CN116640839B - 一种引物和探针组合、包含其的试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于体外诊断试剂领域，具体提供一种引物和探针组合、包含其的试剂盒及其应用，所述引物和探针组合包括多个冠心病用药位点测试的引物与探针，其中，每两对含搭桥引物的引物组合为一组，可对冠心病用药做出相应的评估；同时，每个组合中含有两个位点的测试引物与探针，其通过相应的搭桥引物设计实现“互增式”扩增，提高扩增效率，由于两个基因扩增倍数一致，检测限一致，减少后续的信号平衡调试工作，以此节省测试与调试时间。
Description
技术领域
本本发明属于体外诊断技术领域，具体涉及一种引物和探针组合、包含其的试剂盒及其应用。
背景技术
冠状动脉粥样硬化性心脏病是冠状动脉血管发生动脉粥样硬化病变而引起血管腔狭窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或坏死而导致的心脏病，常常被称为“冠心病”，针对它多样化的致病原因，采取的治疗药物、方案也非常多样化。
药物代谢酶和药物作用靶点基因特性的变化可影响药物的体内浓度和靶组织对药物的敏感性，导致药物反应性（包括药物的疗效和不良反应发生）个体差异，而药物基因组生物标志物的检测是临床实施个体化药物治疗的前提。
现有技术中针对冠心病相关的个体化用药指导基因的检测进行了大量的研究，并相继开发出相应的应用性产品，如申请号为201910485737.X中国专利公开了一种用于他汀类药物个体化基因检测的探针组及试剂盒，该专利通过二代测序法对KIF6、SLCO1B1、COQ2、APOA5、APOE、ABCC2、ABCG2、GATM、HMGCR及ABCB1进行多位点检测，对他汀类药物疗效及副作用起到了评估，但是该专利仅仅覆盖了他汀类药物，对于现有市面上氯吡格雷、硝酸甘油等药物依然不具备指导作用。此外，申请号为202011626922.5采用了熔融曲线法对APOE和SLCO1B1基因进行了检测，同样，该专利总共检测了4个位点，对于市面上通行的冠心类药物指导有限。但是，如果增多检测位点，提高检测通量，其测试时间又会增长，无法进行高效检测。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种引物和探针组合、试剂盒及其在指导冠心病用药上的应用，旨在提供可对多种冠心类药物进行指导，且测试效率高，灵敏度佳，特异性强。
为达到上述目的，本发明一种引物和探针组合，所述引物和探针组合包括第一组合、第二组合、第三组合、第四组合、第六组合、第七组合和第八组合中的至少一种；其中，
所述第一组合包括SLCO1B1基因第一引物对、SLCO1B1基因第一探针、SLCO1B1基因第一桥引物、SLCO1B1基因第二引物对、SLCO1B1基因第二桥引物及SLCO1B1基因第二探针，其中，所述SLCO1B1基因第一引物对的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:1~SEQ.ID.NO:2所示，所述SLCO1B1基因第一桥引物的序列如SEQ.ID.NO:3所示，所述SLCO1B1基因第一探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:4所示，所述SLCO1B1基因第二引物对的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:5~SEQ.ID.NO:6所示，所述SLCO1B1基因第二桥引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:7，所述SLCO1B1基因第二探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:8所示；
所述第二组合包括APOE基因第一引物对、APOE基因第一探针、APOE基因第一桥引物、APOE基因第二引物对、APOE基因第二桥引物及APOE基因第二探针，其中，所述APOE基因第一引物对的序列如SEQ.ID.NO:9~SEQ.ID.NO:10所示，所述APOE基因第一桥引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:11，所述APOE基因第一探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:12所示，所述APOE基因第二引物对的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:13~SEQ.ID.NO:14所示，所述APOE基因第二桥引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:15所示，所述APOE基因第二探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:16所示；
所述第三组合包括CYP2C19基因第一引物对、CYP2C19基因第一桥引物、CYP2C19基因第一探针、CYP2C19基因第二引物对、CYP2C19基因第二桥引物及CYP2C19基因第二探针，其中，所述CYP2C19基因第一引物对的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:17~SEQ.ID.NO:18所示，所述CYP2C19基因第一桥引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:19所示，所述CYP2C19基因第一探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:20所示，所述CYP2C19基因第二引物对的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:21~SEQ.ID.NO:22所示，所述CYP2C19基因第二桥引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:23所示，所述CYP2C19基因第二探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:24所示；
所述第四组合包括CYP2C19基因第三引物对、CYP2C19基因第三桥引物、CYP2C19基因第三探针、ALDH2基因引物对、 ALDH2基因桥引物及ALDH2基因探针，其中，所述CYP2C19基因引物对的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:33~SEQ.ID.NO:34所示，所述CYP2C19基因桥引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:35所示，所述CYP2C19基因探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:36所示，所述ALDH2基因引物对的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:37~SEQ.ID.NO:38所示，所述ALDH2基因桥引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:39所示，所述ALDH2基因探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:40所示；
所述第五组合包括MTHFR基因第一引物对、 MTHFR基因第一桥引物、MTHFR基因第一探针、MTHFR基因第二引物对、MTHFR基因第二桥引物及MTHFR基因第二探针，其中，所述MTHFR基因第一引物对的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:41~SEQ.ID.NO:42所示，所述 MTHFR基因第一桥引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:43所示，所述MTHFR基因第一探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:44所示，所述MTHFR基因第二引物对的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:45~SEQ.ID.NO:46所示，所述MTHFR基因第二桥引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:47所示，所述MTHFR基因第二探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:48所示；
所述第六组合包括MTRR 基因引物对、 MTRR 基因桥引物、MTRR 基因探针、PKCA基因引物对、PKCA基因桥引物、PKCA基因探针，其中，所述MTRR 基因引物对的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:49~SEQ.ID.NO:50所示，所述MTRR 基因桥引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:51所示，所述MTRR 基因探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:52所示，所述PKCA基因引物对的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:53~SEQ.ID.NO:54所示，所述PKCA基因桥引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:55所示，所述PKCA基因探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:56所示；
所述第七组合包括KCNMB1基因引物对、KCNMB1基因桥引物、KCNMB1基因探针、第一内参基因引物对、第一内参基因桥引物及第一内参基因探针，其中，所述KCNMB1基因引物对的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:25~SEQ.ID.NO:26所示，所述KCNMB1基因桥引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:27所示，所述KCNMB1基因探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:28所示，所述第一内参基因引物对的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:29~SEQ.ID.NO:30所示，所述第一内参基因桥引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:31所示，所述第一内参基因探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:32所示；
所述第八组合包括MYNN基因引物对、MYNN基因桥引物、MYNN基因探针、第二内参基因引物对、第二内参基因桥引物及第二内参基因探针，其中，所述MYNN基因引物对的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:57~SEQ.ID.NO:58所示，所述MYNN基因桥引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:59所示，所述MYNN基因探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:60所示，所述第二内参引物对的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:61~SEQ.ID.NO:62所示，所述第二内参基因桥引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:63所示，所述第二内参基因探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:64所示。
可选地，所述SLCO1B1基因第一探针与所述SLCO1B1基因第二探针的5’端与3’端分别标记有第一测试基团与第一测试淬灭基团；和/或，
所述APOE基因第一探针与所述APOE基因第二探针的5’端与3’端分别标记有第二测试基团与第二测试淬灭基团；和/或，
所述CYP2C19基因第一探针与所述CYP2C19基因第二探针的5’端与3’端分别标记有第三测试基团与第三测试淬灭基团；和/或，
所述CYP2C19基因第三探针与所述ALDH2基因探针的5’端与3’端分别标记有第四测试基团与第四测试淬灭基团；和/或，
所述MTHFR基因第一探针与所述MTHFR基因第二探针的5’端与3’端分别标记有第五测试基团与第五测试淬灭基团；和/或，
所述MTRR 基因探针与所述PKCA基因探针的5’端与3’端分别标记有第六测试基团与第六测试淬灭基团；
所述KCNMB1基因探针与所述第一内参基因探针的5’端与3’端分别标记有第七测试基团与第七测试淬灭基团；
所述MYNN基因探针与所述第二内参基因探针的5’端与3’端分别标记有第八测试基团与第八测试淬灭基团。
此外，本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒包括dNTPs、PCR缓冲液、DNA聚合酶上述引物和探针组合。
可选地，所述DNA聚合酶为改性Pfu聚合酶，所述改性Pfu聚合酶是对野生Pfu聚合酶编码93、141、143及147位氨基酸的基因进行敲除后得到，其中，所述野生Pfu聚合酶的编码核苷酸序列如SEQ.ID.NO:65所示。
可选地，所述试剂盒还包括阳性质控品和空白对照；和/或，
所述试剂盒还包括抗体稳定剂；和/或，
所述dNTPs包括dATP、dUTP、dCTP及dGTP；和/或，
所述试剂盒还包括UNG酶。
可选地，所述dNTPs包括AdNTPs和BdNTPs，所述PCR缓冲液包括反应液A包括APCR缓冲液和BPCR缓冲液，所述DNA聚合酶包括ADNA聚合酶和BDNA聚合酶；
所述试剂盒包括反应液A和反应液B，其中，所述反应液A包括第一组合、第二组合、第三组合、第七组合、AdNTPs、APCR缓冲液和ADNA聚合酶，所述反应液B包括第四组合、第五组合、第六组合、第八组合、BdNTPs、BPCR缓冲液和BDNA聚合酶。
可选地，各组分浓度如下表所示：
此外，本发明还提供一种上述试剂盒的制备方法，所述试剂盒的制备方法包括:
以含有所述野生Pfu聚合酶编码核苷酸序列的质粒为模板，采用第一突变产物进行扩增，得到第一突变产物，所述第一突变引物对的序列如SEQ.ID.NO：66~67所示。
以所述第一突变产物为模板，采用第二突变引物对进行扩增，得到Pfu聚合酶突变质粒，所述突变引物对如SEQ.ID.NO：68~69所示。；
将所述Pfu聚合酶突变质粒转化至感受态细胞进行扩大生产，然后进行质粒抽提；
将抽提的所述Pfu聚合酶突变质粒采用用带Nco I、Bg II酶切位点的引物进行扩增，得到Pfu聚合酶突变体；
将所述Pfu聚合酶突变体与载体质粒进行同源重组，得到Pfu聚合酶突变重组质粒；
将所述Pfu聚合酶突变重组质粒转化进表达菌株进行表达，得到改性Pfu聚合酶粗品；
将所述改性Pfu聚合酶粗品进行提纯后得到所述改性Pfu聚合酶；
将所述改性Pfu聚合酶与所述dNTPs、所述PCR缓冲液及所述引物和探针组合组装，得到所述试剂盒。
此外，本发明还提供上述引物和探针组合在制备指导冠心病用药的制剂上的用途。
可选地，所述冠心病指导用药的制剂用于评估他汀类药物肌病风险和/疗效；和/或，
所述冠心病指导用药的制剂用于评估氯吡格雷药物出血风险和/或疗效；和/或，
所述冠心病指导用药的制剂用于评估硝酸甘油药物代谢能力和/或疗效；和/或，
所述冠心病指导用药的制剂用于评估叶酸类药物服药含量；和/或，
所述冠心病指导用药的制剂用于评估苯磺酸氨氯地疗效；和/或，
所述冠心病指导用药的制剂用于评估氢氯噻嗪药物疗效；和/或，
所述冠心病指导用药的制剂用于评估噻嗪类利尿剂疗效。
本发明中，通过筛选的第一组合至第八组合的引物和探针的任意的组合设计，可对冠心病药物的风险或疗效做出相应的评估；同时，每个组合中含有两个位点的测试引物与探针，其通过相应的搭桥引物设计实现“互增式”扩增，提高扩增效率，由于两个基因扩增倍数一致，检测自然限一致，减少后续的信号平衡调试工作，以此节省测试与调试时间。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为应用实施例1反应液A PCR体系各通道测试结果；
图2为应用实施例1反应液B PCR体系各通道测试结果；
图3为对改性Pfu聚合酶SDS-PAGE蛋白电泳验证；
图4为改良后的Pfu-mut聚合酶的耐受性检测结果；
图5为实施例2~实施例4全血耐受性检测结果；
图6为实施例2试剂盒、实施例5试剂盒和实施例6试剂盒的热稳定性检测结果图；
图7为实施例2试剂盒灵敏度检测结果；
图8为实施例2试剂盒甘油三酯特异性检测；
图9为实施例2试剂盒总胆红素特异性检测；
图10为实施例2试剂盒EDTA特异性检测结果；
图11为实施例2试剂盒枸橼酸钠特异性检测结果；
图12为实施例2试剂盒对大肠杆菌的特异性检测结果。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
鉴于背景技术中提出的现有的冠心病用药指导的体外测试试剂测试的位点有限，以致于无法对市面上的多种冠心类药物进行用药指导，同时，现有多位点检测的试剂具有测试时间长，测试效率不高的技术缺陷，本发明提供一种引物与探针组合，所述引物和探针组合包括第一组合、第二组合、第三组合、第四组合、第六组合、第七组合和第八组合中的至少一种；其中，
所述第一组合包括SLCO1B1基因第一引物对、SLCO1B1基因第一探针、SLCO1B1基因第一桥引物、SLCO1B1基因第二引物对、SLCO1B1基因第二桥引物及SLCO1B1基因第二探针，其中，所述SLCO1B1基因第一引物对的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:1~SEQ.ID.NO:2所示，所述SLCO1B1基因第一桥引物的序列如SEQ.ID.NO:3所示，所述SLCO1B1基因第一探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:4所示，所述SLCO1B1基因第二引物对的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:5~SEQ.ID.NO:6所示，所述SLCO1B1基因第二桥引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:7，所述SLCO1B1基因第二探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:8所示；
所述第二组合包括APOE基因第一引物对、APOE基因第一探针、APOE基因第一桥引物、APOE基因第二引物对、APOE基因第二桥引物及APOE基因第二探针，其中，所述APOE基因第一引物对的序列如SEQ.ID.NO:9~SEQ.ID.NO:10所示，所述APOE基因第一桥引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:11，所述APOE基因第一探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:12所示，所述APOE基因第二引物对的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:13~SEQ.ID.NO:14所示，所述APOE基因第二桥引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:15所示，所述APOE基因第二探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:16所示；
所述第三组合包括CYP2C19基因第一引物对、CYP2C19基因第一桥引物、CYP2C19基因第一探针、CYP2C19基因第二引物对、CYP2C19基因第二桥引物及CYP2C19基因第二探针，其中，所述CYP2C19基因第一引物对的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:17~SEQ.ID.NO:18所示，所述CYP2C19基因第一桥引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:19所示，所述CYP2C19基因第一探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:20所示，所述CYP2C19基因第二引物对的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:21~SEQ.ID.NO:22所示，所述CYP2C19基因第二桥引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:23所示，所述CYP2C19基因第二探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:24所示；
所述第四组合包括CYP2C19基因第三引物对、CYP2C19基因第三桥引物、CYP2C19基因第三探针、ALDH2基因引物对、 ALDH2基因桥引物及ALDH2基因探针，其中，所述CYP2C19基因引物对的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:33~SEQ.ID.NO:34所示，所述CYP2C19基因桥引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:35所示，所述CYP2C19基因探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:36所示，所述ALDH2基因引物对的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:37~SEQ.ID.NO:38所示，所述ALDH2基因桥引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:39所示，所述ALDH2基因探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:40所示；
所述第五组合包括MTHFR基因第一引物对、 MTHFR基因第一桥引物、MTHFR基因第一探针、MTHFR基因第二引物对、MTHFR基因第二桥引物及MTHFR基因第二探针，其中，所述MTHFR基因第一引物对的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:41~SEQ.ID.NO:42所示，所述 MTHFR基因第一桥引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:43所示，所述MTHFR基因第一探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:44所示，所述MTHFR基因第二引物对的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:45~SEQ.ID.NO:46所示，所述MTHFR基因第二桥引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:47所示，所述MTHFR基因第二探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:48所示；
所述第六组合包括MTRR 基因引物对、 MTRR 基因桥引物、MTRR 基因探针、PKCA基因引物对、PKCA基因桥引物、PKCA基因探针，其中，所述MTRR 基因引物对的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:49~SEQ.ID.NO:50所示，所述MTRR 基因桥引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:51所示，所述MTRR 基因探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:52所示，所述PKCA基因引物对的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:53~SEQ.ID.NO:54所示，所述PKCA基因桥引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:55所示，所述PKCA基因探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:56所示；
所述第七组合包括KCNMB1基因引物对、KCNMB1基因桥引物、KCNMB1基因探针、第一内参基因引物对、第一内参基因桥引物及第一内参基因探针，其中，所述KCNMB1基因引物对的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:25~SEQ.ID.NO:26所示，所述KCNMB1基因桥引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:27所示，所述KCNMB1基因探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:28所示，所述第一内参基因引物对的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:29~SEQ.ID.NO:30所示，所述第一内参基因桥引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:31所示，所述第一内参基因探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:32所示；
所述第八组合包括MYNN基因引物对、MYNN基因桥引物、MYNN基因探针、第二内参基因引物对、第二内参基因桥引物及第二内参基因探针，其中，所述MYNN基因引物对的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:57~SEQ.ID.NO:58所示，所述MYNN基因桥引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:59所示，所述MYNN基因探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:60所示，所述第二内参引物对的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:61~SEQ.ID.NO:62所示，所述第二内参基因桥引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:63所示，所述第二内参基因探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:64所示。
本发明中，通过采用筛选的第一组合和第二组合的引物探针组合进行检测，可以对他汀类药物进行评估；采用第三组合引物探针组合进行检测，可以对氯吡格雷药物进行评估；采用第四组合引物探针组合进行检测，可以对氯吡格雷药物和叶酸进行评估；采用第五组合引物探针进行检测，可以对叶酸类药物进行评估；采用第六组合引物探针可以对叶酸及氢氯噻嗪类药物进行评估；根据需要对上述组合任意复配，便可实现对多种冠心类药物的评估；同时，每个组合中含有两个位点的测试引物与探针，其通过相应的搭桥引物设计，搭桥部分采用组合中两不同上游引物连接而成，各自的引物对扩增对应目标位点的同时，搭桥引物也进行扩增，实现“互增式”扩增，以此3倍率进行扩增，提高扩增效率，由于两个基因扩增倍数一致，检测限一致，减少后续的信号平衡调试工作，以此节省测试与调试时间；第七组合可对苯磺酸氨氯地平进行评估，第八组合可对噻嗪类利尿剂进行评估；进一步，可在通过第七组合和第八组合分别引入内参引物及内参探针，对实验进行质控，排除误差，从而进一步提高测试准确率。
不仅如此，发明人研究团队发现，每个组合中的引物对通过上述匹配，不仅能确保每个组合中扩增的不同目标的产物量均衡高效，还能尽可能减少非特异产物的产生，保证了检测结果的准确性和特异性。
本发明中，所述SLCO1B1基因第一探针与所述SLCO1B1基因第二探针的5’端与3’端分别标记有第一测试基团与第一测试淬灭基团；所述APOE基因第一探针与所述APOE基因第二探针的5’端与3’端分别标记有第二测试基团与第二测试淬灭基团；所述CYP2C19基因第一探针与所述CYP2C19基因第二探针的5’端与3’端分别标记有第三测试基团与第三测试淬灭基团；所述CYP2C19基因第三探针与所述ALDH2基因探针的5’端与3’端分别标记有第四测试基团与第四测试淬灭基团；所述MTHFR基因第一探针与所述MTHFR基因第二探针的5’端与3’端分别标记有第五测试基团与第五测试淬灭基团；所述MTRR 基因探针与所述PKCA基因探针的5’端与3’端分别标记有第六测试基团与第六测试淬灭基团。所述KCNMB1基因探针与所述第一内参基因探针的5’端与3’端分别标记有第七测试基团与第七测试淬灭基团；所述MYNN基因探针与所述第二内参基因探针的5’端与3’端分别标记有第八测试基团与第八测试淬灭基团。具体地，所述第一测试基团、所述第二测试基团、所述第三测试基团、所述第四测试基团、所述第五测试基团、所述第六测试基团、第七测试基团和第八测试基团分别选自FAM、VIC、ROX或CY5中的任意一种。
将第一组合~第八组合分成A剂与B剂，则A剂中每一组合的测试基团不同，B组的每一组合的测试基团也不同。例如，在一些实施例中，所述A剂包括第一组合、第二组合、第三组合与第七组合，第一组合连接FAM、第二组合连接VIC、第三组合连接ROX、第七组合连接CY5，所述B剂包括第四组合、第五组合、第六组合和第八组合，第四组合连接FAM、第五组合连接VIC、第六组合连接ROX、第八组合连接CY5。通过在同一组合连接不同的测试基团，可以同时进行操作，进而完成多组测试。
此外，本发明还提供一种针对多重PCR结合测试探针荧光熔解曲线技术用于冠心病用药指导的试剂盒，所述用于冠心病用药指导的试剂盒包括dNTPs、PCR缓冲液及DNA聚合酶及上述用于冠心病用药指导的引物和探针组合。
本发明通过将上述引物和探针组合与dNTPs、PCR缓冲液及DNA聚合酶组合成试剂盒，使操作更加简便、快捷。
在本发明中，所述DNA聚合酶为改性Pfu聚合酶，所述改性Pfu聚合酶是对野生Pfu聚合酶的93、141、143及147位氨基酸进行点突变后得到，其中，所述野生Pfu聚合酶的编码核苷酸序列如SEQ.ID.NO:65所示。
本发明通过对野生Pfu聚合酶的93、141、143及147位氨基酸进行点突变，使其弱化3’-5’外切活性，使用改性Pfu聚合酶，在提高试剂盒对血清耐受性的同时，使其不会对游离的探针进行水解，进而不会影响荧光探针与模板链的杂交及增益信号检测，提高了其灵敏度，使其可进行全血样品的检测。
在本发明中，所述dNTPs包括dATP、dUTP、dCTP及dGTP，所述用于冠心病用药指导的试剂盒还包括UNG酶。通过采用dUTP替代dTTP，后续可采用UNG酶消除产物污染性，提高检测准确率。
在本发明，所述冠心病用药指导的试剂盒还包括阳性质控品和空白对照。具体地，在本实施例中，所述阳性质控品为连接所有阳性杂合的质粒DNA，所述空白对照为水。通过采用阳性质控品与空白对照以此判断结果的有效性。
在本发明中，所述冠心病用药指导的试剂盒还包括抗体稳定剂；具体地，所述述抗体稳定剂为浓度为0.8~1.2 U的 Taq Antibody的抗体。通过引入抗体稳定剂，提高试剂盒体系的稳定性和热启动效果，使其可对全血样本进行扩增，提高信号强度。
在本发明中，各组分浓度如下表所示：
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在一些实施例中，将不同的组合采用部分随机的方式组合成反应液A和反应液B，其中，第七组合和第八组合分别在所述反应液A和所述反应液B，第一组合~第六组合随机分在反应液A和反应液B。当然，配套的，所述dNTPs、所述PCR缓冲液、所述DNA聚合酶均分成两份，其中，所述dNTPs分为AdNTPs和BdNTPs，所述PCR缓冲液分为APCR缓冲液和BPCR缓冲液，所述DNA聚合酶分为ADNA聚合酶和BDNA聚合酶；在一些实施例中，具体的分配方式可为：所述反应液A包括第一组合、第二组合、第三组合、第七组合、AdNTPs、APCR缓冲液和ADNA聚合酶，所述反应液B包括第四组合、第五组合、第六组合、第八组合、BdNTPs、BPCR缓冲液和BDNA聚合酶。
需要说明的是，上述分配方式可以根据实际配套的一起需求，检测需求进行匹配。
具体地，在本发明中，所述反应液A包括如下表所示浓度的组分：
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所述反应液B包括如下表所示浓度的组分：
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此外，本发明还提供一种上述试剂盒的制备方法，所述试剂盒的制备方法包括:
步骤S10:以含有所述野生Pfu聚合酶编码核苷酸序列的质粒为模板，采用第一突变产物进行扩增，得到第一突变产物，所述第一突变引物对的序列如SEQ.ID.NO：66~67所示；
步骤S20:以所述第一突变产物为模板，采用第二突变引物对进行扩增，得到Pfu聚合酶突变质粒，所述第二突变引物对如SEQ.ID.NO：68~69所示；；
步骤S30:将所述Pfu聚合酶突变质粒转化至感受态细胞，然后进行质粒抽提；
步骤S40:将抽提的所述Pfu聚合酶突变质粒用带Nco I、Bg II酶切位点的引物进行扩增，得到Pfu聚合酶突变体；
步骤S50:将所述Pfu聚合酶突变体与载体质粒进行同源重组，得到Pfu聚合酶突变重组质粒；
步骤S60:将所述Pfu聚合酶突变重组质粒转化进表达菌株进行表达，得到改性Pfu聚合酶粗品；
步骤S70:将所述改性Pfu聚合酶粗品进行提纯后得到所述改性Pfu聚合酶；
步骤S80:将所述改性Pfu聚合酶与所述dNTPs、所述PCR缓冲液及所述引物和探针组合组装，得到所述试剂盒。
在本发明中，由于三个敲除位点较远，本发明采用两对引物进行依次敲除，提高敲除效率。
在本发明中，步骤S60将所述Pfu聚合酶突变重组质粒转化进表达菌株后，采用IPTG法进行诱导表达，然后对转入Pfu聚合酶突变重组质粒后的表达菌株进行破壁，收集酶液，得到改性Pfu聚合酶粗品。
步骤S70:将所述改性Pfu聚合酶粗品中加入两倍体积的饱和硫酸铵析出，将析出的粗品复溶后进行透析，得到所述改性Pfu聚合酶。采用上述提纯步骤，提纯效果更好。
此外，本发明还提供一种上述引物和探针组合在制备指导冠心病用药的制剂上的用途。
本发明中，通过筛选的第一组合至第八组合的引物和探针，针对不同的药物的敏感位点设计，可以对冠心病的用药风险或疗效进行评估。
具体地，所述冠心病指导用药的制剂用于下列任意药物的评估，他汀类药物用药指导、用于氯吡格雷药物用药指导、用于硝酸甘油药物用药指导、用于叶酸类药物用药指导、用于苯磺酸氨氯地用药指导、用于氢氯噻嗪药物用药指导。
具体地，若制剂为本发明的试剂盒，其使用方法的具体步骤如下：
步骤A10:获取检测样品，将人外周全血加入乙二胺四乙酸或枸橼酸钠，得到人外周抗凝全血样本。
步骤A20如下所示分别配置反应液A的PCR反应体系，与反应液B的PCR反应反应体系。
反应液APCR反应体系如下：
反应液A23μL
人外周抗凝全血样本2μL。
反应液BPCR反应体系如下：
反应液B23μL
人外周抗凝全血样本2μL。
步骤A30:配置阳性对照反应体系，其组分含量与反应液A及反应液B大体一致，唯一不同的是将人外周抗凝全血样本替换成阳性质控品。
步骤A40:设置空白对照反应体系，去除反应液A与反应液B反应体系的中的人外周抗凝全血样本；
步骤A50:按下列反应阶段分别对反应液APCR反应体系、反应液BPCR反应体系、阳性对照反应体系及空白对照反应体系进行PCR反应。
步骤A60：结果分析
按照分析软件生成的熔解曲线图像，根据各个信号通道上的特定Tm值范围内有无熔解峰来鉴定样本的基因型别。由于仪器软件只能自动读取高于阈值线的熔解峰的Tm值，因此，当软件无法自动给出Tm值时，可通过适当调节阈值或者人工判读的方式获得Tm值。
阳性判断值
空白对照：FAM、VIC、ROX、CY5 通道均无明显熔解峰。
质控品：本质控品采用混合质粒样本作为阳性对照来监控实验的有效性，包含本试剂盒所检测的14种杂合突变型基因的质粒以及内参基因β-Actin的质粒，每个通道的检测结果应均为阳性，且熔解峰Tm值应均在参考范围之内，满足以上条件，表明本次实验成功有效，可对待检样本进行分析。
按照表1~2判定待检的人全血样本检测结果：FAM、VIC、ROX、CY5 通道应均为阳性，且熔解峰Tm值应均在参考范围之内，任意检测位点或内参基因β-actin出现无熔解峰或熔解峰Tm值不在参考范围之内，说明该检测结果无效，建议重新检测。
表1A管PCR反应液各位点多态性的Tm值参考范围
表2B管PCR反应液各位点多态性的Tm值参考范围
步骤S60:指导评估，根据获得的结果，结合表3~表8对各类药物服用剂量进行评估。
表3 他汀类药物评估-1
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表4 他汀类药物评估-2
表5 氯吡格雷药物评估
表6硝酸甘油药物评估
表7叶酸类药物评估
表8 苯磺酸氨氯地与氢氯噻嗪药物评估
通过采取步骤进行测试，可以对各类药物对于冠心病调控基因的影响，进而对后续的用药做出相应的指导。需要说明的是，上述评估只是建议剂量，后续还需结合实际情况进行定量。
以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本实施例提供一种定向点突变敲除野生Pfu聚合酶编码93、141、143及147位氨基酸的基因的方法，具体操作步骤如下：
（1）获得带有野生Pfu聚合酶编码基因的pUC57质粒。野生Pfu聚合酶的编码基因由NCBI数据库查找获得，GenBank Sequence ID:CP003685.1，具体地，其基因序列如SEQ.ID.NO:65所示。该质粒DNA由生工生物工程（上海）股份有限公司合成提供。
atgattttagatgtggattacataactgaagaaggaaaacctgttattaggctattcaaaaaagagaacggaaaatttaagatagagcatgatagaacttttagaccatacatttacgctcttctcagggatgattcaaagattgaagaagttaagaaaataacgggggaaaggcatggaaagattgtgagaattgttgatgtagagaaggttgagaaaaagtttctcggcaagcctattaccgtgtggaaactttatttggaacatccccaagatgttcccactattagagaaaaagttagagaacatccagcagttgtggacatcttcgaatacgatattccatttgcaaagagatacctcatcgacaaaggcctaataccaatggagggggaagaagagctaaagattcttgccttcgatatagaaaccctctatcacgaaggagaagagtttggaaaaggcccaattataatgattagttatgcagatgaaaatgaagcaaaggtgattacttggaaaaacatagatcttccatacgttgaggttgtatcaagcgagagagagatgataaagagatttctcaggattatcagggagaaggatcctgacattatagttacttataatggagactcattcgacttcccatatttagcgaaaagggcagaaaaacttgggattaaattaaccattggaagagatggaagcgagcccaagatgcagagaataggcgatatgacggctgtagaagtcaagggaagaatacatttcgacttgtatcatgtaataacaaggacaataaatctcccaacatacacactagaggctgtatatgaagcaatttttggaaagccaaaggagaaggtatacgccgacgagatagcaaaagcctgggaaagtggagagaaccttgagagagttgccaaatactcgatggaagatgcaaaggcaacttatgaactcgggaaagaattccttccaatggaaattcagctttcaagattagttggacaacctttatgggatgtttcaaggtcaagcacagggaaccttgtagagtggttcttacttaggaaagcctacgaaagaaacgaagtagctccaaacaagccaagtgaagaggagtatcaaagaaggctcagggagagctacacaggtggattcgttaaagagccagaaaaggggttgtgggaaaacatagtatacctagattttagagccctatatccctcgattataattacccacaatgtttctcccgatactctaaatcttgagggatgcaagaactatgatatcgctcctcaagtaggccacaagttctgcaaggacatccctggttttataccaagtctcttgggacatttgttagaggaaagacaaaagattaagacaaaaatgaaggaaactcaagatcctatagaaaaaatactccttgactatagacaaaaagcgataaaactcttagcaaattctttctacggatattatggctatgcaaaagcaagatggtactgtaaggagtgtgctgagagcgttactgcctggggaagaaagtacatcgagttagtatggaaggagctcgaagaaaagtttggatttaaagtcctctacattgacactgatggtctctatgcaactatcccaggaggagaaagtgaggaaataaagaaaaaggctctagaatttgtaaaatacataaattcaaagctccctggactgctagagcttgaatatgaagggttttataagaggggattcttcgttacgaagaagaggtatgcagtaatagatgaagaaggaaaagtcattactcgtggtttagagatagttaggagagattggagtgaaattgcaaaagaaactcaagctagagttttggagacaatactaaaacacggagatgttgaagaagctgtgagaatagtaaaagaagtaatacaaaagcttgccaattatgaaattccaccagagaagctcgcaatatatgagcagataacaagaccattacatgagtataaggcgataggtcctcacgtagctgttgcaaagaaactagctgctaaaggagttaaaataaagccaggaatggtaattggatacatagtacttagaggcgatggtccaattagcaatagggcaattctagctgaggaatacgatcccaaaaagcacaagtatgacgcagaatattacattgagaaccaggttcttccagcggtacttaggatattggagggatttggatacagaaaggaagacctcagataccaaaagacaagacaagtcggcctaacttcctggcttaacattaaaaaatcctag（SEQ.ID.NO:65）
（2）设计点突变引物SEQ.ID.NO：66~SEQ.ID.NO：69，首先利用SEQ.ID.NO：66和SEQ.ID.NO：67组成的突变引物组1将野生Pfu质粒DNA突变成93位氨基酸编码基因突变的质粒序列，以此为模板，再利用SEQ.ID.NO：68和SEQ.ID.NO：69组成的突变引物组2将93位氨基酸编码基因突变的质粒序列最终突变成93、141、143、147位氨基酸的编码基因突变的Pfu-mut 聚合酶质粒；
突变引物组1 PCR反应体系
突变引物组1 PCR反应条件
突变引物组2 PCR反应体系
突变引物组2 PCR反应条件
（3）待反应反应结束后，加入1μL的限制性内切酶Dpn I，放置在37℃的恒温箱中酶解1小时,消化掉原来未突变的模板，将剩余含有Pfu-mut 聚合酶序列的质粒转化到感受态细胞中，得到Pfu-mut聚合酶基因的储存菌株，将转化了含有Pfu-mut聚合酶基因质粒的大肠杆菌划平板。设计测序引物CXF和CXR，挑单菌落直接进行菌落PCR扩增，将PCR产物用Sanger测试验证序列突变情况；
CXF:atgattttagatgtggattacat
CXR:ctaggattttttaatgttaagccag
PCR反应体系
PCR反应条件
（4）将转化了含有Pfu-mut聚合酶基因质粒的大肠杆菌划平板后挑单菌落,接种于5mL LB 液体培养基（含氨苄 100μg/mL)中,37℃振荡培养过夜，然后按照质粒提取试剂盒的步骤提取质粒。用带Nco I、Bg II酶切位点的引物进行扩增，其中，带有Nco I酶切位点的引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.70所示，带有Bg II酶切位点的引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.71所示。
PCR反应体系
PCR反应条件
（5）pSE380（购自于上海生工）质粒载体上存在 Nco I 和 Bgl II 的酶切位点，用Nco I、Bg II酶对以上PCR产物以及pSE380质粒进行双酶、回收、连接、转化，构建含Pfu-mut聚合酶基因的表达菌株；
酶切体系：10×buffer 3μL，载体质粒或PCR片段 5μL，Nco I 及 Bgl II各 1μL，加入 ddH2O 至 30μL，37℃酶切 1.5h 后胶回收。
（6）将Pfu-mut聚合酶菌株接种于LB培养基中进行培养，用热变性、盐析法对Pfu-mut酶进行粗提，具体操作为：
将50μL菌种接于5ml LB培养基中摇培10 h,然后转接于250mL LB培养基中,摇培4h 后加入 IPTG （异丙基硫代半乳糖苷）至终浓度为 50mmol/L 后继续培摇8~10h。用50mL离心管分次将全部菌液于离心收集菌体，加入10 mL buffer A（50mmol/LTris-HClpH8.0、1mmol/LEDTA、50mmol/L 葡萄糖）悬浮，加入溶菌酶（天根）至终浓度为 1mg/mL。冰上放置1h，振荡10min，加入0.2 mLTritonX-100，冰上超声破碎（150W×5s×60次）。同时加入 DNAse 和 RNAse 至终浓度 5μg/mL 剧烈振荡混匀，4℃摇床振荡 20min。5000rpm 离心 30min，取上清。75℃水浴1h，隔10min 振荡一次，5000rpm 离心30min，取上清即酶液。
（7）最后将Pfu-mut聚合酶粗提酶液经过亲和层析得到更加纯净的Pfu-mut聚合酶，具体操作为：
在收集的酶液中加入两倍体积的饱和硫酸铵，4℃振荡 15min，5000rpm，4℃离心30min使Pfu-mut聚合酶沉淀,去上清，保留沉淀。加入 1mL buffer A溶解，置于 buffer B（50mmol/L Tris-HCl pH8.0、50mmol/L KCL、0.1mmol/L EDTA、1mmol/L DTT、0.5mmol/LPMSF、50%甘油）中透析 12h，每 6h 换一次透析液。收集终产品。
（8）进行SDS-PAGE 蛋白电泳验证，验证结果如图3所示，Pfu酶分子量大约90kD，点突变并未改变其分子量大小。
（9）验证改良后的Pfu-mut聚合酶的耐受性，以人ACTB基因为模板设计引物SEQ.ID.NO:29~SEQ.ID.NO:30和探针 SEQ.ID.NO:32，直接对不同稀释浓度的全血样本进行扩增检测，检测结果如图4所示，图4中，A为改性前的耐受性，B为改性后的耐受性。
从对比测试结果来看，经过定向点突变的Pfu-mut聚合酶比野生Pfu酶在对全血样本的耐受力更强，最高耐受力达到80%的全血样本。
实施例2
本实施例提供一种用于冠心病用药指导的试剂盒，具体组分如表9中所示，表9中的PCR缓冲液(100mmol/L KCl,100mmol/L (NH4)2SO4,200mmol/LTris-HCl pH8.8，20mmol/LMgSO4，1% TritonX-100，1mg/m L BSA )，dNTP包括dATP、dUTP、dCTP及dGTP，UNG酶（由菲鹏生物公司提供），DNA聚合酶采用实施例1制备的Pfu-mut聚合酶，Taq-Antibody（由菲鹏生物公司提供）质粒DNA混合液（由上海生工公司合成提供）。
表9 用于冠心病用药指导试剂盒的主要成分
其中，反应液A中的引物和探针组合序列信息如表10所示，反应液A中各成分浓度如表11所示，反应液B中的引物和探针组合序列信息如表12所示，C液中各成分浓度如表13所示。
表10 反应液A中的引物和探针组合序列信息
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表11 反应液A中的各成分浓度
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表12 反应液B中引物探针序列信息
表13B管PCR反应液体系配方
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实施例3
本实施例提供一种用于冠心病用药指导的试剂盒，具体组分与实施例2大体一致，唯一不同的是，将DNA聚合酶替换为市场上的同类产品Hot Start TTx (DNA) Kit（由TOYOBO公司提供）。
实施例4
本实施例提供一种用于冠心病用药指导的试剂盒，具体组分与实施例2大体一致，唯一不同的是，将DNA聚合酶替换为市场上的同类产品Hot Start TTx (DNA) Kit（由TOYOBO公司提供），并且将PCR缓冲液替换成与该DNA聚合酶配套的2x Buffer for TTx（由TOYOBO公司提供）。
实施例5
本实施例提供一种用于冠心病用药指导的试剂盒，具体组分与实施例2大体一致，唯一不同的是添加不同品牌的Taq Antibody（上海生工公司）抗体用量根据厂家的推荐常规用量，均为1U/反应，除此之外，其他组分完全一致（参见实施例2）。
实施例6
本实施例提供一种用于冠心病用药指导的试剂盒，具体组分与实施例2大体一致，唯一不同的是没有添加Taq Antibody。
试验实施例1
本试验实施例测试实施例2，实施例3，实施例4试剂盒的全血耐受性，具体操作如下：
加样:取新鲜抗凝全血5μL,分别按100%、80%、60%、40%、20%的全血比例稀释，取稀释后的样本2μL分别加到每组的各个反应液中，盖紧管盖，做好标记，短暂离心5~10秒。
将上述已加模板的反应管置于基因扩增仪（荧光PCR仪）中，并记录好样本摆放顺序，按下表设置PCR扩增参数。
表14 PCR扩增参数
以反应液A中的FAM通道信号为例，实验结果如图5所示，图5中，A为实施例2检测结果，B为实施例3检测结果，C为实施例4检测结果，改造后的DNA聚合酶（Pfu-mut聚合酶）配合优化的PCR体系具有很高的全血耐受性，而商品酶在本体系中表现不佳，检出的信号都普遍偏低。
试验实施例2
本实施例提供实施例2试剂盒、实施例5试剂盒和实施例6试剂盒的热稳定性测试，利用37℃加速破坏实验来检验Taq Antibody对体系的稳定性作用，实验中还设计一组不加Taq Antibody的对照组。具体地，三组反应液按照设计好的方案配制好之后，置于37℃恒温箱中，分别放置1、3、5天，放置时间到后，置于-20℃保存，最后用同一个样本统一进行检测。
以反应液A中的FAM通道信号为例，实验结果如图6所示，图6中，A为实施例2试剂盒测试结果，B为实施例4试剂盒测试结果，C为实施例5测试结果。
实验结果表明，菲鹏生物公司的Taq Antibody添加进试剂盒，与试剂盒中其余组分的适配性更好，因此，可以很大程度上维持体系的稳定性。
试验实施例3
本实施例对实施例2试剂盒进行了灵敏度检测：
取已知基因型的DNA样本，用微量紫外分光光度计进行浓度检测，随后用10mMTris-HCl（PH8.0）进行2倍梯度稀释，最终的稀释梯度分别为32ng/μL、16ng/μL、8ng/μL、4ng/μL、2ng/μL、1ng/μL、0.5ng/μL、0.25ng/μL，
以反应液A中的FAM通道信号为例，结果如图7所示。
检测结果显示，实施例2试剂盒样品的最低限为0.5ng/μL。
试验实施例4
本实施例对实施例2试剂盒进行了特异性检测：
取一个新鲜的EDTA抗凝全血样本进行不同种类的干扰剂的不同浓度进行测试，测试的组别如下：
以反应液A中的FAM通道信号为例，检测结果如图8~图12所示，实施例2试剂盒对甘油三酯≤13.5mmol/L（图8所示）、总胆红素≤350μmol/L（图9所示）、EDTA≤5mg/mL（图10所示）、枸橼酸钠≤2mg/mL（图11所示）具有一定的抗干扰能力；对结构类似物如大肠杆菌DNA均无交叉反应（图12所示）。
应用实施例1
本实施例采用实施例2试剂盒对一个EDTA抗凝全血样本进行检测，具体操作如下：
步骤S10:获取检测样品：抽取人静脉血储存于EDTA或枸橼酸钠抗凝管中，得到人外周抗凝全血样本。
步骤S10:取5μL抗凝全血样本,加入5μL无菌水（50%血含量），震动混匀，短暂离心，标记备用。
步骤S20:按如下所示的含量分别配置反应液A的PCR反应体系，与反应液B的PCR反应反应体系。
反应液A 反应体系如下：
反应液A23μL
全血样本（50%血含量）2μL
反应液B 反应体系如下：
反应液B23μL
全血样本（50%血含量）2μL
步骤S30:配置阳性对照反应体系，其组分含量与反应液A及反应液B大体一致，唯一不同的是将人外周抗凝全血样本替换成阳性质控品。
步骤S40:设置空白对照反应体系，去除反应液A与反应液B反应体系的中的人外周抗凝全血样本；
步骤S50:按下列反应阶段分别对反应液APCR反应体系、反应液BPCR反应体系、阳性对照反应体系及空白对照反应体系进行PCR反应。
步骤S60：结果分析
按照分析软件生成如图1~图2所示的熔解曲线图像，其中，图1中（a）为反应液AFAM通道测试图，（b）为反应液A VIC通道测试图，（c）为反应液A ROX通道测试图，（d）为反应液A CY5通道测试图，图2中（a）为反应液B FAM通道测试图，（b）为反应液B VIC通道测试图，（c）为反应液B ROX通道测试图，（d）为反应液B CY5通道测试图，根据各个信号通道上的特定Tm值范围内有无熔解峰来鉴定样本的基因型别。由于仪器软件只能自动读取高于阈值线的熔解峰的Tm值，因此，当软件无法自动给出Tm值时，可通过适当调节阈值或者人工判读的方式获得Tm值。
阳性判断值
空白对照：FAM、VIC、ROX、CY5 通道均无明显熔解峰。
质控品：本质控品采用混合质粒样本作为阳性对照来监控实验的有效性，包含本试剂盒所检测的14种杂合突变型基因的质粒以及内参基因β-Actin的质粒，每个通道的检测结果应均为阳性，且熔解峰Tm值应均在参考范围之内，满足以上条件，表明本次实验成功有效，可对待检样本进行分析，本次的基因测试结果如表15所示。
表15待检样本14个位点基因型检测结果
根据表15查询待检的人全血样本检测结果：FAM、VIC、ROX、CY5 通道应均为阳性，且熔解峰Tm值应均在参考范围之内，任意检测位点或内参基因β-actin出现无熔解峰或熔解峰Tm值不在参考范围之内，说明该检测结果无效，建议重新检测。
步骤S60:指导评估，根据获得的结果，结合表16对各类药物服用剂量进行评估。
最终，用药指导结果如表16所示（该推荐用量表只针对本实施例中所检测的样本）。
表16 冠心病常用药物推荐用量
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (8)
1.一种引物和探针组合，其特征在于，所述引物和探针组合包括第一组合、第二组合、第三组合、第四组合、第六组合、第七组合和第八组合中的至少一种；其中，
所述第一组合包括SLCO1B1基因第一引物对、SLCO1B1基因第一探针、SLCO1B1基因第一桥引物、SLCO1B1基因第二引物对、SLCO1B1基因第二桥引物及SLCO1B1基因第二探针，其中，所述SLCO1B1基因第一引物对的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:1~SEQ.ID.NO:2所示，所述SLCO1B1基因第一桥引物的序列如SEQ.ID.NO:3所示，所述SLCO1B1基因第一探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:4所示，所述SLCO1B1基因第二引物对的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:5~SEQ.ID.NO:6所示，所述SLCO1B1基因第二桥引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:7，所述SLCO1B1基因第二探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:8所示；
所述第二组合包括APOE基因第一引物对、APOE基因第一探针、APOE基因第一桥引物、APOE基因第二引物对、APOE基因第二桥引物及APOE基因第二探针，其中，所述APOE基因第一引物对的序列如SEQ.ID.NO:9~SEQ.ID.NO:10所示，所述APOE基因第一桥引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:11，所述APOE基因第一探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:12所示，所述APOE基因第二引物对的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:13~SEQ.ID.NO:14所示，所述APOE基因第二桥引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:15所示，所述APOE基因第二探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:16所示；
所述第三组合包括CYP2C19基因第一引物对、CYP2C19基因第一桥引物、CYP2C19基因第一探针、CYP2C19基因第二引物对、CYP2C19基因第二桥引物及CYP2C19基因第二探针，其中，所述CYP2C19基因第一引物对的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:17~SEQ.ID.NO:18所示，所述CYP2C19基因第一桥引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:19所示，所述CYP2C19基因第一探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:20所示，所述CYP2C19基因第二引物对的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:21~SEQ.ID.NO:22所示，所述CYP2C19基因第二桥引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:23所示，所述CYP2C19基因第二探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:24所示；
所述第四组合包括CYP2C19基因第三引物对、CYP2C19基因第三桥引物、CYP2C19基因第三探针、ALDH2基因引物对、 ALDH2基因桥引物及ALDH2基因探针，其中，所述CYP2C19基因第三引物对的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:33~SEQ.ID.NO:34所示，所述CYP2C19基因第三桥引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:35所示，所述CYP2C19基因第三探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:36所示，所述ALDH2基因引物对的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:37~SEQ.ID.NO:38所示，所述ALDH2基因桥引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:39所示，所述ALDH2基因探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:40所示；
所述第五组合包括MTHFR基因第一引物对、 MTHFR基因第一桥引物、MTHFR基因第一探针、MTHFR基因第二引物对、MTHFR基因第二桥引物及MTHFR基因第二探针，其中，所述MTHFR基因第一引物对的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:41~SEQ.ID.NO:42所示，所述 MTHFR基因第一桥引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:43所示，所述MTHFR基因第一探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:44所示，所述MTHFR基因第二引物对的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:45~SEQ.ID.NO:46所示，所述MTHFR基因第二桥引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:47所示，所述MTHFR基因第二探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:48所示；
所述第六组合包括MTRR 基因引物对、 MTRR 基因桥引物、MTRR 基因探针、PKCA基因引物对、PKCA基因桥引物、PKCA基因探针，其中，所述MTRR 基因引物对的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:49~SEQ.ID.NO:50所示，所述MTRR 基因桥引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:51所示，所述MTRR 基因探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:52所示，所述PKCA基因引物对的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:53~SEQ.ID.NO:54所示，所述PKCA基因桥引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:55所示，所述PKCA基因探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:56所示；
所述第七组合包括KCNMB1基因引物对、KCNMB1基因桥引物、KCNMB1基因探针、第一内参基因引物对、第一内参基因桥引物及第一内参基因探针，其中，所述KCNMB1基因引物对的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:25~SEQ.ID.NO:26所示，所述KCNMB1基因桥引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:27所示，所述KCNMB1基因探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:28所示，所述第一内参基因引物对的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:29~SEQ.ID.NO:30所示，所述第一内参基因桥引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:31所示，所述第一内参基因探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:32所示；
所述第八组合包括MYNN基因引物对、MYNN基因桥引物、MYNN基因探针、第二内参基因引物对、第二内参基因桥引物及第二内参基因探针，其中，所述MYNN基因引物对的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:57~SEQ.ID.NO:58所示，所述MYNN基因桥引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:59所示，所述MYNN基因探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:60所示，所述第二内参基因引物对的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:61~SEQ.ID.NO:62所示，所述第二内参基因桥引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:63所示，所述第二内参基因探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:64所示。
2.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括dNTPs、PCR缓冲液、DNA聚合酶及如权利要求1所述的引物和探针组合。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶为改性Pfu聚合酶，所述改性Pfu聚合酶是对野生Pfu聚合酶编码93、141、143及147位氨基酸的基因进行敲除后得到，其中，所述野生Pfu聚合酶的编码核苷酸序列如SEQ.ID.NO:65所示。
4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性质控品和空白对照；和/或，
所述试剂盒还包括抗体稳定剂；和/或，
所述dNTPs包括dATP、dUTP、dCTP及dGTP；和/或，
所述试剂盒还包括UNG酶。
5.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述dNTPs包括AdNTPs和BdNTPs，所述PCR缓冲液包括反应液A包括APCR缓冲液和BPCR缓冲液，所述DNA聚合酶包括A DNA聚合酶和BDNA聚合酶；
所述试剂盒包括反应液A和反应液B，其中，所述反应液A包括第一组合、第二组合、第三组合、第七组合、AdNTPs、APCR缓冲液和ADNA聚合酶，所述反应液B包括第四组合、第五组合、第六组合、第八组合、BdNTPs、BPCR缓冲液和BDNA聚合酶。
6.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，各组分浓度如下表所示：
7.一种如权利要求3所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述试剂盒的制备方法包括:
以含有所述野生Pfu聚合酶编码核苷酸序列的质粒为模板，采用第一突变引物进行扩增，得到第一突变产物，所述第一突变引物的序列如SEQ.ID.NO：66~67所示；
以所述第一突变产物为模板，采用第二突变引物对进行扩增，得到Pfu聚合酶突变质粒，所述第二突变引物对如SEQ.ID.NO：68~69所示；
将所述Pfu聚合酶突变质粒转化至感受态细胞，然后进行质粒抽提；
将抽提的所述Pfu聚合酶突变质粒用带Nco I、Bg II酶切位点的引物进行扩增，得到Pfu聚合酶突变体；
将所述Pfu聚合酶突变体与载体质粒进行同源重组，得到Pfu聚合酶突变重组质粒；
将所述Pfu聚合酶突变重组质粒转化进表达菌株进行表达，得到改性Pfu聚合酶粗品；
将所述改性Pfu聚合酶粗品进行提纯后得到所述改性Pfu聚合酶；
将所述改性Pfu聚合酶与所述dNTPs、所述PCR缓冲液及所述引物和探针组合组装，得到所述试剂盒。
8.一种如权利要求1所述的引物和探针组合在制备指导冠心病相关药物用量的制剂上的用途，其特征在于，
SLCO1B1基因和APOE基因联合指导他汀类药物的用量；
CYP2C19基因指导氯吡格雷的用量；
ALDH2基因指导硝酸甘油的用量；
MTHFR基因和MTRR基因联合指导叶酸的用量；
KCNMB1基因指导苯磺酸氨氯地平的用量；
PKCA基因指导氢氯噻嗪的用量。
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103184265A (zh) * | 2011-12-28 | 2013-07-03 | 协和干细胞基因工程有限公司 | Cyp2c19基因检测试剂盒及其扩增方法和检测方法 |
| CN106957903A (zh) * | 2016-11-01 | 2017-07-18 | 上海泽因生物科技有限公司 | 一种检测叶酸代谢关键酶基因多态性位点基因分型试剂盒和其检测方法 |
| CN111154861A (zh) * | 2020-01-17 | 2020-05-15 | 深圳会众生物技术有限公司 | 检测他汀类药物代谢基因多态性的引物及探针组合物、试剂盒、方法 |
| CN112538528A (zh) * | 2020-12-25 | 2021-03-23 | 上海美吉逾华生物医药科技有限公司 | 一种检测aldh2基因多态性的引物组及试剂盒 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012038049A2 (en) * | 2010-09-22 | 2012-03-29 | Roche Diagnostics Gmbh | Amplification of distant nucleic acid targets using engineered primers |
-
2022
- 2022-09-09 CN CN202211107999.0A patent/CN116640839B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103184265A (zh) * | 2011-12-28 | 2013-07-03 | 协和干细胞基因工程有限公司 | Cyp2c19基因检测试剂盒及其扩增方法和检测方法 |
| CN106957903A (zh) * | 2016-11-01 | 2017-07-18 | 上海泽因生物科技有限公司 | 一种检测叶酸代谢关键酶基因多态性位点基因分型试剂盒和其检测方法 |
| CN111154861A (zh) * | 2020-01-17 | 2020-05-15 | 深圳会众生物技术有限公司 | 检测他汀类药物代谢基因多态性的引物及探针组合物、试剂盒、方法 |
| CN112538528A (zh) * | 2020-12-25 | 2021-03-23 | 上海美吉逾华生物医药科技有限公司 | 一种检测aldh2基因多态性的引物组及试剂盒 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Mechanisms and pharmacogenetic signals underlying thiazide diuretics blood pressure response;Mohamed H Shahin等;Current Opinion in Pharmacology;第27卷;第31-37页 * |
| Pharmacogenomics of Hypertension Treatment;Jacek Rysz等;Int. J. Mol. Sci.;第21卷;第1-26页 * |
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| Publication number | Publication date |
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