CN106906227B

CN106906227B - 一种可溶性草酸氧化酶的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN106906227B
Application number: CN201710133625.9A
Authority: CN
Inventors: 汪小锋; 吴玉峰; 刘文山; 汪卫; 宋保平
Original assignee: Wuhan Kangfude Biotechnolgoy Co ltd
Current assignee: Wuhan Kangfude Biotechnolgoy Co ltd
Priority date: 2017-03-08
Filing date: 2017-03-08
Publication date: 2020-02-21
Anticipated expiration: 2037-03-08
Also published as: CN106906227A

Abstract

本发明公开了一种用于高效表达可溶性草酸脱羧酶的重组表达框，同时发明一种能在大肠杆菌中高效表达可溶性且有活性的草酸氧化酶的制备方法，并将细胞破碎液上清通过硫酸铵沉淀，用柠檬酸‑柠檬酸钠缓冲液复溶后的含草酸氧化酶的溶液，直接用于草酸脱羧酶活力测定。这种测定方法与传统的方法如市售的测定草酸的试剂盒和HPLC法相比，精确度和灵敏度较高，耗时短，成本低，易于通过酶标仪对大量的样品进行高通量测定，具有很好的实用性。本发明中制备的草酸氧化酶还可用于其它以草酸为底物或产物的酶的活力的测定，还可用于人和动物的血液和尿液以及各种含草酸的样品中草酸含量的测定。

Description

一种可溶性草酸氧化酶的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及重组蛋白表达领域，具体涉及一种可溶性草酸氧化酶的制备方法及其应用。

背景技术

草酸氧化酶(Oxalate oxidase，OxO,EC1.2.3.4)主要存在于植物中，能够将草酸分解成二氧化碳和过氧化氢。在草酸积累相关疾病的诊断、体内草酸的清除等方面具有很大的应用潜力。

目前，草酸氧化酶的生产主要有植物组织提取和重组表达，其中，植物提取方法受原料的影响比较大，含量较低，提取工艺复杂，收率低。植物提取的酶，一般是与植物细胞壁稳定的结合，是固体不溶物，不便于其在草酸检测中的应用。重组表达的草酸氧化酶，目前只有大麦、小麦和白腐菌的草酸氧化酶在毕赤酵母中实现了分泌表达，因草酸氧化酶一般都是6聚体蛋白，分子量比较大，单体分子量一般在24kDa左右，总分子量一般超过140kDa，结构比较复杂，折叠成为正确的结构比较困难，大的蛋白分泌表达比较难，效率低；另外，酵母发酵的发酵液中的成分与草酸氧化酶分子结合，会严重影响草酸氧化酶的活性，必须纯化到较高的纯度才有活性，而且表达量较低，发酵周期长，总的生产成本较高。虽然也有在大肠杆菌中表达大麦和小麦草酸氧化酶的报道，但表达量很低，且表达的草酸氧化酶形成包涵体，纯化工艺复杂且活性非常低。总体上，草酸氧化酶重组表达的种类较少，表达量偏低，生产成本较高，限制了其在诊断和治疗与草酸相关的疾病方面的应用。

草酸脱羧酶(Oxalate decarboxylase,OXDC,EC4.1.1.2)是一种包含Mn²⁺的草酸降解酶，主要存在于真菌或一些细菌中，它能够在没有其他辅因子的作用下，直接将草酸降解生成甲酸和CO₂。目前测定草酸脱羧酶活力的方法主要有HPLC法，分光光度法，测压发酶法等，可以通过测定底物草酸分解产生的甲酸的量、CO₂的量或草酸分解减少的量来计算OXDC的活性。甲酸的测定可以用HPLC或甲酸脱氢酶法，CO₂的测定可以通过测压计法和酶法，草酸的测定可以通过HPLC法(廖贤平等.武警医学院学报,19(1):47-50)，次甲基蓝-重铬酸钾法(梁磊等.分析测试学报,2006,25(1):98-101)和滴定法。

HPLC法测定剩余草酸或甲酸对仪器和样品要求比较高，测定样品效率较低，一次只能测定一个样品，成本比较高，不利于高通量测定大量的样品，不利于推广；用酶法测定甲酸法测定需要用到氧化型辅酶I和甲酸脱氢酶，成本高，耗时长。测压计测定CO₂法操作繁琐，对仪器要求较高，不易于大批量测定多个样品；酶法测定CO₂含量方法会用到磷酸烯醇式丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、NADH和苹果酸脱氢酶等较为昂贵的试剂，同样存在成本高和耗时长的问题；次甲基蓝-重铬酸钾法测定草酸试剂比较便宜，方法较为简单，但该方法灵敏度较差，测定草酸的浓度范围较窄(0-0.08mM)；目前用草酸氧化酶法，用纯酶的成本比较高，用植物组织如大麦麦麸提取的草酸氧化酶是与植物细胞壁紧密结合的，成分比较复杂，粗酶的活性低，不溶解于buffer，不利于催化反应对显色有干扰，草酸测定的线性范围较窄(0-0.08mM)。滴定法测定草酸是比较老的方法，同样存在灵敏度差，线性范围较窄，受样品pH干扰大，耗时，不能实现高通量测定等缺点。

目前，草酸氧化酶很难实现重组表达，大肠杆菌中表达的草酸氧化酶都形成包涵体，绝大多数酶没有活力，目前市场上草酸氧化酶的种类很少，产量较低，价格高，植物组织提取的草酸氧化酶活力低，工艺复杂，实用性差，这些都制约了草酸氧化酶法的应用。

发明内容

为了解决现有技术中，草酸氧化酶在大肠杆菌中难以实现可溶性重组表达和草酸脱羧酶活力测定方法繁琐,成本高和难以实现高通量测定的问题，本发明提供了一种用于高效表达可溶性草酸氧化酶的重组表达框，及其在大肠杆菌中高效表达可溶性草酸氧化酶的方法，并将含有表达的草酸氧化酶的破碎液上清直接用于草酸脱羧酶活力测定。

一种用于高效表达可溶性草酸氧化酶的重组表达框，包括大肠杆菌启动子，草酸氧化酶基因和终止子，其中所述草酸氧化酶基因来自小麦的AJ556991、大麦的Y14203、虫拟蜡菌的AJ746412、褐腐菌的EJT98183、红色毛癣菌的XM_003236399、花生的EU024475、裂褶菌的XM_003032043、穇子的KX289589、蒺藜苜蓿的XM_013612545、或为SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6或SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列。

一种用于高效表达可溶性草酸氧化酶的重组表达框，其包括大肠杆菌启动子，草酸氧化酶基因和终止子，所述重组表达框还包括至少在所述草酸氧化酶基因的前置标签和后置标签中的一种，所述前置标签为在所述草酸氧化酶基因和所述大肠杆菌启动子之间插入能促进目的蛋白表达的蛋白标签基因，所述后置标签为在所述草酸氧化酶基因的后面插入编码6～120个带电荷氨基酸的短肽链基因，所述短肽链用于改善草酸氧化酶的可溶性表达。

其中，所述重组表达框还包括至少在所述草酸氧化酶基因的前置标签和后置标签中的一种，包括三种情况，一种情况是所述重组表达框还包括所述草酸氧化酶基因的前置标签，第二种情况是所述重组表达框还包括所述草酸氧化酶基因的后置标签，第二种情况所述重组表达框还包括在所述草酸氧化酶基因的前置标签和后置标签中。

如上所述的重组表达框，优选地，所述蛋白标签为GST标签、MBP标签、硫氧还蛋白(Thioredoxin)标签、NusA标签、DsbA标签或SUMO标签。

如上所述的重组表达框，优选地，所述带电荷氨基酸为赖氨酸，精氨酸，组氨酸，天冬氨酸或谷氨酸，所述短肽链为单个所述带电荷氨基酸的串联重复，或为任意两种或两种以上所述带电荷氨基酸的组合。

如上所述的重组表达框，优选地，其中所述草酸氧化酶基因来自小麦的AJ556991、大麦的Y14203、虫拟蜡菌的AJ746412、褐腐菌的EJT98183、红色毛癣菌的XM_003236399、花生的EU024475、裂褶菌的XM_003032043、穇子的KX289589、蒺藜苜蓿的XM_013612545、或为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列。

一种表达可溶性草酸氧化酶(OxO)的重组菌，将如上所述的重组表达框转化入大肠杆菌宿主菌或转化入具有表达分子伴侣的大肠杆菌宿主菌中得到重组菌。

如上所述的重组菌，优选地，将如上所述的重组表达框和/或，与分子伴侣基因插入到一个表达载体中后转化入大肠杆菌宿主菌。

如上所述的重组菌，优选地，所述分子伴侣为DnaK、DnaJ、GrpE、tig、GroEL或GroES。

如上所述的重组菌，优选地，所述表达分子伴侣为将分子伴侣质粒pGRO7、pG-KJE7、pG-KJE8或pTf16导入所述大肠杆菌宿主菌。

如上所述的重组菌的诱导表达方法，用IPTG进行诱导表达，采用15～32℃的低温培养，诱导过程中一次性或分批加入1～50mM的MnCl₂，诱导培养基中含有终浓度为3～20g/L的促进疏水性蛋白溶解的促溶物；所述促溶物为甜菜碱、甘露糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇。

如上所述的重组菌的诱导表达方法，优选地，所述低温培养为20～28℃，所述MnCl₂为5～10mM，所述促溶物为6～8g/L的甘露糖。

如上所述的重组菌的诱导表达可溶性草酸氧化酶后的纯化方法，诱导培养4～8h后，离心收集菌体，进行超声破碎，离心收集破碎液上清，向细胞破碎液上清中加入硫酸铵使其终浓度为20％～40％，进行沉淀，离心收集沉淀蛋白，用等体积的10mM、25mM或50mM的pH 5.0～6.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶解所述沉淀蛋白，所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中含有终浓度为5～40％的异丙醇，甘油，乙二醇或乙醇，将溶解的蛋白经过3～5层中速定性滤纸真空过滤后，获得纯化后的可溶性草酸氧化酶。

如上所述的重组菌的诱导表达可溶性草酸脱羧酶后的纯化方法，优选地，所述硫酸铵的终浓度为30％，所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中含有终浓度为10％-20％的异丙醇。

一种草酸脱羧酶活力的测定方法，包括以下步骤：

(1)草酸脱羧酶降解草酸生成甲酸和CO₂：将含草酸脱羧酶的样品用稀释液进行n倍稀释；取aμL稀释后草酸脱羧酶样品，加入1mL的草酸反应液中，37℃，800rpm恒温混匀仪反应x min，加入50μL的2.5M H₂SO₄终止反应；其中所述x为5～20；设置对照样品为加aμL的双蒸水；

(2)将所述步骤(1)终止反应后的样品12000rpm离心10min；取上清液加入2～3倍体积的所述稀释液，混合均匀，此步骤应确定稀释后样品pH落在5.0～5.5单位的范围内；

(3)酶标仪检测：将不同浓度的标准草酸样品和所述步骤(2)处理后的待测样品各20μL分别加入96孔酶标板；再加入以体积比8:3:7的显色液、如上所述方法制备的草酸氧化酶酶液、纯水混合均匀的混合液，每孔加入180μL，其中，所述草酸氧化酶酶液中酶活力为500～800U/L，酶比活大于1U/mg,浓度大于0.1mg/ml；

将酶标板放入酶标仪中，37℃孵育10～15min并保持恒温，492nm测量吸光度值；

(4)稀释后样品中草酸残留量：根据步骤(3)测得的标准草酸样品的吸光度值和标准草酸浓度的数值制作草酸的标准曲线，通过标准曲线方程，获得草酸氧化酶活反应后样品残留草酸的浓度b mM；所述对照样品反应后的草酸理论浓度c mM；

(5)酶活单位的计算公式如下：

其中，所述草酸反应液为含有终浓度为5mM的草酸和25mM柠檬酸，pH为3.0的溶液；

所述稀释液为终浓度为72mM碳酸钠，pH为11～11.4；

所述草酸标准溶液中草酸的浓度为0，0.125mM，0.25mM，0.5mM，1.0mM，1.5mM，2.0mM和2.5mM；

所述显色液为pH 4.5～5.520～50mg/L辣根过氧化物酶、pH 5.0～6.030～50mM3,5-二氯-2羟基苯磺酸钠、pH 4.5～6.0500～1000mg/L 4-氨基安替吡啉4-AA、pH4.0～5.5100～500mM柠檬酸-NaOH缓冲液按体积比1:1:1:1混匀。

如上所述的方法制备的重组草酸氧化酶，应用于草酸脱羧酶活力的测定，或用于其它以草酸为底物或产物的酶的活力的测定，还可用于人和动物的血液和尿液以及各种含草酸的样品中草酸含量的测定。

本发明提供了一种用于高效表达可溶性草酸氧化酶的重组表达框，该重组表达框不仅能实现表达可溶性的草酸氧化酶，还达到了能高效表达的目的。

本发明提供了一种在大肠杆菌中高效表达可溶性草酸脱羧酶的方法，并将细胞破碎液简单处理后的含草酸氧化酶的破碎液上清，通过硫酸铵沉淀，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液复溶后的含草酸氧化酶的溶液，直接用于草酸脱羧酶活力测定，这种测定方法与传统的方法如市售的测定草酸的试剂盒和HPLC法相比，精确度和灵敏度较高，耗时短，成本相对较低，易于通过酶标仪对大量的样品进行高通量测定，具有很好的实用性。本发明中制备的草酸氧化酶还可用于其它以草酸为底物或产物的酶的活力的测定，还可用于人和动物的血液和尿液以及各种含草酸的样品中草酸含量的测定。

附图说明

图1为重组表达载体中的oxo基因表达框的四种形式。

图2为基于草酸氧化酶法的草酸标准曲线。

图3为不同批次和不同pH的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶解的草酸脱羧酶与剩余草酸反应时每分钟的OD492数值随时间的变化曲线。

图4为HPLC法和三个不同批次的草酸氧化酶测定5个不同样品的剩余草酸含量的对比。

具体实施方式

为了找到一种能在大肠杆菌中高效表达可溶性草酸氧化酶(OxO)的方法，本发明人对多种来源的草酸氧化酶基因(简称oxo基因)在大肠杆菌中的重组表达进行了反复研究，研究发现，将oxo基因按照大肠杆菌的密码子偏爱性进行优化，将优化的基因插入到大肠杆菌的表达载体中，在oxo基因和大肠杆菌启动子之间插入能促进目的蛋白表达的蛋白标签，或在oxo基因的后面插入编码6～120个由带电荷氨基酸组成的短肽链tag，转化高表达分子伴侣的大肠杆菌宿主菌中得到重组菌，对重组菌的发酵条件进行优化，最终实现发酵结束后，细胞破碎液上清中有大量可溶且有活性的草酸氧化酶。

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。除非特别指明，否则所用技术术语为本领域中的普通技术人员常用术语；本说明书中未注明具体条件的实验方法是按常规实验方法；各种试剂及培养基的成分和配制方法可参见常规实验手册中的操作。

本发明中用到的大肠杆菌菌株和质粒沟通过国内外出售常规生物材料的公司购买；本发明中用到的分子生物学试剂从Thermofisher公司和TOYOBO公司购买；无缝克隆试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司(http://www.vazyme.com/)；其它常用生化试剂均是市售分析纯；PCR产物回收和胶回收DNA的方法均采用omega公司的试剂盒的方法。

实施例1草酸氧化酶基因(oxo基因)的获得

发明人通过对NCBI数据库中已经进行功能验证(如小麦oxo和大麦oxo)和未被实验验证的疑似oxo基因序列进行分析，筛选获得能够用于在原核系统中进行可溶性表达草酸氧化酶的基因。对于NCBI数据库中的已知oxo基因和疑似oxo基因序列，直接全基因合成其CDS序列，构建大肠杆菌表达载体，进行表达测试。对有草酸氧化酶活性的基因，再进一步进行密码子优化，优化序列中密码子适应度指数(CAI)比原始序列提高且大于0.7，无稀有密码子，GC含量在42-58％之间，无超过18bp的重复序列；这些基因可选自小麦oxo(GeneBank Accession NO.AJ556991)，大麦oxo(GeneBank Accession NO.Y14203)，虫拟蜡菌(C.subvermispora)oxo(GeneBank Accession NO.AJ746412)，褐腐菌(D.primogenitus)oxo(GeneBank Accession NO.EJT98183)，红色毛癣菌(T.rubrum)oxo(GeneBankAccession NO.XM_003236399)，花生oxo(GenBank Accession NO.EU024475),裂褶菌(S.commune)oxo(GeneBank Accession NO.XM_003032043)，穇子(E.coracana)oxo(GenBank Accession NO.KX289589)，蒺藜苜蓿(M.truncatula)oxo(GenBank AccessionNO.XM_013612545)等。从植物组织中扩增并鉴定的草酸氧化酶蛋白序列，这些主要有香蕉OxO(SEQ ID NO.1)，甜菜OxO(SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3)，高粱OxO(SEQ ID NO.4)。以其为模版按照大肠杆菌密码子进行优化，对优化的草酸氧化酶基因序列进行分析，将去掉其编码信号肽的DNA序列送到国内基因合成公司进行人工合成。优选香蕉oxo优化基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，甜菜oxo优化基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示和蒺藜苜蓿oxo优化基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，进行表达，更优选蒺藜苜蓿oxo优化基因(SEQ ID NO.7)进行表达，其表达的蒺藜苜蓿OxO的蛋白序列如SEQ ID NO.8所示。

实施例2 oxo基因表达框的设计

本申请的发明经过大量研究发现，为了促进大肠杆菌的可溶性表达，将实例1中所述的人工合成的草酸氧化酶基因oxo基因(SEQ ID NO.5-7)的前后单独或同时增加能促进蛋白可溶表达的蛋白标签，插入到大肠杆菌表达载体pET-28a中构建系列大肠杆菌重组表达载体，之后转化大肠杆菌表达宿主，进行表达，能获得能高效表达的可溶性草酸氧化酶，不含包涵体；其中，oxo基因在重组表达载体中的表达框有四种形式，如图1所示。oxo基因表达框中的启动子为pET-28a载体中的T7启动子。

在oxo基因和大肠杆菌启动子之间插入能促进目的蛋白表达的蛋白标签的基因tag1，蛋白标签可以为GST标签，MBP标签，Thioredoxin标签，NusA标签，DsbA标签，SUMO标签等，优选GST标签和NusA标签，更优选GST标签。

在oxo基因和T7终止子序列之间插入编码6～120个由带电荷氨基酸的短肽链的基因tag2，短肽链能改善oxo基因的可溶性表达，研究发现，所述带电荷氨基酸为赖氨酸,精氨酸，组氨酸，天冬氨酸和谷氨酸，可以为单个带电荷氨基酸的串联重复，也可为任意两种或两种以上氨基酸的组合。优选带负电氨基酸(天冬氨酸和谷氨酸)的单个串联重复和两种氨基酸的组合，更优选的是谷氨酸和天冬氨酸的串联重复。带电荷氨基酸的短肽链优选为6～48个氨基酸，更优选为8～16个氨基酸。

实施例3 oxo基因重组表达载体的构建

本发明人为了发现高效表达可溶性草酸氧化酶的方法进行了反复研究。具体而言，使用蒺藜苜蓿来源的oxo基因(Mtoxo)作为植物来源草酸氧化酶的代表，构建其高效生产系统。植物和微生物来源的oxo基因的种类没有特别限制，只要是迄今为止鉴定的oxo基因原则上均可以采用。

(1)重组表达载体pET28-Mtoxo的构建(oxo表达框1)

以全基因合成的Mtoxo基因(SEQ ID NO.7)为模版，设计引物对F1/R1,对该Mtoxo基因进行扩增，对扩增产物进行胶回收纯化，方法参照市售DNA小量纯化试剂盒说明书的方法，最终得到DNA片段1(即Mtoxo基因片段，序列SEQ ID NO.7)。PCR体系为：10×PCR Buffer5μL，2mM dNTP 5μL，25mM MgSO₄ 5μL，10μM primer F/R各1.5μL，模版DNA 0.5μL，KOD-Plus-Neo 1μL，ddH₂O 32.5μL；PCR反应条件如下：94℃3min,30个循环(98℃10s，60℃30s，68℃35s)，68℃5min，4℃保温10min；以下载体构建的叙述中PCR体系与上述叙述都是一致的，下面不再赘述，PCR反应条件略有不同，主要是退火温度和延伸时间不同。以商业化购买的pET-28a质粒为模版，设计引物对F2/R2对，对质粒进行扩增，PCR反应条件中退火温度55℃，延伸时间5min，其它条件与上述Mtoxo基因扩增的PCR条件一样，扩增产物用限制性内切酶Dpn I在37℃消化2h(50μL体系，反应条件参照说明书)，对消化后的扩增产物进行胶回收纯化，最终得到DNA片段2(pET-28a片段)。通过无缝克隆试剂盒的方法，将上述DNA片段1和DNA片段2连接起来，转化大肠杆菌DH5α。用Inoue法制备DH5α超级感受态，方法参考《分子克隆实验指南(第3版)》，涂布到含有50μg/ml卡拉霉素的抗性LB固体培养基平板上筛选，通过PCR验证和测序验证阳性克隆子，测序正确的重组质粒命名为pET28-Mtoxo；所用引物序列如下：

F1(SEQ ID NO.9)：

5’-AGGAGATATACCATGTCAGACCCAGACCCGGTAC-3’

R1(SEQ ID NO.10)：

5’-GCAGCCGGATCTCAGTTAGCGCTCTTGCTTTGGGT-3’

F2(SEQ ID NO.11)：5’-CTGAGATCCGGCTGCTAAC-3’

R2(SEQ ID NO.12)：5’-CATGGTATATCTCCTTCT-3’

(2)重组表达载体pET28-GST-Mtoxo的构建(oxo表达框2)

以商业化购买的pET-41a质粒为模版，设计引物对F3/R3对，扩增GST标签，PCR反应条件与上述Mtoxo基因扩增的PCR条件一样，扩增产物用限制性内切酶Dpn I在37℃消化2h(50μL体系，反应条件参照说明书)，对消化后的扩增产物进行胶回收纯化，最终得到DNA片段3(GST标签)。以上述构建的质粒pET28-Mtoxo为模版，设计引物对F4和R2，扩增pET28-Mtoxo质粒片段，PCR反应条件中退火温度55℃，延伸时间1.5min，其它条件与上述Mtoxo基因扩增的PCR条件一样，扩增产物用限制性内切酶Dpn I在37℃消化2h，对消化后的扩增产物进行胶回收纯化，最终得到DNA片段4(即pET28-Mtoxo质粒片段)。通过无缝克隆试剂盒的方法，将上述DNA片段3和DNA片段4连接起来，转化大肠杆菌DH5α。用Inoue法制备DH5α超级感受态，方法参考《分子克隆实验指南(第3版)》，涂布到含有50μg/ml卡拉霉素的抗性LB固体培养基平板上筛选，通过PCR验证和测序验证阳性克隆子，测序正确的重组质粒命名为pET28-GST-Mtoxo；其中，所用引物序列如下：

F3(SEQ ID NO.13)：

5’-AGGAGATATACCATGTCCCCTATACTAGGTTATTG-3’

R3(SEQ ID NO.14)：

5’-CGGGTCTGGGTCTGACTTGTCGTCGTCATCTTTTGGAGGATGGTCGC

CAC-3’

F4(SEQ ID NO.15)：5’-TCAGACCCAGACCCGGTAC-3’

(3)重组表达载体pET28-GST-Mtoxo-12E的构建(oxo表达框3)

以上述构建的pET28-GST-Mtoxo载体为模版，设计引物对F5/R5对其进行线性化扩增，PCR反应条件中退火温度57℃，延伸时间1.5min，其它条件与上述Mtoxo基因扩增的PCR条件一样，扩增产物用限制性内切酶Dpn I在37℃消化2h，对消化后的扩增产物进行胶回收纯化，最终得到DNA片段5(即pET28-GST-Mtoxo片段)。在Mtoxo基因后面增加一个12个谷氨酸(简称12E,下同)的标签，通过设计引物对F6/R6，将两条互补引物溶解在10mM的pH 8.0的TE buffer中按照浓度比1:1混合，按照以下程序：94℃2min，55℃5min，4℃5min直接退火，得到短的双链DNA片段6(即12E片段)，具体编码标签12E片段的DNA序列为(SEQ ID NO.16)5’-GAAGAAGAAGAGGAAGAAGAAGAGGAAGAAGAAGAG-3’，通过无缝克隆试剂盒的方法，将上述DNA片段5和DNA片段6连接起来，转化大肠杆菌DH5α。用Inoue法制备DH5α超级感受态,方法参考《分子克隆实验指南(第3版)》，涂布到含有50μg/ml卡拉霉素的抗性LB固体培养基平板上筛选，通过PCR验证和测序验证阳性克隆子，测序正确的重组质粒命名为pET28-GST-Mtoxo-12E；其中，所用引物序列如下：

F5(SEQ ID NO.17)：5’-TAACTGAGATCCGGCTGCTAAC-3’

R5(SEQ ID NO.18)：5’-GCGCTCTTGCTTTGGGTCCA-3’

F6(SEQ ID NO.19)：

5’-CCAAAGCAAGAGCGCGAAGAAGAAGAGGAAGAAGAAGAGGAAGAAGAAGAG-3’

R6(SEQ ID NO.20)：

5’-GCCGGATCTCAGTTACTCTTCTTCTTCCTCTTCTTCTTCCTCTTCTTCTTC-3’

(4)重组表达载体pET28-Mtoxo-12E的构建(oxo表达框4)

提取上述构建的pET28-GST-Mtoxo载体为模版，以磷酸化处理的引物F4和R2进行扩增，扩增产物用限制性内切酶Dpn I在37℃消化2h，用T4连接酶进行平末端连接，为了提高连接效率，采用加PEG4000的反应体系，具体参照T4连接酶的说明书进行。连接产物直接转化大肠杆菌DH5α，涂布到含有50μg/ml卡拉霉素的抗性LB固体培养基平板上筛选，通过PCR验证和测序验证阳性克隆子，测序正确的重组质粒命名为pET28-Mtoxo-12E。

实施例4 oxo基因在大肠杆菌中的重组表达

采用市售质粒小提试剂盒的方法，提取上述构建的4种含oxo基因的重组表达质粒pET28-Mtoxo，pET28-GST-Mtoxo，pET28-GST-Mtoxo-12E和pET28-Mtoxo-12E以及空质粒pET-28a分别转化载体转化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)，涂布到含有50μg/ml卡拉霉素的抗性LB固体培养基平板上筛选，通过PCR验证阳性克隆子，得到重组菌株pET28-Mtoxo/BL21(DE3)，pET28-GST-Mtoxo/BL21(DE3)，pET28-GST-Mtoxo-12E/BL21(DE3)，pET28-Mtoxo-12E/BL21(DE3)，pET-28a/BL21(DE3)。对上述5种菌株进行诱导表达，采用IPTG进行诱导表达，为了使得胞内表达的oxo不形成或少形成包涵体，折叠成正确的结构，采用低温培养，温度范围为15-32℃，优选20-28℃，更优选25℃；种子培养基为LB培养基，发酵培养基是LB培养基的基础上加终浓度为3～20g/L的甜菜碱，甘露糖，甘露醇，海藻糖和山梨醇，优选添加甘露糖和山梨醇，更优选添加6～8g/L甘露糖；4种重组菌株起始生长温度为37℃，待OD600达到0.8～1.0之间时降低温度到25℃，一次性或分批加入1mM的IPTG和1～50mM的MnCl₂，优选加入3～20mM的MnCl₂，更优选加入5mM的MnCl₂；诱导6～8小时后发酵结束，4℃，12000g离心收集菌体，超声波破碎菌体，12000g离心去沉淀，手机破碎液上清，破碎液上清测定草酸氧化酶活力。草酸氧化酶活力测定参照文献方法(Requena L.et al.,Barley(Hordeumvulgare)oxalate oxidase is a manganese-containing enzyme,Biochem.J.1999,343(1):185-190)。不同菌株的破碎液上清的草酸氧化酶活力如表1所示，oxo基因前后带上标签可以促进蛋白可溶性表达的，其中在oxo基因前后都加入tag，可溶性表达的效果较好，表现出草酸氧化酶活力较高。

表1不同菌株破碎液上清的草酸氧化酶活力

菌株	酶活力(U/L)
		pET-28a/BL21(DE3)	0
pET28-Mtoxo/BL21(DE3)	6.1
		pET28-GST-Mtoxo/BL21(DE3)	396
pET28-GST-Mtoxo-12E/BL21(DE3)	693
		pET28-Mtoxo-12E/BL21(DE3)	158

实施例5 oxo基因与分子伴侣在大肠杆菌中的共表达

为了进一步提高草酸氧化酶在大肠杆菌中可溶性表达的效果，采用oxo基因与分子伴侣质粒在大肠杆菌中的共表达的方式，研究发现，所述分子伴侣可为DnaK、DnaJ、GrpE、tig、GroEL或GroES等,可将分子伴侣质粒pGRO7、pG-KJE7、pG-Tf2、pG-KJE8或pTf16等与表达质粒共同导入大肠杆菌表达宿主，也可将分子伴侣基因与oxo基因整合到一个载体中导入大肠杆菌宿主菌，优选将包含oxo基因表达盒和表达分子伴侣质粒pGRO7共同导入到大肠杆菌表达宿主菌中。上述分子伴侣质粒的相关信息如表2所示。

表2：各质粒编码的伴侣蛋白质种类及诱导物

本实施例中采用分子伴侣质粒为pGRO7，是通过国内生物材料销售公司购买的，直接转化大肠杆菌表达菌株pET28-GST-Mtoxo-12E/BL21(DE3)，涂布到含有50μg/ml卡拉霉素和10μg/ml氯霉素的LB固体培养基平板上筛选，通过PCR验证阳性克隆子，重组菌株命名为pGRO7&pET28-GST-Mtoxo-12E/BL21(DE3)。采用实例4中的方法进行诱导表达后，该重组菌株的破碎液上清的草酸氧化酶活力进一步提高到2350U/L。pG-KJE7、pG-Tf2、pG-KJE8或pTf16等分子伴侣质粒与表达质粒转化大肠杆菌表达菌株pET28-GST-Mtoxo-12E/BL21(DE3)的实验过程与上述pGRO7质粒的类似，不在赘述。由表3的结果可知，不同的分子伴侣质粒都不同程度提高了大肠杆菌中重组草酸氧化酶的表达活力，采用pG-Tf2质粒的效果最佳，破碎液上清的草酸氧化酶活力达到2960U/L。

表3不同表达分子伴侣菌株破碎液上清的草酸氧化酶活力

对表达后的草酸氧化酶进行核苷酸序列测序，结果说明测序验证正确，与之前设计一致，没有差别；且导入分子伴侣质粒不会影响草酸氧化酶的基因序列(核苷酸序列)和蛋白序列。

实施例6 草酸氧化酶的初步纯化工艺

将实例5中构建的菌株pGRO7&pET28-GST-Mtoxo-12E/BL21(DE3)，按照实例4中的方法进行诱导表达后，超声波破碎菌体，离心去沉淀得到破碎液上清。对破碎液上清进行初步纯化，分别尝试采用有机溶剂(乙醇和丙酮)和硫酸铵对破碎液上清中的蛋白进行沉淀，结果发现硫酸铵沉淀蛋白的效果比较好。对加入硫酸铵的量进行了优化，分别向破碎液上清中加入终浓度(w/v)为20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％和60％的硫酸铵，考察其沉淀下来的蛋白含量和收率，草酸氧化酶活力和纯度。离心收集沉淀下来的蛋白，用等体积的10mM，25mM或50mM的pH 5.0-6.0的柠檬酸–柠檬酸钠缓冲液溶解沉淀蛋白，优选10mM的pH5.0的柠檬酸–柠檬酸钠缓冲液溶解。上述结果发现20～40％的硫酸铵沉淀效果较好，优选30％的硫酸铵沉淀目的蛋白，最优条件下，即30％的硫酸铵沉淀，10mM pH 5.0的柠檬酸–柠檬酸钠缓冲液溶解沉淀蛋白，草酸氧化酶的蛋白收率大于90％，草酸氧化酶的比活力和纯度分别达到50U/mg和80％。为了促进沉淀蛋白的溶解，可以加入溶解沉淀蛋白的柠檬酸–柠檬酸钠缓冲液中加入终浓度为10～30％(v/v)的异丙醇，甘油，乙二醇或乙醇，优选异丙醇。异丙醇浓度优选为10％～20％，更优选为16％。将溶解的蛋白经过3～5层中速定性滤纸真空过滤后，置于4℃保存备用。

实施例7 制备的草酸氧化酶应用于测定草酸脱羧酶活力

将实例6中制备的草酸氧化酶应用于测定草酸脱羧酶活力。通过草酸氧化酶测定残余草酸浓度来计算草酸脱羧酶活力的方法，包括以下步骤：

(1)草酸脱羧酶降解草酸生成甲酸和CO₂：将含草酸脱羧酶的样品进行n倍稀释；取aμL稀释的草酸脱羧酶样品，加入1mL的草酸反应液中，37℃，800rpm恒温混匀仪反应x min，加入50μL的2.5M H₂SO₄终止反应；其中x一般为5～20；对照样品是加aμL的双蒸水代替aμL稀释的草酸脱羧酶样品，其他步骤同草酸脱羧酶样品的操作；

(2)将终止反应后的样品12000rpm离心10min；取上清液加入2～4倍体积的稀释液中，漩涡混合均匀，此步骤应确定稀释后样品pH落在5.0～5.5单位的范围内；

(3)酶标仪检测：将不同浓度的标准草酸样品和上述步骤(2)处理后的待测样品各20μL分别加入96孔酶标板；再加入由将显色液、实例6中制备的草酸氧化酶酶液(活力较高的样品适当稀释2～4倍，使草酸氧化酶的活力在500～800U/L)、纯水以体积比8:3:7混合均匀的混合液，每孔加入180μL；将酶标板放入酶标仪中，运行程序①板进②振动20s③37℃孵育10～15min并保持恒温④波长492nm扫描⑤板出。待程序结束后拷出数据，分析计算。

(4)稀释后样品中草酸残留量：根据标准草酸样品的吸光度值和标准草酸浓度的数值制作草酸的标准曲线，用excel线性拟合的直线的斜率的R²值在0.99～1.0之间标曲符合要求。通过标准曲线方程，获得草酸氧化酶活反应后样品残留草酸的浓度b mM；对照样品反应后的草酸理论浓度为c mM；

(5)酶活单位的计算公式如下：

其中，①a——草酸氧化酶酶活反应时加入样品的体积(单位μL)

②b——草酸氧化酶活反应后样品残留草酸的浓度(单位mM)

③x——草酸脱羧酶活反应催化反应时间(单位min)

④c——对照样品反应后的草酸理论浓度(单位mM)

⑤n——原始样品稀释的倍数

草酸反应液的配制：用容量瓶配制含有5mM的草酸及25mM柠檬酸的反应液，用KOH调节至pH 3.0，转入蓝盖瓶，贴标签保存。

终止反应液的配制(2.5M H₂SO₄)：量取35mL H₂SO₄贴壁缓慢加入含有160mL高纯水的烧杯中，搅拌均匀，将溶液转入250mL容量瓶中，定容至250mL，混合均匀后转入蓝盖瓶，贴标签保存。

稀释液的配制：称量7.63g无水碳酸钠，溶解于1L水中，检测pH应在11～11.4左右，pH过低则用15％碳酸钠溶液调至11.2，pH过高则用2.5mM硫酸调整至11.2。

草酸标准溶液的配制：使用100mM的NaH₂PO₄对草酸反应液进行稀释至草酸浓度为0,0.125mM,0.25mM,0.5mM,1.0mM,1.5mM,2.0mM和2.5mM。

显色液配制：使用前将以下四种试剂(试剂1-4)按照适当的体积比，如按照体积比1:1:1:1混匀即为显色液，置于4℃冰箱存储。

试剂1：pH 4.5～5.5 20～50mg/L辣根过氧化物酶(HRP)

试剂2：pH 5.0～6.0 30～50mM 3,5-二氯-2羟基苯磺酸钠(DHBS)

试剂3：pH 4.5～6.0 500～1000mg/L 4-氨基安替吡啉4-AA

试剂4：pH 4.0～5.5 100～500mM柠檬酸-NaOH缓冲液；

草酸氧化酶酶液配置：将实例6中制备的草酸氧化酶酶液适当稀释2-5倍，使草酸氧化酶的活力在500～800U/L，保证酶比活大于1U/mg,浓度大于0.1mg/ml。实施例8具体应用

一草酸脱羧酶样品用HPLC法测定的活力为23200U/L,将该样品用上述的基于草酸氧化酶的检测方法进行测定，具体步骤为：

(1)用稀释液将含草酸脱羧酶的样品进行3倍稀释。取25μL稀释的草酸脱羧酶样品，加入1mL的草酸反应液中，37℃，800rpm恒温混匀仪反应10min，加入50μL的2.5M H₂SO₄终止反应；对照样品为加入25μL的双蒸水，代替25μL稀释的草酸脱羧酶样品，其他步骤同草酸脱羧酶样品的操作；

(2)将终止反应后的样品12000rpm离心10min；取上清液加入2倍体积的稀释液中(相当于原始样品被稀释3倍)，漩涡混合均匀，稀释后样品pH为5.3；

(3)酶标仪检测：将不同浓度的标准草酸样品和上述步骤(2)处理后的待测样品各20μL分别加入96孔酶标板；再加入由将显色液、实例6中制备的草酸氧化酶稀释后酶液活力在580U/L、纯水以体积比8:3:7混合均匀的混合液，每孔加入180μL；

将酶标板放入酶标仪中，运行程序①板进②振动20s③37℃孵育10min并保持恒温④波长492nm扫描⑤板出。

(4)稀释后样品中草酸残留量：根据标准草酸样品的吸光度值和标准草酸浓度的数值制作草酸的标准曲线，如图2所示，用excel线性拟合的直线的斜率的R²值达到0.9993。通过标准曲线方程，获得草酸氧化酶活反应后样品残留草酸的浓度。对照样品的残留草酸的理论值c＝5mM*1000μL/(1000+25+50)μL＝4.651mM。稀释后样品的吸光度值为0.895(同一样品3个平行样的平均值)，用图2中的公式计算得草酸浓度为0.943mM，反应后样品残留草酸的浓度b＝0.943mM*3＝2.829mM；

(5)酶活单位的计算参照上述的计算公式，其中n＝3，c＝4.651，x＝10，a＝25，b＝2.829，计算出的样品的草酸脱羧酶的活力为23500U/L,用该方法测定的酶活力与HPLC相比差比较小，误差小于1％。

其中显色液配制：使用前将以下四种试剂(试剂1-4)按照体积比1:1:1:1混匀即为显色液，置于4℃冰箱存储。

试剂1：pH 4.9 40mg/L辣根过氧化物酶(HRP)

试剂2：pH 5.4 35mM 3,5-二氯-2羟基苯磺酸钠(DHBS)

试剂3：pH 5.0 750mg/L 4-氨基安替吡啉4-AA

试剂4：pH 4.5 200mM柠檬酸-NaOH缓冲液；

对三种不同pH值的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 4.5，5.0和5.5)溶解的草酸氧化酶和两个不同批次(第一批次稀释后草酸氧化酶活力为520U/L,第2批稀释后的草酸氧化酶为580U/L)的草酸氧化酶测定草酸氧化酶活力进行了对比测试，每1分钟扫描一次OD492的数值，共扫描90次，发现pH 5.0的柠檬酸–柠檬酸钠缓冲液溶解的草酸氧化酶反应时间较快，结果见图3所示，10min左右消耗完反应液中的草酸，测定草酸时稳定性较好，两个批次之间差别很小。其中，从图3可以看出，pH5.0时，达到最大吸光度值的时间最短，10分钟左右，最大吸光度值在2左右，较为适中，测定时误差较小，在10-30分钟时间内显色物质的稳定性较高(扫描得到的吸光度值波动很小)，最终测定的草酸残留浓度的准确性较高，草酸标准曲线的R²值能落在0.99～1.0之间，与传统的HPLC检测方法相比，误差低于1％；而pH5.5时，最大吸光度值在60分钟才达到稳定，整个检测过程耗时较长；pH 4.5时候，达到最大吸光度值的时间超过10分钟，但吸光度值较低，显色物质在10-30分钟时间的稳定性较pH5.0时候差，在此pH条件下草酸标准曲线的R²值达不到0.99，测定的数值与传统的HPLC检测方法测定数值相比通常偏低，误差大于10％，所以，优选pH 5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶解的草酸氧化酶。

为了验证基于草酸氧化酶法与HPLC检测草酸脱羧酶活力的差别，选取几个不同草酸脱羧酶样品与草酸反应液反应10min后用2.5M H₂SO₄终止反应的样品，分别采用HPLC法(廖贤平等.武警医学院学报,19(1):47-50)和本发明所述的基于草酸氧化酶测定草酸含量的方法进行对比，选取三个不同批次的草酸氧化酶，用于测试本方法的准确性。结果如图4所示，其中酶法1、酶法2、酶法3是三个不同批次的草酸氧化酶，图4中三个不同批次的酶，测定5个不同的草酸脱羧酶样品，两种方法测定的数值的差比低于1％；说明本发明所述的基于草酸氧化酶测定草酸含量的方法与经典的HPLC法测定的草酸含量没有显著性差异，结果也表明本发明所述的基于草酸氧化酶测定草酸含量的方法准确性和重复性较好。

基于本发明的草酸氧化酶测定剩余草酸含量间接测定草酸脱羧酶活力的方法，可以方便的通过酶标仪进行高通量的测定，每块96孔板按照每个样品2-3个重复，可以在1小时左右测定32-48个样品(包含制作标准曲线的样品)，而HPLC法每小时只能测定1个样品(按每个样品3个重复计算)。本发明建立的检测草酸脱羧酶活力的方法，所用的草酸氧化酶是通过较低的成本制备，不需要纯化到很高的纯度，即可以满足剩余草酸含量的测定，总体成本比较低，除了应用于草酸脱羧酶活力的测定，也可用于其它以草酸为底物或产物的酶的活力的测定，还可用于人和动物的血液和尿液以及各种含草酸的样品中草酸含量的测定。

应当指出，以上所述仅为本发明的优选实施例，对于本技术中的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术特征的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些润饰和改进也应属于本发明的专利保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉康复得生物科技股份有限公司

<120> 一种可溶性草酸氧化酶的制备方法及其应用

<130>

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 213

<212> PRT

<213> 香蕉OxO

<400> 1

Phe Asp Pro Ser Pro Leu Gln Asp Phe Cys Val Ala Asp Tyr Asp Ser

1 5 10 15

Asn Val Phe Val Asn Gly Phe Ala Cys Lys Asn Ala Lys Ala Val Thr

20 25 30

Ala Glu Asp Phe Tyr Phe Thr Gly Leu Asp Lys Pro Ala Ser Thr Ala

35 40 45

Asn Glu Leu Gly Ala Asn Ile Thr Leu Val Asn Val Glu Arg Leu Pro

50 55 60

Gly Leu Asn Thr Leu Gly Val Ala Met Ser Arg Ile Asp Tyr Ala Pro

65 70 75 80

Phe Gly Leu Asn Pro Pro His Ser His Pro Arg Ser Ser Glu Ile Leu

85 90 95

His Val Ala Glu Gly Thr Leu Tyr Ala Gly Phe Val Thr Ala Asn Thr

100 105 110

Glu Asn Gly Asn Leu Leu Phe Ala Lys Lys Leu Lys Lys Gly Asp Ala

115 120 125

Phe Val Phe Pro Arg Gly Leu Ile His Phe Gln Phe Asn Ile Gly Asp

130 135 140

Thr Asp Ala Val Ala Phe Ala Thr Phe Gly Ser Gln Ser Pro Gly Leu

145 150 155 160

Val Thr Thr Ala Asn Ala Leu Phe Gly Ser Lys Pro Pro Ile Pro Asp

165 170 175

Tyr Ile Leu Ala Gln Ala Val Gln Leu Ser Lys Thr Thr Val Gly Trp

180 185 190

Leu Gln Gln Gln Gln Trp Leu Asp Ile Ala Gln Glu Tyr Gly Gln Arg

195 200 205

Leu Val Gln Ala Asn

210

<210> 2

<211> 216

<212> PRT

<213> 甜菜OxO 1

<400> 2

Ser Asp Pro Ala Pro Leu Gln Asp Phe Cys Ile Ala Val Asn Asp Pro

1 5 10 15

Asn Ser Ala Val Leu Val Asn Gly Lys Leu Cys Lys Asn Pro Lys Glu

20 25 30

Val Thr Ile Asp Asp Phe Leu Tyr Lys Gly Phe Asn Ile Pro Ala Asp

35 40 45

Thr Asn Asn Thr Gln Gly Ala Ser Ala Thr Leu Val Asp Ile Thr Leu

50 55 60

Phe Pro Ala Val Asn Thr Gln Gly Val Ser Met Ala Arg Val Asp Phe

65 70 75 80

Ala Pro Phe Gly Leu Asn Thr Pro His Leu His Pro Arg Gly Ser Glu

85 90 95

Val Phe Ala Val Met Glu Gly Ile Met Tyr Ala Gly Phe Val Thr Thr

100 105 110

Asp Tyr Lys Leu Tyr Asp Thr Ile Ile Lys Lys Gly Asp Ile Ile Val

115 120 125

Phe Pro Gln Gly Leu Ile His Phe Gln Leu Asn Leu Gly Lys Thr Asp

130 135 140

Ala Leu Ala Ile Ala Ser Phe Gly Ser Gln Asn Pro Gly Arg Ile Asn

145 150 155 160

Ile Ala Asp Ser Val Phe Gly Thr Thr Pro Arg Val Leu Asp Asp Val

165 170 175

Leu Thr Lys Gly Phe Gln Ile Asp Glu Leu Leu Val Lys Gln Leu Arg

180 185 190

Ser Gln Phe Ser Thr Asp Asn Ile Ser Thr Ser Thr Gly Arg Ser Phe

195 200 205

Leu Lys Leu Leu Ser Glu Thr Tyr

210 215

<210> 3

<211> 216

<212> PRT

<213> 甜菜OxO 2

<400> 3

Ser Asp Pro Gly Leu Leu Gln Asp Phe Cys Val Gly Val Asn Asp Pro

1 5 10 15

Asp Ser Ala Val Phe Val Asn Gly Lys Phe Cys Lys Asn Pro Lys Asp

20 25 30

Val Thr Ile Asp Asp Phe Leu Tyr Lys Gly Phe Asn Ile Pro Ser Asp

35 40 45

Thr Asn Asn Thr Gln Arg Ala Glu Ala Thr Leu Val Asp Val Asn Arg

50 55 60

Phe Pro Ala Leu Asn Thr Leu Gly Val Ala Met Ala Arg Val Asp Phe

65 70 75 80

Ala Ser Phe Gly Leu Asn Thr Pro His Leu His Pro Arg Gly Ser Glu

85 90 95

Ile Phe Ala Val Leu Glu Gly Thr Leu Tyr Ala Gly Ile Val Thr Thr

100 105 110

Asp Tyr Lys Leu Phe Asp Thr Val Leu Arg Lys Gly Asp Met Ile Val

115 120 125

Phe Pro Gln Gly Leu Ile His Phe Gln Leu Asn Leu Gly Lys Thr Asp

130 135 140

Ala Leu Ala Ile Ala Ser Phe Gly Ser Gln Phe Pro Gly Arg Val Asn

145 150 155 160

Val Ala Asn Gly Val Phe Gly Thr Thr Pro Gln Ile Leu Asp Asp Val

165 170 175

Leu Thr Gln Ala Phe Gln Val Asp Glu Met Val Ile Gln Gln Leu Arg

180 185 190

Ser Gln Phe Ser Gly Gln Asn Ile Ser Ile Asn Thr Gly Arg Ser Ile

195 200 205

Leu Lys Leu Leu Thr Asp Val Ala

210 215

<210> 4

<211> 201

<212> PRT

<213> 高粱OxO

<400> 4

Thr Asp Pro Asp Pro Leu Gln Asp Phe Cys Val Ala Asp Leu Ser Gly

1 5 10 15

Lys Leu Ser Val Asn Gly Phe Pro Cys Gln Pro Thr Ser Ser Ala Gly

20 25 30

Asp Glu Phe Leu Phe Ser Thr Lys Ile Ala Thr Gly Gly Asp Pro Leu

35 40 45

Ala Asn Pro Asn Gly Ser Asn Val Thr Glu Leu Asp Val Ser Glu Trp

50 55 60

Pro Gly Val Asn Thr Leu Gly Val Ser Met Asn Arg Val Asp Phe Ala

65 70 75 80

Pro Gly Gly Thr Asn Pro Pro His Val His Pro Arg Ala Thr Glu Val

85 90 95

Gly Leu Val Thr Arg Gly Glu Leu Leu Val Gly Ile Ile Gly Ser Leu

100 105 110

Asp Ser Gly Asn Arg Tyr Tyr Ser Lys Val Val Arg Ala Gly Glu Thr

115 120 125

Phe Val Ile Pro Arg Gly Leu Met His Phe Gln Phe Asn Val Gly Lys

130 135 140

Glu Asp Ala Ala Met Val Val Ser Phe Asn Ser Gln Asn Pro Gly Ile

145 150 155 160

Ile Phe Val Pro Leu Thr Leu Phe Gly Ser Ser Pro Pro Ile Pro Thr

165 170 175

Pro Val Leu Ser Lys Ala Leu Arg Val Asp Ala Ser Val Val Asp Leu

180 185 190

Leu Lys Ser Lys Phe Ala Gly Gly Tyr

195 200

<210> 5

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工合成香蕉OxO基因

<400> 5

ttcgacccct cgccgttgca agatttttgc gtagccgact atgattctaa tgtgtttgta 60

aacggattcg cttgtaagaa tgcgaaggca gtcactgcag aagatttcta cttcactgga 120

cttgataaac ctgcttctac agccaatgag ttaggtgcca atatcacgtt ggtaaatgtt 180

gagcgtttac caggactgaa tacgcttgga gtggctatga gtcgtattga ctacgcgccc 240

ttcggtttga atcctcctca ttctcacccc cgctctagcg aaatcctgca cgttgcagag 300

gggacgttat acgcaggttt cgtcacagct aataccgaga atggaaacct gttatttgcc 360

aagaaactta aaaaaggtga cgccttcgta tttcctcgcg gacttattca tttccagttt 420

aacatcgggg acacggatgc ggttgcattc gctacgttcg gttctcaaag tcctggatta 480

gttactacag cgaacgccct gtttgggtcg aaaccaccga ttcccgatta tattttggcg 540

caggccgtac agctttccaa aactacagta gggtggcttc agcaacaaca atggttagac 600

attgctcaag aatatggtca gcgcttggtt caagccaatt aa 642

<210> 6

<211> 651

<212> DNA

<213> 人工合成甜菜OxO基因1

<400> 6

tcagatcccg caccattaca agacttttgc attgccgtga acgatccgaa tagcgcggtg 60

ttagtcaacg ggaaattgtg taaaaatcct aaagaagtaa ctattgacga ttttctttat 120

aaaggattca acatccctgc cgacacaaat aacacccaag gggcttccgc taccttagta 180

gacatcacat tgtttcccgc agtcaatacc caaggagtgt ctatggcacg tgttgatttc 240

gccccgtttg gattaaatac tccccacttg catcctcgtg ggtctgaggt ctttgctgta 300

atggagggga tcatgtatgc tgggtttgtg accacggact acaaattata tgatacgatt 360

attaagaaag gcgatattat cgttttcccg cagggtttga ttcatttcca gttgaacctt 420

gggaagacag acgccttggc cattgcctcg tttggttccc aaaatccggg acgtattaac 480

attgcagatt ccgtgttcgg gacgacgcca cgcgtacttg acgatgttct tactaaggga 540

ttccaaatcg acgaattgtt agtaaagcag ctgcgtagcc agttttcgac tgacaacatc 600

tctacctcta ctggccgctc atttttaaaa ttactgtctg agacctacta a 651

<210> 7

<211> 612

<212> DNA

<213> 人工合成蒺藜苜蓿 oxalate oxidase 基因

<400> 7

tcagacccag acccggtaca ggatttctgt attccgaatc caatccttgc gagcatgatt 60

aaaacacatc acacatttca caccatcctt ccatgtaaaa acagcagcga agtcattacc 120

aacgatttta tctttagtaa tatgaagacc tcgggtaact tttccgagac tgggctggca 180

gttatgcctg ctaaccctac taatttccct ggattgaata cattgggcat gtcatttgcg 240

cgtactgata tcgagattgg tggcattaac cctcctcatt tccacccgcg tgccactgag 300

cttattcatg ttatccaagg aaaggtctac tcgggctttg tagattctaa taataaagtg 360

ttcgcccgta tcctggaaca gggtgaagtc atggttttcc ctcgcggttt agtacatttt 420

atgatgaatg tgggggatga agtcgttaca ctgtttggta gtttcaatag tcaaaaccca 480

ggactgcaga agatcccctc agcggtcttc ggctccggaa ttgatgaaga gttacttcaa 540

aaagccttcg gtttgtccag caaacagatc ggaacaatga aacgcaaatt ggacccaaag 600

caagagcgct aa 612

<210> 8

<211> 203

<212> PRT

<213> 优化后的蒺藜苜蓿 OxO

<400> 8

Ser Asp Pro Asp Pro Val Gln Asp Phe Cys Ile Pro Asn Pro Ile Leu

1 5 10 15

Ala Ser Met Ile Lys Thr His His Thr Phe His Thr Ile Leu Pro Cys

20 25 30

Lys Asn Ser Ser Glu Val Ile Thr Asn Asp Phe Ile Phe Ser Asn Met

35 40 45

Lys Thr Ser Gly Asn Phe Ser Glu Thr Gly Leu Ala Val Met Pro Ala

50 55 60

Asn Pro Thr Asn Phe Pro Gly Leu Asn Thr Leu Gly Met Ser Phe Ala

65 70 75 80

Arg Thr Asp Ile Glu Ile Gly Gly Ile Asn Pro Pro His Phe His Pro

85 90 95

Arg Ala Thr Glu Leu Ile His Val Ile Gln Gly Lys Val Tyr Ser Gly

100 105 110

Phe Val Asp Ser Asn Asn Lys Val Phe Ala Arg Ile Leu Glu Gln Gly

115 120 125

Glu Val Met Val Phe Pro Arg Gly Leu Val His Phe Met Met Asn Val

130 135 140

Gly Asp Glu Val Val Thr Leu Phe Gly Ser Phe Asn Ser Gln Asn Pro

145 150 155 160

Gly Leu Gln Lys Ile Pro Ser Ala Val Phe Gly Ser Gly Ile Asp Glu

165 170 175

Glu Leu Leu Gln Lys Ala Phe Gly Leu Ser Ser Lys Gln Ile Gly Thr

180 185 190

Met Lys Arg Lys Leu Asp Pro Lys Gln Glu Arg

195 200

<210> 9

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

aggagatata ccatgtcaga cccagacccg gtac 34

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

gcagccggat ctcagttagc gctcttgctt tgggt 35

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

ctgagatccg gctgctaac 19

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

catggtatat ctccttct 18

<210> 13

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

aggagatata ccatgtcccc tatactaggt tattg 35

<210> 14

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

cgggtctggg tctgacttgt cgtcgtcatc ttttggagga tggtcgccac 50

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

tcagacccag acccggtac 19

<210> 16

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

gaagaagaag aggaagaaga agaggaagaa gaagag 36

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

taactgagat ccggctgcta ac 22

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

gcgctcttgc tttgggtcca 20

<210> 19

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 19

ccaaagcaag agcgcgaaga agaagaggaa gaagaagagg aagaagaaga g 51

<210> 20

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 20

gccggatctc agttactctt cttcttcctc ttcttcttcc tcttcttctt c 51

Claims

1.一种用于高效表达可溶性草酸氧化酶的重组表达框，其特征在于，其包括大肠杆菌启动子，草酸氧化酶基因和终止子，其中所述草酸氧化酶基因为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列，所述大肠杆菌启动子为大肠杆菌表达载体pET-28a中的T7启动子。

2.一种用于高效表达可溶性草酸氧化酶的重组表达框，其特征在于，其包括大肠杆菌启动子，草酸氧化酶基因，终止子，还包括所述草酸氧化酶基因的前置标签和所述草酸氧化酶基因的后置标签中的至少一种，所述前置标签为在所述草酸氧化酶基因和所述大肠杆菌启动子之间插入的能促进目的蛋白表达的蛋白标签基因，所述后置标签为如SEQ ID NO.16所示的短肽链基因，所述短肽链用于改善草酸氧化酶的可溶性表达；

所述蛋白标签为GST标签、MBP标签、硫氧还蛋白标签、NusA标签、DsbA标签或SUMO标签；

所述大肠杆菌启动子为大肠杆菌表达载体pET-28a中的T7启动子。

3.一种表达可溶性草酸氧化酶的重组菌，其特征在于，将如权利要求1或2所述的重组表达框转化入大肠杆菌宿主菌或转化入具有表达分子伴侣的大肠杆菌宿主菌中得到重组菌。

4.如权利要求3所述的重组菌，其特征在于，所述将如权利要求1或2所述的重组表达框转化入大肠杆菌宿主菌或转化入具有表达分子伴侣的大肠杆菌宿主菌中得到重组菌的方法为：将所述的重组表达框与分子伴侣基因插入到一个表达载体中后转化入大肠杆菌宿主菌，所述分子伴侣为DnaK、DnaJ、GrpE、tig、GroEL或GroES；或者将包含权利要求1或2所述的重组表达框的表达质粒与表达分子伴侣的质粒pGRO7、pG-KJE7、pG-Tf2、pG-KJE8或pTf16共同导入所述大肠杆菌宿主菌。

5.如权利要求3或4所述的重组菌的诱导表达方法，其特征在于，用IPTG进行诱导表达，采用15～32℃的低温培养，诱导过程中一次性或分批加入1～50mM的MnCl₂，诱导培养基中含有终浓度为3～20g/L的促进疏水性蛋白溶解的促溶物；所述促溶物为甜菜碱、甘露糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇。

6.如权利要求5所述的重组菌的诱导表达方法，其特征在于，所述低温培养为20～28℃，所述MnCl₂为5～10mM，所述促溶物为6～8g/L的甘露糖。

7.如权利要求3或4所述的重组菌的诱导表达可溶性草酸氧化酶的纯化方法，其特征在于，将所述重组菌诱导培养4～8h后，离心收集菌体，进行超声破碎，离心收集破碎液上清，向细胞破碎液上清中加入硫酸铵使其终浓度为20％～40％，进行沉淀，离心收集沉淀蛋白，用等体积的10mM、25mM或50mM的pH 5.0～6.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶解所述沉淀蛋白，所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中含有终浓度为5～40％的异丙醇，甘油，乙二醇或乙醇，将溶解的蛋白经过3～5层中速定性滤纸真空过滤后，获得纯化后的可溶性草酸氧化酶。

8.如权利要求7所述的重组菌的诱导表达可溶性草酸氧化酶的纯化方法，其特征在于，所述硫酸铵的终浓度为30％，所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中含有终浓度为10％～20％的异丙醇。

9.一种草酸脱羧酶活力的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)草酸脱羧酶降解草酸生成甲酸和CO₂：将含草酸脱羧酶的样品用稀释液进行n倍稀释；取aμL稀释后草酸脱羧酶样品，加入1mL的草酸反应液中，37℃，800rpm恒温混匀仪反应xmin，加入50μL的2.5M H₂SO₄终止反应；其中所述x为5～20；设置对照样品为加aμL的双蒸水；

(2)将所述步骤(1)终止反应后的样品12000rpm离心10min；取上清液加入2～3倍体积的稀释液，混合均匀，此步骤应确定稀释后样品pH落在5.0～5.5单位的范围内；

(3)酶标仪检测：将不同浓度的标准草酸样品和所述步骤(2)处理后的待测样品各20μL分别加入96孔酶标板；再加入以体积比8:3:7的显色液、如权利要求5-8任一所述方法制备的草酸氧化酶酶液、纯水混合均匀的混合液，每孔加入180μL，其中，所述草酸氧化酶酶液中酶活力为500～800U/L，酶比活大于1U/mg,浓度大于0.1mg/ml；

(5)酶活单位的计算公式如下：

其中，n＝3，a＝25，b＝2.829，c＝4.651，所述草酸反应液为含有终浓度为5mM的草酸和25mM柠檬酸，pH为3.0的溶液；

所述稀释液为终浓度为72mM碳酸钠，pH为11～11.4；

所述草酸标准溶液中草酸的浓度为0,0.125mM,0.25mM,0.5mM,1.0mM,1.5mM,2.0mM和2.5mM；

所述显色液为pH 4.5-5.5 20-50mg/L辣根过氧化物酶、pH 5.0-6.0 30-50mM 3,5-二氯-2羟基苯磺酸钠、pH 4.5～6.0 500～1000mg/L 4-氨基安替吡啉、pH 4.0～5.5 100～500mM柠檬酸-NaOH缓冲液按体积比1:1:1:1混匀。

10.如权利要求5-8任一所述的方法制备的重组草酸氧化酶的应用，其特征在于，所述重组草酸氧化酶用于草酸脱羧酶活力的测定，或用于其它以草酸为底物或产物的酶的活力的测定，或用于人和动物的血液和尿液以及各种含草酸的样品中草酸含量的测定。