JP3650815B2 - 緑色蛍光蛋白質の蛍光特性を制御することが可能なバイオセンサー蛋白質の作成方法、および前記方法により作成されるバイオセンサー蛋白質 - Google Patents
緑色蛍光蛋白質の蛍光特性を制御することが可能なバイオセンサー蛋白質の作成方法、および前記方法により作成されるバイオセンサー蛋白質 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、緑色蛍光蛋白質の蛍光特性を制御することが可能なバイオセンサー蛋白質を作成する方法に関する。更に本発明は、前記方法により作成されるバイオセンサー蛋白質、および前記バイオセンサー蛋白質をコードするバイオセンサー遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在までに、緑色蛍光蛋白質（Green Fluorescent Protein；以下、ＧＦＰともいう）を用いて蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を応用したバイオセンサーがいくつか開発されている。近年ＦＲＥＴを使わずに一種類のＧＦＰで蛍光強度を変化させるタイプの新しいバイオセンサーの開発報告がなされている。しかし、バイオセンサーの感受性は非常に低いものであり、とても実用的なものではなかった。このようなバイオセンサーの感受性の問題は、用いた機能性蛋白質とＧＦＰとの結合部位の検討が不十分であったためであることを、本発明者は本発明を為すにあたり新たに見出した。
【０００３】
一方、バイオセンサーのうちカルシウムセンサーに関しては、これまでに大きく分けて４種類のカルシウムセンサーが開発されている。以下にその概要と問題点を示す。
【０００４】
１）カルシウム感受性の合成色素：これは、カルシウムに感受性のある化学合成された色素で、現在一般によく使用されている。色素を外部から細胞に取り込ませて使用するものである。特定の細胞のみに色素を取り込ませることは難しく、その場合にはガラス針等により細胞に色素を注入しなければならないという問題点を有する。
【０００５】
２）エクオリン：これは、カルシウムに反応して光を発する蛋白質である。細胞に直接注入するか、エクオリンを産生する遺伝子を細胞に取り込ませて使用する。エクオリンが機能するためには細胞に補酵素を供給する必要があり、また発する光が極めて弱いという問題点を有する。
【０００６】
３）ＦＲＥＴを応用したカルシウム感受性蛋白質：これは、カルシウムに感受性のあるカルモジュリン（ＣａＭ）とそれに結合するミオシン軽鎖キナーゼの一部の配列、二つの色の異なるＧＦＰを結合した蛋白質である。当該蛋白質は、カルシウムがＣａＭに結合するとその構造が変化し、ＦＲＥＴを起こして二つのＧＦＰの発する蛍光の強度が変化することを利用したものである。当該蛋白質は、細胞に直接注入するか、その遺伝子を細胞に取り込ませて使用する。ＦＲＥＴによる蛍光の変化は小さいためその信号は極めて弱く、更に一般的に用いられているアルゴンレーザーを搭載したレーザー顕微鏡で測定することができないという問題点を有する。
【０００７】
４）一つのＧＦＰから成るカルシウム感受性蛋白：これは、ＧＦＰのアミノ酸配列の１４４番と１４６番の間にＣａＭを結合したカルシウム感受性蛋白質である。カルシウムがＣａＭに結合すると蛋白質の構造が変化し、ＧＦＰの発する蛍光の強度が変化することを利用している。当該蛋白質も、細胞に直接注入するか、その遺伝子を細胞に取り込ませて使用する。カルシウムに対する感度が低いため実際の細胞では信号／雑音比が悪くなり測定が困難であるという問題点を有する。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
上記事情に鑑み、本発明の目的は、緑色蛍光蛋白質の蛍光特性を制御することが可能なバイオセンサー蛋白質を作成する方法を提供すること、並びに前記方法により作成されるバイオセンサー蛋白質、および前記バイオセンサー蛋白質をコードするバイオセンサー遺伝子を提供することである。
【０００９】
より具体的には、検出すべき物質に対する感度が実用に耐える程度に充分高く、且つ測定が容易なバイオセンサー蛋白質を作成することを目的とする。また、特定細胞への取り込みが容易であり、更に、測定に特別な装置および補酵素等を必要としないバイオセンサー蛋白質を作成することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するため、本発明は以下に記載の手段［１］〜［１５］を提供する。
【００１１】
［１］ 緑色蛍光蛋白質の構造を改変することにより、緑色蛍光蛋白質の蛍光特性を制御することが可能なバイオセンサー蛋白質を作成する方法であって、
（Ａ）緑色蛍光蛋白質の蛍光特性に影響を及ぼすホットスポットアミノ酸残基を推定する工程と；
（Ｂ）前記ホットスポットアミノ酸残基の近傍で緑色蛍光蛋白質のアミノ酸配列を切断して前記蛋白質の構造を改変した種々の改変緑色蛍光蛋白質と、
自身の立体構造の変化を前記改変緑色蛍光蛋白質に伝えることにより、前記改変緑色蛍光蛋白質の立体構造を変化させ、蛍光特性を変化させるように機能する機能性分子
とが連結された種々の融合蛋白質を作成する工程と；
（Ｃ）前記種々の融合蛋白質に、前記機能性分子の立体構造に影響を及ぼす因子を作用させる工程と；
（Ｄ）前記種々の融合蛋白質のなかから、前記（Ｃ）工程により蛍光特性に変化が現れる融合蛋白質をバイオセンサー蛋白質として選択する工程と
を具備することを特徴とする方法。
【００１２】
［２］ ［１］に記載の方法であって、前記蛍光特性が蛍光強度であることを特徴とする方法。
【００１３】
［３］ （１）蛍光特性に影響を及ぼすホットスポットアミノ酸残基の近傍で緑色蛍光蛋白質のアミノ酸配列を切断して、前記蛋白質の構造を改変した改変緑色蛍光蛋白質、および
（２）自身の立体構造の変化を前記改変緑色蛍光蛋白質に伝えることにより、前記改変緑色蛍光蛋白質の立体構造を変化させ、蛍光特性を変化させるように機能する機能性分子
を含むことを特徴とするバイオセンサー蛋白質。
【００１４】
［４］ ［３］に記載のバイオセンサー蛋白質であって、前記蛍光特性が蛍光強度であることを特徴とする蛋白質。
【００１５】
［５］ ［３］または［４］に記載のバイオセンサー蛋白質であって、前記ホットスポットアミノ酸残基が、緑色蛍光蛋白質の第148番目であることを特徴とするバイオセンサー蛋白質。
【００１６】
［６］ ［３］または［４］に記載のバイオセンサー蛋白質であって、前記ホットスポットアミノ酸残基が、緑色蛍光蛋白質の第94番目であることを特徴とするバイオセンサー蛋白質。
【００１７】
［７］ ［３］または［４］に記載のバイオセンサー蛋白質であって、前記ホットスポットアミノ酸残基が、緑色蛍光蛋白質の第96番目であることを特徴とするバイオセンサー蛋白質。
【００１８】
［８］ ［３］または［４］に記載のバイオセンサー蛋白質であって、前記ホットスポットアミノ酸残基が、緑色蛍光蛋白質の第222番目であることを特徴とするバイオセンサー蛋白質。
【００１９】
［９］ （１）下記（ａ）、（ｂ）のアミノ酸配列を、Ｎ末端から順に有する改変緑色蛍光蛋白質：
（ａ） 緑色蛍光蛋白質のＸ〜238番目のアミノ酸配列、
（ｂ） 緑色蛍光蛋白質の１〜Ｙ番目のアミノ酸配列、
（ここで、Ｘは148〜150の任意の位置であり、Ｙは140〜147の任意の位置である）、および
（２）自身の立体構造の変化を前記改変緑色蛍光蛋白質に伝えることにより、前記改変緑色蛍光蛋白質の立体構造を変化させ、蛍光特性を変化させるように機能する機能性分子
を含むことを特徴とするバイオセンサー蛋白質。
【００２０】
［１０］ 下記（ａ）〜（ｈ）の配列を、Ｎ末端から順に有することを特徴とするバイオセンサー蛋白質：
（ａ）メチオニンを含むアミノ酸配列（リンカーＸ）；
（ｂ）ミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質もしくはその一部のアミノ酸配列；
（ｃ）前述の（ｂ）の配列と後述の（ｄ）の配列とを連結するアミノ酸配列（リンカーＹ）；
（ｄ）緑色蛍光蛋白質のＸ〜238番目のアミノ酸配列（ここで、Ｘは148〜150の任意の位置である）；
（ｅ）前述の（ｄ）の配列と後述の（ｆ）の配列とを連結するアミノ酸配列；（ｆ）緑色蛍光蛋白質の１〜Ｙ番目のアミノ酸配列（ここで、Ｙは140〜147の任意の位置である）；
（ｇ）前述の（ｆ）の配列と後述の（ｈ）の配列とを連結するアミノ酸配列（リンカーＺ）；
（ｈ）カルモジュリン蛋白質もしくはその一部のアミノ酸配列。
【００２１】
［１１］ （１）下記（ａ）、（ｂ）のアミノ酸配列を、Ｎ末端から順に有する改変緑色蛍光蛋白質：
（ａ） 緑色蛍光蛋白質の149〜238番目のアミノ酸配列、
（ｂ） 緑色蛍光蛋白質の１〜144番目のアミノ酸配列、および
（２）自身の立体構造の変化を前記改変緑色蛍光蛋白質に伝えることにより、前記改変緑色蛍光蛋白質の立体構造を変化させ、蛍光特性を変化させるように機能する機能性分子
を含むことを特徴とするバイオセンサー蛋白質。
【００２２】
［１２］ 下記（ａ）〜（ｈ）の配列を、Ｎ末端から順に有することを特徴とするバイオセンサー蛋白質：
（ａ） メチオニンを含むアミノ酸配列（リンカーＸ）；
（ｂ） ミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質もしくはその一部のアミノ酸配列；
（ｃ） 前述の（ｂ）の配列と後述の（ｄ）の配列とを連結するアミノ酸配列（リンカーＹ）；
（ｄ） 緑色蛍光蛋白質の149〜238番目のアミノ酸配列；
（ｅ） 前述の（ｄ）の配列と後述の（ｆ）の配列とを連結するアミノ酸配列；
（ｆ） 緑色蛍光蛋白質の１〜144番目のアミノ酸配列；
（ｇ） 前述の（ｆ）の配列と後述の（ｈ）の配列とを連結するアミノ酸配列（リンカーＺ）；および
（ｈ） カルモジュリン蛋白質もしくはその一部のアミノ酸配列。
【００２３】
［１３］ ［３］〜［９］、［１１］の何れか１に記載のバイオセンサー蛋白質であって、前記機能性分子が、カルモジュリン蛋白質もしくはその一部のアミノ酸配列、およびミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質もしくはその一部のアミノ酸配列であることを特徴とするバイオセンサー蛋白質。
【００２４】
［１４］ 下記（ａ）〜（ｈ）の配列を、Ｎ末端から順に有することを特徴とするバイオセンサー蛋白質：
（ａ） Met-Gly-ThrまたはMet-Val-Asp（リンカーＸ）；
（ｂ） ミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質の一部のアミノ酸配列（Ser-Ser-Arg-Arg-Lys-Trp-Asp-Lys-Thr-Gly-His-Ala-Val-Arg-Ala-Ile-Gly-Arg-Leu-Ser-Ser）；
（ｃ） Leu-Glu（リンカーＹ）；
（ｄ） 緑色蛍光蛋白質の149〜238番目のアミノ酸配列；
（ｅ） Gly-Gly-Thr-Gly-Gly-Ser（連結アミノ酸配列）；
（ｆ） 緑色蛍光蛋白質の１〜144番目のアミノ酸配列；
（ｇ） Gly-Thr-ArgまたはThr-Arg（リンカーＺ）；および
（ｈ） ラットのカルモジュリン蛋白質の２〜148番目のアミノ酸配列。
【００２５】
［１５］ ［３］〜［１４］の何れか１に記載のバイオセンサー蛋白質をコードするバイオセンサー遺伝子。
【００２６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の緑色蛍光蛋白質の蛍光特性を制御することが可能なバイオセンサー蛋白質の作成方法について（Ａ）〜（Ｅ）の工程順に説明する。本発明のバイオセンサー蛋白質は、一分子の緑色蛍光蛋白質から成るものである。
【００２７】
〈本発明のバイオセンサー蛋白質の作成方法〉
（Ａ）緑色蛍光蛋白質の蛍光特性に影響を及ぼすホットスポットアミノ酸残基を推定する工程：
緑色蛍光蛋白質（以下、ＧＦＰともいう）は、２３８個のアミノ酸からなる蛋白質である。本発明で使用したＧＦＰは、Clontech社から入手した組換えＧＦＰ（ＥＧＦＰ）である。ＥＧＦＰは、本来のＧＦＰには存在しないバリン（gtg）がＮ末のメチオニンにつづいて挿入されており、これはアミノ酸番号１’と呼ばれる。便宜的にアミノ酸番号１’のバリン（gtg）を省略したＥＧＦＰの核酸およびアミノ酸配列を配列番号１に示す。配列番号１に記載のアミノ酸配列における１〜238番のアミノ酸は、本明細書に記載される「緑色蛍光蛋白質の第ｎ番目のアミノ酸」に対応するものである。
【００２８】
本発明において実際に作成されたバイオセンサー蛋白質はすべて、Ｎ末のメチオニンの後にアミノ酸番号１’のバリンが挿入された上述のＥＧＦＰを使用して作成されたものである。
【００２９】
また本発明では便宜的に、ＧＦＰを図１Ａに示すような簡略化した構造で示す。ＧＦＰは、その分子構造の内部中央に発色団を有している。ＧＦＰは、ＧＦＰをコードするｃＤＮＡを含むプラスミド、例えばpEGFP-N1（Clontech社）を発現させることにより入手することができる。
【００３０】
本発明において、ＧＦＰの蛍光特性に影響を及ぼす「ホットスポットアミノ酸残基」とは、後述の改変緑色蛍光蛋白質を作成する際に、その改変位置の指標となるＧＦＰ上のアミノ酸残基であり、このホットスポットアミノ酸残基の近傍でＧＦＰの構造を改変することにより、所望の改変緑色蛍光蛋白質を作成することが可能となるものである。
【００３１】
ＧＦＰの構造を改変するとは、好ましくは、推定されるホットスポットアミノ酸残基の近傍（好ましくは、ホットスポットアミノ酸残基の前後５アミノ酸の範囲内の各位置）でＧＦＰを切断し、更に切断部位から適切な数のアミノ酸（好ましくは１〜１０個のアミノ酸）を除去することをいう。ただし、ＧＦＰの構造改変は、所望の改変緑色蛍光蛋白質を作成することが可能であれば、記載された改変に限定されず、任意の改変を含み得る。
【００３２】
また、所望の改変緑色蛍光蛋白質（以下、改変ＧＦＰともいう）とは、後述するとおり、ＧＦＰの構造を、その蛍光特性が可逆的に変化し得るように改変したものである。蛍光特性が可逆的に変化するとは、改変ＧＦＰの有している立体構造を変化させる因子（即ち、バイオセンサーが感知する因子）の有無により、改変ＧＦＰの立体構造が可逆的に変化し、それに伴って改変ＧＦＰの蛍光特性が可逆的に変化することをいう。この変化は、蛍光顕微鏡もしくはレーザー顕微鏡等で捉えることができる程度の変化をいい、好ましくは肉眼で捉えることができる程度の変化をいう。例えば、蛍光特性の変化が蛍光強度の変化である場合、蛍光の変化量ΔＦ/Ｆが、好ましくは、少なくとも０．１以上変化すること、より好ましくは１〜１０の範囲で変化することをいう。
【００３３】
本発明において蛍光特性とは、蛍光強度、蛍光波長、蛍光強度比、吸光度、吸光波長などの蛍光特性を指す。本発明では蛍光特性の一例として、蛍光強度を使用する。
【００３４】
このようなホットスポットアミノ酸残基という概念は、本発明において種々の改変ＧＦＰを有する種々のバイオセンサー蛋白質を試作したところ、ＧＦＰの蛍光特性に強い影響を与えるアミノ酸残基がＧＦＰ上に存在することを見出したことにより得られた概念である。
【００３５】
このようなホットスポットアミノ酸残基は、種々の改変ＧＦＰを有するバイオセンサー蛋白質を試作することにより、その性能からその位置を推定することもできるが、ＧＦＰの結晶構造を見て推定することもできる。即ち、ホットスポットアミノ酸残基は、ＧＦＰの発色団と水素結合をしているアミノ酸である可能性が高いので、ＧＦＰの結晶構造から発色団と水素結合をしているアミノ酸をホットスポットアミノ酸残基と推定することができる。
【００３６】
本発明において推定されたＧＦＰのホットスポットアミノ酸残基は、ＧＦＰの第94番目、第96番目、第148番目、第222番目のアミノ酸である。これらの位置のアミノ酸残基がホットスポットアミノ酸残基として好ましいが、これらに限定されない。
【００３７】
（Ｂ）前記ホットスポットアミノ酸残基の近傍で緑色蛍光蛋白質のアミノ酸配列を切断して前記蛋白質の構造を改変した種々の改変緑色蛍光蛋白質と、
自身の立体構造の変化を前記改変緑色蛍光蛋白質に伝えることにより、前記改変緑色蛍光蛋白質の立体構造を変化させ、蛍光特性を変化させるように機能する機能性分子
とが連結された種々の融合蛋白質を作成する工程：
前記工程（Ａ）により推定されたホットスポットアミノ酸残基が、ＧＦＰのｎ番目のアミノ酸であると想定して以下説明する。
【００３８】
本発明において改変緑色蛍光蛋白質（以下、改変ＧＦＰともいう）とは、好ましくは、ＧＦＰをホットスポットアミノ酸残基の近傍（例えば、ＧＦＰのｎ番目のアミノ酸と(ｎ＋１)番目のアミノ酸との間）で切断し、次いで、切断部位のアミノ酸（例えば、(ｎ−ａ)番目〜ｎ番目のアミノ酸）を除去することによりＧＦＰの分子構造を改変し、必要に応じてＧＦＰの本来のＮ末端と本来のＣ末端とを適切な連結アミノ酸（例えば、Gly-Gly-Thr-Gly-Gly-Ser）で連結したものをいう（図１Ｃ参照）。
【００３９】
ただし、このような連結アミノ酸を用いてＧＦＰ本来のＮ末端と本来のＣ末端とを連結し、一本の鎖で繋がれた蛋白質としなくても、細胞内で分断されたままの２つのＧＦＰ断片が機能することも考えられる。
【００４０】
なお、ＧＦＰの本来のＮ末端とＣ末端とを連結するアミノ酸は、好ましくはアミノ酸２〜１０分子から成る配列であり、グリシンを多く含むアミノ酸が好ましく、特に好ましい例としては、Gly-Gly-Thr-Gly-Gly-Serが挙げられるがこれらに限定されない。
【００４１】
例えば、ＧＦＰをｎ番目のアミノ酸と(ｎ＋１)番目のアミノ酸との間で切断し、次いで、(ｎ−ａ)番目〜ｎ番目のアミノ酸を除去し、本来のＮ末端とＣ末端とを上述の連結アミノ酸で連結させた場合、改変ＧＦＰは、Ｎ末端から順に、(ｎ＋１)番目〜２３８番目のアミノ酸、連結アミノ酸、１番目〜(ｎ−ａ)番目のアミノ酸を有する蛋白質となる。尚この場合、後の工程において、改変ＧＦＰの新たなＮ末端および/またはＣ末端に機能性分子を連結させることになる（図１Ｄ参照）。
【００４２】
あるいは、ＧＦＰをｎ番目のアミノ酸と(ｎ＋１)番目のアミノ酸との間で切断し、次いで、(ｎ−ａ)番目〜ｎ番目のアミノ酸を除去し、本来のＮ末端とＣ末端とを連結させない場合については、改変ＧＦＰは、１番目〜(ｎ−ａ)番目のアミノ酸と(ｎ＋１)番目〜２３８番目のアミノ酸とに分断された蛋白質となる。この場合、後の工程で、分断されている両蛋白質の間に機能性分子を挟んで連結させることにより一本の鎖で繋がれた蛋白質としてもよい（図１Ｂ参照）。また、このように一本の鎖で繋がれた蛋白質としなくても、細胞内で分断されたまま２つのＧＦＰ断片が機能することも考えられる。
【００４３】
なお、ここでＧＦＰを切断するホットスポットアミノ酸残基（ｎ番目のアミノ酸）の近傍とは、例えば、(ｎ＋５)〜(ｎ−５)の範囲、好ましくは（ｎ＋２）〜（ｎ−２）の範囲をいう。また、除去するアミノ酸、即ちａの値は、例えば１〜１０、好ましくはａ＝４である。
【００４４】
上述の範囲の種々の改変ＧＦＰを、バイオセンサー蛋白質を構成する候補として挙げることができる。ただし、上述のホットスポットアミノ酸残基の近傍の切断位置、および除去するアミノ酸の数は、当業者により適宜設定することができる。例えば、表１〜２に記載されるとおり、切断位置、除去するアミノ酸の数を種々、変更することができる。
【００４５】
（Ｂ）工程において、前記改変ＧＦＰに連結される機能性分子とは、機能性分子自身が、機能性分子に作用する因子（即ち、バイオセンサーが感知する因子）の結合等の作用により、立体構造に変化を起こし得る分子であって、自身の立体構造の変化を改変ＧＦＰに伝え得る分子であれば限定されない。
【００４６】
従って、本発明において機能性分子は、自身の立体構造の変化を改変ＧＦＰに伝達し改変ＧＦＰの構造に変化を及ぼし得る位置で、改変ＧＦＰに連結されている必要がある。従って機能性分子は、本来のＧＦＰ構造を改変した部分に近接して連結されていることが好ましい。具体的には、ＧＦＰを切断した位置にリンカー分子を介して連結されていることが好ましい。
【００４７】
このような機能性分子は、一分子であってもよいし、二分子以上であってもよい。二分子の場合、機能性分子に作用する因子（即ち、バイオセンサーが感知する因子）は、まず一方の機能性分子の立体構造に変化を及ぼし、次いでその立体構造の変化が、他方の機能性分子の立体構造に変化を及ぼし、それぞれの機能性分子の構造変化が改変ＧＦＰの立体構造に変化を起こさせる。二分子以上の場合も同様に、最初の因子の作用を、シグナル伝達のように次々と他の機能性分子に伝えることにより、最終的には、全ての機能性分子の構造変化がそれぞれに作用して改変ＧＦＰの立体構造に変化を起こさせる。
【００４８】
このように機能性分子が二分子以上の場合には、それぞれの分子の構造変化が改変ＧＦＰの構造に影響を与え得るため、機能性分子が一分子である場合より、改変ＧＦＰへの作用が大きく、結果的に、改変ＧＦＰの蛍光特性を大きく変化させることにつながり得る可能性が高い。
【００４９】
また、本発明において改変ＧＦＰに連結する機能性分子は、その機能性分子が生体内で発現しているとおりの全構造を有している必要は必ずしもなく、上述の機能性分子として役割を果たすものであれば、機能性分子に作用する因子が結合する部位のみを有している一部構造であってもよい。
【００５０】
機能性分子としては、例えば、カルモジュリン蛋白質とミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質との組み合わせ、またはＣＲＥ(Cyclic AMP Responsive Element)結合蛋白質（ＣＲＥＢ）とＣＲＥＢ結合蛋白質（ＣＢＰ）との組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５１】
例えば、本発明では後述の実施例において、カルモジュリン蛋白質、およびミオシン軽鎖キナーゼのカルモジュリン結合機能を有する一部（即ち、Ｍ１３断片）を機能性分子として使用した。このような機能性分子を改変ＧＦＰに連結すれば、この融合蛋白質はカルシウムセンサーとして機能し得る。
【００５２】
改変ＧＦＰに、カルモジュリン蛋白質（ＣａＭ）およびミオシン軽鎖キナーゼ（Ｍ１３）の機能性分子を連結した融合蛋白質の構造を、図１Ｂおよび図１Ｄに模式的に示す。また、これら融合蛋白質の一例の構造を一次元的に図２に示す。
【００５３】
図２に示すように、改変ＧＦＰと機能性分子とは、数個のアミノ酸から成るリンカー分子により連結される。各リンカー分子を区別するため、融合蛋白質のＮ末端に存在する開始コドン（Met）を含むリンカーは、リンカーＸ；改変ＧＦＰのＮ末端側と機能性分子（Ｍ１３）を連結するリンカーは、リンカーＹ；改変ＧＦＰのＣ末端側と機能性分子（ＣａＭ）とを連結するリンカーは、リンカーＺと称する。なお、ＧＦＰ本来のＮ末端とＣ末端とを繋ぐ連結アミノ酸（ＧＧＴＧＧＳ）については、改変ＧＦＰの説明の中の記載を参照されたい。
【００５４】
これら各リンカーの長さや配列は限定される必要はないが、その長さは０〜１０個が好ましく、２個がより好ましい。また、リンカーＹの配列については、ロイシン-グルタミン酸が好ましい。
【００５５】
リンカーは、機能性分子の立体構造の変化を改変ＧＦＰに伝達する部分であるので、リンカーの長さや配列により改変ＧＦＰへの立体構造の変化の度合は大きく影響される。各リンカーの長さ、配列の選択は、結合する機能性分子により変えなければならない。リンカーなしで直接、改変ＧＦＰと機能性分子とが連結した場合も想定される。
【００５６】
実際には、リンカーの配列を種々変更させたバイオセンサー蛋白質を作成して実験してみる必要がある。
【００５７】
具体的に本発明においては、改変ＧＦＰと機能性分子（Ｍ１３）とを連結するリンカーＹの配列を種々変更させたバイオセンサー蛋白質を作成し、その反応性を調べている（表１〜表４参照）。尚、ここでは、改変ＧＦＰのＮ末が本来のＧＦＰの149番目のアミノ酸から始まるとき、この改変ＧＦＰのＮ末に隣接するリンカーＹのアミノ酸を「ＧＦＰの148番目に相当するアミノ酸」と考える。また、「ＧＦＰの148番目に相当するアミノ酸」からＮ末側に１個遡ったアミノ酸を「ＧＦＰの147番目に相当するアミノ酸」と考える。同様に、改変ＧＦＰのＮ末が、本来のＧＦＰの150番目のアミノ酸から始まるときには、この改変ＧＦＰのＮ末に隣接するリンカーＹのアミノ酸からＮ末側に２個溯ったアミノ酸を「ＧＦＰの148番目に相当するアミノ酸」と考えることができる。
【００５８】
後述の表１〜４に記載のバイオセンサー蛋白質が示すとおり、リンカーＹのアミノ酸配列のうち「ＧＦＰの148番目に相当するアミノ酸」が、酸性側鎖を持つ場合（Ｇ５２のAsp、Ｇ１８、Ｇ７９のGlu）、および水酸基をその側鎖の一部に持つ場合（Ｇ３、Ｇ１７のSer、Ｇ２２のThr、Ｇ４７のTyr）、機能的に反応性のあるバイオセンサーを形成しやすいことが判る。逆に塩基性側鎖を持つ場合（Ｇ６２のLys、Ｇ１９、Ｇ７５のArg）、反応性が乏しくなる傾向がある。また、「ＧＦＰの148番目に相当するアミノ酸」が水酸基をその側鎖の一部に持つときには、更に光異性化特性をもつようになる。更に、「ＧＦＰの147番目に相当するアミノ酸」も、バイオセンサー蛋白質の反応性に影響を与えることが判る。この「147番目に相当するアミノ酸」は、Leu＞Thr＞Glyの順に、バイオセンサーの反応性に良い影響を及ぼす。しかし、「147番目に相当するアミノ酸」Proは、148番目のArgの反応性を上げる効果は乏しい（Ｇ１９）。このようにリンカーの配列を種々変更させることにより、適切なリンカーの配列を絞り込むことができる。
【００５９】
融合蛋白質の作成は、公知の遺伝子工学的手法を用いて行うことができる。例えば、融合したい各蛋白質部分をコードする遺伝子（即ち、改変ＧＦＰおよび機能性分子をコードする遺伝子）の断片をそれぞれＰＣＲにより作成し、これら断片をつなぎ合わせることにより融合遺伝子を作成し、次いで、この融合遺伝子を含むプラスミドを所望の細胞に導入して発現させることにより、融合蛋白質はつくられる。
【００６０】
（Ｃ）前記種々の融合蛋白質に、前記機能性分子の立体構造に影響を及ぼす因子を作用させる工程：
工程（Ｂ）により得られた融合蛋白質が有している機能性分子の立体構造に影響を及ぼす分子としては、当該機能性分子に結合する等の作用をして機能性分子の立体構造に影響を与える分子そのものを使用することもできるし、あるいは、機能性分子の立体構造に影響を与える分子を細胞内で増大させるように機能することが知られている分子を使用することもできる。
【００６１】
機能性分子がカルモジュリン蛋白質およびミオシン軽鎖キナーゼの場合、機能性分子の立体構造に影響を及ぼす因子として、カルモジュリンに結合してカルモジュリンの立体構造を変化させるカルシウムイオンを使用してもよいし、あるいは、融合蛋白質を発現している細胞のカルシウムイオン濃度を増大させることが知られている作用因子、例えばＡＴＰ、カルバコール、カフェイン、タプシガルジン等を使用してもよい。これらの因子を作用させることにより、当該融合蛋白質のバイオセンサー（カルシウムセンサー）としての機能を確認することができる。
【００６２】
あるいは、機能性分子がＣＲＥ結合蛋白質（ＣＲＥＢ）とＣＲＥＢ結合蛋白質（ＣＢＰ）の場合、バイオセンサーとしての機能を確認するために使用する作用因子としては、例えばＡキナーゼを使用することができる。
【００６３】
機能性分子の立体構造に影響を及ぼす因子を作用させる方法としては、例えば、改変ＧＦＰと機能性分子との融合蛋白質を産生している細胞をレーザー顕微鏡のステージ上のチャンバーに入れ、作用因子を当該細胞に添加することにより行われる。この方法は、その後の融合蛋白質の蛍光特性の変化を観察することを考慮している点で好ましい。なお、作用因子は、例えばＡＴＰやカルバコールを用いる場合、灌流液（ＨＢＳ）に懸濁し、２０〜３００μＭの濃度で添加することが適切である。
【００６４】
（Ｄ）前記種々の融合蛋白質のなかから、前記（Ｃ）工程により蛍光特性に変化が現れる融合蛋白質をバイオセンサー蛋白質として選択する工程：
工程（Ｃ）の作用により蛍光特性に変化が現れる融合蛋白質を、蛍光を検出することが可能な装置、例えばレーザー顕微鏡もしくは蛍光顕微鏡に取りつけられたＣＣＤカメラ等を用いて検出し、これらをバイオセンサー蛋白質として選択する。ここで「蛍光特性に変化が現れる」とは、蛍光顕微鏡もしくはレーザー顕微鏡等で捉えることができる程度の変化が起こることをいい、好ましくは肉眼で捉えることができる程度の変化が現れることをいう。例えば、蛍光特性の変化が蛍光強度の変化である場合、蛍光の変化量ΔＦ/Ｆが、好ましくは、少なくとも０．１以上変化すること、より好ましくは１〜１０の範囲で変化することをいう。
【００６５】
工程（Ｄ）で選択されたバイオセンサー蛋白質は、センサーとして感知する因子の有無に応じて、当該蛋白質の蛍光特性が可逆的に変化し得る状態にある。
【００６６】
このようにＧＦＰの蛍光特性が可逆的に変化し得るように改変されたバイオセンサー蛋白質は、蛍光特性が変化し得る臨界状態にあるということもできる。
【００６７】
例えば、蛍光特性が蛍光強度である場合、バイオセンサー蛋白質は、蛍光を発する状態と蛍光を発しない状態の臨界状態にある。この臨界状態においてバイオセンサー蛋白質は、蛍光を発していない状態にあってもよいし、蛍光強度の低い状態にあってもよい。あるいは、改変ＧＦＰは蛍光強度の高い状態にあってもよい。ここで、蛍光を発していないとは、光学機器を使用して蛍光を確認できないことをいう。蛍光強度が低いとは、センサーとして感知する因子の存在により、上述の変化量（ΔＦ/Ｆが少なくとも０．１以上変化する量）を示して、蛍光強度が高い状態に変化し得る程度に低いことをいう。同様に、蛍光強度が高いとは、センサーとして感知する因子の存在により、上述の変化量（ΔＦ/Ｆが少なくとも０．１以上変化する量）を示して、蛍光強度が低い状態に変化し得る程度に高いことをいう。
【００６８】
バイオセンサー蛋白質が臨界状態にあって蛍光強度の高い状態は、僅かな立体構造の変化によりその蛍光を発しなくなる「ぎりぎり蛍光を強く発していられる状態」ということもできる。また、バイオセンサー蛋白質が臨界状態にあって蛍光を発していない状態は、僅かな立体構造の変化により蛍光を発する状態に変化し得る「ぎりぎり蛍光を発することができない状態」ということもできる。同様に、バイオセンサー蛋白質が臨界状態にあって蛍光強度が低い状態も、僅かな立体構造の変化により蛍光を強く発する状態に変化し得る「ぎりぎり蛍光を弱くしか発することができない状態」ということもできる。
【００６９】
上述のようにバイオセンサー蛋白質を臨界状態にする理由は、センサーの感知する因子の有無によって敏感に反応し、その立体構造が可逆的に変化し、それに伴ってその蛍光特性が可逆的に変化する状態（例えば、蛍光を発する状態と蛍光を発しない状態との間を可逆的に行き来するような状態）を作り出すためである。バイオセンサー蛋白質は、このような臨界状態にあることにより、バイオセンサーとして機能し得る状態にあるということができる。
【００７０】
［バイオセンサー蛋白質およびバイオセンサー遺伝子］
本発明のバイオセンサー蛋白質は、上述のバイオセンサー蛋白質を作成する方法により選択されたものをいう。また、本発明のバイオセンサー遺伝子は、本発明のバイオセンサー蛋白質をコードする遺伝子をいい、本発明のバイオセンサー蛋白質を細胞で発現させるために使用するものである。
【００７１】
本発明のバイオセンサー蛋白質は、
（１）蛍光特性に影響を及ぼすホットスポットアミノ酸残基の近傍で緑色蛍光蛋白質のアミノ酸配列を切断して前記蛋白質の構造を改変した改変ＧＦＰ、および
（２）自身の立体構造の変化を前記改変ＧＦＰに伝えることにより、前記改変ＧＦＰの立体構造を変化させ、蛍光特性を変化させるように機能する機能性分子を含むことを特徴とする。
【００７２】
バイオセンサー蛋白質が構成要素として含む改変ＧＦＰは、上記規定したとおりであり、好ましくは、ホットスポットアミノ酸残基の近傍でＧＦＰのアミノ酸配列を切断し、次いで、切断部位のアミノ酸を除去することによりＧＦＰの分子構造を改変し、必要に応じてＧＦＰ本来のＮ末端と本来のＣ末端とを適切なアミノ酸配列で連結したものをいう。
【００７３】
また、機能性分子も、上記規定したとおりであり、機能性分子自身が、機能性分子に作用する因子（即ち、バイオセンサーが感知する因子）の結合等の作用により、立体構造に変化を起こし得る分子であって、自身の立体構造の変化を改変ＧＦＰに伝え得る分子である。
【００７４】
改変ＧＦＰ、機能性分子ともに、上記規定されるようなものであれば限定されない。
【００７５】
また、上述のとおり、本発明のバイオセンサー蛋白質は、機能性分子が、自身の立体構造の変化を改変ＧＦＰに伝達し改変ＧＦＰの構造に変化を及ぼし得る位置で、改変ＧＦＰに連結されている必要がある。従って機能性分子は、本来のＧＦＰ構造を改変した部分に近接して連結されていることが好ましい。具体的には、ＧＦＰを切断した位置にリンカー分子を介して連結されていることが好ましい。
【００７６】
更に、本発明のバイオセンサー蛋白質として機能するためには、センサー蛋白質が感知する因子の有無により、センサー蛋白質の蛍光特性が可逆的に変化し得ることが要求される。本発明では蛍光特性の一例として、蛍光強度を使用する。上述したとおり、本発明のバイオセンサー蛋白質は、蛍光を発する状態と蛍光を発しない状態の臨界状態にあり、その蛍光特性を可逆的に変化し得るものである。
【００７７】
また、本発明のバイオセンサー蛋白質は、好ましくはそのホットスポットアミノ酸残基がＧＦＰの148番目、94番目、96番目、もしくは222番目のアミノ酸残基である。
【００７８】
ＧＦＰの148番目のアミノ酸残基をホットスポットアミノ酸残基として採用したバイオセンサー蛋白質は、好ましくは、下記（１）、（２）の配列を含むことを特徴とする：
（１）下記（ａ）、（ｂ）のアミノ酸配列を、Ｎ末端から順に有する改変緑色蛍光蛋白質：
（ａ） 緑色蛍光蛋白質のＸ〜238番目のアミノ酸配列、
（ｂ） 緑色蛍光蛋白質の１〜Ｙ番目のアミノ酸配列、
（ここで、Ｘは148〜150の任意の位置であり、Ｙは140〜147の任意の位置である）、および
（２）自身の立体構造の変化を前記改変緑色蛍光蛋白質に伝えることにより、前記改変緑色蛍光蛋白質の立体構造を変化させ、蛍光特性を変化させるように機能する機能性分子。
【００７９】
また、ＧＦＰの148番目のアミノ酸残基をホットスポットアミノ酸残基として採用したバイオセンサー蛋白質の、より具体的な例としては、下記（ａ）〜（ｈ）の配列を、Ｎ末端から順に有することを特徴とする：
（ａ）メチオニンを含むアミノ酸配列（リンカーＸ）；
（ｂ）ミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質もしくはその一部のアミノ酸配列；
（ｃ）前述の（ｂ）の配列と後述の（ｄ）の配列とを連結するアミノ酸配列（リンカーＹ）；
（ｄ）緑色蛍光蛋白質のＸ〜238番目のアミノ酸配列（ここで、Ｘは148〜150の任意の位置である）；
（ｅ）前述の（ｄ）の配列と後述の（ｆ）の配列とを連結するアミノ酸配列；
（ｆ）緑色蛍光蛋白質の１〜Ｙ番目のアミノ酸配列（ここで、Ｙは140〜147の任意の位置である）；
（ｇ）前述の（ｆ）の配列と後述の（ｈ）の配列とを連結するアミノ酸配列（リンカーＺ）；
（ｈ）カルモジュリン蛋白質もしくはその一部のアミノ酸配列。
【００８０】
ここで、（ａ）のリンカーＸは、メチオニンを含む任意のアミノ酸配列であるが、好ましくは１〜１０個のアミノ酸であり、より好ましくはMet-Xaa-Xaa（Xaaは任意のアミノ酸）であり、更に好ましくはMet-Gly-Thr、Met-Val-Aspである。（ｃ）のリンカーＹは、任意のアミノ酸配列であるが、好ましくは０〜１０個のアミノ酸であり、より好ましくは、リンカーＹのアミノ酸配列のうち「ＧＦＰの147番目に相当するアミノ酸」がLeu、Thr、またはGlyで、「ＧＦＰの148番目に相当するアミノ酸」が、酸性側鎖または水酸基をその一部に含む側鎖を持つアミノ酸であり、更に好ましくはLeu-Gluである。（ｅ）の連結アミノ酸は、好ましくは、２〜１０個のアミノ酸であり、より好ましくは、グリシン等のペプチドの主鎖の動きに大きな自由度を与え、主鎖をフレキシブルにするようなアミノ酸を多く含むアミノ酸配列であり、更に好ましくはGly-Gly-Thr-Gly-Gly-Serである。（ｇ）のリンカーＺは、任意のアミノ酸配列であるが、好ましくは０〜１０個のアミノ酸であり、より好ましくは２〜３個のアミノ酸であり、更に好ましくはThr-Argである。
【００８１】
上述のＧＦＰの148番目のアミノ酸残基をホットスポットアミノ酸残基として用いた種々のバイオセンサー蛋白質の例を下記表１〜２に列挙する。機能性分子としてはミオシン軽鎖キナーゼ（Ｍ１３）およびカルモジュリン（ＣａＭ）を使用した。
【００８２】
【表１】
【００８３】
【表２】
【００８４】
表１〜２に記載のバイオセンサー蛋白質は、Ｎ末端から順に
メチオニンを含むアミノ酸配列（リンカーＸ）；
ミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質の一部のアミノ酸配列（Ｍ１３）；
連結アミノ酸配列（リンカーＹ）；
改変ＧＦＰ（ｃｐＥＧＦＰ）；
連結アミノ酸配列（リンカーＺ）；
カルモジュリン蛋白質の２〜148番目のアミノ酸配列（ＣａＭ）を有する。
【００８５】
ここで機能性分子として使用したラットカルモジュリンのアミノ酸配列を配列番号２に示す。配列番号２に記載のアミノ酸配列における１〜148番のアミノ酸は、本明細書に記載される「カルモジュリン蛋白質のｎ番目のアミノ酸」と対応する。尚、カルモジュリンはアミノ酸に翻訳された後、Ｎ末のメチオニンが翻訳後修飾を受けて切れてなくなるため、配列番号２ではＮ末のメチオニンの記載を省いた。
【００８６】
また、機能性分子として使用したミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質の一部のアミノ酸配列（Ｍ１３）を配列番号３に示す。このＭ１３断片をコードする遺伝子配列は、ニワトリのＭ１３断片をコードする遺伝子配列を改変したものである（Guerriero,V et al Biochemistry 25 8372-8381 (1986)）。
【００８７】
表１〜２において、種々のバイオセンサー蛋白質は、プローブ・ナンバーとして名称が付されている。例えば、プローブ・ナンバーＧ３（以下、Ｇ３ともいう）については、その構造を一次元的に図２に示す。Ｇ３は、Ｎ末端から順に
リンカーＸ（Met-Gly-Thr）；
ミオシン軽鎖キナーゼの一部（Ser-Ser-Arg-Arg-Lys-Trp-Asn-Lys-Thr-Gly-His-Ala-Val-Arg-Ala-Ile-Gly-Arg-Leu-Ser-Ser）；
リンカーＹ（Thr-Ser）；
改変ＧＦＰ｛Ｎ末端から順に、ＧＦＰの149〜238番目のアミノ酸配列、連結アミノ酸（Gly-Gly-Thr-Gly-Gly-Ser）、ＧＦＰの１〜144番目のアミノ酸配列｝；
リンカーＺ（Gly-Thr-Arg）；
ラットのカルモジュリンの２〜148番目のアミノ酸を有する。
【００８８】
表１〜２において、リンカーＸ、Ｙ、Ｚのアミノ酸配列は一文字表記で示す。また、Ｍ１３の「Ｏ」は、（Ser-Ser-Arg-Arg-Lys-Trp-Asn-Lys-Thr-Gly-His-Ala-Val-Arg-Ala-Ile-Gly-Arg-Leu-Ser-Ser）の配列を意味する。ｃｐＥＧＦＰの「149-144」は、改変ＧＦＰがＮ末端から順に、ＧＦＰの149〜238番目のアミノ酸配列、連結アミノ酸（Gly-Gly-Thr-Gly-Gly-Ser）、ＧＦＰの１〜144番目のアミノ酸配列を有することを意味する。ＣａＭの「Ｏ」は、ラットの本来のカルモジュリン２〜148番目のアミノ酸配列を意味し、「ＣＮ」は、カルモジュリンのミュータント ＣａＭＣＮの２〜148番目のアミノ酸配列（Persechini A et al 1997 Cell Calcium 22, 209-216）を意味する。蛍光の「＋」は、ＡＴＰ添加前に弱い蛍光を発しているものを意味し、「−」はＡＴＰ添加前に蛍光を発していないものを意味し、「＊」は、細胞内カルシウム濃度が２ｍＭ程度の高カルシウム状態で弱い蛍光を発するものを意味する。ＡＴＰ応答（ΔF/F）の値は、各バイオセンサー蛋白質を産生する細胞（HEK細胞）のＡＴＰ添加前と添加後の蛍光強度の変化量の値（ΔF）をＡＴＰ添加前の蛍光強度（F）で割った値（Arbitrary unit）である。「ｎｔ」は、not testedを意味する。また、光異性化（Photoisomerization）の「＋」は、バイオセンサー蛋白質が光異性化を起こすことを意味し、「−」は、光異性化を起こさないことを意味する。
【００８９】
表１〜２の結果より、ｃｐＥＧＦＰのＮ末を145〜155番目のアミノ酸の間で変化させ、Ｃ末を140〜147番目のアミノ酸の間で変化させてＡＴＰの反応を測定したところ、Ｎ末が149または150番目のアミノ酸で始まるものが反応性が高かった。Ｃ末は、140、144、147番目でＡＴＰ感受性のある分子を得た。
【００９０】
ここで、148番目のアミノ酸は、リンカーＹに含まれると考えてよい。即ち、改変ＧＦＰのＮ末が、本来のＧＦＰの149番目のアミノ酸から始まるとき、この改変ＧＦＰのＮ末に隣接するリンカーＹのアミノ酸を「ＧＦＰの148番目に相当するアミノ酸」と考えることができる。また同様に、改変ＧＦＰのＮ末が、本来のＧＦＰの150番目のアミノ酸から始まるとき、この改変ＧＦＰのＮ末に隣接するリンカーＹのアミノ酸からＮ末側に２個溯ったアミノ酸を「ＧＦＰの148番目に相当するアミノ酸」と想定することができる。
【００９１】
ＧＦＰの148番目のアミノ酸残基をホットスポットアミノ酸残基として採用したバイオセンサー蛋白質は、より好ましくは、
（１）下記（ａ）、（ｂ）のアミノ酸配列を、Ｎ末端から順に有する改変緑色蛍光蛋白質：
（ａ） 緑色蛍光蛋白質の149〜238番目のアミノ酸配列、
（ｂ） 緑色蛍光蛋白質の１〜144番目のアミノ酸配列、および
（２）自身の立体構造の変化を前記改変緑色蛍光蛋白質に伝えることにより、前記改変緑色蛍光蛋白質の立体構造を変化させ、蛍光特性を変化させるように機能する機能性分子
を含むことを特徴とする。
【００９２】
また、上述のより好ましいバイオセンサー蛋白質の、より具体的な例としては、下記（ａ）〜（ｈ）の配列を、Ｎ末端から順に有することを特徴とする：
（ａ） メチオニンを含むアミノ酸配列（リンカーＸ）；
（ｂ） ミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質もしくはその一部のアミノ酸配列；
（ｃ） 前述の（ｂ）の配列と後述の（ｄ）の配列とを連結するアミノ酸配列（リンカーＹ）；
（ｄ） 緑色蛍光蛋白質の149〜238番目のアミノ酸配列；
（ｅ） 前述の（ｄ）の配列と後述の（ｆ）の配列とを連結するアミノ酸配列；
（ｆ） 緑色蛍光蛋白質の１〜144番目のアミノ酸配列；
（ｇ） 前述の（ｆ）の配列と後述の（ｈ）の配列とを連結するアミノ酸配列（リンカーＺ）；および
（ｈ） カルモジュリン蛋白質もしくはその一部のアミノ酸配列。
【００９３】
ここで、（ａ）のリンカーＸは、メチオニンを含む任意のアミノ酸配列であるが、好ましくは１〜１０個のアミノ酸であり、より好ましくはMet-Xaa-Xaa（Xaaは任意のアミノ酸）であり、更に好ましくはMet-Gly-Thr、Met-Val-Aspである。（ｃ）のリンカーＹは、任意のアミノ酸配列であるが、好ましくは０〜１０個のアミノ酸であり、より好ましくは２個のアミノ酸で、「ＧＦＰの147番目に相当するアミノ酸」がLeu、Thr、またはGlyで、「ＧＦＰの148番目に相当するアミノ酸」が、酸性側鎖または水酸基をその一部に含む側鎖を持つアミノ酸であり、更に好ましくはLeu-Gluである。（ｅ）の連結アミノ酸は、好ましくは、２〜１０個のアミノ酸であり、より好ましくは、グリシン等のペプチドの主鎖の動きに大きな自由度を与え、主鎖をフレキシブルにするようなアミノ酸を多く含むアミノ酸配列であり、更に好ましくはGly-Gly-Thr-Gly-Gly-Serである。（ｇ）のリンカーＺは、任意のアミノ酸配列であるが、好ましくは０〜１０個のアミノ酸であり、より好ましくは２〜３個のアミノ酸であり、更に好ましくはThr-Argである。
【００９４】
上述のより好ましいバイオセンサー蛋白質の種々の例を下記表３〜４に列挙する。機能性分子としてはミオシン軽鎖キナーゼ（Ｍ１３）およびカルモジュリン（ＣａＭ）を使用した。
【００９５】
【表３】
【００９６】
【表４】
【００９７】
表３〜４に記載のバイオセンサー蛋白質は、Ｎ末端から順に
メチオニンを含むアミノ酸配列（リンカーＸ）；
ミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質の一部のアミノ酸配列（Ｍ１３）；
種々の連結アミノ酸配列（リンカーＹ）；
改変ＧＦＰ（ｃｐＥＧＦＰ）；
連結アミノ酸配列（リンカーＺ）；
カルモジュリン蛋白質の２〜148番目のアミノ酸配列（ＣａＭ）を有する。
【００９８】
表３〜４において、種々のバイオセンサー蛋白質は、プローブ・ナンバーとして名称が付されている。例えば、プローブ・ナンバーＧ８５（以下、Ｇ８５ともいう）については、その構造を一次元的に図２に示す。Ｇ８５は、Ｎ末端から順に
リンカーＸ（Met-Val-Asp）；
ミオシン軽鎖キナーゼの一部（Ser-Ser-Arg-Arg-Lys-Trp-Asn-Lys-Thr-Gly-His-Ala-Val-Arg-Ala-Ile-Gly-Arg-Leu-Ser-Ser）；
リンカーＹ（Leu-Glu）；
改変ＧＦＰ｛Ｎ末端から順に、ＧＦＰの149〜238番目のアミノ酸配列、連結アミノ酸（Gly-Gly-Thr-Gly-Gly-Ser）、ＧＦＰの１〜144番目のアミノ酸配列｝；
リンカーＺ（Thr-Arg）；
ラットのカルモジュリンの２〜148番目のアミノ酸を有する。
【００９９】
表３〜４において、リンカーＸ、Ｙ、Ｚのアミノ酸配列は一文字表記で示す。また、Ｍ１３の「Ｏ」は、（Ser-Ser-Arg-Arg-Lys-Trp-Asn-Lys-Thr-Gly-His-Ala-Val-Arg-Ala-Ile-Gly-Arg-Leu-Ser-Ser）の配列を意味する。ｃｐＥＧＦＰの「149-144」は、改変ＧＦＰがＮ末端から順に、ＧＦＰの149〜238番目のアミノ酸配列、連結アミノ酸（Gly-Gly-Thr-Gly-Gly-Ser）、ＧＦＰの１〜144番目のアミノ酸配列を有することを意味する。ＣａＭの「Ｏ」は、ラットの本来のカルモジュリン２〜148番目のアミノ酸配列を意味する。ＡＴＰ応答（ΔF/F）の値は、各バイオセンサー蛋白質を産生する細胞（HEK細胞）のＡＴＰ添加前と添加後の蛍光強度の変化量の値（ΔF）をＡＴＰ添加前の蛍光強度（F）で割った値（Arbitrary unit）である。「ｎ」は、試験した細胞の数を意味する。また、光異性化（Photoisomerization）の「＋」は、バイオセンサー蛋白質が光異性化を起こすことを意味し、「−」は、光異性化を起こさないことを意味する。
【０１００】
表３〜４では、主にリンカーＸ、Ｙ、Ｚのアミノ酸を変化させて、そのＡＴＰに対する反応性を調べた。カルモジュリン断片（２〜148番目）を用いて、リンカーＹの配列がLeu-Gluであるものが最も反応性が良かった。リンカーＺの配列は、Gly-Thr-ArgでもThr-ArgでもＡＴＰに対する反応性に変化はなかった。リンカーＸの配列はMet-Gly-ThrでもMet-Val-AspでもＡＴＰに対する反応性に変化はなかった。また、Ｇ２２に関してはＧ３のｃｐＥＧＦＰ（149-144）より一つアミノ酸が少なくなっているが、反応性に大きな変化はなかった。
【０１０１】
表３〜４に示すとおり、改変ＧＦＰのＮ末端が本来のＧＦＰの149番目のアミノ酸から始まり、リンカーＹに「ＧＦＰの148番目に相当するアミノ酸」としてグルタミン酸（Glu）をもつもの（プローブ・ナンバーＧ１８、Ｇ７２、Ｇ８５）が最も良好な反応性を示し、ＡＴＰに対する蛍光の変化量ΔＦ/Ｆについて１.５〜１.６の値を示した。また、改変ＧＦＰのＮ末端が本来のＧＦＰの150番目のアミノ酸から始まり、リンカーＹに「ＧＦＰの148番目に相当するアミノ酸」としてトレオニン（Thr）をもつもの（Ｇ２２）も反応性（ΔＦ/Ｆ＝０.６）はやや劣るものの充分なカルシウム感受性を有することが明らかとなった。
【０１０２】
更に表３〜４の結果から、148番目に対応するアミノ酸がその側鎖に水酸基を有していると、そのバイオセンサー蛋白質は光異性化を起こすことが判る。このことからも、リンカーＹの二つのアミノ酸のうち、改変ＧＦＰに隣接するアミノ酸が、ＧＦＰの蛍光強度に強く関係していることが明らかである。
【０１０３】
あるいは、上述の表１〜表４に記載のバイオセンサー蛋白質とは別に、ＧＦＰの148番目のアミノ酸残基をホットスポットアミノ酸残基としてその近傍で切断し、その切断された間に機能性分子を連結させたバイオセンサー蛋白質の例を表５に挙げる。
【０１０４】
【表５】
【０１０５】
表５に記載のバイオセンサー蛋白質は、Ｎ末端から順に
緑色蛍光蛋白質の１〜144番目のアミノ酸配列；
リンカーＡ；
ミオシン軽鎖キナーゼの一部のアミノ酸配列（Ｍ１３）；
リンカーＢ；
ラットのカルモジュリンの２〜148番目のアミノ酸配列（ＣａＭ）；
リンカーＣ；
ＧＦＰの149〜238番目のアミノ酸配列を有する。
【０１０６】
表５において、リンカーＡ、Ｂ、Ｃのアミノ酸配列は一文字表記で示す。また、Ｍ１３の「Ｏ」は、（Ser-Ser-Arg-Arg-Lys-Trp-Asn-Lys-Thr-Gly-His-Ala-Val-Arg-Ala-Ile-Gly-Arg-Leu-Ser-Ser）の配列を意味する。ＣａＭの「Ｏ」は、ラットの本来のカルモジュリン２〜148番目のアミノ酸配列を意味する。蛍光の「＋」は、ＡＴＰ添加前に弱い蛍光を発していることを意味する。ＡＴＰ応答（ΔF/F）の値は、各バイオセンサー蛋白質を産生する細胞（HEK細胞）のＡＴＰ添加前と添加後の蛍光強度の変化量の値（ΔF）をＡＴＰ添加前の蛍光強度（F）で割った値（Arbitrary unit）である。ＡＴＰ応答における＊は、ＡＴＰの代わりにカルバコールを用いたときの応答を意味する。また、光異性化（Photoisomerization）の「＋」は、バイオセンサー蛋白質が光異性化を起こすことを意味する。
【０１０７】
表５は、ＧＦＰ本来のＮ末およびＣ末をもつバイオセンサーのグループのＡＴＰに対する反応性を示しており、このグループはＡＴＰに対して弱いながら反応した。リンカーＢの長さを長くしたＡ２の方が反応性は良かった。このタイプはリンカーＡ、Ｂ、Ｃを検討することにより、より高い反応性の分子を作ることができると考えている。
【０１０８】
以上、表１〜表５に示す結果から、ＧＦＰには蛍光強度に強い影響を与えるホットスポットアミノ酸残基（ＧＦＰの148番目のアミノ酸残基）が存在することが明らかとなり、このアミノ酸残基を介してＧＦＰの蛍光強度を効率的に制御することが可能となった。同様に、148番目のアミノ酸残基以外に、94、96、222番目のアミノ酸残基でもＧＦＰの蛍光強度を制御できるバイオセンサーが作成され得ることが、ＧＦＰの結晶構造から推察される。
【０１０９】
本発明のバイオセンサー蛋白質は、上述のとおり、機能性分子としてカルモジュリン蛋白質（もしくはその一部）およびミオシン軽鎖キナーゼ（もしくはその一部）を使用したものが挙げられるが、これに限定されない。即ち、本発明のバイオセンサー蛋白質は、上述のカルシウムセンサーとして機能し得るものに限定されない。
【０１１０】
本発明のカルシウムセンサー蛋白質の特に好ましい例としては、下記（ａ）〜（ｈ）の配列を、Ｎ末端から順に有することを特徴とする：
（ａ） Met-Gly-ThrまたはMet-Val-Asp（リンカーＸ）；
（ｂ） ミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質の一部のアミノ酸配列（Ser-Ser-Arg-Arg-Lys-Trp-Asp-Lys-Thr-Gly-His-Ala-Val-Arg-Ala-Ile-Gly-Arg-Leu-Ser-Ser）；
（ｃ） Leu-Glu（リンカーＹ）；
（ｄ） 緑色蛍光蛋白質の149〜238番目のアミノ酸配列；
（ｅ） Gly-Gly-Thr-Gly-Gly-Ser；
（ｆ） 緑色蛍光蛋白質の１〜144番目のアミノ酸配列；
（ｇ） Gly-Thr-ArgまたはThr-Arg（リンカーＺ）；および
（ｈ） ラットのカルモジュリン蛋白質の２〜148番目のアミノ酸配列。
【０１１１】
本発明において作成されたカルシウムセンサーは、細胞内および細胞外でカルシウム濃度を測定する際に使用することができる。
【０１１２】
例えば、本発明のカルシウムセンサー遺伝子を大腸菌などに導入して予めつくらせたカルシウムセンサー蛋白質と検体とを混合することによりカルシウム濃度を測定することが可能である。また、大腸菌などを使用してつくらせた蛋白質を、カルシウム濃度を測定したい細胞に直接注入することにより細胞内のカルシウム濃度を測定することもできる。あるいは、本発明のカルシウムセンサー遺伝子を、カルシウム濃度を測定したい細胞に導入して細胞に蛋白質を産生させることにより、細胞内のカルシウム濃度を測定してもよい。
【０１１３】
カルシウム濃度の測定は、ある特定の波長の光（例えば、488 nmの励起光）をカルシウムセンサー蛋白質に当てることにより、センサー蛋白質の発する蛍光特性を光学機器（例えば、レーザー顕微鏡）で検出することにより行う。なお、濃度測定に使用するカルシウムセンサー蛋白質が、どのくらいのカルシウム濃度でどのような蛍光特性を示すものであるか、予め調べておくことが必要である。具体的には、例えば、大腸菌でセンサー蛋白質分子を大量に作らせて、蛍光分光光度計を用いて蛍光波長や種々のカルシウム濃度に対して蛍光強度が変化する程度を測定しておくことが必要である（図５）。本発明のバイオセンサー蛋白質は、ＥＧＦＰ（クローンテック社）とほぼ同様な蛍光波長特性を持ち、励起極大は489ｎｍであり、蛍光極大は509ｎｍであった。
【０１１４】
また、本発明においてバイオセンサー遺伝子は、本発明のバイオセンサー蛋白質をコードする遺伝子のことをいう。このようなバイオセンサー遺伝子は、まず、作成したいバイオセンサー蛋白質を構成する各構成部分（例えば、改変ＧＦＰの部分、機能性分子の部分）をコードする遺伝子断片をそれぞれＰＣＲにより作成し、次いで、これら各遺伝子断片を連結させることにより、融合遺伝子の形で作成され得る。このようにして作成されたバイオセンサー遺伝子を適切なベクター（例えば、pEGFP-N1（クローンテック社））に組込み、この組換えベクターを細胞に導入することにより、任意の細胞で所望のバイオセンサー蛋白質を産生させることが可能となる。
【０１１５】
［本発明のバイオセンサー蛋白質の性能の確認］
本発明のバイオセンサー蛋白質は、そのセンサーとしての性能を実験的に確認しておくことが必要である。
【０１１６】
本発明において実際に開発したカルシウムセンサーは、培養細胞human embrionic kidney（HEK）293 cellおよびマウスの骨格筋初代培養細胞にその遺伝子を取り込ませて性能の評価を行った。
【０１１７】
プローブ・ナンバーＧ８５のカルシウムセンサーをHEK 293細胞中で当該遺伝子（その配列を配列番号４に示す）を用いて発現させ、次いで細胞のカルシウムイオン濃度を増大させることが既知の因子として、ＡＴＰ（0.1ｍＭ）およびカルバコール（ＣＣＨ）（0.1ｍＭ）を作用させた。そのときの反応例を図３に示す。
【０１１８】
HEK 293細胞でのＡＴＰに対する蛍光の変化量は、元の蛍光強度の約１.６倍に達し、蛍光顕微鏡下で肉眼でもこれらの変化を捉えることが可能であった。カルバコールに対する蛍光の変化量は、元の蛍光強度の約２.２倍に達した。また、イオノマイシン（0.01ｍＭ）とカルシウムイオン（２ｍＭ）の添加により細胞内を高カルシウムの状態にすると、カルシウムセンサーの蛍光強度は最大に達することが確認された。一方、カルシウムイオンを添加せず、イオノマイシン（0.01ｍＭ）とＥＤＴＡ（10 ｍＭ）を添加することにより細胞内のカルシウム濃度をゼロに近づけると、センサーの蛍光強度は最小になることが確認された。
【０１１９】
また、同様にしてカルシウムセンサー（Ｇ８５）を発現している骨格筋初代培養細胞に、細胞のカルシウムイオン濃度を増大させることが既知の因子、カルバコール（0.1ｍＭ）およびカフェイン（10 ｍＭ）を作用させた。そのときの反応例を図４に示す。図３の結果と同様、カルバコールに対する蛍光の変化量は、元の蛍光強度の約２.５倍に達し、カフェインに対する蛍光の変化量は約１.１倍に達した。
【０１２０】
更に図５において、カルシウム濃度とカルシウムセンサー（Ｇ８５）の蛍光量との関係をグラフ化した。なお、Ｇ８５は大腸菌を用いてつくらせたものである。図５に示すように、本発明のカルシウムセンサー蛋白質は、非常に高いカルシウム感受性を有していた。この感受性の高さは、従来技術の欄で挙げた一つのＧＦＰから成るカルシウム感受性蛋白質よりも約３０倍高いカルシウム感受性であった。
【０１２１】
このように本発明のカルシウムセンサーは、センサーとしての性能の高さが証明されている。
【０１２２】
【実施例】
カルシウムセンサーの製法および測定法
例としてプローブ・ナンバーＧ３をコードしているpN1-G３の作成について：
１．[平滑筋ミオシン軽鎖キナーゼM13]
平滑筋ミオシン軽鎖キナーゼのM13（配列番号３）を、片山化学にて合成した下記の合成プライマーから作製する。即ち、平滑筋ミオシン軽鎖キナーゼのM13に対する２つのプライマー
smMLCKM13-1プライマー
（GCGCTAGCCGCCACCATGGGTACCTCATCACGTCGTAAGTGGAATAAGACAGGTCACGCAGTCAGA；配列番号５）と
smMLCKM13-2プライマー
（GGCGCGGCCGCTCAACTAGTTGAGCTCAGCCGACCTATAGCTCTGACTGCGTGACCTGTCTT；配列番号６）
をテンプレート兼プライマーとしてPolymerase chain reaction（PCR）を行う。アガロースゲル電気泳動を行い、目的のPCR産物をゲルから回収したのちNheIとSpeIで制限酵素処理しPCRフラグメント１を得る。
【０１２３】
２．[改変ＧＦＰ（circularly permutated enhanced GFP；ｃｐＥＧＦＰ）]
GFPをコードするcDNAを含んでいるプラスミドpEGFP-N1(Clontech社から発売されている)をテンプレートとして
EGFP-31プライマー（GGACGCGTACTAGTAACGTCTATATCATGGCCGAC；配列番号７）と
EGFP-20プライマー（CCGGTACCGCCCTTGTACAGCTCGTCCATGCC；配列番号８）
を使用してPCRを行う。アガロースゲル電気泳動を行い、目的のPCR産物をゲルから回収したのちSpeIとKpnIで制限酵素処理しPCRフラグメント２を得る。
【０１２４】
同じくpEGFP-N1をテンプレートとして
EGFP-21プライマー（GCGGTACCGGAGGGAGCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG；配列番号９）と
EGFP-30プライマー（GGACGCGTCCCGTTGTACTCCAGCTTGTGCCC；配列番号１０）
を使用してPCRを行う。アガロースゲル電気泳動を行い、目的のPCR産物をゲルから回収したのちKpnIとMluIで制限酵素処理しPCRフラグメント３を得る。
【０１２５】
３．[カルモジュリン(CaM)]
ラットのカルモジュリンcDNA（配列番号２；アクセション番号 M19312（Mori M 2000 Biochemistry 39, 1316-1323））をコードするプラスミドrCaMをテンプレートとして、ラットのカルモジュリンに対するプライマー
rCaM-2プライマー（GGACGCGT GAC CAA CTG ACT GAA GAG CAG；配列番号１１）と
rCaM-10プライマー（GCGCGGCCGCTCACTTCGCTGTCATCATTTGTAC；配列番号１２）
を用いてPCRを行う。アガロースゲル電気泳動を行い、目的のPCR産物をゲルから回収したのちMluIとNotIで制限酵素処理しPCRフラグメント4を得る。
【０１２６】
以上４つのPCRフラグメントを段階的にDNA ligaseで結合し最終的にNheIとNotIで制限酵素処理したpEGFP-N1 vectorに組み込んだ。
【０１２７】
各実験でプライマーは合成プライマーを使用した（サワディー社および片山化学）。
【０１２８】
上記のPCRの条件は
テンプレートDNA１μｇ
２種類のプライマー各10ピコモル
反応バファー（stratagene社）５マイクロリッター
pfu酵素（stratagene社）2ユニット
2.5mM dNTP（Takara社）4マイクロリッター
水をを加え、全量を50マイクロリッターとした。
【０１２９】
PCRの反応温度は
【０１３０】
DNAのゲルからの回収はDNA Fragment Purification kit MagExtractor（Toyobo社）を用い、キットのマニュアルにしたがって行った。
【０１３１】
アガロースゲル電気泳動は１％または２％アガロースゲル（Agarose LE, Nakarai tesque社）を用い、TAEバッファー（1リットル中Tris base 4.98g (Nakarai tesque社), 氷酢酸1.142 ml (Nakarai tesque社), 0.5M EDTA (pH 8) 2ml（EDTA:Ethyle-nediamine-N,N,N'N' tetraacetic acid disodium salt, Dojin社））にて電気泳動した。
【０１３２】
制限酵素によるDNAの切断はNheI, SpeI, MluI, NotI(NEB社)を用い酵素に添付されたバッファーを使用して、DNA１〜２マイクログラムに酵素各３０ユニット、バッファー１０マイクロリッター、水を加え全量を１００マイクロリッターとし、３７度で１〜３時間反応させた。DNAはその後DNA Fragment Purification kit MagExtractor（Toyobo社）を用いキットのマニュアルにしたがって回収した。
【０１３３】
Ligation反応にはDNA Ligation kit(Takara社)を用いキットのマニュアルにしたがって行った。
【０１３４】
コンピーテントセルは大腸菌HB101（Takara社）を用いtransformationにはカルシウムクロライド法を用いた（Molecular Cloning A laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis著, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）。
【０１３５】
大腸菌からのプラスミドの回収はQIAprep Spin Miniprep kit(Qiagen社)を用いキットのマニュアルにしたがって行った。
【０１３６】
細胞への導入：
cDNA（即ち、上述の大腸菌から回収されたプラスミド）は、Superfect transfection reagent(Qiagen社)を用いてマニュアルにしたがって５x１０mmのサイズのカバーガラスの上に10% 牛胎児血清, 30 units/ml ペニシリンと30 mg/ml ストレプトマイシンを含むDulbecco's modified Eagle培地（Gibuco BRL社）で培養したhuman embrionic kidney(HEK) 293 細胞 (American Type Culture Collection)に導入した。
【０１３７】
導入方法の詳細は以下に記載のとおりである。まず、３マイクログラムの上記cDNA（３マイクロリッター）に12.5マイクロリッターのSuperfect transfection reagentと血清を含まないDulbecco's modified Eagle培地８０マイクロリッターを加え１０分間室温に放置したのちに血清を含むDulbecco's modified Eagle培地を８００マイクロリッター加えた溶液を、リン酸緩衝液で１度洗浄したHEK細胞に加え、３７度で２時間培養した。培養したHEK細胞をリン酸緩衝液で１度洗浄して、10%牛胎児血清を含むDulbecco's modified Eagle培地を適量（３ｃｍディッシュ当たり２ミリリッター）加えて２８度で２〜４日培養し、実験に用いた。
【０１３８】
測定：
培養細胞の付着したカバーガラスを顕微鏡のステージの上においたチャンバーに入れ、HBS液（107 mM NaCl, 6 mM KCl, 1.2 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 1.2 mM KH2PO4, 11.5 mM glucose, 20 mM HEPES pH 7.4（Nakarai tesque, 片山化学、HEPES: 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid, Dojinから購入））で灌流した。１００マイクロモラーのアデノシン三リン酸（ATP、Sigma社）または１００マイクロモラーのカルバコール（Sigma社）はHBSに溶かし細胞に灌流投与した。ライカTCS-NTレーザー顕微鏡を用い488nmで励起し525nmで蛍光を記録した。
【０１３９】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明のバイオセンサー蛋白質を作成する方法は、多種多様なバイオセンサーの開発に応用できるものである。また、本発明のバイオセンサー蛋白質の作成方法により、高性能なバイオセンサーを短期間に作成できるようになることが期待される。
【０１４０】
本方法を利用することにより作成されたカルシウムセンサーの信号強度の変化量は大きく肉眼でも観察でき、カルシウム感受性も従来のものに比べ３０倍と高くなった。また、蛋白質性のセンサーであるので、その遺伝子を取り込ませることにより容易に細胞にセンサーを発現させることができる。また、測定に特別な装置および物質を必要とせず、アルゴンレーザーを用いた検出器が利用可能であり、補酵素を必要としないという利点も有する。
【０１４１】
更に今回開発したカルシウムセンサーは、当該蛋白質そのものを用いてカルシウム濃度を測定する機器に組み込むことができる。さらにこの蛋白質の遺伝子を組み込んだ動物、植物、組織、臓器、細胞等は、医薬品の開発および農業製品の開発に利用することができる。
【０１４２】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＧＦＰ、改変ＧＦＰ、および改変ＧＦＰを用いたカルシウムセンサー蛋白質の構造を模式的に示す図。
【図２】 カルシウムセンサー蛋白質（Ｇ３およびＧ８５）の一次構造を示す図。
【図３】 ＡＴＰおよびカルバコールに対して、HEK293細胞に発現したカルシウムセンサー蛋白質の蛍光量が変化する様子を示す図。
【図４】 カルバコールおよびカフェインに対して、骨格筋細胞に発現したカルシウムセンサー蛋白質の蛍光量が変化する様子を示す図。
【図５】 カルシウム濃度と蛍光量との関係を示すグラフ図。
【発明の属する技術分野】
本発明は、緑色蛍光蛋白質の蛍光特性を制御することが可能なバイオセンサー蛋白質を作成する方法に関する。更に本発明は、前記方法により作成されるバイオセンサー蛋白質、および前記バイオセンサー蛋白質をコードするバイオセンサー遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在までに、緑色蛍光蛋白質（Green Fluorescent Protein；以下、ＧＦＰともいう）を用いて蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を応用したバイオセンサーがいくつか開発されている。近年ＦＲＥＴを使わずに一種類のＧＦＰで蛍光強度を変化させるタイプの新しいバイオセンサーの開発報告がなされている。しかし、バイオセンサーの感受性は非常に低いものであり、とても実用的なものではなかった。このようなバイオセンサーの感受性の問題は、用いた機能性蛋白質とＧＦＰとの結合部位の検討が不十分であったためであることを、本発明者は本発明を為すにあたり新たに見出した。
【０００３】
一方、バイオセンサーのうちカルシウムセンサーに関しては、これまでに大きく分けて４種類のカルシウムセンサーが開発されている。以下にその概要と問題点を示す。
【０００４】
１）カルシウム感受性の合成色素：これは、カルシウムに感受性のある化学合成された色素で、現在一般によく使用されている。色素を外部から細胞に取り込ませて使用するものである。特定の細胞のみに色素を取り込ませることは難しく、その場合にはガラス針等により細胞に色素を注入しなければならないという問題点を有する。
【０００５】
２）エクオリン：これは、カルシウムに反応して光を発する蛋白質である。細胞に直接注入するか、エクオリンを産生する遺伝子を細胞に取り込ませて使用する。エクオリンが機能するためには細胞に補酵素を供給する必要があり、また発する光が極めて弱いという問題点を有する。
【０００６】
３）ＦＲＥＴを応用したカルシウム感受性蛋白質：これは、カルシウムに感受性のあるカルモジュリン（ＣａＭ）とそれに結合するミオシン軽鎖キナーゼの一部の配列、二つの色の異なるＧＦＰを結合した蛋白質である。当該蛋白質は、カルシウムがＣａＭに結合するとその構造が変化し、ＦＲＥＴを起こして二つのＧＦＰの発する蛍光の強度が変化することを利用したものである。当該蛋白質は、細胞に直接注入するか、その遺伝子を細胞に取り込ませて使用する。ＦＲＥＴによる蛍光の変化は小さいためその信号は極めて弱く、更に一般的に用いられているアルゴンレーザーを搭載したレーザー顕微鏡で測定することができないという問題点を有する。
【０００７】
４）一つのＧＦＰから成るカルシウム感受性蛋白：これは、ＧＦＰのアミノ酸配列の１４４番と１４６番の間にＣａＭを結合したカルシウム感受性蛋白質である。カルシウムがＣａＭに結合すると蛋白質の構造が変化し、ＧＦＰの発する蛍光の強度が変化することを利用している。当該蛋白質も、細胞に直接注入するか、その遺伝子を細胞に取り込ませて使用する。カルシウムに対する感度が低いため実際の細胞では信号／雑音比が悪くなり測定が困難であるという問題点を有する。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
上記事情に鑑み、本発明の目的は、緑色蛍光蛋白質の蛍光特性を制御することが可能なバイオセンサー蛋白質を作成する方法を提供すること、並びに前記方法により作成されるバイオセンサー蛋白質、および前記バイオセンサー蛋白質をコードするバイオセンサー遺伝子を提供することである。
【０００９】
より具体的には、検出すべき物質に対する感度が実用に耐える程度に充分高く、且つ測定が容易なバイオセンサー蛋白質を作成することを目的とする。また、特定細胞への取り込みが容易であり、更に、測定に特別な装置および補酵素等を必要としないバイオセンサー蛋白質を作成することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するため、本発明は以下に記載の手段［１］〜［１５］を提供する。
【００１１】
［１］ 緑色蛍光蛋白質の構造を改変することにより、緑色蛍光蛋白質の蛍光特性を制御することが可能なバイオセンサー蛋白質を作成する方法であって、
（Ａ）緑色蛍光蛋白質の蛍光特性に影響を及ぼすホットスポットアミノ酸残基を推定する工程と；
（Ｂ）前記ホットスポットアミノ酸残基の近傍で緑色蛍光蛋白質のアミノ酸配列を切断して前記蛋白質の構造を改変した種々の改変緑色蛍光蛋白質と、
自身の立体構造の変化を前記改変緑色蛍光蛋白質に伝えることにより、前記改変緑色蛍光蛋白質の立体構造を変化させ、蛍光特性を変化させるように機能する機能性分子
とが連結された種々の融合蛋白質を作成する工程と；
（Ｃ）前記種々の融合蛋白質に、前記機能性分子の立体構造に影響を及ぼす因子を作用させる工程と；
（Ｄ）前記種々の融合蛋白質のなかから、前記（Ｃ）工程により蛍光特性に変化が現れる融合蛋白質をバイオセンサー蛋白質として選択する工程と
を具備することを特徴とする方法。
【００１２】
［２］ ［１］に記載の方法であって、前記蛍光特性が蛍光強度であることを特徴とする方法。
【００１３】
［３］ （１）蛍光特性に影響を及ぼすホットスポットアミノ酸残基の近傍で緑色蛍光蛋白質のアミノ酸配列を切断して、前記蛋白質の構造を改変した改変緑色蛍光蛋白質、および
（２）自身の立体構造の変化を前記改変緑色蛍光蛋白質に伝えることにより、前記改変緑色蛍光蛋白質の立体構造を変化させ、蛍光特性を変化させるように機能する機能性分子
を含むことを特徴とするバイオセンサー蛋白質。
【００１４】
［４］ ［３］に記載のバイオセンサー蛋白質であって、前記蛍光特性が蛍光強度であることを特徴とする蛋白質。
【００１５】
［５］ ［３］または［４］に記載のバイオセンサー蛋白質であって、前記ホットスポットアミノ酸残基が、緑色蛍光蛋白質の第148番目であることを特徴とするバイオセンサー蛋白質。
【００１６】
［６］ ［３］または［４］に記載のバイオセンサー蛋白質であって、前記ホットスポットアミノ酸残基が、緑色蛍光蛋白質の第94番目であることを特徴とするバイオセンサー蛋白質。
【００１７】
［７］ ［３］または［４］に記載のバイオセンサー蛋白質であって、前記ホットスポットアミノ酸残基が、緑色蛍光蛋白質の第96番目であることを特徴とするバイオセンサー蛋白質。
【００１８】
［８］ ［３］または［４］に記載のバイオセンサー蛋白質であって、前記ホットスポットアミノ酸残基が、緑色蛍光蛋白質の第222番目であることを特徴とするバイオセンサー蛋白質。
【００１９】
［９］ （１）下記（ａ）、（ｂ）のアミノ酸配列を、Ｎ末端から順に有する改変緑色蛍光蛋白質：
（ａ） 緑色蛍光蛋白質のＸ〜238番目のアミノ酸配列、
（ｂ） 緑色蛍光蛋白質の１〜Ｙ番目のアミノ酸配列、
（ここで、Ｘは148〜150の任意の位置であり、Ｙは140〜147の任意の位置である）、および
（２）自身の立体構造の変化を前記改変緑色蛍光蛋白質に伝えることにより、前記改変緑色蛍光蛋白質の立体構造を変化させ、蛍光特性を変化させるように機能する機能性分子
を含むことを特徴とするバイオセンサー蛋白質。
【００２０】
［１０］ 下記（ａ）〜（ｈ）の配列を、Ｎ末端から順に有することを特徴とするバイオセンサー蛋白質：
（ａ）メチオニンを含むアミノ酸配列（リンカーＸ）；
（ｂ）ミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質もしくはその一部のアミノ酸配列；
（ｃ）前述の（ｂ）の配列と後述の（ｄ）の配列とを連結するアミノ酸配列（リンカーＹ）；
（ｄ）緑色蛍光蛋白質のＸ〜238番目のアミノ酸配列（ここで、Ｘは148〜150の任意の位置である）；
（ｅ）前述の（ｄ）の配列と後述の（ｆ）の配列とを連結するアミノ酸配列；（ｆ）緑色蛍光蛋白質の１〜Ｙ番目のアミノ酸配列（ここで、Ｙは140〜147の任意の位置である）；
（ｇ）前述の（ｆ）の配列と後述の（ｈ）の配列とを連結するアミノ酸配列（リンカーＺ）；
（ｈ）カルモジュリン蛋白質もしくはその一部のアミノ酸配列。
【００２１】
［１１］ （１）下記（ａ）、（ｂ）のアミノ酸配列を、Ｎ末端から順に有する改変緑色蛍光蛋白質：
（ａ） 緑色蛍光蛋白質の149〜238番目のアミノ酸配列、
（ｂ） 緑色蛍光蛋白質の１〜144番目のアミノ酸配列、および
（２）自身の立体構造の変化を前記改変緑色蛍光蛋白質に伝えることにより、前記改変緑色蛍光蛋白質の立体構造を変化させ、蛍光特性を変化させるように機能する機能性分子
を含むことを特徴とするバイオセンサー蛋白質。
【００２２】
［１２］ 下記（ａ）〜（ｈ）の配列を、Ｎ末端から順に有することを特徴とするバイオセンサー蛋白質：
（ａ） メチオニンを含むアミノ酸配列（リンカーＸ）；
（ｂ） ミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質もしくはその一部のアミノ酸配列；
（ｃ） 前述の（ｂ）の配列と後述の（ｄ）の配列とを連結するアミノ酸配列（リンカーＹ）；
（ｄ） 緑色蛍光蛋白質の149〜238番目のアミノ酸配列；
（ｅ） 前述の（ｄ）の配列と後述の（ｆ）の配列とを連結するアミノ酸配列；
（ｆ） 緑色蛍光蛋白質の１〜144番目のアミノ酸配列；
（ｇ） 前述の（ｆ）の配列と後述の（ｈ）の配列とを連結するアミノ酸配列（リンカーＺ）；および
（ｈ） カルモジュリン蛋白質もしくはその一部のアミノ酸配列。
【００２３】
［１３］ ［３］〜［９］、［１１］の何れか１に記載のバイオセンサー蛋白質であって、前記機能性分子が、カルモジュリン蛋白質もしくはその一部のアミノ酸配列、およびミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質もしくはその一部のアミノ酸配列であることを特徴とするバイオセンサー蛋白質。
【００２４】
［１４］ 下記（ａ）〜（ｈ）の配列を、Ｎ末端から順に有することを特徴とするバイオセンサー蛋白質：
（ａ） Met-Gly-ThrまたはMet-Val-Asp（リンカーＸ）；
（ｂ） ミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質の一部のアミノ酸配列（Ser-Ser-Arg-Arg-Lys-Trp-Asp-Lys-Thr-Gly-His-Ala-Val-Arg-Ala-Ile-Gly-Arg-Leu-Ser-Ser）；
（ｃ） Leu-Glu（リンカーＹ）；
（ｄ） 緑色蛍光蛋白質の149〜238番目のアミノ酸配列；
（ｅ） Gly-Gly-Thr-Gly-Gly-Ser（連結アミノ酸配列）；
（ｆ） 緑色蛍光蛋白質の１〜144番目のアミノ酸配列；
（ｇ） Gly-Thr-ArgまたはThr-Arg（リンカーＺ）；および
（ｈ） ラットのカルモジュリン蛋白質の２〜148番目のアミノ酸配列。
【００２５】
［１５］ ［３］〜［１４］の何れか１に記載のバイオセンサー蛋白質をコードするバイオセンサー遺伝子。
【００２６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の緑色蛍光蛋白質の蛍光特性を制御することが可能なバイオセンサー蛋白質の作成方法について（Ａ）〜（Ｅ）の工程順に説明する。本発明のバイオセンサー蛋白質は、一分子の緑色蛍光蛋白質から成るものである。
【００２７】
〈本発明のバイオセンサー蛋白質の作成方法〉
（Ａ）緑色蛍光蛋白質の蛍光特性に影響を及ぼすホットスポットアミノ酸残基を推定する工程：
緑色蛍光蛋白質（以下、ＧＦＰともいう）は、２３８個のアミノ酸からなる蛋白質である。本発明で使用したＧＦＰは、Clontech社から入手した組換えＧＦＰ（ＥＧＦＰ）である。ＥＧＦＰは、本来のＧＦＰには存在しないバリン（gtg）がＮ末のメチオニンにつづいて挿入されており、これはアミノ酸番号１’と呼ばれる。便宜的にアミノ酸番号１’のバリン（gtg）を省略したＥＧＦＰの核酸およびアミノ酸配列を配列番号１に示す。配列番号１に記載のアミノ酸配列における１〜238番のアミノ酸は、本明細書に記載される「緑色蛍光蛋白質の第ｎ番目のアミノ酸」に対応するものである。
【００２８】
本発明において実際に作成されたバイオセンサー蛋白質はすべて、Ｎ末のメチオニンの後にアミノ酸番号１’のバリンが挿入された上述のＥＧＦＰを使用して作成されたものである。
【００２９】
また本発明では便宜的に、ＧＦＰを図１Ａに示すような簡略化した構造で示す。ＧＦＰは、その分子構造の内部中央に発色団を有している。ＧＦＰは、ＧＦＰをコードするｃＤＮＡを含むプラスミド、例えばpEGFP-N1（Clontech社）を発現させることにより入手することができる。
【００３０】
本発明において、ＧＦＰの蛍光特性に影響を及ぼす「ホットスポットアミノ酸残基」とは、後述の改変緑色蛍光蛋白質を作成する際に、その改変位置の指標となるＧＦＰ上のアミノ酸残基であり、このホットスポットアミノ酸残基の近傍でＧＦＰの構造を改変することにより、所望の改変緑色蛍光蛋白質を作成することが可能となるものである。
【００３１】
ＧＦＰの構造を改変するとは、好ましくは、推定されるホットスポットアミノ酸残基の近傍（好ましくは、ホットスポットアミノ酸残基の前後５アミノ酸の範囲内の各位置）でＧＦＰを切断し、更に切断部位から適切な数のアミノ酸（好ましくは１〜１０個のアミノ酸）を除去することをいう。ただし、ＧＦＰの構造改変は、所望の改変緑色蛍光蛋白質を作成することが可能であれば、記載された改変に限定されず、任意の改変を含み得る。
【００３２】
また、所望の改変緑色蛍光蛋白質（以下、改変ＧＦＰともいう）とは、後述するとおり、ＧＦＰの構造を、その蛍光特性が可逆的に変化し得るように改変したものである。蛍光特性が可逆的に変化するとは、改変ＧＦＰの有している立体構造を変化させる因子（即ち、バイオセンサーが感知する因子）の有無により、改変ＧＦＰの立体構造が可逆的に変化し、それに伴って改変ＧＦＰの蛍光特性が可逆的に変化することをいう。この変化は、蛍光顕微鏡もしくはレーザー顕微鏡等で捉えることができる程度の変化をいい、好ましくは肉眼で捉えることができる程度の変化をいう。例えば、蛍光特性の変化が蛍光強度の変化である場合、蛍光の変化量ΔＦ/Ｆが、好ましくは、少なくとも０．１以上変化すること、より好ましくは１〜１０の範囲で変化することをいう。
【００３３】
本発明において蛍光特性とは、蛍光強度、蛍光波長、蛍光強度比、吸光度、吸光波長などの蛍光特性を指す。本発明では蛍光特性の一例として、蛍光強度を使用する。
【００３４】
このようなホットスポットアミノ酸残基という概念は、本発明において種々の改変ＧＦＰを有する種々のバイオセンサー蛋白質を試作したところ、ＧＦＰの蛍光特性に強い影響を与えるアミノ酸残基がＧＦＰ上に存在することを見出したことにより得られた概念である。
【００３５】
このようなホットスポットアミノ酸残基は、種々の改変ＧＦＰを有するバイオセンサー蛋白質を試作することにより、その性能からその位置を推定することもできるが、ＧＦＰの結晶構造を見て推定することもできる。即ち、ホットスポットアミノ酸残基は、ＧＦＰの発色団と水素結合をしているアミノ酸である可能性が高いので、ＧＦＰの結晶構造から発色団と水素結合をしているアミノ酸をホットスポットアミノ酸残基と推定することができる。
【００３６】
本発明において推定されたＧＦＰのホットスポットアミノ酸残基は、ＧＦＰの第94番目、第96番目、第148番目、第222番目のアミノ酸である。これらの位置のアミノ酸残基がホットスポットアミノ酸残基として好ましいが、これらに限定されない。
【００３７】
（Ｂ）前記ホットスポットアミノ酸残基の近傍で緑色蛍光蛋白質のアミノ酸配列を切断して前記蛋白質の構造を改変した種々の改変緑色蛍光蛋白質と、
自身の立体構造の変化を前記改変緑色蛍光蛋白質に伝えることにより、前記改変緑色蛍光蛋白質の立体構造を変化させ、蛍光特性を変化させるように機能する機能性分子
とが連結された種々の融合蛋白質を作成する工程：
前記工程（Ａ）により推定されたホットスポットアミノ酸残基が、ＧＦＰのｎ番目のアミノ酸であると想定して以下説明する。
【００３８】
本発明において改変緑色蛍光蛋白質（以下、改変ＧＦＰともいう）とは、好ましくは、ＧＦＰをホットスポットアミノ酸残基の近傍（例えば、ＧＦＰのｎ番目のアミノ酸と(ｎ＋１)番目のアミノ酸との間）で切断し、次いで、切断部位のアミノ酸（例えば、(ｎ−ａ)番目〜ｎ番目のアミノ酸）を除去することによりＧＦＰの分子構造を改変し、必要に応じてＧＦＰの本来のＮ末端と本来のＣ末端とを適切な連結アミノ酸（例えば、Gly-Gly-Thr-Gly-Gly-Ser）で連結したものをいう（図１Ｃ参照）。
【００３９】
ただし、このような連結アミノ酸を用いてＧＦＰ本来のＮ末端と本来のＣ末端とを連結し、一本の鎖で繋がれた蛋白質としなくても、細胞内で分断されたままの２つのＧＦＰ断片が機能することも考えられる。
【００４０】
なお、ＧＦＰの本来のＮ末端とＣ末端とを連結するアミノ酸は、好ましくはアミノ酸２〜１０分子から成る配列であり、グリシンを多く含むアミノ酸が好ましく、特に好ましい例としては、Gly-Gly-Thr-Gly-Gly-Serが挙げられるがこれらに限定されない。
【００４１】
例えば、ＧＦＰをｎ番目のアミノ酸と(ｎ＋１)番目のアミノ酸との間で切断し、次いで、(ｎ−ａ)番目〜ｎ番目のアミノ酸を除去し、本来のＮ末端とＣ末端とを上述の連結アミノ酸で連結させた場合、改変ＧＦＰは、Ｎ末端から順に、(ｎ＋１)番目〜２３８番目のアミノ酸、連結アミノ酸、１番目〜(ｎ−ａ)番目のアミノ酸を有する蛋白質となる。尚この場合、後の工程において、改変ＧＦＰの新たなＮ末端および/またはＣ末端に機能性分子を連結させることになる（図１Ｄ参照）。
【００４２】
あるいは、ＧＦＰをｎ番目のアミノ酸と(ｎ＋１)番目のアミノ酸との間で切断し、次いで、(ｎ−ａ)番目〜ｎ番目のアミノ酸を除去し、本来のＮ末端とＣ末端とを連結させない場合については、改変ＧＦＰは、１番目〜(ｎ−ａ)番目のアミノ酸と(ｎ＋１)番目〜２３８番目のアミノ酸とに分断された蛋白質となる。この場合、後の工程で、分断されている両蛋白質の間に機能性分子を挟んで連結させることにより一本の鎖で繋がれた蛋白質としてもよい（図１Ｂ参照）。また、このように一本の鎖で繋がれた蛋白質としなくても、細胞内で分断されたまま２つのＧＦＰ断片が機能することも考えられる。
【００４３】
なお、ここでＧＦＰを切断するホットスポットアミノ酸残基（ｎ番目のアミノ酸）の近傍とは、例えば、(ｎ＋５)〜(ｎ−５)の範囲、好ましくは（ｎ＋２）〜（ｎ−２）の範囲をいう。また、除去するアミノ酸、即ちａの値は、例えば１〜１０、好ましくはａ＝４である。
【００４４】
上述の範囲の種々の改変ＧＦＰを、バイオセンサー蛋白質を構成する候補として挙げることができる。ただし、上述のホットスポットアミノ酸残基の近傍の切断位置、および除去するアミノ酸の数は、当業者により適宜設定することができる。例えば、表１〜２に記載されるとおり、切断位置、除去するアミノ酸の数を種々、変更することができる。
【００４５】
（Ｂ）工程において、前記改変ＧＦＰに連結される機能性分子とは、機能性分子自身が、機能性分子に作用する因子（即ち、バイオセンサーが感知する因子）の結合等の作用により、立体構造に変化を起こし得る分子であって、自身の立体構造の変化を改変ＧＦＰに伝え得る分子であれば限定されない。
【００４６】
従って、本発明において機能性分子は、自身の立体構造の変化を改変ＧＦＰに伝達し改変ＧＦＰの構造に変化を及ぼし得る位置で、改変ＧＦＰに連結されている必要がある。従って機能性分子は、本来のＧＦＰ構造を改変した部分に近接して連結されていることが好ましい。具体的には、ＧＦＰを切断した位置にリンカー分子を介して連結されていることが好ましい。
【００４７】
このような機能性分子は、一分子であってもよいし、二分子以上であってもよい。二分子の場合、機能性分子に作用する因子（即ち、バイオセンサーが感知する因子）は、まず一方の機能性分子の立体構造に変化を及ぼし、次いでその立体構造の変化が、他方の機能性分子の立体構造に変化を及ぼし、それぞれの機能性分子の構造変化が改変ＧＦＰの立体構造に変化を起こさせる。二分子以上の場合も同様に、最初の因子の作用を、シグナル伝達のように次々と他の機能性分子に伝えることにより、最終的には、全ての機能性分子の構造変化がそれぞれに作用して改変ＧＦＰの立体構造に変化を起こさせる。
【００４８】
このように機能性分子が二分子以上の場合には、それぞれの分子の構造変化が改変ＧＦＰの構造に影響を与え得るため、機能性分子が一分子である場合より、改変ＧＦＰへの作用が大きく、結果的に、改変ＧＦＰの蛍光特性を大きく変化させることにつながり得る可能性が高い。
【００４９】
また、本発明において改変ＧＦＰに連結する機能性分子は、その機能性分子が生体内で発現しているとおりの全構造を有している必要は必ずしもなく、上述の機能性分子として役割を果たすものであれば、機能性分子に作用する因子が結合する部位のみを有している一部構造であってもよい。
【００５０】
機能性分子としては、例えば、カルモジュリン蛋白質とミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質との組み合わせ、またはＣＲＥ(Cyclic AMP Responsive Element)結合蛋白質（ＣＲＥＢ）とＣＲＥＢ結合蛋白質（ＣＢＰ）との組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５１】
例えば、本発明では後述の実施例において、カルモジュリン蛋白質、およびミオシン軽鎖キナーゼのカルモジュリン結合機能を有する一部（即ち、Ｍ１３断片）を機能性分子として使用した。このような機能性分子を改変ＧＦＰに連結すれば、この融合蛋白質はカルシウムセンサーとして機能し得る。
【００５２】
改変ＧＦＰに、カルモジュリン蛋白質（ＣａＭ）およびミオシン軽鎖キナーゼ（Ｍ１３）の機能性分子を連結した融合蛋白質の構造を、図１Ｂおよび図１Ｄに模式的に示す。また、これら融合蛋白質の一例の構造を一次元的に図２に示す。
【００５３】
図２に示すように、改変ＧＦＰと機能性分子とは、数個のアミノ酸から成るリンカー分子により連結される。各リンカー分子を区別するため、融合蛋白質のＮ末端に存在する開始コドン（Met）を含むリンカーは、リンカーＸ；改変ＧＦＰのＮ末端側と機能性分子（Ｍ１３）を連結するリンカーは、リンカーＹ；改変ＧＦＰのＣ末端側と機能性分子（ＣａＭ）とを連結するリンカーは、リンカーＺと称する。なお、ＧＦＰ本来のＮ末端とＣ末端とを繋ぐ連結アミノ酸（ＧＧＴＧＧＳ）については、改変ＧＦＰの説明の中の記載を参照されたい。
【００５４】
これら各リンカーの長さや配列は限定される必要はないが、その長さは０〜１０個が好ましく、２個がより好ましい。また、リンカーＹの配列については、ロイシン-グルタミン酸が好ましい。
【００５５】
リンカーは、機能性分子の立体構造の変化を改変ＧＦＰに伝達する部分であるので、リンカーの長さや配列により改変ＧＦＰへの立体構造の変化の度合は大きく影響される。各リンカーの長さ、配列の選択は、結合する機能性分子により変えなければならない。リンカーなしで直接、改変ＧＦＰと機能性分子とが連結した場合も想定される。
【００５６】
実際には、リンカーの配列を種々変更させたバイオセンサー蛋白質を作成して実験してみる必要がある。
【００５７】
具体的に本発明においては、改変ＧＦＰと機能性分子（Ｍ１３）とを連結するリンカーＹの配列を種々変更させたバイオセンサー蛋白質を作成し、その反応性を調べている（表１〜表４参照）。尚、ここでは、改変ＧＦＰのＮ末が本来のＧＦＰの149番目のアミノ酸から始まるとき、この改変ＧＦＰのＮ末に隣接するリンカーＹのアミノ酸を「ＧＦＰの148番目に相当するアミノ酸」と考える。また、「ＧＦＰの148番目に相当するアミノ酸」からＮ末側に１個遡ったアミノ酸を「ＧＦＰの147番目に相当するアミノ酸」と考える。同様に、改変ＧＦＰのＮ末が、本来のＧＦＰの150番目のアミノ酸から始まるときには、この改変ＧＦＰのＮ末に隣接するリンカーＹのアミノ酸からＮ末側に２個溯ったアミノ酸を「ＧＦＰの148番目に相当するアミノ酸」と考えることができる。
【００５８】
後述の表１〜４に記載のバイオセンサー蛋白質が示すとおり、リンカーＹのアミノ酸配列のうち「ＧＦＰの148番目に相当するアミノ酸」が、酸性側鎖を持つ場合（Ｇ５２のAsp、Ｇ１８、Ｇ７９のGlu）、および水酸基をその側鎖の一部に持つ場合（Ｇ３、Ｇ１７のSer、Ｇ２２のThr、Ｇ４７のTyr）、機能的に反応性のあるバイオセンサーを形成しやすいことが判る。逆に塩基性側鎖を持つ場合（Ｇ６２のLys、Ｇ１９、Ｇ７５のArg）、反応性が乏しくなる傾向がある。また、「ＧＦＰの148番目に相当するアミノ酸」が水酸基をその側鎖の一部に持つときには、更に光異性化特性をもつようになる。更に、「ＧＦＰの147番目に相当するアミノ酸」も、バイオセンサー蛋白質の反応性に影響を与えることが判る。この「147番目に相当するアミノ酸」は、Leu＞Thr＞Glyの順に、バイオセンサーの反応性に良い影響を及ぼす。しかし、「147番目に相当するアミノ酸」Proは、148番目のArgの反応性を上げる効果は乏しい（Ｇ１９）。このようにリンカーの配列を種々変更させることにより、適切なリンカーの配列を絞り込むことができる。
【００５９】
融合蛋白質の作成は、公知の遺伝子工学的手法を用いて行うことができる。例えば、融合したい各蛋白質部分をコードする遺伝子（即ち、改変ＧＦＰおよび機能性分子をコードする遺伝子）の断片をそれぞれＰＣＲにより作成し、これら断片をつなぎ合わせることにより融合遺伝子を作成し、次いで、この融合遺伝子を含むプラスミドを所望の細胞に導入して発現させることにより、融合蛋白質はつくられる。
【００６０】
（Ｃ）前記種々の融合蛋白質に、前記機能性分子の立体構造に影響を及ぼす因子を作用させる工程：
工程（Ｂ）により得られた融合蛋白質が有している機能性分子の立体構造に影響を及ぼす分子としては、当該機能性分子に結合する等の作用をして機能性分子の立体構造に影響を与える分子そのものを使用することもできるし、あるいは、機能性分子の立体構造に影響を与える分子を細胞内で増大させるように機能することが知られている分子を使用することもできる。
【００６１】
機能性分子がカルモジュリン蛋白質およびミオシン軽鎖キナーゼの場合、機能性分子の立体構造に影響を及ぼす因子として、カルモジュリンに結合してカルモジュリンの立体構造を変化させるカルシウムイオンを使用してもよいし、あるいは、融合蛋白質を発現している細胞のカルシウムイオン濃度を増大させることが知られている作用因子、例えばＡＴＰ、カルバコール、カフェイン、タプシガルジン等を使用してもよい。これらの因子を作用させることにより、当該融合蛋白質のバイオセンサー（カルシウムセンサー）としての機能を確認することができる。
【００６２】
あるいは、機能性分子がＣＲＥ結合蛋白質（ＣＲＥＢ）とＣＲＥＢ結合蛋白質（ＣＢＰ）の場合、バイオセンサーとしての機能を確認するために使用する作用因子としては、例えばＡキナーゼを使用することができる。
【００６３】
機能性分子の立体構造に影響を及ぼす因子を作用させる方法としては、例えば、改変ＧＦＰと機能性分子との融合蛋白質を産生している細胞をレーザー顕微鏡のステージ上のチャンバーに入れ、作用因子を当該細胞に添加することにより行われる。この方法は、その後の融合蛋白質の蛍光特性の変化を観察することを考慮している点で好ましい。なお、作用因子は、例えばＡＴＰやカルバコールを用いる場合、灌流液（ＨＢＳ）に懸濁し、２０〜３００μＭの濃度で添加することが適切である。
【００６４】
（Ｄ）前記種々の融合蛋白質のなかから、前記（Ｃ）工程により蛍光特性に変化が現れる融合蛋白質をバイオセンサー蛋白質として選択する工程：
工程（Ｃ）の作用により蛍光特性に変化が現れる融合蛋白質を、蛍光を検出することが可能な装置、例えばレーザー顕微鏡もしくは蛍光顕微鏡に取りつけられたＣＣＤカメラ等を用いて検出し、これらをバイオセンサー蛋白質として選択する。ここで「蛍光特性に変化が現れる」とは、蛍光顕微鏡もしくはレーザー顕微鏡等で捉えることができる程度の変化が起こることをいい、好ましくは肉眼で捉えることができる程度の変化が現れることをいう。例えば、蛍光特性の変化が蛍光強度の変化である場合、蛍光の変化量ΔＦ/Ｆが、好ましくは、少なくとも０．１以上変化すること、より好ましくは１〜１０の範囲で変化することをいう。
【００６５】
工程（Ｄ）で選択されたバイオセンサー蛋白質は、センサーとして感知する因子の有無に応じて、当該蛋白質の蛍光特性が可逆的に変化し得る状態にある。
【００６６】
このようにＧＦＰの蛍光特性が可逆的に変化し得るように改変されたバイオセンサー蛋白質は、蛍光特性が変化し得る臨界状態にあるということもできる。
【００６７】
例えば、蛍光特性が蛍光強度である場合、バイオセンサー蛋白質は、蛍光を発する状態と蛍光を発しない状態の臨界状態にある。この臨界状態においてバイオセンサー蛋白質は、蛍光を発していない状態にあってもよいし、蛍光強度の低い状態にあってもよい。あるいは、改変ＧＦＰは蛍光強度の高い状態にあってもよい。ここで、蛍光を発していないとは、光学機器を使用して蛍光を確認できないことをいう。蛍光強度が低いとは、センサーとして感知する因子の存在により、上述の変化量（ΔＦ/Ｆが少なくとも０．１以上変化する量）を示して、蛍光強度が高い状態に変化し得る程度に低いことをいう。同様に、蛍光強度が高いとは、センサーとして感知する因子の存在により、上述の変化量（ΔＦ/Ｆが少なくとも０．１以上変化する量）を示して、蛍光強度が低い状態に変化し得る程度に高いことをいう。
【００６８】
バイオセンサー蛋白質が臨界状態にあって蛍光強度の高い状態は、僅かな立体構造の変化によりその蛍光を発しなくなる「ぎりぎり蛍光を強く発していられる状態」ということもできる。また、バイオセンサー蛋白質が臨界状態にあって蛍光を発していない状態は、僅かな立体構造の変化により蛍光を発する状態に変化し得る「ぎりぎり蛍光を発することができない状態」ということもできる。同様に、バイオセンサー蛋白質が臨界状態にあって蛍光強度が低い状態も、僅かな立体構造の変化により蛍光を強く発する状態に変化し得る「ぎりぎり蛍光を弱くしか発することができない状態」ということもできる。
【００６９】
上述のようにバイオセンサー蛋白質を臨界状態にする理由は、センサーの感知する因子の有無によって敏感に反応し、その立体構造が可逆的に変化し、それに伴ってその蛍光特性が可逆的に変化する状態（例えば、蛍光を発する状態と蛍光を発しない状態との間を可逆的に行き来するような状態）を作り出すためである。バイオセンサー蛋白質は、このような臨界状態にあることにより、バイオセンサーとして機能し得る状態にあるということができる。
【００７０】
［バイオセンサー蛋白質およびバイオセンサー遺伝子］
本発明のバイオセンサー蛋白質は、上述のバイオセンサー蛋白質を作成する方法により選択されたものをいう。また、本発明のバイオセンサー遺伝子は、本発明のバイオセンサー蛋白質をコードする遺伝子をいい、本発明のバイオセンサー蛋白質を細胞で発現させるために使用するものである。
【００７１】
本発明のバイオセンサー蛋白質は、
（１）蛍光特性に影響を及ぼすホットスポットアミノ酸残基の近傍で緑色蛍光蛋白質のアミノ酸配列を切断して前記蛋白質の構造を改変した改変ＧＦＰ、および
（２）自身の立体構造の変化を前記改変ＧＦＰに伝えることにより、前記改変ＧＦＰの立体構造を変化させ、蛍光特性を変化させるように機能する機能性分子を含むことを特徴とする。
【００７２】
バイオセンサー蛋白質が構成要素として含む改変ＧＦＰは、上記規定したとおりであり、好ましくは、ホットスポットアミノ酸残基の近傍でＧＦＰのアミノ酸配列を切断し、次いで、切断部位のアミノ酸を除去することによりＧＦＰの分子構造を改変し、必要に応じてＧＦＰ本来のＮ末端と本来のＣ末端とを適切なアミノ酸配列で連結したものをいう。
【００７３】
また、機能性分子も、上記規定したとおりであり、機能性分子自身が、機能性分子に作用する因子（即ち、バイオセンサーが感知する因子）の結合等の作用により、立体構造に変化を起こし得る分子であって、自身の立体構造の変化を改変ＧＦＰに伝え得る分子である。
【００７４】
改変ＧＦＰ、機能性分子ともに、上記規定されるようなものであれば限定されない。
【００７５】
また、上述のとおり、本発明のバイオセンサー蛋白質は、機能性分子が、自身の立体構造の変化を改変ＧＦＰに伝達し改変ＧＦＰの構造に変化を及ぼし得る位置で、改変ＧＦＰに連結されている必要がある。従って機能性分子は、本来のＧＦＰ構造を改変した部分に近接して連結されていることが好ましい。具体的には、ＧＦＰを切断した位置にリンカー分子を介して連結されていることが好ましい。
【００７６】
更に、本発明のバイオセンサー蛋白質として機能するためには、センサー蛋白質が感知する因子の有無により、センサー蛋白質の蛍光特性が可逆的に変化し得ることが要求される。本発明では蛍光特性の一例として、蛍光強度を使用する。上述したとおり、本発明のバイオセンサー蛋白質は、蛍光を発する状態と蛍光を発しない状態の臨界状態にあり、その蛍光特性を可逆的に変化し得るものである。
【００７７】
また、本発明のバイオセンサー蛋白質は、好ましくはそのホットスポットアミノ酸残基がＧＦＰの148番目、94番目、96番目、もしくは222番目のアミノ酸残基である。
【００７８】
ＧＦＰの148番目のアミノ酸残基をホットスポットアミノ酸残基として採用したバイオセンサー蛋白質は、好ましくは、下記（１）、（２）の配列を含むことを特徴とする：
（１）下記（ａ）、（ｂ）のアミノ酸配列を、Ｎ末端から順に有する改変緑色蛍光蛋白質：
（ａ） 緑色蛍光蛋白質のＸ〜238番目のアミノ酸配列、
（ｂ） 緑色蛍光蛋白質の１〜Ｙ番目のアミノ酸配列、
（ここで、Ｘは148〜150の任意の位置であり、Ｙは140〜147の任意の位置である）、および
（２）自身の立体構造の変化を前記改変緑色蛍光蛋白質に伝えることにより、前記改変緑色蛍光蛋白質の立体構造を変化させ、蛍光特性を変化させるように機能する機能性分子。
【００７９】
また、ＧＦＰの148番目のアミノ酸残基をホットスポットアミノ酸残基として採用したバイオセンサー蛋白質の、より具体的な例としては、下記（ａ）〜（ｈ）の配列を、Ｎ末端から順に有することを特徴とする：
（ａ）メチオニンを含むアミノ酸配列（リンカーＸ）；
（ｂ）ミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質もしくはその一部のアミノ酸配列；
（ｃ）前述の（ｂ）の配列と後述の（ｄ）の配列とを連結するアミノ酸配列（リンカーＹ）；
（ｄ）緑色蛍光蛋白質のＸ〜238番目のアミノ酸配列（ここで、Ｘは148〜150の任意の位置である）；
（ｅ）前述の（ｄ）の配列と後述の（ｆ）の配列とを連結するアミノ酸配列；
（ｆ）緑色蛍光蛋白質の１〜Ｙ番目のアミノ酸配列（ここで、Ｙは140〜147の任意の位置である）；
（ｇ）前述の（ｆ）の配列と後述の（ｈ）の配列とを連結するアミノ酸配列（リンカーＺ）；
（ｈ）カルモジュリン蛋白質もしくはその一部のアミノ酸配列。
【００８０】
ここで、（ａ）のリンカーＸは、メチオニンを含む任意のアミノ酸配列であるが、好ましくは１〜１０個のアミノ酸であり、より好ましくはMet-Xaa-Xaa（Xaaは任意のアミノ酸）であり、更に好ましくはMet-Gly-Thr、Met-Val-Aspである。（ｃ）のリンカーＹは、任意のアミノ酸配列であるが、好ましくは０〜１０個のアミノ酸であり、より好ましくは、リンカーＹのアミノ酸配列のうち「ＧＦＰの147番目に相当するアミノ酸」がLeu、Thr、またはGlyで、「ＧＦＰの148番目に相当するアミノ酸」が、酸性側鎖または水酸基をその一部に含む側鎖を持つアミノ酸であり、更に好ましくはLeu-Gluである。（ｅ）の連結アミノ酸は、好ましくは、２〜１０個のアミノ酸であり、より好ましくは、グリシン等のペプチドの主鎖の動きに大きな自由度を与え、主鎖をフレキシブルにするようなアミノ酸を多く含むアミノ酸配列であり、更に好ましくはGly-Gly-Thr-Gly-Gly-Serである。（ｇ）のリンカーＺは、任意のアミノ酸配列であるが、好ましくは０〜１０個のアミノ酸であり、より好ましくは２〜３個のアミノ酸であり、更に好ましくはThr-Argである。
【００８１】
上述のＧＦＰの148番目のアミノ酸残基をホットスポットアミノ酸残基として用いた種々のバイオセンサー蛋白質の例を下記表１〜２に列挙する。機能性分子としてはミオシン軽鎖キナーゼ（Ｍ１３）およびカルモジュリン（ＣａＭ）を使用した。
【００８２】
【表１】
【表２】
表１〜２に記載のバイオセンサー蛋白質は、Ｎ末端から順に
メチオニンを含むアミノ酸配列（リンカーＸ）；
ミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質の一部のアミノ酸配列（Ｍ１３）；
連結アミノ酸配列（リンカーＹ）；
改変ＧＦＰ（ｃｐＥＧＦＰ）；
連結アミノ酸配列（リンカーＺ）；
カルモジュリン蛋白質の２〜148番目のアミノ酸配列（ＣａＭ）を有する。
【００８５】
ここで機能性分子として使用したラットカルモジュリンのアミノ酸配列を配列番号２に示す。配列番号２に記載のアミノ酸配列における１〜148番のアミノ酸は、本明細書に記載される「カルモジュリン蛋白質のｎ番目のアミノ酸」と対応する。尚、カルモジュリンはアミノ酸に翻訳された後、Ｎ末のメチオニンが翻訳後修飾を受けて切れてなくなるため、配列番号２ではＮ末のメチオニンの記載を省いた。
【００８６】
また、機能性分子として使用したミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質の一部のアミノ酸配列（Ｍ１３）を配列番号３に示す。このＭ１３断片をコードする遺伝子配列は、ニワトリのＭ１３断片をコードする遺伝子配列を改変したものである（Guerriero,V et al Biochemistry 25 8372-8381 (1986)）。
【００８７】
表１〜２において、種々のバイオセンサー蛋白質は、プローブ・ナンバーとして名称が付されている。例えば、プローブ・ナンバーＧ３（以下、Ｇ３ともいう）については、その構造を一次元的に図２に示す。Ｇ３は、Ｎ末端から順に
リンカーＸ（Met-Gly-Thr）；
ミオシン軽鎖キナーゼの一部（Ser-Ser-Arg-Arg-Lys-Trp-Asn-Lys-Thr-Gly-His-Ala-Val-Arg-Ala-Ile-Gly-Arg-Leu-Ser-Ser）；
リンカーＹ（Thr-Ser）；
改変ＧＦＰ｛Ｎ末端から順に、ＧＦＰの149〜238番目のアミノ酸配列、連結アミノ酸（Gly-Gly-Thr-Gly-Gly-Ser）、ＧＦＰの１〜144番目のアミノ酸配列｝；
リンカーＺ（Gly-Thr-Arg）；
ラットのカルモジュリンの２〜148番目のアミノ酸を有する。
【００８８】
表１〜２において、リンカーＸ、Ｙ、Ｚのアミノ酸配列は一文字表記で示す。また、Ｍ１３の「Ｏ」は、（Ser-Ser-Arg-Arg-Lys-Trp-Asn-Lys-Thr-Gly-His-Ala-Val-Arg-Ala-Ile-Gly-Arg-Leu-Ser-Ser）の配列を意味する。ｃｐＥＧＦＰの「149-144」は、改変ＧＦＰがＮ末端から順に、ＧＦＰの149〜238番目のアミノ酸配列、連結アミノ酸（Gly-Gly-Thr-Gly-Gly-Ser）、ＧＦＰの１〜144番目のアミノ酸配列を有することを意味する。ＣａＭの「Ｏ」は、ラットの本来のカルモジュリン２〜148番目のアミノ酸配列を意味し、「ＣＮ」は、カルモジュリンのミュータント ＣａＭＣＮの２〜148番目のアミノ酸配列（Persechini A et al 1997 Cell Calcium 22, 209-216）を意味する。蛍光の「＋」は、ＡＴＰ添加前に弱い蛍光を発しているものを意味し、「−」はＡＴＰ添加前に蛍光を発していないものを意味し、「＊」は、細胞内カルシウム濃度が２ｍＭ程度の高カルシウム状態で弱い蛍光を発するものを意味する。ＡＴＰ応答（ΔF/F）の値は、各バイオセンサー蛋白質を産生する細胞（HEK細胞）のＡＴＰ添加前と添加後の蛍光強度の変化量の値（ΔF）をＡＴＰ添加前の蛍光強度（F）で割った値（Arbitrary unit）である。「ｎｔ」は、not testedを意味する。また、光異性化（Photoisomerization）の「＋」は、バイオセンサー蛋白質が光異性化を起こすことを意味し、「−」は、光異性化を起こさないことを意味する。
【００８９】
表１〜２の結果より、ｃｐＥＧＦＰのＮ末を145〜155番目のアミノ酸の間で変化させ、Ｃ末を140〜147番目のアミノ酸の間で変化させてＡＴＰの反応を測定したところ、Ｎ末が149または150番目のアミノ酸で始まるものが反応性が高かった。Ｃ末は、140、144、147番目でＡＴＰ感受性のある分子を得た。
【００９０】
ここで、148番目のアミノ酸は、リンカーＹに含まれると考えてよい。即ち、改変ＧＦＰのＮ末が、本来のＧＦＰの149番目のアミノ酸から始まるとき、この改変ＧＦＰのＮ末に隣接するリンカーＹのアミノ酸を「ＧＦＰの148番目に相当するアミノ酸」と考えることができる。また同様に、改変ＧＦＰのＮ末が、本来のＧＦＰの150番目のアミノ酸から始まるとき、この改変ＧＦＰのＮ末に隣接するリンカーＹのアミノ酸からＮ末側に２個溯ったアミノ酸を「ＧＦＰの148番目に相当するアミノ酸」と想定することができる。
【００９１】
ＧＦＰの148番目のアミノ酸残基をホットスポットアミノ酸残基として採用したバイオセンサー蛋白質は、より好ましくは、
（１）下記（ａ）、（ｂ）のアミノ酸配列を、Ｎ末端から順に有する改変緑色蛍光蛋白質：
（ａ） 緑色蛍光蛋白質の149〜238番目のアミノ酸配列、
（ｂ） 緑色蛍光蛋白質の１〜144番目のアミノ酸配列、および
（２）自身の立体構造の変化を前記改変緑色蛍光蛋白質に伝えることにより、前記改変緑色蛍光蛋白質の立体構造を変化させ、蛍光特性を変化させるように機能する機能性分子
を含むことを特徴とする。
【００９２】
また、上述のより好ましいバイオセンサー蛋白質の、より具体的な例としては、下記（ａ）〜（ｈ）の配列を、Ｎ末端から順に有することを特徴とする：
（ａ） メチオニンを含むアミノ酸配列（リンカーＸ）；
（ｂ） ミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質もしくはその一部のアミノ酸配列；
（ｃ） 前述の（ｂ）の配列と後述の（ｄ）の配列とを連結するアミノ酸配列（リンカーＹ）；
（ｄ） 緑色蛍光蛋白質の149〜238番目のアミノ酸配列；
（ｅ） 前述の（ｄ）の配列と後述の（ｆ）の配列とを連結するアミノ酸配列；
（ｆ） 緑色蛍光蛋白質の１〜144番目のアミノ酸配列；
（ｇ） 前述の（ｆ）の配列と後述の（ｈ）の配列とを連結するアミノ酸配列（リンカーＺ）；および
（ｈ） カルモジュリン蛋白質もしくはその一部のアミノ酸配列。
【００９３】
ここで、（ａ）のリンカーＸは、メチオニンを含む任意のアミノ酸配列であるが、好ましくは１〜１０個のアミノ酸であり、より好ましくはMet-Xaa-Xaa（Xaaは任意のアミノ酸）であり、更に好ましくはMet-Gly-Thr、Met-Val-Aspである。（ｃ）のリンカーＹは、任意のアミノ酸配列であるが、好ましくは０〜１０個のアミノ酸であり、より好ましくは２個のアミノ酸で、「ＧＦＰの147番目に相当するアミノ酸」がLeu、Thr、またはGlyで、「ＧＦＰの148番目に相当するアミノ酸」が、酸性側鎖または水酸基をその一部に含む側鎖を持つアミノ酸であり、更に好ましくはLeu-Gluである。（ｅ）の連結アミノ酸は、好ましくは、２〜１０個のアミノ酸であり、より好ましくは、グリシン等のペプチドの主鎖の動きに大きな自由度を与え、主鎖をフレキシブルにするようなアミノ酸を多く含むアミノ酸配列であり、更に好ましくはGly-Gly-Thr-Gly-Gly-Serである。（ｇ）のリンカーＺは、任意のアミノ酸配列であるが、好ましくは０〜１０個のアミノ酸であり、より好ましくは２〜３個のアミノ酸であり、更に好ましくはThr-Argである。
【００９４】
上述のより好ましいバイオセンサー蛋白質の種々の例を下記表３〜４に列挙する。機能性分子としてはミオシン軽鎖キナーゼ（Ｍ１３）およびカルモジュリン（ＣａＭ）を使用した。
【００９５】
【表３】
【表４】
表３〜４に記載のバイオセンサー蛋白質は、Ｎ末端から順に
メチオニンを含むアミノ酸配列（リンカーＸ）；
ミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質の一部のアミノ酸配列（Ｍ１３）；
種々の連結アミノ酸配列（リンカーＹ）；
改変ＧＦＰ（ｃｐＥＧＦＰ）；
連結アミノ酸配列（リンカーＺ）；
カルモジュリン蛋白質の２〜148番目のアミノ酸配列（ＣａＭ）を有する。
【００９８】
表３〜４において、種々のバイオセンサー蛋白質は、プローブ・ナンバーとして名称が付されている。例えば、プローブ・ナンバーＧ８５（以下、Ｇ８５ともいう）については、その構造を一次元的に図２に示す。Ｇ８５は、Ｎ末端から順に
リンカーＸ（Met-Val-Asp）；
ミオシン軽鎖キナーゼの一部（Ser-Ser-Arg-Arg-Lys-Trp-Asn-Lys-Thr-Gly-His-Ala-Val-Arg-Ala-Ile-Gly-Arg-Leu-Ser-Ser）；
リンカーＹ（Leu-Glu）；
改変ＧＦＰ｛Ｎ末端から順に、ＧＦＰの149〜238番目のアミノ酸配列、連結アミノ酸（Gly-Gly-Thr-Gly-Gly-Ser）、ＧＦＰの１〜144番目のアミノ酸配列｝；
リンカーＺ（Thr-Arg）；
ラットのカルモジュリンの２〜148番目のアミノ酸を有する。
【００９９】
表３〜４において、リンカーＸ、Ｙ、Ｚのアミノ酸配列は一文字表記で示す。また、Ｍ１３の「Ｏ」は、（Ser-Ser-Arg-Arg-Lys-Trp-Asn-Lys-Thr-Gly-His-Ala-Val-Arg-Ala-Ile-Gly-Arg-Leu-Ser-Ser）の配列を意味する。ｃｐＥＧＦＰの「149-144」は、改変ＧＦＰがＮ末端から順に、ＧＦＰの149〜238番目のアミノ酸配列、連結アミノ酸（Gly-Gly-Thr-Gly-Gly-Ser）、ＧＦＰの１〜144番目のアミノ酸配列を有することを意味する。ＣａＭの「Ｏ」は、ラットの本来のカルモジュリン２〜148番目のアミノ酸配列を意味する。ＡＴＰ応答（ΔF/F）の値は、各バイオセンサー蛋白質を産生する細胞（HEK細胞）のＡＴＰ添加前と添加後の蛍光強度の変化量の値（ΔF）をＡＴＰ添加前の蛍光強度（F）で割った値（Arbitrary unit）である。「ｎ」は、試験した細胞の数を意味する。また、光異性化（Photoisomerization）の「＋」は、バイオセンサー蛋白質が光異性化を起こすことを意味し、「−」は、光異性化を起こさないことを意味する。
【０１００】
表３〜４では、主にリンカーＸ、Ｙ、Ｚのアミノ酸を変化させて、そのＡＴＰに対する反応性を調べた。カルモジュリン断片（２〜148番目）を用いて、リンカーＹの配列がLeu-Gluであるものが最も反応性が良かった。リンカーＺの配列は、Gly-Thr-ArgでもThr-ArgでもＡＴＰに対する反応性に変化はなかった。リンカーＸの配列はMet-Gly-ThrでもMet-Val-AspでもＡＴＰに対する反応性に変化はなかった。また、Ｇ２２に関してはＧ３のｃｐＥＧＦＰ（149-144）より一つアミノ酸が少なくなっているが、反応性に大きな変化はなかった。
【０１０１】
表３〜４に示すとおり、改変ＧＦＰのＮ末端が本来のＧＦＰの149番目のアミノ酸から始まり、リンカーＹに「ＧＦＰの148番目に相当するアミノ酸」としてグルタミン酸（Glu）をもつもの（プローブ・ナンバーＧ１８、Ｇ７２、Ｇ８５）が最も良好な反応性を示し、ＡＴＰに対する蛍光の変化量ΔＦ/Ｆについて１.５〜１.６の値を示した。また、改変ＧＦＰのＮ末端が本来のＧＦＰの150番目のアミノ酸から始まり、リンカーＹに「ＧＦＰの148番目に相当するアミノ酸」としてトレオニン（Thr）をもつもの（Ｇ２２）も反応性（ΔＦ/Ｆ＝０.６）はやや劣るものの充分なカルシウム感受性を有することが明らかとなった。
【０１０２】
更に表３〜４の結果から、148番目に対応するアミノ酸がその側鎖に水酸基を有していると、そのバイオセンサー蛋白質は光異性化を起こすことが判る。このことからも、リンカーＹの二つのアミノ酸のうち、改変ＧＦＰに隣接するアミノ酸が、ＧＦＰの蛍光強度に強く関係していることが明らかである。
【０１０３】
あるいは、上述の表１〜表４に記載のバイオセンサー蛋白質とは別に、ＧＦＰの148番目のアミノ酸残基をホットスポットアミノ酸残基としてその近傍で切断し、その切断された間に機能性分子を連結させたバイオセンサー蛋白質の例を表５に挙げる。
【０１０４】
【表５】
表５に記載のバイオセンサー蛋白質は、Ｎ末端から順に
緑色蛍光蛋白質の１〜144番目のアミノ酸配列；
リンカーＡ；
ミオシン軽鎖キナーゼの一部のアミノ酸配列（Ｍ１３）；
リンカーＢ；
ラットのカルモジュリンの２〜148番目のアミノ酸配列（ＣａＭ）；
リンカーＣ；
ＧＦＰの149〜238番目のアミノ酸配列を有する。
【０１０６】
表５において、リンカーＡ、Ｂ、Ｃのアミノ酸配列は一文字表記で示す。また、Ｍ１３の「Ｏ」は、（Ser-Ser-Arg-Arg-Lys-Trp-Asn-Lys-Thr-Gly-His-Ala-Val-Arg-Ala-Ile-Gly-Arg-Leu-Ser-Ser）の配列を意味する。ＣａＭの「Ｏ」は、ラットの本来のカルモジュリン２〜148番目のアミノ酸配列を意味する。蛍光の「＋」は、ＡＴＰ添加前に弱い蛍光を発していることを意味する。ＡＴＰ応答（ΔF/F）の値は、各バイオセンサー蛋白質を産生する細胞（HEK細胞）のＡＴＰ添加前と添加後の蛍光強度の変化量の値（ΔF）をＡＴＰ添加前の蛍光強度（F）で割った値（Arbitrary unit）である。ＡＴＰ応答における＊は、ＡＴＰの代わりにカルバコールを用いたときの応答を意味する。また、光異性化（Photoisomerization）の「＋」は、バイオセンサー蛋白質が光異性化を起こすことを意味する。
【０１０７】
表５は、ＧＦＰ本来のＮ末およびＣ末をもつバイオセンサーのグループのＡＴＰに対する反応性を示しており、このグループはＡＴＰに対して弱いながら反応した。リンカーＢの長さを長くしたＡ２の方が反応性は良かった。このタイプはリンカーＡ、Ｂ、Ｃを検討することにより、より高い反応性の分子を作ることができると考えている。
【０１０８】
以上、表１〜表５に示す結果から、ＧＦＰには蛍光強度に強い影響を与えるホットスポットアミノ酸残基（ＧＦＰの148番目のアミノ酸残基）が存在することが明らかとなり、このアミノ酸残基を介してＧＦＰの蛍光強度を効率的に制御することが可能となった。同様に、148番目のアミノ酸残基以外に、94、96、222番目のアミノ酸残基でもＧＦＰの蛍光強度を制御できるバイオセンサーが作成され得ることが、ＧＦＰの結晶構造から推察される。
【０１０９】
本発明のバイオセンサー蛋白質は、上述のとおり、機能性分子としてカルモジュリン蛋白質（もしくはその一部）およびミオシン軽鎖キナーゼ（もしくはその一部）を使用したものが挙げられるが、これに限定されない。即ち、本発明のバイオセンサー蛋白質は、上述のカルシウムセンサーとして機能し得るものに限定されない。
【０１１０】
本発明のカルシウムセンサー蛋白質の特に好ましい例としては、下記（ａ）〜（ｈ）の配列を、Ｎ末端から順に有することを特徴とする：
（ａ） Met-Gly-ThrまたはMet-Val-Asp（リンカーＸ）；
（ｂ） ミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質の一部のアミノ酸配列（Ser-Ser-Arg-Arg-Lys-Trp-Asp-Lys-Thr-Gly-His-Ala-Val-Arg-Ala-Ile-Gly-Arg-Leu-Ser-Ser）；
（ｃ） Leu-Glu（リンカーＹ）；
（ｄ） 緑色蛍光蛋白質の149〜238番目のアミノ酸配列；
（ｅ） Gly-Gly-Thr-Gly-Gly-Ser；
（ｆ） 緑色蛍光蛋白質の１〜144番目のアミノ酸配列；
（ｇ） Gly-Thr-ArgまたはThr-Arg（リンカーＺ）；および
（ｈ） ラットのカルモジュリン蛋白質の２〜148番目のアミノ酸配列。
【０１１１】
本発明において作成されたカルシウムセンサーは、細胞内および細胞外でカルシウム濃度を測定する際に使用することができる。
【０１１２】
例えば、本発明のカルシウムセンサー遺伝子を大腸菌などに導入して予めつくらせたカルシウムセンサー蛋白質と検体とを混合することによりカルシウム濃度を測定することが可能である。また、大腸菌などを使用してつくらせた蛋白質を、カルシウム濃度を測定したい細胞に直接注入することにより細胞内のカルシウム濃度を測定することもできる。あるいは、本発明のカルシウムセンサー遺伝子を、カルシウム濃度を測定したい細胞に導入して細胞に蛋白質を産生させることにより、細胞内のカルシウム濃度を測定してもよい。
【０１１３】
カルシウム濃度の測定は、ある特定の波長の光（例えば、488 nmの励起光）をカルシウムセンサー蛋白質に当てることにより、センサー蛋白質の発する蛍光特性を光学機器（例えば、レーザー顕微鏡）で検出することにより行う。なお、濃度測定に使用するカルシウムセンサー蛋白質が、どのくらいのカルシウム濃度でどのような蛍光特性を示すものであるか、予め調べておくことが必要である。具体的には、例えば、大腸菌でセンサー蛋白質分子を大量に作らせて、蛍光分光光度計を用いて蛍光波長や種々のカルシウム濃度に対して蛍光強度が変化する程度を測定しておくことが必要である（図５）。本発明のバイオセンサー蛋白質は、ＥＧＦＰ（クローンテック社）とほぼ同様な蛍光波長特性を持ち、励起極大は489ｎｍであり、蛍光極大は509ｎｍであった。
【０１１４】
また、本発明においてバイオセンサー遺伝子は、本発明のバイオセンサー蛋白質をコードする遺伝子のことをいう。このようなバイオセンサー遺伝子は、まず、作成したいバイオセンサー蛋白質を構成する各構成部分（例えば、改変ＧＦＰの部分、機能性分子の部分）をコードする遺伝子断片をそれぞれＰＣＲにより作成し、次いで、これら各遺伝子断片を連結させることにより、融合遺伝子の形で作成され得る。このようにして作成されたバイオセンサー遺伝子を適切なベクター（例えば、pEGFP-N1（クローンテック社））に組込み、この組換えベクターを細胞に導入することにより、任意の細胞で所望のバイオセンサー蛋白質を産生させることが可能となる。
【０１１５】
［本発明のバイオセンサー蛋白質の性能の確認］
本発明のバイオセンサー蛋白質は、そのセンサーとしての性能を実験的に確認しておくことが必要である。
【０１１６】
本発明において実際に開発したカルシウムセンサーは、培養細胞human embrionic kidney（HEK）293 cellおよびマウスの骨格筋初代培養細胞にその遺伝子を取り込ませて性能の評価を行った。
【０１１７】
プローブ・ナンバーＧ８５のカルシウムセンサーをHEK 293細胞中で当該遺伝子（その配列を配列番号４に示す）を用いて発現させ、次いで細胞のカルシウムイオン濃度を増大させることが既知の因子として、ＡＴＰ（0.1ｍＭ）およびカルバコール（ＣＣＨ）（0.1ｍＭ）を作用させた。そのときの反応例を図３に示す。
【０１１８】
HEK 293細胞でのＡＴＰに対する蛍光の変化量は、元の蛍光強度の約１.６倍に達し、蛍光顕微鏡下で肉眼でもこれらの変化を捉えることが可能であった。カルバコールに対する蛍光の変化量は、元の蛍光強度の約２.２倍に達した。また、イオノマイシン（0.01ｍＭ）とカルシウムイオン（２ｍＭ）の添加により細胞内を高カルシウムの状態にすると、カルシウムセンサーの蛍光強度は最大に達することが確認された。一方、カルシウムイオンを添加せず、イオノマイシン（0.01ｍＭ）とＥＤＴＡ（10 ｍＭ）を添加することにより細胞内のカルシウム濃度をゼロに近づけると、センサーの蛍光強度は最小になることが確認された。
【０１１９】
また、同様にしてカルシウムセンサー（Ｇ８５）を発現している骨格筋初代培養細胞に、細胞のカルシウムイオン濃度を増大させることが既知の因子、カルバコール（0.1ｍＭ）およびカフェイン（10 ｍＭ）を作用させた。そのときの反応例を図４に示す。図３の結果と同様、カルバコールに対する蛍光の変化量は、元の蛍光強度の約２.５倍に達し、カフェインに対する蛍光の変化量は約１.１倍に達した。
【０１２０】
更に図５において、カルシウム濃度とカルシウムセンサー（Ｇ８５）の蛍光量との関係をグラフ化した。なお、Ｇ８５は大腸菌を用いてつくらせたものである。図５に示すように、本発明のカルシウムセンサー蛋白質は、非常に高いカルシウム感受性を有していた。この感受性の高さは、従来技術の欄で挙げた一つのＧＦＰから成るカルシウム感受性蛋白質よりも約３０倍高いカルシウム感受性であった。
【０１２１】
このように本発明のカルシウムセンサーは、センサーとしての性能の高さが証明されている。
【０１２２】
【実施例】
カルシウムセンサーの製法および測定法
例としてプローブ・ナンバーＧ３をコードしているpN1-G３の作成について：
１．[平滑筋ミオシン軽鎖キナーゼM13]
平滑筋ミオシン軽鎖キナーゼのM13（配列番号３）を、片山化学にて合成した下記の合成プライマーから作製する。即ち、平滑筋ミオシン軽鎖キナーゼのM13に対する２つのプライマー
smMLCKM13-1プライマー
（GCGCTAGCCGCCACCATGGGTACCTCATCACGTCGTAAGTGGAATAAGACAGGTCACGCAGTCAGA；配列番号５）と
smMLCKM13-2プライマー
（GGCGCGGCCGCTCAACTAGTTGAGCTCAGCCGACCTATAGCTCTGACTGCGTGACCTGTCTT；配列番号６）
をテンプレート兼プライマーとしてPolymerase chain reaction（PCR）を行う。アガロースゲル電気泳動を行い、目的のPCR産物をゲルから回収したのちNheIとSpeIで制限酵素処理しPCRフラグメント１を得る。
【０１２３】
２．[改変ＧＦＰ（circularly permutated enhanced GFP；ｃｐＥＧＦＰ）]
GFPをコードするcDNAを含んでいるプラスミドpEGFP-N1(Clontech社から発売されている)をテンプレートとして
EGFP-31プライマー（GGACGCGTACTAGTAACGTCTATATCATGGCCGAC；配列番号７）と
EGFP-20プライマー（CCGGTACCGCCCTTGTACAGCTCGTCCATGCC；配列番号８）
を使用してPCRを行う。アガロースゲル電気泳動を行い、目的のPCR産物をゲルから回収したのちSpeIとKpnIで制限酵素処理しPCRフラグメント２を得る。
【０１２４】
同じくpEGFP-N1をテンプレートとして
EGFP-21プライマー（GCGGTACCGGAGGGAGCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG；配列番号９）と
EGFP-30プライマー（GGACGCGTCCCGTTGTACTCCAGCTTGTGCCC；配列番号１０）
を使用してPCRを行う。アガロースゲル電気泳動を行い、目的のPCR産物をゲルから回収したのちKpnIとMluIで制限酵素処理しPCRフラグメント３を得る。
【０１２５】
３．[カルモジュリン(CaM)]
ラットのカルモジュリンcDNA（配列番号２；アクセション番号 M19312（Mori M 2000 Biochemistry 39, 1316-1323））をコードするプラスミドrCaMをテンプレートとして、ラットのカルモジュリンに対するプライマー
rCaM-2プライマー（GGACGCGT GAC CAA CTG ACT GAA GAG CAG；配列番号１１）と
rCaM-10プライマー（GCGCGGCCGCTCACTTCGCTGTCATCATTTGTAC；配列番号１２）
を用いてPCRを行う。アガロースゲル電気泳動を行い、目的のPCR産物をゲルから回収したのちMluIとNotIで制限酵素処理しPCRフラグメント4を得る。
【０１２６】
以上４つのPCRフラグメントを段階的にDNA ligaseで結合し最終的にNheIとNotIで制限酵素処理したpEGFP-N1 vectorに組み込んだ。
【０１２７】
各実験でプライマーは合成プライマーを使用した（サワディー社および片山化学）。
【０１２８】
上記のPCRの条件は
テンプレートDNA１μｇ
２種類のプライマー各10ピコモル
反応バファー（stratagene社）５マイクロリッター
pfu酵素（stratagene社）2ユニット
2.5mM dNTP（Takara社）4マイクロリッター
水をを加え、全量を50マイクロリッターとした。
【０１２９】
PCRの反応温度は
DNAのゲルからの回収はDNA Fragment Purification kit MagExtractor（Toyobo社）を用い、キットのマニュアルにしたがって行った。
【０１３１】
アガロースゲル電気泳動は１％または２％アガロースゲル（Agarose LE, Nakarai tesque社）を用い、TAEバッファー（1リットル中Tris base 4.98g (Nakarai tesque社), 氷酢酸1.142 ml (Nakarai tesque社), 0.5M EDTA (pH 8) 2ml（EDTA:Ethyle-nediamine-N,N,N'N' tetraacetic acid disodium salt, Dojin社））にて電気泳動した。
【０１３２】
制限酵素によるDNAの切断はNheI, SpeI, MluI, NotI(NEB社)を用い酵素に添付されたバッファーを使用して、DNA１〜２マイクログラムに酵素各３０ユニット、バッファー１０マイクロリッター、水を加え全量を１００マイクロリッターとし、３７度で１〜３時間反応させた。DNAはその後DNA Fragment Purification kit MagExtractor（Toyobo社）を用いキットのマニュアルにしたがって回収した。
【０１３３】
Ligation反応にはDNA Ligation kit(Takara社)を用いキットのマニュアルにしたがって行った。
【０１３４】
コンピーテントセルは大腸菌HB101（Takara社）を用いtransformationにはカルシウムクロライド法を用いた（Molecular Cloning A laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis著, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）。
【０１３５】
大腸菌からのプラスミドの回収はQIAprep Spin Miniprep kit(Qiagen社)を用いキットのマニュアルにしたがって行った。
【０１３６】
細胞への導入：
cDNA（即ち、上述の大腸菌から回収されたプラスミド）は、Superfect transfection reagent(Qiagen社)を用いてマニュアルにしたがって５x１０mmのサイズのカバーガラスの上に10% 牛胎児血清, 30 units/ml ペニシリンと30 mg/ml ストレプトマイシンを含むDulbecco's modified Eagle培地（Gibuco BRL社）で培養したhuman embrionic kidney(HEK) 293 細胞 (American Type Culture Collection)に導入した。
【０１３７】
導入方法の詳細は以下に記載のとおりである。まず、３マイクログラムの上記cDNA（３マイクロリッター）に12.5マイクロリッターのSuperfect transfection reagentと血清を含まないDulbecco's modified Eagle培地８０マイクロリッターを加え１０分間室温に放置したのちに血清を含むDulbecco's modified Eagle培地を８００マイクロリッター加えた溶液を、リン酸緩衝液で１度洗浄したHEK細胞に加え、３７度で２時間培養した。培養したHEK細胞をリン酸緩衝液で１度洗浄して、10%牛胎児血清を含むDulbecco's modified Eagle培地を適量（３ｃｍディッシュ当たり２ミリリッター）加えて２８度で２〜４日培養し、実験に用いた。
【０１３８】
測定：
培養細胞の付着したカバーガラスを顕微鏡のステージの上においたチャンバーに入れ、HBS液（107 mM NaCl, 6 mM KCl, 1.2 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 1.2 mM KH2PO4, 11.5 mM glucose, 20 mM HEPES pH 7.4（Nakarai tesque, 片山化学、HEPES: 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid, Dojinから購入））で灌流した。１００マイクロモラーのアデノシン三リン酸（ATP、Sigma社）または１００マイクロモラーのカルバコール（Sigma社）はHBSに溶かし細胞に灌流投与した。ライカTCS-NTレーザー顕微鏡を用い488nmで励起し525nmで蛍光を記録した。
【０１３９】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明のバイオセンサー蛋白質を作成する方法は、多種多様なバイオセンサーの開発に応用できるものである。また、本発明のバイオセンサー蛋白質の作成方法により、高性能なバイオセンサーを短期間に作成できるようになることが期待される。
【０１４０】
本方法を利用することにより作成されたカルシウムセンサーの信号強度の変化量は大きく肉眼でも観察でき、カルシウム感受性も従来のものに比べ３０倍と高くなった。また、蛋白質性のセンサーであるので、その遺伝子を取り込ませることにより容易に細胞にセンサーを発現させることができる。また、測定に特別な装置および物質を必要とせず、アルゴンレーザーを用いた検出器が利用可能であり、補酵素を必要としないという利点も有する。
【０１４１】
更に今回開発したカルシウムセンサーは、当該蛋白質そのものを用いてカルシウム濃度を測定する機器に組み込むことができる。さらにこの蛋白質の遺伝子を組み込んだ動物、植物、組織、臓器、細胞等は、医薬品の開発および農業製品の開発に利用することができる。
【０１４２】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＧＦＰ、改変ＧＦＰ、および改変ＧＦＰを用いたカルシウムセンサー蛋白質の構造を模式的に示す図。
【図２】 カルシウムセンサー蛋白質（Ｇ３およびＧ８５）の一次構造を示す図。
【図３】 ＡＴＰおよびカルバコールに対して、HEK293細胞に発現したカルシウムセンサー蛋白質の蛍光量が変化する様子を示す図。
【図４】 カルバコールおよびカフェインに対して、骨格筋細胞に発現したカルシウムセンサー蛋白質の蛍光量が変化する様子を示す図。
【図５】 カルシウム濃度と蛍光量との関係を示すグラフ図。
Claims (23)
- 緑色蛍光蛋白質の構造を改変することにより、緑色蛍光蛋白質の蛍光特性を制御することが可能なバイオセンサー蛋白質を作成する方法であって、
（Ａ）緑色蛍光蛋白質をそのＸ番目のホットスポットアミノ酸残基（ここでＸは、９４、９６、１４８、または２２２である）の（Ｘ−２）〜（Ｘ＋２）の範囲内で切断し、切断部位のアミノ酸残基を１〜１０個除去することにより、緑色蛍光蛋白質の構造を改変する工程と；
（Ｂ）前記工程により改変された種々の改変緑色蛍光蛋白質と、
自身の立体構造の変化を前記改変緑色蛍光蛋白質に伝えることにより、前記改変緑色蛍光蛋白質の立体構造を変化させ、蛍光特性を変化させるように機能する機能性蛋白質である、ｉ）カルモジュリン蛋白質、そのＣａ 2+ イオン結合部位およびミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質結合部位の両方を維持するように改変されたカルモジュリン蛋白質ミュータント、またはカルモジュリン蛋白質の部分アミノ酸配列から成りＣａ 2+ イオン結合部位およびミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質結合部位の両方を含むポリペプチド、並びに ii ）ミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質、またはミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質の部分アミノ酸配列から成りカルモジュリン結合部位を含むポリペプチドのそれぞれと
が連結された種々の融合蛋白質を作成する工程と；
（Ｃ）前記種々の融合蛋白質に、前記機能性蛋白質の立体構造に影響を及ぼす因子を作用させる工程と；
（Ｄ）前記種々の融合蛋白質のなかから、前記（Ｃ）工程により蛍光特性に変化が現れる融合蛋白質をバイオセンサー蛋白質として選択する工程と
を具備することを特徴とする方法。 - 請求項１に記載の方法であって、前記機能性蛋白質が、
ｉ）配列番号２に記載のカルモジュリン蛋白質の２〜 148 番目のアミノ酸配列から成る蛋白質、またはカルモジュリン蛋白質ミュータントＣａＭＣＮの２〜 148 番目のアミノ酸配列から成る蛋白質；および
ii ）ミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質の部分アミノ酸配列である、配列番号３に記載のＭ１３断片
であることを特徴とする方法。 - 緑色蛍光蛋白質の構造を改変することにより、緑色蛍光蛋白質の蛍光特性を制御することが可能なバイオセンサー蛋白質を作成する方法であって、
（Ａ）緑色蛍光蛋白質をそのＸ番目のアミノ酸残基（ここでＸは148〜150の任意の値である）と（Ｘ−１）番目のアミノ酸残基との間で切断し、（Ｘ−１）番目から（Ｘ−ａ）番目までのアミノ酸残基（ここでａは１〜７の任意の値である）を除去することにより、緑色蛍光蛋白質の構造を改変する工程と；
（Ｂ）前記工程により改変された種々の改変緑色蛍光蛋白質と、
自身の立体構造の変化を前記改変緑色蛍光蛋白質に伝えることにより、前記改変緑色蛍光蛋白質の立体構造を変化させ、蛍光特性を変化させるように機能する機能性蛋白質である、ｉ）カルモジュリン蛋白質、そのＣａ 2+ イオン結合部位およびミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質結合部位の両方を維持するように改変されたカルモジュリン蛋白質ミュータント、またはカルモジュリン蛋白質の部分アミノ酸配列から成りＣａ 2+ イオン結合部位およびミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質結合部位の両方を含むポリペプチド、並びに ii ）ミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質、またはミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質の部分アミノ酸配列から成りカルモジュリン結合部位を含むポリペプチドのそれぞれと
が連結された種々の融合蛋白質を作成する工程と；
（Ｃ）前記種々の融合蛋白質に、前記機能性蛋白質の立体構造に影響を及ぼす因子を作用させる工程と；
（Ｄ）前記種々の融合蛋白質のなかから、前記（Ｃ）工程により蛍光特性に変化が現れる融合蛋白質をバイオセンサー蛋白質として選択する工程と
を具備することを特徴とする方法。 - 請求項３に記載の方法であって、前記機能性蛋白質が、
ｉ）配列番号２に記載のカルモジュリン蛋白質の２〜 148 番目のアミノ酸配列から成る蛋白質、またはカルモジュリン蛋白質ミュータントＣａＭＣＮの２〜 148 番目のアミノ酸配列から成る蛋白質；および
ii ）ミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質の部分アミノ酸配列である、配列番号３に記載のＭ１３断片
であることを特徴とする方法。 - 請求項３に記載の方法であって、前記（Ａ）の工程が、緑色蛍光蛋白質を149番目のアミノ酸残基と148番目のアミノ酸残基との間で切断し、148番目から145番目までのアミノ酸残基を除去し、緑色蛍光蛋白質の本来のＮ末端である１番目のアミノ酸残基と本来のＣ末端である238番目のアミノ酸残基とを連結することにより、緑色蛍光蛋白質の構造を改変する工程であることを特徴とする方法。
- 請求項５に記載の方法であって、前記機能性蛋白質が、
ｉ）配列番号２に記載のカルモジュリン蛋白質の２〜 148 番目のアミノ酸配列から成る蛋白質、またはカルモジュリン蛋白質ミュータントＣａＭＣＮの２〜 148 番目のアミノ酸配列から成る蛋白質；および
ii ）ミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質の部分アミノ酸配列である、配列番号３に記載のＭ１３断片
であることを特徴とする方法。 - 請求項１〜６の何れか１項に記載の方法であって、前記蛍光特性が蛍光強度であることを特徴とする方法。
- （１）下記（ａ）、（ｂ）のアミノ酸配列を、Ｎ末端から順に有する改変緑色蛍光蛋白質：
（ａ） 緑色蛍光蛋白質のＸ〜238番目のアミノ酸配列、
（ｂ） 緑色蛍光蛋白質の１〜Ｙ番目のアミノ酸配列、
（ここで、Ｘは148〜150の任意の位置であり、Ｙは140〜147の任意の位置である）、および
（２）自身の立体構造の変化を前記改変緑色蛍光蛋白質に伝えることにより、前記改変緑色蛍光蛋白質の立体構造を変化させ、蛍光特性を変化させるように機能する機能性蛋白質である、ｉ）カルモジュリン蛋白質、そのＣａ 2+ イオン結合部位およびミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質結合部位の両方を維持するように改変されたカルモジュリン蛋白質ミュータント、またはカルモジュリン蛋白質の部分アミノ酸配列から成りＣａ 2+ イオン結合部位およびミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質結合部位の両方を含むポリペプチド、並びに ii ）ミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質、またはミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質の部分アミノ酸配列から成りカルモジュリン結合部位を含むポリペプチドのそれぞれと
を含むことを特徴とするバイオセンサー蛋白質。 - 請求項８に記載のバイオセンサー蛋白質であって、前記機能性蛋白質が、
ｉ）配列番号２に記載のカルモジュリン蛋白質の２〜 148 番目のアミノ酸配列から成る蛋白質、またはカルモジュリン蛋白質ミュータントＣａＭＣＮの２〜 148 番目のアミノ酸配列から成る蛋白質；および
ii ）ミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質の部分アミノ酸配列である、配列番号３に記載のＭ１３断片
であることを特徴とするバイオセンサー蛋白質。 - 下記（ａ）〜（ｈ）の配列を、Ｎ末端から順に有することを特徴とするバイオセンサー蛋白質：
（ａ）３つのアミノ酸からなる配列Xaa1-Xaa2-Xaa3（ここでXaa1はメチオニンであり、Xaa2およびXaa3はそれぞれ独立して任意のアミノ酸である）（リンカーＸ）；
（ｂ）ミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質、またはカルモジュリン結合部位を含むその部分アミノ酸配列；
（ｃ）前述の（ｂ）の配列と後述の（ｄ）の配列とを連結する、２つのアミノ酸からなる配列Xaa4-Xaa5（ここでXaa4はロイシン、トレオニンおよびグリシンからなる群から選択される何れか一のアミノ酸であり、Xaa5は任意のアミノ酸である）（リンカーＹ）；
（ｄ）緑色蛍光蛋白質のＸ〜238番目のアミノ酸配列（ここで、Ｘは148〜150の任意の位置である）；
（ｅ）前述の（ｄ）の配列と後述の（ｆ）の配列とを連結する、６つのアミノ酸からなる配列Gly-Gly-Xaa6-Gly-Gly-Xaa7（ここでXaa6およびXaa7はそれぞれ独立して任意のアミノ酸である）；
（ｆ）緑色蛍光蛋白質の１〜Ｙ番目のアミノ酸配列（ここで、Ｙは140〜147の任意の位置である）；
（ｇ）前述の（ｆ）の配列と後述の（ｈ）の配列とを連結するアミノ酸配列Gly-Thr-ArgまたはThr-Arg（リンカーＺ）；
（ｈ）カルモジュリン蛋白質、そのＣａ 2+ イオン結合部位およびミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質結合部位の両方を維持するように改変されたカルモジュリン蛋白質ミュータント、またはＣａ 2+ イオン結合部位およびミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質結合部位の両方を含むその部分アミノ酸配列。 - 請求項１０に記載のバイオセンサー蛋白質であって、前記（ｅ）に記載の６つのアミノ酸からなる配列Gly-Gly-Xaa6-Gly-Gly-Xaa7が、Gly-Gly-Thr-Gly-Gly-Serであることを特徴とするバイオセンサー蛋白質。
- 請求項１０または１１に記載のバイオセンサー蛋白質であって、前記（ａ）に記載の３つのアミノ酸からなる配列Xaa1-Xaa2-Xaa3が、Met-Gly-ThrまたはMet-Val-Aspであることを特徴とするバイオセンサー蛋白質。
- （１）下記（ａ）、（ｂ）のアミノ酸配列を、Ｎ末端から順に有する改変緑色蛍光蛋白質：
（ａ） 緑色蛍光蛋白質の149〜238番目のアミノ酸配列、
（ｂ） 緑色蛍光蛋白質の１〜144番目のアミノ酸配列、および
（２）自身の立体構造の変化を前記改変緑色蛍光蛋白質に伝えることにより、前記改変緑色蛍光蛋白質の立体構造を変化させ、蛍光特性を変化させるように機能する機能性蛋白質である、ｉ）カルモジュリン蛋白質、そのＣａ 2+ イオン結合部位およびミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質結合部位の両方を維持するように改変されたカルモジュリン蛋白質ミュータント、またはカルモジュリン蛋白質の部分アミノ酸配列から成りＣａ 2+ イオン結合部位およびミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質結合部位の両方を含むポリペプチド、並びに ii ）ミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質、またはミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質の部分アミノ酸配列から成りカルモジュリン結合部位を含むポリペプチド
を含むことを特徴とするバイオセンサー蛋白質。 - 請求項１３に記載のバイオセンサー蛋白質であって、前記機能性蛋白質が、
ｉ）配列番号２に記載のカルモジュリン蛋白質の２〜 148 番目のアミノ酸配列から成る蛋白質、またはカルモジュリン蛋白質ミュータントＣａＭＣＮの２〜 148 番目のアミノ酸配列から成る蛋白質；および
ii ）ミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質の部分アミノ酸配列である、配列番号３に記載のＭ１３断片
であることを特徴とするバイオセンサー蛋白質。 - 下記（ａ）〜（ｈ）の配列を、Ｎ末端から順に有することを特徴とするバイオセンサー蛋白質：
（ａ） ３つのアミノ酸からなる配列Xaa1-Xaa2-Xaa3（ここでXaa1はメチオニンであり、Xaa2およびXaa3はそれぞれ独立して任意のアミノ酸である）（リンカーＸ）；
（ｂ） ミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質、またはカルモジュリン結合部位を含むその部分アミノ酸配列；
（ｃ） 前述の（ｂ）の配列と後述の（ｄ）の配列とを連結する、２つのアミノ酸からなる配列Xaa4-Xaa5（ここでXaa4はロイシン、トレオニンおよびグリシンからなる群から選択される何れか一のアミノ酸であり、Xaa5は任意のアミノ酸である）（リンカーＹ）；
（ｄ） 緑色蛍光蛋白質の149〜238番目のアミノ酸配列；
（ｅ） 前述の（ｄ）の配列と後述の（ｆ）の配列とを連結する、６つのアミノ酸からなる配列Gly-Gly-Xaa6-Gly-Gly-Xaa7（ここでXaa6およびXaa7はそれぞれ独立して任意のアミノ酸である）；
（ｆ） 緑色蛍光蛋白質の１〜144番目のアミノ酸配列；
（ｇ） 前述の（ｆ）の配列と後述の（ｈ）の配列とを連結するアミノ酸配列Gly-Thr-ArgまたはThr-Arg；および
（ｈ） カルモジュリン蛋白質、そのＣａ 2+ イオン結合部位およびミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質結合部位の両方を維持するように改変されたカルモジュリン蛋白質ミュータント、またはＣａ 2+ イオン結合部位およびミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質結合部位の両方を含むその部分アミノ酸配列。 - 請求項１５に記載のバイオセンサー蛋白質であって、前記（ｅ）に記載の６つのアミノ酸からなる配列Gly-Gly-Xaa6-Gly-Gly-Xaa7が、Gly-Gly-Thr-Gly-Gly-Serであることを特徴とするバイオセンサー蛋白質。
- 請求項１５または１６に記載のバイオセンサー蛋白質であって、前記（ａ）に記載の３つのアミノ酸からなる配列Xaa1-Xaa2-Xaa3が、Met-Gly-ThrまたはMet-Val-Aspであることを特徴とするバイオセンサー蛋白質。
- 下記（ａ）〜（ｈ）の配列を、Ｎ末端から順に有することを特徴とするバイオセンサー蛋白質：
（ａ） Met-Gly-ThrまたはMet-Val-Asp（リンカーＸ）；
（ｂ） ミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質の一部のアミノ酸配列（Ser-Ser-Arg-Arg-Lys-Trp-Asn-Lys-Thr-Gly-His-Ala-Val-Arg-Ala-Ile-Gly-Arg-Leu-Ser-Ser）；
（ｃ） Thr-Ser、Gly-Ser、Leu-Glu、Thr-Tyr、Thr-Asp、Thr-Cys、Thr-Phe、Thr-Met、Thr-Thr、Thr-Glu、Thr-His、およびThr-Leuからなる群より選択される何れか１のアミノ酸配列（リンカーＹ）；
（ｄ） 緑色蛍光蛋白質の149〜238番目のアミノ酸配列；
（ｅ） Gly-Gly-Thr-Gly-Gly-Ser（連結アミノ酸配列）；
（ｆ） 緑色蛍光蛋白質の１〜144番目のアミノ酸配列；
（ｇ） Gly-Thr-ArgまたはThr-Arg（リンカーＺ）；および
（ｈ） ラットのカルモジュリン蛋白質の２〜148番目のアミノ酸配列、またはカルモジュリン蛋白質ミュータントＣａＭＣＮの２〜 148 番目のアミノ酸配列。 - 下記（ａ）〜（ｈ）の配列を、Ｎ末端から順に有することを特徴とするバイオセンサー蛋白質：
（ａ） Met-Gly-ThrまたはMet-Val-Asp（リンカーＸ）；
（ｂ） ミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質の一部のアミノ酸配列（Ser-Ser-Arg-Arg-Lys-Trp-Asn-Lys-Thr-Gly-His-Ala-Val-Arg-Ala-Ile-Gly-Arg-Leu-Ser-Ser）；
（ｃ） Leu-Glu（リンカーＹ）；
（ｄ） 緑色蛍光蛋白質の149〜238番目のアミノ酸配列；
（ｅ） Gly-Gly-Thr-Gly-Gly-Ser（連結アミノ酸配列）；
（ｆ） 緑色蛍光蛋白質の１〜144番目のアミノ酸配列；
（ｇ） Gly-Thr-ArgまたはThr-Arg（リンカーＺ）；および
（ｈ） ラットのカルモジュリン蛋白質の２〜148番目のアミノ酸配列。 - 請求項１８または１９に記載のバイオセンサー蛋白質をコードするバイオセンサー遺伝子。
- 下記（ａ）〜（ｇ）の配列を、Ｎ末端から順に有することを特徴とするバイオセンサー蛋白質：
（ａ）緑色蛍光蛋白質の１〜144番目のアミノ酸配列；
（ｂ）前述の（ａ）の配列と後述の（ｃ）の配列とを連結するアミノ酸配列Gly-Thr-Arg（リンカーＡ）；
（ｃ）カルモジュリン蛋白質、そのＣａ 2+ イオン結合部位およびミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質結合部位の両方を維持するように改変されたカルモジュリン蛋白質ミュータント、またはＣａ 2+ イオン結合部位およびミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質結合部位の両方を含むその部分アミノ酸配列；
（ｄ）前述の（ｃ）の配列と後述の（ｅ）の配列とを連結するアミノ酸配列Gly-ThrまたはGly-Thr-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser（リンカーＢ）；
（ｅ）ミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質、またはカルモジュリン結合部位を含むその部分アミノ酸配列；
（ｆ）前述の（ｅ）の配列と後述の（ｇ）の配列とを連結するアミノ酸配列Thr-Ser（リンカーＣ）；および
（ｇ）緑色蛍光蛋白質の149〜238番目のアミノ酸配列。 - 下記（ａ）〜（ｇ）の配列を、Ｎ末端から順に有することを特徴とするバイオセンサー蛋白質：
（ａ）緑色蛍光蛋白質の１〜144番目のアミノ酸配列；
（ｂ）Gly-Thr-Arg（リンカーＡ）；
（ｃ）ラットのカルモジュリン蛋白質の２〜148番目のアミノ酸配列；
（ｄ）Gly-ThrまたはGly-Thr-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser（リンカーＢ）；
（ｅ）；ミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質の一部のアミノ酸配列（Ser-Ser-Arg-Arg-Lys-Trp-Asn-Lys-Thr-Gly-His-Ala-Val-Arg-Ala-Ile-Gly-Arg-Leu-Ser-Ser）；
（ｆ）Thr-Ser（リンカーＣ）；および
（ｇ）緑色蛍光蛋白質の149〜238番目のアミノ酸配列。 - 請求項２２に記載のバイオセンサー蛋白質をコードするバイオセンサー遺伝子。
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