 β-가닥은 문자로 표시되어 있다. 가닥 3A 및 3B는 청색으로 착색되고 포도당의 배위에 관여하는 활성 부위 잔기는 볼 및 스틱으로 표시되어 있다. 촉매성 His144는 적색으로 착색되어 있다. (B) 가닥 A와 B를 연결하는 루프를 나타내는 GDH의 측면도. A에서와 같이 구조가 표시되고 착색되어 있다.
도 2. Ca2 +의 다양한 농도에서의 PQQ-GDH-CaM 활성의 분광 분석. (A) 0.6 mM의 전자 매개체인 페나진 메토술페이트(phenazine methosulphate)의 존재 하에 60 μM의 전자 수용 염료인 디클로로페놀인도페놀의 흡광도의 시간 분해능 변화를 20 mM의 포도당 및 1 nM GDH-CaM의 존재 하에 600 nm에서 측정하였다. (B) A와 마찬가지였지만, 증가하는 농도의 CaCl2에 노출된 3 nM GDH-CaM을 사용하였다. (C) 전기화학 시스템에서 센서로서의 GDH-CaM 키머(chimer)의 성능. 메인 플롯; GDH-CaM 시간 대 전류 전극의 Ca2 + 농도 증가에 대한 반응. 삽입된 Ag 기준 스트립에 대한 전류를 +0.4 V에서 5 초 후에 측정하였고, GDH-CaM는 300 nM로, PMS 매개체는 3 mM로, 포도당은 50 mM로 존재하였다. 삽입 플롯; 두 가지 대표적인 칼슘 농도(0 및 100 μm)에서 삽입된 Ag 기준 스트립에 대한 +0.4 V에서 분극 이후의 전류 대 시간. (D) 20 mM 포도당 및 1.1 mM의 특정 Ca2 + 킬레이터 BAPTA의 존재 하에 3 nM GDH-CaM의 관찰된 초기 반응 속도의 플롯. 실험은 (B)와 같이 수행하였다. 채워진 삼각형은 적정이 2 mM MgCl2의 존재 하에 수행된 실험을 나타낸다.
도 3. (A) 프로테아제 절단성 링커를 통해 Abe K 등이 2013년 개시한 억제 펩티드인 NSTHHHHFATIW(서열번호 51)와 연결된 피롤로퀴놀린 퀴논 포도당 탈수소효소. 분석에서, 0.3 mM의 전자 매개체인 페나진 메토설페이트의 존재 하에 10 μM의 전자 수용 염료인 디클로로페놀인도페놀의 흡광도를 20 mM의 포도당, 50 uM의 CaCl2 및 2 nM의 GDH-AI의 존재 하에 600 nm에서 측정하였다. 10 μM의 TVMV 프로테아제를 사용하였다. (B) 파지 디스플레이에 의해 동정된 억제 펩티드인 SHDIHYM에 트롬빈 절단성 링커를 통해 연결된 피롤로퀴놀린 퀴논 포도당 탈수소효소. 활성은 60 μM의 디클로로페놀인도페놀, 0.6 mM의 페나진 메토설페이트, 20 mM의 포도당, 50 uM의 CaCl2, 5 nM의 GDH-AI 및 20 U의 트롬빈을 사용하여 (A)에서와 같이 측정하였다. (C) TVMV 절단성 링커를 통해 억제 항체 단편에 C-말단으로 융합된 피롤로퀴놀린 퀴논 포도당 탈수소효소를 기반으로 하는 바이오센서의 개략도. (D) 다양한 항체 도메인을 갖는 여러 바이오센서의 활성 분석. 활성은 (B)에서와 같이 측정하였다. (E) 분석물-매개 스캐폴딩 상호 작용에 의해 자가 억제된 GDH의 경우, 활성 또는 자가 억제된 프로테아제 버전이 근접하게 되는 2-성분 수용체 구조의 개략도 (F) E에 도시된 2-성분 수용체의 라파마이신 매개 활성화. 이 분석에서, 1 nM GDH-VH-FKBP12, 15 nM FRB-TVMV를 100 nM의 라파마이신의 존재 및 부재 하에 90 분 동안 60 μM의 디클로로페놀인도페놀, 0.6 mM 페나진 메토설페이트, 50 uM CaCl2로 배양하였다. 20 mM의 포도당을 첨가한 후 600 nM에서 흡광도를 모니터링하였다. (G) 자가 억제된 GDH를 기반으로 하는 가역적 2-성분 바이오센서 구조의 개략도. 이러한 구조에서, 억제 도메인은 칼모듈린 결합 펩티드 또는 친화성 클램프(affinity clamp) 리간드 펩티드와 같은 리간드 펩티드에 융합된다. 시스템의 제 2 성분은 칼모듈린과 같은 결합 도메인 또는 친화성 클램프 결합 펩티드에 의해 표시된다. 리간드에 의한 두 분자의 스캐폴딩은 AI와 GDH의 "줄다리기” 상호 작용을 초래하고, 효소의 활성화를 유발하는 이의 결합 도메인과 융합된 펩티드를 만든다. (H) GDH와 AI 사이의 링커가 리간드 결합 후 구조적 변화를 겪는 리간드 결합 도메인을 포함하는 GDH의 AI 형태를 기반으로 하는 바이오센서 구조의 개략도. 이는 GDH의 활성 부위에서 AI를 제거한다.
도 4. 전기화학적 바이오센서를 제작하기 위한 GDH 효소 분할 부위의 이용. 반응 조건은 15 nM GDH-FRB, TVMV 부위 1 mM 라파마이신을 함유하는 10 nM GDH-FKBP, 1 mM TVMV 및 100 mM CaCl2이었다.
도 5. 조작되고 효소적으로 불활성화된 돌연변이 도메인(적색)을 대응하는 활성 도메인(녹색)으로 치환함으로써 라파마이신을 검출할 수 있게 하는 분할 GDH 효소를 포함하는 전기화학적 바이오센서. (A) 결합 모이어티는 FRB이고 FKBP는 라파마이신과 결합한다. 일반적으로, FRB는 일단 FKBP에 결합되면 라파마이신과 결합한다. 반응 조건은 15 nM GDH-FRB, 10 nM GDH-FKBP(TVMV에 의해 미리 절단됨), 100μM CaCl2 +/- 20% 혈청이었다. (B) 면역 억제제인 FK506(타크로리무스)의 검출을 위한 2-성분 시스템. 바이오센서 결합 모이어티는 GDH의 하나의 활성 성분에 융합된 칼시뉴린 A/B 헤테로다이머 및 또 다른 활성 성분에 융합된 FKBP를 포함한다. 오른쪽 플롯은 라파마이신 및 사이클로스포린 A의 존재 또는 부재 하에 FK506을 이용한 센서의 적정을 나타낸다. (C) 면역 억제제인 사이클로스포린 A의 검출을 위한 2-성분 시스템. 센서는 GDH의 하나의 활성 성분에 융합된 칼시뉴린 A/B 헤테로다이머 및 또 다른 활성 성분에 융합된 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이성화효소 A로 구성된다.
도 6. 아밀라아제를 검출하기 위한 분할 GDH 효소를 포함하는 전기화학적 바이오센서. 결합 모이어티는 아밀라아제에 결합하는 VHH1 및 VHH2로 명명된 카멜리드(camelid) VHH 항체이다. 반응 조건은 20 nM GDH-VHH1(PDB: 1KXV), 15 nM GDH-VHH2(PDB: 1BVN)(TVMV에 의해 미리 절단됨) 및 100 uM CaCl2이었다. (B) 아밀라아제 바이오센서의 시간 대 전류 분석.
시료 준비 및 반응 조건은 다음과 같았다: AMY-2 PQQ/TVMV 믹스의 제조: AMY-2 PQQ 및 TVMV(50 μM의 20 μL에서 AMY-2 및 50 μM에서 20 μL의 TVMV)의 각각 하나의 분취량을 해동시켰다. 4 μL의 TVMV를 20 μL의 AMY-2 PQQ와 혼합하였다(최종 농도 8.3 μM TVMV 및 41.6 μM AMY-2 PQQ). 이를 사용하기 전에 실온에서 3.00 시간 동안 보관하였다. 완충액: 0.01 M 인산나트륨 완충액(pH 7.4), 142 mM NaCl, 4.2 mM KCl, 2.23 mM MgCl2. (A) 25 mM CaCl2(MW0034/1, mw 147.01): 완충액 중의 50 μM CaCl2, 2.23 mM MgCl2 : 20 uL의 25 mM CaCl2 + 9.98 mL 완충액. AMY-1: 사용하기 직전에 하나의 분액(20 μL, 50 μM)을 해동시켰다. (B) 500 nM AMY-1: 5 μL의 50 uM AMY-1 + (A)의 495 μL. (C) 416 nM의 AMY-2 PQQ(83 nM TVMV): 5 μL의 AMY-2PQQ/TVMV 믹스 + (A)의 495 μL. 인간 타액 알파 아밀라아제(MW0022/1): 시그마, A1031, lotSLBK8708V. CofA는 시료가 9%의 단백질이고 활성이 852 U/mg라고 명시하고 있다. 알파 아밀라아제의 분자량이 50 kDa라고 가정하면, 0.55 mg/mL의 고체는 1.0 uM 알파 아밀라아제를 함유한다. 2.46 uM 알파 아밀라아제: 0.776 mL (A) 중 0.00104 g(이는 사용 직전에 준비됨). 1230 nM 알파 아밀라아제: 0.5 mL의 2.46 μM 아밀라아제 + (A)의 0.5 mL. 123 nM 알파 아밀라아제: 0.1 mL의 1230 nM 아밀라아제 + (A)의 0.9 mL.
도 7. 조작되고 효소적으로 불활성화된 돌연변이 도메인(적색)을 과량으로 첨가하여 자발적 GDH 효소 재구성을 줄임.
도 8. (A) 프로테아제 표적 분자를 검출하기 위한 전기화학적 바이오센서. S = 스캐폴딩 도메인 결합 모이어티: 예를 들어, SH2 도메인, PDZ 등. L = 스캐폴딩 도메인에 결합하는 리간드 펩티드. 프로테아제 표적 분자에 대한 절단 부위는 S 및 L 중간체에 위치하고, 따라서 절단은 활성 GDH 도메인에 결합된 L이 S와 결합할 수 있게 하고, 조작되고 효소적으로 불활성화된 돌연변이 도메인(적색)을 대응하는 활성 GDH 도메인(녹색)으로 치환하는 것을 촉진한다. (B) 다양한 농도의 트롬빈을 갖는 트롬빈 센서의 활성화(상단에서 하단으로 0.013 U/ml, 0.13 U/ml, 1.3 U/ml). 분석에서 0.6 mM의 전자 매개체인 페나진 메토설페이트의 존재 하에 60 μM의 전자 수용 염료인 디클로로페놀인도페놀의 흡광도를 20 mM 포도당, 50 μM CaCl2, 10 nM GDH-S-L 및 15 nM 불활성 GDH-L의 존재 하에 600 nm에서 측정하였다. (C) 고친화성 트롬빈 결합 펩티드 및 트롬빈 절단 부위를 갖는 트롬빈 센서. 활성은 (B)에서와 같이 측정하였지만 트롬빈 농도는 0.00013 U/ml; 0.0013 U/mL(0.5 ng/ml; 16 pM); 0.013 U/mL(5 ng/mL); 0.13 U/mL(50 ng/mL); 1.3 U/ml(500 ng/ml)이었다. (D) 두 세트의 고친화성 트롬빈 절단 부위를 갖는 트롬빈 센서. 활성은 (B)에서와 같이 측정하였지만, 트롬빈 농도는 0.0013 U/ml(0.5 ng/ml; 10 pM); 0.013 U/ml(5 ng/ml); 0.13 U/ml(50 ng/ml); 1.3 U/ml(500 ng/ml)이었다. (E) 인자 Xa의 다양한 농도에서 인자 Xa 센서의 활성. 활성은 (B)에서와 같이 측정하였지만 트롬빈 농도는 0.01 μg/ml; 0.1 μg/ml, 1 μg/ml, 7 μg/ml이었다. (F) E와 동일하지만 세 개의 Xa 절단 부위가 있는 센서를 사용하였다. 활성은 (B)에서와 같이 측정하였지만 트롬빈 농도는 0.001 μg/ml; 0.01 μg/ml ; 0. 1 μg/ml, 1 μg/ml, 7 μg/ml이었다.
도 9. 불법 약물 검출을 위한 전기화학적 바이오센서. 이 실시형태에서, 표적 분자는 테트라하이드로칸나비놀(tetrahydrocannabinol, THC)이다. 결합 모이어티는 칼모듈린 결합 펩티드에 접합된 THC이다.
도 10. 불법 약물 검출을 위한 전기화학적 바이오센서. 이 실시형태에서, 표적 분자는 테트라하이드로칸나비놀(THC)이다. 결합 모이어티는 THC 항체에 경쟁적으로 결합하는 펩티드이다.
도 11. 불법 약물 검출을 위한 전기화학적 바이오센서. 이 실시형태에서, 표적 분자는 테트라하이드로칸나비놀(THC)이다. 결합 모이어티는 항-THC 항체 및 스캐폴딩 도메인에 경쟁적으로 결합하는 펩티드이다. 제 3 성분은 프로테아제에 융합된 THC 항체 및 SH2 또는 PDZ와 같은 스캐폴딩 도메인을 포함한다.
도 12. 전기화학적 바이오센서에 의해 생성된 전류를 검출하기 위한 기본 전자 장치의 개략도.
도 13. GDH 대신 Cam-GDH 바이오센서를 포함하도록 재조작된 상업용 혈당 모니터의 예. 센서는 인간 타액에서 Ca2 +의 존재에 의해 활성화되었다.
도 14. 전기화학적 바이오센서 및 이의 구성 요소의 아미노산 서열(서열번호 2 내지 10, 53, 54). GDH 아미노산 서열은 이중 밑줄로 표시되고, 결합 모이어티 아미노산 서열은 이탤릭체로 표시되며, TVMV 절단 부위(ETVRFQS; 서열번호 11)는 굵게 표시되어 있다. GDH 돌연변이, GDH 단편, 결합 모이어티, 프로테아제 절단 및 프로테아제 결합 부위 및 억제 펩티드의 아미노산 서열(서열번호 12 내지 49 및 51 내지 52, 55).
본 발명은 표적 분자에 대응하여 하나 이상의 전자를 생산 또는 생성할 수 있는 바이오센서를 제공한다. 적절하게, 바이오센서는 촉매적 "불활성" 상태와 촉매적 "활성" 상태 사이에서 전환되어 하나 이상의 전자를 생성하도록 기질 분자와 반응할 수 있는 효소 또는 효소 단편을 포함한다. 따라서, 본원에 기재된 바이오센서의 특징을 갖는 효소 및 효소 단편이 본원에 제공된다. 더욱 상세하게, 효소 또는 효소 단편은 촉매적 "불활성" 상태와 촉매적 "활성" 상태 사이에서 전환되도록 설계된 포도당 탈수소효소(GDH)와 같은 산화환원효소이다. 하나의 특정 형태에서, GDH 분자는 표적 분자와 결합할 수 있는 이종 삽입체를 갖고, 이로 인해 효소 활성화를 유발하는 구조적 변화를 일으킨다. 또 다른 특정 형태에서, GDH 분자는 활성 부분 및 조작된 돌연변이 부분을 포함하는 "분할 효소" 구조체이며, 바이오센서의 하나 이상의 결합 모이어티에 의한 표적 분자의 결합은 조작된 돌연변이 부분이 또 다른 활성 부분에 의해 치환되어 GDH 효소 활성을 재구성한다. 본원에 개시된 바이오센서 분자는 "표적 분자"가 진단 가치가 있거나 중요한 분석물 또는 다른 분자인 분자 진단에서 효능을 가질 수 있다. 그러나, 본원에 개시된 바이오센서의 또 다른 응용은 다중-성분 인공 세포 신호 전달 네트워크를 구축하기 위한 합성 생물학 응용일 수 있다.
부정 관사는 단수의 부정 정사로 해석되거나 또는 부정 관사가 지칭하는 하나 이상의 단일 대상을 제외하는 것으로 해석되어서는 안 된다는 것을 알 것이다. 예를 들어, 단수의 분자는 하나의 분자, 하나 이상의 분자 또는 다수의 분자를 포함한다.
문맥상 달리 요구되지 않는 한, 본원에서 사용되는 "포함한다" 및 "포함하는"이라는 단어는 명시된 정수 또는 정수 집단의 포함을 의미하지만 임의의 다른 정수 또는 정수 집단의 배제를 의미하지는 않는다는 것을 알 것이다.
본 발명의 목적을 위해, "분리된(isolated)"은 자연 상태에서 제거되거나 또는 인간의 조작을 받은 물질(예를 들어, 분자)을 의미한다. 분리된 물질은 자연 상태에서 정상적으로 동반되는 성분을 실질적으로 또는 본질적으로 함유하지 않거나 자연 상태에서 정상적으로 동반되는 성분과 함께 인공 상태로 되도록 조작될 수 있다. 분리된 단백질 및 핵산은 천연, 화학 합성 또는 재조합 형태일 수 있다.
"단백질"은 아미노산 중합체를 의미한다. 아미노산은 본 기술 분야에 널리 공지된 천연 또는 비-천연 아미노산, D- 또는 L- 아미노산일 수 있다.
"펩티드"는 50개 미만의 아미노산을 갖는 단백질이다.
"폴리펩티드"는 50개 이상의 아미노산을 갖는 단백질이다.
"효소"는 하나 이상의 기질 분자에 대한 촉매 활성을 갖는 단백질이다. 적절하게, 효소는 기질 분자에 대해 촉매 활성을 나타내어 하나 이상의 전자를 생성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 효소는 산화환원효소이다. 하나의 특정 실시형태에서, 효소는 포도당 탈수소효소(GDH)이고 기질 분자는 포도당이다. 촉매 활성은 따라서 실시예 1에 따라 측정될 수 있는 포도당 탈수소효소 활성일 수 있다. 포도당 탈수소효소는 PQQ-GDH 또는 FAD-GDH일 수 있다. 바람직하게, GDH는 PQQ-GDH이다. 또 다른 실시형태에서, 효소는 포도당 산화효소이고 기질은 포도당이다. 또 다른 실시형태에서, 효소는 디하이드로폴레이트 환원효소(dihydrofolate reductase, DHFR)이고 기질 분자는 디하이드로폴산이다. 또 다른 실시형태에서, 효소는 젖산 탈수소효소(lactate dehydrogenase, LDH)이고 기질 분자는 젖산이다.
본원에서 일반적으로 사용되는 "촉매적으로 활성인" 및 "촉매적 활성 상태"는 효소 또는 이의 단편 또는 부분에 의해 표시되거나 달성될 수 있는 효소 활성의 절대적 또는 상대적 양을 의미할 수 있다. 일반적으로, 효소는 적절한 반응 조건 하에 하나 이상의 전자를 생성하기 위해 기질 분자에 대해 특정 효소 활성을 나타낼 수 있는 경우 촉매적으로 활성이거나 촉매적 활성 상태에 있다. 본원에서 일반적으로 사용되는 "촉매적으로 불활성인" 및 "촉매적 불활성 상태"는 적절한 반응 조건 하에 기질 분자에 대해 특정 효소 활성을 실질적으로 나타낼 수 없는 효소 또는 이의 단편 또는 부분을 의미할 수 있다. 일반적으로, 생성된 전자는 상응하는 촉매적 활성 효소에 의해 생성된 전자와 비교하여 실질적으로 적거나 전혀 존재하지 않을 것이다.
제 1 양태에서, 본 발명은 촉매적 활성 상태에 있을 때 기질 분자와 반응하여 하나 이상의 전자를 생성할 수 있는 효소의 적어도 하나의 아미노산 서열; 및 효소를 촉매적 불활성 상태에서 해제 가능하게 유지하는 적어도 하나의 이종 변형 아미노산 서열을 포함하는 바이오센서 분자를 제공하며, 이종 변형 아미노산 서열은 표적 분자에 반응하여 효소의 아미노산 서열을 촉매적 불활성 상태에서 상기 촉매적 활성 상태로 전환시킨다.
적절하게, 적어도 하나의 효소 아미노산 서열 및 상기 적어도 하나의 이종 센서 아미노산 서열은 하나의 인접한 아미노산 서열 내에 존재하거나 또는 이의 적어도 일부를 형성한다.
특정 실시형태에서, 상기 적어도 하나의 이종 센서 아미노산 서열은 상기 적어도 하나의 효소 아미노산 서열 내의 삽입체이고, 상기 촉매적 불활성 상태와 상기 촉매적 활성 상태 사이에서 효소 아미노산 서열의 전환을 용이하게 한다. 이러한 맥락에서, "삽입체(insert)"는 상기 적어도 하나의 효소 아미노산 서열과는 이종인 아미노산 서열이 상기 적어도 하나의 효소 아미노산의 각각의 부분, 서브-서열 또는 단편 사이에 그리고 이와 인접하게 위치하는 아미노산 서열을 의미한다.
적절하게, 이종 센서 아미노산 서열은 상기 표적 분자와 결합하여 효소의 아미노산 서열을 촉매적 불활성 상태에서 상기 촉매적 활성 상태로 전환시킨다. 바람직하게, 이종 센서 아미노산 서열에 의한 표적 분자의 결합은 효소의 아미노산 서열을 촉매적 불활성 상태에서 상기 촉매적 활성 상태로 전환시키거나 이를 용이하게 하는 구조적 변화를 일으킨다.
일 실시형태에서, 이종 센서 아미노산 서열은 칼슘-결합 단백질의 아미노산 서열 또는 이의 단편이다. 이 실시형태에 따르면, 표적 분자는 칼슘이거나 이를 포함한다. 특정 실시형태에서, 칼슘-결합 단백질은 칼모듈린이다.
효소는 기질 분자와 반응하여 하나 이상의 전자를 생성할 수 있는 임의의 효소일 수 있다. 바람직하게, 효소는 GDH, LDH 또는 DHFR과 같은 산화환원효소이다. 이들 실시형태에 따르면, 기질 분자는 각각 포도당, 젖산 또는 디하이드로폴산이다. 효소가 GDH인 경우, FAD-GDH 또는 PQQ-GDH일 수 있다. PQQ-GDH는 바람직하게 서열번호 1의 서열 또는 이의 변이체를 포함한다.
본 발명은 따라서 표적 분자에 반응하는 이종 센서 아미노산 서열을 포함하는 산화환원효소, 바람직하게는 포도당 탈수소효소(GDH)를 제공하며, 표적 분자의 결합은 효소의 촉매 활성을 조절하도록 작용한다.
표적 분자는 본원에 기재된 임의의 표적 분자일 수 있고, 따라서 상기 표적 분자에 반응하는 이종 센서 아미노산 서열은 본원에 기재된 상기 표적 분자에 대한 임의의 결합 모이어티일 수 있으며, 이는 효소에 포함될 때 표적 분자와의 상호 작용에 따라 효소의 촉매 활성을 해제 가능하게 조절하는 능력을 갖는다. 이종 센서 아미노산 서열은 따라서 효소의 촉매 활성을 가역적으로 조절한다. 이종 센서 아미노산 서열은 표적 분자의 존재 하에 치환되어 효소를 촉매적으로 활성화시킬 수 있다. 이종 센서 아미노산 서열은 효소의 촉매 활성을 알로스테릭하게 조절할 수 있다. 이종 센서 아미노산 서열은 펩티드 또는 단백질과 같은 표적 분자와 결합할 때 구조적 재배열을 겪는 하나 이상의 도메인(예를 들어, 하나 또는 두 개의 도메인)을 포함할 수 있다. 대안적으로, 이종 센서 아미노산 서열은 펩티드 또는 단백질과 같은 표적 분자와 결합할 때 구조적 재배열을 겪는 구조화되지 않거나 폴딩되지 않은 서열을 나타낼 수 있다. 구조적 재배열은 하나 이상의 폴딩된 단백질 도메인을 생성할 수 있다.
이종 센서 아미노산 서열은 이하에 설명된 결합 모이어티일 수 있다. 이종 센서 아미노산 서열은 이하에 설명된 친화성 클램프일 수 있다. 이종 센서 아미노산 서열은 바람직하게 칼슘-결합 단백질의 아미노산 서열 또는 이의 기능적 단편이다. 칼슘 결합 단백질은 칼모듈린 또는 이의 기능적 칼슘-결합 단편일 수 있다.
이종 센서 아미노산 서열은 일반적으로 효소의 아미노산 서열 내의 삽입체로서 제공된다. 삽입은 효소의 안정한 폴딩을 방지하는 입체적 충돌없이 상기 삽입을 허용하는 효소의 아미노산 서열 내의 위치에서 이루어진다. 링커 서열은 삽입의 내성을 지원하기 위해 삽입체와 효소의 서열 사이에 첨가될 수 있다. 삽입은 일반적으로 이종 센서 아미노산 서열이 효소, 일반적으로 효소의 활성 부위에서 구조적 변화를 유도함으로써 촉매 활성을 가역적으로 억제하도록 한다. 이종 센서 아미노산 서열은 일반적으로 효소에 대한 억제 효과를 해제하고 촉매 활성을 회복시키는 표적 분자의 존재 하에 구조적 변화를 겪는다. 삽입은 상기한 바와 같이 이종 센서 아미노산 서열을 기능적으로 허용하는 효소의 구조에서 루프 또는 턴 영역에 위치할 수 있다.
상기한 바이오센서 및 효소의 하나의 특정 실시형태에서, 포도당 탈수소효소, 예를 들어, 아시네토박터 칼코아세티쿠스(Acinetobacter calcoaceticus) PQQ-GDH와 같은 피롤로퀴놀린 퀴논 포도당 탈수소효소(pyrroloquinoline quinone glucose dehydrogenase, PQQ-GDH)는 알로스테릭 수용체 도메인으로 조작됨으로써 표적 분자 결합에 대응하여 촉매 활성을 제어할 수 있다. 본 발명자들은, 이종 센서 아미노산 서열의 삽입을 허용하면서 활성 중심에 구조적 변화를 전달하기에 충분히 근접할 수 있는 효소의 활성 중심 부근의 가능한 부위에 대해 A. 칼코아세티 쿠스 PQQ-GDH(PDB: 1CQ1)의 고해상도 구조를 분석하였다. β-시트 3의 가닥 A와 B를 연결하는 루프는 이러한 삽입을 위한 적절한 부위로서 제안된다. 가닥 A의 시작은 포도당 O1 원자에서 양성자를 추출하는 일반 염기의 역할을 하는 His144를 갖는다. His144는 촉매 작용에 매우 중요하기 때문에, 가닥 A와 B의 분리에 의해 도입되는 비틀림에 의한 전위는 GDH 촉매 활성의 변화로 이어진다.
일 실시형태에서, 바이오센서는 가닥 3A와 3B을 연결하는 루프에 삽입된 칼모듈린의 칼슘-결합 도메인을 포함하고, 따라서 이 도메인에 의한 칼슘의 결합은 실질적인 구조적 변화를 일으킨다. 특정 실시형태에서, 바이오센서는 PQQ-GDH의 잔기 153과 155 사이에 마우스 CaM의 잔기 12-67이 삽입된 키메라 단백질이다. 구조적 긴장과 충돌을 줄이기 위해, 본 발명자들은 또한 접합 부위 내에서 칼모듈린의 N-말단에 GSGS 링커를 칼모듈린 아미노산 서열의 C-말단에 Gly 링커를 도입하였다. Ca2+ 이온의 부재 하에, 바이오센서는 사실상 효소 활성을 나타내지 않는다. Ca2 + 이온의 첨가는 바이오센서의 용량-의존적 활성화를 유발하는 반면, 이종 칼모듈린 삽입체가 결여된 PQQ-GDH에 대해 제한된 영향만을 미친다.
이들 실시형태의 비제한적인 예가 도 1 내지 도 3에 도시되어 있다. 본원에 기재된 임의의 이종 센서 아미노산 서열은 상기한 바와 같은 PQQ-GDH의 가닥 3A와 3B를 연결하는 루프에 상응하는 GDH 효소의 루프 또는 턴 영역 또는 상기 효소의 잔기 153 내지 155(서열번호 1의 잔기 153-155)에 상응하는 영역에 도입될 수 있다. 숙련자는 구조 분석 및 서열 정렬로부터 기타 효소의 상응하는 위치를 확인할 수 있다. 상응하는 위치는 일반적으로 삽입된 이종 센서 아미노산 서열을 수용하여 상기한 바와 같이 효소의 촉매 활성을 가역적으로 억제하는 위치이다. 삽입은 서열번호 1의 His144에 상응하는 촉매 잔기를 전위시킬 수 있다.
본 발명은 또한 서열번호 1 또는 이의 변이체의 잔기 153 내지 155 사이에 삽입된 이종 센서 아미노산 서열을 포함하는 GDH 효소를 제공한다. 이러한 효소는 서열번호 13(잔기 1 내지 153)의 서열 또는 이의 변이체, 이종 센서 아미노산 서열, 및 서열번호 15(잔기 155 내지 454) 또는 이의 변이체를 순서대로 포함할 수 있다. 서열번호 1, 13 및 15의 변이체는 이하에서 더 설명된다. 이들 서열은 상기한 바와 같은 삽입된 이종 센서 아미노산 서열의 허용을 제공하는 링커 서열에 의해 분리될 수 있다. 본 발명은 또한 서열번호 53 또는 이의 변이체를 포함하는 상기한 PQQ-GDH 및 마우스 CaM을 기반으로 하는 칼슘 바이오센서를 제공한다.
본 발명은 또한 표적 분자에 반응하는 이종 센서 아미노산 서열을 포함하는 산화환원효소, 바람직하게는 포도당 탈수소효소(GDH)를 조작하는 방법을 제공하며, 표적 분자의 결합은 효소의 촉매 활성을 조절하도록 작용한다. 방법은 이종 센서 아미노산 서열의 삽입을 허용할 수 있는 효소 내의 적당한 위치를 선택하는 단계 및 상기 이종 센서 아미노산 서열을 효소에 삽입하는 단계를 포함하며, 효소는 표적 분자에 반응하여 효소의 촉매 활성을 조절하도록(일반적으로 활성화시키도록) 조작된다.
본 발명은 또한 촉매적 활성 상태에 있을 때 기질 분자와 반응할 수 있는 효소의 적어도 하나의 아미노산 서열; 및 효소를 촉매적 불활성 상태에서 해제 가능하게 유지하도록 조작된 상기 효소의 적어도 하나의 다른 아미노산 서열을 포함하는 바이오센서 분자를 제공하며, 상기 바이오센서는 표적 분자에 반응하여 효소의 아미노산 서열을 촉매적 불활성 상태에서 상기 촉매적 활성 상태로 전환시킨다. 상기 효소의 적어도 하나의 아미노산 서열 및 적어도 하나의 다른 (조작된) 아미노산 서열은 비-공유 상호 작용할 수 있고, 조작된 아미노산 서열은 전기화학적 바이오센서의 맥락에서 이하에서 더 설명되는 또 다른 아미노산 서열에 의해 치환될 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태는 촉매적 활성 상태에 있을 때 기질 분자와 반응하여 하나 이상의 전자를 생성할 수 있는 효소의 적어도 하나의 아미노산 서열; 및 효소를 촉매적 불활성 상태에서 해제 가능하게 유지하도록 조작된 상기 효소의 적어도 하나의 다른 아미노산 서열을 포함하는 바이오센서 분자를 제공하며, 상기 바이오센서는 표적 분자에 반응하여 효소의 아미노산 서열을 촉매적 불활성 상태에서 상기 촉매적 활성 상태로 전환시킨다.
적절하게, 상기 효소의 상기 적어도 하나의 다른 아미노산 서열은 하나 이상의 아미노산 서열 변이를 포함하도록 조작된다. 적절하게, 촉매적 활성 상태에 있을 때 기질 분자와 반응하여 하나 이상의 전자를 생성할 수 있는 효소의 상기 적어도 하나의 아미노산 서열 및 효소를 촉매적 불활성 상태에서 해제 가능하게 유지하도록 조작된 상기 효소의 상기 적어도 하나의 다른 아미노산 서열은 비-공유 상호 작용한다.
일 실시형태에서, 이들은 효소의 각각의 아미노산 서열이고, 이들 중 하나는 하나 이상의 아미노산 서열 변이를 포함하도록 조작됨으로써, 기질 분자와 반응하는 효소의 상기 적어도 하나의 아미노산 서열을 억제, 예방 또는 저해한다. 적절하게, 이러한 "조작된 돌연변이"는 기질 분자와 반응할 수 있는 효소의 상기 적어도 하나의 아미노산 서열과 비-공유 결합됨으로써, 효소 활성을 억제, 방지 또는 저해하도록 작용한다. 바람직한 실시형태에서, 효소의 각각의 아미노산 서열은 하나의 인접한 아미노산 서열로서 표현되거나 생산되고, 이러한 아미노산 서열은 이후 프로테아제에 의해 절단됨으로써 기질 분자와 반응할 수 있는 효소의 상기 적어도 하나의 아미노산 서열 및 조작된 돌연변이 간의 비-공유 결합을 가능하게 한다.
효소의 상기 적어도 하나의 아미노산 서열은 따라서 일반적으로 상기 효소의 제 1 단편 서열을 나타내고, 이는 상기 효소의 제 2 단편 서열을 나타내는 상기 효소의 상기 적어도 하나의 다른 또는 상기 또 다른 아미노산 서열과 비-공유 상호 작용하여 안정한 효소를 재구성할 수 있다. 제 1 및 제 2 단편 서열은 효소의 완전한 서열을 함께 구성하거나 촉매 도메인을 포함하는 안정한 형태의 상기 효소를 제공하기 위해 효소의 충분한 서열을 함께 구성할 수 있다.
재구성된 효소는 안정한 비-촉매적 활성 효소일 수 있으며, 제 1 단편 서열은 효소를 촉매적 불활성 상태에서 해제 가능하게 유지하도록 조작된 상기 효소의 상기 적어도 하나의 다른 아미노산 서열을 나타낸다. 대안적으로, 재구성된 효소는 안정한 촉매적 활성 효소일 수 있으며, 제 1 단편 서열은 효소를 촉매적 불활성 상태에서 해제 가능하게 유지하도록 조작된 상기 효소의 상기 적어도 하나의 다른 아미노산 서열을 치환할 수 있는 상기 효소의 상기 또 다른 아미노산 서열을 나타낸다. 본원에 기재된 안정한 효소는 상기 비-공유 상호 작용하는 아미노산 서열이 가용성 효소 복합체를 형성하는 효소이다. 비-공유 상호 작용하는 아미노산 서열은 다른 안정한 효소를 형성하기 위해 또 다른 아미노산 서열을 치환함으로써 가역적으로 해리될 수 있다.
GDH에 관한 실시형태에서, 효소의 각각의 아미노산 서열은 서열번호 13의 서열 또는 이의 변이체 및 서열번호 15의 서열 또는 이의 변이체일 수 있다. "조작된 돌연변이"는 일반적으로 H144 돌연변이 및 하나 이상의 Q76 및 D143에 대한 돌연변이를 포함한다. 돌연변이는 효소의 촉매 활성을 감소시키거나 폐지하도록 선택된다. 바람직하게, H144, Q76 및 D143은 각각 변이된다. 이들 잔기는 각각 알라닌으로 변형될 수 있고, 또는 촉매 활성을 감소시키거나 폐지하는 알라닌에 대한 대안적인 돌연변이가 이루어질 수 있다. 조작된 돌연변이는 효소의 적어도 하나의 아미노산 서열과 비-공유 결합될 때 촉매적 불활성인 효소를 또한 생산하는 서열번호 14의 서열 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 변이체는 본원에 기재된 바와 같이 76번, 143번 및 144번 위치에서 서열번호 14 내의 돌연변이에 대한 또 다른 돌연변이를 포함할 수 있다.
그 결과 생성된 조작된 돌연변이는 바람직하게 에피토프-태그 단백질로서 대장균과 같은 박테리아에서 발현되고 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된다.
일 실시형태에서, 프로테아제 절단 부위는 ETVRFQS(서열번호 11) 또는 이의 기능적 변이체와 같은 TVMV 절단 부위이다. 프로테아제 절단 부위는 대안적으로 서열번호 33 또는 이의 기능적 변이체와 같은 트롬빈 절단 부위 또는 서열번호 34 또는 35 또는 이의 기능적 변이체와 같은 인자 Xa 부위일 수 있다.
일 실시형태에서, 본 양태의 바이오센서는 효소를 촉매적 불활성 상태에서 해제 가능하게 유지하도록 조작된 상기 효소의 상기 적어도 하나의 다른 아미노산 서열을 치환할 수 있는 상기 효소의 또 다른 아미노산 서열을 더 포함한다. 일반적으로, 상기 효소의 상기 또 다른 아미노산 서열은, 하나 이상의 아미노산 서열 변이가 결여되어 있지만, 조작된 돌연변이의 아미노산 서열과 실질적으로 일치하는 아미노산 서열을 포함한다. 일반적으로, 이러한 치환은 상기 효소의 상기 또 다른 아미노산 서열을, 기질과 반응하여 기능성 촉매적 활성 효소를 형성할 수 있는 효소의 상기 적어도 하나의 아미노산 서열과 비-공유 결합시킴으로써 효소의 촉매 활성을 회복시킨다.
이러한 실시형태의 비제한적인 예가 도 4 내지 도 9에 도시되어 있다. 특히 도 7을 참조하면, 표적 분자 결합의 부재 하에 효소의 촉매 활성의 자발적 치환을 감소시키거나 제거하는 몰 과량의 조작된 돌연변이가 제공될 수 있다는 것을 알 것이다. 이는 따라서 "배경 노이즈"를 억제하여 바이오센서의 민감성을 향상시킨다.
광범위한 실시형태에서, 상기 효소의 상기 또 다른 아미노산 서열 및 기질과 반응할 수 있는 효소의 상기 적어도 하나의 아미노산 서열은, 예를 들어 표적 분자와 결합함으로써, 상기 또 다른 아미노산 서열에 의한 조작된 아미노산 서열의 치환을 용이하게 하도록 상호 작용할 수 있는 각각의 결합 모이어티를 포함한다.
관련된 양태에서, 본 발명은 또한 상기 효소의 제 2 단편 서열을 포함하는 폴리펩티드와 비-공유 상호 작용하여 안정한 효소를 재구성할 수 있는 산화환원효소, 바람직하게는 포도당 탈수소효소(GDH)의 제 1 단편 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
제 1 및 제 2 단편 서열은 상기한 바와 같이 효소의 완전한 서열을 함께 구성할 수 있거나 촉매 도메인을 포함하는 안정한 형태의 상기 효소를 제공하기에 위해 효소의 충분한 서열을 함께 구성할 수 있다.
제 1 단편 서열을 포함하는 폴리펩티드는 상기 효소의 제 2 단편 서열을 포함하는 상기 폴리펩티드와 안정한 촉매적 활성 효소를 재구성할 수 있다. 이 실시형태에서, 상기 효소의 제 1 단편 서열을 포함하는 폴리펩티드는, 촉매 활성을 회복시키기 위해 안정한 효소 복합체로부터 효소를 촉매 불활성 상태로 유지하도록 조작된 상기 효소의 상응하는 단편 서열을 치환할 수 있다.
제 1 단편 서열을 포함하는 폴리펩티드는 대안적으로 상기 폴리펩티드를 포함하는 안정한 효소를 촉매적으로 불활성이 되도록 하는 상기한 바와 같은 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 이러한 폴리펩티드(조작된 폴리펩티드로도 설명됨)는 또한 촉매 활성을 회복시키기 위해 상기 안정한 효소 복합체로부터 치환될 수 있다.
상기한 바와 같이 조작된 제 1 단편 서열 및 인접한 폴리펩티드의 일부로서의 상기 제 2 단편 서열 모두를 포함하는 산화환원효소, 바람직하게는 GDH 효소가 또한 제공되며, 제 1 및 제 2 단편 서열은 하나 이상의 프로테아제 절단 부위에 의해 분리되고, 따라서 프로테아제 활성은 조작된 단편 서열이 치환되도록 하고 및 촉매 활성을 회복시킬 수 있는 제 1 단편 서열이 제 2 단편 서열과 비-공유 결합하도록 하여 안정한 촉매적 활성 효소를 형성한다.
상기한 폴리펩티드는 상기 효소의 제 2 단편 서열을 포함하는 대응 폴리펩티드 상의 각각의 결합 모이어티와 상호 작용할 수 있는 결합 모이어티를 포함할 수 있으며, 결합 모이어티 간의 상호 작용은 재구성된 안정한 포도당 탈수소효소의 촉매 활성을 조절한다. 결합 모이어티 간의 상호 작용은 표적 분자의 결합에 의해 조절될 수 있다. 결합 모이어티 및 상응하는 타겟 분자는 본원에 기재된 임의의 것에서 선택될 수 있다.
상기한 폴리펩티드는 각각의 결합 모이어티의 상호 작용을 억제하는 서열 및 하나 이상의 프로테아제 절단 부위를 더 포함할 수 있으며, 프로테아제에 의한 절단은 결합 모이어티 간의 상호 작용을 제공한다. 폴리펩티드는 프로테아제의 결합 및/또는 절단 효율을 향상시키는 서열을 더 포함할 수 있다. 프로테아제 절단 부위 및 프로테아제의 결합 및/또는 절단 효율을 향상시키는 서열은 본원에 기재된 임의의 것에서 선택될 수 있다.
특정 실시형태에서, 상기한 제 1 및 제 2 단편 서열은 상기한 바와 같은 PQQ-GDH의 가닥 3A 및 3B을 연결하는 루프에 상응하는 GDH 효소의 루프 또는 턴 영역 또는 상기 효소의 잔기 153 내지 155(서열번호 1의 잔기 153-155)에 상응하는 영역에서 GDH 효소의 절단에 의해 유도될 수 있다. 숙련자는 구조 분석 및 서열 정렬로부터 기타 효소의 상응하는 위치를 확인할 수 있다. 상응하는 위치는 일반적으로 안정한 효소를 재구성할 수 있는 상기 효소의 기능적 단편을 생성을 허용하는 위치이다.
이 양태에서, 본 발명은 또한 안정한 효소를 재구성할 수 있는 제 1 및 제 2 단편 서열을 제공하도록 산화환원효소, 바람직하게는 포도당 탈수소효소(GDH)를 조작하는 방법을 제공한다. 방법은 효소가 절단되어 상기 제 1 및 제 2 단편 서열을 제공할 수 있는 효소 내 적합한 위치를 선택하는 단계를 포함한다. 방법은 일반적으로 상기 서열로부터 재구성된 안정한 효소를 촉매적으로 불활성이 되도록 하는 상기 서열 중 하나에 돌연변이를 도입하는 단계를 더 포함한다. 방법은 하나 이상의 결합 모이어티를 상기 서열에 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 이는 안정한 촉매적 활성 효소를 재구성하기 위해 이들 서열을 포함하는 폴리펩티드의 비-공유 결합을 돕는다.
본 발명은 또한 서열번호 13 또는 이의 변이체를 포함하는 GDH 효소의 제 1 단편 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 이 폴리펩티드는 상기한 바와 같이 안정한 촉매적 활성 GDH 효소를 재구성할 수 있는 폴리펩티드일 수 있다. 본 발명은 또한 서열번호 14 또는 이의 변이체를 포함하는 GDH 효소의 제 1 단편 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 이 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드를 포함하는 안정한 효소를 상기한 바와 같이 촉매적으로 불활성이 되도록 조작될 수 있다. 서열번호 14의 변이체는 상기한 바와 같이 하나 이상 바람직하게는 모든 H144, Q76 및 D143에서 알라닌에 대한 대안적인 불활성화 돌연변이를 포함할 수 있다. 서열번호 13 또는 14의 변이체는 상기 폴리펩티드에 포함될 때 서열번호 15를 포함하는 폴리펩티드와 함께 안정한 GDH 효소를 재구성할 수 있는 서열일 수 있다.
본 발명은 또한 서열번호 15 또는 이의 변이체를 포함하는 GDH 효소의 제 2 단편 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 서열번호 15의 변이체는 상기 폴리펩티드에 포함될 때 상기한 바와 같이 서열번호 13 또는 서열번호 14를 포함하는 폴리펩티드와 함께 안정한 GDH 효소를 재구성할 수 있는 서열일 수 있다.
서열번호 13 또는 이의 변이체, 서열번호 14 또는 이의 변이체, 또는 서열번호 15 또는 이의 변이체를 포함하는 이들 폴리펩티드는 본원에 기재된 임의의 것에서 선택되는 하나 이상의 결합 모이어티를 더 포함할 수 있다. 일반적으로, 결합 모이어티는 서열번호 13 또는 서열번호 14의 서열 또는 이의 변이체의 C-말단 및 상기 폴리펩티드 내의 서열번호 15의 서열 또는 이의 변이체의 N-말단에 제공된다. 결합 모이어티를 포함하는 이러한 폴리펩티드의 대표적인 예는 서열번호 2, 4, 7, 9에 의해 제공된다. 본 발명은 또한 본원에 기재된 바와 같은 서열번호 2, 4, 7 및 9 중 임의의 변이체를 포함한다.
한 개 또는 두 개 또는 세 개와 같이 하나 이상의 프로테아제 절단 부위에 의해 분리된 두 개의 동족(각각의) 결합 모이어티를 더 포함하는 서열번호 13 또는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩티드가 또한 제공된다. 폴리펩티드는 프로테아제의 결합 및/또는 절단 효율을 향상시키는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 동족 결합 모이어티는 프로테아제의 부재 하에 상호 작용하고, 이러한 상호 작용은 이후 프로테아제의 절단에 의해 파괴되어 서열번호 15 또는 이의 변이체를 포함하는 추가 폴리펩티드상의 각각의 결합 모이어티에 보유 결합 모이어티가 결합 되도록 함으로서, 촉매적 활성 GDH 효소를 재구성한다. 동족 결합 모이어티, 프로테아제 절단 부위 및 결합 및/또는 절단 효율을 향상시키는 서열은 본원에 기재된 임의의 것에서 선택될 수 있다. 이들 폴리펩티드의 대표적인 예는 서열번호 40, 42, 44, 46 및 48에 의해 제공된다. 본 발명은 또한 본원에 기재된 바와 같은 서열번호 40, 42, 44, 46 및 48 중 어느 하나의 변이체를 포함한다.
또한, 서열번호 14의 서열 또는 이의 변이체 및 추가로 서열번호 15의 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 GDH 효소가 제공되며, 하나 이상의 프로테아제 절단 부위는 상기 서열 사이에 위치하고, 따라서 프로테아제에 의한 절단은 상기 효소로부터 서열번호 14의 서열을 포함하는 폴리펩티드를 치환할 수 있다. GDH 효소는 선택적으로 표적 분자의 존재 하에 서열번호 13 또는 이의 변이체를 포함하는 GDH 효소의 제 1 단편 서열을 포함하는 폴리펩티드 상의 각각의 결합 모이어티와 상호 작용할 수 있는 결합 모이어티를 더 포함할 수 있으며, 결합 모이어티 간의 상호 작용은 안정한 GDH 효소의 재구성을 허용한다. 이러한 GDH 효소의 대표적인 예는 서열번호 3, 6, 9, 41, 43, 45, 47 및 49에 의해 제공된다. 본 발명은 또한 본원에 기재된 바와 같이 서열번호 3, 6, 9, 41, 43, 45, 47 및 49 중 임의의 변이체를 포함한다.
이들 폴리펩티드 및 효소는 본원에 기재된 바와 같은 바이오센서 상에 제공될 수 있다. 대안적으로, 본원에 기재된 바와 같은 표적 분자를 검출하기 위해 함께 상호 작용하는 폴리펩티드 및 효소의 적절한 조합 및 대표적인 예에서의 바이오센서가, 표적 분자의 검출이 가능한 시험관 내 환경에서 함께 제공될 수 있다. 폴리펩티드 및 효소는 표적 분자의 검출을 위해 용액으로 함께 제공될 수 있다. 본원에서 일반적으로 사용되는 "결합 모이어티" 또는 "결합 모이어티들"은 서로를 인식 및/또는 결합할 수 있는 하나 또는 다수의 분자 또는 생물학적 또는 화학적 성분 또는 독립체, 또는 하나 이상의 다른 표적 분자를 의미한다. 결합 모이어티는 단백질, 핵산(예를 들어, 단일 가닥 또는 이중 가닥의 DNA 또는 RNA), 당, 올리고당, 다당류 또는 그 밖의 탄수화물, 지질 또는 당 단백질, PNA 구조체 등과 같은 이들의 임의의 조합, 또는 이들의 분자 성분일 수 있다. 단지 예로서, 결합 모이어티는 이에 제한되지 않으나 (i) 동족 성장 인자, 사이토카인, 호르몬(예를 들어, 인슐린), 신경전달물질(neurotransmitter) 등과 같은 표적 분자의 결합에 반응하는 수용체의 리간드 결합 도메인의 아미노산 서열; (ii) 이온 또는 대사산물(metabolite)(예를 들어, 칼모듈린 또는 칼시뉴린과 같은 Ca2 +-결합 단백질 또는 포도당 수송체)과 같은 표적 분자와 결합할 수 있거나 이에 반응하는 이온 또는 대사산물 수송체의 아미노산 서열; (iii) DNA 표적 분자의 아연-의존성 결합에 반응하는 아연-집게 아미노산 서열; (iv) DNA 표적 분자의 결합에 반응하는 헬릭스-루프-헬릭스 아미노산 서열; (v) 포스포이노시티드 표적 분자와의 결합에 반응하는 플렉스트린 상동 도메인 아미노산 서열; (vi) 신호 전달 단백질에 반응하는 Src 상동 2- 또는 Src 상동 3-도메인의 아미노산 서열; (vii) 항체 표적 분자의 결합에 반응하는 항원의 아미노산 서열; 또는 (viii) 인산화 가능한 또는 인산화된 표적 분자의 결합에 반응하는 단백질 키나아제 또는 포스파타아제의 아미노산 서열; (ix) 유비퀴틴-결합 도메인; (x) 라파마이신-결합 FKBP 및 FRB 도메인과 같은 저분자, 약물 또는 항생제와 결합하는 단백질 또는 단백질 도메인; (xi) DNA 또는 RNA가 아미노산 서열 또는 다른 단백질-핵산 상호 작용에 결합되거나 가교 결합되는 경우와 같이 핵산 표적 분자와 결합하는 단일 또는 이중 가닥의 DNA, RNA 또는 PNA 구조체; 및/또는 (xii) PDZ-FH3 도메인 융합과 같은 친화성 클램프; 이들의 변형 또는 조작된 버전일 수 있거나 이들을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 특정 결합 모이어티는 서열번호 5, 16 내지 19, 36, 37, 52 및 55 및 이의 변이체에 의해 제공된다. 변이체는 일반적으로 관련된 각각의 결합 모이어티에 대해 기능적으로 결합하는 변이체이다.
결합 모이어티는 이에 제한되지 않으나 비오틴, 아비딘, 에피토프 태그, 렉틴, 탄수화물, 지질과 같은 결합제와 같이 변형되거나 화학적으로 유도체화될 수 있다는 것을 알 것이다.
일부 실시형태에서, 각각의 모이어티들은 직접 결합하거나, 상호 작용하거나 또는 복합체를 형성할 수 있다. 제 1 결합 모이어티 및 제 2 결합 모이어티는 직접 결합하거나 상호 작용할 수 있는 분자를 포함할 수 있다. 따라서, 표적 분자와 결합 모이어티 간의 직접 결합 상호 작용은 제 1 및 제 2 분자 성분의 공-위치(co-localization)를 적절하게 촉진한다.
다른 실시형태에서, 각각의 결합 모이어티들은 결합하거나, 상호 작용하거나 또는 표적 분자와 함께 복합체를 형성할 수 있다. 일반적으로, 각각의 결합 모이어티들은 결합하거나, 상호 작용하거나 또는 동일한 표적 분자와 함께 복합체를 형성할 수 있다. 또한, "동일한" 표적 분자는 각각의 결합 모이어티에 의해 결합되어 프로테아제 활성을 공-위치시키고 활성화시킬 수 있는 각각의 상이한 모이어티, 서브유닛, 도메인, 리간드 또는 에피토프를 가질 수 있다는 것을 알 것이다.
표적 분자는 항체 및 항체 단편, 항원, 효소, 인단백질, 당단백질, 및 지단백질을 포함하는 단백질, 지질, 인지질, 단당, 이당류 및 다당류를 포함하는 탄수화물, 핵산, 핵단백질 또는 임의의 다른 분자 또는 분석물과 같은, 임의의 리간드, 분석물, 소형 유기 분자, 에피토프, 도메인, 단편, 서브유닛, 모이어티, 또는 이들의 조합일 수 있다. 여기에는 항생제, 금지 물질, 불법 약물 또는 중독 약물, 화학 요법 작용제 및 약물 설계 및 스크리닝에 사용되는 납 화합물을 포함하는 약물 및 기타 의약품, 바이오마커, 종양 및 기타 항원과 같은 생물학적 시료에서 일반적으로 발견되는 분자 및 분석물, 수용체, 전사 인자, 호르몬, 신경전달물질, 성장 인자, 사이토카인, 수용체, 대사 효소, 신호 전달 분자를 포함하는 DNA-결합 단백질, DNA 및 RNA와 같은 핵산, 막 지질 및 기타 세포 성분, 바이러스성, 박테리아성, 원생동물, 곰팡이 및 웜 단백질을 포함하는 병원균 유래 분자, 지질, 탄수화물 및 핵산을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 상기한 바와 같이, "동일한" 표적 분자는 상이한, 각각의 결합 모이어티에 의해 결합될 수 있다는 것을 알 것이다.
일 실시형태에서, 결합 모이어티는 직접 결합하거나 상호 작용하거나 표적 분자에 결합할 수 있는 임의의 단백질 또는 단백질 단편 또는 도메인의 적어도 단편의 아미노산 서열을 포함한다. 결합 모이어티는 표적 분자와 결합할 수 있는 결합 부분, 도메인 또는 영역(예를 들어, Binz et al., 2005 Nature Biotechnology, 23, 1257-68에서 검토됨)을 생성하거나 포함하도록 적절하게 조작될 수 있는 펩티드, 항체, 항체 단편 또는 임의의 다른 단백질 골격과 같은 단백질이거나 이를 포함할 수 있다.
하나의 특정 실시형태에서, 결합 모이어티는 각각 친화성 클램프의 아미노산 서열이거나 이를 포함한다. 친화성 클램프는 바람직하게 인식 도메인 및 선택적으로 인핸서 도메인을 포함한다. 인식 도메인은 일반적으로 위의 (i) 내지 (ix)에 기재된 하나 이상의 표적 분자와 결합할 수 있다. 인식 도메인은 포스포-티로신 결합(예를 들어, SH2, PTB), 포스포-세린 결합(예를 들어, UIM, GAT, CUE, BTB/POZ, VHS, UBA, RING, HECT, WW, 14-3-3, 폴로-박스), 포스포-트레오닌 결합(예를 들어, FHA, WW, 폴로-박스), 프롤린-풍부 영역 결합(예를 들어, EVH1, SH3, GYF), 아세틸화 리신 결합(예를 들어, 브로모), 메틸화 리신 결합(예를 들어, Chromo, PHD), 세포 사멸(예를 들어, BIR, TRAF, DED, Death, CARD, BH), 세포 골격 변형(예를 들어, ADF, GEL, DH, CH, FH2), 유비퀴틴-결합 도메인 또는 이의 변형 또는 조작된 버전, 또는 기타 세포 기능(예를 들어, EH, CC, VHL, TUDOR, PUF Repeat, PAS, MH1, LRR1, IQ, HEAT, GRIP, TUBBY, SNARE, TPR, TIR, START, SOCS Box, SAM, RGS, PDZ, PB1, LIM, F-BOX, ENTH, EF-Hand, SHADOW, ARM, ANK)과 관련된 도메인을 포함할 수 있지만 이에 제한되는 것은 아니다.
인핸서 도메인은 일반적으로 적어도 하나의 표적 분자 또는 표적 분자들에 대한 결합 친화성을 증가시키거나 향상시킨다. 일부 실시형태에서, 친화성은 인식 도메인 단독의 친화성과 적어도 10 배, 100 배 또는 1000 배 증가될 수 있다. 친화성 클램프는 인식 도메인과 인핸서 도메인을 연결하는 링커를 더 포함할 수 있다.
하나의 특정 실시형태에서, 친화성 클램프는 PDZ 도메인의 적어도 일부 또는 단편을 포함하는 인식 도메인 및 적어도 피브로넥틴 III 형 도메인의 적어도 일부 또는 단편을 포함하는 인핸서 도메인을 포함한다. PDZ 도메인은 인간 Erbin 단백질로부터 유도될 수 있다. Erbin-PDZ(ePDZ)는 p120-관련 카테닌(예를 들어, 구개 심장 안면 증후군(Velo-cardio-facial syndrome, ARVCF)에서 삭제된 δ-카테닌 및 아마딜로 반복(Armadillo repeat) 유전자)의 C-말단과 같은 표적 분자에 결합한다. 바람직하게, 친화성 클램프의 이 실시형태는 인핸서 도메인으로서 인간 피브로넥틴의 10 번째 III 형(FN3) 도메인을 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 친화성 클램프는 하나 이상의 연결기 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 연결기 아미노산 서열은 프로테아제 아미노산 서열(예를 들어, 프로테아제 아미노산 서열을 포함)을 Erbin-PDZ 도메인에, Erbin-PDZ 도메인을 FN3 도메인에 및/또는 FN3 도메인을 억제제에 연결할 수 있다.
또한, 친화성 클램프 구조와 기능 및 본 발명에 따라 사용될 수 있는 특정 친화성 클램프의 더욱 상세한 설명은 WO2009/062170, Zhuang & Liu, 2011, Comput. Theoret. Chem. 963 448, Huang et al, 2009, J. Mol. Biol. 392 1221, Huang et al., 2008, PNAS (USA) 105 6578, and Koide1, 및 Huang Methods Enzymol. 2013; 523: 285-302를 참조한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 친화성 클램프의 예는 서열번호 52로 제공된다.
또 다른 실시형태에서, 결합 모이어티는 항체 표적 분자에 결합될 수 있는 하나 또는 다수의 에피토프를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 결합 모이어티는 이에 제한되지 않으나 단클론 및 다클론 항체, 재조합 항체, Fab 및 Fab'2 단편, 디아바디 및 단일 사슬 항체 단편(예를 들어, scV)을 포함하는 항체 또는 항체 단편일 수 있거나 이들을 포함할 수 있다. 적절하게, 제 1 및 제 2 결합 모이어티는 표적 분자에 결합하는 각각의 항체 또는 항체 단편일 수 있거나 이들을 포함할 수 있다. 비제한적인 예가 도 2c에 개략적으로 도시되어 있다.
또 다른 특정 실시형태에서, 결합 모이어티는 항체(들)가 표적 분자에 대한 특이성을 갖는 항체-결합 분자일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 항체-결합 분자는 바람직하게 항체의 Fc 부분에 결합하는 단백질 A의 아미노산 서열 또는 이의 단편(예를 들어, ZZ 도메인)이다.
이러한 양태의 특정 실시형태는 따라서 촉매적 활성 상태에 있을 때 기질 분자와 반응하여 하나 이상의 전자를 생성할 수 있는 효소의 적어도 하나의 아미노산 서열; 제 1 결합 모이어티; 및 효소를 촉매적 불활성 상태에서 해제 가능하게 유지하도록 조작된 상기 효소의 적어도 하나의 다른 아미노산 서열을 포함하는 제 1 성분; 및 상기 효소의 적어도 하나의 다른 아미노산 서열 및 제 2 결합 모이어티를 포함하는 제 2 성분을 포함하는 바이오센서를 제공하며, 상기 바이오센서는, 상기 제 1 및 제 2 결합 모이어티 간의 상호 작용이 제 2 성분의 상기 적어도 하나의 다른 아미노산 서열에 의한 제 1 성분의 상기 적어도 하나의 다른 아미노산 서열의 치환을 용이하게 함으로써, 제 1 성분의 효소를 촉매적 불활성 상태에서 촉매적 활성 상태로 전환시키도록 구성된다.
"제 1", "제 2" 및 "제 3"이라는 용어는 바이오센서의 각각의 분리된 또는 별개의 분자 성분 및/또는 결합 모이어티의 맥락에서 사용되지만, 이들은 특정 역전될 수 없는 모든 특정의 비-임의적 순서 또는 지정과 관련이 없다는 것을 알 것이다. 따라서, 본원에 개시된 제 1 성분 제 2 및/또는 제 3 성분의 구조 및 기능적 특성은 각각 제 3 성분, 제 2 성분 및/또는 제 1 성분의 구조 및 기능적 특성일 수 있다. 유사하게, 본원에 개시된 제 1 결합 모이어티 및 제 2 결합 모이어티의 구조 및 기능적 특성은 각각 제 2 결합 모이어티 및 제 1 결합 모이어티의 구조 및 기능적 특성일 수 있다. 또한, 바이오센서는 하나 이상의 다른 명시되지 않은 분자 성분을 더 포함할 수 있다.
이러한 맥락에서, "구성 요소" 또는 "분자 성분"은 바이오센서의 분리된 부분, 부위 또는 구성 요소를 형성하는 별개의 분자이다. 일반적인 실시형태에서, 각각의 분자 성분은 하나의 인접한 아미노산 서열(즉, 융합 단백질)이거나 이를 포함한다. 많은 실시형태에서, 제 1 및 제 2 성분은 각각의 결합 모이어티에 의해 매개되는 "결합 이벤트"의 맥락에서 비-공유 결합, 연결, 상호 작용 또는 관련될 수 있지만, 이들은 여전히 바이오센서를 형성하는 별개의 분자인 것이 명백할 것이다.
일부 실시형태에서, 표적 분자는 아밀라아제와 같은 효소이다. 이러한 실시형태에서, 제 1 및 제 2 결합 모이어티는 각각 카멜리드 항체 VHH1 및 VHH2이다.
일부 실시형태에서, 표적 분자는 라파마이신과 같은 소형 유기 분자이다. 이러한 실시형태에서, 제 1 및 제 2 결합 모이어티는 각각 FKBP 및 FRB이다. 이러한 일반적인 실시형태의 특정 형태의 비제한적인 예가 일반적으로 도 5A 및 도 6에 도시되어 있다..
일부 실시형태에서, 표적 분자는 FK506과 같은 소형 유기 분자이다. 이러한 실시형태에서, 제 1 및 제 2 결합 모이어티는 각각 도 5B에 나타낸 바와 같은 FKBP 및 칼시뉴린 A/B 복합체이다.
일부 실시형태에서, 표적 분자는 사이클로스포린과 같은 소형 유기 분자이다. 이러한 실시형태에서, 제 1 및 제 2 결합 모이어티는 각각 도 5C에 도시된 바와 같은 펩티딜 프롤릴 시스 트랜스 이성화효소 A 및 칼시뉴린 A/B 복합체이다.
또 다른 광범위한 실시형태에서, 상기 효소의 상기 조작된 아미노산 서열 및 기질과 반응할 수 있는 효소의 상기 적어도 하나의 아미노산 서열은 처음에 상호 작용하는 각각의 결합 모이어티를 포함하고, 이러한 상호 작용은 이후 표적 분자와 결합하는 하나의 또는 또 다른 결합 모이어티에 의해 파괴된다. 이러한 상호 작용의 파괴는 상기 또 다른 아미노산 서열에 의한 조작된 아미노산 서열의 치환을 용이하게 한다.
제 2 양태의 또 다른 특정 실시형태는 따라서 촉매적 활성 상태에 있을 때 기질 분자와 반응하여 하나 이상의 전자를 생성할 수 있는 효소의 적어도 하나의 아미노산 서열; 제 1 결합 모이어티; 및 효소를 촉매적 불활성 상태에서 해제 가능하게 유지하도록 조작된 상기 효소의 적어도 하나의 다른 아미노산 서열을 포함하는 제 1 성분; 및 상기 효소의 적어도 하나의 다른 아미노산 서열 및 제 2 결합 모이어티를 포함하는 제 2 성분을 포함하는 바이오센서를 제공하며, 상기 바이오센서는, 상기 제 1 및 제 2 결합 모이어티 간의 상호 작용이 제 1 또는 제 2 결합 모이어티와 결합할 수 있는 표적 분자에 의해 해제되어 제 2 분자의 상기 적어도 하나의 다른 아미노산 서열에 의한 제 1 분자의 상기 적어도 하나의 다른 아미노산 서열의 치환을 용이하게 함으로써, 제 1 성분의 효소를 촉매적 불활성 상태에서 촉매적 활성 상태로 전환시키도록 구성된다.
바람직하게, 바이오센서는 처음에 제 1 및 제 2 결합 모이어티와 상호 작용하여 상기 제 1 및 제 2 결합 모이어티 간의 상호 작용을 해제 가능하게 유지시키는 교차 결합제를 더 포함한다. 적절하게, 교차 결합제는 표적 분자에 의해 제 1 및/또는 제 2 결합 모이어티로부터 치환 가능하여 제 2 분자의 상기 적어도 하나의 다른 아미노산 서열에 의한 제 1 분자의 상기 적어도 하나의 다른 아미노산 서열의 치환을 용이하게 한다.
일부 실시형태에서, 표적 분자는 THC와 같은 불법 약물이다. 이러한 실시형태에서, 결합 모이어티는 THC 칼모듈린 결합 펩티드 접합체이거나 대안적으로 칼모듈린 결합 펩티드에 융합된 항-THC 항체의 THC 결합 부위와 경쟁적으로 결합하는 펩티드이다. 이 실시형태에 따르면, 교차 결합제는 아미노산 서열 GVMPREETDSKTASPWKSARLMVHTVATFNSIKELNERWRSLQQLA(서열번호 13)를 포함하거나 이로 구성된 칼모듈린 결합 펩티드이다.
이러한 실시형태의 비제한적인 예가 도 9에 도시되어 있다.
또 다른 광범위한 실시형태에서, 제 2 양태의 바이오센서는 프로테아제 표적 분자를 검출하기에 적합하다. 바람직하게, 기질과 반응할 수 있는 효소의 상기 적어도 하나의 아미노산 서열 및 효소의 상기 또 다른 아미노산 서열은 이들 간의 결합 억제제의 프로테아제 절단 이후 상호 작용할 수 있는 각각의 결합 모이어티를 포함한다. 이러한 상호 작용은 상기 또 다른 아미노산 서열에 의한 조작된 아미노산 서열의 치환을 용이하게 한다.
제 2 양태의 또 다른 특정 양태는 따라서 촉매적 활성 상태에 있을 때 기질 분자와 반응하여 하나 이상의 전자를 생성할 수 있는 효소의 적어도 하나의 아미노산 서열; 제 1 결합 모이어티; 및 효소를 촉매적 불활성 상태에서 해제 가능하게 유지하도록 조작된 상기 효소의 적어도 하나의 다른 아미노산 서열을 포함하는 제 1 성분; 및 상기 효소의 적어도 하나의 다른 아미노산 서열 및 프로테아제 절단 부위에 의해 억제제에 연결 또는 결합된 제 2 결합 모이어티를 포함하는 제 2 성분을 포함하는 바이오센서를 제공하며, 억제제는 제 1 및 제 2 결합 모이어티 간의 상호 작용을 방지 또는 억제하고, 상기 바이오센서는, 상기 억제제가 상기 프로테아제 결합 부위를 절단하는 프로테아제 표적 분자에 의해 해제되어 제 1 및 제 2 결합 모이어티 간의 상호 작용을 촉진시켜 제 2 분자의 상기 적어도 하나의 다른 아미노산 서열에 의한 제 1 분자의 상기 적어도 하나의 다른 아미노산 서열의 치환을 용이함으로써, 제 1 성분의 효소를 촉매적 불활성 상태에서 촉매적 활성 상태로 전환시키도록 구성된다.
"프로테아제(protease)"는 펩티드 결합을 가수분해 또는 절단하는 능력을 나타내거나 나타낼 수 있는 단백질이다. 동일한 용어는 "프로테이나제(proteinase)"와 "펩티다아제(peptidase)"를 포함한다. 프로테아제는 세린 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 메탈로프로테아제, 트레오닌 프로테아제, 아스파르트산 프로테아제, 글루탐산 프로테아제, 산 프로테아제, 중성 프로테아제, 알칼리 프로테아제, 엑소프로테아제, 아미노펩티다아제 및 엔도펩티다아제를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 프로테아제는 자연 발생 프로테아제의 정제 또는 합성(예를 들어, 재조합 합성) 형태일 수 있거나, 선택적으로 더 변형되어 하나 이상의 원하는 특징, 활성 또는 특성을 갖는 자연 발생 프로테아제의 하나 이상의 단편 또는 도메인을 포함하는 조작되거나 변형된 프로테아제일 수 있다.
표적 프로테아제는 프로테아제 절단 부위가 알려진 임의의 프로테아제일 수 있다. 적절하게, 표적 프로테아제는 박테리아, 식물 및 동물을 포함하는 유기체로부터 수득될 수 있는 생물학적 시료에서 검출 가능하다. 동물은 인간과 그 밖의 포유동물을 포함할 수 있다. 표적 프로테아제의 비제한적인 예는 트롬빈, 플라스민, 인자 VII, 인자 IX, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 XII(하게만 인자) 및 칼리크레인(예를 들어, 칼리크레인 III, P-30 또는 전립선 특이 항원)과 같은 그 밖의 프로테아제, 매트릭스 메탈로프로티나아제(예를 들어, MMP7 및 MMP9과 같은 상처와 궤양과 관련됨), 아다말리신(adamalysin), 세랄리신(serralysin), 아스타신(astacin) 및 메트진신(metzincin), 트립신(trypsin), 키모트립신(chymotrypsin), 엘라스타아제(elastase), 카텝신 G(cathepsin G), 펩신(pepsin) 및 카르복시펩티다아제 A(carboxypeptidase A)등의 기타 프로테아제뿐만 아니라 HIV 프로테아제, 웨스트 나일 NS3 프로테아제 및 뎅기열 바이러스 프로테아제와 같은 병원성 바이러스의 프로테아제를 포함하지만 이제 제한되지 한정되지 않는다.
이 실시형태의 비제한적인 예가 도 8에 도시되어 있다.
제 3 양태에서, 본 발명은 촉매적 활성 상태에 있을 때 기질 분자와 반응하여 하나 이상의 전자를 생성할 수 있는 효소의 적어도 하나의 아미노산 서열; 표적 분자와 결합할 수 있는 결합 모이어티; 및 표적 분자의 부재 하에 결합 모이어티와 상호 작용하여 효소를 억제할 수 있는 적어도 하나의 효소 억제제를 포함하는 바이오센서를 제공하며, 상기 바이오센서는, 표적 분자가 상기 적어도 하나의 효소 억제제와 결합 모이어티 간의 상호 작용을 해제시킴으로써 억제제에 의한 효소의 억제를 해제시키고 효소의 아미노산 서열을 촉매적 불활성 상태에서 상기 촉매적 활성 상태로 전환시킬 수 있도록 구성된다.
효소, 기질 분자, 표적 분자 및/또는 결합 모이어티는 상기한 임의의 효소, 기질 분자, 표적 분자 및/또는 결합 모이어티일 수 있다.
이 양태의 특별한 특징은 표적 분자가 존재하는 경우 결합 모이어티가 이에 결합하거나 이와 상호 작용할 수 있다는 것이다. 바람직한 초기 상태에서, 결합 모이어티는 효소 억제제, 또는 효소 억제제에 연결된 분자(예를 들어, 아미노산 서열)와 해제 가능하게 상호 작용하거나 이에 결합한다. 이는 효소 억제제에 의한 효소 억제를 촉진한다. 이후, 존재하는 경우, 표적 분자는 효소 억제제 또는 이에 연결된 분자와 경쟁하여 결합 모이어티로부터 효소 억제제를 해제하여 효소 억제의 해제를 유도함으로써, 효소를 촉매적 활성 상태로 전환시킨다.
효소 억제제는 하나 이상의 전자를 제공하기 위해 기질 분자와 반응하는 효소의 능력을 예방, 억제, 예방 또는 저해할 수 있는 임의의 분자일 수 있다.
제 3 양태의 실시형태는 촉매적 활성 상태에 있을 때 기질 분자와 반응하여 하나 이상의 전자를 생성할 수 있는 효소의 적어도 하나의 아미노산 서열; 프로테아제 절단 부위에 의해 효소에 연결 또는 결합된 상기 효소의 억제제; 및 제 1 성분 결합 모이어티를 포함하는 제 1 성분; 제 1 성분 결합 모이어티와 결합할 수 있는 제 2 성분 결합 모이어티; 프로테아제 아미노산 서열; 및 표적 분자와 결합할 수 있는 또 다른 제 2 성분 결합 모이어티를 포함하는 제 2 성분; 및 표적 분자의 부재 하에 상기 제 2 성분 결합 모이어티와 상호 작용할 수 있는 제 3 성분 결합 모이어티를 포함하는 제 3 성분을 포함하는 바이오센서를 제공하며, 상기 바이오 센서는, 상기 표적 분자가 제 3 성분 결합 모이어티와 상기 제 2 성분 결합 모이어티 간의 결합을 치환하여 상기 제 1 성분 결합 모이어티와 상기 제 2 성분 결합 모이어티 간의 상호 작용을 촉진시키고, 이에 따라 프로테아제가 프로테아제 절단 부위를 절단하여 억제제에 의한 효소의 억제를 제거하고 따라서 효소를 촉매적 불활성 상태에서 촉매적 활성 상태로 전환시키도록 구성된다.
효소, 기질 분자, 표적 분자 및/또는 결합 모이어티는 상기한 임의의 효소, 기질 분자, 표적 분자 및/또는 결합 모이어티일 수 있다.
이 실시형태의 특별한 특징은 제 1 성분의 프로테아제 절단 부위가 제 2 성분의 프로테아제 아미노산 서열에 의해 절단될 수 있다는 것이다. 바람직하게, 제 3 성분 결합 모이어티는 제 1 및 제 2 부분을 포함하며, 제 1 부분은 처음에 상기 제 2 성분 결합 모이어티에 해제 가능하게 결합하거나 상호 작용할 수 있고, 제 2 부분은 처음에 표적 분자의 부재하에 상기 또 다른 제 2 성분 결합 모이어티와 해제 가능하게 결합하거나 상호 작용할 수 있다. 존재하는 경우, 표적 분자는 상기 또 다른 제 2 성분 결합 모이어티로부터 제 3 성분의 제 2 부분을 치환할 수 있다. 이는 제 3 성분의 제 1 부분의 해제가 상기 제 2 성분 결합 모이어티와 상호 작용하거나 결합하는 것을 용이하게 한다. 이는 제 1 성분 결합 모이어티가 상기 제 2 성분 결합 모이어티와 결합 또는 상호 작용하는 것을 용이하게 하여, 제 1 및 제 2 성분을 공-위치시키고, 제 2 성분의 프로테아제 아미노산 서열을 제 1 성분의 프로테아제 절단 부위의 근접하게 한다. 프로테아제는 이후 프로테아제 절단 부위를 절단함으로써 효소 억제제로부터 효소를 해제할 수 있고, 이는 효소 억제를 해제함으로써 효소를 촉매적 활성 상태로 전환시킨다.
관련된 양태에서, 본 발명은 또한 효소의 촉매 활성을 방지 또는 감소시키도록 작용하는 억제 모이어티를 포함하는 산화환원효소, 바람직하게는 GDH 효소를 제공하며, 억제 모이어티는 하나 이상의 분자의 존재 하에 치환되어 효소의 촉매 활성을 활성화할 수 있다. 억제 모이어티는 또한 본원에서 효소 억제제로서 설명되며, 촉매 활성을 활성화시키도록 치환될 수 있는 효소의 촉매 활성을 예방 또는 감소시킬 수 있는 임의의 분자일 수 있다.
억제 모이어티는 활성 부위에서 촉매성 아미노산 잔기를 치환할 수 있다. 억제 모이어티는 활성 부위에 대한 기질의 접근을 입체적으로 방지할 수 있다. 억제 모이어티는 바람직하게 항체 또는 항체 단편 또는 억제 펩티드이다. 억제 모이어티는 효소의 N-또는 C-말단을 포함하여 효소에서 N-또는 C-말단에 위치할 수 있고 또는 효소의 아미노산 서열에 내부적으로 위치할 수 있다. 효소는, 예를 들어, 효소 내의 영역에 대한 억제 펩티드의 친화성을 증가시켜 상기 영역에 더욱 강력하게 결합 또는 고정하도록 하고 촉매 활성을 방지 또는 감소시킴으로써 효소의 촉매 활성을 방지 또는 감소시키는 억제 모이어티(예를 들어, 억제 펩티드)의 능력을 증가시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다.
GDH 효소에 관한 실시형태에서, 억제 모이어티는 효소의 C-말단에 위치한 항체 또는 항체 단편 또는 억제 펩티드일 수 있다. GDH 효소는 서열번호 1의 서열 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 억제 모이어티는 일반적으로 상기 GDH 효소의 C-말단 영역, 예를 들어 C-말단 또는 C-말단 근처에 첨가되는 서열번호 20 내지 24, 51 또는 55의 임의의 서열 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다.
GDH 효소가 억제 모이어티의 결합을 돕는 아미노산 돌연변이를 포함하는 상기한 바와 같은 돌연변이 효소인 경우, 이는 일반적으로 효소의 C-말단에 위치하는 억제 모이어티의 억제 활성을 향상시킬 수 있는 서열번호 1(서열번호 1의 본래의 PQQ-GDH 효소에서 EMTY1)의 340 내지 344 위치에 해당하는 하나 이상의 위치에서 이러한 돌연변이를 포함한다. 변이체는 바람직하게 서열번호 1의 343 위치에서 티로신 잔기를 보유한다. 변이체는 극성 또는 친수성 아미노산 잔기를 도입하는 340번 내지 342번 및 344번 위치 중 하나 이상의 위치에서 돌연변이를 포함할 수 있다. 변이체는 서열번호 1의 340번 내지 344번 위치에 해당하는 위치에서 서열 SSSYS(서열번호 51) 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 돌연변이 효소는 서열번호 31의 서열 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 상기한 돌연변이 GDH 효소(예를 들어, 서열번호 31의 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 GDH 효소)에 첨가될 수 있는 억제 모이어티의 대표적인 예는 서열번호 25 내지 30 또는 이의 변이체를 포함한다. 이러한 억제 모이어티는 일반적으로 상기한 바와 같이 효소에 C-말단에 포함된다. 억제 모이어티(자가 억제 효소)를 포함하는 돌연변이 GDH 효소의 대표적인 예는 서열번호 31 내지 33 및 54에 의해 제공된다. 본 발명은 서열번호 31 내지 33 및 54의 임의의 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 자가 억제된 돌연변이 GDH 효소를 제공한다.
상기한 산화환원효소(예를 들어, GDH)는 일반적으로 하나 이상의 프로테아제 절단 부위를 포함하고, 여기서 프로테아제에 의한 상기 부위의 절단은 억제 모이어티를 치환하여 효소의 촉매 활성을 활성화시킨다. 효소는 프로테아제의 결합 및/또는 절단 효율을 향상시키는 서열을 더 포함할 수 있다.
산화환원효소는 추가 분자 상에서 각각의 결합 모이어티와 상호 작용할 수 있는 결합 모이어티를 포함할 수 있으며, 결합 모이어티 간의 상호 작용은 억제 잔기를 치환하여 효소의 촉매 활성을 활성화시킨다. 이러한 산화환원효소는 하나 이상의 프로테아제 절단 부위를 더 포함할 수 있으며, 추가의 분자는 프로테아제를 더 포함하고, 결합 모이어티 간의 상호 작용은 프로테아제를 상기 부위와 근접하게 하여 상기 부위를 절단하고 억제 모이어티를 치환하도록 작용한다. 결합 모이어티 및 프로테아제 절단 부위(들)는 본원에 기재된 임의의 것에서 선택될 수 있다.
프로테아제 절단에 의해 활성화된 자가 억제된 GDH 효소의 예가 도 3A 내지 도 3E에 도시되어 있다.
본 발명은 또한 상기 효소에 융합될 때 촉매 활성을 예방 또는 감소시킬 수 있는 억제 모이어티를 스크리닝하는 단계를 포함하는, 자가 억제된 산화환원효소(예를 들어, GDH)를 조작하는 방법을 제공하며, 억제 모이어티는 표적 분자의 존재 하에 치환되어 촉매 활성을 재구성할 수 있다. 억제 모이어티는 효소의 서열에 N-또는 C-말단으로 혼입될 수 있다. GDH 효소에 관한 실시형태에서, 억제 모이어티는 바람직하게 C-말단에 융합된 것과 같이 효소에서 C-말단에 제공된다. GDH 효소는 서열번호 1 또는 서열번호 31의 서열 또는 이들 중 어느 하나의 변이체를 포함할 수 있다. 추정되는 억제 모이어티는 파지 디스플레이에 의해 동정될 수 있다. 스크리닝은 시험관내 활성 분석에서 수행될 수 있다. 적합한 분석은 본원의 실시예에 설명되어 있다.
프로테아제 아미노산 서열은 프로테아제의 전체 아미노산 서열일 수 있고 또는 프로테아제의 단백질 가수분해 활성 단편 또는 서브 서열의 아미노산 서열일 수 있다.
일부 실시형태에서, 프로테아제는 자가 억제 프로테아제일 수 있다.
하나의 바람직한 실시형태에서, 프로테아제는 엔도펩티다아제이다.
일부 실시형태에서, 프로테아제는 바이러스 게놈으로부터 유래되거나 이에 의해 인코딩된다. 일반적으로, 이러한 프로테아제는 다단백질의 발현 및 단백질 분해 처리 및/또는 이에 제한되지 않으나 피코르나바이러스목(Picornavirales), 니도바이러스 목(Nidovirales), 헤르페스바이러스목(Herpesvirales), 레트로바이러스 및 아데노바이러스와 같은 바이러스의 라이프 사이클의 일부로서 필요한 다른 이벤트에 의존한다. 프로테아제의 특정 예는 담배 에치 바이러스(tobacco etch virus, TEV), 담배 엽맥 반점 바이러스(tobacco vein mottling virus, TVMV), 사탕수수 모자이크 바이러스(sugarcane mosaic virus, SMV) 등의 NIa 프로테아제와 같은 포티바이러스과(Potyviridae) 프로테아제; C형 간염 바이러스(HCV)의 NS3 프로테아제와 같은 플라비바이러스과(Flaviviridae) 프로테아제; EV71, 노로바이러스 등의 의 3C 프로테아제, 인간 리노바이러스, 콕사키바이러스 B4(coxsackievirus B4) 등의 2A 프로테아제 및 구제역 바이러스(foot and mouth disease virus, FMDV) 등의 리더 프로테아제와 같은 피코르나바이러스과(Picornaviridae) 프로테아제; SARS-CoV의 3C-유사 프로테아제, IBV-CoV 및 HSV-1, HSV-2, HCMV 및 MCMV 프로테아제 등과 같은 헤르페스바이러스 프로테아제와 같은 코로나바이러스과(Coronaviridae) 프로테아제를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게, 바이러스 게놈은 식물 바이러스이다.
더욱 바람직하게, 식물 바이러스는 포티바이러스이다.
특히 바람직한 실시형태에서, 프로테아제는 TEV, TVMV 또는 SMV의 NIa 프로테아제와 같은 포티바이러스 프로테아제이다.
대안적인 실시형태에서, 프로테아제는 HCV와 같은 플라비바이러스의 NS3 프로테아제이다.
다른 실시형태에서, 프로테아제는 유비퀴틴(Ub), NEDD8 및 Atg8 프로테아제를 포함하는 SUMO 관련 프로테아제이다[21]. 이들 프로테아제는 프로테아제 내성 링커를 통해 각각의 인식 도메인(예를 들어, SUMO)과의 융합에 의해 자가 억제 형태로 변환된다.
하나의 특정 실시형태에서, 제 2 성분 결합 모이어티는 스캐폴딩 단백질, 이의 도메인 또는 단편이다. 비제한적인 예는 PDZ 도메인, SH2 또는 SH3 도메인 또는 이의 단편을 포함한다. 상기한 바와 같이, 바람직하게 제 3 성분 결합 모이어티는 제 1 및 제 2 부분을 포함하며, 제 1 부분은 처음에 상기 제 2 성분 결합 모이어티에 해제 가능하게 결합하거나 상호 작용할 수 있고, 제 2 부분은 처음에 표적 분자의 부재하에 상기 또 다른 제 2 성분 결합 모이어티와 해제 가능하게 결합하거나 상호 작용할 수 있다. 제 1 부분은 스캐폴딩 단백질, 이의 도메인 또는 단편에 결합하는 리간드(예를 들어, 펩티드)일 수 있다.
제 3 성분의 제 2 부분은 표적 분자의 결합 부위 또는 표적 분자 또는 제 1 부분에 접합된 이의 유사체에 경쟁적으로 결합하는 펩티드일 수 있다.
이들 실시 형태의 비제한적인 예가 도 10 및 도 11에 도시되어 있다.
본원에 기재된 바이오센서 및 이의 분자 성분은 본 기술 분야에서 잘 이해되는 키메라 단백질 또는 융합 단백질의 형태와 같은 인접 아미노산 서열일 수 있거나 이를 포함할 수 있다는 것을 알 것이다. 선택적으로, 각각의 아미노산 서열(예를 들어, 결합 모이어티, 효소 아미노산 서열, 프로테아제 아미노산 서열 등)은 스페이서 또는 링커(예를 들어, 아미노산, 아미노산 서열, 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 서열 또는 그 밖의 분자)에 의해 연결 또는 결합되어, 이에 제한되지 않으나, 표적 분자 인식, 결합 및 효소 활성 또는 억제와 같은 특징 또는 활성을 최적화하는 별개의 또는 분리된 아미노산 서열일 수 있다. 효소 아미노산 서열, 조작된 돌연변이, 링커, 프로테아제 절단 부위 및 결합 모이어티를 포함하는 아미노산 서열의 비제한적인 예가 도 14 및 서열번호 1-55에 제공된다.
또한, 본 발명은 본원에 기재된 실시형태의 변이체이거나 본원에 개시된 구성 프로테아제, 센서 및/또는 억제 아미노산 서열의 변이체를 포함하는 바이오센서 분자를 포함한다는 것을 알 것이다. 일반적으로, 이러한 변이체는 서열번호 1 내지 55 또는 이의 일부와 같이 본원에 개시된 임의의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 단지 예로서, 보존적 아미노산 변이체는 상당히 또는 실질적으로 기능의 변화 없이 이루어질 수 있다. 예를 들어, 전하, 친수성, 소수성, 측쇄 "벌크", 2차 및/또는 3차 구조(예를 들어 헬리시티(helicity)), 표적 분자 결합, 프로테아제 활성 및/또는 프로테아제 억제 활성이 실질적으로 변경되지 않고 또는 바이오센서의 기능을 상당히 또는 실질적으로 손상시키지 않는 정도로 변경되는 보존된 아미노산 치환이 허용될 수 있다. (본원에 기재된 조작된 비-활성 돌연변이 외에) 본 발명의 변이체는 기능성으로 선택되어 촉매 활성을 보유하거나 실질적으로 보유하거나, 또는 상기한 바와 같은 바이오센서의 적합한 추가 성분과 함께 제공될 때 이러한 촉매 활성을 재구성하는 능력을 갖는다. 본원에 기재된 비-공유 결합 아미노산 서열의 변이체(예를 들어, 제 1 및 제 2 단편 서열)는 이들의 각각의 결합 파트너 서열과 함께 제공될 때 안정한 효소를 재구성하는 능력을 보유하도록 선택된다.
"서열 동일성"이란 용어는 서열이 비교 범위에 걸쳐 동일하다는 정도를 고려하여, 표준 알고리즘을 사용하여 적절한 정렬을 고려해서 정확한 아미노산 매치의 수를 포함하는 가장 넓은 의미로 본원에서 사용된다. 서열 동일성은 예를 들어 Altschul 등(1997, Nucl. Acids Res. 25 3389. A)이 개시한 바와 같은 GAP, BESTFIT, FASTA 및 BLAST 계열의 프로그램과 같은 컴퓨터 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 서열 분석에 대한 자세한 설명은 문헌(Unit 19.3 of CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY Eds. Ausubel et al. (John Wiley & Sons Inc NY, 1995-1999))에서 찾을 수 있다.
단백질 단편은 본원에 개시된 아미노산 서열의 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 바람직하게는 최대 80%, 85%, 더욱 바람직하게는 최대 90% 또는 최대 95-99%를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 단백질 단편은 서열번호 1 내지 55와 같은 본원에 개시된 아미노산 서열의 최대 5개, 10개, 20개, 40개, 50개, 70개, 80개, 90개, 100개, 120개, 150개, 180개, 200개, 220개, 230개, 250개, 280개, 300개, 330개, 350개, 400개 또는 450개의 아미노산을 포함할 수 있다.
상기한 바로부터 알 수 있는 바와 같이, 본원에 기재된 바이오센서는 하나 이상의 표적 분자와의 결합, 상호 작용 또는 이들의 검출에 대응하여 기질 분자와 반응함으로써 전자를 생성한다. 이러한 맥락에서 기질 분자와 "반응하다", 기질 분자와의 "반응" 또는 기질 분자와 "반응하는"은 기질 분자당 하나 또는 다수의 전자의 순생산 또는 전체 생산과 함께 기질 분자를 하나 이상의 생성물 분자로 효소적으로 변형시키는 것을 의미한다. 따라서, 바이오센서는 전자 공여체로서 작용하여, 반응에 의해 생성된 전자가, 이에 제한되지 않으나, 페나진 메토설페이트 또는 페로시안화칼륨과 같은 전자 셔틀을 통해 또는 직접 흘러서 음극으로 작용할 수 있다. 애노드와 캐소드 간의 전위 변화는 전자 검출기에 의해 검출된다. 이러한 구성의 비제한적인 예가 도 12에 도시되어 있다.
본 발명의 추가의 양태는 하나 이상의 기질 분자와 함께 본원에 개시된 하나 이상의 바이오센서를 포함하는 키트 또는 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 표적 분자를 검출하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기한 양태의 조성물을 시료에 접촉시켜 시료 내의 표적 분자의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함한다.
적절하게, 시료는 생물학적 시료이다. 생물학적 시료는 기관 샘플, 조직 샘플, 세포 샘플, 유체 샘플 또는 유기체 또는 유기체의 구성 성분으로부터 수득될 수 있거나, 수득된, 유래할 수 있거나 유래한 다른 샘플을 포함할 수 있다. 생물학적 시료는 발효 배지, 공급 원료 또는 예를 들어, 이에 제한되지 않으나, 유제품을 포함하는 식품을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 생물학적 시료는 포유동물, 바람직하게는 인간으로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 생물학적 시료는 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 타액, 눈물, 땀, 뇌척수액 또는 양수와 같은 유체 샘플, 조직 또는 기관 생검과 같은 조직 샘플 또는 적혈구, 림프구, 종양 세포 또는 피부 세포를 포함하는 세포 샘플을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 생물학적 시료의 특정 유형은 병리학 시료이다.
적절하게, 바이오센서의 효소 활성은 시료 성분(예를 들어, 혈청 단백질, 대사산물, 세포, 세포 파편 및 성분, 자연 발생 프로테아제 억제제 등)에 의해 실질적으로 억제되지 않는다.
일 실시형태에서, 바이오센서 및/또는 사용 방법은 중독성 불법 약물(예를 들어, 칸나비노이드, 암페타민, 코카인, 헤로인 등) 사용의 검출 및/또는 스포츠에서의 성능-향상 물질 및/또는 성능-향상 물질의 검출을 피하기 위해 일반적으로 사용되는 마스킹제(masking agent)의 검출과 같은 약물 검사에 적용될 수 있다. 이는 인간 및/또는 성능을 향상시키기 위해 불법적인 "도핑"을 받을 수 있는 경주마 및 그레이하운드와 같은 다른 포유동물에서의 금지된 성능-향상 물질의 검출에 적용될 수 있다.
또 다른 특정 실시형태에서, 바이오센서 및/또는 사용 방법은 인간과 같은 포유동물의 질병 또는 질환을 진단하기 위한 것이다.
따라서, 본 발명의 바람직한 양태는 인간의 질병 또는 질환의 진단 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기한 양태의 조성물을 인간으로부터 수득된 생물학적 시료에 접촉시켜 생물학적 시료 내의 표적 분자의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하고, 표적 분자의 존재 또는 부재의 결정은 질병 또는 질환의 진단을 용이하게 한다.
질병 또는 질환은 표적 분자의 검출이 진단에 도움이 되는 임의의 것일 수 있다. 표적 분자 또는 분석물의 비제한적 예는 상기한 바와 같은 혈액 응고 인자, PSA를 포함하는 칼리크레인, 매트릭스 메탈로프로티나아제, 바이러스 및 세균 프로테아제, 항체, 포도당, 트리글리세리드, 지단백질, 콜레스테롤, 종양 항원, 림프구 항원, 자가항원 및 자가항체, 약물, 염, 크레아티닌, 혈청 또는 혈장 단백질, 살충제, 요산, 인간과 동물의 대사 산물 및 중간 생성물 및 금속을 포함한다.
본 발명의 이러한 바람직한 양태는 환자의 위치에서 표적 분자의 존재 또는 부재의 결정이 일어날 수 있고 이후 해당 위치에서 분석되거나 질병 또는 질환의 진단을 위해 원격 위치로 전송되는 "현장 진단" 방법으로서 수행되도록 구성될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기한 양태 중 임의의 양태의 바이오센서를 포함하는 세포 또는 챔버를 포함하는 검출 장치를 제공한다.
적절하게, 시료는 세포 또는 챔버에 도입되어 표적 분자의 검출을 용이하게 할 수 있다.
특정 실시형태에서, 검출 장치는 표적 분자의 존재를 나타내는 전기화학, 음향 및/또는 광학 신호를 제공할 수 있다.
검출 장치는,
프로세서; 및
프로세서에 결합된 메모리를 포함함으로써 진단 대상 결과로부터 질병 진단을 더 제공할 수 있으며, 메모리는 프로세서에 의해 실행될 때, 진단 시험 결과를 분석하고 질병 또는 질환의 진단을 제공하는 기능을 포함하는 일련의 기능을 수행하는 컴퓨터 판독 가능 프로그램 코드 성분을 포함한다.
검출 장치는,
프로세서; 및
프로세서에 결합된 메모리를 포함함으로써 진단 시험 결과의 통신을 더 제공할 수 있으며, 메모리는 프로세서에 의해 실행될 때,
진달 결과를 수신 장치에 전달하는 기능; 및
선택적으로, 상기 또는 또 다른 수신 장치로부터 질병 또는 질환의 진단을 수신하는 기능을 포함하는 일련의 기능을 수행하는 컴퓨터 판독 가능 프로그램 코드 성분을 포함한다.
본 발명의 진단 양태는 또한 하나 또는 다수의 상이한 표적 분자를 검출할 수 있는 하나 또는 다수의 상이한 바이오센서를 포함하는 키트의 형태일 수 있다. 이와 관련하여, 키트는 다수의 상이한 표적 분자를 검출할 수 있는 상이한 바이오센서의 어레이를 포함할 수 있다. 키트는 상기한 바와 같이 하나 이상의 증폭 분자, 불활성화 분자 및/또는 표지된 기질을 더 포함할 수 있다. 키트는 또한 완충제 및 희석제와 같은 시약, 반응 용기 및 사용 설명서를 포함하는 추가 성분을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기한 바와 같은 본 발명의 바이오센서의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 인코딩하는 분리된 핵산을 제공한다.
본원에서 사용된 "핵산"이라는 용어는 cDNA, 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 및 게놈 DNA를 포함하는 단일 또는 이중 가닥의 mRNA, RNA, cRNA, RNAi, siRNA 및 DNA를 의미한다.
"폴리뉴클레오티드"는 80개 이상의 인접 뉴클레오티드를 갖는 핵산인 반면, "올리고뉴클레오티드"는 80개 미만의 인접 뉴클레오티드를 갖는다. "프라이머"는 일반적으로 상보적인 핵산 "주형"에 어닐링할 수 있고, Taq 중합효소, RNA-의존성 DNA 중합효소 또는 SequenaseTM과 같은 DNA 중합효소의 작용에 의해 주형-의존적 방식으로 연장될 수 있는, 바람직하게는 15개 내지 50개의 인접 뉴클레오티드를 갖는 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드이다. "프로브"는 예를 들어 노던 또는 서던 블로팅에서 상보적인 서열을 검출하기 위해 적절하게 표지된, 단일 또는 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명은 또한 분리된 핵산의 변이체 및/또는 단편을 제공한다. 변이체는 본원에 개시된 임의의 뉴클레오티드 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 80%, 적어도 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 91%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는다. 다른 실시형태에서, 핵산 변이체는 매우 엄격한 조건 하에 본원에 개시된 임의의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 서열과 하이브리드화할 수 있다.
단편은 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95 내지 99%의 본원에 개시된 임의의 뉴클레오티드 서열 내에 존재하는 인접 뉴클레오티드를 포함하거나 이들로 구성될 수 있다.
단편은 20개, 50개, 100개, 150개, 200개, 250개, 300개, 350개, 400개, 450개, 500개, 550개, 600개, 650개, 700개, 750개, 800개, 850개, 900개, 950개, 1000개, 1050개, 1100개, 1150개, 1200개, 1350개 또는 1300개의 본원에 개시된 임의의 뉴클레오티드 서열 내에 존재하는 인접 뉴클레오티드를 포함하거나 이들로 구성될 수 있다.
본 발명은 또한 하나 이상의 추가 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 본원에 개시된 바와 같은 하나 이상의 분리된 핵산, 이들의 변이체 또는 단편을 포함하는 "유전자 구조체"를 제공한다.
본원에서 일반적으로 사용되는 "유전자 구조체"는 본원에 개시된 분리된 핵산을 혼입시키고 및/또는 이의 사용을 용이하게 하는 인위적으로 생성된 핵산이다.
특정 실시형태에서, 이러한 구조체는 재조합 조작, 증식, 증폭, 동종 재조합 및/또는 상기 분리된 핵산의 발현에 유용할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 재조합 단백질 발현에 사용되는 유전자 구조체는 "발현 구조체"라 불리고, 발현되는 분리된 핵산은 발현 벡터에서 하나 이상의 추가 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합되거나 작동 가능하게 연결된다.
"발현 벡터"는 플라스미드와 같은 자가 복제 염색체-외 벡터 또는 숙주 게놈으로 통합되는 벡터일 수 있다.
이러한 맥락에서, 하나 이상의 추가 뉴클레오티드 서열은 조절 뉴클레오티드 서열이다.
"작동 가능하게 결합된" 또는 "작동 가능하게 연결된"은 상기 조절 뉴클레오티드 서열(들)이 핵산의 발현을 개시, 조절 또는 제어하도록 발현되는 핵산에 대해 위치한다는 것을 의미한다.
조절 뉴클레오티드 서열은 일반적으로 발현에 사용되는 숙주 세포에 적합할 것이다. 다양한 유형의 적절한 발현 벡터 및 적합한 조절 서열이 다양한 숙주 세포에 대해 본 기술 분야에 공지되어 있다.
하나 이상의 조절 뉴클레오티드 서열은 프로모터 서열, 리더 또는 신호 서열, 리보솜 결합 부위, 전사 시작 및 종결 서열, 번역 시작 및 종결 서열, 스플라이스 공여체/수용체 서열 및 인핸서 또는 활성제 서열을 포함할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 기술 분야에 공지된 구성적 또는 유도성 프로모터가 사용될 수 있으며, 예를 들어, 니신-유도성, 테트라사이클린-억제성, IPTG-유도성, 알코올-유도성, 산-유도성 및/또는 금속-유도성 프로모터를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 발현 벡터는 선별 마커 유전자를 포함한다. 선별 마커는 형질전환 박테리아(예를 들어, bla , kanR , ermB 및 tetR) 또는 형질전환 포유동물 세포(하이그로마이신, G418 및 퓨로마이신 내성)를 선별하는 데 유용하다.
발현에 적합한 숙주 세포는 대장균(예를 들어, DH5α)을 포함하는 박테리아 세포, S. 세레비아에(S. cerevisiae) 또는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)와 같은 효모 세포, 바큐로바이러스 발현 시스템과 함께 사용되는 SF9 세포와 같은 곤충 세포, 또는 CHO, BHK 또는 293 세포와 같은 다양한 포유 동물 또는 다른 동물의 숙주 세포 중 임의의 것과 같은 원핵 세포 또는 진핵 세포 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다
적합한 숙주 세포 내로의 발현 구조체의 도입은 이에 제한되지 않으나 본 기술 분야에 공지된 전기 천공, 열 충격, 인산칼슘 침전, DEAE 덱스트란-매개 형질전환, 리포좀-기반 형질전환(예를 들어, 리포펙틴, 리포펙타민), 원형질 융합, 미세주입 또는 미세입자 충격을 포함하는 다양한 기술에 의해 수행될 수 있다.
재조합 바이오센서 분자의 정제는 본 기술 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 재조합 바이오센서 분자는 His 태그의 경우에 니켈 기질 또는 수지일 수 있는 적절한 친화성 매트릭스에 의한 정제를 허용하는 융합 파트너(바람직하게는 C-말단 His 태그)를 포함한다.
본 발명이 잘 이해될 수 있고 실행될 수 있도록, 본 발명의 실시형태들이 다음의 비제한적인 실시예를 참조하여 설명될 것이다.
실시예
실시예 1
아시네토박터 칼코아세티쿠스 피롤로퀴놀린 퀴논 포도당 탈수소효소를 기반으로 하는 전기화학적 바이오센서 설계
지난 30년 동안 바이오센서는 건강 관리에 사용되는 복잡하고 값비싼 분석 장비의 실용적인 대안이 되었다[1]. 현재 사용되는 일부 검출 기술 중에서 광학, 음향, 압전, 전기화학 센서는 단순성, 특이성 및 고성능이 두드러진 특징을 이룬다[2]. 전기화학적 혈당 센서는 바이오센서 시장의 거의 90%를 차지하는 가장 상업적으로 성공한 바이오센서이다[3]. 이들 센서의 성공은 설계의 단순성 및 제조의 용이성과 결합된 높은 선택성과 민감성 때문이다. 센서는 재조합 포도당 산화효소 또는 포도당 탈수소효소에 의한 포도당 산화의 전류 측정 모니터링을 기반으로 한다[4]. 여기서, 건조한 분석 챔버는 높은 전류 밀도로 효소 반응을 시작하는 시료로 넘치게 된다. 혈당 센서의 제 3 세대는 또한 산소와 전자 전달 매개체와는 관계가 없기 때문에 시스템이 덜 표류하게 만든다[5]. 설계의 단순성과 견고함은 0.1 달러 이하의 일회용 포도당 감지 전극의 제조를 가능하게 한다[6]. 놀랍게도, 이러한 기술적 및 상업적 성공은 임상 요구 및 현장 진단의 상용성 모두에도 불구하고 다른 전기화학적 바이오센서와 병행하지 못하였다. 이는 분석물이 높은(4-10 mM) 농도로 존재하고 또한 선택적이고 물리적으로 안정하고 고도로 진행성인 전기화학적 수용체에 대한 에너지원을 제공하는 포도당 감지의 독특한 특징에 의해 적어도 부분적으로 설명될 수 있다.
재료 및 방법
키메라 유전자 구성 및 단백질 발현과 정제
GDH-CaM 키메라 단백질의 구조체는 제조사 지침(New England Biolab)에 따라 Gibson AssemblyTM 방법에 의해 생성되었고 PET28a 벡터에 클로닝되었다. 조립을 위한 유전자 단편은 PCR에 의해 또는 IDT(통합 DNA 기술(Integrated DNA Technologies)로부터의 Gblock 유전자 합성에 의해 만들어졌다. 단백질 발현 및 정제는 Olsthoorn & Duine에 의해 기술된 바와 같이 수행하였다[19]. 정제된 GDH-CaM은 1:1.5의 비율로 PQQ를 첨가함으로써 재구성되었다. GDH 및 PQQ의 재구성에 대한 비율은 또한 본원에 기재된 PQQ-GDH 효소를 사용하는 다른 모든 실험에서 사용되었다.
사이클로스포린 센서의 단백질은 이전에 기재된 바와 같이 정제되었다(http://www.pnas.org/content/99/21/13522). Ni-NTA 정제 이후, 풀링된 효소-함유 분획에 최종 농도 5 mM가 되도록 EDTA를 보충하고, 20 mM KH2PO4 pH 7.0 및 5 mM EDTA를 함유하는 완충액에 대해 10 시간 동안 투석하였다. 이어서 EDTA를 pH 7.0의 20 mM KH2PO4 만을 함유하는 완충액에 대해 시료를 투석하여 제거하였다.
GDH 효소 활성의 분석
GDH 효소 분석은 Yu 등에 의해 기술된 바와 같이 수행하였다[20]. 간략하게, 1.5-mL 분석 시스템은 20 mM 포도당, 0.6 mM 페나진 메토설페이트, 0.06 mM 2,6-디클로로페놀, 10 mM MOPS(pH 7.0) 및 CaCl2와 효소의 대응하는 농도로 구성되었다. 효소 분석은 2,6-디클로로페놀의 600 nm에서의 흡광도의 감소를 모니터링하여 25℃에서 수행하였다.
GDH - Cam 활성의 전기화학적 분석
시간 대 전류 측정은 DropSens 일회용 스크린 인쇄된 금 전극(Cat#DRP-C220BT)에 접속된 Digy-Ivy DY2116B 3-전극 미니-포텐시오스탯을 사용하여 수행하였다. 전극을 스캔 사이에서 98℃ 밀리큐 워터(milliQ water)로 세척하여, 결합된 활성 효소가 존재하지 않도록 하였다. 반응은 300 nM GDH-CaM, 3 mM에서 PMS 매개체, pH 7.6의 PBS에서 총 부피 50 μl의 50 mM 포도당을 함유하였다. 반응은 40 mM 포도당을 첨가하여 시작하였고, 전극 표면 상에 피펫팅하기 전에 1 분 동안 실온에서 배양하였다. 시간 대 전류 측정은 5초 동안 +0.4 V에서 스크린 인쇄된 전극 상에 매립된 은 스트립에 대해 수행되었으며, 데이터는 일반적으로 5초 시점 대 칼슘 농도에서 전류로 보고되었다(도 2c).
결과
본 발명자들은 포도당 바이오센서에서 이루어진 기술적 진보가 구조적으로 포도당과 관련이 없는 분석물에 대한 바이오센서의 설계에 대해 연구될 수 있다고 추측하였다. 이를 위해, 직접 전자 전달이 가능한 아시네토박터 칼코아세티쿠스 피롤로퀴놀린 퀴논 포도당 탈수소효소(PQQ-GDH)를 바이오센서 설계의 출발점으로 선택하였다[7][8]. 그러나, 효소의 기질 특이성을 개량하기보다는, 리간드 의존적 방식으로 촉매 활성을 조절하는 알로스테릭 수용체 도메인을 효소에 부여하기를 원하였다. 이를 달성하기 위해, 구조적 변화를 활성 중심에 전달하고 동시에 수용체 도메인의 삽입을 허용하기에 충분히 근접한 활성 중심 부근의 가능한 부위에 대한 A. 칼코아세티쿠스 PQQ-GDH(PDB: 1CQ1)의 고해상도 구조를 분석하였다.
밑줄친 N-말단 리더 서열을 포함하는 PQQ-GDH 아미노산 서열은 서열번호 50에 제시되어 있다. N-말단 리더 서열이 절단된 성숙한 PQQ-GDH 아미노산 서열은 서열번호 1에 제시되어 있다:
신호 서열(서열번호 50)의 절단 이전의 단백질 서열:
M N K H L L A K I A L L G A A Q L V T L S A F A D V P L I P S Q F A K A K S E N F D K K V I L S N L N K P H A L L W G P D N Q I W L T E R A T G K I L R V N P E S G S V K T V F Q V P E I V N D A D G Q N G L L G F A F H P D F K N N P Y I Y I S G T F K N P K S T D K E L P N Q T I I R R Y T Y N K S T D T L E K P V D L L A G L P S S K D H Q S G R L V I G P D Q K I Y Y T I G D Q G R N Q L A Y L F L P N Q A Q H T P T Q Q E L N G K D Y H T Y M G K V L R L N L D G S I P K D N P S F N G V V S H I Y T L G H R N P Q G L A F T P N G K L L Q S E Q G P N S D D E I N L I V K G G N Y G W P N V A G Y K D D S G Y A Y A N Y S A A A N K T I K D L A Q N G V K V A A G V P V T K E S E W T G K N F V P P L K T L Y T V Q D T Y N Y N D P T C G E M T Y I C W P T V A P S S A Y V Y K G G K K A I T G W E N T L L V P S L K R G V I F R I K L D P T Y S T T Y D D A V P M F K S N N R Y R D V I A S P D G N V L Y V L T D T A G N V Q K D D G S V T N T L E N P G S L I K F T Y K A K
성숙 단백질(서열번호 1)
D V P L I P S Q F A K A K S E N F D K K V I L S N L N K P H A L L W G P D N Q I W L T E R A T G K I L R V N P E S G S V K T V F Q V P E I V N D A D G Q N G L L G F A F H P D F K N N P Y I Y I S G T F K N P K S T D K E L P N Q T I I R R Y T Y N K S T D T L E K P V D L L A G L P S S K D H Q S G R L V I G P D Q K I Y Y T I G D Q G R N Q L A Y L F L P N Q A Q H T P T Q Q E L N G K D Y H T Y M G K V L R L N L D G S I P K D N P S F N G V V S H I Y T L G H R N P Q G L A F T P N G K L L Q S E Q G P N S D D E I N L I V K G G N Y G W P N V A G Y K D D S G Y A Y A N Y S A A A N K T I K D L A Q N G V K V A A G V P V T K E S E W T G K N F V P P L K T L Y T V Q D T Y N Y N D P T C G E M T Y I C W P T V A P S S A Y V Y K G G K K A I T G W E N T L L V P S L K R G V I F R I K L D P T Y S T T Y D D A V P M F K S N N R Y R D V I A S P D G N V L Y V L T D T A G N V Q K D D G S V T N T L E N P G S L I K F T Y K A K
일반적으로, 잔기 넘버링은 성숙 단백질(서열번호 1)에 대한 것이다. 서열번호 50의 아미노산 25-478은 성숙 단백질의 잔기 1-454이다.
본 발명자들은 β-시트 3의 가닥 A와 B를 연결하는 루프를 선택하였다(도 1A, 도 B). 가닥 A의 시작은 포도당 O1 원자에서 양성자를 추출하는 일반 염기의 역할을 하는 His144를 갖는다[9]. His144는 촉매 작용에 매우 중요하기 때문에, 가닥 A와 B의 분리에 의해 도입되는 비틀림에 의한 전위는 GDH 촉매 활성의 변화로 이어질 것이라고 추측하였다. 또한, 리간드 결합 시 큰 구조적 변화를 겪는 것으로 알려진 단백질 도메인을 가닥 3A와 3B를 연결하는 루프에 통합하여 이러한 아이디어를 시험하기로 결정하였다(도 1B).
루프는 호모다이머에서 구조와 두 번째 서브유닛을 멀리하고 입체 충돌의 가능성을 줄인다. 삽입 부위로서, 진핵 세포에서 칼슘 신호를 표적 단백질로 전달하는데 주요한 역할을 하는 17kDa 단백질인 칼모듈린(CaM)을 선택하였다[10]. CaM의 네 개의 EF 손에 대한 Ca2 +의 결합은 CaM의 두 개의 로브 각각에서 펩티드 결합 포켓을 개방하는 큰 구조적 변화를 일으킨다. CaM의 이러한 특징은 형광 단백질의 FRET 강도 또는 β-락타마아제의 활성 또는 스펙트럼 변화를 기반으로 유전적으로 인코딩될 수 있는 Ca2 + 센서의 구성을 위해 반복적으로 이용되고 있다[11][12]. GDH와 CaM 모두에 대한 유용한 구조 정보를 기반으로[10], 마우스 CaM 12-67의 잔기가 PQQ-GDH의 잔기 153과 155 사이에 삽입된 키메라 단백질을 설계하였다. 구조적 긴장과 충돌을 줄이기 위해, 본 발명자들은 또한 칼모듈린의 N-말단에 GSGS 링커를, 접합 부위에서 칼모듈린의 C-말단에 Gly 링커를 도입하였다. 생성된 단백질은 재조합 형태의 대장균에서 원형질막으로 생산되었고 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피에 의해 균질성으로 정제되었다. 그리고 나서, GDH-CaM 키메라 단백질의 활성을 분석하기 위해 기존의 비색 분석법을 사용하였다[13]. Ca2 + 이온이 없는 도 2에서 볼 수 있듯이, CaM-GDH는 사실상 효소 활성을 나타내지 않았다. CaCl2의 첨가는 키메라 단백질의 용량 의존적 활성화를 유도하였지만 야생형 효소에 대해 제한된 효과를 갖는다. Ca2 + 킬레이터 EDTA의 첨가는 효소를 기저 상태로 복귀시키므로 활성화는 가역적이었다(도 2A). 선택된 실험 조건 하에서 신호 변화는 30 배였다. Ca2 + 적정 데이터의 분석은 Ca2 + 농도에 대한 비선형 반응을 나타내었고 이는 이전에 CaM에 대해 설명되었으며 협력하는 Ca2 + 결합을 반영한다[14].
데이터의 적합성은 개발된 센서가 600 nM의 Ca2 + 친화성을 가지며 400 내지 500 nM 사이에서 가장 큰 신호 변화를 나타냄을 증명하였다. 600 nM의 Kd가 세포내 환경에서 이온화된 CaM의 친화도를 반영하는 반면, 이 이온의 세포외 농도는 훨씬 높다. 혈액, 소변 및 타액과 같은 체액은 1 내지 2 mM의 Ca2 + 농도를 나타낸다[15]. 표준 농도로부터의 편차는 내분비 장애, 골다공증 및 암과 같은 만성 병리적 상태 또는 패혈증 및 급성 신부전과 같은 급성 상태를 반영하기 때문에 이러한 매개 변수를 신속하게 평가할 수 있는 능력은 임상에서 중요하다[16]. 따라서 이온화된 칼슘에 대한 신속하고 정확한 검사는 현장 진단(point of care, POC)에 매우 유용하다. 원칙적으로 Ca2 + 농도가 센서의 반응 범위에 들어갈 때까지는 생물학적 시료를 간단히 희석할 수 있지만, 이는 POC 적용에 대한 매력을 현저하게 감소시킨다. 대신, Ca2 + 농도를 완화하여 이의 자유 농도가 센서 응답 범위에 들어갈 수 있는지 여부를 테스트하였다. 이를 위해, 잘 특성화된 Ca2 + 킬레이터인 1,2-비스(2-아미노페녹시)에탄-N,N,N',N'-테트라아세트산(BAPTA)의 존재 하에서 실험을 반복하였다. 시료에 1.1 mM의 BAPTA의 첨가는 혈액 시료의 생리학적 Ca2 + 농도의 범위 내로 최적의 센서 응답을 이동시킬 수 있었다(도 2C). 또한 Mg2 +의 존재가 Ca2 + 바이오센서의 반응에 영향을 미치는지 여부를 테스트하였다. 도 2C에 표시된 결과는 Ca2 +에 의한 본 발명자들의 키메라 GDH의 활성화가 Mg2 +의 존재에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 증명하였다. 이러한 결과는 개발된 GDH-Cam 키메라 단백질이 POC 바이오센서의 구성에 적합하다는 것을 뒷받침한다.
저렴한 혈당 측정기 스트립의 개발을 가능하게 하는 특징은 GDH가 탈수 및 재수화 이후 이의 활성을 유지하는 능력이었다. 본 발명자들은 키메라 단백질이 탈수 및 재수화 이후 활성을 유지하는 능력을 시험하였고 야생형 GDH와 유사하게 키메라 단백질이 재수화 시 활성을 유지한다는 것을 확인하였다. 표준 혈당 측정기를 기반으로 Ca2 + 측정기를 제작하기 위한 노력으로 분석 및 진단 응용을 위해 개발된 바이오센서의 유용성을 추가로 분석하였다. 이를 위해, 효소 혼합물의 표준 Akku-Chek 전극을 제거하고 이를 GDH-Cam 키메라 단백질, 포도당 및 PMS 매개체의 혼합물로 대체하였다. 또한, 감지 전극이 인간의 타액에 존재하는 Ca2 + 이온에 의해 활성화되고 바이오센서에 의해 생성된 전류가 표준 혈당 측정기를 사용하여 검출될 수 있음을 입증하였다(도 13).
도 4 내지 도 9 및 도 15(서열번호 2 내지 10)를 참조하면, 조작된 "죽은" 또는 촉매적으로 불활성인 GDH 효소의 실시형태가 도시되어 있다. 최초의 아이디어는 GDH를 두 부분 또는 단편으로 분할하는 것이었다. 제 1 부분 또는 단편은 GDH(1-153AA)이고, 제 2 부분 또는 단편은 GDH(155-454AA)이다. 이어서, 표적 분자를 검출하기 위해 각각 부분에 결합 모이어티가 결합될 수 있다. 예를 들어, 라파마이신 센서의 경우, FRB를 GDH(1-153AA)에 그리고 FKBP를 GDH(154-454AA)에 부착하였다.
그러나 FKBP-GDH(154-454AA)가 아닌 단백질 GDH(1-153AA)-FRB만이 대장균으로부터 정제될 수 있었다. 따라서, 대장균으로부터 정제될 수 있는 구조체를 생산하기 위해 다른 접근법을 취했다: GDH(1-153AA, Q76A, D143A,H144A)-TVMV 절단 부위-FKBP-GDH(155-454AA).
GDH의 H144는 GDH의 중요한 촉매 잔기이다. 초기 실험 데이터에 따르면, 삼중 변이(Q76A, D143A, H144A)만이 이 GDH 변이를 비활성으로 만들었다. TVMV에 의한 절단 이후, 라파마이신에 대한 FRB 및 FKBP의 결합을 통해 촉매 활성이 있는 전체 GDH의 재구성에 FKBP-GDH(154-454AA)가 이용 가능하였다.
또한 GDH를 두 부분으로 분할한다고 하더라도, 이들은 여전히 스스로 재구성할 수 있다. 자기-재구성에 대한 친화성(Kd)은 대략 50 내지 100 nM이다. 따라서, 현재의 분석 조건에서, 낮은 자기-재구성 정도를 갖게 하기 위해(낮은 활성 배경을 초래함), GDH의 두 부분의 농도를 100 nM 미만으로 설정하였다. 또 다른 접근법은 FKBP-GDH(155-454AA)로 GDH(1-153AA)-FRB의 자기 재구성을 방지하기 위해 과량의 GDH(1-153AA, Q76A, D143A, H144A)로 분석을 수행하는 것이다.
요약하면, 본 발명자들은 여기서 Ca2 + 게이트 전기화학적 센서의 성공적인 구조-가이드 설계의 첫 번째 예를 제시한다. 본 발명자들의 접근법은 촉매 부위의 변경 또는 보결기 변경을 사용하는 특이성 조작에 대해 보고된 접근법을 벗어난다[8][16]. 대신에, 촉매 중심에 근접하고 대형 자체 폴딩 단백질 도메인의 삽입에 대해 내성이 있는 GDH 분자의 중간에 있는 삽입 부위를 확인하였다. 도메인 삽입 전략은 인공적으로 알로스테릭하게 조절된 효소를 성공적으로 제작하기 위해 이전에 여러 차례에 걸쳐 사용되었지만[17][18], 전기화학적으로 활성인 효소에는 적용되지 않았다. 기재된 접근법은 촉매 작용 속도가 더 이상 포도당 농도에 의해 제한되지 않지만 선택된 분석물에 의해 게이트되는 바이오센서의 작동 모드를 변경시킨다. GDH의 높은 전환 속도는 기타 다른 유형의 센서를 설계할 설계하기 위한 매우 매력적인 섀시가 된다. GDH에서 확인된 삽입 부위는 이제 다른 감지 영역의 삽입에 이용될 수 있다. 이 과정은 주로 경험적이며 상당한 양의 최적화를 수반하는 반면, 이용 가능한 데이터는 일단 단백질 내의 삽입 부위가 확인되면 이들은 다중 도메인 삽입에 이용될 수 있다는 것을 시사한다[12]. GDH-기반 혈당 센서의 흔히 볼 수 있는 사용과 엔드 포인트의 가용성 및 지속적인 측정 장치의 사용을 고려할 때, 본 발명자들의 접근법은 Ca2 + 센서를 임상 실습에 도입하는데 있어 신속한 경로를 약속한다.
또한 선택된 분석물에 노출될 때 활성 효소를 형성하는 비활성의 조작된 GDH 단편을 기반으로 하는 전반적인 바이오센서 구조를 개발하였다. 또한, 단백질에 대해 리간드 인식 합성 전기화학적 수용체를 교환함으로써, 저분자 및 효소 활성이 구축될 수 있음을 입증하였다.
분할된 GDH 를 기반으로 하는 2-성분 수용체 구조
이전에 보고된 칼모듈린-GDH 바이오센서인 Ca2 + 바이오센서의 특성 분석은 GDH가 합성 전기화학적 수용체를 구축하기 위한 탁월한 빌딩 블록이라는 것을 확신시켜 주었다. 높은 촉매 작용 속도(초당 Kcat 3860)와 결합된 높은 물리적 안정성은 전자 장치와의 직접적인 접속을 위한 이상적인 작동자가 된다. β-시트 3의 가닥 A 및 B를 연결하는 루프가 큰 도메인의 삽입을 허용할 수 있다는 관찰은 효소가 이 위치에서 분할되어 2-성분 재구성 시스템을 구성하는데 사용될 수 있는지 여부를 테스트하도록 유도하였다(도 4). 이를 위해, 라파마이신의 존재 하에 복합체를 형성하는 FRB 및 FKBP 도메인과 융합된 대장균에서 N- 및 C-말단 부분을 발현시켰다. FRB-GDH1-153은 균질성으로 생산 및 정제될 수 있는 반면, FKBP-GDH155-454는 봉입체를 형성하고 가용성 형태로 생산될 수 없었다. 분할이 단백질의 소수성 코어를 노출한다는 사실을 감안할 때 이것은 완전히 놀랍지 않다. 분리된 단백질은 일반적으로 생체내의 샤페론 시스템에 의해 어느 정도 보상될 수 있는 손상된 무결성 및 안정성으로 인하여 체외에서보다 체내에서 훨씬 더 잘 작동한다.
그러나, 본 발명자들은 GDH의 N-말단 단편이 물리적으로 안정되어 있고 분명히 자체적으로 폴딩된다는 사실에서 용기를 얻었다. 따라서 C-말단 단편이 용액 내에서 안정화될 수 있다면 원래의 계획을 진행할 수 있을 것이라고 추측하였다. 이를 위해, 가닥 A와 B를 연결하고 이의 C-말단에 FKBP 도메인을 지니는 루프 내에서 TVMV 절단 부위를 갖는 GDH 변이체를 제작하였다. 또한 활성 부위에서 촉매적으로 중요한 잔기인 Gln76, Asp143 및 His144를 Ala로 변형시켜 융합 단백질을 촉매적으로 죽게 하였다.
생성된 단백질은 가용성 형태로 재조합적으로 생산되었고 예상대로 검출 가능한 촉매 활성을 나타내지 않았다. 융합 단백질이 라파마이신의 존재 및 부재 하에 정제된 FRB-GDH1 -153과 혼합될 때, 거의 활성이 회복되지 않았다. GDH의 N- 단편 및 C-단편을 연결하는 루프를 포함하는 프로테아제 절단 부위를 소화시키고 재구성 실험을 반복하였다. 이전 사례에서와 같이 GDH 활성은 거의 회복되지 않았다. 그러나 시스템이 라파마이신에 노출되었을 때 발명자들은 GDH 활성의 신속하고 용량 의존적인 회복을 관찰하였고, 이는 GDH의 불활성화된 N-말단 단편이 FRB-융합된 GDH1 -153 단편에 의해 치환되었음을 나타낸다(도 4 및 5A). 증가된 농도의 라파마이신으로 반응을 적정하고, 관측된 속도를 이차 방정식에 맞추었다. 수득된 11 nM의 값은 Banaszynski 등(J Am Chem Soc 2005, 127: 4715-21)에 의해 이미 발표된 12 nM의 값과 잘 일치한다. 중요하게도, FK506 및 사이클로스포린과 같은 과량의 관련된 면역 억제 화합물이 바이오센서를 상당한 정도로 활성화시키지 않았기 때문에 반응은 특이적이었다.
개발된 바이오센서 구조의 일반적인 특성 테스트
다음으로 본 발명자들은 개발된 구조가 충분히 일반적이고 다른 바이오마커로 확장될 수 있는지 테스트를 착수하였다. 라파마이신(시롤리무스)이 개발된 바이오센서와 교차 반응하지 않는 사이클로스포린 및 FK506(타크로리무스)과 함께 거대 고리 면역 억제제의 종류에 속해 있기 때문에, 유사한 바이오센서가 이들 약물에 대해서도 개발될 수 있는지 궁금해졌다. 본 발명자들은 면역 억제제가 매우 좁은 치료 범위를 갖고 있으며 현재 이들에 대한 현장 치료 테스트가 존재하지 않는다는 사실에 의해 추가적으로 동기를 부여받았다.
본 발명자들은 칼시뉴린 A와 B 및 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이성화효소(PDB: 1MF8)를 갖는 시클로스포린 및 칼시뉴린 A와 B 및 FKBP(PDB:1TCO)와 복합체를 이루는 FK506의 입수 가능한 공-결정 구조를 분석하였다. 복합체의 토폴로지를 통해, 복잡한 조립체가 리간드에 의해 유도될 때 분자 근접성이 예상되는 GDH 단편의 융합 단백질을 설계할 수 있었다. 융합 단백질은 재조합 및 정제된 형태로 생산되었다(표 1). 개발된 바이오센서는 동종 약물에 대해 용량 의존적으로 반응하였고(도 5B 및 C), 비-동종 약물이 고농도로 존재하는 경우에도 검출 가능한 교차 반응성을 나타내지 않았다. 이러한 결과는 개발된 바이오센서 구조가 알려진 표적을 갖는 생체 이물질 검출에 신속하게 채택될 수 있음을 입증한다.
다음 단계에서, 본 발명자들은 개발된 바이오센서 구조가 단백질 바이오마커의 검출에 적용될 수 있는지 여부를 테스트하고자 하였다. 첫 번째 예로서, 인간의 스트레스 바이오마커로 일반적으로 사용되는 타액 α 아밀라아제를 선택하였다. 알파 아밀라아제의 이용 가능한 결정 구조를 분석하였고 VHH 도메인(PDB: 1KXQ, 1KXT, 1KXV 및 1BVN)에 결합된 돼지 α-아밀라아제의 세 가지 결정 구조를 확인하였다. 인간과 돼지의 알파 아밀라아제가 97% 서열이 동일하기 때문에, VHH 도메인이 인간 타액 α-아밀라아제를 인식할 수 있을 것으로 예상하였다. 구조 분석을 기반으로, PDB:1KXV 및 PDB:1BVN에서 추출한 VHH 도메인이 비경쟁적으로 인간 타액 알파 아밀라아제에 결합한다고 가정하였다. 따라서 VHH1BVN의 삽입으로 GDH1 -153-VHH1KXV 및 GDH 불활성 돌연변이를 갖는 융합 단백질을 구축하였고 재조합 형태로 생산하였다. 두 가지 재조합 단백질의 혼합물에 대한 인간 타액 알파 아밀라아제의 첨가는 더욱 높은 농도에서 감소하는 GDH 활성의 용량 의존적 증가를 유발하였으며, 이는 하나의 융합 단백질만이 결합된 알파 아밀라아제 복합체의 형성을 반영한다. 이러한 결과는 개발된 감지 구조가 단백질 바이오마커의 검출에 사용될 수 있음을 입증한다(도 6).
마지막으로, 본 발명자들은 개발된 센서 구조가 화학 물질보다는 효소 활성을 측정하는데 사용될 수 있는지 여부를 확인하고자 하였다. 시험 예로서 지구상에서 단백질의 가장 큰 부류를 구성하는 프로테아제를 선택하였다. 프로테아제 활성을 단편으로부터의 GDH의 재구성에 연결하기 위해, SH3 도메인 결합 펩티드가 프로테아제-소화 가능 링커를 통해 SH3 도메인에 연결된 SH3 도메인의 자가 억제된 버전을 제작하였다(도 8). 이러한 구성에서, SH3 도메인은 도메인과 이의 리간드를 연결하는 링커가 손상되지 않는 한 외부 SH3 도메인 결합 펩티드의 결합으로부터 보호된다. 본 발명자들은 자가 억제된 SH3 모듈을 GDH1 -153 C-말단으로 융합시킨 반면, SH3 펩티드는 이의 N-말단에 프로테아제 절단 부위를 갖는 불활성화 전장 GDH에 삽입되었다. 이러한 설계에서, SH3 도메인과 그이의 리간드 사이에, 그리고 GDH1-153의 불활성 N-말단과 SH3 결합 펩티드 사이에 인자 Xa 절단 부위를 배치하였다. 재조합 형태로 제조된 구조체의 용액이 함께 혼합되었을 때, 단지 적은 GDH 활성만이 검출되었고, 이는 SH3 펩티드가 효소의 재구성을 유도할 수 없음을 시사한다. 그러나, 인자 Xa의 첨가는 GDH 활성의 시간 의존적 증가를 유발하였으며, 이는 자가-억제 펩티드의 단백질 분해성 제거가 활성 복합체의 트랜스 및 재구성에서 SH3 펩티드의 결합을 가능하게 한다는 것을 나타낸다. 프로테아제 바이오센서의 보편적인 특성을 입증하기 위해, 인자 Xa 절단 부위를 트롬빈의 절단 부위로 대체하였다. 또한 트롬빈 절단 부위와 트롬빈 프로테아제를 사용하여 동일한 실험을 반복하였고 프로테아제의 존재 하에 바이오센서의 강력한 활성화를 관찰하였다.
면역 억제제와 아밀라아제의 반응 속도와 프로테아제 바이오센서의 반응률을 비교할 때, 전자가 상당히 느리게 활성화된다는 사실을 발견하였다. 본 발명자들은 이것이 상대적으로 느린 링커 소화 속도를 유발하는 트롬빈의 낮은 Km 때문인 것으로 의심하였다. 또한, 여분의 트롬빈 결합 모티프 "KTAPPFDFEAIPEEYL"(서열번호 39)을 링커에 도입하면 비생산적인 프로테아제:펩티드 복합체의 완전한 해리를 감소시킴으로써 전체 절단 반응을 가속화시킬 것이라고 추측하였다. 실제로 트롬빈 기질 서열의 두 개의 카피 및 여분의 결합 모티프의 혼입은 바이오센서의 반응률 및 민감성 모두를 증가시켰다(도 8C). 유사하게, 인자 Xa의 바이오센서의 경우, 두 개의 추가적인 절단 부위를 SH3와 SH3 결합 도메인을 연결하는 링커에 도입하면 민감성과 반응률이 증가한다(도 8E 및 도 8F).
감지 전극 제작을 위해 개발된 바이오센서의 안정성 분석
GDH 기반의 혈당 모니터의 압도적인 성공은 적어도 부분적으로는 전극상의 바이오센서의 탈수 및 대기 온도에서의 장기간 보관을 가능하게 하는 효소의 높은 안정성 때문이다. GDH의 조작된 버전이 건조되고 기능적 형태로 재수화될 수 있는지 여부를 시험하기 위해, 건조된 라파마이신 바이오센서를 상이한 온도에서 4 시간 동안 배양하였다. 데이터는 활성이 40도까지 손실되지 않았고, 약간의 활성 감소가 50도까지 관찰된 것을 보여준다. 또한, 건조된 라파마이신 바이오센서를 실온에서 14일까지 방치하였으며, 활성에서 검출 가능한 변화가 없었고 이는 감지 전극의 구성에 적합함을 나타낸다. 다음으로 상용 포텐시오스탯을 사용하여 시간 대 전류 측정에서 바이오센서의 성능을 테스트하였다. 시간 대 전류 측정은 DropSens 일회용 스크린 인쇄된 금 전극(Cat#DRP-C220BT)에 접속된 Autolab PGSTAT204 포텐시오스탯을 사용하여 수행하였다. 각각의 측정에 대해 신선한 센서를 사용하였다. 반응은 22.5 nM AMY-1,18.7 nM AMY-2 PQQ, 3.7 nM TVMV, 1.0 mM 1-메톡시-5-메틸페나지늄 메틸 설페이트, 50 mM 포도당, 2.0 mM MgCl2, 50 uM CaCl2 및 pH 7.4 PBS에서 총 부피 45 μl 중의 0, 2, 4, 6, 의 0, 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20, 30, 40 50, 100, 200, 300, 400, 600, 800 또는 1000 nM 인간 타액 알파 아밀라아제를 함유하였다. 1 mM 1-메톡시-5-메틸페나지늄 메틸 설페이트 및 50 mM 포도당의 첨가하여 반응을 개시하였고, 전극 표면에 피펫팅되기 전에 30 초 동안 실온에서 배양하였다. 180초의 대기 시간 이후, 시간 대 전류 측정은 5초 동안 +0.4 V에서 스크린 인쇄된 전극 상에 매립된 은 스트립에 대해 수행되었으며, 데이터는 일반적으로 5초 시점 대 아밀라아제 농도에서 전류로 보고되었다.
자가 억제 GDH 효소의 제작
본 발명자들은 효소의 촉매적 활성 효소를 자가 억제하는 억제 모이어티를 포함하는 GDH 효소를 더 제작하였으며, 효소는 이후 프로테아제에 의해 효소로부터 절단되어 활성을 재구성할 수 있다. 프로테아제 절단 이벤트는 또한 표적 분자의 존재에 따라 바이오센서의 상이한 성분 간의 결합 상호 작용에 연결될 수 있다. 이러한 유형의 자가 억제 효소는 효소의 활성화 및 표적 분자의 검출을 나타내는 데이터와 함께도 3A 내지 도 3E에 도시되어 있다. 억제 펩티드의 활성 부위에 대한 향상된 정착을 제공하기 위해 GDH 효소에 돌연변이가 이루어졌으며, 이들 돌연변이에서 활성 억제를 제공하는 억제 펩티드를 추가로 동정하였다. 그 결과 생성된 자가 억제 GDH 모듈은 프로테아제 활성을 검출하기 위한 일반적인 플랫폼을 제공하는데, 여기서 바이오센서의 특이성은 프로테아제 절단 부위를 각각의 프로테아제에 대한 인식 부위로 대체함으로써 변경될 수 있다.
자가 억제(AI) GDH 모듈의 유용성은, 리간드와의 상호 작용을 통해 스캐폴딩되어 작동 가능하게 연결된 결합 도메인에 작용에 의해 AI-GDH 모듈이 프로테아제에 근접하게 되는 2-성분 수용체와 같은 상이한 수용체 구조의 구축을 가능하게 한다(도 3E). 이는 개발된 AI-GDH 모듈을 기반으로 하여 구축된 라파마이신 수용체에 의해 예시된다. 또한, 동일한 AI-GDH 유닛이 도 3G에 예시된 가역적 수용체 구조에 통합될 수 있다. 또한, AI-GDH 모듈의 가역적 분석물 매개된 활성화는 GDH와 AI를 연결하는 링커 내로 리간드가 결합할 때 구조적 변화를 겪는 분석물 결합 도메인을 통합함으로써 달성될 수 있다(도 3H). 상기 실험 중 일부에서 사용된 억제 모이어티가 또한 시험관내 선별 검사를 통해 확인되었다. 더욱 구체적으로, 독립적인 기능성 단백질 도메인(예를 들어, 리포터 효소, 상응하는 활성 부위 특이적 결합제 및 분석물 특이적 결합 수용체)에서 자가 억제된 GDH 모듈은 대장균 세포 배양물의 상등액에서 직접 96 웰 플레이트 내에서 중간 처리량 분석을 사용하여 조작할 수 있다. 이를 위해, 추정되는 활성 위치 특이적 결합제(이전에 파지 디스플레이 또는 관련 스크리닝 및 선별 과정에 의해 확인됨)의 DNA 라이브러리를 유동성 링커 및 분석물 특이적 수용체로서 작용하는 TVMV에 대한 절단 부위에 의해 분리된 리포터 효소 GDH의 C-말단에 먼저 삽입하였다. 생성된 융합 단백질은 카나마이신 저항성을 부여하는 pET-28 벡터의 골격에서 주변 세포질 발현을 위해 IPTG 유도성 프로모터 및 PelB 리더 펩티드의 제어 하에 클로닝된다. 대장균 BL21 RIL로의 형질전환 이후, 세포를 카나마이신 존재 하에 한천 플레이트에 분주하고 37℃에서 밤새 성장시켰다. 다음날, 카나마이신과 클로람페니콜이 보충된 200 μL LB 배지에 개별 콜로니를 접종하고, 37℃에서 5-6 시간 동안 성장시켰다. 추정되는 자가 억제된 GDH 모듈의 발현은 이후 0.2 mM IPTG로 유도되었고 18℃에서 24 시간 동안 방치하였다. 자가 억제된 GDH 모듈을 분석하기 위해, 세포를 10분 동안 4,500 g에서 원심 분리하여 세포 배양물의 상등액을 분리하였고, 생성된 상등액(45 μL)을 TVMV 프로테아제(mg/mL 프로테아제에서 5 μL)의 존재 및 부재 하에 1 시간 동안 배양하였으며, 600 nM 2-6-디클로로페놀-인도페놀(DCPIP), 600 nM 페나진 메토설페이트(PSF), 60 nM PQQ 및 pH 7.0에서 100 mM CaCl2 및 20 mM K2HPO4로 완충된 20 mM 포도당을 사용하여 GDH 활성을 측정하였다. 620 nM에서 흡광도의 감소를 측정하여 반응을 모니터링하였다.
이 분석은 중간 처리량 시험관내 선별을 제공하여 추정되는 억제 모이어티의 처리를 허용한다.
결론
전문 시설로부터 침대 머리맡이나 농장과 같은 작용점으로 진단법과 분석법을 이동시키는 것은 개인과 사회 모두 전체에게 이익을 가져다 줄 것으로 예상된다. 그 중에는 정보에 입각한 의사 결정, 최종 사용자 참여 및 비용 절감이 있다. 현재까지, 혈당 모니터와 같은 전기화학적 바이오센서만이 광범위한 배치를 위해 성능 및 비용 기준을 충족시킨다. 혈당 모니터의 성공은 조건의 특성, 동시에 에너지원으로 작용하는 분석물의 풍부함 및 바이오센서의 현저한 안정성과 관련된다.
여기서 본 발명자들은 원친적인 바이오센서 GDH를 일반적인 바이오센서 구조로 재설계함으로써 고도로 향상된 혈당 측정기 기술을 구축한다. 효소의 현저한 생물 물리학적 안정성을 이용함으로써, 이를 개별 성분들이 활성화되지도 않고 재조합할 수 없는 2-성분의 신호 시스템으로 전환시킨다. 이는 자발적 활성화의 억제제 및 효소의 활성 절반의 정확한 접힘 및 안정성을 보장하는 샤페론 인자 모두의 역할을 하는 불활성 단편을 갖는 분할 효소를 생성함으로써 달성된다. 이는 생체외 응용에 대한 이들의 유용성을 제한하는 열등한 생물 물리학적 특성으로 종종 고통받는 그 밖의 분리된 효소 시스템과는 다른 개발된 구조를 설정한다.
개발된 시스템의 활성화는 불활성 N-말단 단편의 활성 형태로의 농도 주도 치환을 유발하는 단편의 분석물 매개 스캐폴딩을 통해 달성된다. 활성화의 동역학은 놀랍게도 신속한 것으로 보이며, 이는 N-말단 및 C-말단 복합체의 높은 오프 속도를 나타낸다. 실용적인 측면에서, 이는 시스템 응답의 빠른 속도로 해석되어 현장 진단 응용에 적합하게 한다. 본 발명자들은 저분자, 단백질 및 프로테아제 활성에 대한 다양한 바이오센서를 구축하기 위해 개발된 기본 구조를 사용하였다. 센서는 우수한 반응률, 민감성 및 선택성을 입증하였고, 이는 시스템이 실제로 모듈식이며 결합 도메인을 찾을 수 있는 모든 분석물에 실제로 적용될 수 있다. 원칙적으로 이 시스템은 반합성 시스템으로 확장될 수 있으며 저분자, DNA, RNA 및 기타 유형의 생물학적, 합성 중합체 및 번역 후 변형에 의해 매개되는 연관 이벤트를 검출하는 데 사용된다.
이는 인터넷 가능 개인 전자 장치의 흔히 볼 수 있는 존재가 오랫동안 개인 모바일 분석 및 진단 응용의 아이디어를 뒷받침하였기에 잠재적으로 중요한 암시를 갖는다. 그러나, 표준 분석 기술의 소형화는 지금까지 모바일 기기에서 쉽게 호스팅될 수 있도록 충분히 작고 저렴하며 휴대 가능한 바이오센싱 응용을 제공할 수 없었다. 본원에 제시된 접근법은 잠재적으로 모든 분석물에 대한 혈당 모니터링을 위해 개발된 저렴하고 휴대 가능한 기술의 채택을 가능하게 한다. GDH의 신속한 촉매 작용 속도 및 생성되는 전자 전류는 분자 인식 이벤트의 검출을 단순화시켜, 잠재적으로 전극의 소형화 및 다중화를 가능하게 한다.
약물 센서용 단백질 성분
라파마이신 GDH1 -153-FRB-His6 GDH1 -153 불활성 변이체-FKBP-GDH155 -454-His6
FK506 GDH1 -153-칼시뉴린 B-His6
His6-칼시뉴린 A의 공동 발현		 GDH1 -153 불활성 변이체-FKBP-GDH155 -454-His6
사이클로스포린 A GDH1 -153-칼시뉴린 B-His6
His6-칼시뉴린 A의 공동 발현		 GDH1 -153 불활성 변이체-GDH155 -454-CYPA-His6
타액 알파 아밀라아제 GDH1 -153-VHH1KXV-His6 GDH1 -153 불활성 변이체-VHH1BVN-GDH155 -454-His6
트롬빈 센서 GDH1 -153-SH3-Thr-SH3 결합 펩티드-His6 GDH1 -153 불활성 변이체-Thr-SH3 결합 펩티드155 -454-His6
인자 센서 GDH1 -153-SH3-FX-SH3 결합 펩티드-His6 GDH1 -153 불활성 변이체-FX-SH3 결합 펩티드-GDH155-454-His6
명세서 전체에 걸쳐, 목적은 본 발명을 임의의 일 실시형태 또는 특정 특징의 집합으로 제한하지 않으면서 본 발명의 바람직한 실시형태들을 설명하는 것이었다. 본 발명을 벗어나지 않고 개시되고 예시된 실시형태에 대해 다양한 변경 및 수정이 이루어질 수 있다.
본 명세서에서 언급된 각각의 특허 및 과학 문헌, 컴퓨터 프로그램 및 알고리즘의 개시는 그 전체가 참조로 포함된다.
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SEQUENCE LISTING <110> THE UNIVERSITY OF QUEENSLAND <120> ELECTROCHEMICAL BIOSENSOR <130> N409876WO <140> PCT/AU2016/050436 <141> 2016-06-01 <150> AU 2015902093 <151> 2015-06-01 <160> 61 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 454 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mature PQQ-GDH protein <400> 1 Asp Val Pro Leu Ile Pro Ser Gln Phe Ala Lys Ala Lys Ser Glu Asn 1 5 10 15 Phe Asp Lys Lys Val Ile Leu Ser Asn Leu Asn Lys Pro His Ala Leu 20 25 30 Leu Trp Gly Pro Asp Asn Gln Ile Trp Leu Thr Glu Arg Ala Thr Gly 35 40 45 Lys Ile Leu Arg Val Asn Pro Glu Ser Gly Ser Val Lys Thr Val Phe 50 55 60 Gln Val Pro Glu Ile Val Asn Asp Ala Asp Gly Gln Asn Gly Leu Leu 65 70 75 80 Gly Phe Ala Phe His Pro Asp Phe Lys Asn Asn Pro Tyr Ile Tyr Ile 85 90 95 Ser Gly Thr Phe Lys Asn Pro Lys Ser Thr Asp Lys Glu Leu Pro Asn 100 105 110 Gln Thr Ile Ile Arg Arg Tyr Thr Tyr Asn Lys Ser Thr Asp Thr Leu 115 120 125 Glu Lys Pro Val Asp Leu Leu Ala Gly Leu Pro Ser Ser Lys Asp His 130 135 140 Gln Ser Gly Arg Leu 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Asp His 130 135 140 Gln Ser Gly Arg Leu Val Ile Gly Pro Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 145 150 155 160 Gly Ala Glu Tyr Val Arg Ala Leu Phe Asp Phe Asn Gly Asn Asp Glu 165 170 175 Glu Asp Leu Pro Phe Lys Lys Gly Asp Ile Leu Arg Ile Arg Asp Lys 180 185 190 Pro Glu Glu Gln Trp Trp Asn Ala Glu Asp Ser Glu Gly Lys Arg Gly 195 200 205 Met Ile Pro Val Pro Tyr Val Glu Lys Tyr Gly Gly Ser Gly Gly Ser 210 215 220 Gly Gly Ile Glu Gly Arg Gly Ile Asp Gly Arg Gly Ile Glu Gly Arg 225 230 235 240 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Pro Pro Pro Pro Leu Pro Pro Lys 245 250 255 Arg Arg Arg Gly Gly Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu His His His His 260 265 270 His His <210> 49 <211> 498 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Component2: GDH(1-153AA, Q76A, D143A,H144A)-three Factor Xa site-SH3L-GDH(155-454AA) <400> 49 Asp Val Pro Leu Ile Pro Ser Gln Phe Ala Lys Ala Lys Ser Glu Asn 1 5 10 15 Phe Asp Lys Lys Val Ile Leu Ser Asn Leu Asn Lys Pro His Ala Leu 20 25 30 Leu Trp Gly Pro Asp Asn Gln Ile Trp Leu Thr Glu Arg Ala Thr Gly 35 40 45 Lys Ile Leu Arg Val Asn Pro Glu Ser Gly Ser Val Lys Thr Val Phe 50 55 60 Gln Val Pro Glu Ile Val Asn Asp Ala Asp Gly Ala Asn Gly Leu Leu 65 70 75 80 Gly Phe Ala Phe His Pro Asp Phe Lys Asn Asn Pro Tyr Ile Tyr Ile 85 90 95 Ser Gly Thr Phe Lys Asn Pro Lys Ser Thr Asp Lys Glu Leu Pro Asn 100 105 110 Gln Thr Ile Ile Arg Arg Tyr Thr Tyr Asn Lys Ser Thr Asp Thr Leu 115 120 125 Glu Lys Pro Val Asp Leu Leu Ala Gly Leu Pro Ser Ser Lys Ala Ala 130 135 140 Gln Ser Gly Arg Leu Val Ile Gly Pro Gly Gly Ile Glu Gly Arg Gly 145 150 155 160 Ile Asp Gly Arg Gly Ile Glu Gly Arg Gly Gly Ser Gly Pro Pro Pro 165 170 175 Pro Leu Pro Pro Lys Arg Arg Arg Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly 180 185 190 Gln Lys Ile Tyr Tyr Thr Ile Gly Asp Gln Gly Arg Asn Gln Leu Ala 195 200 205 Tyr Leu Phe Leu Pro Asn Gln Ala Gln His Thr Pro Thr Gln Gln Glu 210 215 220 Leu Asn Gly Lys Asp Tyr His Thr Tyr Met Gly Lys Val Leu Arg Leu 225 230 235 240 Asn Leu Asp Gly Ser Ile Pro Lys Asp Asn Pro Ser Phe Asn Gly Val 245 250 255 Val Ser His Ile Tyr Thr Leu Gly His Arg Asn Pro Gln Gly Leu Ala 260 265 270 Phe Thr Pro Asn Gly Lys Leu Leu Gln Ser Glu Gln Gly Pro Asn Ser 275 280 285 Asp Asp Glu Ile Asn Leu Ile Val Lys Gly Gly Asn Tyr Gly Trp Pro 290 295 300 Asn Val Ala Gly Tyr Lys Asp Asp Ser Gly Tyr Ala Tyr Ala Asn Tyr 305 310 315 320 Ser Ala Ala Ala Asn Lys Thr Ile Lys Asp Leu Ala Gln Asn Gly Val 325 330 335 Lys Val Ala Ala Gly Val Pro Val Thr Lys Glu Ser Glu Trp Thr Gly 340 345 350 Lys Asn Phe Val Pro Pro Leu Lys Thr Leu Tyr Thr Val Gln Asp Thr 355 360 365 Tyr Asn Tyr Asn Asp Pro Thr Cys Gly Glu Met Thr Tyr Ile Cys Trp 370 375 380 Pro Thr Val Ala Pro Ser Ser Ala Tyr Val Tyr Lys Gly Gly Lys Lys 385 390 395 400 Ala Ile Thr Gly Trp Glu Asn Thr Leu Leu Val Pro Ser Leu Lys Arg 405 410 415 Gly Val Ile Phe Arg Ile Lys Leu Asp Pro Thr Tyr Ser Thr Thr Tyr 420 425 430 Asp Asp Ala Val Pro Met Phe Lys Ser Asn Asn Arg Tyr Arg Asp Val 435 440 445 Ile Ala Ser Pro Asp Gly Asn Val Leu Tyr Val Leu Thr Asp Thr Ala 450 455 460 Gly Asn Val Gln Lys Asp Asp Gly Ser Val Thr Asn Thr Leu Glu Asn 465 470 475 480 Pro Gly Ser Leu Ile Lys Phe Thr Tyr Lys Ala Lys His His His His 485 490 495 His His <210> 50 <211> 478 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PQQ-GDH protein sequence before cleavage of signal sequence <400> 50 Met Asn Lys His Leu Leu Ala Lys Ile Ala Leu Leu Gly Ala Ala Gln 1 5 10 15 Leu Val Thr Leu Ser Ala Phe Ala Asp Val Pro Leu Ile Pro Ser Gln 20 25 30 Phe Ala Lys Ala Lys Ser Glu Asn Phe Asp Lys Lys Val Ile Leu Ser 35 40 45 Asn Leu Asn Lys Pro His Ala Leu Leu Trp Gly Pro Asp Asn Gln Ile 50 55 60 Trp Leu Thr Glu Arg Ala Thr Gly Lys Ile Leu Arg Val Asn Pro Glu 65 70 75 80 Ser Gly Ser Val Lys Thr Val Phe Gln Val Pro Glu Ile Val Asn Asp 85 90 95 Ala Asp Gly Gln Asn Gly Leu Leu Gly Phe Ala Phe His Pro Asp Phe 100 105 110 Lys Asn Asn Pro Tyr Ile Tyr Ile Ser Gly Thr Phe Lys Asn Pro Lys 115 120 125 Ser Thr Asp Lys Glu Leu Pro Asn Gln Thr Ile Ile Arg Arg Tyr Thr 130 135 140 Tyr Asn Lys Ser Thr Asp Thr Leu Glu Lys Pro Val Asp Leu Leu Ala 145 150 155 160 Gly Leu Pro Ser Ser Lys Asp His Gln Ser Gly Arg Leu Val Ile Gly 165 170 175 Pro Asp Gln Lys Ile Tyr Tyr Thr Ile Gly Asp Gln Gly Arg Asn Gln 180 185 190 Leu Ala Tyr Leu Phe Leu Pro Asn Gln Ala Gln His Thr Pro Thr Gln 195 200 205 Gln Glu Leu Asn Gly Lys Asp Tyr His Thr Tyr Met Gly Lys Val Leu 210 215 220 Arg Leu Asn Leu Asp Gly Ser Ile Pro Lys Asp Asn Pro Ser Phe Asn 225 230 235 240 Gly Val Val Ser His Ile Tyr Thr Leu Gly His Arg Asn Pro Gln Gly 245 250 255 Leu Ala Phe Thr Pro Asn Gly Lys Leu Leu Gln Ser Glu Gln Gly Pro 260 265 270 Asn Ser Asp Asp Glu Ile Asn Leu Ile Val Lys Gly Gly Asn Tyr Gly 275 280 285 Trp Pro Asn Val Ala Gly Tyr Lys Asp Asp Ser Gly Tyr Ala Tyr Ala 290 295 300 Asn Tyr Ser Ala Ala Ala Asn Lys Thr Ile Lys Asp Leu Ala Gln Asn 305 310 315 320 Gly Val Lys Val Ala Ala Gly Val Pro Val Thr Lys Glu Ser Glu Trp 325 330 335 Thr Gly Lys Asn Phe Val Pro Pro Leu Lys Thr Leu Tyr Thr Val Gln 340 345 350 Asp Thr Tyr Asn Tyr Asn Asp Pro Thr Cys Gly Glu Met Thr Tyr Ile 355 360 365 Cys Trp Pro Thr Val Ala Pro Ser Ser Ala Tyr Val Tyr Lys Gly Gly 370 375 380 Lys Lys Ala Ile Thr Gly Trp Glu Asn Thr Leu Leu Val Pro Ser Leu 385 390 395 400 Lys Arg Gly Val Ile Phe Arg Ile Lys Leu Asp Pro Thr Tyr Ser Thr 405 410 415 Thr Tyr Asp Asp Ala Val Pro Met Phe Lys Ser Asn Asn Arg Tyr Arg 420 425 430 Asp Val Ile Ala Ser Pro Asp Gly Asn Val Leu Tyr Val Leu Thr Asp 435 440 445 Thr Ala Gly Asn Val Gln Lys Asp Asp Gly Ser Val Thr Asn Thr Leu 450 455 460 Glu Asn Pro Gly Ser Leu Ile Lys Phe Thr Tyr Lys Ala Lys 465 470 475 <210> 51 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Inhibitory peptide <400> 51 Asn Ser Thr His His His His Phe Ala Thr Ile Trp 1 5 10 <210> 52 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Affinity Clamp <400> 52 Lys Ala Leu Leu Lys Gly Val Arg Asp Phe Asn Pro Ile Ser Ala Cys 1 5 10 15 Val Cys Leu Leu Glu Asn Ser Ser Asp Gly His Ser Glu Arg Leu Phe 20 25 30 Gly Ile Gly Phe Gly Pro Tyr Ile Ile Ala Asn Gln His Leu Phe Arg 35 40 45 Arg Asn Asn Gly Glu Leu Thr Ile Lys Thr Met His Gly Glu Phe Lys 50 55 60 Val Lys Asn Ser Thr Gln Leu Gln Met Lys Pro Val Glu Gly Arg Asp 65 70 75 80 Ile Ile Val Ile Lys Met Ala Lys Asp Phe Pro Pro Phe Pro Gln Lys 85 90 95 Leu Lys Phe Arg Gln Pro Thr Ile Lys Asp Arg Val Cys Met Val Ser 100 105 110 Thr Asn Phe Gln Gln Lys Ser Val Ser Ser Leu Val Ser Glu Ser Ser 115 120 125 His Ile Val His Lys Glu Asp Thr Ser Phe Trp Gln His Trp Ile Thr 130 135 140 Thr Lys Asp Gly Gln Cys Gly Ser Pro Leu Val Ser Ile Ile Asp Gly 145 150 155 160 Asn Ile Leu Gly Ile His Ser Leu Thr His Thr Thr Asn Gly Ser Asn 165 170 175 Tyr Phe Val Glu Phe Pro Glu Lys Phe Val Ala Thr Tyr Leu Asp Ala 180 185 190 Ala Asp Gly Trp Cys Lys Asn Trp Lys Phe Asn Ala Asp Lys Ile Ser 195 200 205 Trp Gly Ser Phe Ile Leu Trp Glu 210 215 <210> 53 <211> 608 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Calcium biosensor (PQQ-GDH with CaM insertion between residues 153 and 155) <400> 53 Asp Val Pro Leu Ile Pro Ser Gln Phe Ala Lys Ala Lys Ser Glu Asn 1 5 10 15 Phe Asp Lys Lys Val Ile Leu Ser Asn Leu Asn Lys Pro His Ala Leu 20 25 30 Leu Trp Gly Pro Asp Asn Gln Ile Trp Leu Thr Glu Arg Ala Thr Gly 35 40 45 Lys Ile Leu Arg Val Asn Pro Glu Ser Gly Ser Val Lys Thr Val Phe 50 55 60 Gln Val Pro Glu Ile Val Asn Asp Ala Asp Gly Gln Asn Gly Leu Leu 65 70 75 80 Gly Phe Ala Phe His Pro Asp Phe Lys Asn Asn Pro Tyr Ile Tyr Ile 85 90 95 Ser Gly Thr Phe Lys Asn Pro Lys Ser Thr Asp Lys Glu Leu Pro Asn 100 105 110 Gln Thr Ile Ile Arg Arg Tyr Thr Tyr Asn Lys Ser Thr Asp Thr Leu 115 120 125 Glu Lys Pro Val Asp Leu Leu Ala Gly Leu Pro Ser Ser Lys Asp His 130 135 140 Gln Ser Gly Arg Leu Val Ile Gly Pro Gly Ala Asp Gln Leu Thr Glu 145 150 155 160 Glu Gln Ile Ala Glu Phe Lys Glu Ala Phe Ser Leu Phe Asp Lys Asp 165 170 175 Gly Asp Gly Thr Ile Thr Thr Lys Glu Leu Gly Thr Val Met Arg Ser 180 185 190 Leu Gly Gln Asn Pro Thr Glu Ala Glu Leu Gln Asp Met Ile Asn Glu 195 200 205 Val Asp Ala Asp Gly Asn Gly Thr Ile Asp Phe Pro Glu Phe Leu Thr 210 215 220 Met Met Ala Arg Lys Met Lys Asp Thr Asp Ser Glu Glu Glu Ile Arg 225 230 235 240 Glu Ala Phe Arg Val Phe Asp Lys Asp Gly Asn Gly Tyr Ile Ser Ala 245 250 255 Ala Glu Leu Arg His Val Met Thr Asn Leu Gly Glu Lys Leu Thr Asp 260 265 270 Glu Glu Val Asp Glu Met Ile Arg Glu Ala Asp Ile Asp Gly Asp Gly 275 280 285 Gln Val Asn Tyr Glu Glu Phe Val Gln Met Met Thr Ala Gly Gln Lys 290 295 300 Ile Tyr Tyr Thr Ile Gly Asp Gln Gly Arg Asn Gln Leu Ala Tyr Leu 305 310 315 320 Phe Leu Pro Asn Gln Ala Gln His Thr Pro Thr Gln Gln Glu Leu Asn 325 330 335 Gly Lys Asp Tyr His Thr Tyr Met Gly Lys Val Leu Arg Leu Asn Leu 340 345 350 Asp Gly Ser Ile Pro Lys Asp Asn Pro Ser Phe Asn Gly Val Val Ser 355 360 365 His Ile Tyr Thr Leu Gly His Arg Asn Pro Gln Gly Leu Ala Phe Thr 370 375 380 Pro Asn Gly Lys Leu Leu Gln Ser Glu Gln Gly Pro Asn Ser Asp Asp 385 390 395 400 Glu Ile Asn Leu Ile Val Lys Gly Gly Asn Tyr Gly Trp Pro Asn Val 405 410 415 Ala Gly Tyr Lys Asp Asp Ser Gly Tyr Ala Tyr Ala Asn Tyr Ser Ala 420 425 430 Ala Ala Asn Lys Thr Ile Lys Asp Leu Ala Gln Asn Gly Val Lys Val 435 440 445 Ala Ala Gly Val Pro Val Thr Lys Glu Ser Glu Trp Thr Gly Lys Asn 450 455 460 Phe Val Pro Pro Leu Lys Thr Leu Tyr Thr Val Gln Asp Thr Tyr Asn 465 470 475 480 Tyr Asn Asp Pro Thr Cys Gly Glu Met Thr Tyr Ile Cys Trp Pro Thr 485 490 495 Val Ala Pro Ser Ser Ala Tyr Val Tyr Lys Gly Gly Lys Lys Ala Ile 500 505 510 Thr Gly Trp Glu Asn Thr Leu Leu Val Pro Ser Leu Lys Arg Gly Val 515 520 525 Ile Phe Arg Ile Lys Leu Asp Pro Thr Tyr Ser Thr Thr Tyr Asp Asp 530 535 540 Ala Val Pro Met Phe Lys Ser Asn Asn Arg Tyr Arg Asp Val Ile Ala 545 550 555 560 Ser Pro Asp Gly Asn Val Leu Tyr Val Leu Thr Asp Thr Ala Gly Asn 565 570 575 Val Gln Lys Asp Asp Gly Ser Val Thr Asn Thr Leu Glu Asn Pro Gly 580 585 590 Ser Leu Ile Lys Phe Thr Tyr Lys Ala Lys His His His His His His 595 600 605 <210> 54 <211> 754 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GDH[TVMV]-VH[B6]-FKBP12 <400> 54 Asp Val Pro Leu Ile Pro Ser Gln Phe Ala Lys Ala Lys Ser Glu Asn 1 5 10 15 Phe Asp Lys Lys Val Ile Leu Ser Asn Leu Asn Lys Pro His Ala Leu 20 25 30 Leu Trp Gly Pro Asp Asn Gln Ile Trp Leu Thr Glu Arg Ala Thr Gly 35 40 45 Lys Ile Leu Arg Val Asn Pro Glu Ser Gly Ser Val Lys Thr Val Phe 50 55 60 Gln Val Pro Glu Ile Val Asn Asp Ala Asp Gly Gln Asn Gly Leu Leu 65 70 75 80 Gly Phe Ala Phe His Pro Asp Phe Lys Asn Asn Pro Tyr Ile Tyr Ile 85 90 95 Ser Gly Thr Phe Lys Asn Pro Lys Ser Thr Asp Lys Glu Leu Pro Asn 100 105 110 Gln Thr Ile Ile Arg Arg Tyr Thr Tyr Asn Lys Ser Thr Asp Thr Leu 115 120 125 Glu Lys Pro Val Asp Leu Leu Ala Gly Leu Pro Ser Ser Lys Asp His 130 135 140 Gln Ser Gly Arg Leu Val Ile Gly Pro Asp Gln Lys Ile Tyr Tyr Thr 145 150 155 160 Ile Gly Asp Gln Gly Arg Asn Gln Leu Ala Tyr Leu Phe Leu Pro Asn 165 170 175 Gln Ala Gln His Thr Pro Thr Gln Gln Glu Leu Asn Gly Lys Asp Tyr 180 185 190 His Thr Tyr Met Gly Lys Val Leu Arg Leu Asn Leu Asp Gly Ser Ile 195 200 205 Pro Lys Asp Asn Pro Ser Phe Asn Gly Val Val Ser His Ile Tyr Thr 210 215 220 Leu Gly His Arg Asn Pro Gln Gly Leu Ala Phe Thr Pro Asn Gly Lys 225 230 235 240 Leu Leu Gln Ser Glu Gln Gly Pro Asn Ser Asp Asp Glu Ile Asn Leu 245 250 255 Ile Val Lys Gly Gly Asn Tyr Gly Trp Pro Asn Val Ala Gly Tyr Lys 260 265 270 Asp Asp Ser Gly Tyr Ala Tyr Ala Asn Tyr Ser Ala Ala Ala Asn Lys 275 280 285 Thr Ile Lys Asp Leu Ala Gln Asn Gly Val Lys Val Ala Ala Gly Val 290 295 300 Pro Val Thr Lys Glu Ser Glu Trp Thr Gly Lys Asn Phe Val Pro Pro 305 310 315 320 Leu Lys Thr Leu Tyr Thr Val Gln Asp Thr Tyr Asn Tyr Asn Asp Pro 325 330 335 Thr Cys Gly Glu Met Thr Tyr Ile Cys Trp Pro Thr Val Ala Pro Ser 340 345 350 Ser Ala Tyr Val Tyr Lys Gly Gly Lys Lys Ala Ile Thr Gly Trp Glu 355 360 365 Asn Thr Leu Leu Val Pro Ser Leu Lys Arg Gly Val Ile Phe Arg Ile 370 375 380 Lys Leu Asp Pro Thr Tyr Ser Thr Thr Tyr Asp Asp Ala Val Pro Met 385 390 395 400 Phe Lys Ser Asn Asn Arg Tyr Arg Asp Val Ile Ala Ser Pro Asp Gly 405 410 415 Asn Val Leu Tyr Val Leu Thr Asp Thr Ala Gly Asn Val Gln Lys Asp 420 425 430 Asp Gly Ser Val Thr Asn Thr Leu Glu Asn Pro Gly Ser Leu Ile Lys 435 440 445 Phe Thr Tyr Lys Ala Lys Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 450 455 460 Gly Glu Thr Val Arg Phe Gln Ser Gly Gly Ser Gly Gly Thr Gly Gly 465 470 475 480 Ser Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Met Ala Glu Val Gln Leu 485 490 495 Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu 500 505 510 Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Arg Phe Ser Asp Glu Asp Met Gly Trp 515 520 525 Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ala 530 535 540 Ser His Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe 545 550 555 560 Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn 565 570 575 Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Thr Val 580 585 590 Asp Gly Phe Ser Arg Ile Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 595 600 605 Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Gly Gly Ser Gly Gly Thr Ser Gly 610 615 620 Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Gln 625 630 635 640 Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro Lys Arg Gly 645 650 655 Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp Gly Lys Lys 660 665 670 Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe Met Leu Gly 675 680 685 Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala Gln Met Ser 690 695 700 Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr Ala Tyr Gly 705 710 715 720 Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr Leu Val Phe 725 730 735 Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu Gly Gly Thr Gly His His His His 740 745 750 His His <210> 55 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH[B6] <400> 55 Ala Met Ala Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 1 5 10 15 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Arg Phe 20 25 30 Ser Asp Glu Asp Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Ser Ala Ile Ala Ser His Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala 50 55 60 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 65 70 75 80 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Lys Thr Val Asp Gly Phe Ser Arg Ile Thr Phe Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala 115 120 125 <210> 56 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Inhibitory peptide identified by phage display Fig 3B <400> 56 Ser His Asp Ile His Tyr Met 1 5 <210> 57 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GSGS linker <400> 57 Gly Ser Gly Ser 1 <210> 58 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cross-binder, a calmodulin binding peptide <400> 58 Gly Val Met Pro Arg Glu Glu Thr Asp Ser Lys Thr Ala Ser Pro Trp 1 5 10 15 Lys Ser Ala Arg Leu Met Val His Thr Val Ala Thr Phe Asn Ser Ile 20 25 30 Lys Glu Leu Asn Glu Arg Trp Arg Ser Leu Gln Gln Leu Ala 35 40 45 <210> 59 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Positions 340-344 of SEQ ID NO: 1 <400> 59 Glu Met Thr Tyr 1 <210> 60 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Positions 340-344 of SEQ ID NO: 1 <400> 60 Glu Met Thr Tyr Ile 1 5 <210> 61 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant sequence <400> 61 Ser Ser Ser Tyr Ser 1 5

Claims (45)

  1. 촉매적 활성 상태에 있을 때 기질 분자와 반응하여 하나 이상의 전자를 생성할 수 있는 효소의 적어도 하나의 아미노산 서열; 및 효소를 촉매적 불활성 상태에서 해제 가능하게 유지하는 적어도 하나의 이종 센서 아미노산 서열을 포함하는 바이오센서로서, 이종 센서 아미노산 서열은 표적 분자에 반응하여 효소의 아미노산 서열을 촉매적 불활성 상태에서 상기 촉매적 활성 상태로 전환시키는 바이오센서.
  2. 제 1 항에 있어서,
    적어도 하나의 효소 아미노산 서열 및 상기 적어도 하나의 이종 센서 아미노산 서열은 하나의 인접한 아미노산 서열 내에 존재하거나 또는 이의 적어도 일부를 형성하는, 바이오센서.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 이종 센서 아미노산 서열은 상기 적어도 하나의 효소 아미노산 서열 내의 삽입체이고, 상기 촉매적 불활성 상태와 상기 촉매적 활성 상태 사이에서 효소 아미노산 서열의 전환을 용이하게 하는, 바이오센서.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    이종 센서 아미노산 서열은 상기 표적 분자와 결합하여 효소의 아미노산 서열을 촉매적 불활성 상태에서 상기 촉매적 활성 상태로 전환시키는, 바이오센서.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    이종 센서 아미노산 서열은 칼슘-결합 단백질의 아미노산 서열 또는 이의 단편인, 바이오센서.
  6. 제 5 항에 있어서,
    칼슘-결합 단백질은 칼모듈린인, 바이오센서.
  7. 촉매적 활성 상태에 있을 때 기질 분자와 반응하여 하나 이상의 전자를 생성할 수 있는 효소의 적어도 하나의 아미노산 서열; 및 효소를 촉매적 불활성 상태에서 해제 가능하게 유지하도록 조작된 상기 효소의 적어도 하나의 다른 아미노산 서열을 포함하는 바이오센서로서, 상기 바이오센서는 표적 분자에 반응하여 효소의 아미노산 서열을 촉매적 불활성 상태에서 상기 촉매적 활성 상태로 전환시키는 바이오센서.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 효소의 상기 적어도 하나의 다른 아미노산 서열은 하나 이상의 아미노산 서열 변이를 포함하도록 조작되는, 바이오센서.
  9. 제 8 항에 있어서,
    촉매적 활성 상태에 있을 때 기질 분자와 반응하여 하나 이상의 전자를 생성할 수 있는 효소의 상기 적어도 하나의 아미노산 서열 및 효소를 촉매적 불활성 상태에서 해제 가능하게 유지하도록 조작된 상기 효소의 상기 적어도 하나의 다른 아미노산 서열은 비-공유 상호 작용하는, 바이오센서.
  10. 제 9 항에 있어서,
    효소를 촉매적 불활성 상태에서 해제 가능하게 유지하도록 조작된 상기 효소의 상기 적어도 하나의 다른 아미노산 서열을 치환할 수 있는 상기 효소의 또 다른 아미노산 서열을 더 포함하는 바이오센서.
  11. 제 10 항에 있어서,
    치환은 상기 효소의 상기 또 다른 아미노산 서열을, 기질과 반응하여 기능성 촉매적 활성 효소를 형성할 수 있는 효소의 상기 적어도 하나의 아미노산 서열과 비-공유 결합시킴으로써 효소의 촉매 활성을 회복시키는, 바이오센서.
  12. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서,
    상기 효소의 상기 또 다른 아미노산 서열 및 기질과 반응할 수 있는 효소의 상기 적어도 하나의 아미노산 서열은, 표적 분자와 결합함으로써 상기 또 다른 아미노산 서열에 의한 조작된 아미노산 서열의 치환을 용이하게 하도록 상호 작용할 수 있는 각각의 결합 모이어티를 포함하는, 바이오센서.
  13. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서,
    상기 효소의 상기 조작된 아미노산 서열 및 기질과 반응할 수 있는 효소의 상기 적어도 하나의 아미노산 서열은 처음에 상호 작용하는 각각의 결합 모이어티를 포함하고, 이러한 상호 작용은 이후 표적 분자와 결합하는 하나의 또는 또 다른 결합 모이어티에 의해 파괴되어 상기 또 다른 아미노산 서열에 의한 조작된 아미노산 서열의 치환을 용이하게 하는, 바이오센서.
  14. 제 7 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    효소의 적어도 하나의 아미노산 서열은 상기 효소의 제 1 단편 서열을 나타내고, 상기 효소의 적어도 하나의 다른 아미노산 서열 또는 또 다른 아미노산 서열은 상기 효소의 제 2 단편 서열을 나타내며, 상기 제 1 및 제 2 단편 서열은 비-공유 상호 작용하여 안정한 효소를 재구성할 수 있는, 바이오센서.
  15. 제 7 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    프로테아제 표적 분자를 검출하기에 적합하고, 상기 효소의 상기 아미노산 서열 내에 하나 이상의 프로테아제 절단 부위를 포함하며, 선택적으로 상기 아미노산 서열은 프로테아제의 결합 및/또는 절단 효율을 향상시키는 서열을 더 포함하는, 바이오센서.
  16. 제 15 항에 있어서,
    기질과 반응할 수 있는 효소의 상기 적어도 하나의 아미노산 서열 및 효소의 상기 또 다른 아미노산 서열은 이들 간의 결합 억제제의 프로테아제 절단 이후 상호 작용할 수 있는 각각의 결합 모이어티를 포함하는, 바이오센서.
  17. 촉매적 활성 상태에 있을 때 기질 분자와 반응하여 하나 이상의 전자를 생성할 수 있는 효소의 적어도 하나의 아미노산 서열; 표적 분자와 결합할 수 있는 결합 모이어티; 및 표적 분자의 부재 하에 결합 모이어티와 상호 작용하여 효소를 억제할 수 있는 적어도 하나의 효소 억제제를 포함하는 바이오센서로서, 표적 분자가 상기 적어도 하나의 효소 억제제와 결합 모이어티 간의 상호 작용을 해제시킴으로써 억제제에 의한 효소의 억제를 해제시키고 효소의 아미노산 서열을 촉매적 불활성 상태에서 상기 촉매적 활성 상태로 전환시킬 수 있도록 구성되는 바이오센서.
  18. 제 17 항에 있어서,
    촉매적 활성 상태에 있을 때 기질 분자와 반응하여 하나 이상의 전자를 생성할 수 있는 효소의 적어도 하나의 아미노산 서열; 하나 이상의 프로테아제 절단 부위에 의해 효소에 연결 또는 결합된 상기 효소의 억제제; 및 제 1 성분 결합 모이어티를 포함하는 제 1 성분; 제 1 성분 결합 모이어티와 결합할 수 있는 제 2 성분 결합 모이어티; 프로테아제 아미노산 서열; 및 표적 분자와 결합할 수 있는 또 다른 제 2 성분 결합 모이어티를 포함하는 제 2 성분; 및 표적 분자의 부재 하에 상기 제 2 성분 결합 모이어티와 상호 작용할 수 있는 제 3 성분 결합 모이어티를 포함하는 제 3 성분을 포함하고, 상기 표적 분자가 제 3 성분 결합 모이어티와 상기 제 2 성분 결합 모이어티 간의 결합을 치환하여 상기 제 1 성분 결합 모이어티와 상기 제 2 성분 결합 모이어티 간의 상호 작용을 촉진시키고, 이에 따라 프로테아제가 프로테아제 절단 부위(들)를 절단하여 억제제에 의한 효소의 억제를 제거하고 따라서 효소를 촉매적 불활성 상태에서 촉매적 활성 상태로 전환시키도록 구성되는 바이오센서.
  19. 제 18 항에 있어서,
    상기 프로테아제 절단 부위에 인접하게 위치한 프로테아제의 결합 및/또는 절단 효율을 향상시키는 서열을 더 포함하는 바이오센서.
  20. 제 18 항 또는 제 19 항에 있어서,
    제 3 성분 결합 모이어티는 상기 제 2 성분 결합 모이어티 중 하나와 상호 작용할 수 있는 제 1 부분 및 표적 분자의 부재하에 상기 제 2 성분 결합 모이어티 중 또 다른 하나와 상호 작용할 수 있는 제 2 부분을 포함하는, 바이오센서.
  21. 제 20 항에 있어서,
    상기 제 2 성분 결합 모이어티 중 상기 또 다른 하나에 의한 표적 분자의 결합은 제 3 성분의 제 2 부분의 결합을 억제하는, 바이오센서.
  22. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 효소는 포도당 탈수소효소와 같은 산화환원효소인, 바이오센서.
  23. 표적 분자에 반응하는 이종 센서 아미노산 서열을 포함하는 포도당 탈수소효소(glucose dehydrogenase, GDH)로서, 표적 분자의 결합은 효소의 촉매 활성을 조절하도록 작용하는, 포도당 탈수소효소.
  24. 제 23 항에 있어서,
    이종 센서 아미노산 서열은 칼슘-결합 단백질의 아미노산 서열 또는 이의 기능성 단편인, 포도당 탈수소효소
  25. 효소의 촉매 활성을 방지 또는 감소시키도록 작용하는 억제 모이어티를 포함하는 산화환원효소로서, 상기 억제 모이어티는 하나 이상의 분자의 존재 하에 치환되어 효소의 촉매 활성을 활성화시킬 수 있는, 산화환원효소.
  26. 제 25 항에 있어서,
    하나 이상의 프로테아제 절단 부위를 포함하고, 프로테아제에 의한 상기 부위의 절단은 억제 모이어티를 치환하여 효소의 촉매 활성을 활성화시키고, 선택적으로 프로테아제의 결합 및/또는 절단 효율을 향상시키는 서열을 더 포함하는 산화환원효소.
  27. 제 25 항 또는 제 26 항에 있어서,
    추가 분자 상에서 각각의 결합 모이어티와 상호 작용할 수 있는 결합 모이어티를 포함하고, 결합 모이어티 간의 상호 작용은 억제 잔기를 치환하여 효소의 촉매 활성을 활성화시키는, 산화환원효소.
  28. 제 27 항에 있어서,
    하나 이상의 프로테아제 절단 부위를 포함하고, 추가의 분자는 프로테아제를 더 포함하고, 결합 모이어티 간의 상호 작용은 프로테아제를 상기 부위와 근접하게 하여 상기 부위를 절단하고 억제 모이어티를 치환하도록 작용하는, 산화환원효소.
  29. 제 25 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
    산화환원효소는 포도당 탈수소효소인, 산화환원효소.
  30. 포도당 탈수소효소(GDH)의 제 1 단편 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 효소의 제 2 단편 서열을 포함하는 폴리펩티드와 비-공유 상호 작용하여 안정한 GDH 효소를 재구성할 수 있는 폴리펩티드.
  31. 제 30 항의 GDH 효소의 제 1 단편 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 효소의 제 2 단편 서열을 포함하는 상기 폴리펩티드와 안정한 촉매적 활성 GDH 효소를 재구성할 수 있는 폴리펩티드.
  32. 제 30 항의 GDH 효소의 제 1 단편 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 재구성된 안정한 GDH 효소를 촉매적으로 불활성이 되도록 하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 폴리펩티드.
  33. 제 30 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항의 GDH 효소의 제 1 단편 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 효소의 제 2 단편 서열을 포함하는 상기 폴리펩티드 내에 포함된 각각의 결합 모이어티와 상호 작용할 수 있는 결합 모이어티를 포함하고, 결합 모이어티 간의 상호 작용은 재구성된 안정한 포도당 탈수소효소의 촉매 활성을 조절하는, 폴리펩티드.
  34. 제 33 항의 GDH 효소의 제 1 단편 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 결합 모이어티 간의 상호 작용은 표적 분자의 결합에 의해 조절되는, 폴리펩티드.
  35. 제 33 항 또는 제 34 항의 GDH 효소의 제 1 단편 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 각각의 결합 모이어티의 상호 작용을 억제하는 서열 및 하나 이상의 프로테아제 절단 부위를 더 포함하고, 프로테아제에 의한 절단은 결합 모이어티 간의 상호 작용을 제공하며, 선택적으로 프로테아제의 결합 및/또는 절단 효율을 향상시키는 서열을 더 포함하는 폴리펩티드.
  36. 제 1 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 정의된 바이오센서, 포도당 탈수소효소, 산화환원효소 또는 포도당 탈수소효소의 제 1 및 제 2 단편 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 조성물 또는 키트.
  37. 제 36 항에 있어서,
    기질 분자를 더 포함하는 조성물 또는 키트.
  38. 표적 분자를 검출하는 방법으로서, 상기 방법은 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항의 바이오센서 또는 제 36 항 또는 제 37 항의 조성물을 시료에 접촉시켜 시료 중의 표적 분자의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  39. 제 38 항에 있어서,
    포유동물 내에서 성능 향상 물질 또는 불법 약물을 검출하기 위한 방법.
  40. 유기체 내의 질병 또는 질환의 진단 방법으로서, 상기 방법은 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항의 바이오센서 또는 제 36 항 또는 제 37 항의 조성물을 유기체로부터 수득된 생물학적 시료에 접촉시켜 생물학적 시료 중의 표적 분자의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하고, 표적 분자의 존재 또는 부재의 결정은 질병 또는 질환의 진단을 용이하게 하는 방법.
  41. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항의 바이오센서, 제 23 항 또는 제 24 항의 포도당 탈수소효소(GDH), 제 25 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항의 산화환원효소 또는 제 30 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에서 정의된 GDH 효소의 제 1 및 제 2 단편 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 세포 또는 챔버를 포함하는 검출 장치.
  42. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항의 바이오센서, 제 23 항 또는 제 24 항의 포도당 탈수소효소(GDH), 제 25 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항의 산화환원효소 또는 제 30 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에서 정의된 GDH 효소의 제 1 및 제 2 단편 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 분리된 핵산.
  43. 제 42 항의 분리된 핵산을 포함하는 유전자 구조체.
  44. 제 43 항의 유전자 구조체를 포함하는 숙주 세포.
  45. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에서 정의된 재조합 단백질 바이오센서 또는 이의 구성 요소, 제 23 항 또는 제 24 항의 포도당 탈수소효소(GDH), 제 25 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항의 산화환원효소 또는 제 30 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에서 정의된 GDH 효소의 제 1 및 제 2 단편 서열을 포함하는 폴리펩티드를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 제 44 항의 숙주 세포에서 재조합 단백질 바이오센서 또는 이의 구성 요소 또는 GDH 효소 또는 산화환원효소 또는 GDH 효소의 제 1 또는 제 2 단편 서열을 포함하는 폴리펩티드를 생산하는 단계를 포함하는 방법.
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