CN107849544A - 电化学生物传感器 - Google Patents

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Abstract

本发明提供生物传感器，其包括能够与底物反应以产生一个或多个电子的酶（例如葡萄糖脱氢酶）的氨基酸序列，其中所述酶已经被设计成响应于结合靶分子而从催化失活状态转变为催化活性状态。本发明还提供了检测靶分子的方法，其中酶（如葡萄糖脱氢酶）响应于靶分子的结合从催化失活状态转换至催化活性状态，使得该酶与底物反应以产生一个或多个电子。

Description

电化学生物传感器
技术领域
本发明涉及生物传感器。更具体地说，本发明涉及电化学生物传感器以及适于检测样品中的一种或多种目标分子的电化学活性酶或其片段。生物传感器分子也可涉及合成生物学领域，例如用于构建人工细胞信号传导网络。
背景
生物样品中目标分子或分析物的检测对于健康和疾病的诊断监测至关重要。分析物检测的关键要求是特异性和灵敏度，尤其是当目标分子或分析物在生物样品中的含量或浓度有限时。
通常，特异性由特异性结合分析物的单克隆抗体提供。灵敏度通常由与特异性抗体结合的或与辅助检测相对低水平的分析物的第二抗体结合的标签来提供。这种诊断方法已经众所周知并且以酶联免疫吸附夹心测定(ELISA)形式广泛使用。在一些情况下，酶扩增可以进一步提高灵敏度，例如通过使用催化相同反应的酶原裂解反应的产物来实现。这种“自催化”酶的一些例子是胰蛋白酶原、胃蛋白酶原或血液凝固因子XII。然而，就特异性而言，抗体相对昂贵并且对某些分析物而言难以产生足够的特异性。多克隆抗体也具有相同的缺点，甚至更难以大规模生产和纯化。
目前用于检测特定目标分子和分析物以用于预后或诊断目的的方法受到许多限制，这大大限制了它们在临床、围手术期和床旁环境中的广泛应用。最重要的是，绝大多数诊断分析需要大量的技术专业知识和一系列昂贵而特异性试剂(最著名的是单克隆抗体)以及精密的生物医学基础设施，而这些基础设施很难在专业实验室环境之外获得。例如，ELISA(用于检测复杂生物样品中特定分析物的金标准)依靠在固体表面上选择性捕获目标分析物，而固体表面则依靠对目标分析物特异的第二种亲和试剂进行检测。ELISA还具有大量的孵育和洗涤步骤，这通常是耗时且难以标准化的，因为众多连续步骤经常在不同程序、操作者和实验室中引入显著差异，使定量比较变得困难。
发明内容
本发明致力于开发定量的、相对便宜的和容易生产的分子生物传感器，其容易在与治疗方案相容的短时间内检测目标分子(例如分析物)的存在或活性。这样的生物传感器既可以单独应用，也可以组合使用，以验证和/或诊断分子表型，并具有高特异性和高统计可信度，而与无关的生理过程中的遗传背景和自然变化无关。这样的分子生物传感器可以用于其他测试程序，例如目标分子或分析物是非法药物或提高比赛成绩的药物的情况。
更具体地说，本发明提供了一种分子生物传感器，其特别适用于并入诸如床旁照护设备之类的电子设备中以用于分析和传输诊断结果。
因此，本发明的一个目的是提供一种生物传感器分子，其对靶分子具有特异性并且可以对靶分子的检测产生电响应。
在一个广泛的形式中，本发明涉及一种生物传感器，其包含能够与底物反应以产生一个或多个电子的酶的氨基酸序列，其中所述酶已被改造为可响应目标分子的结合而从催化失活状态转换成催化活性状态。
在第一方面，本发明提供了一种生物传感器，其包含能够在催化活性状态下与底物分子反应以产生一个或多个电子的酶的至少一个氨基酸序列；和可释放地(releasably)将酶保持在催化失活状态的至少一个异源传感氨基酸序列，其中所述异源传感氨基酸序列对靶分子有应答以将所述酶的氨基酸序列从催化失活状态转换成催化活性状态。因此，异源传感氨基酸序列可逆地调节酶的催化活性。在靶分子存在的情况下，异源传感氨基酸序列可被置换，从而催化激活酶。异源传感氨基酸序列可以别构调节酶的催化活性。
合适地，所述至少一个酶氨基酸序列和所述至少一个异源传感氨基酸序列存在于单个连续氨基酸序列中或形成单个连续氨基酸序列的至少一部分。
在一个具体的实施方案中，所述至少一个异源传感氨基酸序列是所述至少一个酶氨基酸序列中的插入片段，从而有利于在所述催化失活状态和所述催化活性状态之间转换酶氨基酸序列。
合适地，所述异源传感氨基酸序列结合所述靶分子，从而将酶的氨基酸序列从催化失活状态转换为所述催化活性状态。
在一个实施方案中，所述异源传感氨基酸序列是钙结合蛋白或其片段的氨基酸序列。在一个具体的实施方案中，所述钙结合蛋白是钙调蛋白。
在第二个方面，本发明提供了一种生物传感器，其包含能够在催化活性状态下与底物分子反应以产生一个或多个电子的酶的至少一个氨基酸序列；以及所述酶的至少一个其他氨基酸序列，所述至少一个其他氨基酸序列被工程化以将所述酶可释放地保持在催化失活状态，其中所述生物传感器响应于靶分子以将所述酶的氨基酸序列从催化失活状态转换至所述催化活性状态。
合适地，所述酶的所述至少一个其他氨基酸序列被工程化以包含一个或多个氨基酸序列突变。合适地，当处于催化活性状态时能够与底物分子反应以产生一个或多个电子的所述酶的至少一个氨基酸序列，与被工程化以将酶可释放地保持在催化失活状态的所述酶的所述至少一个其他氨基酸序列，非共价地相互作用。在一个实施方案中，该方面的生物传感器进一步包含所述酶的再一个氨基酸序列，其能够置换所述被工程化以将酶可释放地维持在催化失活状态的所述酶的所述至少一个其他氨基酸序列。通常，这种置换通过将所述酶的所述再一个氨基酸序列与所述能够与底物反应的酶的所述至少一个氨基酸序列非共价组合来恢复所述酶的催化活性，以形成功能性催化活性酶。在一个广义的实施方案中，所述酶的所述再一个氨基酸序列和能够与底物反应的所述酶的至少一个氨基酸序列包含各自的结合部分，所述结合部分可以例如通过结合靶分子而相互作用以促进用所述再一个氨基酸序列置换所述工程化的氨基酸序列。
因此，第二个方面的具体实施方案提供了一种生物传感器，其包含第一组分和第二组分，所述第一组分包含:能够在催化活性状态下与底物分子反应以产生一个或多个电子的酶的至少一个氨基酸序列；第一结合部分；以及所述酶的至少一个其他氨基酸序列，所述至少一个其他氨基酸序列被工程化以将所述酶可释放地保持在催化失活状态；并且所述第二组分包含:所述酶的至少一个其他氨基酸序列和第二结合部分；所述第一结合部分和第二结合部分之间的相互作用促进所述第一组分的所述至少一个其他氨基酸序列被所述第二组分的所述至少一个其他氨基酸序列置换，从而将所述第一组分从催化失活状态转化为催化活性状态。
在另一个广义的实施方案中，所述酶的所述工程化氨基酸序列和能够与底物反应的所述酶的所述至少一个氨基酸序列包含各自的结合部分，这些结合部分起初相互作用，随后所述相互作用因其中一个或另一个结合部分结合靶分子而被破坏。这种相互作用的破坏促进了所述再一个氨基酸序列对工程化的氨基酸序列的置换。
因此，第二个方面的另一特定实施方案提供了一种生物传感器，其包含第一组分和第二组分，所述第一组分包含:能够在催化活性状态下与底物分子反应以产生一个或多个电子的酶的至少一个氨基酸序列；第一结合部分；以及所述酶的至少一个其他氨基酸序列，所述至少一个其他氨基酸序列被工程化以将所述酶可释放地保持在催化失活状态；并且所述第二组分包含:所述酶的至少一个其他氨基酸序列和第二结合部分；所述第一结合部分和所述第二结合部分之间的相互作用被能够结合所述第一或第二结合部分的靶分子释放，以促进所述第一分子的所述至少一个其他氨基酸序列被第二分子的所述至少一个其他氨基酸序列置换，从而使第一组分的酶从催化失活状态转换为催化活性状态。
在另一个广义的实施方案中，第二个方面的生物传感器适用于检测蛋白酶靶分子，因此通常包含一个或多个(例如两个或三个)蛋白酶切割位点。优选地，该一个或多个蛋白酶切割位点位于能够置换工程化的氨基酸序列的、所述酶的所述再一个氨基酸序列处。所述再一个氨基酸序列可以进一步包含增强蛋白酶的结合和/或切割效率的序列，其可以位于蛋白酶切割位点附近。
优选地，所述能够与底物反应的酶的至少一个氨基酸序列和该酶的所述再一个氨基酸序列包含各自的结合部分，所述结合部分可以在蛋白酶切割这些结合部分的结合抑制剂后相互作用。这种相互作用促进了所述再一个氨基酸序列对工程化的氨基酸序列的置换。
因此，第二个方面的另一特定实施方案提供了一种生物传感器，其包含第一组分和第二组分，所述第一组分包含:能够在催化活性状态下与底物分子反应以产生一个或多个电子的酶的至少一个氨基酸序列；第一结合部分；以及所述酶的至少一个其他氨基酸序列，所述至少一个其他氨基酸序列经工程改造以将所述酶可释放地保持在催化失活状态；并且所述第二组分包含所述酶的至少一个其他氨基酸序列和通过蛋白酶切割位点连接至抑制剂的第二结合部分，其中所述抑制剂阻止或抑制所述第一结合部分和所述第二结合部分之间的相互作用；所述抑制剂被切割所述蛋白酶切割位点的蛋白酶靶分子释放，以促进所述第一结合部分和第二结合部分之间的相互作用，从而促进第一分子的所述至少一个其他氨基酸序列被第二分子的所述至少一个其他氨基酸序列置换，从而将第一组分的酶从催化失活状态转换为催化活性状态。
在一个具体的实施方案中，所述抑制剂与第一结合部分基本上是相同的分子。
在第三个方面，本发明提供了一种生物传感器，其包含能够在催化活性状态下与底物分子反应以产生一个或多个电子的酶的至少一个氨基酸序列；能够结合靶分子的结合部分；和至少一种酶抑制剂，其能够在不存在靶分子的情况下与所述结合部分相互作用从而抑制所述酶；所述靶分子可以释放所述至少一种酶抑制剂和所述结合部分之间的相互作用，从而释放抑制剂对酶的抑制，并将酶的氨基酸序列从催化失活状态转换到所述催化活性状态。
第三个方面的一个实施方案提供了一种生物传感器，其包含第一组分、第二组分和第三组分，所述第一组分包含:能够在催化活性状态下与底物分子反应以产生一个或多个电子的酶的至少一个氨基酸序列；通过蛋白酶切割位点与该酶连接或偶联的所述酶的抑制剂；和第一组分结合部分；所述第二组分包含:能够结合所述第一组分结合部分的第二组分结合部分；蛋白酶氨基酸序列；和能够结合靶分子的另一第二组分结合部分；所述第三组分包含第三组分结合部分，所述第三组分结合部分可在不存在所述靶分子的情况下与所述第二组分结合部分相互作用；所述靶分子可以取代第三组分结合部分和所述第二组分结合部分之间的结合，以促进所述第一组分结合部分和所述第二组分结合部分之间的相互作用，由此蛋白酶切割蛋白酶切割位点以去除抑制剂对酶的抑制，从而将酶从催化失活状态转换为催化活性状态。
在所有上述方面中，所述酶可以是氧化还原酶，优选葡萄糖脱氢酶。
本发明进一步提供了一种氧化还原酶，优选葡萄糖脱氢酶(GDH)，其包含响应于靶分子的异源传感氨基酸序列，其中靶分子的结合起到调节酶的催化活性的作用。
本发明还提供了氧化还原酶，优选葡萄糖脱氢酶(GDH)，其包含用于阻止或降低该酶的催化活性的抑制性部分，其中该抑制性部分可以在存在一个或多个分子的情况下被置换以激活该酶的催化活性。
本发明进一步提供了包含葡萄糖脱氢酶(GDH)酶的第一片段序列的多肽，其能够与包含所述酶的第二片段序列的多肽非共价相互作用以重建稳定的GDH酶。本发明的另一个方面提供了包含任何上述方面的生物传感器、氧化还原酶、GDH酶或包含GDH酶的第一和第二片段序列的多肽的组合物或试剂盒。所述组合物或试剂盒可进一步包含底物分子。
本发明的另一个方面提供了检测靶分子的方法，所述方法包括使任何前述方面的生物传感器、氧化还原酶或GDH酶或包含GDH酶的第一和第二片段序列的多肽与样品接触，从而确定样品中是否存在靶分子。
本发明的又一个方面提供了诊断生物体中的疾病或病症的方法，所述方法包括使任何前述方面的生物传感器、氧化还原酶或GDH酶或包含GDH酶的第一和第二片段序列的多肽与从该生物体获得的生物样品接触，从而确定该生物样品中是否存在靶分子，确定是否存在靶分子有助于该疾病或病症的诊断。
所述生物体可以包括植物和动物，包括鱼类、鸟类和哺乳动物(如人类)。
本发明的再一个方面提供了一种检测装置，其包括小室或腔室，所述小室或腔室包括任何前述方面的生物传感器、氧化还原酶或GDH酶或包含GDH酶的第一和第二片段序列的多肽。
合适地，可将样品引入小室或腔室中，从而有利于靶分子的检测。
在某些实施方案中，该检测装置能够提供指示靶分子存在的电化学、声学和/或光学信号。
该检测装置还可以从诊断目标结果提供疾病诊断，所述检测装置包括:
处理器；和
连接到所述处理器的存储器，所述存储器包括计算机可读程序代码组件，所述计算机可读程序代码组件在由所述处理器执行时执行一组功能，所述功能包括:
分析诊断测试结果并提供疾病或病症的诊断。
该检测装置可以进一步传送诊断测试结果，所述检测装置包括:
处理器；和
连接到所述处理器的存储器，所述存储器包括计算机可读程序代码组件，所述计算机可读程序代码组件在由所述处理器执行时执行一组功能，所述功能包括:
将诊断结果传输到接收设备；以及
可选地从该或另一接收设备接收该疾病或病症的诊断。
本发明的一个相关方面提供了编码任何上述方面的生物传感器或其组分的分离的核酸、或编码本发明的氧化还原酶或GDH酶的分离的核酸、或编码包含本发明的GDH酶的第一或第二片段序列的多肽的分离的核酸。
本发明的另一个相关方面提供了包含上述方面的分离的核酸的遗传构建体。
本发明的另一个相关方面提供了包含前述方面的遗传构建体的宿主细胞。
另一个相关方面提供了生产本发明的重组蛋白质生物传感器或其组分、或氧化还原酶或GDH酶、或包含GDH酶的第一或第二片段序列的多肽的方法，所述方法包括在前述方面的宿主细胞中产生所述重组蛋白质生物传感器或其组分的步骤。
附图说明
图1.醋酸钙不动杆菌PQQ-GDH的结构和钙调蛋白插入位点的鉴定。(A)与PQQ和葡萄糖复合的酶的带状图。PQQ辅因子以球棍形式显示，而葡萄糖以原子色显示。结合的Ca2+显示为空间填充对象。β-折叠用各数字标记和折叠3的β-链用字母标记。链3A和3B着色为蓝色，参与葡萄糖配位的活性位点残基以球棒显示。催化性His144呈红色。(B)GDH的侧视图，显示连接链A和B的环。结构显示和着色如A图。
图2.在不同浓度的Ca2+下PQQ-GDH-CaM活性的光谱分析。(A)在存在20mM葡萄糖和1nM GDH-CaM的情况下，在600nm处测量在0.6mM电子介体吩嗪硫酸甲酯存在下60μM电子接受型染料二氯苯酚靛酚的吸收的时间分辨变化。(B)与A中一样，但使用暴露于浓度逐渐增加的CaCl2的3nM GDH-CaM。(C)在电化学系统中作为传感器的GDH-CaM嵌入物的性能。主图:GDH-CaM计时电极对Ca2+浓度升高的响应。在相对于嵌入的Ag参比条+0.4V下于5s后测量电流，GDH-CaM 300nM，PMS介质3mM，葡萄糖50mM。插图:在两个代表性的钙浓度(0和100μM)下，在相对于嵌入的Ag参考条为+0.4V时极化之后，电流对时间作图。(D)在20mM葡萄糖和1.1mM特异性Ca2+螯合剂BAPTA存在下观察到的3nM GDH-CaM的初始反应速率的图。试验如(B)中进行的一样。实心三角代表在存在2mM MgCl2时进行滴定的实验。
图3.(A)通过蛋白酶可切割的接头连接有Abe K等(2013)描述的抑制性肽NSTHHHHFATIW(SEQ ID NO:51)的吡咯并喹啉醌葡萄糖脱氢酶。在该试验中，在存在20mM葡萄糖、50μM CaCl2和2nM GDH-AI的情况下，在600nm处测量在0.3mM电子介体吩嗪硫酸甲酯存在下10μM电子接受型染料二氯苯酚靛酚的吸收。使用10uM的TVMV蛋白酶。(B)经由凝血酶可切割接头连接有通过噬菌体展示鉴定的抑制性肽SHDIHYM的吡咯并喹啉醌葡萄糖脱氢酶。如(A)中所述测量活性，测定试验中使用60μM二氯酚靛酚、0.6mM吩嗪硫酸甲酯、20mM葡萄糖、50μM CaCl2、5nM GDH-AI和20U凝血酶。(C)基于通过TVMV可切割接头C末端融合至抑制性抗体片段的吡咯并喹啉醌葡萄糖脱氢酶的生物传感器的示意图。(D)携带不同抗体结构域的几种生物传感器的活性分析。如(B)中那样测定活性。(E)双组分受体架构的示意图，其中通过分析物介导的支架相互作用使活性的或自抑制的蛋白酶接近自抑制GDH。(F)E中图示的双组分受体的雷帕霉素介导的激活。在该试验中，在存在和不存在100nM雷帕霉素的情况下，将1nM GDH-VH-FKBP12、15nM FRB-TVMV与60μM二氯酚靛酚、0.6mM吩嗪硫酸甲酯，50uM CaCl2孵育90分钟。加入20mM葡萄糖后，监测600nM的吸收。(G)基于自抑制GDH的可逆双组分生物传感器架构的示意图。在这种架构中，抑制性结构域与配体肽(例如钙调蛋白结合肽或亲和钳配体肽)融合。该系统的第二个组分是结合结构域，如钙调蛋白或亲和钳结合肽。配体对两种分子的支架作用导致AI与GDH以及融合肽与其结合结构域的“拔河”相互作用，导致酶激活。(H)基于GDH的AI形式的生物传感器结构的示意图，其中GDH和AI之间的接头包含配体结合域，其在配体结合后发生构象变化。这使得AI从GDH活性部位脱离。
图4.利用GDH酶分裂位点来创建电化学生物传感器。反应条件是15nM GDH-FRB、10nM具有TVMV位点的GDH-FKBP和1mM雷帕霉素、1mM TVMV和100mM CaCl2。
图5.包含分裂的GDH酶的电化学生物传感器，用对应的活性结构域(绿色)置换工程化的酶促失活的突变结构域(红色)能够检测雷帕霉素。(A)结合部分是FRB和FKBP结合雷帕霉素。通常，FRB一旦与FKBP结合就结合雷帕霉素。反应条件是15nM GDH-FRB、10nM GDH-FKBP(通过TVMV预先切割)、100μM CaCl2+/-20％血清。(B)用于检测免疫抑制剂药物FK506(他克莫司)的双组分系统。生物传感器结合部分包含与GDH的一个活性组分融合的钙调磷酸酶A/B异二聚体和与另一个活性组分融合的FKBP。右图是在有或无雷帕霉素和环孢菌素A的情况下用FK506滴定传感器。(C)用于检测免疫抑制剂药物环孢菌素A的双组分系统。传感器由与GDH的一个活性组分融合的钙调磷酸酶A/B异二聚体和与另一个活性组分融合的肽基-脯氨酰顺反异构酶α构成。
图6.包含分裂的GDH酶的电化学生物传感器以检测α淀粉酶。结合部分是结合α淀粉酶的称为VHH1和VHH2的骆驼科VHH抗体。反应条件是20nM GDH-VHH1(来自PDB:1KXV)、15nM GDH-VHH2(来自PDB:1BVN)(通过TVMV预先切割)和100μM CaCl2。(B)淀粉酶生物传感器的计时电流分析。样品制备和反应条件如下:AMY-2 PQQ/TVMV混合物的制备:将AMY-2PQQ和TVMV(20μL的50μM的AMY-2和20μL的50μM的TVMV)各取一等分进行解冻。将4μL TVMV与20μL AMY-2 PQQ混合(终浓度为8.3μM TVMV和41.6μM AMY-2 PQQ)。使用前将其在室温下保存3.00小时。缓冲液:0.01M磷酸钠缓冲液(pH7.4)、142mM NaCl、4.2mM KCl、2.23mM MgCl2。(A)25mM CaCl2(MW0034/1，MW147.01):50μM CaCl2，2.23mM MgCl2缓冲液:20μL 25mM CaCl2+9.98mL缓冲液。AMY-1:使用前立即将一份(20μL，50μM)解冻。(B)500nM AMY-1:5μL的50uMAMY-1+495μL的(A)。(C)416nM AMY-2 PQQ(83nM TVMV):5μL AMY-2PQQ/TVMV混合物+495μL的(A)。人唾液α淀粉酶(MW0022/1):来自Sigma，A1031，批号SLBK8708V。CofA指出样品为9％蛋白质，活性为852U/mg。假定α-淀粉酶的分子量是50kDa，则0.55mg/mL的固体含有1.0uM的α-淀粉酶。2.46uMα-淀粉酶:0.776mL(A)中0.00104g(在使用前立即制备)。1230nMα淀粉酶:0.5mL2.46μM淀粉酶+0.5mL的(A)。123nMα淀粉酶:0.1mL 1230nM淀粉酶+0.9mL的(A)。
图7.通过加入过量的工程化的酶促失活的突变体结构域(红色)来减少自发的GDH酶重构。
图8.(A)用于检测蛋白酶靶分子的电化学生物传感器。S＝支架作用结构域结合部分:例如SH2结构域、PDZ等。L＝结合支架作用结构域的配体肽。蛋白酶靶分子的切割位点位于S和L中间，使得切割允许偶联到活性GDH结构域上的L结合S并便于相应的活性GDH结构域(绿色)置换工程化的酶促失活的突变体结构域(红色)。(B)用不同浓度的凝血酶(从顶部到底部线条依次为0.013U/ml；0.13U/ml；1.3U/ml)激活凝血酶传感器。在该试验中，在存在20mM葡萄糖、50μM CaCl2、10nM GDH-S-L和15nM失活GDH-L的情况下，在600nm处测量在0.6mM电子介体吩嗪硫酸甲酯存在下60μM电子接受型染料二氯酚靛酚的吸收。(C)携带高亲和性凝血酶结合肽和凝血酶切割位点的凝血酶传感器。如(B)中那样测量活性，但凝血酶浓度为0.00013U/ml；0.0013U/ml(0.5ng/ml；16pM)；0.013U/ml(5ng/ml)；0.13U/ml(50ng/ml)；1.3U/ml(500ng/ml)。(D)携带两组高亲和性凝血酶切割位点的凝血酶传感器。如(B)中测定活性，但凝血酶浓度为0.0013U/ml(0.5ng/ml；10pM)；0.013U/ml(5ng/ml)；0.13U/ml(50ng/ml)；1.3U/ml(500ng/ml)。(E)因子Xa传感器在不同浓度因子Xa下的活性。如(B)中测定活性，但凝血酶浓度为0.01μg/ml；0.1μg/ml，1μg/ml，7μg/ml。(F)与E相同，但传感器含有三个因子Xa切割位点。如(B)中所述测量活性，但凝血酶浓度为0.001μg/ml；0.01μg/ml；0.1μg/ml，1μg/ml，7μg/ml。
图9.电化学生物传感器用于非法药物检测。在该实施方案中，靶分子是四氢大麻酚(THC)。结合部分是与钙调蛋白结合肽缀合的THC。
图10.电化学生物传感器用于非法药物检测。在该实施方案中，靶分子是四氢大麻酚(THC)。结合部分是与THC抗体竞争性结合的肽。
图11.电化学生物传感器用于非法药物检测。在该实施方案中，靶分子是四氢大麻酚(THC)。结合部分是与抗THC抗体和支架作用结构域竞争性结合的肽。第三个组分包含与蛋白酶融合的THC抗体和诸如SH2或PDZ的支架结构域。
图12.用于检测由电化学生物传感器产生的电流的基本电子设备的示意图。
图13.商业葡萄糖监测仪的例子，其已被重新设计，以包含代替GDH的Cam-GDH生物传感器。该传感器被人唾液中的Ca2+激活。
图14.电化学生物传感器及其组分的氨基酸序列(SEQ ID NO:2-10、53、54)。GDH氨基酸序列用标出，结合部分氨基酸序列用斜体表示，TVMV切割位点(ETVRFQS；SEQID NO:11)用粗体表示。GDH突变体、GDH片段、结合部分、蛋白酶切割和蛋白酶结合位点以及抑制性肽的氨基酸序列(SEQ ID No 12-49和51-52、55)。
详细描述
本发明提供能够响应于目标分子而产生或生成一个或多个电子的生物传感器。合适地，该生物传感器包含可在催化“失活”和催化“活性”状态之间转换的酶或酶片段，从而与底物分子反应以产生一个或多个电子。因此，本文还提供了具有本文所述的生物传感器的特征的酶和酶片段。更具体地说，该酶或酶片段是氧化还原酶，例如葡萄糖脱氢酶(GDH)，其已经被设计为能够在催化“失活”和催化“活性”状态之间转换。在一个特定形式中，GDH分子具有可以结合靶分子的异源插入片段，从而导致构象变化，继而导致酶激活。在另一特定形式中，GDH分子是包含活性部分和工程化突变体部分的“分裂酶”构建体，由此通过生物传感器的一个或多个结合部分结合靶分子导致该工程化突变体部分被另一个活性部分置换而重新构建GDH酶活性。本文公开的生物传感器分子可以在分子诊断中具有功效，其中“靶分子”是分析物或具有诊断价值或重要性的其他分子。然而，本文公开的生物传感器的另一个应用可以用于构建多组分人造细胞信号传导网络的合成生物学应用中。
应该理解的是，不定冠词“一”和“一个”不能被理解为单数的不定冠词或者排除超过一个或多于一个单个主题的不定冠词。例如，“一(a)”分子包括一个分子、一个或多个分子或多个分子。
如本文所用，除非上下文另有要求，否则词语“包括”、“包含”将被理解为意指包含所述整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组。
对于本发明的目的而言，“分离的”是指已经从其天然状态中除去或以其他方式经人操纵的物质(例如分子)。分离的材料可以基本上或实质上不含在其自然状态下通常伴随的组分，或者可以被操纵以便与在自然状态下通常与其相伴的组分一起处于人工状态。分离的蛋白质和核酸可以是天然的、化学合成的或重组的形式。
“蛋白质”是指氨基酸聚合物。氨基酸可以是天然或非天然氨基酸、D-或L-氨基酸，这在本领域中是充分理解的。
“肽”是具有少于五十(50)个氨基酸的蛋白质。
“多肽”是具有五十(50)个或更多个氨基酸的蛋白质。
“酶”是对一个或多个底物分子具有催化活性的蛋白质。合适地，酶能够显示对底物分子的催化活性，从而产生一个或多个电子。在一些实施方案中，酶是氧化还原酶。在一个特定的实施方案中，酶是葡萄糖脱氢酶(GDH)，底物分子是葡萄糖。因此催化活性可以是可以根据实施例1测定的葡萄糖脱氢酶活性。葡萄糖脱氢酶可以是PQQ-GDH或FAD-GDH。优选地，GDH是PQQ-GDH。在另一个实施方案中，酶是葡萄糖氧化酶，底物是葡萄糖。在另一个实施方案中，酶是二氢叶酸还原酶(DHFR)，底物分子是二氢叶酸。在另一个实施方案中，酶是乳酸脱氢酶(LDH)，底物分子是乳酸。
如本文通常使用的，“催化活性”和“催化活性状态”可以指可以通过酶或其片段或其部分显示或实现的绝对量或相对量的酶活性。典型地，如果酶在适当的反应条件下能够显示针对底物分子的特定酶活性以产生一个或多个电子，则该酶具有催化活性或呈催化活性状态。如本文通常所用，“催化失活”和“催化失活状态”可指在适当的反应条件下基本上不能显示针对底物分子的特定酶活性的酶、其片段或部分。典型地，产生的电子与由相应的催化活性酶产生的电子相比将明显更少，或者完全不存在。
第一方面，本发明提供了一种生物传感器分子，其包含能够在催化活性状态下与底物分子反应以产生一个或多个电子的酶的至少一个氨基酸序列；和至少一个可释放地将所述酶保持在催化失活状态的异源修饰氨基酸序列，其中所述异源修饰氨基酸序列响应于靶分子以将所述酶的氨基酸序列从催化失活状态转换成所述催化活性状态。
合适地，所述至少一个酶氨基酸序列和所述至少一个异源传感氨基酸序列存在于单个连续氨基酸序列中或形成单个连续氨基酸序列的至少一部分。
在一个具体的实施方案中，所述至少一个异源传感氨基酸序列是所述至少一个酶氨基酸序列中的插入片段，从而有利于将该酶氨基酸序列在所述催化失活状态和所述催化活性状态之间转换。在本文中，“插入片段”是指对于所述至少一个酶氨基酸序列异源的氨基酸序列位于所述至少一个酶氨基酸的相应部分、子序列或片段之间并且与其邻接。
合适地，异源传感氨基酸序列结合所述靶分子，从而将酶的氨基酸序列从催化失活状态转变为所述催化活性状态。优选地，靶分子与异源传感氨基酸序列的结合导致构象变化，其导致或促进酶的氨基酸序列从催化失活状态转变为所述催化活性状态。
在一个实施方案中，该异源传感氨基酸序列是钙结合蛋白的氨基酸序列或其片段。根据该实施方案，靶分子是钙或包含钙。在一个具体的实施方案中，该钙结合蛋白是钙调蛋白。
酶可以是能够与底物分子反应从而产生一个或多个电子的任何酶。优选地，酶是氧化还原酶，例如GDH、LDH或DHFR。根据这些实施方案，底物分子分别是葡萄糖、乳酸或二氢叶酸。当酶是GDH时，它可以是FAD-GDH或PQQ-GDH。PQQ-GDH优选包含SEQ ID NO:1的序列或其变体。
因此，本发明进一步提供了氧化还原酶，优选葡萄糖脱氢酶(GDH)，其包含响应于靶分子的异源传感氨基酸序列，其中靶分子的结合起到调节酶的催化活性的作用。
靶分子可以是本文所述的任何靶分子，因此对所述靶分子有响应的异源传感氨基酸序列可以是本文所述靶分子的任何结合部分，当包含在酶中时，其具有依赖于与靶分子的相互作用而可释放地调节酶的催化活性的能力。因此，该异源传感氨基酸序列可逆地调节酶的催化活性。在靶分子存在的情况下，异源传感氨基酸序列可被置换，从而催化性地激活该酶。异源传感氨基酸序列可以变构调节酶的催化活性。该异源传感氨基酸序列可以包含一个或多个结构域(例如一个或两个结构域)，所述结构域在结合靶分子(如肽或蛋白质)时发生结构重排。或者，异源传感氨基酸序列可以是非结构化或未折叠的序列，其在结合靶分子(如肽或蛋白质)时经历结构重排。结构重排可以产生一个或多个折叠的蛋白质结构域。
该异源传感氨基酸序列可以是如下所述的结合部分。该异源传感氨基酸序列可以是如下所述的亲和钳。该异源传感氨基酸序列优选为钙结合蛋白的氨基酸序列或其功能片段。该钙结合蛋白可以是钙调蛋白或其功能性钙结合片段。
该异源的传感器氨基酸序列通常作为该酶的氨基酸序列内的插入片段提供。插入是在该酶的氨基酸序列中的耐受所述插入的位置处进行的，而不形成阻碍酶的稳定折叠的空间位阻。可以在插入片段和酶的序列之间添加接头序列以有助于该插入的耐受性。插入通常允许异源的传感器氨基酸序列通过诱导酶的构象变化(通常在酶的活性位点)而可逆地抑制催化活性。在靶分子存在的情况下，异源传感氨基酸序列通常发生构象变化，释放其对酶的抑制作用并恢复催化活性。如上所述，插入可以位于酶结构中的功能上耐受异源传感氨基酸序列的环区域或转角区域(turn region)。
在上述生物传感器和酶的一个具体实施方案中，葡萄糖脱氢酶(例如吡咯并喹啉醌葡萄糖脱氢酶(PQQ-GDH)，如醋酸钙不动杆菌PQQ-GDH)可以用变构受体结构域工程化，以响应目标分子结合而控制催化活性。本发明人已经分析了醋酸钙不动杆菌PQQ-GDH(PDB:1CQ1)的高分辨率结构以识别酶活性中心附近的可能位点，该位点将足够靠近活性中心而将构象变化传递给活性中心，同时耐受异源传感氨基酸序列的插入。连接β折叠3的链A和B的环被提议作为这种插入的合适位置。链A的起始端带有His144，起到从葡萄糖O1原子中提取质子的广义碱的作用。由于His144对于催化是至关重要的，所以通过分离链A和B引起扭转(torsion)而使其转位(dislocation)导致GDH催化活性的变化。
在一个实施方案中，生物传感器包含插入到连接链3A和3B的环中的钙调蛋白的钙结合结构域，使得通过该结构域的钙结合导致实质性的构象变化。在一个具体实施方案中，生物传感器是嵌合蛋白，其中小鼠CaM的残基12-67被插入在PQQ-GDH的残基153和155之间。为了减少结构张力和冲突(structural tension and clashes)，我们还在钙调蛋白的N端引入了GSGS接头序列，在钙调蛋白氨基酸序列的C末端的连接位点处引入了Gly接头序列。在没有Ca2+离子的情况下，生物传感器几乎不显示酶活性。Ca2+离子的加入导致生物传感器的剂量依赖性激活，而对缺少异源钙调蛋白插入片段的PQQ-GDH仅有有限的作用。
这些实施方式的非限制性实施例图示于图1-3中。本文所述的任何异源传感氨基酸序列可以在对应于如上所述的PQQ-GDH的连接链3A和3B的环的GDH酶的环区域或转角区域引入，或在对应于所述酶的残基153至155(SEQ ID NO:1的残基153-155)的区域引入。技术人员能够从结构分析和序列比对中识别其他酶中的相应位置。相应的位置通常是容纳插入的异源传感氨基酸序列使得其如上所述可逆地抑制酶的催化活性的位置。插入可以使对应于SEQ ID NO:1的His144的催化残基转位。
本发明进一步提供了包含插入在SEQ ID NO:1的残基153和155之间的异源传感氨基酸序列的GDH酶或其变体。这种酶可依次包含SEQ ID NO:13(残基1-153)的序列或其变体、该异源传感氨基酸序列和SEQ ID NO:15(残基155-454)的序列或其变体。下面进一步描述SEQ ID No 1、13和15的变体。上述序列可以通过接头序列分开，以允许耐受如上所述的插入的异源传感氨基酸序列。本发明进一步提供基于如上所述的包含SEQ ID NO:53或其变体的PQQ-GDH和小鼠CaM的钙生物传感器。
本发明另外提供了改造氧化还原酶的方法，所述酶优选为包含对靶分子有响应的异源传感氨基酸序列的葡萄糖脱氢酶(GDH)，其中靶分子的结合起到调节酶的催化活性的作用。该方法包括在酶中选择能够耐受插入异源传感氨基酸序列的合适位置，并将所述异源传感氨基酸序列插入到酶中，使得该酶被工程化而响应靶分子以调节(通常是激活)酶的催化活性。
本发明进一步提供了一种生物传感器分子，其包含能够在催化活性状态下与底物分子反应的酶的至少一个氨基酸序列；以及所述酶的至少一个其他氨基酸序列，所述至少一个其他氨基酸序列被工程化以将所述酶可释放地维持在催化失活状态，其中所述生物传感器响应于靶分子以将所述酶的氨基酸序列从所述催化失活状态转换至所述催化活性状态。所述酶的至少一个氨基酸序列和至少一个其他(工程化的)氨基酸序列可以非共价地相互作用，并且如下文在电化学生物传感器中进一步描述的，该工程化的氨基酸序列可被又一个氨基酸序列置换。
本发明的一个优选方面提供了一种生物传感器分子，其包含能够在催化活性状态下与底物分子反应以产生一个或多个电子的酶的至少一个氨基酸序列；以及所述酶的至少一个其他氨基酸序列，所述至少一个其他氨基酸序列被工程化以将所述酶可释放地维持在催化失活状态，其中所述生物传感器响应于靶分子以将所述酶的氨基酸序列从所述催化失活状态转换至所述催化活性状态。
合适地，所述酶的所述至少一个其他氨基酸序列被工程化以包含一个或多个氨基酸序列突变。合适地，当处于催化活性状态时能够与底物分子反应以产生一个或多个电子的所述酶的所述至少一个氨基酸序列，与被工程化以将酶可释放地保持在非催化失活状态的所述酶的所述至少一个其他氨基酸序列，非共价地相互作用。
在一个实施方案中，这些是所述酶的相应氨基酸序列，其中一个被工程化而包含一个或多个氨基酸序列突变，从而抑制、阻止或以其他方式抑制所述酶的至少一个氨基酸序列与所述底物分子反应。合适地，这种“工程化的突变体”与能够与底物分子反应的酶的所述至少一个氨基酸序列非共价地联合，由此起到抑制、阻止或以其他方式抑制酶活性的作用。在一个优选的实施方案中，酶的各个氨基酸序列被表达或以其他方式产生为单个、连续的氨基酸序列，其随后被蛋白酶切割，从而使得工程化的突变体和能够与底物分子反应的酶的所述至少一个氨基酸序列之间非共价联合。
因此，所述酶的所述至少一个氨基酸序列通常代表所述酶的第一片段序列，其能够与代表所述酶的第二片段序列的所述酶的所述至少一个其他或所述又一个氨基酸序列非共价相互作用，以重构稳定的酶。第一和第二片段序列可一起构成酶的完整序列或一起构成足够的酶序列以提供所述酶(包括其催化结构域)的稳定形式。
该重构的酶可以是稳定的非催化活性酶，其中第一片段序列代表所述酶的所述至少一个其他氨基酸序列，其被工程化以使酶可释放地保持在催化失活状态。或者，该重构的酶可以是稳定的催化活性酶，其中第一片段序列代表所述酶的所述又一个氨基酸序列，该又一个氨基酸序列能够置换所述酶的被工程化以将酶可释放地维持在催化失活状态的所述至少一个其他氨基酸序列。如本文所述的稳定的酶是其中所述非共价相互作用的氨基酸序列形成可溶性酶复合物的酶。非共价相互作用的氨基酸序列还可以被另一个取代氨基酸序列可逆地解离，以形成另一种稳定的酶。
在涉及GDH的实施方案中，酶的各个氨基酸序列可以是SEQ ID NO:13的序列或其变体，和SEQ ID NO:15的序列或其变体。“工程化的突变体”通常包含H144突变以及Q76和D143突变中的一个或多个。这些突变被选择以降低或消除酶的催化活性。优选地，H144、Q76和D143每个都突变。这些残基可以各自突变为丙氨酸，或者突变成可以降低或消除催化活性的丙氨酸替代性突变。工程化的突变体可以包含SEQ ID NO:14的序列或其变体，当与酶的至少一个氨基酸序列非共价结合时，该突变体也产生催化失活的酶。如本文所述，所述变体可以包含SEQ ID NO:14中位于第76、143和144位的替代性突变。
所得到的工程化突变体优选在细菌(如大肠杆菌)中作为表位标记蛋白质表达，并通过亲和层析纯化。
在一个实施方案中，蛋白酶切割位点是TVMV切割位点，例如ETVRFQS(SEQ ID NO:11)或其功能性变体。可选地，蛋白酶切割位点可以是凝血酶切割位点，如SEQ ID NO:33或其功能性变体，或因子Xa位点，如SEQ ID NO:34或35或其功能性变体。
在一个实施方案中，该方面的生物传感器进一步包含所述酶的又一个氨基酸序列，其能够置换所述酶的被工程化以将酶可释放地维持在催化失活状态的所述至少一个其他氨基酸序列。通常，所述酶的所述又一个氨基酸序列包含基本上对应于工程化突变体的氨基酸序列，尽管缺少一个或多个氨基酸序列突变。通常，这种置换通过将所述酶的所述又一个氨基酸序列与能够与底物反应的酶的所述至少一个氨基酸序列非共价组合来恢复所述酶的催化活性，以形成功能性催化活性酶。
这些实施方案的非限制性例子显示在图4-9中。如图7所示，可以理解的是，可以提供摩尔过量的工程突变体，其减少或消除了酶在不存在靶分子结合的情况下的催化活性的自发置换。由此抑制了“背景噪音”，从而提高了生物传感器的灵敏度。
在一个广泛的实施方案中，所述酶的所述又一个氨基酸序列和能够与底物反应的酶的所述至少一个氨基酸序列包含各自的结合部分，所述结合部分可以例如通过结合靶分子而相互作用以促进所述又一个氨基酸序列对工程化的氨基酸序列的置换。
在一个相关的方面，本发明进一步提供了一种多肽，其包含氧化还原酶(优选葡萄糖脱氢酶(GDH))的第一片段序列，该第一片段序列能够与包含所述酶的第二片段序列的多肽非共价相互作用以重构一个稳定的酶。
如上所述，该第一和第二片段序列可一起构成酶的完整序列，或一起构成足以提供包括其催化结构域的稳定形式的所述酶的酶序列。
包含第一片段序列的多肽可以能够与包含所述酶的第二片段序列的所述多肽一起重构稳定的催化活性酶。在该实施方案中，包含所述酶的第一片段序列的多肽能够从稳定的酶复合物中置换所述酶的相应片段序列，从而恢复催化活性，所述相应片段序列经工程化以使酶维持在催化失活状态。
可选地，包含第一片段序列的多肽可以包含如上定义的一个或多个突变，其使得包含所述多肽的稳定酶催化失活。这样的多肽(也描述为工程化多肽)也能够从所述稳定的酶复合物中置换以恢复催化活性。
本文还提供了氧化还原酶，优选GDH酶，其包含如上所述工程化的第一片段序列和作为连续多肽的一部分的所述第二片段序列，其中第一和第二片段序列被一个或多个蛋白酶切割位点隔开，使得蛋白酶活性允许该工程化的片段序列被置换，并允许能够恢复催化活性第一片段序列随后非共价地与第二片段序列结合从而形成稳定的催化活性酶。
上述多肽可以包含能够与包含所述酶的第二片段序列的对应多肽(counterpartpolypeptide)上的相应结合部分相互作用的结合部分，其中结合部分之间的相互作用调节重构的稳定葡萄糖脱氢酶的催化活性。结合部分之间的相互作用可以通过靶分子的结合来调节。结合部分和相应的靶分子可以选自本文所述的任何一个。
上述多肽还可以包含抑制相应结合部分的相互作用的序列和一个或多个蛋白酶切割位点，其中蛋白酶的切割使得结合部分之间能够相互作用。多肽可以进一步包含增强蛋白酶的结合和/或切割效率的序列。蛋白酶切割位点和增强蛋白酶的结合和/或切割效率的序列可以选自本文所述的任何一个。
在具体的实施方案中，上述第一和第二片段序列可以通过如上所述在对应于PQQ-GDH的环连接链3A和3B的、GDH酶的环区域或转角区域中切割GDH酶来获得，或对应于所述酶的残基153至155(SEQ ID NO:1的残基153-155)的区域中切割GDH酶来获得。技术人员能够从结构分析和序列比对中识别其他酶中的相应位置。相应的位置通常是允许产生能够重构稳定酶的所述酶的功能片段的位置。
在这方面，本发明另外提供了改造氧化还原酶，优选葡萄糖脱氢酶(GDH)酶，以提供能够重构稳定酶的第一和第二片段序列的方法。该方法包括在酶中选择合适的位置，在该位置该酶可被切割以提供所述第一和第二片段序列。该方法通常还包括将突变引入到所述序列之一中，使得从所述序列重构的稳定酶催化失活。该方法可以进一步包括向所述序列添加一个或多个结合部分，这些结合部分有助于包含所述序列的多肽的非共价结合以重建稳定的催化活性酶。
本发明进一步提供了包含GDH酶的第一片段序列的多肽，其包含SEQ ID NO:13或其变体。如上所述，该多肽可以是能够重构稳定的催化活性GDH酶的多肽。本发明另外提供了包含GDH酶的第一片段序列的多肽，其包含SEQ ID NO:14或其变体。如上所述，可以将该多肽工程化以使包含所述多肽的稳定酶催化失活。如上所述，SEQ ID NO:14的变体可以在H144、Q76和D143中的一处或多处、优选全部位置包含对丙氨酸的替代性失活突变。SEQ IDNO:13或14的变体可以是当包含在所述多肽中时能够与包含SEQ ID NO:15的多肽一起重构稳定的GDH酶的序列。
本发明进一步提供了包含GDH酶的第二片段序列的多肽，其包含SEQ ID NO:15或其变体。SEQ ID NO:15的变体可以是当包含在所述多肽中时能够与如上所述的包含SEQ IDNO:13或SEQ ID NO:14的多肽一起重构稳定的GDH酶的序列。
包含SEQ ID NO:13或其变体、SEQ ID NO:14或其变体、或SEQ ID NO:15或其变体的以上多肽可进一步包含选自本文所述的任何一个结合部分的一个或多个结合部分。典型地，在一个所述多肽中，结合部分提供在SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的序列或其变体的C-末端、SEQ ID NO:15的序列或其变体的N-末端。SEQ ID NO 2、4、7、9提供了包括结合部分的此类多肽的代表性实例。本发明还包括如本文所述的SEQ ID NO 2、4、7和9中任一个的变体。
本文还提供了包含SEQ ID NO:13或其变体的多肽，其进一步包含由一个或多个(例如一个、两个或三个)蛋白酶切割位点隔开的两个同源(相应)结合部分。该多肽可以另外包含增强蛋白酶的结合和/或切割效率的序列。在不存在蛋白酶的情况下，同源结合部分相互作用，然后通过蛋白酶的切割来破坏相互作用，以允许保留的结合部分与包含SEQ IDNO:15或其变体的另一多肽上的相应结合部分结合，从而重构催化活性的GDH酶。该同源结合部分、蛋白酶切割位点和增强结合和/或切割效率的序列可以选自本文所述的任何一个。上述多肽的代表性实例为SEQ ID NO 40、42、44、46和48提供。本发明还包括如本文所述的SEQ ID NO 40、42、44、46和48中任一个的变体。
本文还提供了包含SEQ ID NO:14的序列或其变体以及另外的SEQ ID NO:15的序列或其变体的GDH酶，其中一个或多个蛋白酶切割位点位于所述序列之间，使得通过蛋白酶的切割能够从所述酶置换包含SEQ ID NO:14的序列的多肽。GDH酶可进一步包含能够与包含SEQ ID NO:13或其变体的GDH酶的第一片段序列的多肽上的相应结合部分相互作用的结合部分，该相互作用任选地在靶分子存在下进行，其中结合部分之间的相互作用允许重构稳定的GDH酶。此类GDH酶的代表性实例为SEQ ID NO 3、6、9、41、43、45、47和49。本发明还包括如本文所述SEQ ID NO3、6、9、41、43、45、47和49的任一个的变体。
如上所述，可以在生物传感器上提供上述多肽和酶。或者，如本文和代表性实例生物传感器中描述的一起相互作用以检测靶分子的多肽和酶的合适组合可以在任何体外情形(可能检测到靶分子的情形)中一起提供。多肽和酶可以一起提供在溶液中用于检测靶分子。如本文通常使用的，“结合部分”是指能够彼此或与一个或多个其他靶分子识别和/或结合的一个或多个分子或生物学或化学组分或实体。结合部分可以是蛋白质、核酸(例如单链或双链DNA或RNA)、糖、寡糖、多糖或其他碳水化合物、脂质或这些的任意组合，例如糖蛋白、PNA构建体等或其分子组分。仅作为举例，结合部分可以是或者包含:(i)响应于例如同源生长因子、细胞因子、激素(例如胰岛素)、神经递质等靶分子的结合的受体的配体结合结构域的氨基酸序列；(ii)能够结合靶分子(如离子或代谢物)或响应于靶分子的结合的离子转运蛋白或代谢物转运蛋白(例如Ca2+结合蛋白，如钙调蛋白或钙调磷酸酶或葡萄糖转运蛋白)的氨基酸序列；(iii)响应于锌依赖性结合DNA靶分子的锌指氨基酸序列；(iv)响应于结合DNA靶分子的螺旋-环-螺旋氨基酸序列；(v)响应于磷酸肌醇靶分子的结合的普列克底物蛋白(pleckstrin)同源结构域氨基酸序列；(vi)响应于信号传导蛋白的Src同源2-结构域或Src同源3-结构域的氨基酸序列；(vii)响应于抗体靶分子的结合的抗原的氨基酸序列；或(viii)响应于可磷酸化的或磷酸化的靶分子的结合的蛋白激酶或磷酸酶的氨基酸序列；(ix)泛素结合结构域；(x)结合小分子、药物或抗生素如蛋白质或蛋白质结构域，如结合雷帕霉素的FKBP和FRB结构域；(xi)结合核酸靶分子的单链或双链DNA、RNA或PNA构建体，例如其中DNA或RNA与氨基酸序列偶联或交联或其他蛋白质-核酸相互作用；和/或(xii)亲和钳，例如PDZ-FH3结构域融合物；包括它们的修饰或工程化形式，但不限于此。
本发明中使用的特定结合部分由SEQ ID NO 5、16-19、36-37、52和55及其变体提供。变体通常是相关各自结合部分的功能性结合变体。
还应理解的是，结合部分可被修饰或化学衍生，例如用结合试剂修饰或衍生，如生物素、抗生物素蛋白、表位标签、凝集素、碳水化合物、脂质，但不限于此。
在一些实施方案中，各个部分可以直接结合、相互作用或形成复合物。第一结合部分和第二结合部分可以包含可以直接结合或相互作用的分子。因此，靶分子和结合部分之间的直接结合相互作用适当地促进了第一和第二分子组分的共定位。
在其他实施方案中，相应的结合部分能够与靶分子结合、相互作用或形成复合物。通常，相应的结合部分能够与相同的靶分子结合、相互作用或形成复合物。还应理解的是，“相同的”靶分子可以具有各自不同的部分、亚基、结构域、配体或表位，它们可由相应的结合部分结合从而共定位和激活蛋白酶活性。
目标分子可以是任何配体、分析物、小有机分子、表位、结构域、片段、亚基、部分或其组合，例如蛋白质(包括抗体和抗体片段、抗原、酶、磷蛋白、糖蛋白、脂蛋白和糖蛋白)、脂质、磷脂、碳水化合物(包括单糖、二糖和多糖)、核酸、核蛋白或任何其他分子或分析物。这些包括药物和其他药剂，包括抗生素、禁用药物、非法药物或成瘾药物化学治疗剂和药物设计和筛选中的先导化合物，生物样品中常见的分子和分析物，如生物标志物、肿瘤抗原和其他抗原、受体、DNA结合蛋白，包括转录因子、激素、神经递质、生长因子、细胞因子、受体、代谢酶、信号传导分子、核酸(如DNA和RNA)，膜脂质和其他细胞组分，病原体衍生的分子，包括病毒、细菌、原生动物、真菌和蠕虫蛋白、脂质、碳水化合物和核酸，但不限于此。如前所述，应该理解的是，“相同的”目标分子可以被不同的相应的结合部分结合。
在一个实施方案中，结合部分包含可以直接结合靶分子或与靶分子相互作用的任何蛋白质或蛋白质片段或结构域的至少一个片段的氨基酸序列。结合部分可以是或包含蛋白质，例如肽、抗体、抗体片段或任何其他蛋白质支架，其可以适当地工程化以产生或包含结合靶分子的结合部分、结构域或区域(综述参见例如Binz et al.,2005NatureBiotechnology,23,1257-68.)。
在一个具体的实施方案中，结合部分分别是或包含亲和钳的氨基酸序列。亲和钳优选包含识别结构域，并且任选地包含增强子结构域。识别结构域通常能够结合一个或多个靶分子，如以上在(i)-(ix)所述的靶分子。识别结构域可以包括但不限于以下事件中涉及的结构域:磷酸酪氨酸结合(例如SH2、PTB)、磷酸丝氨酸结合(例如UIM、GAT、CUE、BTB/POZ、VHS、UBA、RING、HECT、WW、14-3-3、Polo-box)、磷酸苏氨酸结合(例如FHA、WW、Polo-box)、富含脯氨酸的区域结合(例如EVH1、SH3、GYF)、乙酰化赖氨酸结合(例如Bromo)、甲基化赖氨酸结合(例如Chromo、PHD)、凋亡(例如BIR、TRAF、DED、Death、CARD、BH)、细胞骨架调节(例如ADF、GEL、DH、CH、FH2)、泛素结合结构域或其修饰或工程化形式、或其他细胞功能(例如EH、CC、VHL、TUDOR、PUF重复、PAS、MH1、LRR1、IQ、HEAT、GRIP、TUBBY、SNARE、TPR、TIR、START、SOCS Box、SAM、RGS、PDZ、PB1、LIM、F-BOX、ENTH、EF-Hand、SHADOW、ARM、ANK)。
增强子结构域通常增加或增强对至少一种或靶分子的结合亲和力。在一些实施方案中，与只有识别结构域相比，亲和力可以增加至少10倍、100倍或1000倍。亲和力可以进一步包含连接识别结构域和增强子结构域的接头。
在一个具体的实施方案中，亲和钳包含具有PDZ结构域的至少一部分或片段的识别结构域和具有纤连蛋白III型结构域的至少一部分或片段的增强子结构域。PDZ结构域可以来源于人Erbin蛋白。Erbin-PDZ(ePDZ)与靶分子)结合，靶分子例如是p120相关连环蛋白的C-末端(例如在软腭-心-面综合征(ARVCF)中缺失的δ-连环蛋白和犰狳重复基因)。优选地，亲和钳的该实施方案进一步包含人纤连蛋白的第十个(10)III型(FN3)结构域作为增强子结构域。
在一些实施方案中，亲和钳可以包含一个或多个连接体氨基酸序列。例如，连接体氨基酸序列可将蛋白酶氨基酸序列(例如包含蛋白酶氨基酸序列)连接到Erbin-PDZ结构域，将Erbin-PDZ结构域连接到FN3结构域和/或将FN3结构域连接到抑制剂。
关于亲和钳的结构和功能，以及可以根据本发明使用的特定的亲和钳的更详细描述，参考文献WO2009/062170,Zhuang&Liu,2011,Comput.Theoret.Chem.963 448,Huang etal,2009,J.Mol.Biol.392 1221,Huang et al.,2008,PNAS(USA)105 6578,以及Koide1,*和Huang Methods Enzymol.2013；523:285–302。可以在本发明中使用的亲和钳的实例提供为SEQ ID NO:52。
在另一个实施方案中，结合部分包含可与或可被抗体靶分子结合的一个或多个表位。
在另一个实施方案中，结合部分可以是或包含抗体或抗体片段，包括单克隆和多克隆抗体、重组抗体、Fab和Fab'2片段、双抗体和单链抗体片段(例如scV)，但不限于此。合适地，第一和第二结合部分可以是或包含结合靶分子的各自的抗体或抗体片段。图2C中示意性地示出了非限制性的例子。
在又一个具体的实施方案中，结合部分可以是或包含抗体结合分子，其中抗体对靶分子具有特异性。抗体结合分子优选是蛋白质A的氨基酸序列或其片段(例如ZZ结构域)，其结合抗体的Fc部分。
因此，该方面的具体实施方案提供了一种生物传感器，其包含第一组分和第二组分，所述第一组分包含:能够在催化活性状态下与底物分子反应以产生一个或多个电子的酶的至少一个氨基酸序列；第一结合部分；以及所述酶的至少一个其他氨基酸序列，所述至少一个其他氨基酸序列经工程改造以将所述酶可释放地保持在催化失活状态；所述第二组分包含所述酶的至少一个其他氨基酸序列和第二结合部分；设置成使得所述第一和第二结合部分之间的相互作用促进所述第一组分的所述至少一个其他氨基酸序列被所述第二组分的所述至少一个其他氨基酸序列置换，从而将所述第一组分的酶从催化失活状态转变为催化活性状态。
虽然术语“第一”、“第二”和“第三”被用于描述生物传感器的相应的分离的或离散的分子组分和/或结合部分，但是应当理解，这些不涉及任何特定的不能颠倒的非任意排序或指定。因此，本文公开的第一组分、第二和/或第三组分的结构和功能特性可以分别是第三组分、第二组分和/或第一组分的结构和功能特性。类似地，本文公开的第一结合部分和第二结合部分的结构和功能特性可以分别是第二结合部分和第一结合部分的结构和功能特性。还将理解的是，生物传感器可以进一步包含一种或多种其他未述及的分子组分。
在本文中，“组分”或“分子组分”是形成生物传感器的单独部分、部分或组分的离散分子。在典型的实施方案中，每个分子组分是或包含单个连续的氨基酸序列(即融合蛋白)。虽然显而易见的是，在许多实施方案中，第一和第二组分可以在由相应的结合部分介导的“结合事件”中非共价结合、偶联、相互作用或联合，但它们仍然是形成生物传感器的离散分子。
在一些实施方案中，靶分子是酶，例如α淀粉酶。在这样的实施方案中，第一和第二结合部分分别是骆驼科抗体VHH1和VHH2。
在一些实施方案中，靶分子是小有机分子，如雷帕霉素。在这样的实施方案中，第一和第二结合部分分别是FKBP和FRB。这个一般实施例的特定形式的非限制性例子总体上示于图5A和6中。
在一些实施方案中，靶分子是小有机分子，如FK506。在这样的实施方案中，如图5B所示，第一和第二结合部分分别是FKBP和钙调磷酸酶A/B复合物(Calcineurin A/Bcomplex)。
在一些实施方案中，靶分子是小的有机分子，如环孢菌素。在这样的实施方案中，第一和第二结合部分分别是如图5C所示的肽基脯氨酰顺反异构酶α和钙调磷酸酶A/B复合物。
在另一个广泛的实施方案中，所述酶的所述工程化氨基酸序列和能够与底物分子反应的所述酶的至少一个氨基酸序列包含最初相互作用的相应的结合部分，所述相互作用随后因一个或另一个结合部分结合了靶分子而破坏。这种相互作用的这种破坏促进了所述又一个氨基酸序列对工程化氨基酸序列的置换。
因此，第二方面的另一个具体实施方案提供了一种生物传感器，其包含第一组分和第二组分，所述第一组分包含:至少一个能够在催化活性状态下与底物分子反应以产生一个或多个电子的酶的氨基酸序列；第一结合部分；以及所述酶的至少一个其他氨基酸序列，所述至少一个其他氨基酸序列经工程改造以将所述酶可释放地保持在催化失活状态；所述第二组分包含所述酶的至少一个其他氨基酸序列和第二结合部分；被设置成使得所述第一和第二结合部分之间的相互作用被能够结合所述第一或第二结合部分的靶分子释放，以促进所述第一分子的所述至少一个其他氨基酸序列被第二分子的所述至少一个其他氨基酸序列置换，从而使第一组分的酶从催化失活状态转变为催化活性状态。
优选地，生物传感器还包含交叉结合剂，其最初与第一和第二结合部分相互作用以可释放地维持所述第一和第二结合部分之间的相互作用。合适地，交叉结合剂能够通过靶分子从第一和/或第二结合部分置换出来，从而促进第一分子的所述至少一个其他氨基酸序列被第二分子的所述至少一个其他氨基酸序列置换。
在一些实施方案中，靶分子是非法药物，例如THC。在这样的实施方案中，结合部分是THC钙调蛋白结合肽缀合物或竞争性结合与钙调蛋白结合肽融合的抗THC抗体的THC结合位点的肽。根据该实施方案，交叉结合物是包含氨基酸序列GVMPREETDSKTASPWKSARLMVHTVATFNSIKELNERWRSLQQLA(SEQ ID NO:13)或由该序列组成的钙调蛋白结合肽。
图9中示出了这样的实施例的一个非限制性示例。
在另一个广泛的实施方案中，第二方面的生物传感器适用于检测蛋白酶靶分子。优选地，所述能够与底物反应的所述酶的所述至少一个氨基酸序列和所述酶的所述又一个氨基酸序列包含各自的结合部分，所述结合部分可以在蛋白酶切割它们之间的结合抑制剂后相互作用。这种相互作用促进了所述又一个氨基酸序列对工程化氨基酸序列的置换。
因此，第二方面的另一特定实施方案提供了包含第一组分和第二组分的生物传感器，所述第一组分包含:至少一种能够在催化活性状态下与底物分子反应以产生一个或多个电子的酶的氨基酸序列；第一结合部分；以及所述酶的至少一个其他氨基酸序列，所述至少一个其他氨基酸序列经工程改造以将所述酶可释放地保持在催化失活状态；所述第二组分包含所述酶的至少一个其他氨基酸序列和通过蛋白酶切割位点连接至抑制剂的第二结合部分，其中所述抑制剂阻止或抑制所述第一和第二结合部分之间的相互作用；使得所述抑制剂通过切割所述蛋白酶切割位点的蛋白酶靶分子释放，以促进所述第一和第二结合部分之间的相互作用，以促进第一份子的所述至少一个其他氨基酸序列被第二分子的所述至少一个其他氨基酸序列置换，从而将第一组分的酶从催化失活状态转换为催化活性状态。
“蛋白酶”是显示或能够显示水解或以其他方式裂解肽键的能力的蛋白质。类似的术语包括“蛋白酶(proteinase)”和“肽酶”。蛋白酶包括但不限于丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、外蛋白酶(exoproteases)、氨肽酶和肽链内切酶。蛋白酶可以是天然存在的蛋白酶的纯化的或合成的(例如重组合成的)形式，或者可以是工程化或修饰的蛋白酶，其包含天然存在的蛋白酶的一个或多个片段或结构域，所述天然存在的蛋白酶任选地被进一步修饰以拥有一个或多个所需的特征、活性或性质。
靶蛋白酶可以是蛋白酶切割位点已知的任何蛋白酶。合适地，靶蛋白酶在可从生物体(包括细菌、植物和动物)获得的生物样品中是可检测的。动物可能包括人类和其他哺乳动物。目标蛋白酶的非限制性实例包括参与血液凝固的蛋白酶，例如凝血酶、纤溶酶、因子VII、因子IX、因子X、因子Xa、因子XI、因子XII(Hageman因子)和其他蛋白酶，如激肽释放酶(例如激肽释放酶III、P-30或前列腺特异性抗原)、基质金属蛋白酶(如涉及伤口和溃疡，例如MMP7和MMP9)、adamalysin蛋白酶、serralysin蛋白酶、虾红素以及甲硫氨酸锌蛋白(metzincin)家族的其他蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、组织蛋白酶G、胃蛋白酶和羧肽酶A以及致病性病毒的蛋白酶(如HIV蛋白酶、西尼罗河NS3蛋白酶和登革热病毒蛋白酶)，但不限于此。
这个实施例的一个非限制性例子在图8中示出。
第三方面，本发明提供了一种生物传感器分子，其包含能够在催化活性状态下与底物分子反应以产生一个或多个电子的酶的至少一个氨基酸序列；能够结合靶分子的结合部分；和至少一种酶抑制剂，其能够在不存在靶分子的情况下与结合部分相互作用从而抑制酶；设置成使得目标分子可以释放所述至少一种酶抑制剂和结合部分之间的相互作用，从而释放抑制剂对酶的抑制，并将酶的氨基酸序列从催化失活状态转换到所述催化活性状态。
酶、底物分子、靶分子和/或结合部分可以是如上所述的任何酶、底物分子、靶分子和/或结合部分。
该方面的特定特征是结合部分可以与靶分子(如果存在的话)结合或相互作用。在优选的初始状态下，结合部分可释放地与酶抑制剂或与酶抑制剂连接的分子(例如氨基酸序列)相互作用或结合。这有利于酶抑制剂的酶抑制。随后，如果存在的话，靶分子与酶抑制剂或与其连接的分子竞争，由此从结合部分释放酶抑制剂，导致酶抑制释放，由此将酶转换成催化活性状态。
酶抑制剂可以是能够阻止、抑制、阻止或压制酶与底物分子反应以提供一个或多个电子的能力的任何分子。
第三方面的一个实施方案提供了包含第一组分、第二组分和第三组分的生物传感器，所述第一组分包含:至少一种能够在催化活性状态下与底物分子反应以产生一个或多个电子的酶的氨基酸序列；通过蛋白酶切割位点与酶连接或偶联的所述酶的抑制剂；和第一组分结合部分；所述第二组分包含能够结合所述第一组分结合部分的第二组分结合部分；蛋白酶氨基酸序列；和能够结合靶分子的另一第二组分结合部分；所述第三组分包含第三组分结合部分，所述第三组分结合部分可在不存在所述靶分子的情况下与所述第二组分结合部分相互作用；设置成使得所述靶分子可以置换第三组分结合部分和所述第二组分结合部分之间的结合，以促进所述第一组分结合部分和所述第二组分结合部分之间的相互作用，由此蛋白酶切割蛋白酶切割位点以去除抑制剂对酶的抑制，从而将酶从催化失活状态转换为催化活性状态。
酶、底物分子、靶分子和/或结合部分可以是如上所述的任何酶、底物分子、靶分子和/或结合部分。
该实施方案的特定特征是第一组分的蛋白酶切割位点可被第二组分的蛋白酶氨基酸序列切割。优选地，第三组分结合部分包含第一和第二部分，其中在不存在目标分子的情况下，第一部分可以最初可释放地结合第二组分结合部分或与所述第二组分结合部分相互作用，第二部分可以最初可释放地结合所述另一第二组分结合部分或与所述另一第二组分结合部分相互作用。如果存在的话，靶分子可以从所述另一第二组分结合部分置换第三组分的第二部分。这促成了第三组分的第一部分释放与所述第二组分结合部分的相互作用或结合。这有助于第一组分结合部分结合第二组分结合部分或与所述第二组分结合部分相互作用，从而共同定位第一和第二组分，并使第二组分的蛋白酶氨基酸序列进入第一组分的蛋白酶酶切位点附近。蛋白酶随后可以切割蛋白酶切割位点，从而从酶抑制剂释放酶，其导致酶抑制的释放，由此将酶转换成催化活性状态。
在一个相关方面，本发明进一步提供了一种氧化还原酶，优选GDH酶，其包含抑制性部分，用以阻止或降低酶的催化活性，其中抑制性部分可在一个或多个分子存在下被置换以激活酶的催化活性。抑制性部分在本文中也被描述为酶抑制剂并且可以是能够阻止或降低酶的催化活性的任何分子，其能够被置换以激活催化活性。
抑制性部分可以置换活性位点上的催化性氨基酸残基。抑制性部分可以空间阻止底物进入活性位点。抑制性部分优选是抗体或抗体片段或抑制性肽。抑制性部分可以位于酶的N端方向或C端方向，包括在酶的N端或C端，或者可以位于酶的氨基酸序列的内部。所述酶可以包含增加抑制性部分(例如抑制性肽)阻止或降低酶的催化活性的能力的一个或多个突变，例如通过增加抑制性肽对酶内区域的亲和力，使其更牢固地结合或锚定到所述区域，从而阻止或降低催化活性。
在涉及GDH酶的实施方案中，抑制性部分可以是位于酶的C末端的抗体或抗体片段或抑制性肽。GDH酶可以包含SEQ ID NO:1的序列或其变体。抑制性部分可以包含SEQ ID No20-24、51或55中任一个的序列或其变体，其通常被添加在所述GDH酶的C端区域中，例如在C端或C端附近。
当GDH酶是如上所述的包含辅助抑制性部分的结合的氨基酸突变的突变酶时，其通常在对应于SEQ ID NO:1的位置340-344的一个或多个位置处(SEQ ID NO:1的天然PQQ-GDH酶的EMTY1)包含这样的突变，其能够增强位于酶的C末端的抑制性部分的抑制活性。该变体优选保留SEQ ID NO:1的位置343上的酪氨酸残基。该变体可以包含引入极性或亲水性氨基酸残基的位置340至342和344中的一个或多个上的突变。该变体可以在对应于SEQ IDNO:1的位置340-344的位置包含序列SSSYS(SEQ ID NO:51)或其变体。突变酶可以包含SEQID NO:31的序列或其变体。可以加入到如上所述的突变GDH酶(例如包含SEQ ID NO:31序列的GHD酶或其变体)中的抑制性部分的代表性实例包括SEQ ID No 25-30或其变体。如上所述，这些抑制性部分通常被包括在酶的C-末端方向。包含抑制性部分的突变GDH酶(自抑制酶)的代表性实例由SEQ ID No 31至33和54提供。本发明提供了包含SEQ ID No 31至33和54中任一个的序列或其变体的自抑制突变GDH酶。
上述氧化还原酶(例如GDH)通常包含一个或多个蛋白酶切割位点，其中蛋白酶对一个所述位点的切割移除了抑制性部分以激活酶的催化活性。该酶可以进一步包含增强蛋白酶的结合和/或切割效率的序列。
氧化还原酶可包含能够与另一分子上的相应结合部分相互作用的结合部分，其中结合部分之间的相互作用移除了抑制性部分以激活酶的催化活性。这样的氧化还原酶可以进一步包含一个或多个蛋白酶切割位点，其中该另一分子额外包含蛋白酶，并且结合部分之间的相互作用起到使该蛋白酶接近所述位点的作用，以切割所述位点并移除抑制性部分。结合部分和蛋白酶切割位点可以选自本文所述的任何一个。
在图3A-E中显示了通过蛋白酶切割激活的自抑制GDH酶的例子。
本发明进一步提供了一种改造自抑制氧化还原酶(如GDH)酶的方法，包括筛选当与所述酶融合时能够阻止或降低催化活性的抑制性部分，其中所述抑制性部分能够在存在目标分子的情况下被移除而重构催化活性。抑制性部分可以被加入到酶序列的N-或C-末端方向。在涉及GDH酶的实施方案中，抑制性部分优选在酶的C端提供，例如与C端融合。GHD酶可以包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:31的序列或其任一种的变体。推定的抑制性部分可以通过噬菌体展示来鉴定。筛选可以在体外活性试验中进行。本文实施例中描述了一个合适的试验。
蛋白酶氨基酸序列可以是蛋白酶的完整氨基酸序列，或者可以是蛋白酶的蛋白水解活性片段或子序列的氨基酸序列。
在一些实施方案中，蛋白酶可以是自抑制蛋白酶。
在一个优选的实施方案中，蛋白酶是肽链内切酶。
在一些实施方案中，蛋白酶来自病毒基因组或由其编码。通常，这样的蛋白酶依赖于多蛋白的表达和蛋白水解加工和/或作为病毒(如小核糖核酸病毒目、网巢病毒目(Nidovirales)、疱疹病毒目、逆转录病毒和腺病毒)的生命周期的一部分所需的其他事件，但不限于此。蛋白酶的具体例子包括:马铃薯Y病毒科(Potyviridae)蛋白酶，如烟草蚀纹病毒(TEV)、烟草叶脉斑点病毒(TVMV)、甘蔗花叶病毒(SMV)等的NIa蛋白酶；黄病毒科蛋白酶，例如丙型肝炎病毒(HCV)的NS3蛋白酶；小核糖核酸病毒科蛋白酶，如EV71、诺如病毒等的3C蛋白酶、人鼻病毒2A型蛋白酶、柯萨奇病毒B4等及口蹄疫病毒(FMDV)的前导蛋白酶等；冠状病毒科蛋白酶，如SARS-CoV、IBV-CoV的3C样蛋白酶和疱疹病毒蛋白酶，如HSV-1、HSV-2、HCMV和MCMV蛋白酶等，但不限于此。
优选地，病毒基因组是植物病毒。
更优选地，植物病毒是马铃薯Y病毒。
在特别优选的实施方案中，蛋白酶是马铃薯Y病毒蛋白酶，如TEV、TVMV或SMV的NIa蛋白酶。
在另一个实施方案中，蛋白酶是黄病毒(如HCV)的NS3蛋白酶。
在其他实施方案中，蛋白酶是SUMO相关的蛋白酶，其包括泛素(Ub)、NEDD8和Atg8蛋白酶[21]。这些蛋白酶通过与它们各自的识别结构域(例如SUMO)经由蛋白酶抗性接头融合而转化为自抑制形式。
在一个特定实施方案中，第二组分结合部分是支架蛋白、其结构域或片段。非限制性实例包括PDZ结构域、SH2或SH3结构域或其片段。如前所述，第三组分结合部分优选包含第一和第二部分，其中在不存在靶分子的情况下，第一部分可以最初可释放地结合所述第二组分结合部分或与所述第二组分结合部分相互作用，第二部分可以最初可释放地结合所述另一第二组分结合部分或与所述另一第二组分结合部分相互作用。第一部分可以是结合支架蛋白、其结构域或片段的配体(例如肽)。
第三组分的第二部分可以是竞争性结合至目标分子的结合位点的肽或与第一部分缀合的靶分子或其类似物。
这些实施例的非限制性例子在图10和11中示出。
应该理解的是，本文所述的生物传感器及其分子组分可以是或包含连续的氨基酸序列，例如是如本领域中所熟知的嵌合蛋白或融合蛋白的形式。任选地，相应的氨基酸序列(例如结合部分、酶氨基酸序列、蛋白酶氨基酸序列等)可以是由间隔区或接头(例如氨基酸、氨基酸序列、核苷酸、核苷酸序列或其他分子)连接的不连续或分开的氨基酸序列，以优化诸如靶分子识别、结合和酶活性或抑制的特征或活性，但不限于此。包含酶氨基酸序列、工程突变体、接头、蛋白酶切割位点和结合部分的氨基酸序列的非限制性实例提供于图14和SEQ ID NO:1-55中。
还应理解的是，本发明包括构成本文所述实施方案的变体的生物传感器分子，或者包含本文公开的组成蛋白酶、传感器和/或抑制剂氨基酸序列的变体的生物传感器分子。通常，这样的变体与本文公开的任一氨基酸序列具有至少80％、至少85％、优选至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，例如SEQ ID NOS:1-55或其部分。作为例子，可以进行保守性氨基酸变化，而功能没有显著的或实质性的改变。例如，当电荷、亲水性、疏水性、侧链“体积”、二级和/或三级结构(例如螺旋度)、靶分子结合、蛋白酶活性和/或蛋白酶抑制活性基本不变或被改变到不明显或实质上危及生物传感器功能的程度时，可以耐受保守氨基酸取代。本发明的变体(不是本文所述的工程化的非活性突变体)被选择为功能性的，因此保留或基本保留催化活性，或者保留或基本保留当与生物传感器的合适的其他组分一起提供时重构此类催化活性的能力。选择本文所述的非共价缔合氨基酸序列(例如第一和第二片段序列)的变体，以在与其各自的结合伴侣序列组合时提供重构稳定酶的能力。
术语“序列同一性”在本文中以其最广泛的含义使用，以包括精确氨基酸匹配的数目，考虑使用标准算法的适当比对，并考虑序列在比较窗口上的相同程度。序列同一性可以使用计算机算法(例如GAP、BESTFIT、FASTA和BLAST程序家族)来确定，例如Altschul etal.,1997,Nucl.Acids Res.25 3389所公开的。关于序列分析的详细讨论可见于CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY Eds.Ausubel et al.(John Wiley&Sons Inc NY,1995-1999)第19.3单元。
蛋白质片段可以包含本文公开的氨基酸序列的多达5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％，优选高达80％、85％，更优选高达90％或高达95-99％。在一些实施方案中，蛋白质片段可以包含本文公开的氨基酸序列的至多5、10、20、40、50、70、80、90、100、120、150、180、200、220、230、250、280、300、330、350、400或450个氨基酸，例如SEQ ID NO:1-55。
从上文可以理解，本文所述的生物传感器响应于与一种或多种靶分子结合、相互作用或以其他方式检测一种或多种靶分子而与底物分子反应从而产生电子。在本文中，与底物分子“反应”是指将底物分子酶催化转化成一个或多个产物分子，其中每个底物分子净产生或总体产生一个或多个电子。因此，生物传感器用作电子供体，由此反应产生的电子可以直接或经由电子穿梭体(例如但不限于吩嗪硫酸甲酯或亚铁氰化钾)流动，从而充当阳极。所产生的阳极和阴极之间的电势变化可被电子探测器检测到。图12中示出了这种装置的一个非限制性例子。
本发明的另一方面提供了包含一个或多个本文公开的生物传感器与一种或多种底物分子组合的试剂盒或组合物。
另一方面，本发明提供了检测靶分子的方法，所述方法包括使上述方面的组合物与样品接触的步骤，从而确定样品中靶分子的存在或不存在。
样品合适地是生物样品。生物样品可包括器官样品、组织样品、细胞样品、流体样品或从生物体或生物体组分可获得的、已获得的、可衍生的或已衍生的任何其他样品。生物样品可以包含发酵培养基、原料或食物产品，例如但不限于乳制品。
在具体的实施方案中，生物样品可得自哺乳动物，优选人。举例来说，生物样品可以是流体样品，如血液、血清、血浆、尿液、唾液、泪液、汗液、脑脊髓液或羊水；组织样品，如组织或器官活组织检查物；或可以是细胞样品，例如包含红细胞、淋巴细胞、肿瘤细胞或皮肤细胞的样品，但不限于此。一种特定类型的生物样品是病理样品。
合适地，生物传感器的酶活性基本上不受样品组分(例如血清蛋白质、代谢物、细胞、细胞碎片和组分、天然存在的蛋白酶抑制剂等)的抑制。
在一个实施方案中，生物传感器和/或使用方法可以适用于药物测试，例如用于检测成瘾性非法药物(例如大麻素类、安非他明类、可卡因、海洛因等)的使用和/或用于检测体育运动中的提高比赛成绩的物质和/或通常用于避免检测到提高比赛成绩物质的掩蔽剂。这可能适用于检测人类和/或其他哺乳动物(如可能遭受非法“兴奋剂”以提高比赛成绩的赛马和赛狗)禁用的提高比赛成绩物质。
在另一个具体的实施方案中，生物传感器和/或使用方法用于诊断哺乳动物(例如人)的疾病或病症。
因此，本发明的一个优选方面提供了诊断人类疾病或病症的方法，所述方法包括使上述方面的组合物与从人获得的生物样品接触的步骤，从而确定生物样品中是否存在目标分子，确定是否存在目标分子有助于诊断该疾病或病症。
所述疾病或病症可以是检测到靶分子有助于其诊断的任何疾病或病症。目标分子或分析物的非限制性实例包括如前所述的血液凝固因子、包括PSA的激肽释放酶、基质金属蛋白酶、病毒和细菌蛋白酶、抗体、葡萄糖、甘油三酯、脂蛋白、胆固醇、肿瘤抗原、淋巴细胞抗原、自身抗原和自身抗体、药物、盐类、肌酸酐、血清或血浆蛋白、杀虫剂、尿酸、人和动物代谢产物和中间体以及金属。
本发明的这个优选方面可被调整而适于作为“床旁”方法来执行，由此以在患者位置确定是否确定目标分子，然后在该位置分析或传输到远程位置，以诊断疾病或病症。
本发明的又一方面提供了一种检测装置，其包括包含任何前述方面的生物传感器的小室或腔室。
适当地，可以将样品引入小室或腔室中，从而有助于检测靶分子。
在某些实施方案中，检测装置能够提供指示目标分子存在的电化学声学和/或光学信号。
检测装置通过包括以下部件还可以由诊断目标结果提供疾病诊断:
处理器；和
连接到所述处理器的存储器，所述存储器包括计算机可读程序代码组件，所述计算机可读程序代码组件在由所述处理器执行时执行一组功能，包括:
分析诊断测试结果并提供疾病或病症的诊断。
所述检测装置通过包括以下部件可以进一步提供用于传送诊断测试结果:
处理器；和
连接至处理器的存储器，所述存储器包括计算机可读程序代码组件，所述计算机可读程序代码组件在由所述处理器执行时执行一组功能，包括:
将诊断结果传输到接收设备；和
可选地从该或另一接收设备接收疾病或病症的诊断。
本发明的诊断方面还可以是试剂盒的形式，其包含能够检测一种或多种不同靶分子的一个或多个不同生物传感器。就这一点而言，试剂盒可以包含能够检测多种不同的靶分子的不同生物传感器的阵列。如上文所述，所述试剂盒还可以包含一个或多个放大分子(amplifier molecule)、钝化分子(deactivating molecule)和/或标记的底物。试剂盒还可以包含附加组分，包括诸如缓冲液和稀释剂的试剂、反应容器和使用说明书。
本发明的另一方面提供了编码本发明的生物传感器的氨基酸序列或其上文所定义的变体的分离的核酸。
如本文所用，术语“核酸”指单链或双链的mRNA、RNA、cRNA、RNAi、siRNA和DNA，包括cDNA、线粒体DNA(mtDNA)和基因组DNA。
“多核苷酸”是具有八十(80)个或更多个连续核苷酸的核酸，而“寡核苷酸”具有少于八十(80)个连续核苷酸。“引物”通常是单链寡核苷酸，优选具有15-50个连续核苷酸，其能够与互补核酸“模板”退火并通过DNA聚合酶(如Taq聚合酶、依赖于RNA的DNA聚合酶或SequenaseTM)的作用以模板依赖的方式延伸。“探针”可以是单链或双链寡核苷酸或多核苷酸，其适于被标记而用于在例如Northern或Southern印迹中检测互补序列。
本发明还提供了分离的核酸的变体和/或片段。变体可以包含与本文公开的任一核苷酸序列具有至少70％、至少75％，优选至少80％、至少85％，更优选至少90％、91％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸序列同一性的核苷酸序列。在其他实施方案中，核酸变体可以在高度严格条件下与本文公开的任何核苷酸序列杂交。
片段可以包含存在于本文公开的任何核苷酸序列中的连续核苷酸的多达5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95-99％。
片段可以包含存在于本文公开的任何核苷酸序列中的多达20、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1350或1300个连续核苷酸或由该数量的连续核苷酸组成。
本发明还提供“遗传构建体”，其包含与一个或多个另外的核苷酸序列可操作地连接的一个或多个本文公开的分离的核酸、其变体或片段。
如本文通常使用的，“遗传构建体”是掺入和/或有助于使用本文公开的分离的核酸的人工产生的核酸。
在具体的实施方案中，此类构建体可用于所述分离的核酸的重组操作、增殖、扩增、同源重组和/或表达。
如本文所用，用于重组蛋白表达的遗传构建体被称为“表达构建体”，其中待表达的分离的核酸与表达载体中的一个或多个另外的核苷酸序列可操作地连接。
“表达载体”可以是自我复制的染色体外载体(如质粒)，也可以是整合到宿主基因组中的载体。
在这种情况下，一个或多个另外的核苷酸序列是调控性核苷酸序列。
“可操作地连接”是指所述调控性核苷酸序列相对于待表达的核酸进行定位以启动、调控或以其他方式控制核酸的表达。
调控性核苷酸序列通常适合用于表达的宿主细胞。本领域已知许多类型的用于各种宿主细胞的合适的表达载体和合适的调控性序列。
一种或多种调控性核苷酸序列可以包括但不限于启动子序列、前导序列或信号序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列、剪接供体/受体序列和增强子或激活子序列。
可以使用本领域已知的组成型或诱导型启动子，包括例如乳酸链球菌肽诱导型、四环素抑制型、IPTG诱导型、醇诱导型、酸诱导型和/或金属诱导型启动子。
在一个实施方案中，表达载体包含选择标记基因。无论是为了选择转化的细菌(如bla、kanR、ermB和tetR)还是转化的哺乳动物细胞(如潮霉素、G418和嘌呤霉素抗性)，选择性标记都是有用的。
用于表达的合适的宿主细胞可以是原核或真核的，例如包括大肠杆菌(例如DH5α)的细菌细胞、酵母细胞(例如酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母)、昆虫细胞(例如与杆状病毒表达系统一起使用的SF9细胞)，或任何一种哺乳动物或其他动物宿主细胞(如CHO、BHK或293细胞)，但不限于此。
可以通过以下技术将表达构建体导入合适的宿主细胞，包括但不限于，如本领域所熟知的电穿孔、热休克、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、基于脂质体的转染(例如lipofectin法、lipofectamine法)、原生质体融合、显微注射或微粒轰击。
重组生物传感器分子的纯化可以通过本领域已知的任何方法进行。在优选的实施方案中，重组生物传感器分子包含融合伴侣(优选C末端His标签)，其允许借助合适的亲和基质进行纯化，在His标签的情况下亲和基质可以是镍基质或树脂。
为了使本发明容易理解并付诸实践，将参照以下非限制性实施例来描述本发明的实施方式。
实施例
实施例1
基于醋酸钙不动杆菌吡咯并喹啉醌葡萄糖脱氢酶设计电化学生物传感器
在过去的三十年中，生物传感器已经成为医疗保健中使用的复杂昂贵的分析仪器的实用替代品[1]。在目前使用的几种检测技术中，这种光学、声学、压电电化学传感器由于其简单性、特异性和高性能而引人注目[2]。电化学血糖传感器是商业上最成功的生物传感器，占生物传感器市场的近90％[3]。这些传感器的成功归功于其高选择性和高灵敏度以及简单的设计和易于制造。这些传感器是基于监测重组葡萄糖氧化酶或葡萄糖脱氢酶在葡萄糖氧化过程中的电流来设计的[4]。在这里，干燥的分析室充满了引起具有高电流密度的酶反应的样品。第三代葡萄糖传感器也独立于氧和电子传递介质，使得系统不易漂移[5]。该设计的简单性和稳健性使得一次性葡萄糖传感电极的制造成本低于0.1美元[6]。值得注意的是，尽管临床需求和床旁诊断的商业潜力很大，但这种技术和商业上的成功并未在其他电化学生物传感器上实现。这可以至少部分地由葡萄糖传感的独特特征来解释，在葡萄糖传感中，分析物以高(4-10mM)浓度存在，并且还为选择性的、物理稳定的和高度有进行性(processive)的电化学受体提供能量来源。
材料和方法
嵌合基因构建和蛋白质的表达和纯化
GDH-CaM嵌合蛋白的构建体根据生产商说明书(New England Biolab)通过GibsonAssemblyTM方法产生并克隆到PET28a载体中。用于装配的基因片段通过PCR或通过来自IDT(Integrated DNA Technologies)的Gblcok基因合成来制备。Olsthoorn&Duine19描述了蛋白质的表达和纯化。纯化的GDH-CaM通过以1:1.5的比例加入PQQ来重构。GDH和PQQ重构的这一比例也用于使用本文所述的PQQ-GDH酶的所有其他实验中。
如文献所述纯化环孢菌素传感器的蛋白质(http://www.pnas.org/content/99/21/13522)。在Ni-NTA纯化后，向合并的含酶馏分补充EDTA至终浓度5mM，并用含有20mMKH2PO4 pH7.0和5mM EDTA的缓冲液透析10小时。随后通过将样品用仅含有20mM KH2PO4pH7.0的缓冲液透析以除去EDTA。
GDH酶活性的分析
如Yu等人所述20进行GDH酶测定。简而言之，1.5-mL测定系统由20mM葡萄糖、0.6mM吩嗪硫酸甲酯、0.06mM 2,6-二氯苯酚、10mM MOPS(pH7.0)和相应浓度的CaCl2和酶组成。通过监测在600nm处2,6-二氯苯酚的吸光度的降低，在25℃下进行酶测定。
GDH-Cam活性的电化学分析
使用接入到DropSens一次性丝网印刷金电极(Cat#DRP-C220BT)的Digy-IvyDY2116B 3电极微型恒电位仪进行计时电流(chronoamperometric)测量。扫描之间用98℃milliQ水洗涤电极，以确保不存在结合的活性酶。反应物包含:300nM GDH-CaM、3mM的PMS介质、50mM葡萄糖、50μl总体积、pH 7.6PBS。加入40mM葡萄糖开始反应并在室温下孵育1分钟，然后移液到电极表面上。计时电流测量在相对于丝网印刷电极上的嵌入银带为+0.4V下进行5秒，数据通常报告为不同钙浓度时在5s时间点的电流(图2C)。
结果
我们推测葡萄糖生物传感器技术的进步可以探索与葡萄糖结构不相关的分析物的生物传感器的设计。为此，我们选择了能够进行直接电子转移的醋酸钙不动杆菌吡咯并喹啉醌葡萄糖脱氢酶(PQQ-GDH)作为生物传感器设计的起点[7][8]。然而，我们不是试图修改酶的底物特异性，而是要赋予酶以变构受体结构域，其以配体依赖性方式控制其催化活性。为了实现这一目的，我们分析了醋酸钙不动杆菌PQQ-GDH(PDB:1CQ1)的高分辨率结构，以寻找活性中心附近的可能位点，该位点将足够近以将构象变化传递到活性中心，同时足够远而容忍受体结构域的插入。
包括带下划线的N末端前导序列的PQQ-GDH氨基酸序列示于SEQ ID NO:50。具有被切割的N-末端前导序列的成熟PQQ-GDH氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示:
信号序列切割前的蛋白质序列(SEQ ID NO:50)
M N K H L L A K I A L L G A A Q L V T L S A F A D V P L I P S Q F A KA K S E N F D K K V I L S N L N K P H A L L W G P D N Q I W L T E R A T G K IL R V N P E S G S V K T V F Q V P E I V N D A D G Q N G L L G F A F H P D F KN N P Y I Y I S G T F K N P K S T D K E L P N Q T I I R R Y T Y N K S T D T LE K P V D L L A G L P S S K D H Q S G R L V I G P D Q K I Y Y T I G D Q G R NQ L A Y L F L P N Q A Q H T P T Q Q E L N G K D Y H T Y M G K V L R L N L D GS I P K D N P S F N G V V S H I Y T L G H R N P Q G L A F T P N G K L L Q S EQ G P N S D D E I N L I V K G G N Y G W P N V A G Y K D D S G Y A Y A N Y S AA A N K T I K D L A Q N G V K V A A G V P V T K E S E W T G K N F V P P L K TL Y T V Q D T Y N Y N D P T C G E M T Y I C W P T V A P S S A Y V Y K G G K KA I T G W E N T L L V P S L K R G V I F R I K L D P T Y S T T Y D D A V P M FK S N N R Y R D V I A S P D G N V L Y V L T D T A G N V Q K D D G S V T N T LE N P G S L I K F T Y K A K
成熟蛋白质(SEQ ID NO:1)
D V P L I P S Q F A K A K S E N F D K K V I L S N L N K P H A L L W GP D N Q I W L T E R A T G K I L R V N P E S G S V K T V F Q V P E I V N D A DG Q N G L L G F A F H P D F K N N P Y I Y I S G T F K N P K S T D K E L P N QT I I R R Y T Y N K S T D T L E K P V D L L A G L P S S K D H Q S G R L V I GP D Q K I Y Y T I G D Q G R N Q L A Y L F L P N Q A Q H T P T Q Q E L N G K DY H T Y M G K V L R L N L D G S I P K D N P S F N G V V S H I Y T L G H R N PQ G L A F T P N G K L L Q S E Q G P N S D D E I N L I V K G G N Y G W P N V AG Y K D D S G Y A Y A N Y S A A A N K T I K D L A Q N G V K V A A G V P V T KE S E W T G K N F V P P L K T L Y T V Q D T Y N Y N D P T C G E M T Y I C W PT V A P S S A Y V Y K G G K K A I T G W E N T L L V P S L K R G V I F R I K LD P T Y S T T Y D D A V P M F K S N N R Y R D V I A S P D G N V L Y V L T D TA G N V Q K D D G S V T N T L E N P G S L I K F T Y K A K
通常，残基编号将是成熟蛋白(SEQ ID NO:1)的编号。SEQ ID NO:50的氨基酸25-478是成熟蛋白的残基1-454。
我们的选择落在连接β-折叠3的链A和B的环上(图1A，B)。链A的起点含有His144，它是从葡萄糖O1原子中提取质子的一般基础[9]。由于His144对于催化是至关重要的，我们推测通过分离链A和B而引入的扭转引起的位错将导致GDH催化活性的改变。我们决定通过在连接链3A和3B的环中掺入已知在配体结合时发生大的构象变化的蛋白质结构域来测试这个想法(图1B)。
该环背离结构和同源二聚体中的第二个亚基，减少空间冲突的可能性。作为一个插入结构域，我们选择钙调蛋白(CaM)，一种17kDa的蛋白质，它在真核细胞的钙信号向靶蛋白的传输中发挥重要作用[10]。Ca2+与CaM的四个EF-hand结构的结合导致大的构象变化，在CaM的两个小叶(lobe)的每一个内打开一个肽结合口袋。基于荧光蛋白的光谱变化或FRET强度或b-内酰胺酶活性，CaM的这一特征已被反复用于构建可遗传编码的Ca2+传感器[11][12]。
基于GDH和CaM的可用结构信息[10]，我们设计了嵌合蛋白，其中在PQQ-GDH的残基153和155之间插入了小鼠CaM 12-67的残基。为了减少结构张力和冲突，我们还在连接位点引入了钙调蛋白N-末端的GSGS连接子和钙调蛋白C-末端的Gly连接子。得到的蛋白质在大肠杆菌中重组产生，并通过Ni-NTA亲和层析纯化至均一。然后，我们使用建立的比色法分析GDH-CaM嵌合蛋白的活性[13]。如图2所示，在不存在Ca2+离子的情况下，CaM-GDH几乎不显示酶活性。CaCl2的加入导致嵌合蛋白的剂量依赖性激活，而对野生型酶的作用仅有限。当加入Ca2+螯合剂EDTA时，酶返回到基态，因此激活是可逆的(图2A)。在选定的实验条件下的信号变化是30倍。Ca2+滴定数据的分析显示，对Ca2+浓度的响应是非线性的，这在之前关于CaM的报道中已有描述，反映了Ca2+的协同结合[14]。
数据的拟合表明，所开发的传感器具有600nM的Ca2+亲和力，并在400至500nM之间显示出最大信号变化。虽然600nM的Kd反映了CaM在细胞内环境中对离子化的亲和力，但该离子的细胞外浓度要高得多。体液(如血液、尿液和唾液)中的Ca2+浓度在1和2mM之间[15]。快速评估这些参数的能力在临床中很重要，因为偏离标准浓度往往反映慢性病理状态，如内分泌紊乱、骨质疏松和癌症或急性状态(如败血症和急性肾功能衰竭)[15]。因此，快速准确的离子钙测试对于床旁(POC)诊断是非常有价值的。虽然原则上可以简单地稀释生物样品直到Ca2+浓度落入传感器的响应范围内，但是这会显著降低其对POC应用的吸引力。相反，我们测试了我们是否可以缓冲Ca2+浓度，使其以自由浓度进入传感器响应范围。为此，我们在存在良好表征的Ca2+螯合剂1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N′,N′-四乙酸(BAPTA)的情况下重复我们的实验。向样品中加入1.1mM的BAPTA使得我们能够将传感器的最佳响应转换成血液样品中生理Ca2+浓度的范围(图2C)。我们还测试了Mg2+是否会影响Ca2+生物传感器的响应。图2C所示的结果表明，通过Ca2+激活我们的嵌合GDH不受Mg2+存在的影响。这个结果支持了所开发的GDH-Cam嵌合蛋白适用于构建POC生物传感器的想法。
能够开发廉价的血糖仪条的特征是GDH在脱水和再水合后保留其活性的能力。我们测试了我们的嵌合蛋白在干燥和再水合后保留活性的能力，并证实类似于野生型GDH，嵌合蛋白在再水合时保持其活性。为了进一步分析开发的生物传感器在分析和诊断应用中的用途，我们试图在标准血糖仪的基础上创建Ca2+计。为此，我们剥离了酶混合物的标准Akku-Chek电极，代之以GDH-Cam嵌合蛋白、葡萄糖和PMS介体的混合物。我们证明传感电极被人唾液中的Ca2+离子激活，并且可以使用标准血糖仪检测生物传感器产生的电流(图13)。
现在参考图4-9和图15(SEQ ID NO:2-10)，其显示了工程化的“死”或催化失活的GDH酶的实施方案。最初的想法是将GDH分成两部分或两个片段:第一部分或片段是GDH(1-153AA)；第二部分或片段是GDH(155-454AA)。然后可将结合部分偶联到每个部分以检测靶分子。例如，对于雷帕霉素传感器，我们将FRB连接到GDH(1-153AA)，将FKBP连接到GDH(154-454AA)。
然而，只有蛋白质GDH(1-153AA)-FRB可以从大肠杆菌纯化，而FKBP-GDH(154-454AA)不可以。因此，采用不同的方法来产生可以从大肠杆菌中纯化的构建体:GDH(1-153AA,Q76A,D143A,H144A)-TVMV切割位点-FKBP-GDH(155-454AA)。
GDH的H144是GDH的关键催化残基。根据初始实验数据，只有三重突变(Q76A,D143A,H144A)才使该GDH变体失活。通过TVMV切割后，通过FRB和FKBP与雷帕霉素的结合，FKBP-GDH(154-454AA)可用于重构完整的、具有催化活性的GDH。
另外，即使把GDH分成两部分，它们也可以自己重构。自我重构的亲和力(Kd)约为50-100nM。因此，在目前的检测条件下，我们将GDH的两个部分的浓度设定为低于100nM，以具有低程度的自我重构(导致低活性背景)。另一种方法是用高过量的GDH(1-153AA,Q76A,D143A,H144A)进行测定以防止GDF(1-153AA)-FRB与FKBP-GDH(155-454AA)的自我重构。
总之，我们在这里介绍了Ca2+门控电化学传感器的成功的结构导向设计的第一个例子。我们的方法与已报道的使用催化位点修饰或辅基修饰的特异性工程化方法相背离[8][16]。相反，我们在GDH分子中间识别了一个插入位点，该位点接近催化中心，并且耐受插入大的自主折叠蛋白结构域。结构域插入策略以前已经有几次使用，并且成功地产生了人工变构调节酶[17][18]，但从未应用于电化学活性酶。所描述的方法改变了生物传感器的操作模式，其中催化速率不再受葡萄糖浓度的限制，而由所选择的分析物门控。GDH的高转换率(turnover rate)使其成为用于其他类型传感器设计的极具吸引力的框架(chassis)。GDH中识别的插入位点现在可以用于插入其他传感结构域。虽然这个过程在很大程度上是经验性的，并涉及大量的优化，但已得到的数据表明，一旦蛋白质中的插入位点被识别，它们就可以被用于插入多个结构域[12]。鉴于基于GDH的葡萄糖传感器的广泛使用和终端测量设备的可获得性，我们的方法有希望使Ca2+传感器快速引入临床实践。
我们还开发了一种基于非活性工程化GDH片段的通用生物传感器架构，该非活性工程化GDH片段在暴露于选定分析物时形成活性酶。我们证明，通过交换配体识别，可以构建出蛋白质、小分子和酶活性的合成电化学受体。
基于分裂GDH的双组分受体架构
对先前报道的钙调蛋白-GDH生物传感器Ca2+生物传感器的性质的分析使我们确信，GDH是用于构建合成电化学受体的优良构件。它的高物理稳定性和非常高的催化速率(每秒钟Kcat 3860)使其成为与电子设备直接接合的理想驱动器。观察到β-折叠3的连接链A和B的环可以容忍大结构域的插入，这促使我们测试该酶是否可以在该位置被分裂并用于构建双组分重构系统(图4)。为此，我们在大肠杆菌中表达了与FRB和FKBP结构域融合的该酶的N末端和C末端部分，它们在雷帕霉素存在下形成复合物。虽然FRB-GDH1-153可以生产和纯化到均一，但FKBP-GDH155-454形成包涵体并且不能以可溶形式生产。考虑到分裂暴露了蛋白质的疏水核心，这并不是完全令人惊讶的。分裂的蛋白通常在体内比在体外表现好得多，因为受损的完整性和稳定性在一定程度上可以被体内伴侣系统(chaperon system)补偿。
然而，GDH的N-末端片段物理稳定且显然自主折叠的事实鼓励了我们。我们进而推测，如果C端片段可以在溶液中稳定，我们可能能够继续我们原来的计划。为此，我们构建了GDH的变体，其中TVMV切割位点设在连接链A和B并且在其C端携带FKBP结构域的环中。我们还将活性位点中催化活性上重要的残基Gln76、Asp143和His144突变为Ala，使融合蛋白催化失活。
得到的蛋白质以可溶形式重组生产，并且如预期的那样没有显示出可检测的催化活性。当融合蛋白与纯化的FRB-GDH1-153在存在和不存在雷帕霉素的情况下混合时，活性恢复得非常少。然后，我们消化了含有连接GDH的N-和C-片段的环的蛋白酶切割位点，并重复重构实验。和以前的情况一样，GDH活性很少被恢复。然而，当系统暴露于雷帕霉素时，我们观察到GDH活性的快速和剂量依赖性恢复，表明GDH的失活的N-末端片段被FRB融合的GDH1-153片段置换(图4和5A)。我们用增加浓度的雷帕霉素滴定反应，并将观察到的速率拟合成二次方程式。所获得的11nM的值与Banaszynski等人(J Am Chem Soc 2005,127:4715-21)先前公布的12nM值相当一致。重要的是，由于过量的相关免疫抑制剂化合物如FK506和环孢菌素不能将生物传感器激活到可感知(appreciable)的程度，所以该反应是特异性的。
测试所开发的生物传感器架构的一般性质
接下来我们将测试开发的架构是否具有足够的通用性，并且可以扩展到其他生物标志物上。由于雷帕霉素(西罗莫司)属于大环免疫抑制剂类，并且环孢菌素和FK506(他克莫司)与所开发的生物传感器不交叉反应，我们想知道是否也可以开发用于这些药物的类似的生物传感器。另外，免疫抑制剂的治疗窗口非常狭窄，并且目前还没有床旁检测，因此我们更有动机这样做。
我们分析了环孢菌素与钙调磷酸酶A和B及肽基脯氨酰顺反异构酶(PDB:1MF8)的可获得的共晶结构，以及FK506与钙调磷酸酶A和B以及FKBP(PDB:1TCO)复合的可获得的共晶结构。该复合物的拓扑结构使我们能够设计出GDH片段的融合蛋白，当复合物组合体被配体诱导时，GDH片段预期会进入分子附近。以重组和纯化形式产生融合蛋白(表1)。所开发的生物传感器以剂量依赖性方式对同源药物作出响应(图5B和C)，并且即使当非同源药物以高浓度存在时也不显示可检测的交叉反应性。这些结果表明，所开发的生物传感器架构可以快速用于通过已知靶标来检测异生物。
在下一步，我们想测试所开发的生物传感器架构是否可以应用于蛋白质生物标志物的检测。作为第一个例子，我们选择了常用作人类应激生物标志物的唾液α淀粉酶。我们分析了α淀粉酶的可获得的晶体结构，并识别出与VHH结构域(PDB:1KXQ，1KXT，1KXV和1BVN)结合的猪α-淀粉酶的三种晶体结构。由于人类和猪α-淀粉酶具有97％的序列同一性，我们预期VHH结构域将能够识别人类唾液α-淀粉酶。基于结构分析，我们假设从PDB:1KXV和PDB:1BVN提取的VHH结构域将非竞争性结合人唾液α淀粉酶。为此，我们构建了GDH1-153-VHH1KXV融合蛋白和带有VHH1BVN插入的GDH失活突变体的融合蛋白，并将它们以重组形式生产。将人唾液α淀粉酶添加到两种重组蛋白的混合物中导致GDH活性的剂量依赖性增加，在更高的浓度下活性降低，反映了α淀粉酶复合物的形成，仅有一种融合蛋白与之结合。这些结果表明，所开发的传感器架构可以用于检测蛋白质生物标志物(图6)。
最后，我们想确定开发的传感器架构是否可用于测量酶活性而不是化学实体。作为一个测试的例子，我们选择了构成地球上最大的一类蛋白质的蛋白酶。为了将该蛋白酶活性与由片段重构GDH相关联，我们创建了SH3结构域的自抑制形式，其中SH3结构域结合肽通过蛋白酶-可消化接头连接到SH3结构域(图8)。在这种构造中，只要连接结构域和其配体的连接体是完整的，就可以保护SH3结构域免受外部SH3结构域结合肽的结合。我们将自抑制的SH3模块融合至GDH1-153的C末端，而将SH3肽插入无活性的全长GDH，而蛋白酶切割位点位于N-末端。在这个设计中，我们在SH3结构域和它的配体之间以及GDH1-153失活的N-末端和SH3结合肽之间放置了因子Xa切割位点。当以重组形式产生的构建体的溶液混合在一起时，只能检测到很少的GDH活性，表明SH3肽不能驱动酶的重构。然而，因子Xa的加入导致GDH活性的时间依赖性增加，表明自抑制肽的蛋白水解去除能够使SH3肽反式结合并重构活性复合物。为了证明蛋白酶生物传感器的通用性，我们用凝血酶切割位点取代了因子Xa切割位点。我们使用凝血酶切割位点和凝血酶蛋白酶重复了相同的实验，并且在存在蛋白酶的情况下观察到生物传感器的强力激活。
当比较蛋白酶生物传感器与免疫抑制剂和淀粉酶的响应速率时，我们注意到前者的激活显著较慢。我们怀疑这是由于凝血酶的Km值低的原因，导致接头消化速率相对较慢。我们推测在接头中引入额外的凝血酶结合基序“KTAPPFDFEAIPEEYL”(SEQ ID NO:39)将通过减少非生产性蛋白酶:肽复合物的完全解离来加速整体切割反应。实际上掺入凝血酶底物序列和额外结合基序的两个拷贝增加了生物传感器的响应速率和灵敏度(图8C)。类似地，在因子Xa的生物传感器的情况下，向连接SH3和SH3结合结构域的接头中引入两个另外的切割位点，导致灵敏度和响应速率增加(图8E和F)。
分析所开发的生物传感器的稳定性以构建感应电极
基于GDH的葡萄糖监测仪的巨大成功至少部分是由于酶的高稳定性，其允许电极上的生物传感器脱水并且在环境温度下长期储存。为了测试所设计的GDH形式是否可以以功能形式干燥和再水合，我们在不同温度下孵育干燥的雷帕霉素生物传感器长达4小时。数据显示，直到40度之前没有任何活性损失，到50度时只有很少的活性降低。我们还在室温下放置了干燥的雷帕霉素生物传感器达14天，活性没有发现变化，表明它们适合构建感应电极。接下来，我们使用市售的恒电势器测量生物传感器在计时电流测量中的性能。使用连接到DropSens一次性丝网印刷的金电极(Cat#DRP-C220BT)的Autolab PGSTAT204恒电势器(Eco Chemie)进行计时电流测量。每次测量都使用新的传感器。反应物包含:22.5nM AMY-1、18.7nM AMY-2 PQQ、3.7nM TVMV、1.0mM 1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸甲脂、50mM葡萄糖、2.0mM MgCl2、50uM CaCl2和0、2、4、6、8、10、15、20、30、40、50、100、200、300、400、600、800或1000nM人唾液α淀粉酶，45μl总体积，反应介质为pH 7.4的PBS。加入1mM 1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸甲脂和50mM葡萄糖开始反应，并在移液到电极表面上之前在室温下孵育30秒。经过180秒的等待时间后，在相对于丝网印刷电极上嵌入的银条为+0.4V下，进行5秒计时电流法，数据通常报告为在5秒时间点时的电流(vs淀粉酶浓度)。
自抑制GDH酶的设计
我们进一步设计了GDH酶，其包括抑制酶的催化活性的抑制性部分，然后可以通过蛋白酶将其从酶上切下以重构活性。蛋白酶切割事件还可以与生物传感器的不同组分之间的结合相互作用相关联，这取决于靶分子的存在。图3A-E中显示了这种类型的自抑制酶以及显示酶激活和靶分子检测的数据。还对GDH酶进行了突变以改进抑制肽对活性位点的锚定，并进一步鉴定了这些突变体中抑制活性的抑制肽。由此产生的自抑制GDH模块为蛋白酶活性检测提供了通用平台，其中生物传感器的特异性可通过用相应蛋白酶的识别位点取代该蛋白酶切割位点而改变。
自抑制(AI)GDH模块的可获得性使得能够构建不同的受体架构，例如双组分受体，其中AI-GDH模块通过与配体相互作用而支架化的可操作连接的结合域的作用而接近蛋白酶(图3E)。例如，基于所开发的AI-GDH模块构建雷帕霉素受体。此外，相同的AI-GDH单元可以整合到图3G中例示的可逆受体架构中。此外，可以通过将配体结合时发生构象变化的分析物结合域整合到连接GDH与AI的接头中来实现AI-GDH模块的可逆的分析物介导的激活(图3H)。
一些上述实验中使用的抑制部分也通过体外筛选试验来鉴定。更详细地说，可以在96孔板中直接在大肠杆菌细胞培养物的上清液中使用中等通量试验来设计来自独立功能性蛋白质结构域(例如报道酶、相应的活性位点特异性结合物和分析物特异性结合受体)的自抑制GDH模块。为此目的，首先将假定的活性位点特异性结合物(先前已通过噬菌体展示或相关筛选和选择程序鉴定)的DNA文库插入报道酶GDH的C-末端，通过柔性接头和TVMV的切割位点隔开，其作为分析物特异性受体。将得到的融合蛋白在IPTG诱导型启动子和PelB前导肽的控制下克隆，以在赋予卡那霉素抗性的pET-28载体的骨架中进行周质表达。在转化到大肠杆菌BL21RIL中之后，在卡那霉素存在下将细胞铺在琼脂平板上，并在37℃下过夜生长。第二天，将200μL补充有卡那霉素和氯霉素的LB培养基接种单独的菌落，并在37℃下生长5-6小时。然后用0.2mM IPTG诱导推测的自抑制GDH模块的表达，并在18℃下表达24小时。为了测定自抑制的GDH模块，细胞培养物的上清液通过以4,500g离心细胞10分钟来分离，同时将所得上清液(45μL)在存在和不存在TVMV蛋白酶(5μL，1mg/mL蛋白酶)处理1小时，测定GDH活性，测试反应物:600nM 2-6-二氯苯基-靛酚(DCPIP)、600nM吩嗪硫酸甲酯(PSF)、60nM PQQ和20mM葡萄糖，用100μM CaCl2和20mM K2HPO4缓冲为pH7.0。通过测量620nM处吸光度的降低来监测反应。
该试验提供了中等通量的体外筛选以允许处理推测的抑制性部分。
结论
将诊断和分析从专业设施转移到床边或农场等行动地点，预计将为个人和整个社会带来益处。这些益处包括知情决策、最终用户参与和成本降低。迄今为止，只有葡萄糖监测仪等电化学生物传感器能满足广泛部署的性能和成本基准。葡萄糖监测仪的成功与病症的性质、同时作为能源的分析物的丰度以及生物传感器的显著稳定性有关。
本文中，我们建立在高度先进的血糖仪技术基础上，将生物传感器GDH重新设计成一个通用的生物传感器架构。通过利用酶的显著生物物理稳定性，我们将其转化为双组分信号传导系统，其中单个组分既无活性也不能重新组装。这是通过创建一个分裂酶来实现，其具有无活性片段，既作为自发激活的抑制剂，又作为一个伴侣因子，确保酶的有活性的一半正确的折叠和稳定性。这将所开发的架构与其他分裂酶系统区分开来，所述其他分裂酶系统经常具有较差的生物物理性质，限制了它们在体外应用中的效用。
所开发的系统的激活是通过分析物介导的片段支架(scaffolding)实现的，这导致非活性N-末端片段被其活性形式浓度驱动的置换。激活的动力学似乎是令人惊讶的迅速，表明N-和C-末端复合物的高解离速率。实际上，系统响应的快速性使其适合于床边应用。我们使用已开发的基本架构来构建一系列的小分子、蛋白质和蛋白酶活性的生物传感器。传感器表现出优异的响应速度、灵敏度和选择性，确认该系统是真正的模块化，可以实际应用于任何可以找到结合域的分析物。原则上，该系统可以扩展到半合成系统，并用于检测由小分子、DNA、RNA和其他类型的生物合成聚合物和翻译后修饰介导的关联事件。
这具有潜在的重要意义，因为无处不在的互联网个人电子设备的存在长期以来支持个人移动分析和诊断应用的想法。然而，迄今为止，标准分析技术的小型化不能够得到足够小、便宜且便携的生物传感应用程序以将其容易地安装在移动设备上。本文介绍的方法可能允许将为葡萄糖监测所开发的便宜和便携式技术用于潜在的任何分析物。GDH的高催化速率和由此产生的电子电流简化了分子识别事件的检测，这可能实现电极小型化和多路复用(multiplexing)。
表1:药物传感器的蛋白组分
在整个说明书中，目的是描述本发明的优选实施例，而不将本发明限制为任何一个实施例或特征的特定集合。在不脱离本发明的情况下，可以对所描述和图示的实施例进行各种改变和修改。
本说明书中引用的每个专利和科学文献、计算机程序和算法的公开内容通过引用整体并入。
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Claims (45)

1.一种生物传感器，其包含能够在催化活性状态下与底物分子反应以产生一个或多个电子的酶的至少一个氨基酸序列；和可释放地将所述酶保持在催化失活状态的至少一个异源传感氨基酸序列，其中所述异源传感氨基酸序列对靶分子有应答以将所述酶的氨基酸序列从催化失活状态转换成所述催化活性状态。
2.根据权利要求1所述的生物传感器，其中所述至少一个酶氨基酸序列和所述至少一个异源传感氨基酸序列存在于单个连续氨基酸序列的至少一部分中或形成单个连续氨基酸序列的至少一部分。
3.根据权利要求2所述的生物传感器，其中所述至少一个异源传感氨基酸序列是所述至少一个酶氨基酸序列中的插入片段，从而有利于在所述催化失活状态和所述催化活性状态之间转换所述酶氨基酸序列。
4.根据任一项前述权利要求所述的生物传感器，其中所述异源传感氨基酸序列结合所述靶分子，从而将酶的氨基酸序列从催化失活状态转换为催化活性状态。
5.根据任一项前述权利要求所述的生物传感器，其中所述异源传感氨基酸序列是钙结合蛋白的氨基酸序列或其片段。
6.根据权利要求5所述的生物传感器，其中所述钙结合蛋白是钙调蛋白。
7.一种生物传感器，其包含当处于催化活性状态时能够与底物分子反应以产生一个或多个电子的酶的至少一个氨基酸序列；以及所述酶的至少一个其他氨基酸序列，所述至少一个其他氨基酸序列被工程化以将所述酶可释放地保持在催化失活状态，其中所述生物传感器响应于靶分子以将所述酶的氨基酸序列从所述催化失活状态转换至所述催化活性状态。
8.根据权利要求7所述的生物传感器，其中所述酶的所述至少一个其他氨基酸序列被工程化以包含一个或多个氨基酸序列突变。
9.根据权利要求8所述的生物传感器，其中当处于催化活性状态时能够与底物分子反应以产生一个或多个电子的所述酶的所述至少一个氨基酸序列，与被工程化以将酶可释放地保持在催化失活状态的所述酶的所述至少一个其他氨基酸序列，非共价地相互作用。
10.根据权利要求9所述的生物传感器，其中所述生物传感器进一步包含所述酶的又一个氨基酸序列，该又一个氨基酸序列能够置换所述酶的被工程化以将所述酶可释放地保持在催化失活状态的所述至少一个其他氨基酸序列。
11.根据权利要求10所述的生物传感器，其中所述置换通过将所述酶的所述又一个氨基酸序列与能够与底物反应的酶的所述至少一个氨基酸序列非共价地组合以恢复所述酶的催化活性，从而形成功能性催化活性酶。
12.根据权利要求10或11所述的生物传感器，其中所述酶的所述又一个氨基酸序列和能够与底物反应的所述酶的至少一个氨基酸序列包含可通过结合靶分子而相互作用的相应的结合部分，以促进所述又一个氨基酸序列对工程化的氨基酸序列 的置换。
13.根据权利要求10或11所述的生物传感器，其中所述酶的所述工程化的氨基酸序列和能够与底物反应的所述酶的所述至少一个氨基酸序列包含最初相互作用的相应的结合部分，所述相互作用随后因其中一个或另一个结合部分结合靶分子而被破坏，以促进所述又一个氨基酸序列对工程化的氨基酸序列的置换。
14.根据权利要求7至13中的任一项所述的生物传感器，其中所述酶的至少一个氨基酸序列代表所述酶的第一片段序列，并且所述酶的至少一个其他氨基酸序列或又一个氨基酸序列代表所述酶的所述第二片段序列，其中所述第一和第二片段序列能够非共价相互作用以重构稳定的酶。
15.根据权利要求7至14中的任一项所述的生物传感器，其中所述生物传感器适合于检测蛋白酶靶分子，所述生物传感器在所述酶的所述氨基酸序列中包含一个或多个蛋白酶切割位点，任选地，其中所述氨基酸序列还包含增强蛋白酶的结合和/或切割效率的序列。
16.根据权利要求15所述的生物传感器，其中能够与底物反应的所述酶的至少一个氨基酸序列和所述酶的所述又一个氨基酸序列包含各自的结合部分，所述结合部分可以在蛋白酶切割它们之间的结合抑制剂之后相互作用。
17.一种生物传感器，其包含当处于催化活性状态时能够与底物分子反应以产生一个或多个电子的酶的至少一个氨基酸序列；能够结合靶分子的结合部分；和至少一种酶抑制剂，其能够在不存在靶分子的情况下与结合部分相互作用从而抑制所述酶；被设置成使得所述靶分子可以释放所述至少一种酶抑制剂和结合部分之间的相互作用，从而释放抑制剂对酶的抑制，并将酶的氨基酸序列从催化失活状态转换到所述催化活性状态。
18.根据权利要求17所述的生物传感器，其中所述生物传感器包含第一组分、第二组分和第三组分，所述第一组分包含:当处于催化活性状态时能够与底物分子反应以产生一个或多个电子的酶的至少一个氨基酸序列；通过一个或多个蛋白酶切割位点与酶连接或偶联的所述酶的抑制剂；和第一组分结合部分；所述第二组分包含:能够结合所述第一组分结合部分的第二组分结合部分；蛋白酶氨基酸序列；和能够结合靶分子的另一第二组分结合部分；并且所述第三组分包含第三组分结合部分，所述第三组分结合部分可在不存在所述靶分子的情况下与所述第二组分结合部分相互作用；设置成使得所述靶分子可以置换第三组分结合部分和所述第二组分结合部分之间的结合，以促进所述第一组分结合部分与所述第二组分结合部分之间的相互作用，由此蛋白酶切割蛋白酶切割位点以除去所述抑制剂对酶的酶，从而将酶从催化失活状态转换成催化活性状态。
19.根据权利要求18所述的生物传感器，其中所述生物传感器还包含位于所述蛋白酶切割位点附近的增强蛋白酶的结合和/或切割效率的序列。
20.根据权利要求18或19所述的生物传感器，其中所述第三组分结合部分包含可与其中一个所述第二组分结合部分相互作用的第一部分和可在不存在所述靶分子的情况下与所述第二组分结合部分中的另一个相互作用的第二部分。
21.根据权利要求20所述的生物传感器，其中所述靶分子与所述第二组分结合部分的所述另一个的结合抑制所述第三组分的第二部分的结合。
22.根据前述任一项权利要求所述的生物传感器，其中所述酶是氧化还原酶，如葡萄糖脱氢酶。
23.一种葡萄糖脱氢酶(GDH)，其包含响应于靶分子的异源传感氨基酸序列，其中所述靶分子的结合起到调节所述酶的催化活性的作用。
24.根据权利要求20所述的GDH，其中所述异源传感氨基酸序列是钙结合蛋白的氨基酸序列或其功能片段。
25.一种氧化还原酶，其包含抑制性部分，所述抑制性部分用于阻止或降低所述酶的催化活性，其中所述抑制性部分可在一个或多个分子的存在下被置换以激活所述酶的催化活性。
26.根据权利要求25所述的氧化还原酶，其包含一个或多个蛋白酶切割位点，其中通过蛋白酶对一个所述位点的切割去除了所述抑制性部分，以激活所述酶的催化活性，任选地，所述氧化还原酶还包含增强蛋白酶的结合和/或切割效率的序列 。
27.根据权利要求25或26所述的氧化还原酶，所述氧化还原酶包含能够与另一分子上的相应结合部分相互作用的结合部分，其中所述结合部分之间的相互作用去除了所述抑制性部分以激活所述酶的催化活性。
28.根据权利要求27所述的氧化还原酶，所述氧化还原酶包含一个或多个蛋白酶切割位点，其中所述另一分子另外包含蛋白酶，并且结合部分之间的相互作用使蛋白酶接近一个所述位点从而切割所述位点并去除所述抑制性部分。
29.根据权利要求25至28的任一项所述的氧化还原酶，所述氧化还原酶是葡萄糖脱氢酶。
30.一种包含葡萄糖脱氢酶(GDH)的第一片段序列的多肽，其能够与包含所述酶的第二片段序列的多肽非共价相互作用以重构稳定的GDH酶。
31.根据权利要求30所述的包含葡萄糖脱氢酶(GDH)的第一片段序列的多肽，其能够用包含所述酶的第二片段序列的所述多肽重构稳定的催化活性GDH酶。
32.根据权利要求30所述的包含葡萄糖脱氢酶(GDH)的第一片段序列的多肽，其包含使重构的稳定GDH酶催化失活的一个或多个突变。
33.根据权利要求30至32任一项所述的包含葡萄糖脱氢酶(GDH)的第一片段序列的多肽，其包含能够与包含在所述包含所述酶的第二片段序列的多肽中的相应结合部分相互作用的结合部分，其中结合部分之间的相互作用调节重构的稳定葡萄糖脱氢酶的催化活性。
34.根据权利要求33所述的包含葡萄糖脱氢酶(GDH)的第一片段序列的多肽，其中结合部分之间的相互作用通过靶分子的结合来调节。
35.根据权利要求33或34所述的包含葡萄糖脱氢酶(GDH)的第一片段序列的多肽，其进一步包含抑制各个结合部分相互作用的序列，以及一个或多个蛋白酶切割位点，其中蛋白酶的切割使得结合部分之间能够相互作用，任选地，所述多肽还包含增强蛋白酶的结合和/或切割效率的序列。
36.一种组合物或试剂盒，其包含如前述任一项权利要求中所定义的生物传感器、葡萄糖脱氢酶、氧化还原酶或包含葡萄糖脱氢酶的第一和第二片段序列的多肽。
37.根据权利要求36所述的组合物或试剂盒，其进一步包含底物分子。
38.一种检测靶分子的方法，所述方法包括使权利要求1-22中任一项所述的生物传感器或权利要求36或37所述的组合物与样品接触的步骤，从而确定该样品中是否存在所述靶分子。
39.根据权利要求38所述的方法，其用于检测哺乳动物中提高比赛成绩药物或非法药物。
40.一种诊断生物体中的疾病或病症的方法，所述方法包括使权利要求1-22中任一项所述的生物传感器或权利要求36或37所述的组合物与从所述生物体获得的生物样品接触的步骤，从而确定该生物样品中是否存在靶分子，确定是否存在靶分子有助于诊断疾病或病症。
41.一种检测装置，其包括小室或腔室，所述小室或腔室含有权利要求1-22中任一项所述的生物传感器、权利要求23或24中任一项所述的葡萄糖脱氢酶(GDH)、权利要求25-29中任一项所述的氧化还原酶或如权利要求30-35中任一项所定义的包含GDH酶的第一和第二片段序列的多肽。
42.分离的核酸，其编码权利要求1-22中任一项所述的生物传感器或其组分、权利要求23-24所述的葡萄糖脱氢酶(GDH)酶、权利要求25-29中任一项所述的氧化还原酶或如权利要求30-35中任一项所定义的包含GDH酶的第一或第二片段序列的多肽。
43.一种遗传构建体，其包含权利要求42所述的分离的核酸。
44.包含权利要求43所述的遗传构建体的宿主细胞。
45.一种生产权利要求1-22中任一项所定义的重组蛋白质生物传感器或其组分、权利要求23-24中的葡萄糖脱氢酶(GDH)酶、权利要求25-29中任一项的氧化还原酶或如权利要求30-35中任一项所定义的包含GDH酶的第一或第二片段序列的多肽的方法，所述方法包括在权利要求44的宿主细胞中生产所述重组蛋白质生物传感器或其组分、或所述GDH酶、或所述氧化还原酶酶、或包含GDH酶的第一或第二片段序列的多肽。
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