KR20100090003A

KR20100090003A - 제1형 당뇨병의 신규한 진단 마커

Info

Publication number: KR20100090003A
Application number: KR1020090009231A
Authority: KR
Inventors: 박상규; 박경수; 김성훈
Original assignee: 서울대학교병원; 서울대학교산학협력단
Priority date: 2009-02-05
Filing date: 2009-02-05
Publication date: 2010-08-13
Also published as: EP2395100A4; US8563327B2; US20120015383A1; WO2010090471A9; CN102308002A; WO2010090471A3; EP2395100A2; JP2012517014A; JP5571696B2; KR101067815B1; WO2010090471A2; EP2395100B1

Abstract

본 발명은 제1형 당뇨병의 신규한 진단 마커에 관한 것으로, 알라닌 tRNA 합성효소(alanyl-tRNA synthetase), 글리신 tRNA 합성효소(glycyl-tRNA synthetase), 아스파라긴 tRNA 합성효소(asparaginyl-tRNA synthetase) 또는 트립토판 tRNA 합성효소(tryptophanyl-tRNA synthethase)를 포함하는 제1형 당뇨병 진단용 조성물, 이를 포함하는 진단 키트 및 진단 방법을 제공한다. 본 발명의 조성물, 키트 및 방법은 환자의 시료로부터 손쉽게 제1형 당뇨병 여부를 진단할 수 있으므로 제1형 당뇨병의 조기 진단 및 확정을 위하여 사용할 수 있다.

아미노아실 tRNA 합성효소, 제1형 당뇨병, 진단, 마커

Description

제1형 당뇨병의 신규한 진단 마커{Novel diagnostic marker for type I diabetes mellitus}

본 발명은 제1형 당뇨병의 신규한 진단 마커에 관한 것으로, 아미노아실 tRNA 합성효소에 대한 항체를 유효성분으로 포함하는 제1형 당뇨병의 진단용 조성물에 관한 것이다.

당뇨병은 크게 제1형과 제2형 당뇨병으로 나눌 수 있는데 제1형 당뇨병은 유전적 감수성 및 바이러스 감염으로 인해 췌장에 면역학적 반응이 유발되고, β-세포가 선택적으로 파괴되어 발생하는 자가면역질환이며, 제2형 당뇨병은 인슐린 저항성이 선행하는 형으로 주요 병인으로는 비만, 인슐린 수용체의 감소, tyrosine kinase 활성도 감소, 근육조직과 지방조직의 muscle/adipose tissue type transportor의 감소, insulin receptor substrate-1(IRS-1)의 세포 내 결핍 등 복잡한 원인에 의해 발병하는 것으로 보고되고 있다.

그 중, 제1형 당뇨병은 전형적인 자가면역질환의 하나로 알려져 있고, 췌장 β-세포를 인식하는 자가활성화 T 세포에 의해 인슐린을 생성하는 췌장 β-세포가 파과되는 만성 질환이다. 체액성 및 세포성 면역 반응은 제1형 당뇨병과 주로 연관되어 있고, 여러 가지 섬-세포 항체에 대한 자가 항체가 제1형 당뇨병 환자의 혈장에 존재한다. 글루탐산 탈 카르복시화 효소(GAD65), 인슐린, 단백질 타이로신 인산화효소-연관 섬 항체 2(IA-2)에 대한 자가 항체가 HbA1C 및 c-펩티드 정량화와 함께 제1형 당뇨병을 진단하는 데에 사용된다. 조기 진단 및 정확한 판정은 조기에 의학적 치료를 가능하게 하여 제1형 당뇨병의 진행을 늦추는데 유용하기 때문에 임상적으로 중요하다. 자가 항체 진단을 사용한 민감도는 GAD65는 약 60 내지 80%, 인슐린은 40 내지 60%, IA-2는 30 내지 70%로 나타났다. 이들 세 자가항체를 조합하여도 제1형 당뇨병의 80 내지 90%정도만 커버할 수 있다. 따라서, 제1형 당뇨병의 조기 진단을 위한 새로운 자가항체진단법을 개발할 필요가 있어 왔다.

이에 본 발명자들은 아미노아실 tRNA 합성효소의 생리적 기능에 대해서 연구하던 중 이들에 대한 자가항체가 제1형 당뇨병 환자에 다수 존재하고, 이들을 그 항체에 대한 아미노아실 tRNA 합성효소를 통해 검출할 수 있음을 발견하여 아미노아실 tRNA 합성효소를 포함하는 제1형 당뇨병의 진단용 조성물을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 아미노아실 tRNA 합성효소의 신규한 용도를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아미노아실 tRNA 합성효소를 포함하는 제1형 당뇨병 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 제1형 당뇨병 진단 키트를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 제1형 당뇨병 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 시료로부터 항원-항체 반응을 통해 항-ARS 항체, 항-GRS 항체, 항-NRS 항체 및 항-WRS 항체로 이루어진 군에서 하나이상 선택된 항체를 검출하는 방법을 제공한다.

이하 본 발명의 내용을 보다 상세히 설명하기로 한다.

본 발명의 조성물은 아미노아실 tRNA 합성효소를 포함하며, 제1형 당뇨병의 진단의 목적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 아미노아실 tRNA 합성효소는 아미노산과 이에 대응되는 tRNA의 결합을 촉매하는 단백질로 본 발명의 아미노아실 tRNA 합성효소는 바람직하게는 알라닌 tRNA 합성효소(alanyl-tRNA synthetase, ARS), 글리신 tRNA 합성효소(glycyl-tRNA synthetase, GRS), 아스파라긴 tRNA 합성효소(asparaginyl-tRNA synthetase, NRS) 또는 트립토판 tRNA 합성효소(tryptophanyl-tRNA synthethase, WRS)를 단독으로 또는 조합으로 사용할 수 있다.

상기에서 알라닌 tRNA 합성효소, 글리신 tRNA 합성효소, 아스파라긴 tRNA 합성효소 및 트립토판 tRNA 합성효소는 이에 제한되지는 않으나, 각각 서열번호 1(ARS), 서열번호 2(GRS), 서열번호 3(NRS) 및 서열번호 4(WRS)로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 또한, 알라닌 tRNA 합성효소는 Genbank Accession No. D32020에 기재된 서열, 글리신 tRNA 합성효소는 Genbank Accession No. U09510에 기재된 서열, , 아스파라긴 tRNA 합성효소는 Genbank Accession No. D84273에 기재된 서열, 트립토판 tRNA 합성효소는 Genbank Accession No. M61715에 기재된 서열일 수 있다. 또한, 상기 알라닌 tRNA 합성효소, 글리신 tRNA 합성효소, 아스파라긴 tRNA 합성효소 및 트립토판 tRNA 합성효소는 각각 이들의 기능적 동등물을 포함한다.

상기 기능적 동등물이란 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성(즉, 동일성)을 갖는 폴리펩티드를 말한다. 예를 들면, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 것으로, 각각의 아미노아실 tRNA 합성효소(즉, ARS, GRS, NRS 또는 WRS)와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 여기서, "실질적으로 동질의 생리활성"이란 각각의 아미노아실 tRNA 합성효소의 활성을 보이는 것을 의미한다. 상기 기능적 동등물은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열 중 일부가 부가, 치환 또는 결실의 결과 생성될 것일 수 있다. 상기에서 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 또한 상기 기능적 동 등물에는 본 발명의 아미노아실 tRNA 합성효소의 아미노산 서열상에서 아미노산의 일부가 결실된 변형체도 포함된다. 상기 아미노산의 결실 또는 치환은 바람직하게는 본 발명의 아미노아실 tRNA 합성효소의 생리활성에 직접적으로 관련되지 않은 영역에 위치해 있다. 또한 아미노산의 결실은 바람직하게는 아미노아실 tRNA 합성효소의 생리활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다. 아울러 상기 아미노아실 tRNA 합성효소의 아미노산 서열의 양 말단 또는 서열 내에 몇몇의 아미노산이 부가된 변형체도 포함된다. 또한 본 발명의 기능적 동등물의 범위에는 본 발명에 따른 아미노아실 tRNA 합성효소의 기본 골격 및 이의 생리 활성을 유지하면서 일부 화학 구조가 변형된 유도체도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 아미노아실 tRNA 합성효소의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경이 이에 포함된다.

본 명세서에서 서열 상동성 및 동질성은 ARS, GRS, NRS 또는 WRS의 아미노산 서열과 후보 서열을 정렬하고 갭(gaps)을 도입한 후 각각의 아미노산 서열에 대한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 필요한 경우, 최대 백분율 서열 동질성을 수득하기 위하여 서열 동질성의 부분으로서 보존적 치환은 고려하지 않는다. 또한, ARS, GRS, NRS 또는 WRS의 아미노산 서열의 N-말단, C-말단 또는 내부 신장, 결손 또는 삽입은 서열 동질성 또는 상동성에 영향을 주는 서열로서 해석되지 않는다. 또한, 상기 서열 동질성은 두 개의 폴리펩티드의 아미노산 서열의 유사한 부분을 비교하기 위해 사용되는 일반적인 표준 방법에 의해 결정할 수 있다. BLAST 또는 FASTA와 같은 컴퓨터 프로그램은 두 개의 폴리펩티드를 각각의 아미노산이 최적으로 매칭되도록 정렬한다(하나 또는 두 서열의 전장서열을 따라 또는 하나 또는 두 서열의 예측된 부분을 따라). 상기 프로그램은 디펄트 오프닝 페널티(default opening penalty) 및 디펄트 갭 페널티(default gap penalty)를 제공하며 컴퓨터 프로그램과 함께 연계되어 사용될 수 있는 PAM250(표준 스코링 매트릭스 Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequence and Structure, vol 5, supp 3, 1978)와 같은 스코링 매트릭스를 제공한다. 예를 들어, 백분율 동질성은 다음과 같이 계산할 수 있다. 일치하는 서열(identical matches)의 총 수에 100을 곱한 다음 대응되는 스팬(matched span) 내의 보다 긴 서열의 길이와 두 서열을 정렬하기 위해 보다 긴 서열 내로 도입된 갭(gaps)의 수의 합으로 나눈다.

본 발명에 따른 ARS, GRS, NRS 또는 WRS는 천연에서 추출하거나 유전공학적 방법에 의해 작제될 수 있다. 예를 들면, 통상적인 방법에 따라 상기 ARS, GRS, NRS, WRS 또는 이의 기능적 동등물을 암호화하는 핵산을 작제한다. 상기 핵산은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(Biosearch 또는 Applied Biosystems 사에서 판매하는 것)을 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 작제된 핵산은 이에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 핵산의 발현을 조절하는 하나 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포 를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 핵산이 발현되기에 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 핵산에 의해 발현된, 실질적으로 순수한 폴리펩티드를 회수한다. 상기 회수는 당업계에 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 "실질적으로 순수한 폴리펩티드(substantially pure polypeptide)"라 함은 본 발명에 따른 폴리펩티드가 숙주세포로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 폴리펩티드 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., Second(1998) and Third(2000) Editions Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie & Fink(eds.), Academic Press, San Diego, Calif, 1991; 및 Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:12073-12080, 1990.

또한, 본 발명의 ARS, GRS, NRS 또는 WRS는 당업계에 공지된 화학적 합성(Creighton, Proteins; Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., NY, 1983)에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로서 이들로 한정되는 것은 아니지만 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법이 포함된다(Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, 1997; A Practical Approach, Athert on & Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, 1989).

한편, 본 발명은 ARS, GRS, NRS 또는 WRS를 단독으로 또는 2 이상 포함하는 제1형 당뇨병 진단 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 ARS, GRS, NRS 또는 WRS 이외에 면역학적 분석에 사용되는 당 업계에 공지된 도구 및/또는 시약을 추가로 포함할 수 있다.

상기에서 면역학적 분석은 항원과 항체의 결합을 측정할 수 있는 있는 방법이라면 모두 포함될 수 있다. 이러한 방법들은 당 분야에 공지되어 있으며 예를 들어, 면역세포화학 및 면역조직화학, 방사선 면역 분석법(radioimmunoassays), 효소결합면역법(ELISA: Enzyme Linked Immunoabsorbent assay), 면역 블롯(immunoblotting), 파아르 분석법(Farr assay), 면역침강, 라텍스 응집, 적혈구 응집, 비탁계법, 면역확산법, 카운터-전류 전기영동법, 단일 라디칼 면역확산법, 단백질 칩 및 면역형광법이 있다.

면역학적 분석에 사용되는 도구 및/또는 시약으로는 적합한 담체 또는 지지체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제가 포함된다. 또한, 표지물질이 효소인 경우에는 효소활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포 함할 수 있다.

본 발명의 진단용 키트에 포함되는 ARS, GRS, NRS 또는 WRS는 바람직하게는 적합한 담체 또는 지지체에 문헌에 개시된 바와 같은 다양한 방법을 이용하여 고정될 수 있으며(Antibodies: A Labotory Manual, Harlow ＆ Lane; Cold SpringHarbor, 1988), 적합한 담체 또는 지지체의 예로는 아가로스, 셀룰로즈, 니트로셀룰로즈, 덱스트란, 세파덱스, 세파로즈, 리포솜, 카복시메틸 셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 폴리스테린, 반려암, 여과지, 이온교환수지, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 유리, 폴리아민-메틸 비닐-에테르-말레산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체, 나일론, 컵, 플랫 팩(flat packs) 등이 포함된다. 그 외의 다른 고체 기질로는 세포 배양 플레이트, ELISA 플레이트, 튜브 및 폴리머성 막이 있다. 상기 지지체는 임의의 가능한 형태, 예를 들어 구형(비드), 원통형(시험관 또는 웰 내면), 평면형(시트, 시험 스트립)을 가질 수 있다.

검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지는 항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정가능하게 하며, 이의 예로는 효소, 형광물질, 리간드, 발광물질, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사성 동위원소 등을 사용할 수 있다. 효소로는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라아제, 글리코즈 옥시다아제, 헥소키나제, 말레이트 디하이드로게나아제, 글루코스-6-인산디하이드로게나아제, 인버타아제 등 을 사용할 수 있다. 형광물질로는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, 플루오르신이소티옥시아네이트 등을 사용할 수 있다. 리간드로는 바이오틴 유도체 등이 있으며, 발광물질로는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있다. 미소입자로는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있고 레독스 분자로는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논 등이 있다. 방사성 동위원소로는 ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁸⁶Re 등이 있다. 그러나 상기 예시된 것들 외에 면역학적 분석법에 사용할 수 있은 것이라면 어느 것이라도 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 제1형 당뇨병 진단 키트는 종래에 알려진 제1형 당뇨병 진단 마커를 추가로 포함할 수 있다. 종래에 알려진 제1형 당뇨병 진단 마커는 이에 한정되지는 않으나, GAD65, IA-2, 인슐린, ICA, Hb1Ac, C-peptide, Slc30A8일 수 있다.

아울러, 또한, 본 발명은 제1형 당뇨병 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 시료로부터 항원-항체 반응을 통해 항-ARS 항체, 항-GRS 항체, 항-NRS 항체 및 항-WRS 항체로 이루어진 군에서 하나이상 선택된 항체를 검출하는 방법을 제공한다. 이 때, 시료 및 항원-항체 반응에 대해서는 상기에서 기재한 바와 같다.

상기에서 항-ARS 항체, 항-GRS 항체, 항-NRS 항체 및 항-WRS 항체는 각각 ARS, GRS, NRS 및 WRS의 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 항체는 ARS, GRS, NRS 또는 WRS에 대해 특이적으로 결합하는 각각의 항체를 의미하며, 바람직하게는 자가항체이다.

또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

아울러, 본 발명에서 ARS, GRS, NRS 및 WRS는 전체 길이를 가지는 폴리펩티드 뿐만아니라, 항-ARS 항체, 항-GRS 항체, 항-NRS 항체 및 항-WRS 항체와 각각 결합할 수 있는 단편일 수 있다.

참고로, 상기에서 언급한 뉴클레오티드 및 단백질 작업에는 다음의 문헌을 참조할 수 있다(Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990)).

아울러, 제1형 당뇨병 및 이의 마커에 대해서는 다음의 문헌을 참조할 수 있다: Latent autoimmune (Type-1) diabetes mellitus in adults. Part. I. Serologic markers of autoimmune involvement of pancreatic beta-cells: GADA, ICA, IA-2 a IA-A. Martinka E, OcenA, StrakovJ, MokM.Vnitr Lek. 1999 Feb;45(2):97-102; Prevalence of ICA and GAD antibodies at initial presentation of type 1 diabetes mellitus in Singapore children. Lee YS, Ng WY, Thai AC, Lui KF, Loke KY.J Pediatr Endocrinol Metab. 2001 Jun;14(6):767-72; A comparison of serum and EDTA plasma in the measurement of glutamic acid decarboxylase autoantibodies (GADA) and autoantibodies to islet antigen-2 (IA-2A) using the RSR radioimmunoassay (RIA) and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) kits. Rahmati K, Lernmark A, Becker C, Foltyn-Zadura A, Larsson K, Ivarsson SA, TC. Clin Lab. 2008;54(7-8):227-35; GAD treatment and insulin secretion in recent-onset type 1 diabetes. Ludvigsson J, FaresjM, Hjorth M, Axelsson S, ChM, Pihl M, Vaarala O, Forsander G, Ivarsson S, Johansson C, Lindh A, Nilsson NO, Aman J, Ortqvist E, Zerhouni P, Casas R. N Engl J Med. 2008 Oct 30;359(18):1909-20; Analysis of pancreas tissue in a child positive for islet cell antibodies.23: Oikarinen M, Tauriainen S, Honkanen T, Vuori K, Karhunen P, Vasama-Nolvi C, Oikarinen S, Verbeke C, Blair GE, Rantala I, Ilonen J, Simell O, Knip M, HyH.Diabetologia. 2008 Oct;51(10):1796-802; Autoimmune mechanisms in type 1 diabetes. Knip M, Siljander H. Autoimmun Rev. 2008 Jul;7(7):550-7; A common nonsynonymous single nucleotide polymorphism in the SLC30A8 gene determines ZnT8 autoantibody specificity in type 1 diabetes. Wenzlau JM, Liu Y, Yu L, Moua O, Fowler KT, Rangasamy S, Walters J, Eisenbarth GS, Davidson HW, Hutton JC. Diabetes. 2008 Oct;57(10):2693-7; Diabetes Antibody Standardization Program: evaluation of assays for autoantibodies to glutamic acid decarboxylase and islet antigen-2. Diabetes Antibody Standardization Program: evaluation of assays for autoantibodies to glutamic acid decarboxylase and islet antigen-2. Diabetologia. 2008 May;51(5):846-52.

본 발명의 일 실시예에서는 인간의 췌장에서 아미노아실 tRNA 합성효소의 발현 프로파일을 확인하기 위하여, 항-ARS 항체, 항-GRS 항체, 항-NRS 항체 및 항-WRS 항체를 각각 이용하여 간접면역형광염색법으로 ARS, GRS, NRS 및 WRS의 체장에서의 위치를 확인하였다. 그 결과, ARS 및 GRS는 랑게르한스섬의 베타 세포(도 1의 C 및 D) 및 췌관(pancreatic ductal epithelial) 세포(도 1의 C 및 D의 화살표 부분)에 주로 존재하고, NRS 및 WRS는 췌장내의 랑게르한스섬 및 포상세포(acinar cell)에 균등하게 분포되어 있음을 알 수 있었다(도 1의 E 및 F).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 제1형 당뇨병 환자 및 제2형 당뇨병 환자의 혈장에서 항-아미노아실 tRNA 합성효소에 대한 자가항체를 검출하여 제1형 당뇨의 진단에 활용할 수 있는지 확인하였다. 그 결과, 항-ARS 자가항체, 항-GRS 자가항체, 항-NRS 자가항체 및 항-WRS 자가항체 모두 정상 및 제2형 당뇨병에 비해서 제1형 당뇨병 환자에서 다수 검출되어, 제1형 당뇨병에 대한 진단 마커로 이용할 수 있음을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명은 제1형 당뇨병에 대한 신규한 진단 마커로서, 알라닌 tRNA 합성효소(alanyl-tRNA synthetase), 글리신 tRNA 합성효소(glycyl-tRNA synthetase), 아스파라긴 tRNA 합성효소(asparaginyl-tRNA synthetase) 또는 트립토판 tRNA 합성효소(tryptophanyl-tRNA synthethase)를 포함하는 제1형 당뇨병 진단용 조성물, 이를 포함하는 진단 키트 및 진단 방법을 제공한다. 본 발명의 조성물, 키트 및 방법은 환자의 시료로부터 손쉽게 제1형 당뇨병 여부를 진단할 수 있으므로 제1형 당뇨병의 조기 진단 및 확정을 위하여 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실험방법>

1. 단백질의 발현 및 정제

1-685(GRS), 1-548(NRS), 1-968(AlaRS) 및 1-471(WRS)을 인코딩하는 서열이 각각 증폭되도록 PCR 증폭하고, PCR 산물과 pET28a 벡터를 각각 EcoRI/SalI을 처리하여 잘라 pET28a(Novagen)로 서브클론(subclone)하고 12시간 동안 23 ℃에서 0.5 mM IPTG를 가하여 대장균(E. Coli) BL21에서 과발현시켰다.(이 때, 삽입된 GRS, NRS, AlaRS, WRS의 서열은 각각 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8과 같다) 상기 세포를 채취하고 버퍼 A(50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 2 mM 2-mercaptoethanol, pH 7.8)에서 고주파 분해하여 용해하고 22,000× g의 속도로 원심분리하였다. 상기 원심분리후 상등액을 황산암모늄으로 천천히 저어 침전시켰다. 25~50% 사이의 정도를 버퍼 B(50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 2 mM 2-mercaptoethanol, 15% 글리세롤, pH 7.6)로 투석하고 SP-sepharose 칼럼(BioRad)에 로드하였다. 상기 침전된 단백질을 0.7 M NaCl의 농도 구배 및 heparin 칼럼으로 용리하였다. 상기 단백질을 Ni⁺⁺-칼럼(invitrogen)에 다시 로드하고 250 mM 이미다졸로 용리하였다. 상기 단백질을 1× PBS에 대해 투석하여 70 ℃에서 저장하였다.

2. ELISA

GAD 및 ICA의 자가항체를 검출하기 위해, GAD 및 ICA ELISA 키트를 Biomerica사로부터 구입하고 하기 제조자 프로토콜에 의해 ELISA를 수행하였다. aaRS 자가항체 분석을 위해, 각 웰을 2 ng/㎖의 ARSs로 4 ℃에서 12시간 동안 코팅하고 2.5% BSA가 함유된 PBS로 상온에서 1시간 동안 차단하고 1/100로 희석된 혈청을 각 웰에 가하여 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 0.1% Tween 20이 함유된 PBS로 상기 플레이트를 세척하고 1/10,000로 희석된 HRP가 결합된 항-인간 항체를 각 웰에 가하고 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 세척 버퍼로 상기 플레이트를 세척하고 TMB(tetramethylbenzidine, Sigma)를 첨가하여 빛이 차단된 상태에서 상온에서 20분 동안 반응시켰다. 이후 1N HCl를 첨가하여 반응을 멈추고 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.

3. 환자의 혈청을 이용한 웨스턴 블럿(Western blot)

각 정제된 aaRSs 10 ng을 10% SDS-PAGE에 로딩하고 PVDF막(0.4㎛, Millipore)으로 이동시켰다. 상기 막을 5% BSA가 함유된 TBST(20 mM Tris-HCl, 130 mM NaCl, 0.2% Tween 20)로 상온에서 1시간 동안 차단하였다. 한편 본 발명자들은 1% BSA가 함유된 TBST로 각 환자의 샘플을 1/100배로 희석하고 상온에서 1시간 동안 막을 배양하였다. 상기 막을 세척한 후 본 발명자들은 상기 막에 1/10,000로 희석된 HRP(horseradish peroxidase)가 결합된 항-인간 항체를 가하여 반응시켰다.

<실험결과>

1. 췌장에서 aaRSs(aminoacyl-tRNA synthetases)의 면역형광염색

최근 연구는 몇몇 aaRSs의 발현이 췌장에서 많이 발생한다는 사실을 보여주고 있다. 본 발명자들은 인간의 췌장에서 aaRSs의 발현 프로파일(expression profile)을 알아보기 위해, 각 aaRS의 특이 항체를 생성하고 간접면역형광염색법을 사용하여 ARS, -GRS, -NRS 및 -WRS의 췌장에서의 위치를 살펴보았다.

그 결과 상기 ARS 및 GRS는 랑게르한스섬의 베타 세포(도 1의 C 및 D) 및 췌관(pancreatic ductal epithelial) 세포(도 1의 C 및 D의 화살표 부분)에서 주로, 특이적으로 위치함을 알 수 있었다. 반면에 NRS 및 WRS는 췌장내의 랑게르한스섬 및 포상세포(acinar cell)에 균등하게 분포되어 있음을 알 수 있었다(도 1의 E 및 F).

2. 인간 혈장(Human Plasma)을 사용한 자가항체 분석

aaRSs에 대한 자가항체가 자가면역 질환의 환자에서 발견되고, 1형 당뇨병(type I DM)이 췌장의 베타 세포 사멸에 의해 유발되는 자가면역에 의해 발생되기 때문에, 본 발병자들은 정상, 1형 당뇨병 및 2형 당뇨병 환자의 혈장에서 항-aaRSs 자가항체의 존재 여부가 당뇨병을 진단할 수 있는지 그리고 당뇨병의 진단 마커가 될 수 있는지 여부를 확인하였다.

본 발명자들은 각 정제된 aaRSs로 96 웰-플레이트의 각 웰을 코팅하고 항-aaRS 자가항체를 탐지하기 위해 정상(n=65), 1형 당뇨병(n=58) 및 2형 당뇨병(n=60) 환자의 혈장을 로드하였다.

그 결과 항-ARS 자가항체는 정상에서는 4.6%, 1형 당뇨병에서는 25.9% 그리고 2형 당뇨병에서는 5%로 발견되었다(도 2A). 항-GRS 자가항체는 정상에서는 4.6%, 1형 당뇨병에서는 10.3% 그리고 2형 당뇨병에서는 5%로 발견되었다. (도 2B). 항-NRS 자가항체는 정상에서는 4.6%, 1형 당뇨병에서는 17.2% 그리고 2형 당뇨병에서는 5%로 발견되었다(도 2C). 항-WRS 자가항체는 정상에서는 4.6%, 1형 당뇨병에서는 13.8% 그리고 2형 당뇨병에서는 5%로 발견되었다(도 2D). 상기 결과를 종합하면, 1형 당뇨병 혈장의 41.3%가 항-aaRS 항체를 가지고 있는 반면 정상 및 2형 당뇨병 혈장의 5%만이 항-aaRS 항체를 가지고 있음을 알 수 있었다.

이후, 본 발명자들은 항-aaRS 항체에 양성으로 판단된 혈장이 특이적으로 각 aaRS를 인식할 수 있는지 여부를 확인하였다. ARS, GRS, NRS 및 WRS를 이용한 면역블롯을 수행한 결과, 인간의 혈장이 특이적으로 각 aaRS를 인식하고 있음을 알 수 있었다.

상기 결과를 통하여 항-aaRS 항체가 특이적으로 1형 당뇨병에서 특이적으로 발견되고 1형 당뇨병인지 여부를 결정할 수 있는 진단 마커가 될 수 있음을 알 수 있었다.

3. GAD 및 ICA로부터 aaRS의 차이 분석

자가항체에서 GAD 및 ICA로 aaRS의 차이를 분석하기 위해, 우선 본 발명자들은 항-GAD 및 항-ICA 검출 키트를 이용하여 ELISA를 수행하였다. 1형 당뇨병 혈장을 이용한 분석에서 항-GAD 및 항-ICA 항체가 각각 62.1% 및 22.4%로 발견되었다. 그리고 환자의 19%가 이중양성(double positive)을 나타내었다(도 3A).

이후 본 발명자들은 GAD 및 ICA 항체를 사용하여 각 aaRS 항체가 1형 당뇨병 진단을 구별할 수 있는지 없는지를 분석하였다. 항-WRS 항체의 경우에, 5.2%가 GAD 및 ICA로 중복되었고, 또한 각각 1.7%가 GAD 또는 ICA로 중복되었다. 결국 본 발명자들은 13.2% 중 5.2%가 WRS 특이적임을 알 수 있었다. 항-GRS 항체의 분석에서, 6.9%가 GAD 및 ICA로 중복되었고, 또한 각각 1.7%가 GAD 또는 ICA로 중복되었다. 결국 본 발명자들은 GRS에만 특이적인 자기항체는 존재하지 않음을 알 수 있었다. 항-NRS 항체의 분석에서, 6.9%가 GAD 및 ICA로 중복되었고, 또한 6.9%가 GAD 와 중복되었다. 결국 본 발명자들은 17.2% 중 3.4%가 특이적 항-NRS 항체임을 알 수 있었다. 항-ARS 항체의 분석에서, 8.6%가 GAD 및 ICA로 중복되었고, 또한 13.8%가 GAD와 중복되었다. 결국 본 발명자들은 25.9% 중 3.5%가 특이적 항-ARS임을 알 수 있었다. 모든 항-aaRS 항체를 분석에 함께 사용하였을 때, 10.3%가 GAD 및 ICA와 중복되었으며 17.2% 및 3.5%가 GAD 및 ICA와 각각 중복되었다.

상기 실험결과를 통하여 41.35% 중 10.3%가 특이적 항-aaRS임을 알 수 있었으며 특히 특이적 ICA는 존재하지 않음을 알 수 있었다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 제1형 당뇨병에 대한 신규한 진단 마커로서, 알라닌 tRNA 합성효소(alanyl-tRNA synthetase), 글리신 tRNA 합성효소(glycyl-tRNA synthetase), 아스파라긴 tRNA 합성효소(asparaginyl-tRNA synthetase) 또는 트립토판 tRNA 합성효소(tryptophanyl-tRNA synthethase)를 포함하는 제1형 당뇨병 진단용 조성물, 이를 포함하는 진단 키트 및 진단 방법을 제공한다. 본 발명의 조성물, 키트 및 방법은 환자의 시료로부터 손쉽게 제1형 당뇨병 여부를 진단할 수 있으므로 제1형 당뇨병의 조기 진단 및 확정을 위하여 사용할 수 있다.

도 1은 췌장에서 ARS, GRS, NRS 및 WRS에 대해서 면역형광염색을 한 결과이다.(A : Mock, B : 인슐린, C : ARS, D : GRS, E : NRS, F : WRS)

도 2는 혈장에서 각각의 아미노아실 tRNA 합성효소에 대한 자가항체를 검출한 결과이다(A : ARS, B : GRS, C : NRS, D : WRS, E : 아미노아실 tRNA 합성효소, F : 혈장에 대해서 각각 ARS, GRS, NRS 및 WRS를 이용한 면역블롯 결과)

도 3은 GAD, ICA 및 aaRS에 대해서 특이적으로 결합하는 자가항체를 구분하여 나타낸 것이다.(A : WRS, B : GRS, C : NRS, D : ARS, E : 아미노아실 tRNA 합성효소)

<110> Seoul National University Industry Foundation <120> Novel diagnostic marker for type I diabetes mellitus <130> NP08-0088 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 968 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Asp Ser Thr Leu Thr Ala Ser Glu Ile Arg Gln Arg Phe Ile Asp 1 5 10 15 Phe Phe Lys Arg Asn Glu His Thr Tyr Val His Ser Ser Ala Thr Ile 20 25 30 Pro Leu Asp Asp Pro Thr Leu Leu Phe Ala Asn Ala Gly Met Asn Gln 35 40 45 Phe Lys Pro Ile Phe Leu Asn Thr Ile Asp Pro Ser His Pro Met Ala 50 55 60 Lys Leu Ser Arg Ala Ala Asn Thr Gln Lys Cys Ile Arg Ala Gly Gly 65 70 75 80 Lys Gln Asn Asp Leu Asp Asp Val Gly Lys Asp Val Tyr His His Thr 85 90 95 Phe Phe Glu Met Leu Gly Ser Trp Ser Phe Gly Asp Tyr Phe Lys Glu 100 105 110 Leu Ala Cys Lys Met Ala Leu Glu Leu Leu Thr Gln Glu Phe Gly Ile 115 120 125 Pro Ile Glu Arg Leu Tyr Val Thr Tyr Phe Gly Gly Asp Glu Ala Ala 130 135 140 Gly Leu Glu Ala Asp Leu Glu Cys Lys Gln Ile Trp Gln Asn Leu Gly 145 150 155 160 Leu Asp Asp Thr Lys Ile Leu Pro Gly Asn Met Lys Asp Asn Phe Trp 165 170 175 Glu Met Gly Asp Thr Gly Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Ile His Tyr 180 185 190 Asp Arg Ile Gly Gly Arg Asp Ala Ala His Leu Val Asn Gln Asp Asp 195 200 205 Pro Asn Val Leu Glu Ile Trp Asn Leu Val Phe Ile Gln Tyr Asn Arg 210 215 220 Glu Ala Asp Gly Ile Leu Lys Pro Leu Pro Lys Lys Ser Ile Asp Thr 225 230 235 240 Gly Met Gly Leu Glu Arg Leu Val Ser Val Leu Gln Asn Lys Met Ser 245 250 255 Asn Tyr Asp Thr Asp Leu Phe Val Pro Tyr Phe Glu Ala Ile Gln Lys 260 265 270 Gly Thr Gly Ala Arg Pro Tyr Thr Gly Lys Val Gly Ala Glu Asp Ala 275 280 285 Asp Gly Ile Asp Met Ala Tyr Arg Val Leu Ala Asp His Ala Arg Thr 290 295 300 Ile Thr Val Ala Leu Ala Asp Gly Gly Arg Pro Asp Asn Thr Gly Arg 305 310 315 320 Gly Tyr Val Leu Arg Arg Ile Leu Arg Arg Ala Val Arg Tyr Ala His 325 330 335 Glu Lys Leu Asn Ala Ser Arg Gly Phe Phe Ala Thr Leu Val Asp Val 340 345 350 Val Val Gln Ser Leu Gly Asp Ala Phe Pro Glu Leu Lys Lys Asp Pro 355 360 365 Asp Met Val Lys Asp Ile Ile Asn Glu Glu 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Ala Gly Asn Ala Ser 20 25 30 Lys Asp Glu Ile Asp Ser Ala Val Lys Met Leu Val Ser Leu Lys Met 35 40 45 Ser Tyr Lys Ala Ala Ala Gly Glu Asp Tyr Lys Ala Asp Cys Pro Pro 50 55 60 Gly Asn Pro Ala Pro Thr Ser Asn His Gly Pro Asp Ala Thr Glu Ala 65 70 75 80 Glu Glu Asp Phe Val Asp Pro Trp Thr Val Gln Thr Ser Ser Ala Lys 85 90 95 Gly Ile Asp Tyr Asp Lys Leu Ile Val Arg Phe Gly Ser Ser Lys Ile 100 105 110 Asp Lys Glu Leu Ile Asn Arg Ile Glu Arg Ala Thr Gly Gln Arg Pro 115 120 125 His His Phe Leu Arg Arg Gly Ile Phe Phe Ser His Arg Asp Met Asn 130 135 140 Gln Val Leu Asp Ala Tyr Glu Asn Lys Lys Pro Phe Tyr Leu Tyr Thr 145 150 155 160 Gly Arg Gly Pro Ser Ser Glu Ala Met His Val Gly His Leu Ile Pro 165 170 175 Phe Ile Phe Thr Lys Trp Leu Gln Asp Val Phe Asn Val Pro Leu Val 180 185 190 Ile Gln Met Thr Asp Asp Glu Lys Tyr Leu Trp Lys Asp Leu Thr Leu 195 200 205 Asp Gln Ala Tyr Gly Asp Ala Val Glu Asn Ala Lys Asp Ile Ile Ala 210 215 220 Cys Gly Phe Asp Ile Asn Lys Thr Phe Ile Phe Ser Asp Leu Asp Tyr 225 230 235 240 Met Gly Met Ser Ser Gly Phe Tyr Lys Asn Val Val Lys Ile Gln Lys 245 250 255 His Val Thr Phe Asn Gln Val Lys Gly Ile Phe Gly Phe Thr Asp Ser 260 265 270 Asp Cys Ile Gly Lys Ile Ser Phe Pro Ala Ile Gln Ala Ala Pro Ser 275 280 285 Phe Ser Asn Ser Phe Pro Gln Ile Phe Arg Asp Arg Thr Asp Ile Gln 290 295 300 Cys Leu Ile Pro Cys Ala Ile Asp Gln Asp Pro Tyr Phe Arg Met Thr 305 310 315 320 Arg Asp Val Ala Pro Arg Ile Gly Tyr Pro Lys Pro Ala Leu Leu His 325 330 335 Ser Thr Phe Phe Pro Ala Leu Gln Gly Ala Gln Thr Lys Met Ser Ala 340 345 350 Ser Asp Pro Asn Ser Ser Ile Phe Leu Thr Asp Thr Ala Lys Gln Ile 355 360 365 Lys Thr Lys Val Asn Lys His Ala Phe Ser Gly Gly Arg Asp Thr Ile 370 375 380 Glu Glu His Arg Gln Phe Gly Gly Asn Cys Asp Val Asp Val Ser Phe 385 390 395 400 Met Tyr Leu Thr Phe Phe Leu Glu Asp Asp Asp Lys Leu Glu Gln Ile 405 410 415 Arg Lys Asp Tyr Thr Ser Gly Ala Met Leu Thr Gly Glu Leu Lys Lys 420 425 430 Ala Leu Ile Glu Val Leu Gln Pro Leu Ile Ala Glu His Gln Ala Arg 435 440 445 Arg Lys Glu Val Thr Asp Glu Ile Val Lys Glu Phe Met Thr Pro Arg 450 455 460 Lys Leu Ser Phe Asp Phe Gln 465 470 <210> 5 <211> 2907 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARS coding sequence <400> 5 atggactcta ctctaacagc aagtgaaatc cggcagcgat ttatagattt cttcaagagg 60 aacgagcata cgtatgttca ctcgtctgcc accatcccat tggatgaccc cactttgctc 120 tttgccaatg caggcatgaa ccagtttaaa cccattttcc tgaacacaat tgacccatct 180 caccccatgg caaagctgag cagagctgcc aatacccaga agtgcatccg ggctgggggc 240 aaacaaaatg acctggacga tgtgggcaag gatgtctatc atcacacctt cttcgagatg 300 ctgggctctt ggtcttttgg agattacttt aaggaattgg catgtaagat ggctctggaa 360 ctcctcaccc aagagtttgg cattcccatt gaaagacttt atgttactta ctttggcggg 420 gatgaagcag ctggcttaga agcagatctg gaatgcaaac agatctggca aaatttgggg 480 ctggatgaca ccaaaatcct cccaggcaac atgaaggata acttctggga gatgggtgac 540 acgggcccct gtggtccttg cagtgagatc cactacgacc ggattggtgg tcgggacgcc 600 gcacatcttg tcaaccagga cgaccctaat gtgctggaga tctggaacct tgtgttcatc 660 cagtataaca gggaagctga tggcattctg aaacctcttc ccaagaaaag cattgacaca 720 gggatgggcc tggaacgact ggtatctgtg ctgcagaata agatgtccaa ctatgacact 780 gacctttttg tcccttactt tgaagccatt cagaagggca caggtgcccg accatacact 840 gggaaagttg gtgctgagga tgccgatggg attgacatgg cctaccgggt gctggctgac 900 catgctcgga ccatcactgt ggcactggct gatggtggcc ggcctgacaa cacagggcgt 960 ggatatgtgt tgagacggat tctccgccga gctgtccgat acgcccatga aaagctcaat 1020 gccagcaggg gcttctttgc tacgttagtg gatgttgtcg tccagtccct gggagatgca 1080 tttcctgagc tgaagaagga cccagacatg gtgaaggaca tcattaatga agaagaggtg 1140 cagtttctca agactctcag cagagggcgt cgcatcctgg acaggaaaat tcagagcctg 1200 ggagacagca agaccattcc cggagacact gcttggctcc tctatgacac ctatgggttt 1260 ccagtggatc tgactggact gattgctgaa gagaagggcc tggtggtaga catggatggc 1320 tttgaagagg agaggaaact ggcccagctg aaatcacagg gcaagggagc tggtggggaa 1380 gacctcatta tgctggacat ttacgctatc gaagagctcc gggcacgggg tctggaggtc 1440 acagatgatt ccccaaagta caattaccat ttggactcca gtggtagcta tgtatttgag 1500 aacacagtgg ctacggtgat ggctctgcgc agggagaaga tgttcgtgga agaggtgtcc 1560 acaggccagg agtgtggagt ggtgctggac aagacctgtt tctatgctga gcaaggaggc 1620 cagatctatg acgaaggcta cctggtgaag gtggatgaca gcagtgaaga taaaacagag 1680 tttacagtga agaatgctca ggtccgagga gggtatgtgc tacacattgg aaccatctac 1740 ggtgacctga aagtggggga tcaggtctgg ctgtttattg atgagccccg acgaagaccc 1800 atcatgagca accacacagc tacgcacatt ctgaacttcg ccctgcgctc agtgcttggg 1860 gaagctgacc agaaaggctc attggttgct cctgaccgcc tcagatttga ctttactgcc 1920 aagggagcca tgtccaccca acagatcaag aaggctgaag agattgctaa tgagatgatt 1980 gaggcagcca aggccgtcta tacccaggat tgccccctgg cagcagcgaa agccatccag 2040 ggcctacggg ctgtgtttga tgagacctat cctgaccctg tgcgagtcgt ctccattggg 2100 gtcccggtgt ccgagttgct ggatgacccc tctgggcctg ctggctccct gacttctgtt 2160 gagttctgtg ggggaacgca cctgcggaac tcgagtcatg caggagcttt tgtgatcgtg 2220 acggaagaag ccattgccaa gggtatccgg aggattgtgg ctgtcacagg tgccgaggcc 2280 cagaaggccc tcaggaaagc agagagcttg aagaaatgtc tctctgtcat ggaagccaaa 2340 gtgaaggctc agactgctcc aaacaaggat gtgcagaggg agatcgctga ccttggagag 2400 gccctggcca ctgcagtcat cccccagtgg cagaaggatg aattgcggga gactctcaaa 2460 tccctaaaga aggtcatgga tgacttggac cgagccagca aagccgatgt ccagaaacga 2520 gtgttagaga agacgaagca gttcatcgac agcaacccca accagcctct tgtcatcctg 2580 gagatggaga gcggcgcctc agccaaggcc ctgaatgaag ccttgaagct cttcaagatg 2640 cactcccctc agacttctgc catgctcttc acggtggaca atgaggctgg caagatcacg 2700 tgcctgtgtc aagtccccca gaatgcagcc aatcggggct taaaagccag cgagtgggtg 2760 cagcaggtgt caggcttgat ggacggtaaa ggtggtggca aggatgtgtc tgcacaggcc 2820 acaggcaaga acgttggctg cctgcaggag gcgctgcagc tggccacttc cttcgcccag 2880 ctgcgcctcg gggatgtaaa gaactga 2907 <210> 6 <211> 2058 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GRS coding sequence <400> 6 atggacggcg cgggggctga ggaggtgctg gctcctctga ggctagcagt gcgccagcag 60 ggagatcttg tgcgaaaact caaagaagat aaagcacccc aagtagacgt agacaaagca 120 gtggctgagc tcaaagcccg caagagggtt ctggaagcaa aggagctggc gttacagccc 180 aaagatgata ttgtagaccg agcaaaaatg gaagataccc 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ccgcatctac 1080 ctctacctca cgaaggttgg aatatctcca gataaactcc gcttccggca gcacatggag 1140 aatgagatgg cccattatgc ctgtgactgt tgggatgcag aatccaaaac atcctacggt 1200 tggattgaga ttgttggatg tgctgatcgt tcctgttatg acctctcctg tcatgcacga 1260 gccaccaaag tcccacttgt agctgagaaa cctctgaaag aacccaaaac agtcaatgtt 1320 gttcagtttg aacccagtaa gggagcaatt ggtaaggcat ataagaagga tgcaaaactg 1380 gtgatggagt atcttgccat ttgtgatgag tgctacatta cagaaattga gatgctgctg 1440 aatgagaaag gggaattcac aattgaaact gaagggaaaa catttcagtt aacaaaagac 1500 atgatcaatg tgaagagatt ccagaaaaca ctatatgtgg aagaagttgt tccgaatgta 1560 attgaacctt ccttcggcct gggtaggatc atgtatacgg tatttgaaca tacattccat 1620 gtacgagaag gagatgaaca gagaacattc ttcagtttcc ctgctgtagt tgctccattc 1680 aaatgttccg tcctcccact gagccaaaac caggagttca tgccatttgt caaggaatta 1740 tcggaagccc tgaccaggca tggagtatct cacaaagtag acgattcctc tgggtcaatc 1800 ggaaggcgct atgccaggac tgatgagatt ggcgtggctt ttggtgtcac cattgacttt 1860 gacacagtga acaagacccc ccacactgca actctgaggg accgtgactc aatgcggcag 1920 ataagagcag agatctctga gctgcccagc atagtccaag acctagccaa tggcaacatc 1980 acatgggctg atgtggaggc caggtatcct ctgtttgaag ggcaagagac tggtaaaaaa 2040 gagacaatcg aggaatga 2058 <210> 7 <211> 1647 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NRS coding sequence <400> 7 atggtgctag cagagctgta cgtctctgac cgagagggaa gcgatgccac gggagatgga 60 accaaggaga aaccatttaa aacaggtcta aaggctttga tgacagtagg gaaagaacca 120 tttcctacca tttacgtaga ttcacaaaaa gaaaatgaga ggtggaatgt tatttctaaa 180 tcacagttga agaacattaa aaagatgtgg catagggaac aaatgaagag tgaatcccgg 240 gaaaagaaag aggcagaaga tagtttacga agagaaaaga acctggaaga agcaaagaag 300 attaccatta aaaatgatcc aagtctccca gagccaaaat gtgtgaagat tggtgcgtta 360 gaaggatata gaggccaaag agtaaaggtg tttggctggg tccacaggct gcgcaggcaa 420 ggaaagaatt taatgtttct ggtgttgcga gatggtacag gttatcttca gtgtgtcttg 480 gcggatgagt tgtgtcagtg ctacaatgga gttctcttgt ccacggagag cagtgttgca 540 gtgtatggaa tgctaaatct taccccaaag ggcaagcagg ctccaggtgg ccatgagctg 600 agttgtgact tctgggaact aattgggttg gcccctgctg gaggagctga caacctgatc 660 aatgaggagt ctgacgttga tgtccagctc aacaacagac acatgatgat ccgaggagaa 720 aacatgtcca aaatcctaaa agcacgatcc atggtcacca ggtgctttag agatcacttc 780 tttgataggg ggtactatga agttactcct ccaacattag tgcaaacaca agtagaaggt 840 ggtgccacac tcttcaagct tgactatttt ggggaagagg catttttgac tcaatcctct 900 cagttgtact tggagacctg cctcccagcc ctgggagatg ttttttgtat tgctcagtca 960 taccgggcag agcagtccag aacacgaagg cacctggctg agtacactca cgtggaagct 1020 gagtgtcctt tcctgacttt tgacgacctc ctgaaccggt tggaggactt ggtttgtgat 1080 gtggtagatc gaatattgaa gtcacctgca gggagcatag tgcatgagct caacccgaac 1140 tttcagcccc ccaaacggcc tttcaaacgg atgaactatt cagatgctat cgtttggcta 1200 aaagaacatg atgtaaagaa agaagatgga actttctatg aatttggaga agatatccca 1260 gaagctcctg agagactgat gacagacacc attaatgaac caatcttgct gtgtcgattt 1320 cctgtggaga tcaagtcctt ctacatgcag cgatgtcctg aggattcccg tcttactgaa 1380 tctgtcgacg tgttgatgcc caatgttggt gagattgtgg gaggctcaat gcgtatcttt 1440 gatagtgaag aaatactggc aggttataaa agggaaggga ttgaccccac tccctattac 1500 tggtatacgg atcagagaaa atacggtaca tgtccccatg gaggatatgg cttgggcttg 1560 gaacgattct taacgtggat tctgaatagg tatcacatcc gagacgtgtg cttataccct 1620 cgatttgtcc agcgttgcac gccataa 1647 <210> 8 <211> 1416 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WRS coding sequence <400> 8 atgcccaaca gtgagcccgc atctctgctg gagctgttca acagcatcgc cacacaaggg 60 gagctcgtaa ggtccctcaa agcgggaaat gcgtcaaagg atgaaattga ttctgcagta 120 aagatgttgg tgtcattaaa aatgagctac aaagctgccg cgggggagga ttacaaggct 180 gactgtcctc cagggaaccc agcacctacc agtaatcatg gcccagatgc cacagaagct 240 gaagaggatt ttgtggaccc atggacagta cagacaagca gtgcaaaagg catagactac 300 gataagctca ttgttcggtt tggaagtagt aaaattgaca aagagctaat aaaccgaata 360 gagagagcca ccggccaaag accacaccac ttcctgcgca gaggcatctt cttctcacac 420 agagatatga atcaggttct tgatgcctat gaaaataaga agccatttta tctgtacacg 480 ggccggggcc cctcttctga agcaatgcat gtaggtcacc tcattccatt tattttcaca 540 aagtggctcc aggatgtatt taacgtgccc ttggtcatcc agatgacgga tgacgagaag 600 tatctgtgga aggacctgac cctggaccag gcctatggcg atgctgttga gaatgccaag 660 gacatcatcg cctgtggctt tgacatcaac aagactttca tattctctga cctggactac 720 atggggatga gctcaggttt ctacaaaaat gtggtgaaga ttcaaaagca tgttaccttc 780 aaccaagtga aaggcatttt cggcttcact gacagcgact gcattgggaa gatcagtttt 840 cctgccatcc aggctgctcc ctccttcagc aactcattcc cacagatctt ccgagacagg 900 acggatatcc agtgccttat cccatgtgcc attgaccagg atccttactt tagaatgaca 960 agggacgtcg cccccaggat cggctatcct aaaccagccc tgttgcactc caccttcttc 1020 ccagccctgc agggcgccca gaccaaaatg agtgccagcg acccaaactc ctccatcttc 1080 ctcaccgaca cggccaagca gatcaaaacc aaggtcaata agcatgcgtt ttctggaggg 1140 agagacacca tcgaggagca caggcagttt gggggcaact gtgatgtgga cgtgtctttc 1200 atgtacctga ccttcttcct cgaggacgac gacaagctcg agcagatcag gaaggattac 1260 accagcggag ccatgctcac cggtgagctc aagaaggcac tcatagaggt tctgcagccc 1320 ttgatcgcag agcaccaggc ccggcgcaag gaggtcacgg atgagatagt gaaagagttc 1380 atgactcccc ggaagctgtc cttcgacttt cagtag 1416

Claims

알라닌 tRNA 합성효소(alanyl-tRNA synthetase), 글리신 tRNA 합성효소(glycyl-tRNA synthetase), 아스파라긴 tRNA 합성효소(asparaginyl-tRNA synthetase) 및 트립토판 tRNA 합성효소(tryptophanyl-tRNA synthethase)로 이루어진 군에서 하나이상 선택된 아미노아실 tRNA 합성효소(aminoacyl-tRNA synthetase)를 유효성분으로 포함하는 제1형 당뇨병 진단용 조성물.
제1항의 조성물을 포함하는 제1형 당뇨병 진단 키트.
제2항에 있어서, 상기 키트는 GAD65, IA-2, 인슐린, ICA, Hb1Ac, C-peptide, Slc30A8로 이루어진 군에서 선택된 제1형 당뇨병 진단 마커를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제1형 당뇨병 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 시료로부터 항원-항체 반응을 통해 항-알라닌 tRNA 합성효소 항체, 항-글리신 tRNA 합성효소 항체, 항-아스파라긴 tRNA 합성효소 항체 및 항-트립토판 tRNA 합성효소 항체로 이루 어진 군에서 하나이상 선택된 항체를 검출하는 방법.