WO2006126570A1 - 生体反応又は生体内状態変化の複数同時解析法 - Google Patents

生体反応又は生体内状態変化の複数同時解析法 Download PDF

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biomolecule
fluorescent
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Miho Suzuki
Yuzuru Hushimi
Yasuhiko Oki
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National University Corporation Saitama University
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    • G01N2021/6441—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks with two or more labels

Definitions

  • the present invention relates to an activity measurement molecule necessary for measuring a biological reaction or in vivo state change, and an activity measurement method using the activity measurement molecule. More specifically, the present invention relates to an activity measurement molecule for measuring a biological reaction or in-vivo state change using quantum dots, and an activity measurement method using the activity measurement molecule.
  • the biological reaction refers to an enzymatic reaction for degrading, transferring, adding, or synthesizing proteins, nucleic acids, lipids, carbohydrates, and the like, changes in the concentration of substances in the body, changes in intracellular localization, and the like.
  • changes in the state of Z cells in a living body are carried out by a series of reactions by multi-component constituents through a spatio-temporal chain reaction. Therefore, it is possible to monitor the state of living Z cells more precisely by simultaneously monitoring the reactions made by various biological components, and the information obtained as a result is used for pathological diagnosis and drug discovery. It is expected to be a useful index.
  • the current situation is that even a method for monitoring a plurality of enzyme reactions has been developed, rather than a different type of reaction caused by these different components.
  • the term “strictly” used here refers to a more detailed analysis of the state of a living organism or cell, and is not a force, but a quantitative comparison that goes beyond differences between samples, measuring devices, and facilities in diagnostics. In order to investigate, it is necessary to measure the internal standard reaction etc. set in the sample at the same time, and even when one enzyme activity is used for pathological diagnosis, simultaneous measurement of different types of reactions is possible as an internal standard reaction. It also refers to what must be done.
  • the inventors have so far made a biological component labeled with a GFP protein and a fluorescent dye or a fluorescent dye using a method such as introduction of a new amino acid sequence by applying protein engineering modification to GFP.
  • a complex molecule (bioprobe) has been prepared, and a method has been developed to monitor in parallel various reactions performed by biological components. This is the fluorescence observed between two fluorescent molecules in the same molecule or in the vicinity between fluorescent dyes (or biological components labeled with fluorescent dyes) that form a complex with GFP (or other fluorescent protein).
  • FRET Resonance energy transfer
  • FCCS fluorescence cross-correlation spectroscopy
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-153279
  • Patent Document 2 WO2004Z042404
  • Non-patent literature 1 Suzuki et al., Biochim. Biophys. Acta, 1679: 222-229, 2004
  • Non-patent literature 2 Suzuki et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 330: 454-460, 2005
  • Non-Patent Document 3 Chang et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 334: 1317-1321, 2005
  • Non-Patent Document 4 Lin et al., Anal. Biochem., 319: 239-243, 2003
  • Non-Patent Document 5 Medintz et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 101: 9612-9617, 2
  • the molecular weight of the biomolecule labeled with a fluorescent dye that binds to GFP is large, it is possible to obtain a complex with GFP.
  • the binding efficiency is extremely poor and not suitable for practical use. It is difficult to efficiently obtain a large amount of measurement molecules (for example, a complex of GFP and another fluorescently labeled protein, or a complex of GFP and fluorescently labeled DNA) necessary for measuring an enzyme reaction. It was.
  • an object of the present invention is to stably provide an activity measurement molecule for simultaneously detecting a plurality of biological reactions or in vivo state changes, regardless of the measurement environment.
  • Another object of the present invention is to provide a method for simultaneous analysis of multiple biological reactions using the activity measurement molecule.
  • the present inventors are excellent in tolerance of the measurement environment when measuring a biological reaction or in-vivo state change, and simultaneously detect a plurality of in-vivo reactions or in-vivo state changes.
  • quantum dots As a result of earnest research in the development of activity measurement molecules and measurement methods for the above, it was found that the above problems can be solved by selecting quantum dots as FRET donors or FCCS fluorescent donors, and the present invention was completed. It came to let you. [0008] About 10 types of GFP color mutants that can be used as FRET donors or FCCS fluorescent donors are currently available, but their fluorescence characteristics are not so broad as excitation spectra with short stalk shifts.
  • Non-patent Document 3 it uses the quenching effect observed between quantum dots with opposite charges and gold particles, and peptide After labeling with gold particles, fixing on the quantum dot, observing quenching, we analyzed the process of recovering the fluorescence of the quantum dot by deactivating the quenching effect by proteolytic enzyme activity treatment. The result is ratio imaging (high accuracy data obtained by FRET in a narrow sense), and it has been effective for measuring enzyme activity for 18 to 47 hours. Improvement was required.
  • the present invention makes it possible to perform multiple simultaneous analysis or visualization which has been difficult in the past.
  • the present invention relates to the following (1) to (19).
  • one or more biomolecules labeled with fluorescent molecules and Z or unlabeled biomolecules, which are targets for biological reaction or in vivo state change are bound on quantum dots. It is an activity measuring molecule for simultaneous analysis of biological reactions and Z or in vivo state changes characterized by
  • the activity measurement molecule according to (1) above wherein the biomolecule is a peptide, and the peptide is covalently bound to the fluorescent molecule. It is.
  • a third aspect of the present invention is the activity measurement molecule according to (2) above, wherein the covalent bond is a peptide bond.
  • the quantum dot is coated with avidin, the biomolecule is biotinized, and the biomolecule is bound to the quantum dot via a piotine-avidin bond.
  • the activity measuring molecule according to any one of (1) to (3) above, which is characterized in that
  • the fifth aspect of the present invention is that the fluorescence-labeled biomolecule has a number power of 40 to 40, and Z or the fluorescent label is a number of biomolecules power of 40 to 40.
  • the activity measurement molecule according to any one of the above (1) to (4), which is characterized in that
  • the biomolecule is a group consisting of a nucleic acid, a protein, a peptide, an amino acid, a coenzyme, a sugar, a sugar chain, a lipid, a derivative thereof, and a complex thereof.
  • the activity measurement molecule according to any one of (1) to (5) above, wherein the activity measurement molecule is selected.
  • a seventh aspect of the present invention is the activity measuring molecule according to any one of (1) to (6) above, wherein the biological reaction is an enzyme reaction.
  • the enzyme comprises a nucleolytic enzyme, a nucleic acid modifying enzyme, a proteolytic enzyme, a protein modifying enzyme, a sugar chain decomposing enzyme, a sugar nucleotide synthase, and a glycosyltransferase.
  • the ninth aspect of the present invention is the activity measurement molecule according to (8) above, wherein the enzyme is a nucleolytic enzyme, and the biomolecule is a nuclear acid.
  • the tenth aspect of the present invention is the activity measurement molecule according to (8) above, wherein the enzyme is a proteolytic enzyme, and the biomolecule is a peptide.
  • the fluorescent molecule is selected from fluorescent proteins typified by BFP, CFP, GFP, YFP, and RFP and variants thereof (1) to ( 10) is an activity measuring molecule according to any one of the above.
  • one or more activity measurement molecules bound to the first biomolecule according to any one of (1) to (6) above and a fluorescent molecule are labeled or not labeled.
  • Mix one or more second biomolecular force test samples and incubate under conditions suitable for the interaction of the first and second biomolecules on the quantum dots and during or during incubation Then, each quantum dot is excited with a wavelength suitable for each quantum dot, and the first biomolecule bound on each quantum dot and the fluorescent label bound to Z or each second biomolecule are added to the system.
  • This is a method for simultaneous analysis of multiple interactions of biomolecules, comprising detecting changes in fluorescence intensity obtained from all the fluorescent molecules present.
  • the first biomolecule on the quantum dot is a group consisting of a nucleic acid, a protein, a peptide, a sugar, a sugar chain, a derivative thereof, and a complex force thereof.
  • the second biomolecule is selected from the group consisting of nucleic acids, proteins, peptides, sugars, sugar chains, derivatives thereof, and complex power thereof.
  • the test sample is a cell extract, a cell culture supernatant, blood, or a body fluid. It is a method.
  • a mixture of one or more activity measurement molecules according to any one of the above (7) to (11) and one or more enzymes to be activity-detected are mixed. Incubate the mixture under conditions optimal for the activity of the enzyme, and during or after incubation, excite each quantum dot at a wavelength suitable for each quantum dot and bind to each quantum dot and each substrate.
  • a method for simultaneous analysis of multiple enzyme activities comprising detecting changes in fluorescence intensity obtained from all fluorescent molecules present in the system, such as fluorescent labels.
  • the seventeenth aspect of the present invention is the method according to (16) above, wherein at least one of the enzymes is a proteolytic enzyme.
  • the eighteenth aspect of the present invention is the method according to (16) or (17) above, wherein the enzyme-measurement molecule mixture is further mixed with a second substrate fluorescently labeled with the enzyme. It is a method.
  • the fluorescence characteristics of the quantum dots contained in the mixture of activity measuring molecules are different from each other. It is a method described in any of them.
  • the activity measurement molecule of the present invention (also referred to as a bioprobe) has a high degree of integration such as a substrate required for activity measurement, and the molar dye used for the molecule is a conventional fluorescent dye.
  • the activity measurement molecule is an ultrasensitive measurement molecule that does not require signal amplification or the like because it is ⁇ 10 times or more in comparison, and the method of the present invention using the molecule is highly sensitive. Results can be provided.
  • the activity measuring molecule and the activity measuring method of the present invention allow the activity measuring molecule to be taken into a cell or an individual, so that a biological phenomenon actually occurring in vivo can be prevented. It can be visualized and is expected to be useful not only in the above-mentioned in vitro but also in diagnosis of disease states, drug discovery screening, etc.
  • Figure 1 shows the substrate DNA used in DNase assembly (lanes 2, 3; PCR product) and the substrate DNA bound to the quantum dot (lanes 4, 6; Q dots + PCR product) The results of polyacrylamide gel electrophoresis and SYBR Greenl (Promega Corp.) staining are shown. Lane 1 migrated 100 base DNA marker (100 bp ladder) and Lane 5 (Q dots) migrated only quantum dots.
  • Fig. 2 shows the results of FRET measurement for only quantum dots, with the fluorescently labeled substrate DNA bound to the quantum dots, and with the DNase treatment by binding the fluorescently labeled substrate DNA to the quantum dots. Show.
  • FIG. 3 shows FRET measurement results when a PCR product (labeled with dUTP-Alexa 532) was immobilized on a quantum dot (QD525) and subjected to DNase treatment. Untreated (square) is resolved by force DNase treatment (triangle) where FRET is observed. The circle graph shows the DNase-treated sample measured under higher sensitivity conditions.
  • FIG. 4 shows the results of observing FRET after immobilizing ssDNA (-strand DNA) on QD 525 (primer was hybridized in advance) and then treating with Klenow fragment. Triangles are the results of observation of Klenow fragment untreated and circles are treated with Klenow fragment.
  • FIG. 5 is a view showing the amino acid sequence of a chimera protein comprising a proteolytic enzyme recognition peptide sequence and GFP or RFP.
  • A is trypsin and GFP
  • B is caspase 1 and GFP
  • C is caspase 9 and GFP
  • D is cathebsin E and GFP
  • E is caspase 3 It is the amino acid sequence of the recombinant protein of and RFP.
  • the inserted sequence is shown in italics and the enzyme recognition sequence is underlined.
  • FIG. 6 shows the results of measuring trypsin activity by FRET.
  • the peak wavelength of fluorescence intensity shifted from 513 nm to 508 nm by trypsin treatment.
  • FIG. 7 shows the results of measuring caspase-3 activity by FRET.
  • the peak wavelength of fluorescence intensity shifted from 510 nm to 506 nm by trypsin treatment.
  • FIG. 8 shows the results of observing the fluorescence spectrum of each quantum dot (QD) alone exposed to a pH environment. Almost no change at pH 7 or higher.
  • FIG. 9 shows the results of observing the fluorescence spectrum of each pH-sensitive fluorescent dye alone exposed to a pH environment. Although there are significant changes around pH 7.9, there is almost no change at pH 7.9 or lower and pH 7.9 or higher, respectively. Ex is the excitation fluorescence spectrum, and Em is the fluorescence spectrum obtained by the maximum excitation wavelength.
  • FIG. 10 shows the results of observing the fluorescence spectrum by immobilizing pH-sensitive fluorescent dyes on quantum dots and exposing them to each pH environment. As the waveform pattern, each change is emphasized, and the merit of the combination comes out. The fluorescence spectrum of only the quantum dots is shown in the figure as Not modified for reference.
  • FIG. 11 shows the results of simultaneous measurement of DNA-degrading enzyme activity and proteolytic enzyme activity. + And 1 indicate the presence or absence of treatment of each enzyme.
  • one or more biomolecules labeled with fluorescent molecules and Z or unlabeled biomolecules, which are targets for biological reaction or in vivo state change are bound on quantum dots. It is an activity measuring molecule for simultaneous analysis of biological reaction and Z or in vivo state change, characterized by
  • the “activity measuring molecule” of the present invention is a biological molecule to be subjected to biological reaction or in vivo state change, or a binding partner of the biological molecule (for example, protein, nucleic acid, lipid, sugar, etc.).
  • a binding partner of the biological molecule for example, protein, nucleic acid, lipid, sugar, etc.
  • proteins, nucleic acids, lipids, sugars, etc. or the like that are labeled with a fluorescent molecule or those not labeled with a fluorescent molecule are bound on quantum dots.
  • a fluorescent label is used, and a thing in which a thing is bound on a quantum dot is the fluorescent label, and It can be used to detect the binding mode of a second biomolecule that binds to the biomolecule.
  • Biomolecule means all molecules present in a living body with a functional or structural role, such as nucleic acids, proteins, peptides, amino acids, coenzymes, sugars, sugar chains, lipids. Or derivatives and complexes thereof (eg, glycoproteins, glycolipids, etc.), various enzymes (eg, nucleolytic enzymes, nucleic acid modifying enzymes, nucleic acid synthesizing enzymes, proteolytic enzymes, protein modifying enzymes, glycolytic enzymes, Sugar nucleotide synthase or glycosyltransferase), substrates for enzyme reactions (eg, proteins, nucleic acids, lipids, sugars, etc.).
  • enzymes eg, nucleolytic enzymes, nucleic acid modifying enzymes, nucleic acid synthesizing enzymes, proteolytic enzymes, protein modifying enzymes, glycolytic enzymes, Sugar nucleotide synthase or glycosyltransferase
  • substrates for enzyme reactions e
  • the “biological reaction” referred to here includes all reactions between biomolecules.
  • an enzyme reaction is a typical example.
  • in vivo state change means that even if no chemical reaction occurs, as a result of interactions between biomolecules, 1 biomolecule is decomposed or 2 biomolecules are combined to form an integral body. All of the state changes that become Sarako, not only the interaction between biomolecules, but also the concentration of the biomolecule to be measured (concentration change of related molecules that occur during the reaction, such as calcium ion concentration change, proton concentration change, pH change Etc.), membrane potential, redox state, etc. are also included in the in vivo state change of the present invention.
  • Quantum dots are small lumps of about 10 to several nm in which several hundred to several thousand semiconductor atoms are gathered.
  • Dr. Louis Brus et al. In the 1970s Bell Laboratories and Alexander of the former Soviet Yoffe Laboratory The process was devised by Dr. Efros and Alexie Ekimov et al., And the core technology is based on the invention described in US Pat. No. 5,990,479.
  • Electron beam lithography A method of separating a two-dimensional quantum well using one or the like, or a method of separating a one-dimensional quantum wire, Stranski-Krastanov
  • Stranski-Krastanov A typical manufacturing method is a mode crystal growth method.
  • Manufactured products can also be purchased from Quantum Dot Corp., USA.
  • fluorescently labeled dye fluorescent molecule
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • FCCS quantum dots
  • the biomolecule used in the activity measurement molecule of the present invention is fluorescently labeled, it can be labeled according to the type and characteristics of the biomolecule.
  • the biomolecule is DNA
  • the end of the DNA can be labeled, or the entire DNA can be labeled. This method can be performed based on a method known in the art.
  • the biomolecule is a protein, lipid, or sugar, it can be performed by a known technique.
  • the activity-measuring molecule of the present invention makes it possible to detect a target biological reaction or biological change by applying a method for detecting FRET or an FCCS method.
  • FRET should be observed between the quantum dot and the fluorescently labeled biomolecule, or the FCCS method should be applicable.
  • FRET conditions such as keeping a certain distance between quantum dots and fluorescently labeled biomolecules are necessary.
  • quantum dots have a high quantum yield, this is not the case between ordinary fluorescent dye molecules. Compared to the observation of phenomena, the range of application is wider.
  • FCCS there is no distance limitation, and the better the sensitivity is, the more the molecular weight of the two molecules after the reaction is different. Since it is assumed that multiple biomolecules are fixed on the quantum dot! /, It is easy to realize the molecular weight difference after the reaction. Under these conditions, selection can be made based on ordinary technical common knowledge of those skilled in the art.
  • the activity measuring molecule of the present invention can be used even in a fluid state such as in a liquid or in a state where it is fixed to a support such as a base.
  • a support for example, in the case of an avidin-coated quantum dot, it can be fixed to a microplate as it is or via a biotin derivative, or an antibody-coated molecule.
  • dots they can be immobilized using an antibody immobilization column (such as a protein A or protein G column).
  • a histidine tag can be attached to the protein, and it can be easily immobilized on a chip or gold substrate activated with Ni 2+ —NTA.
  • the quantum dot and the biomolecule can be bound by a method known in the art, and can be a covalent bond or a non-covalent bond (for example, For example, coordinate bonds (for example, His tag— ⁇ ⁇ — ⁇ ) or antigen-antibody reaction may be used. Piotin-avidin binding can also be utilized. In brief, fluorescently labeled biomolecules (proteins, DNA, sugar chains, etc.) are piotinized, and avidin-coated quantum dots are mixed to form a pyotin-avidin bond. Biomolecules can be bound to the.
  • biotinylating a biomolecule if the biomolecule is a protein or the like, there is an amino group reactive pyotinating reagent, piotin NHS-ester!
  • piotin NHS-ester This can be achieved by reacting with the N-terminus of the protein, that is, any amino acid residue-specific reactive piotin or reagent can be applied, and if the biomolecule is a nucleic acid or sugar chain, these are aminated.
  • This is achieved by obtaining a derivative corresponding to the reactive group of the piotinker reagent, such as by reacting with an amino group-reactive piotinating reagent after making the derivative.
  • quantum dots coated with the antibody or avidin for example, functional groups present on the quantum dots (for example, —COOH, —NH
  • Quantum dots suitable for these methods are commercially available, and these commercially available products can also be used.
  • Another embodiment of the present invention is a biomolecule peptide that is a target of biological reaction or in vivo state change on a quantum dot, and is covalently bonded to a fluorescent molecule and binds at least one biomolecule. It is an activity measurement molecule for simultaneous analysis of multiple biological reactions and changes in Z or in vivo conditions.
  • the activity measurement molecule in this embodiment can be a useful tool for measuring a single biological reaction or the like.
  • any fluorescent molecule known to those skilled in the art can be used.
  • fluorescent proteins can be used, and fluorescence such as BFP, CFP, GFP, YFP, and RFP is representative. Proteins and mutants thereof are preferred.
  • the peptide that can be used in the present embodiment may be a functioning function in vivo or a peptide part corresponding to a functional region of a protein. Further, the peptide may be a part of a protein such as a sequence corresponding to a functional domain or a functional region of a specific protein. Examples of the peptide include a recognition sequence for a proteolytic enzyme and a recognition for a protein kinase. Sequence, glycosyltransferase recognition sequence, nucleic acid binding sequence, etc. are recognized by a certain in vivo molecule and expected to interact with the in vivo molecule. As a result of the interaction, FRET between the quantum dot and the fluorescent molecule, etc. Any of those that affect FRET or the like as a result of degradation of the peptide or the like can be used.
  • the binding between the fluorescent molecule and the biomolecule is not particularly limited, but in the case of a fluorescent protein, peptide binding is desirable because genetic engineering techniques can be applied.
  • other covalent bonds such as phosphorothioate bond, phosphorodithioate bond, phosphoramidothioate bond, phosphoramidate bond, phosphoramidate bond, methylphosphonate bond and the like can also be used.
  • coordination bonds for example, His tag—Ni 2+ —NTA
  • inclusion inclusion of fluorescent molecules to bound cyclodextrins
  • the positional relationship between the two must be such that large FRET changes, FCCS, etc. can be observed before and after the reaction.
  • GFP, RFP or its color mutant as a fluorescent protein, insert it into any of 11 loop regions connecting N-terminal, C-terminal and 11 j8 chains of GFP and RFP. be able to.
  • the peptide and the fluorescent protein or quantum dot may be bound directly, but in some cases, several amino acids (about 1 to 20) that serve as a spacer may be inserted.
  • fluorescence resonance energy transfer generated between a quantum dot and a biological component labeled with a fluorescent molecule is monitored as a state change of a biological reaction.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • FCCS fluorescence cross-correlation spectroscopy
  • the most efficient FRET is detected.
  • the FCCS method when the FCCS method is applied, a fluctuation pattern is detected in which the quantum dot and the labeled biomolecule are the same molecule.
  • the biomolecule contained in the activity measurement molecule is a protein, nucleic acid, sugar chain, etc.
  • the protease, nucleic acid When treated with a degrading enzyme or a glycan degrading enzyme, the biomolecule is cleaved, and the fluorescent molecule labeled on the biomolecule is dissociated from the quantum dot, so that FRET is eliminated and two fluorescent molecules are also separated. The behavior of another molecule is shown and the fluctuation pattern changes.
  • This process is analyzed by measuring FRET, fluorescence lifetime, time-resolved fluorescence, etc. using a fluorescence spectrophotometer, measuring FCCS using a fluorescence cross-correlation spectrometer, and using a fluorescence microplate reader that supports these measurements. Monitoring is possible.
  • the enzyme is a transferase
  • a substrate that is not labeled on the quantum dot is bound, and FRET generated as a result of the transfer of the labeled second substrate by the transferase is detected.
  • the activity can be monitored by measuring the change in a fluctuation pattern in which a fluorescent molecule that behaves differently behaves as a single fluorescent molecule.
  • protein, protein and nucleic acid, nucleic acid, protein As for the binding reaction between glycans and sugar chains, an activity measurement molecule is prepared by binding one biomolecule on a quantum dot without fluorescent labeling, and the fluorescence-labeled biomolecule that becomes a binding partner with the activity measurement molecule is prepared.
  • Quantum dots are characterized by having a broad absorption band on the blue side of the fluorescence wavelength and exhibiting narrow fluorescence regardless of the excitation wavelength. Therefore, different quantum dots can be excited at the same wavelength and different fluorescence wavelengths can be excited simultaneously. It is possible to get.
  • a wavelength that is most suitable for the characteristics of the quantum dot to be used is desired.For example, 300 to 500 nm, preferably, a wavelength farther from the excitation wavelength of all acceptors present in the activity measurement system is used.
  • the characteristics of the quantum dots that are used well are expected to show 490nm, 525nm, 565nm, 585nm, 605nm, 655nm.
  • quantum dots having different fluorescence characteristics are bound to quantum dot 1
  • another fluorescently labeled protein is bound to quantum dot 2
  • sugar chains that are not fluorescently labeled are bound to quantum dot 3.
  • a test sample containing a DNA-degrading enzyme, proteolytic enzyme, glycosyltransferase, and fluorescently labeled sugar (a mixture of purified enzyme, cell extract, culture supernatant) Etc.) are mixed with the activity measurement molecule, and the fluorescence wavelength characteristic change obtained by irradiating the excitation wavelength while incubating under appropriate conditions is analyzed by FRET change detection method or FCCS method. It becomes possible to confirm the above three kinds of enzyme activities. Furthermore, a mixture of quantum dots to which proteins that are not fluorescently labeled and fluorescently labeled proteins are mixed can detect protein-protein interactions, and can be detected by binding to biomolecules (including chelating metal ions). When an environment-dependent fluorescent dye that changes its fluorescence characteristics is bound to a quantum dot using an appropriate spacer molecule, the concentration change of the biomolecule can be applied to the FRET change detection method. It is.
  • the method of the present invention can be applied to multiple simultaneous analyzes of many biological reactions or in-vivo state changes.
  • the timing of irradiating the quantum dots with the excitation wavelength may be during the test substance incubation or after the incubation. If you want to see some activity or reaction in real time, you should irradiate the excitation wavelength after the incubation if you want to confirm the final activity that it is preferable to irradiate the excitation wavelength during the incubation.
  • fluorescent fading occurred in a very short time, and it was very difficult to obtain good results.
  • the method of the present invention since the quantum dot is a semiconductor, fluorescence can be retained for a certain period of time, and real-time monitoring of a relatively slow reaction is also possible.
  • the activity-measuring molecule of the present invention can be included in the form of a kit together with instructions for use in a container or pack.
  • the activity measuring molecule of the present invention is supplied as a kit, it is preferably packaged in a form that enables long-term storage without losing the function of the activity measuring molecule.
  • the activity measuring molecule contained in the kit is supplied in any kind of container in which the constituents maintain the activity effectively for a long period of time, are not adsorbed by the material of the container, and are not altered.
  • a sealed glass ampoule includes a buffer packaged under a neutral, non-reactive gas such as nitrogen gas.
  • Ampoules are also composed of glass, polycarbonate, organic polymers such as polystyrene, ceramics, metals, or any other suitable material commonly used to hold reagents.
  • suitable containers include simple bottles made of similar material, such as ampoules, and packaging materials that are internally lined with foil, such as aluminum or alloy.
  • kits for use are attached to the kit.
  • Instructions for using the kit comprising the activity measuring molecule are printed on paper or other material, and Z or floppy disk
  • kit may be supplied as an electrically or electromagnetically readable medium such as a CD-ROM, DVD-ROM, Zip disk, video tape or audio tape.
  • Detailed instructions for use may actually be included in the kit, or may be posted on a website designated by the kit manufacturer or distributor or notified by e-mail or the like.
  • the Example for measuring the activity of a DNA-degrading enzyme is shown.
  • the double-stranded DNA used as a substrate is a plasmid encoding UV5casS22tag using a primer set of 5 'AG AACC ACTCCC AGC AGC AGTTAC AAA CTC3' (SEQ ID NO: 1) and 5 'ACTCCAATTGGCGATGGCCCTG3' (SEQ ID NO: 2).
  • Non-patent document 2) was used as a template to amplify a part (approximately 150 mer) by PCR, and the amplified product was confirmed for base length by electrophoresis.
  • dUTP Alexa Alexa Fluor 568-5dUTP or Alexa Fluor 532-5dUTP, Moleclar Probes
  • Alexa-dUTP was added to a concentration of 0.05 mM), after 94 ° C for 2 minutes, 94 ° C30 Second, 63 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 30 seconds, and finally PCR reaction was performed under the reaction conditions of 72 ° C for 7 minutes to prepare DNA as a substrate for DNase labeled with Alexa dye.
  • the activity measurement molecule was prepared by immobilizing ssDNA (-strand DNA) with a primer hybridized beforehand on a quantum dot (QD525) by the above-described method.
  • the prepared active molecule was subjected to DNA chain extension reaction using Klenow fragment as a DNA polymerase.
  • FRET could not be observed before treatment with DNA polymerase (lowest state), but FRET was observed by DNA polymerase treatment (highest state) (Fig. Four).
  • trypsin activity was measured using a peptide containing a trypsin sensitive site as a biomolecule.
  • Peptide containing a trypsin-sensitive site force GEP—trypsin recognition peptide insertion modification so that the His tag is added to the C-terminal side of GFP as shown in Fig. 5A
  • GFPUV5 sequence is incorporated by PCR into ET21a (NOVAGEN) shown in Non-Patent Document 1, and a DNA fragment encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 is inserted into its C-terminal region.
  • a DNA fragment encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 is inserted into its C-terminal region.
  • GEP-trypsin recognition recombinant protein was expressed, and recognition peptide insertion recombination protein purification was performed using the His tag.
  • Amine-treated quantum dots (Amine Evitag Lake Placid Blue, Evident Tec hnologie) were incubated with a homobivalent cross-linking reagent capable of reacting with the amine group (0.1 ⁇ in carbonate buffer) Remove the homobivalent cross-linking reagent of the reaction with an ultrafiltration spin column. The obtained quantum dots and Ni-NTA amin derivative are further incubated (0. in carbonate buffer).
  • Ni-NTA amin derivative and buffer substitution phosphoric acid buffer
  • the recognition peptide-inserted recombinant protein can be immobilized on the quantum dot via the His tag site.
  • trypsin activity was measured using a peptide containing caspase 3 as a biomolecule.
  • Peptide containing a caspase 3 sensitive site force GE P-Caspase 3 so that it is inserted into the C-terminal region of GFP and a His tag is added to the C-terminal side as shown in Figure 5B
  • An expression vector for the recognition peptide-inserted recombinant protein was constructed. This expression vector was prepared in the same manner as in the case of measuring the above trypsin activity.
  • An amine group is converted into a thiol group by reacting a amine-treated quantum dot (Amine Evitag Lake Placid Blue, Evident Technologies) with a Traut reagent.
  • This quantum dot and a pH-sensitive fluorescent dye (delivered by Dr. Hirokazu Komatsu, Keio University) are incubated in a phosphate buffer to bind the pH-sensitive fluorescent dye onto the quantum dot. Unreacted pH-sensitive fluorescent dye is removed with a gel filtration column.
  • the obtained pH-sensitive fluorescent dye-coupled quantum dots were dispersed in a pH monitoring buffer, and the quantum dots were excited to measure the fluorescence spectrum.
  • the fluorescence spectrum of the quantum dot alone and the pH sensitive fluorescent dye alone was measured in the same pH monitoring buffer.
  • a large fluorescence spectrum change depending on pH was obtained only when fixed on a quantum dot (Figs. 8, 9, 10), indicating that a molecule for measuring pH change could be prepared.
  • This example shows the results of simultaneous detection of the activities of nucleolytic enzymes and proteolytic enzymes using the configuration of the present invention.
  • a molecule for measuring the activity of DNA-degrading enzyme was prepared in the same manner as in [Example 1] using QD525 as quantum dots and Alexa532 as a fluorescent molecule.
  • protein content The activity measurement molecule of degrading enzyme (here, using trypsin) was prepared in the same manner as in [Example 2] using QD565 as a quantum dot and GFP (FIG. 5A) as a fluorescent molecule.
  • a shift in the peak wavelength of the fluorescence intensity detected by each treatment was observed from the peak wavelength of the tube not treated with DNase and trypsin.
  • the waveform pattern of DNase-Trypsin was used as a basis, and changes in the waveform pattern due to each enzyme treatment were observed to determine the activity status of each enzyme. Monitor. There are three peaks around 510, 560 and 600nm. + With DNase-Trpsin, the peak near 600 nm, which is the only additive of nucleolytic enzymes, decreased and the peak near 560 nm increased. In DNase + Trpsin, only trypsin was added, but a peak near 510 nm was observed to be shifted. + DNase + Trpsin was observed when both enzymes were added, but both of the above two changes were observed.
  • the increase in the peak near 560 nm is considered to be due to the observation of the fluorescence wavelength of the quantum dot with fixed DNA.
  • the example observation method (a method of observing the change in the waveform pattern with respect to the control) was not particularly troublesome.

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Abstract

　本発明は生体反応又は生体内状態変化を測定するために必要な活性測定分子および該活性測定分子を使用した活性測定方法の提供を目的とする。 　量子ドット上に、生体反応又は生体内状態変化の対象となる蛍光標識した生体分子及び／又は蛍光標識しない生体分子を１つ以上結合していることを特徴とする生体反応及び／又は生体内状態変化の複数同時解析用活性測定分子の提供、並びに該活性測定分子を用いた生体反応及び／又は生体内状態変化の複数同時解析方法。

Description

明 細 書
生体反応又は生体内状態変化の複数同時解析法
技術分野
[0001] 本発明は生体反応又は生体内状態変化を測定するために必要な活性測定分子お よび該活性測定分子を使用した活性測定方法に関する。より詳細には、量子ドットを 用いた生体反応又は生体内状態変化測定用の活性測定分子および該活性測定分 子を使用した活性測定方法に関する。
背景技術
[0002] 生体内に存在する物質は、種々様々な役割を担って 、ることから、その生体反応の 様式も非常に多岐にわたるものである。ここで、生体反応とは、タンパク質、核酸、脂 質、糖質などに対する分解、転移、付加、合成を行う酵素反応や、生体内物質の濃 度変化、細胞内局在変化等を指す。生体内 Z細胞内で行う状態変化は、多くの場 合多成分構成体による一連の反応が時間 ·空間的連鎖反応することで担われている 。従って、様々な生体構成成分によってなされる反応を同時にモニターすることで生 体 Z細胞の状態をより厳密にとらえることが可能となり、その結果得られた情報は、病 態診断並びに、創薬の際の有用な指標となることが期待される。し力しながら、このよ うな異なる成分によって起こる異なる様式の反応どころか、複数の酵素反応をモニタ 一する方法すら開発されて 、な 、のが現状である。
また、ここで言う「厳密に」とは生体や細胞の状態のより詳細な解析を指すば力りで はなく診断等において試料間、測定装置間、施設間の差を超えて定量的な比較検 討をするには試料中に設定した内部標準反応等を同時に測定しなければならず、例 えある一つの酵素活性を病態診断に用いる場合でも内部標準反応として別種の反 応の同時測定が行われなければならない事も指す。
[0003] プロテインチップと称されるものの多くは ELISA法などと同様に抗体を用いて所望 のタンパク質の存在量 (発現量)を検出することができるものである力 生体内におい てそのタンパク質が関わる詳細な相互作用メカニズムなどの反応機構まで明らかに することはできず、また、質量分析 (MS)を用いたリン酸ィ匕タンパク質の同定等にお いてもその修飾を受けたタンパク質の存在量が確認されるに留まる。すなわち、修飾 酵素の活性状態の把握は出来ない。
また、酵素活性測定用人工基質などが多く開発されているものの、それらを並列し てハイスループット的に使用することは困難である。なぜなら、従来技術では、測定 対象が全く異なる場合でも用いる試薬が類似のものが殆どで同時に別種の活性は測 定不可能な場合が殆どだ力 である。
[0004] そこで発明者らは、これまでに、 GFPにタンパク質工学的改変を施し、新たなァミノ 酸配列の導入などの方法を用いて、 GFPタンパク質と蛍光色素あるいは蛍光色素で ラベルされた生体成分とを結合させた複合体分子 (バイオプローブ)を調製し、生体 構成成分によってなされる色々な反応を並列的にモニターする方法を開発してきた。 これは GFP (あるいは他の蛍光タンパク質）と複合体を形成する蛍光色素（あるいは 蛍光色素でラベルされた生体成分）間の同一分子あるいは近傍に存在する 2種の蛍 光分子間で観察される蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET)を生体反応の状態変化に 変換して細胞内外に関わらずモニターするものである（例えば、非特許文献 1、非特 許文献 2及び特許文献 1)。既存のプロテアーゼ解析法が存在量の解析にほぼ特ィ匕 されたものであるのに対し、この方法論は、反応、状態変化をモニターできる点にお いて優れているといえる。また、 FRETではなく 2種の蛍光分子間で観察される蛍光 相互相関分光法 (FCCS)によっても、反応、状態変化をモニター可能であることが 明らかとなっている。
また、量子ドットと蛍光分子を標識した生体分子により構成されるバイオプローブに おける FRETを利用した解析方法もこれまでに報告されているが、効率的で測定対 象に依存しな!、FRETの観測が困難性あるなどの理由から、測定精度を担保した利 用は実現されていない (特許文献 2、非特許文献 3、非特許文献 4及び非特許文献 5
) o
[0005] 特許文献 1 :特開 2002— 153279
特許文献 2： WO2004Z042404
非特許文献 1 : Suzukiら， Biochim. Biophys. Acta, 1679 : 222- 229, 2004 非特許文献 2 : Suzukiら， Biochem. Biophys. Res. Comm. , 330 :454— 460, 2005
非特許文献 3 : Changら， Biochem. Biophys. Res. Comm. , 334 : 1317—1321 , 2005
非特許文献 4: Linら， Anal. Biochem. , 319 : 239- 243, 2003
非特許文献 5 : Medintzら， Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 101 : 9612- 9617, 2
004
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 上述のように、複数同時可視化という観点力 複数の蛍光タンパク質 (例えば、 GF Pとその色変異体)を用いる場合、それぞれの蛍光タンパク質の使用環境における適 合性および安定性に問題があり、広範な用途への適用が困難であった。
また、量子ドットなどを用いる点においても、広範な用途のための一般化された解析 システムの安定性等における問題が存在していた。
さらに、 GFPに結合させる蛍光色素でラベルした生体分子の分子量が大きい場合 、 GFPとの複合体を得る事は可能である力 結合効率が極めて悪く実用化には適さ ないことから、種々の生体反応、酵素反応を測定するのに必要な測定分子 (例えば、 GFPと他の蛍光標識タンパク質との複合体、又は GFPと蛍光標識 DNAとの複合体） を大量に効率よく取得するのが困難であった。
よって、本発明は測定環境に左右されず、かつ、複数の生体反応又は生体内状態 変化を同時検出するための活性測定分子の安定した提供を目的とする。
また、本発明は該活性測定分子を使用した生体反応複数同時解析法の提供を目 的とする。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明者らは、上記事情に鑑み、生体反応又は生体内状態変化を測定するにあ たり、測定環境の寛容さに優れ、同時に複数の生体反応又は生体内状態変化等を 検出するための活性測定分子、および測定方法の開発において鋭意研究を行った 結果、 FRETのドナーあるいは FCCSの蛍光供与体として量子ドットを選択すること で、上記課題が解決することを見出し、本発明を完成させるに至った。 [0008] FRETのドナーあるいは FCCSの蛍光供与体として成立する GFPの色変異体は、 現在 10種類程度利用可能であるものの、その蛍光特性はストークシフトが短ぐ励起 スペクトルはそれ程広く無いのに対し広い蛍光スペクトルを持つものであり、複数の 活性測定分子を得るに上で、十分に区別し得る変異体を容易に入手することは困難 である。一方、 GFPと比較して、量子ドットは生体への無毒性が確認されている物が 、同様に 10種類程度存在するが、その蛍光特性は、広い励起スペクトルに対し狭い 蛍光スペクトルを有し、上述の蛍光タンパク質に比べ大変優れた特性を示す。さら〖こ 量子ドット自体無機分子であるため、タンパク質である GFPに比べるとロット差の少な い製造が容易であり、今後、所望の蛍光特性を備えた量子ドットの取得が格段に容 易になると考えられる。また、量子ドットは GFPと比較すると測定環境への寛容さが高 ぐ蛍光タンパク質に比べて飛躍的に優れた光安定性を有し、さらには、中性付近か ら大きくはずれた pH条件下、油層、高温環境などにおいても活性測定が可能である
[0009] 複数の生体反応等を同時にモニターして解析するためには、より多くの生体反応 等を区別化しモニターすることを可能にする活性測定分子が必要となる。従来使用さ れて 、た GFPを FRETのドナーある!/、は FCCSの蛍光供与体として使用するために は、色変異体ごとに異なる励起波長を用いなければ所望の蛍光を得ることができな かったが、量子ドットの場合はすべて同じ励起波長を使用することが可能である。し 力も性質の異なる量子ドットの取得は GFP等と比較してはるかに容易であることから（ 粒径が異なると蛍光が異なる）、量子ドットを使用することによって、これまで困難であ つた測定対象の並列性の増大を可能とし、複数同時解析方法 (可視化方法)を最適 化することができる。また、量子ドットの蛍光は GFP及びその色変異体に比べてより 長波長側の蛍光を示すものが多いため生体内で観察される自家蛍光との区別をより 明確に行うことができる。
[0010] さらに、本発明者らは、従来報告されている量子ドットの使用における困難性を顕 著に改善することで、量子ドットを利用した解析システムの実用化を可能にした。前掲 の従来技術を報告する文献には、生体反応等の解析における量子ドットの利用性を 報告したものも存在するが、その解析結果は実用化する上での問題及び困難性を示 唆するものが少なくな力つた。例えば、量子ドットを用いたタンパク質分解酵素活性の 検出を報告した例においては (非特許文献 3)、逆電荷を持つ量子ドットと金粒子の 間で観察される消光効果を利用したもので、ペプチドを金粒子でラベルし量子ドット 上に固定化、消光を観察した後、タンパク質分解酵素活性処理により消光効果の解 消により量子ドットの蛍光が回復する過程を解析したものである。その結果は、 ratio imaging (狭義の FRETにより得られる精度の高 、データ）になって 、な 、ばかりか 酵素活性測定に 18時間から 47時間も力かっており、実際の解析への利用にはかな りの改善を要するものであった。
以上のような点から、本願発明は従来困難であった複数同時解析もしくはその可視 化を可能ならしめるものであるということができる。
すなわち、本発明は以下の（1)〜（19)に関する。
(1)本発明の第 1の態様は、量子ドット上に、生体反応又は生体内状態変化の対象 となる、蛍光分子で標識した生体分子及び Z又は標識しな 、生体分子を 1以上結合 していることを特徴とする生体反応及び Z又は生体内状態変化の複数同時解析用 活性測定分子である。
(2)本発明の第 2の態様は、前記生体分子がペプチドであり、該ペプチドが前記蛍 光分子と共有結合で結合していることを特徴とする上記（1)に記載の活性測定分子 である。
(3)本発明の第 3の態様は、前記共有結合がペプチド結合であることを特徴とする上 記（2)に記載の活性測定分子である。
(4)本発明の第 4の態様は、前記量子ドットをアビジンでコートし、前記生体分子をビ ォチンィ匕して、ピオチン—アビジン結合を介して、前記生体分子が量子ドットに結合 することを特徴とする上記（1)乃至（3)の 、ずれかに記載の活性測定分子である。
(5)本発明の第 5の態様は、前記蛍光標識した生体分子の数力^〜 40であり、及び Z又は前記蛍光標識して 、な 、生体分子の数力^〜 40であることを特徴とする上記 (1)乃至 (4)の 、ずれかに記載の活性測定分子である。
(6)本発明の第 6の態様は、前記生体分子が、核酸、タンパク質、ペプチド、アミノ酸 、補酵素、糖、糖鎖、脂質、それらの誘導体、及びそれらの複合体からなるグループ より選択されることを特徴とする上記（1)乃至（5)の ヽずれかに記載の活性測定分子 である。
(7)本発明の第 7の態様は、前記生体反応が酵素反応であることを特徴とする上記（ 1)乃至（6)の 、ずれかに記載の活性測定分子である。
(8)本発明の第 8の態様は、前記酵素が、核酸分解酵素、核酸修飾酵素、タンパク 質分解酵素、タンパク質修飾酵素、糖鎖分解酵素、糖ヌクレオチド合成酵素及び糖 転移酵素からなるグループより選択されることを特徴とする上記（7)に記載の活性測 定分子である。
(9)本発明の第 9の態様は、前記酵素が、核酸分解酵素であり、前記生体分子が核 酸であることを特徴とする上記（8)に記載の活性測定分子である。
(10)本発明の第 10の態様は、前記酵素が、タンパク質分解酵素であり、前記生体 分子がペプチドであることを特徴とする上記 (8)に記載の活性測定分子である。
(11)本発明の第 11の態様は、前記蛍光分子が BFP、 CFP、 GFP、 YFP、 RFPを 代表とする蛍光蛋白質とその変異体から選択されることを特徴とする上記（1)乃至（1 0)の 、ずれかに記載の活性測定分子である。
(12)本発明の第 12の態様は、上記（1)乃至 (6)のいずれかに記載の第 1の生体分 子を結合した 1以上の活性測定分子と蛍光分子で標識した又は標識しない 1以上の 第 2の生体分子力 なる試験サンプルを混合し、量子ドット上の第 1の生体分子と第 2 の生体分子が相互作用するために適した条件下でインキュベートし、インキュベート の間又はインキュベート後、各量子ドットに適した波長で各量子ドットを励起し、各量 子ドット上に結合している第 1の生体分子及び Z又は各第 2の生体分子に結合した 蛍光標識など、系に存在するすべての蛍光分子から得られる蛍光強度の変化を検 出することを含んでなる、生体分子の相互作用複数同時解析方法である。
(13)本発明の第 13の態様は、前記量子ドット上の第 1の生体分子が、核酸、タンパ ク質、ペプチド、糖、糖鎖、それらの誘導体、及びそれらの複合体力 なるグループよ り選択されることを特徴とする上記（12)に記載の方法である。
(14)本発明の第 14の態様は、前記第 2の生体分子が、核酸、タンパク質、ペプチド 、糖、糖鎖、それらの誘導体、及びそれらの複合体力 なるグループより選択されるこ とを特徴とする上記（ 12)又は（ 13)に記載の方法である。
(15)本発明の第 15の態様は、前記試験サンプルが細胞抽出液、細胞培養上清、 血液、体液であることを特徴とする上記（12)乃至（14)の 、ずれかに記載の方法で ある。
(16)本発明の第 16の態様は、上記（7)乃至（11)のいずれかに記載の 1以上の活 性測定分子の混合物と、活性検出の対象である 1以上の酵素を混合し、該混合物を 該酵素の活性に至適な条件下でインキュベートし、インキュベートの間又はインキュ ペート後、各量子ドットに適した波長で各量子ドットを励起し、各量子ドット及び各基 質に結合した蛍光標識など系に存在するすべての蛍光分子から得られる蛍光強度 の変化を検出することを含んでなる、酵素活性複数同時解析方法。
(17)本発明の第 17の態様は、前記酵素の少なくとも 1つがタンパク質分解酵素であ ることを特徴とする上記（16)に記載の方法である。
(18)本発明の第 18の態様は、活性測定分子の混合物に、前記酵素の蛍光標識し た第 2の基質をさらに混合することを特徴とする上記（16)又は（17)に記載の方法で ある。
(19)本発明の第 19の態様は、前記活性測定分子の混合物中に含まれる量子ドット の蛍光特性が相互に異なるものであることを特徴とする上記（ 12)乃至（ 18)のいず れかに記載の方法である。
発明の効果
[0012] 本発明の活性測定分子ならびに方法を用いることで、従来測定が困難であった環 境における生体反応の解析が可能になる。
[0013] 本発明の活性測定分子 (バイオプローブとも称する）は、活性測定に要する基質な どの集積度が高いこと、また、該分子に使用されるモル吸光係数が従来使用されて いる蛍光色素と比較して〜 10倍以上であることなどから、該活性測定分子はシグナ ルの増幅等を要せず超高感度な測定分子であり、該分子を使用する本発明の方法 は、感度の高い結果を提供することができる。
[0014] 本発明の活性測定分子ならびに方法を用いることで、複数の生体反応、状態変化 を同時に測定することが可能な、従来存在しないプロテインチップの作製が可能とな り、プロテオーム解析など得られる情報が飛躍的に増えるば力りではなぐチップ化が 可能である事により網羅的な解析の進展に貢献することができる。この様なチップは 病態診断や創薬スクリーニングチップにも利用可能となる。
[0015] 本発明の活性測定分子ならびに活性測定方法により、該活性測定分子を細胞内 あるいは個体内に取り込ませることが可能となるため、インビボ (in vivo)で実際に生 じている生命現象を可視化してとらえることが可能となり、上述のインビトロ（in vitro )の場合のみならず、病態の診断、創薬スクリーニングなどに役立つことが期待される 図面の簡単な説明
[0016] [図 1]図 1は DNaseアツセィに用いた基質 DNA (レーン 2、 3 ;PCR product)、量子ド ットに結合させた基質 DNAを（レーン 4、 6 ; Q dots+PCR product)ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動を行い、 SYBRGreenl (Promega Corp.)染色した結果を示す。レーン 1 は 100ベース DNAマーカー（100 bp ladder)を、レーン 5 (Q dots)は量子ドットのみ を泳動した。
[図 2]図 2は、量子ドットのみ、量子ドットに蛍光標識した基質 DNAを結合させたもの 、量子ドットに蛍光標識した基質 DNAを結合させ DNase処理したものに関し、 FRE Tを測定した結果を示す。
[図 3]図 3は、量子ドット（QD525)上に PCR product (dUTP-Alexa 532でラベルした） を固定化し DNase処理を行った場合の FRETの測定結果を示す。未処理（四角）で は、 FRETが観察されている力 DNase処理（三角）により解消している。丸のグラフ は DNase処理した試料をより高感度な条件で測定したものである。
[図 4]図 4は、 QD 525上に ssDNA (—本鎖 DNA)を固定化（プライマーは予めハイブ リダィズさせた）した後、 Klenow fragmentによる処理を行い、 FRETを観察した結果を 示す。三角は Klenow fragment無処理、丸は Klenow fragmentで処理したものの観察 結果である。
[図 5]図 5は、タンパク質分解酵素の認識ペプチド配列と GFP又は RFPとのキメラタン パク質のアミノ酸配列を示す図である。 Aはトリプシンと GFP、 Bはキャスパーゼ一 3と GFP、 Cはキャスパーゼー 9と GFP、 Dはカテブシン Eと GFP、 Eはキャスパーゼー 3 と RFPとの組換えタンパク質のアミノ酸配列である。挿入配列を斜字で示し、酵素の 認識配列に下線を付した。
[図 6]図 6は、トリプシン活性を FRETにより測定した結果を示す。トリプシン処理により 、蛍光強度のピーク波長が 513nmから 508nmへ移動した。
[図 7]図 7は、キャスパーゼ— 3活性を FRETにより測定した結果を示す。トリプシン処 理により、蛍光強度のピーク波長が 510nmから 506nmへ移動した。
[図 8]図 8は、量子ドット（QD)のみを各々 pH環境にさらして蛍光スペクトルを観察した 結果を示す。 pH7以上では殆ど変化が無い。
[図 9]図 9は、 pH感受性蛍光色素のみを各々 pH環境にさらして蛍光スペクトルを観 察した結果を示す。 pH7. 9前後で大きく変化が出るが、それぞれ、 pH7. 9以下及 び pH7. 9以上ではほぼ変化が見られない。また、 Exは励起蛍光スペクトル、 Emは 最大励起波長により得られる蛍光スペクトルである。
[図 10]図 10は、量子ドット上に pH感受性蛍光色素を固定化し各々の pH環境にさら して蛍光スペクトルを観察した結果を示す。波形パターンとしてはそれぞれの変化を 強調する形になっており結合のメリットが出た。量子ドットのみの蛍光スペクトルを参 照のため Not modifiedとして図中に示した。
[図 11]図 11は、 DNA分解酵素活性とタンパク質分解酵素活性を同時に測定した結 果を示す。 +と一は、各酵素の処理の有無を示す。
発明を実施するための最良の形態
本発明における実施態様の 1つは、量子ドット上に、生体反応又は生体内状態変 化の対象となる、蛍光分子で標識した生体分子及び Z又は標識しな 、生体分子を 1 以上結合していることを特徴とする生体反応及び Z又は生体内状態変化の複数同 時解析用活性測定分子である。
ここで本発明の「活性測定分子」は、生体反応又は生体内状態変化等の対象とな る生体分子、又は、該生体分子 (例えば、タンパク質、核酸、脂質、糖など)の結合パ 一トナー (例えば、タンパク質、核酸、脂質、糖など)などに蛍光分子標識したもの又 は蛍光分子標識していないものを量子ドット上に結合させたものである。ここで、蛍光 標識をして 、な 、ものを量子ドット上に結合させたものは、該蛍光標識をして 、な 、 生体分子と結合する第 2の生体分子との結合様式を検出するために使用することが できる。「生体分子」とは、生体内において、機能的又は構造的な役割を担って存在 する全ての分子のことであり、例えば、核酸、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、補酵素 、糖、糖鎖、脂質、又はそれらの誘導体及び複合体 (例えば、糖タンパク質、糖脂質 など）、各種酵素 (例えば、核酸分解酵素、核酸修飾酵素、核酸合成酵素、タンパク 質分解酵素、タンパク質修飾酵素、糖鎖分解酵素、糖ヌクレオチド合成酵素又は糖 転移酵素）、酵素反応の基質 (例えば、タンパク質、核酸、脂質、糖など)などが含ま れる。
ここでいう「生体反応」には、生体分子同士の反応の全てが含まれ、例えば、酵素 反応などがその典型的な例である。また、「生体内状態変化」とは、化学反応は生じ ない場合であっても、生体分子同士の相互作用などの結果、 1の生体分子が分解し たり、 2の生体分子が結合して一体化するような状態変化の全てが含まれる。さら〖こ、 生体分子同士の相互作用のみならず、測定対象である生体分子の濃度 (反応中に 起きる関連分子の濃度変化など、例えば、カルシウムイオン濃度変化、プロトンの濃 度変化である pH変化など)や膜電位、酸化還元状態なども本発明の生体内状態変 化に含まれる。
「量子ドット」は、半導体原子が数百個から数千個集まった 10数 nm程度の小塊のこ とであり、 1970年代米国 Bell研究所の Louis Brus博士ら及び旧ソビエト Yoffe研究 所の Alexander Efros博士並びに Alexie Ekimovらによりその製法が考案されたもの で、コア技術は米国特許第 5990479号に記載された発明に基づいている。現在で もその製造方法について技術的改良が盛んに行われている力 電子線リソグラフィ 一などを用いて二次元的な量子井戸を切り分けたり、一次元の量子細線を切り分け たりする方法、 Stranski-Krastanovモードの結晶成長による方法などが代表的な製造 方法である。また、製造品については、米国 Quantum Dot Corp.などから購入 することも可會である。
本発明の活性測定分子に用いられる生体分子に蛍光標識色素 (蛍光分子)を導入 する場合には、量子ドットとの間で蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET)または蛍光 2分 子のゆらぎを検出する（FCCS)ことができるような蛍光標識色素であれば、いかなる ものでも利用可能である。限定はしないが、例えば、そのような蛍光標識色素として、 Alexa dye, BODIPY、 Cy dye, quencherなどが好適に利用可能である。
[0019] 本発明の活性測定分子に用いられる生体分子を蛍光標識する場合、該生体分子 の種類および特性に応じて標識ィ匕することができる。例えば、該生体分子が DNAで ある場合には、該 DNAの末端を標識するか、あるいは、 DNA全体を標識することが 可能である。当該方法は当該技術分野にぉ 、て公知の方法に基づ 、て行うことがで きる。生体分子がタンパク質、脂質、糖である場合も同様に公知の技術によって行う ことができる。
[0020] 本発明の活性測定分子は、 FRETを検出する方法又は FCCS法などを適用するこ とにより、目的の生体反応、生体変化などの検出を可能ならしめるものである。この場 合、量子ドットと蛍光標識生体分子との間で FRETが観測され、または FCCS法が適 用可能である必要がある。 FRETにおいては、量子ドットと蛍光標識生体分子との間 を、一定の距離の範囲内にするなどの条件が必要となるが、量子ドットの量子収率が 高いため通常の蛍光色素分子間でこの現象を観察する場合に比してその適応範囲 は広くなる。一方、 FCCSにおいては特に距離的制限は無ぐ反応後の 2分子の分 子量に差がある程良好な感度が得られる。量子ドット上には複数の生体分子固定を 想定して!/、るため反応後の分子量差を実現し易く成って 、る。これらの条件にっ 、て は、当業者の通常の技術常識に基づいて選択可能である。
[0021] 本発明の活性測定分子は、液体中などの流動状態においても、または基盤などの 支持体に固定した状態においても、使用することができる。支持体に固定する場合に は、例えば、アビジンコート等された量子ドットの場合には、そのままあるいはビォチ ン誘導体を介してマイクロプレートに固定ィ匕可能であるし、また、抗体コートされた量 子ドットの場合には、抗体固定化 (プロテイン A又はプロテイン Gカラムなど)カラム等 を用いてに固定ィ匕することができる。さらにいずれの場合もヒスチジンタグをタンパク 質中に持たせる事が出来、 Ni2+— NTAなどで活性化されたチップ、金基盤上に容 易に固定化出来る。
[0022] 本発明の活性測定分子を製造するにあたり、量子ドットと生体分子との結合は、当 該分野において公知の方法により行うことができ、共有結合でも、非共有結合 (例え ば、配位結合 (例えば、 His tag— ΝΓ^— ΝΤΑ)や抗原抗体反応を利用する、ので もよい。また、ピオチン一アビジン結合も利用することができる。概略を説明すると、蛍 光標識した生体分子 (タンパク質、 DNA、糖鎖など）をピオチンィ匕し、アビジンコート した量子ドットを混合してピオチン アビジン結合を形成させ、該結合を介して、量子 ドット上に生体分子を結合することができる。ここで、生体分子をピオチン化する場合 、該生体分子がタンパク質などである場合には、アミノ基反応性ピオチン化試薬であ るピオチン NHS -エステルある!/ヽはスルフォー NHS -エステルをアミノ酸残基ゃタ ンパク質の N末端と反応させることにより達成され、すなわちアミノ酸残基特異的反応 性ピオチンか試薬であればすべて適応可能で、また、生体分子が核酸もしくは糖鎖 の場合、これらをァミノ化誘導体とした後、アミノ基反応性ピオチン化試薬と反応させ る、などの様にピオチンカゝ試薬の反応基に対応した誘導体を得ることにより達成され る。
また、上記抗体やアビジンでコートされた量子ドットを用いる方法以外では、例えば 、量子ドット上に存在する官能基 (例えば、—COOH、 -NH
2など）を介して結合さ せる方法なども利用可能である。これらの方法に適した量子ドットが市販されており、 これらの市販品を使用することもできる。
本発明における他の実施態様は、量子ドット上に、生体反応又は生体内状態変化 の対象となる生体分子ペプチドであって、蛍光分子と共有結合して!/、る生体分子を 少なくとも 1つ結合していることを特徴とする生体反応及び Z又は生体内状態変化の 複数同時解析用活性測定分子である。本実施態様における活性測定分子は単一の 生体反応等を測定する上でも有用なツールとなり得る。使用可能な「蛍光分子」は、 当業者において既知の如何なる蛍光分子でも使用可能であり、例えば、蛍光タンパ ク質などが使用可能であり、 BFP、 CFP、 GFP、 YFP、 RFPを代表とする蛍光蛋白 質とその変異体などが好ましい。また、本実施態様において使用可能なペプチドは、 生体内においてそれ自体機能しているものでも、また、タンパク質の機能領域等に相 当するペプチド部分でもよい。また、当該ペプチドは、特定のタンパク質の機能ドメイ ン又は機能領域に相当する配列など、タンパク質の一部であってもよい。本ペプチド としては、例えば、タンパク質分解酵素の認識配列、タンパク質リン酸化酵素の認識 配列、糖転移酵素の認識配列、核酸結合配列、など、ある生体内分子によって認識 され、該生体内分子との相互作用が期待され、相互作用の結果、量子ドットと蛍光分 子間における FRET等に影響を及ぼすもの、又は、該ペプチドが分解等される結果 、 FRET等に影響を及ぼすものであれば、いずれも使用することができる。
[0024] 蛍光分子と生体分子の間における結合は、特に結合様式は問わないが、蛍光タン ノ ク質の場合には、遺伝子工学的手法を適用することができる理由から、ペプチド結 合が望ましいが、それ以外の共有結合、例えば、ホスホロチォエート結合、ホスホロジ チォエート結合、ホスホラミドチォエート結合、ホスホラミデート結合、ホスホルジアミ デート結合、メチルホスホネート結合なども使用可能である。非共有結合では配位結 合 (例えば、 His tag— Ni2+— NTA)や包接 (結合させたシクロデキストリンに蛍光 分子を包接させる）などが使用可能である。
蛍光タンパク質とペプチドを共有結合させる場合、両者の位置関係は、反応の前後 で大きな FRET変ィ匕、 FCCSなどが観測可能な位置関係にある必要がある。例えば 、蛍光タンパク質として、 GFP、 RFPやその色変異体などを使用する場合、 GFP、 R FPの N末端、 C末端、 11本の j8鎖をつなぐ 11本のループ領域のいずれかに挿入す ることができる。この場合、当該ペプチドと蛍光タンパク質又は量子ドットとを直接結 合させてもよいが、場合によっては、スぺーサ一となるいくつかアミノ酸（1〜20程度） を挿入してもよい。
[0025] 本発明におけるその他の実施態様は、上記活性測定分子を用いて、量子ドットと蛍 光分子標識した生体成分間に生じる蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET)を生体反応 の状態変化としてモニターし、あるいは、量子ドットと該標識した生体成分間で観察さ れる蛍光 2分子のゆらぎを蛍光相互相関分光法 (FCCS)によって検出することにより 生体反応、例えば、タンパク質同士、タンパク質と核酸、核酸同士、タンパク質と糖鎖 などの結合や解離反応、あるいは、酵素反応をモニターすることである。
量子ドット上に標識された生体分子が結合している状態において、最も高い効率の FRETが検出される。また、 FCCS法を適用する場合、量子ドットと標識された生体 分子が同一分子としてのゆらぎのノターンが検出される。ここで活性測定分子に含ま れる生体分子がタンパク質、核酸、糖鎖などの場合に、タンパク質分解酵素、核酸分 解酵素、糖鎖分解酵素で処理すると、生体分子が切断されることで、生体分子に標 識された蛍光分子が量子ドットから解離するため、 FRETが解消され、また、 2つの蛍 光分子が別の分子としての挙動を示しゆらぎのパターンが変化する。この過程を蛍 光分光光度計による FRET、蛍光寿命、時間分解蛍光等の測定、蛍光相互相関分 光計による FCCSの測定及びそれらの測定対応蛍光マイクロプレートリーダーを用い て解析することで酵素活性のモニターが可能である。
[0026] また、酵素が転移酵素である場合には、量子ドット上に標識されていない基質を結 合させ、標識された第 2の基質が転移酵素によって転移された結果生じる FRETを 検出するか、あるいは、ばらばらに挙動する蛍光分子が 1つの蛍光分子としての挙動 を示すゆらぎパターンへの変化を測定することにより、活性のモニターが可能である さらに、タンパク質同士、タンパク質と核酸、核酸同士、タンパク質と糖鎖などの結 合反応に関しては、一方の生体分子を蛍光標識せずに量子ドット上に結合させた活 性測定分子を調製し、該活性測定分子と結合パートナーとなる蛍光標識した生体分 子を接触させた結果、 FRETの最も低い状態カゝら高い状態への変化が検出されるか 、または、独立した蛍光分子としてのゆらぎパターンが 1つの大きな分子上にある 2つ の蛍光分子としてのゆらぎパターンに変化した場合には、両生体分子が結合または 相互作用し得ると判断することができる。
[0027] 量子ドットは蛍光波長の青色側に広い吸収帯を持ち励起波長によらず狭い蛍光を 示せるのが特徴であるため、異種の量子ドットを同波長で励起し、異蛍光波長を同時 に得る事が可能である。励起波長は、使用する量子ドットの特性にもっとも適した波 長が望ましぐ例えば、 300から 500nm、好ましくは、該活性測定系に存在するすべ てのァクセプターの励起波長からより離れた波長を用いるのが良ぐ用いた量子ドット の特' 14【こ応じて 490nm、 525nm, 565nm, 585nm, 605nm, 655nm【こ 光を示 すことが予想される。
従って、異なる生体反応又は生体内状態変化を測定するための生体分子を結合さ せた蛍光特性の異なるドットを共存させた場合にぉ 、ても、同一の波長で異なる蛍光 特性を有する量子ドットの全てを励起することができることから、複数の生体反応を同 時にモニターすることができる。例えば、 1の量子ドットには、蛍光標識した DNAを結 合させ、 2の量子ドットには別の蛍光標識を行ったタンパク質を結合させ、 3の量子ド ットには蛍光標識しない糖鎖を結合させて活性測定分子を調製した場合、 DNA分 解酵素、タンパク質分解酵素、糖転移酵素及び蛍光標識した糖を含んだ試験サンプ ル (精製した酵素などの混合物、または細胞抽出物、培養上清など)を該活性測定 分子と混合し、適切な条件下でインキュベートしている間に励起波長を照射すること によって得られる蛍光波長の特性変化を、 FRET変化検出法又は FCCS法によって 解析することにより、上記 3種の酵素活性を確認することが可能となる。さらに、蛍光 標識しないタンパク質を結合させた量子ドットと蛍光標識したタンパク質の混合ではタ ンパク質間相互作用を検出することができ、生体分子との結合 (金属イオンをキレート するなども含め）によりその蛍光特性が変化する環境依存型蛍光色素を適切なスぺ ーサ一分子等を用いて量子ドットに結合させた場合には、該生体分子の濃度変化を FRET変化検出法に適応する事も可能である。
以上のように、本発明の方法は、多くの生体反応又は生体内状態変化の複数同時 解析に適用することができる。
[0028] 量子ドットに励起波長を照射するタイミングは、試験物質をインキュベートしている 間、又はインキュベートの後のいずれであってもよい。リアルタイムで何らかの活性、 反応を見たい場合はインキュベート中に励起波長を照射するのが好ましぐ最終的な 活性の確認を行うのであれば、インキュベート後に励起波長を照射すればよい。従来 の蛍光色素を用いて、生体内反応のリアルタイムでの逐次観察を試みようとすると、 非常に短い時間で蛍光退色が生じ、良好の結果を得ることが非常に困難であった。 これに対し、本発明の方法を用いると、量子ドットが半導体であることから蛍光の保持 がある程度長時間可能であり、比較的遅い反応のリアルタイムモニターをも可能にす る。
[0029] 本発明の活性測定分子はキットの形態で、容器、パック中に使用説明書と共に含 めることができる。本発明の活性測定分子がキットとして供給される場合、該活性測 定分子の機能を失うことなく長期間の貯蔵を可能ならしめる形態にて包装されるのが 好ましい。 キット中に含まれる活性測定分子は、構成成分が活性を長期間有効に持続し、容 器の材質によって吸着されず、変質を受けないような何れかの種類の容器中に供給 される。例えば、封着されたガラスアンプルは、窒素ガスのような中性で不反応性ガス の下において包装されたバッファーを含む。アンプルは、ガラス、ポリカーボネート、 ポリスチレンなどの有機ポリマー、セラミック、金属、又は試薬を保持するために通常 用いられる他の何れかの適切な材料など力も構成される。他の適切な容器の例には 、アンプルなどの類似物質力 作られる簡単なボトル、及び内部がアルミニウム又は 合金などのホイルで裏打ちされた包装材が含まれる。
[0030] また、キットには使用説明書も添付される。当該活性測定分子から成るキットの使用 説明は、紙又は他の材質上に印刷され、及び Z又はフロッピー（登録商標）ディスク
、 CD-ROM, DVD-ROM, Zipディスク、ビデオテープ、オーディオテープなどの 電気的又は電磁的に読み取り可能な媒体として供給されてもよい。詳細な使用説明 は、キット内に実際に添付されていてもよぐあるいは、キットの製造者又は分配者に よって指定され又は電子メール等で通知されるウェブサイトに掲載されていてもよい。
[0031] 以下に実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
実施例
[0032] 〔実施例 1〕
DNA分解酵素の活件沏 I定
1.活性測定分子の調製
DNA分解酵素の活性を測定するための実施例を示す。
基質となる二重鎖 DNAは、 5 ' AG AACC ACTCCC AGC AGC AGTTAC AAA CTC3 ' (配列番号 1)及び 5 'ACTCCAATTGGCGATGGCCCTG3 ' (配列番号 2)のプライマーセットを使用し、 UV5casS22tagをコードしているプラスミド（非特許 文献 2を参照のこと）をテンプレートにして PCR法により一部を (およそ 150mer)増幅 し、増幅された産物は、電気泳動により塩基長の確認を行った。具体的には、 dUTP Alexa (Alexa Fluor 568— 5dUTP又は Alexa Fluor 532— 5dUTP, Moleclar Probes社）を 、 PCR反応液に加え（dATP、 dCTP、 dGTPを各 0. 2mM、 0. 14mM dTTPを含 み、 Alexa- dUTPは、 0. 05mM濃度になるように添カ卩した）、 94°C2分後、 94°C30 秒、 63°C30秒、 72°C30秒を 30サイクル、最後に 72°C7分の反応条件にて PCR反 応を行わせ、 Alexa dyeで標識した DNaseの基質となる DNAを調製した。また、配 列番号 1又は 2で示される配列力 なるプライマーの末端をピオチンラベルしておくこ とで、アビジンコートした量子ドット (住商バイオサイエンス株式会社)と容易に結合す ることができた。この結合反応は、 PCR後精製した二本鎖 DNAと量子ドットを添付バ ッファー中にて（組成 2% BSA in 50mM borate, pH8. 3 with 0. 05% sodium azide)室温で 2時間インキュベートの条件で行った。量子ドットはアビジン コートにより多価となっているため、複数の基質 DNAの結合が可能である（図 1)。
[0033] 2. DNA分解活性の測定
1分子の量子ドット（FRETのドナー）に対し複数個 Alexa dyeでラベルされた多数 の基質 DNA (FRETのァクセプター）が結合しても量子ドットの量子収率は極めて高 く効率の良い FRETが観察された（図 2、図 3)。このようにして調製した活性測定分 子に DNase (Promega社）を混合し、 37°Cにて 60分インキュベートし、基質 DNAの 分解反応を行わせたところ、 FRETの解消が観察された（図 2、図 3)。
[0034] 3.考察
本測定を量子ドットの代わりに GFPなどを用いると、 GFPと DNAを一対一で結合さ せた場合、 DNAに取り込まれた複数の蛍光ラベルが、 GFPの蛍光量子収率以上（ ラベルされた蛍光分子の蛍光のみとなる）になると高効率の FRETが観察されず、基 質として使用することができなくなる欠点を呈することとなる。
さらに、 GFPと DNAを有機化学的に共有結合させる場合、タンパク質と核酸の効 率の良い結合方法はこれまでに殆ど知られていない。最近、 150merまでの dsDNA をタンパク質に効率よく結合させる方法が報告された。し力しながら、この方法論では 煩雑なステップを経なければならな ヽ事ゃモニターした ヽ DNaseの種類によっては 活性測定プローブとして成立するためには 150mer程度では不十分であると考えら れることから従来の方法では限界がある。それに対し、本実施例は簡潔なステップで あるば力りではなぐより長鎖にすぐさま応用可能であると思われる。
[0035] 〔実施例 2〕
DNAポリメラーゼ活性の測定 1.活性測定分子の調製
活性測定分子は、量子ドット（QD525)上に、予めプライマーをハイブリダィズさせ た ssDNA (—本鎖 DNA)を、上述の方法により固定ィ匕して調製した。
2. DNA分解活性の測定
調製した活性分子に対し、 DNAポリメラーゼとして、 Klenow fragment (タレノウ フラグメント）を用いて、 DNA鎖伸長反応を行わせた。その結果、 DNAポリメラーゼ で処理する前は、 FRETを観察することができな力つたが（最低の状態）、 DNAポリメ ラーゼ処理により、 FRETが観察されるようになった (最高の状態）（図 4)。
〔実施例 3〕
トリプシンの活件沏 I定
1. トリプシン感受性部位の GFP標識及び活性測定分子の調製
本実施例、生体分子としてトリプシン感受性部位を含むペプチドを用い、トリプシン の活性測定を行ったものである。
トリプシン感受性部位を含むペプチド (配列番号 3)力 図 5Aに示すように GFPの C 末端領域に挿入され、さらにその C末端側に Hisタグが付加されるように、 GEP—トリ プシン認識ペプチド挿入改変タンパク質の発現ベクターを構築した。本発現ベクター は、非特許文献 1に示した力 ¾ET21a (NOVAGEN社）に PCRにより GFPUV5配列 を組み込みさらにその C末端領域に、配列番号 4で示されるアミノ酸配列をコードす る DNA断片を挿入することで構築した。構築した発現ベクターを用い、 GEP—トリプ シン認識組換えタンパク質を発現させ、 Hisタグを利用して、認識ペプチド挿入組換 えタンパク質精製を行った。
ァミン（Amine)処理された量子ドット（Amine Evitag Lake Placid Blue, Evident Tec hnologie社)とァミン基と反応可能なホモ二価性架橋試薬をインンキュペートし (0. 1 μ Μ 炭酸バッファ一中）、未反応のホモ二価性架橋試薬を限外濾過スピンカラムに て除去する。得られた量子ドットと Ni—NTAのァミン誘導体をさらにインキュベートす る（0. 炭酸バッファ一中）。 Ni— NTAの結合した量子ドットより限外濾過スピ ンカラムにて未反応の Ni—NTAのァミン誘導体の除去及びバッファー置換を行い（ リン酸バッファー）精製した認識ペプチド挿入組換えタンパク質とインキュベートすると 、 Hisタグ部位を介して、認識ペプチド挿入組換えタンパク質を量子ドット上に固定ィ匕 することができる。
[0037] 2.トリプシンの活性測定
上述のように調製した活性測定分子にトリプシンを添加し、 37°C120分のインキュ ベートを行ったところ、 FRETの解消が観察された（図 6)。つまり、蛍光強度のピーク 波長が、トリプシン処理によって 513nm (トリプシン未処理）から 508nm (トリプシン処 理）に変化した。
従来、量子ドットを用いたタンパク質分解酵素活性の測定においては、酵素と基質 とのインキュベーションに極めて長時間（〜47時間）必要であったため、真の酵素活 性を反映しているか疑わしい点が存在していた。これに対し、本実施例において、本 発明の構成をとることにより、合理的なインキュベーション時間により、明確な測定結 果が得ることができた。
[0038] 〔実施例 4〕
キャスパーゼー 3の活件測定
1.キャスパーゼ 3感受性部位の GFP標識及び活性測定分子の調製
本実施例、生体分子としてキャスパーゼー 3を含むペプチドを用い、トリプシンの活 性測定を行ったものである。
キャスパーゼー 3感受性部位を含むペプチド (配列番号 5)力 図 5Bに示すように G FPの C末端領域に挿入され、さらにその C末端側に Hisタグが付加されるように、 GE P -キャスパーゼ 3認識ペプチド挿入組換えタンパク質の発現ベクターを構築した 。本発現ベクターは、上述のトリプシン活性を測定する場合と同様にして調製した。
2.キャスパーゼー 3の活性測定
上述のように調製した活性測定分子にキャスパーゼ— 3を（Medical & Biological La boratories社）添カ卩し、 30°C 120分のインキュベートを行ったところ、 FRETの解消が 観察された (図 7)。
従来、量子ドットを用いたタンパク質分解酵素活性の測定においては、酵素と基質 とのインキュベーションに極めて長時間（〜47時間）必要であったため、真の酵素活 性を反映しているか疑わしい点が存在していた。これに対し、本実施例において、本 発明の構成をとることにより、合理的なインキュベーション時間により、明確な測定結 果が得ることができた。つまり、蛍光強度のピーク波長が、キャスパーゼー 3処理によ つて 510nm (トリプシン未処理）から 506nm (トリプシン処理）に変化した。
なお、キャスパーゼー 9 (図 5Cに、実験に使用した GEP キャスパーゼー 9認識べ プチド挿入改変タンパク質のアミノ酸配列を示す）、カテブシン— E (図 5Dに、実験に 使用した GEP—カテブシン E認識ペプチド挿入改変タンパク質のアミノ酸配列を 示す）に関しても同様に使用可能である。
また、上記トリプシン及びキャスパーゼ一 3の実施例は 、ずれも GFPを用いて 、る が RFPを用いた場合も概ね同様の結果が得られている。さらに、 GFP又は RFPの N 末端側に酵素認識ペプチドを配置した場合も、同様の結果に使用可能である。
[0039] 〔実施例 5〕
の沏 I
ァミン処理された量子ドット（Amine Evitag Lake Placid Blue , Evident Technologies 社）に Traut試薬を反応させアミン基をチオール基に変換する。この量子ドットと pH 感受性蛍光色素 (慶応大学小松広和博士より分譲)のマレイミド誘導体 (チオール基 反応性)をリン酸バッファ一中でインキュベートし量子ドット上に pH感受性蛍光色素 を結合させる。未反応の pH感受性蛍光色素をゲル濾過カラムにて除去する。得られ た pH感受性蛍光色素結合量子ドットをそれぞれ pHモニター用バッファーに分散さ せ、量子ドットを励起し蛍光スペクトルを測定した。ここで、量子ドット単体、 pH感受性 蛍光色素単体も同様の pHモニター用バッファー中にてそれぞれ蛍光スペクトルを測 定した。この結果量子ドット上に固定ィ匕した場合のみ pHに依存した大きな蛍光スぺ タトル変化が得られ (図 8、 9、 10)、 pH変化測定用分子を作製出来た事が示された。
[0040] 〔実施例 6〕
酵素活件の複数同時枪出
本実施例は、本発明の構成を用いて、核酸分解酵素とタンパク質分解酵素の各々 の活性を同時に検出した結果を示す。
DNA分解酵素活性の活性測定分子は、量子ドットとして QD525を、蛍光分子とし て Alexa532を用い、〔実施例 1〕と同様な方法で調製を行った。一方、タンパク質分 解酵素（ここでは、トリプシンを用いた）の活性測定分子は、量子ドットとして QD565 を、蛍光分子として GFP (図 5A)を用い、〔実施例 2〕と同様な方法で調製を行った。 調製した活性測定分子を 4つのチューブに分注して、 DNase未処理及びトリプシン 未処理（図 11、 一DNase— Trypsin)のチューブをコントロールとして、 DNase処理 及びトリプシン処理（図 11、 +DNase+Trypsin) )、 DNase処理及びトリプシン未処 理（図 11、 +DNase—Trypsin) )、 DNase未処理及びトリプシン処理（図 11、—D Nase+Trypsin) )を行ったチューブに対し FRETの測定を行った。その結果、図 11 に示す通り、 DNase未処理及びトリプシン未処理のチューブのピーク波長から、各処 理によって検出される蛍光強度のピーク波長のずれが観察された。詳細には、本実 施例の核酸分解酵素及びタンパク質分解酵素の同時測定においては、 DNase— Trypsinの波形パターンを基本とし、各酵素処理による波形パターンの変化を観察し 、各酵素の活性状況をモニターする。 510、 560、 600nm付近に 3つのピークが存 在する。 + DNase—Trpsinでは、核酸分解酵素のみの添カ卩である力 600nm付近 のピークが減少し 560nm付近のピークが増加した。 DNase+Trpsinではトリプシ ンのみの添加であるが、 510nm付近のピークがずれているが観察された。 +DNase +Trpsinは、両酵素を添加した場合であるが、上記 2点の変化の両方が観察された 。なお、 +Trpsinでトリプシンを添カ卩した場合、 560nm付近のピークの増加は、 DN Aを固定ィ匕している方の量子ドットの蛍光波長が観察されたものと思われるが、本実 施例の観察方法 (コントロールに対して波形パターンの変化を観察する方法）におい ては、特に、支障は出なかった。
以上の結果から、本発明の構成を用いることで複数の生体内反応を同時に検出で きることが分力つた。

Claims

請求の範囲
[I] 量子ドット上に、生体反応又は生体内状態変化の対象となる、蛍光分子で標識した 生体分子及び Z又は標識しない生体分子を 1以上結合していることを特徴とする生 体反応及び Z又は生体内状態変化の複数同時解析用活性測定分子。
[2] 前記生体分子がペプチドであり、該ペプチドが前記蛍光分子と共有結合又は非共 有結合で結合して 、ることを特徴とする請求項 1に記載の活性測定分子。
[3] 前記共有結合がペプチド結合であることを特徴とする請求項 2に記載の活性測定 分子。
[4] 前記量子ドットをアビジンでコートし、前記生体分子をピオチン化して、ピオチン アビジン結合を介して、前記生体分子が量子ドットに結合することを特徴とする請求 項 1乃至 3のいずれかに記載の活性測定分子。
[5] 前記蛍光標識した生体分子の数が 0〜40であり、及び Z又は前記蛍光標識してい ない生体分子の数力^〜 40であることを特徴とする請求項 1乃至 4のいずれかに記 載の活性測定分子。
[6] 前記生体分子が、核酸、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、補酵素、糖、糖鎖、脂質、 それらの誘導体、及びそれらの複合体力 なるグループより選択されることを特徴と する請求項 1乃至 5のいずれかに記載の活性測定分子。
[7] 前記生体反応が酵素反応であることを特徴とする請求項 1乃至 6のいずれかに記 載の活性測定分子。
[8] 前記酵素が、核酸分解酵素、核酸修飾酵素、核酸合成酵素、タンパク質分解酵素 、タンパク質修飾酵素、糖鎖分解酵素、糖ヌクレオチド合成酵素及び糖転移酵素か らなるグループより選択されることを特徴とする請求項 7に記載の活性測定分子。
[9] 前記酵素が、核酸分解酵素であり、前記生体分子が核酸であることを特徴とする請 求項 8に記載の活性測定分子。
[10] 前記酵素が、タンパク質分解酵素であり、前記生体分子がペプチドであることを特 徴とする請求項 8に記載の活性測定分子。
[II] 前記蛍光分子が、 BFP、 CFP、 GFP、 YFP、 RFPを代表とする蛍光蛋白質とその 変異体力も選択されることを特徴とする請求項 1乃至 10のいずれかに記載の活性測 定分子。
[12] 請求項 1乃至 6のいずれかに記載の第 1の生体分子を結合した 1以上の活性測定 分子と蛍光分子で標識した又は標識しない 1以上の第 2の生体分子からなる試験サ ンプルを混合し、量子ドット上の第 1の生体分子と第 2の生体分子が相互作用するた めに適した条件下でインキュベートし、インキュベートの間又はインキュベート後、各 量子ドットに適した波長で各量子ドットを励起し、各量子ドット、量子ドット上に結合し ている第 1の生体分子及び Z又は各第 2の生体分子に結合した蛍光標識など系に 存在するすべての蛍光分子力 得られる蛍光強度の変化を検出することを含んでな る、生体分子の相互作用複数同時解析方法。
[13] 前記量子ドット上の第 1の生体分子が、核酸、タンパク質、ペプチド、糖、糖鎖、そ れらの誘導体、及びそれらの複合体力 なるグループより選択されることを特徴とする 請求項 12に記載の方法。
[14] 前記第 2の生体分子が、核酸、タンパク質、ペプチド、糖、糖鎖、それらの誘導体、 及びそれらの複合体力もなるグループより選択されることを特徴とする請求項 12又は 13に記載の方法。
[15] 前記試験サンプルが細胞抽出液、細胞培養上清、血液、体液であることを特徴と する請求項 12乃至 14のいずれかに記載の方法。
[16] 請求項 7乃至 11のいずれかに記載の 1以上の活性測定分子の混合物と、活性検 出の対象である 1以上の酵素を混合し、該混合物を該酵素の活性に至適な条件下 でインキュベートし、インキュベートの間又はインキュベート後、各量子ドットに適した 波長で各量子ドットを励起し、各量子ドット及び各基質に結合した蛍光標識など系に 存在するすべての蛍光分子力 得られる蛍光強度の変化を検出することを含んでな る、酵素活性複数同時解析方法。
[17] 前記酵素の少なくとも 1つがタンパク質分解酵素であることを特徴とする請求項 16 に記載の方法。
[18] 活性測定分子の混合物に、前記酵素の蛍光標識した第 2の基質をさらに混合する ことを特徴とする請求項 16又は 17に記載の方法。
[19] 前記活性測定分子の混合物中に含まれる量子ドットの蛍光特性が相互に異なるも のであることを特徴とする請求項 12乃至 18のいずれかに記載の方法。
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