JPH0556800A - 単純ヘルペスウイルスの型特異的検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 単純ヘルペスウイルスＩ型およびII型の型特
異的検出方法を提供する。 【構成】 水性液体被検試料中の単純ヘルペスウイルス
の型特異的検出において、CACGGGTATA AGGACATCCA の第
１のＤＮＡプライマーとGGGTCCTCGT CCAGATCGCTの第２
のＤＮＡプライマーとの組み合わせ、あるいは、GCCTCT
TTTC CCCCGGGGAGの第１のＤＮＡプライマーとGGGAAAAAA
G CCGCGCGGGGの第２のＤＮＡプライマーとの組み合わせ
を用いてＤＮＡ増幅工程を行う。また、ＤＮＡ検査工程
において、CCCCGATTCG GGCCCGGTCG CTCGCTACCG GTGCGCC
ACC のプローブまたはCCCCGCGGGCGCCGCCCCTC CCCCCGCGC
G CCGCGGGCTG のプローブを使用する。 【効果】 化学合成が可能な程度の大きさで、しかも型
別の特異性が減少しない塩基配列からなるＤＮＡプライ
マーおよびプローブを用いて、ＨＳＶＩ型またはＨＳＶ
II型の感染症を、高精度で、迅速に、しかも型特異的に
識別することができ、その結果を診断および治療に役立
てることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒト単純ヘルペスウイ
ルスＩ型（以下、ＨＳＶＩと称することがある）および
ヒト単純ヘルペスウイルスII型（以下、ＨＳＶIIと称す
ることがある）の型特異的検出方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ヒト単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は
ヒトの知覚神経節に潜伏し、一度感染すると回帰発症を
繰り返す。ＨＳＶにはＩ型とII型とがあり、型によって
回帰発症率や薬剤感受性が異なるので、ＨＳＶの型判別
は重要な問題である。ＨＳＶ感染症の最も確実な診断方
法はウイルスを分離して判定するものであるが、この方
法は培養細胞の準備が必要であり、また判定までに数日
を必要とするので、治療に適切に反映させることが困難
である。蛍光抗体法により判定する方法もあるが、この
場合には患部細胞を必要とする。また、ＨＳＶを型特異
的に識別するＤＮＡ断片をプローブとして患者検体をド
ットブロット法で検査する方法が知られているが、多量
の試料（例えば、２００〜５００μｌ）を必要とするだ
けでなく、ＨＳＶであることを判別することができて
も、型の判別まではできない場合があった。以上のよう
に、従来の方法では、医療の現場の要求に十分応えるこ
とが困難であった。従って、短時間に、精度高くＨＳＶ
Ｉ型とII型の型を判別することのできる手法と体外診断
薬の開発が望まれていた。

【０００３】一方、従来から、ＨＳＶには型特異的な識
別を可能にする塩基配列は存在しないと言われてきたの
に対し、本発明者らは、ＨＳＶの型特異的ＤＮＡプロー
ブを既に開発している。即ち、ＨＳＶＩ型またはＨＳＶ
II型のＤＮＡを特定の制限酵素によって切断して得られ
るＤＮＡ断片〔または、そのＤＮＡ断片を適当なベクタ
ー（プラスミド）に挿入し、クローン化して得られるベ
クター（プラスミド）ＤＮＡを特定の制限酵素で切断し
て得られるＤＮＡ断片〕を標識化し、型特異的なＤＮＡ
プローブを得ることができる。これらの標識化ＤＮＡ断
片は数百〜数キロｂｐ（塩基対）の大きさであり、型別
の特異性が優れている。これらの詳細は、特開平２−１
４２４９９号公報および特願平２−９０１９８号明細書
に開示した。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、前記の
標識化ＤＮＡ断片は化学合成によって作成するのが困難
な大きさであるので、本発明者は、より簡便に取り扱う
ことができ（例えば、化学合成が可能な程度の大きさで
あり）、しかも型別の特異性が減少しない塩基配列を見
出すことを目的として更に検討を続けた結果、型特異的
な識別が可能で、比較的小さい塩基配列を見出すことに
成功した。即ち、本発明の目的は、ＨＳＶＩ型ＤＮＡま
たはＨＳＶII型ＤＮＡに特異的なＤＮＡ断片の増幅に用
いることのできる各種プライマー、およびＨＳＶＩ型Ｄ
ＮＡまたはＨＳＶII型ＤＮＡに特異的なプローブを提供
するものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】従って、本発明は、配列
表における配列番号１の配列で表される塩基配列からな
るオリゴヌクレオチド部分を含有する第１のＤＮＡプラ
イマー〔以下、プライマー（１ａ）と称することがあ
る〕と配列表における配列番号２の配列で表される塩基
配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含有する第２の
ＤＮＡプライマー〔以下、プライマー（２ａ）と称する
ことがある〕との組み合わせ、あるいは、配列表におけ
る配列番号３の配列で表される塩基配列からなるオリゴ
ヌクレオチド部分を含有する第１のＤＮＡプライマー
〔以下、プライマー（１ｂ）と称することがある〕と配
列表における配列番号４の配列で表される塩基配列から
なるオリゴヌクレオチド部分を含有する第２のＤＮＡプ
ライマー〔以下、プライマー（２ｂ）と称することがあ
る〕との組み合わせと、ＤＮＡポリメラーゼと、水性液
体被検試料とを含む混合液をＤＮＡ増幅工程にかけ、続
いて、得られた反応液をＤＮＡ検査工程にかけること特
徴とする、単純ヘルペスウイルスの型特異的検出方法に
関する。本明細書の塩基配列において、Ａはアデニン、
Ｃはシトシン、ＧはグアニンそしてＴはチミンの意味で
ある。

【０００６】本発明方法で用いる液体被検試料は、ＨＳ
Ｖを含有している疑いのある試料であれば特に制限され
ない。例えば、患者水疱内溶液、咽頭拭い液、髄液等を
用いることができる。

【０００７】本発明による前記のＨＳＶ検出方法は、主
に、（１）ＤＮＡ増幅工程と、（２）ＤＮＡ検査工程と
からなる。このＤＮＡ増幅工程（１）では、ＰＣＲ（Ｐ
ｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）
法を用いることができる。ＰＣＲ法を利用すると、微量
のＤＮＡから、目的とするＤＮＡ領域のみを自動的に約
１００万倍にまで増幅することができる（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ、２３９：４８７−４９１，１９８８）。ＰＣＲ法で
は、増幅させるＤＮＡ領域を挟んで＋鎖に対するプライ
マー（以下、第１プライマーと称する）および−鎖に対
するプライマー（以下、第２プライマーと称する）の２
種のＤＮＡプライマーを用いる。

【０００８】本発明のＤＮＡ増幅工程（１）で用いる第
１プライマーと第２プライマーとの組み合わせとして
は、（ａ）第１プライマー（１ａ）と第２プライマー
（２ａ）および（ｂ）第１プライマー（１ｂ）と第２プ
ライマー（２ｂ）、の２種の組み合わせがあり、これら
の組み合わせのいずれか１種を単独で用いるか、または
２種を同時に用いることができる。前記のプライマーの
組み合わせ（ａ）を用いるとＨＳＶＩ型の特異的検出
を、そして前記のプライマーの組み合わせ（ｂ）を用い
るとＨＳＶII型の特異的検出を行うことができる。

【０００９】本発明で用いるＤＮＡプライマー（１ａ）
およびプライマー（２ａ）は、ＨＳＶＩ型ＤＮＡの遺伝
子地図上０．７５マップユニットにある。プライマー
（１ａ）はＢａｍＨＩＢフラグメントの５’末端の３１
塩基上流から１２塩基上流までの補完鎖の２０塩基を含
み、プライマー（２ａ）はＢａｍＨＩＢフラグメントの
５’末端から２１２塩基下流から１９３塩基下流までの
補完鎖の２０塩基を含む。プライマー（１ｂ）およびプ
ライマー（２ｂ）は、ＨＳＶII型ＤＮＡのａ’シークエ
ンス（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，５５，３１５−３３
１，１９８１）上にある。プライマー（１ｂ）はａ’シ
ークエンスの５’末端の９塩基下流から２８塩基下流ま
での補完鎖の２０塩基を含み、プライマー（２ｂ）は
ａ’シークエンスの５’末端から２２１塩基下流から２
０２塩基下流までの補完鎖の２０塩基を含む。従って、
本発明方法において、被検試料中にＨＳＶＩ型ＤＮＡが
存在する場合には、プライマー（１ａ）とプライマー
（２ａ）との組合せによりＢａｍＨＩフラグメントの遺
伝子の一部に相当する２４３ｂｐ部分が、被検試料中に
ＨＳＶII型ＤＮＡが存在する場合には、プライマー（１
ｂ）とプライマー（２ｂ）の組合せによりａ’シークエ
ンスの遺伝子の一部に相当する２１３ｂｐ部分が、短時
間の内に特異的に大量に増幅されるので、被検試料中に
おけるＨＳＶＩ型ＤＮＡおよびＨＳＶII型ＤＮＡの存在
を極めて特異的に検出することができる。

【００１０】前記の第１プライマーおよび第２プライマ
ーはそれぞれ１５ｍｅｒ〜３０ｍｅｒであることができ
るが、一般的には２０ｍｅｒ〜２５ｍｅｒであるのが好
ましい。１５ｍｅｒ未満であるとアニーリングの際の特
異性が減少し、非特異的結合が増加する。また、３０ｍ
ｅｒを越えるとプライマー分子間あるいは分子内での二
次構造を取りやすくなるので好ましくない。本発明方法
で用いる第１プライマーおよび第２プライマーのそれぞ
れを構成する各塩基は、公知の任意の態様で修飾（例え
ば、ビオチン化または発光物質によるラベル化）されて
いてもよい。

【００１１】本発明による前記のそれぞれの第１プライ
マーおよび第２プライマーは、通常のＤＮＡ自動合成機
（例えばアプライドバイオシステム社製）を用いて、公
知のＤＮＡ合成法（例えばホスホアミダイト法）によっ
て調製することができる。

【００１２】本発明のＤＮＡ増幅工程（１）では、第１
プライマーおよび第２プライマーと共に、ＤＮＡポリメ
ラーゼ、特には耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅
サイクルを繰り返す。耐熱性ポリメラーゼとしては、特
に９５℃までの温度で活性を維持することのできるＤＮ
Ａポリメラーゼ、例えば、市販のＴａｑポリメラーゼを
用いることができる。

【００１３】本発明のＤＮＡ増幅工程では前記の第１プ
ライマーと第２プライマーとの特定の組み合わせ、ＤＮ
Ａポリメラーゼおよび液体被検試料を含む混合液を用い
る。第１プライマー、第２プライマーおよびＤＮＡポリ
メラーゼの使用量は、液体被検試料の種類によって変化
するが、ＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅工程を実行すること
ができる範囲で容易に決定することができる。この混合
液は場合により、緩衝液（例えば、トリス塩酸緩衝
液）、安定化剤（例えば、ゼラチン）、または塩類（例
えば、塩化ナトリウム）を含有することができる。

【００１４】本発明方法では、前記の混合液を用いてＰ
ＣＲ法の増幅サイクルを実施する。増幅サイクルは、 （ｉ）ＤＮＡの変性工程（約９０℃〜９５℃で、約１０
秒〜約２分間） （ii）１本鎖ＤＮＡと第１プライマーおよび第２プライ
マーとのアニーリング工程（約３７℃〜７０℃で、約３
０秒〜約３分間）、および （iii ）ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成工程（約
６５℃〜８０℃で、約３０秒〜約５分間）とからなる。
１サイクル毎にＤＮＡ量は２倍に増幅され、ｎサイクル
後には２ⁿ 倍に増幅される。本発明においては、前記の
増幅サイクルを１０〜６０回、好ましくは２０〜４０回
繰り返す。最後のサイクルにおいては、工程（iii ）の
加熱時間を約５〜１０分間に延長してＤＮＡ合成が完全
に行われるようにするのが好ましい。

【００１５】被検試料中にＨＳＶが存在する場合には、
前記の増幅サイクル終了後に、約２００〜３００ｂｐの
ＤＮＡが大量に合成される。このＤＮＡを次のＤＮＡ検
査工程によって検出する。

【００１６】ＤＮＡ検査工程としては、ゲル電気泳動法
およびエチジウムブロマイド染色を利用する方法、サザ
ンブロットハイブリッド法、またはジデオキシ法による
塩基配列決定法、放射性標識法などを用いることができ
る。ゲル電気泳動法を行う場合には、例えば、アガロー
スゲルを担体としたサブマリーン型電気泳動、またはア
クリルアミドを用いたスラブ型電気泳動を使用すること
ができる。

【００１７】サザンブロットハイブリッド法、またはｉ
ｎ ｓｉｔｕハイブリッド法を行う場合には、放射性プ
ローブ、非放射性プローブ（例えば、酵素標識プロー
ブ、ビオチン化プローブ、ジゴキシゲニン化プローブま
たは化学発光物質、蛍光物質で標識したプローブ）を用
いることができる。

【００１８】更に、ジデオキシ法による塩基配列決定法
を利用する場合には、蛍光標識を使用したＤＮＡオート
シークエンサー（アプライドバイオシステムズ社）を用
いることができる。

【００１９】本発明は、更に、ＨＳＶＩ型ＤＮＡおよび
ＨＳＶII型ＤＮＡの各々の特異的な検出に用いることの
できる２種類のＤＮＡプローブを提供するものでもあ
る。これらのＤＮＡプローブは、（Ａ）配列表における
配列番号５の配列で表される塩基配列からなるオリゴヌ
クレオチド部分を含有するＤＮＡプローブ（以下、プロ
ーブＡと称することがある）、または（Ｂ）配列表にお
ける配列番号６の配列で表される塩基配列からなるオリ
ゴヌクレオチド部分を含有するＤＮＡプローブ（以下、
プローブＢと称することがある）である。

【００２０】プローブＡはＢａｍＨＩＢフラグメントの
５’末端から下流５０塩基から８９塩基までの４０塩基
を含む。プローブＡはＨＳＶＩ型ＤＮＡのＢａｍＨＩフ
ラグメントに特異的である。プローブＡの長さは被検試
料に対する前処理の種類によって異なる。被検試料がＰ
ＣＲ法によるＤＮＡ増幅工程を経たものである場合に
は、１０ｂｐ乃至ＰＣＲ法で増幅されるＤＮＡ断片の大
きさ（プライマー部分は除く）まで可能である。また、
被検試料がＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅工程を経たもので
なく、プローブＡをｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド法に用
いる場合には、プローブＡの長さは１０ｂｐ乃至２８７
ｂｐの大きさまで可能である。配列表における配列番号
５の配列で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチ
ド部分からなるＤＮＡプローブＡ（４０ｍｅｒ）は、被
検試料がＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅工程を経たものであ
っても、あるいはｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド法の場合
であっても、いずれにも用いることができるので好まし
い。プローブＡの調製法としては、サクシノイミド（例
えば、ジサクシニミジルスベレイト）を用いる方法、マ
レイミド法、活性ハロゲン法、アジドを用いた光反応、
あるいはカルボジイミド法などを用いることができる。

【００２１】プローブＢはａ’シークエンスの５’末端
から１４８塩基下流から１８７塩基下流までの４０塩基
を含む。プローブＢは、ＨＳＶII型ＤＮＡのａ’シーク
エンスに特異的である。プローブＢの長さは被検試料に
対する前処理の種類によって異なる。被検試料がＰＣＲ
法によるＤＮＡ増幅工程を経たものである場合には、１
０ｂｐ乃至ＰＣＲ法で増幅されるＤＮＡ断片の大きさ
（プライマー部分は除く）まで可能である。また、被検
試料がＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅工程を経たものでな
く、プローブＢをｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド法に用い
る場合には、プローブＢの長さは１０ｂｐ乃至１８５ｂ
ｐの大きさまで可能である。配列表における配列番号６
の配列で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
部分からなるＤＮＡプローブＢ（４０ｍｅｒ）は、被検
試料がＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅工程を経たものであっ
ても、あるいはｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド法の場合で
あっても、いずれにも用いることができるので好まし
い。プローブＢの調製法としては、前記のプローブＡの
調製法と同じ方法を用いることができる。

【００２２】プローブＡおよびプローブＢの標識物質と
しては、従来公知の任意の物質を使用することができ
る。好ましくは、非放射性物質（酵素、蛍光色素、発光
物質、ビオチン等）を用いる。標識化ＤＮＡの合成法に
は、大別すると （１）ＤＮＡの合成過程で直接的に標識化ＤＮＡを調製
する方法と （２）リンカーが結合したＤＮＡを合成してから単離
し、これに標識試薬を作用させる方法 とがあり、特に方法（２）は目的に応じて標識の型を容
易に変更でき、応用面で優れているので好ましい。方法
（２）で用いるリンカーとしては、５’−ジメトキシト
リチル−５−〔Ｎ−（トリフルオロアセチルアミノヘキ
シル）−３−アクリルイミド〕−２’−デオキシウリジ
ン−３’−〔（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソ
プロピル〕］ホスホルアミダイト等を挙げることができ
る。

【００２３】プローブに結合されている標識から信号を
発生させ、更にその信号を測定する方法も、従来から公
知の任意の方法を用いることができる。

【００２４】

【作用】本発明方法においてプライマー（１ａ）および
プライマー（２ａ）の組み合わせを用いると、被検試料
中にＨＳＶＩ型ＤＮＡが存在する場合にのみ、ＢａｍＨ
Ｉフラグメントの遺伝子の一部に相当する２４３ｂｐ塩
基部分が短時間のうちに特異的に大量に増幅合成され
る。また、プライマー（１ｂ）およびプライマー（２
ｂ）の組み合わせを用いると、被検試料中にＨＳＶII型
ＤＮＡが存在する場合にのみ、ａ’シークエンスの遺伝
子の一部に相当する２１３ｂｐ塩基部分が短時間のうち
に特異的に大量に増幅合成される。従って、被検試料中
におけるＨＳＶＩ型ウイルスおよび／またはＨＳＶII型
ウイルスの存在を極めて特異的に検出することができ
る。更に、被検試料中のＨＳＶＩ型ＤＮＡまたはＨＳＶ
II型ＤＮＡ量が微量であってもＤＮＡが増幅合成される
ので高感度である。

【００２５】また、本発明方法においては、（場合によ
り増幅した）ＨＳＶＩ型ＤＮＡまたはＨＳＶII型ＤＮＡ
に特異的な標識化ＤＮＡプローブを用いるので、極めて
正確にＨＳＶＩ型ＤＮＡまたはＨＳＶII型ＤＮＡを検出
することができる。更に、前記の第１および第２プライ
マーを用いる増幅工程と前記のプローブを用いる検査工
程とを併用すると、検査の所要時間はエチジウム染色の
場合は４〜５時間程度であり、サザンブロットハイブリ
ッド法まで行う場合でも４８〜５０時間程度であり、迅
速に結果を得ることができる。

【００２６】

【実施例】以下、実施例によって本発明を更に詳細に説
明するがこれらは本発明の範囲を限定するものではな
い。

【００２７】実施例１：プライマーおよびプローブの合
成 ３８１Ａ型自動ＤＮＡ合成装置（アプライドバイオシス
テムズ社）に、アデニンＣＰＧカラムを装着して、配列
表における配列番号１の配列に記載の塩基２０個からな
るプライマー（１ａ）を合成し、更に、チミンＣＰＧカ
ラムを装着して配列表における配列番号２の配列に記載
の塩基２０個からなるプライマー（２ａ）を合成し、そ
してグアニンＣＰＧカラムを装着して配列表における配
列番号３の配列に記載の塩基２０個からなるプライマー
（１ｂ）および配列表における配列番号４の配列に記載
の塩基２０個からなるプライマー（２ｂ）をそれぞれ合
成した。アンモニア水（約３０％）２．５mlを入れたデ
ィスポシリンジ（２．５ml）を、合成工程が完了したＣ
ＰＧカラムに接続し、アンモニア水をカラム内に押し出
して、合成したＤＮＡフラグメントを溶出した。回収し
たＤＮＡアンモニア溶液の入ったバイアル瓶を密栓し、
６５℃で６時間加熱した後、室温まで冷やしてから濃縮
した。濃縮物を凍結乾燥し、１０ｍＭトリエチルアンモ
ニウムアセテート（以下、ＴＥＡ−Ａと称す）（ｐＨ
７．４）に溶解し、沈澱を除いてから、Ｌ−６２００型
高速液体クロマトグラフィー装置（日立製作所）（以
下、ＨＰＬＣと称す）に分離用カラム（ＹＭＣ−Ｐａｃ
ｋ ＯＤＳ−ＡＭ３１３：ＹＭＣ社）を装着し、５％ア
セトニトリルを含んだ９５ｍＭ−ＴＥＡ−Ａとアセトニ
トリルとによる濃度勾配を用いて精製し、メインピーク
を集めた。得られた残渣に８０％酢酸（アセトニトリル
で調整）を加えて懸濁させ、室温で３０分間保持してか
ら減圧乾燥した。乾燥物を１０ｍＭ−ＴＥＡ−Ａに溶解
し、ジエチルエーテルで抽出してから減圧乾燥した。乾
燥したＤＮＡ試料をＴＥＡ−Ａに溶解し、沈澱を除いて
から、２回目のＨＰＬＣによる精製を行い、メインピー
クを集めた。こうして得られた精製ＤＮＡプライマーを
減圧乾燥して保存し、後記の実施例２および３で用い
た。

【００２８】前記と同様の操作により、配列表における
配列番号５の配列に記載の塩基４０個からなるプローブ
Ａおよび配列表における配列番号６の配列に記載の塩基
４０個からなるプローブＢを合成した。なお、プローブ
Ａの合成にはシトシンＣＰＧカラムを用い、そしてプロ
ーブＢの合成にはグアニンＣＰＧカラムを用いた。

【００２９】実施例２：標識プローブの調製（オリゴラ
ベリング） 前記実施例１で調製したプローブＡおよびＢを、³²Ｐに
よってオリゴラベリングした（ファルマシア社のオリゴ
ラベリングキットを使用）。プローブＤＮＡ１００ｎｇ
を含む水溶液４μｌに水５８μｌを加えて、１０分間１
００℃で加熱後、直ちに氷冷した。氷冷したプローブ液
にデオキシヌクレオチド三燐酸混液２０μｌ、ウシ血清
アルブミン４μｌ、クレノフ酵素４μｌ、α−³²Ｐ−ｄ
ＣＴＰ（３００Ｃｉ／）１μｌを加え、室温で２時間保
持した。次に、反応停止液４０μｌ、キャリアＲＮＡ
（１０ｍｇ／ｍｌ）４０μｌおよび水３６０μｌを加え
て希釈した反応液に、４Ｍ塩化ナトリウム０．１容量
部、エチルアルコール２容量部を加え、−７０℃で１５
分間放置してＤＮＡを沈澱させ、１５，０００回転で遠
心した。得られた沈澱を、１ｍＭ−ＥＤＴＡを含む１０
ｍＭトリス塩酸緩衝液３０μｌに溶かし、７．５Ｍアン
モニウムアセテート１６μｌおよびエチルアルコール９
２μｌを加え、−７０℃で１５分間放置した後、遠心し
た。得られた沈澱に７５％エチルアルコール２００μｌ
を加えて更に遠心し、得られた沈澱を室温で２時間風乾
した。得られた標識プローブを、１ｍＭＥＤＴＡを含む
１０ｍＭトリス塩酸緩衝液２００μｌに溶かした。こう
して得られた標識プローブ溶液は、一回のドットブロッ
ティングに対して約１０μｌの量で用いる。

【００３０】実施例３：標識プローブの調製（エンドラ
ベリング）³² Ｐでエンドラベリングしたプローブの調製は以下の方
法で実施した。前記実施例１で調製したプローブＤＮＡ
５００ｎｇを含む溶液１μｌに、１０×キナーゼ緩衝液
２．５μｌ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ１．５μｌ
（１５単位）およびγ- ³²Ｐ−ＡＴＰ２０μｌ（２００
Ｃｉ）を加え、３７℃で４５分間保持した。次に、メチ
ルアルコール２ｍｌおよび洗浄液（０．１Ｍトリス−Ｈ
Ｃｌの１００ｍｌ中にトリエチルアミン１４０μｌを含
む１ｍＭ−ＥＤＴＡ−１Ｍトリス塩酸緩衝液：ｐＨ７．
７：以下、Ａ液と称する）２ｍｌで洗った逆相イオン交
換カラム（ＮＥＮ ＳＯＲＢ２０カラム：ＤｕＰｏｎｔ
社）に、Ａ液４００μｌを加えた前記反応液を流した。
続いて、前記カラムをＡ液３ｍｌおよび水３ｍｌで洗浄
した後、２０％エチルアルコール水溶液１ｍｌで標識プ
ローブを溶出した。標識プローブは最初の５００μｌの
画分に溶出された。一回のハイブリダイゼイションに
は、こうして得られた溶出液５０μｌを用いる。

【００３１】実施例４：ＨＳＶのＤＮＡの抽出 ＨＳＶＩ型の標準株としてＷＴ５１−３−４〔角膜ヘル
ペス患者からの分離株：Ａｃｔａ Ｖｉｒｏｌ．２３：
２２６−２３０（１９７９）〕を、そしてＨＳＶII型の
標準株としてＵＷ２６８を用い、更に型が判明している
ＨＳＶ野性株として臨床分離株（ＨＳＶ感染患者のヘル
ペス様部位から単離）をＩ型およびII型のそれぞれにつ
いて５株づつ用いた。

【００３２】各ウイルスをアフリカミドリザルの腎由来
のＣＶ−１細胞に１ｐｆｕ／細胞の濃度で感染させた。
ウイルスに感染した細胞を５％二酸化炭素−９５％空気
の気相中で培養した。細胞変性効果の見られた細胞を用
いて、庶糖法（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，９３，２６０−２６
４，１９７９）によりウイルスＤＮＡを抽出した。

【００３３】実施例５：ＰＣＲ法によるＨＳＶ−ＤＮＡ
の増幅 前記実施例４で抽出したＨＳＶＩ型標準株のＤＮＡ、Ｈ
ＳＶII型標準株のＤＮＡおよび型既知のＨＳＶ野性株の
ＤＮＡ各１０ｎｇを、１２５μＭ−ｄＡＴＰ、１２５μ
Ｍ−ｄＣＴＰ、１２５μＭ−ｄＴＴＰ、３１．２５μＭ
−ｄＧＴＰ、９３．７５μＭデアザＣ⁷ ＧＴＰ（以下ｄ
Ｃ⁷ ｄＧＴＰと略す）、０．０１％ゼラチン、２０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）、１．５ｍＭ−ＭｇＣ
ｌ₂ 、５０ｍＭ−ＫＣｌ、１０％ジメチルスルホキシ
ド、２μＭプライマーおよび２．５単位のＴａｑポリメ
ラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ：シー
タス社）を含むＰＣＲ反応液１００μｌに加えた。ＨＳ
ＶＩ型用プライマーを用いた系でのＰＣＲ法は（ｉ）９
２℃で１分間、（ii）６０℃で１分間、および（iii）
７２℃で２分間からなるサイクルを３０サイクル実施
し、最後に７２℃で５分間のプログラムでＤＮＡの増幅
を行った。ＨＳＶII型用プライマーを用いる系でのＰＣ
Ｒ法は（ｉ）９３℃で１分間、（ii）６５℃で１分間、
および（iii ）７３℃で１分間からなるサイクルを３０
サイクル行った後、最後に７３℃で５分間のプログラム
でＤＮＡの増幅を行った。

【００３４】実施例６：電気泳動によるＰＣＲ反応生成
物の確認と診断 電気泳動用のゲルは、トリス塩酸５．４ｇと硼酸２．７
５ｇと０．５Ｍ−ＥＤＴＡ２mlとを含む緩衝液（ｐＨ
８．０）（以下、０．５×ＴＢＥと称す）１リットルに
アガロースゲル４％を溶解し、ムピド（アドバンス社）
のゲルプレートに流して調製した。次に、ＰＣＲ反応後
の溶液１０μｌにフィコールタイプ４００（ファルマシ
ア社）の１５％水溶液２μｌを混合し、その混合物全量
をサンプルウエルに入れた。１×ＴＡＥを電極槽に入れ
て、室温で１００Ｖにて、２時間電気泳動を行った。電
気泳動終了後に、アガロースゲルをエチジウムブロマイ
ドで染色し、ＵＶイルミネイター照射下で電気泳動の結
果を確認した。ＨＳＶＩ型用プライマーを用いた結果を
図１に、そしてＨＳＶII型用プライマーを用いた結果を
図２に示す。図１および図２において記号は以下の意味
である。 Ｍ：ＤＮＡマーカー、 １：ＨＳＶＩ型標準株（ＷＴ５１−３−４）、 ２〜６：ＨＳＶＩ型野性株、 ７：ＨＳＶII型標準株（ＵＷ２６８）、 ８〜１２：ＨＳＶII型野性株、

【００３５】なお、ＤＮＡマーカー（Φ×１７４−Ｈａ
ｅIII ｄｉｇｅｓｔ）としては、下から７２ｂｐ、１１
８ｂｐ、１９４ｂｐ、２３４ｂｐ、２７１ｂｐ、２８１
ｂｐ、３１０ｂｐ、６０３ｂｐ、８７２ｂｐ、１０７８
ｂｐ、および１３５７ｂｐと現れるものを用いた。図１
および図２から明らかなように、本発明によるプライマ
ーを用いてＰＣＲ法を行うことによって、目的とするＨ
ＳＶの型特異的なＤＮＡ特定部位の増幅が可能となる。

【００３６】なお、図２のエチジウムブロマイド染色に
よれば、ＨＳＶII型用プライマーを用いたＰＣＲ法にお
いて、ＨＳＶＩ型およびＨＳＶII型のそれぞれに複数の
バンドが観察される。ＨＳＶＩ型およびＨＳＶII型で
は、それぞれ増幅される部分が異なるので、それぞれの
標準株との対比からＨＳＶＩ型およびＨＳＶII型の判定
は可能であるが、この点を更に確認するために、実施例
３で調製したエンドラベリング標識プローブＡおよびＢ
を用い、サザンハイブリダイゼイションを行った。即
ち、電気泳動後のアガロースゲルからＤＮＡ Ｈｙｂｒ
ｉｄｉｚａｔｉｏｎｍｅｍｂｒａｎｃｅ（ＧｅｎｅＳｃ
ｒｅｅｎＰｌｕｓ：ＤｕＰｏｎｔ社）にサザンブロット
したものと各々のプローブをハイブリダイゼイションし
た後、オートラジオグラフィーを得た。結果を図３に示
す。図３のレーン１および３はＨＳＶＩ型標準株（ＷＴ
５１−３−４）であり、レーン２および４はＨＳＶII型
標準株（ＵＷ２６８）である。更に、図３のレーン１お
よび２にはエンドラベリング標識プローブＡを使用し、
レーン３および４にはエンドラベリング標識プローブＢ
を使用した。図３から明らかな様に、ＨＳＶII型用プラ
イマーをテンプレートにして増幅したバンドだけがＨＳ
ＶII型判別プローブＢとハイブリダイズし、ＨＳＶＩ型
用プライマーをテンプレートにして増幅したバンドはＨ
ＳＶII型判別プローブＢとハイブリダイズしなかった。
以上の結果から明らかなように、本発明のプライマーで
患者検体のＤＮＡを増幅し、増幅されたＤＮＡを本発明
のプローブで確認することによりＨＳＶ感染症の起因ウ
イルスがＨＳＶＩ型であるのか、あるいはＨＳＶII型で
あるのかの型確定診断を行うことができる。

【００３７】実施例７：水疱内溶液のドットブロット法
によるＨＳＶの型判別 ヘルペス感染症の疑いのある患者から採取した水疱内溶
液５μｌを生理食塩水２ｍｌに懸濁して、希釈した。希
釈検体２００μｌに同容量の０．５Ｎ−ＮａＯＨを加
え、室温で１０分間放置した。ＤＮＡを変性させた前記
の処理済検体５０μｌを、ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎＰｌｕ
ｓＮＥＦ９７６（Ｄｕ Ｐｏｎｔ社）を装着したブロッ
ティング装置に載せ、室温で３０分間放置した後、吸引
により液を除いた。ＤＮＡをブロットしたＧｅｎｅＳｃ
ｒｅｅｎＰｌｕｓＮＥＦ９７６をプラスチック袋に入
れ、続いて、０．２％ポリビニルピロリドン（分子量４
０，０００）、０．２％フィコール（分子量４０，００
０）、０．２％ウシ血清アルブミン、０．０５Ｍトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１Ｍ塩化ナトリウム、０．
１％燐酸ナトリウム、１％ラウリル硫酸ナトリウム、１
０％デキストラン硫酸ナトリウム（分子量５００，００
０）および変性した鮭精子ＤＮＡ（１００μｇ／ｍｌ）
の組成からなるハイブリダイゼイション液５ｍｌを加え
て密封した。６５℃で６時間放置した後、実施例２で調
製した³²Ｐで標識（オリゴラベリング）したＨＳＶ型判
別用プローブを加え、更に、６５℃で６時間放置した。
処理の終わったＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎＰｌｕｓＮＥＦ９
７６を、大量の０．３Ｍ塩化ナトリウムと０．０３４Ｍ
クエン酸三ナトリウムとを含む２×ＳＳＣ（ｐＨ７．
０）中で、室温下および攪拌下に５分間、２回洗浄した
後、２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ中で６５℃にて１５分間で
２回洗浄した後、更に、室温下および攪拌下に５分間、
０．１×ＳＳＣ中で２回洗浄した。洗浄後の膜を室温で
１時間風乾した。

【００３８】ＨＳＶの型判別用プローブとのハイブリダ
イゼイション処理の終わったＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎＰｌ
ｕｓＮＥＦ９７６を感光用カセットに入れて固定し、フ
ィルム（Ｋｏｄａｋ−Ｘ−ＯＭＡＴ−ＡＲ ＸＡＲ５）
に重ね、−７０℃で感光させ、現像した。結果を図４に
示す。図４において、１〜５は患者検体であり、６はＨ
ＳＶＩ型標準株であり、７はＨＳＶII型標準株であり、
図面右側の記載は判定結果である。図４から明らかな様
に、プローブＡはＨＳＶＩ型のウイルスと、プローブＢ
はＨＳＶII型のウイルスとハイブリダイズしている。

【００３９】実施例８：水疱内溶液ＨＳＶの型判別 （１）実施例７で用いた水疱内溶液５μｌを生理食塩水
２ｍｌに懸濁した。希釈検体５０μｌに６Ｍグアニジン
イソシアネート５０μｌとガラスパウダー１０μｌとを
加えて室温で放置した。１０分後、１５，０００回転で
２分間遠心し、上清を捨てた。沈澱に５０％エチルアル
コール、１ｍＭ−ＥＤＴＡおよび５０ｍＭ塩化ナトリウ
ムを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）１ｍ
ｌを加えて懸濁し、攪拌後、１５，０００回転で更に２
分間遠心した。遠心によるガラスパウダーの洗浄を３回
繰り返した。洗浄したガラスパウダーに蒸留水５０μｌ
を加えて懸濁させ、５５℃で１５分間放置した。次に、
１５，０００回転で２分間遠心し、その上清をＤＮＡ抽
出液としてＰＣＲ法によるＤＮＡの増幅工程に用いた。
前記実施例５に記載の方法によってＤＮＡ増幅工程を行
い、実施例６に記載の方法によってＰＣＲ反応生成物の
型判定を行った。

【００４０】（２）一方、対照試験として、従来の蛍光
抗体法を実施した。即ち、病変部位を細い綿棒で擦り取
り、無蛍光スライドの二か所に塗沫し、自然乾燥させて
から、室温で１０分間アセトン固定を行った。次に、そ
れぞれの固定された検体を、蛍光標識した抗ＨＳＶＩ型
抗体（Ｓｙｖａ社）または抗ＨＳＶII型抗体（Ｓｙｖａ
社）と室温で約３０分間反応させた。スライドガラスを
水洗し、グリセリン包埋した後、これを蛍光顕微鏡下で
観察した。

【００４１】（３）更に、対照試験として、従来の臨床
診断法（医師が発病部位や病巣を観察して診断する）を
実施した。

【００４２】これらの結果を表１に示す。表１に示すよ
うに、供試した水疱内溶液１８検体中、臨床診断法では
ＨＳＶＩ型３検体、ＨＳＶII型３検体、そして判定不能
（Ｉ型であるかII型であるのかを確定的に診断できない
もの）１２検体であり、蛍光抗体法ではＨＳＶＩ型７検
体、ＨＳＶII型１検体、検査不能（患部細胞を採取でき
ない）８検体、そして判定不能２検体となった。これに
対し、本発明によるドットブロットハイブリダイゼイシ
ョンのＤＮＡ検査では、ＨＳＶＩ型１２検体、そしてＨ
ＳＶII型６検体となり、検査不能および型判別不能の検
体はなかった。

【００４３】実施例９：咽頭拭い液のＨＳＶの型判別 実施例８（１）に記載の方法により、ヘルペス感染症の
疑いのある患者の咽頭拭い液からＤＮＡを抽出した。こ
の抽出ＤＮＡを用いて、実施例７に記載のドットブロッ
ト法によるＨＳＶの型判別と実施例８（１）に記載のＰ
ＣＲ法によるＨＳＶの型判別を行った。咽頭拭い液３６
検体中、ドットブロット法ではＨＳＶＩ型１０検体、型
判別不能１０検体、そして陰性１６検体の結果が得られ
たが、本発明によるＰＣＲ法ではＨＳＶＩ型が３２検体
で、残り４検体が陰性と言う高い型判別能を示した。こ
れらの結果を表２に示す。

【００４４】

【表１】

【００４５】

【表２】

【００４６】

【発明の効果】本発明方法は、ＨＳＶＩ型ＤＮＡまたは
ＨＳＶII型ＤＮＡに特異的なＤＮＡ断片の増幅に用いる
ことのできる各種プライマー、およびＨＳＶＩ型ＤＮＡ
またはＨＳＶII型ＤＮＡに特異的なプローブとして、化
学合成が可能な程度の大きさで、しかも型別の特異性が
減少しない塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを提供
するものである。従って、ＨＳＶＩ型またはＨＳＶII型
の感染症を、高精度で、迅速に、しかも型特異的に識別
することができ、その結果を診断および治療に役立てる
ことができる。

【００４７】

【配列表】

【００４８】配列番号：１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列： CACGGGTATA AGGACATCCA

【００４９】配列番号：２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列： GGGTCCTCGT CCAGATCGCT

【００５０】配列番号：３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列： GCCTCTTTTC CCCCGGGGAG

【００５１】配列番号：４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列 GGGAAAAAAG CCGCGCGGGG

【００５２】配列番号：５ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列 CCCCGATTCG GGCCCGGTCG CTCGCTACCG GTGCGCCACC

【００５３】配列番号：６ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列 CCCCGCGGGC GCCGCCCCTC CCCCCGCGCG CCGCGGGCTG

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のＨＳＶＩ型用プライマーを用いたＰＣ
Ｒ反応により増幅されたＤＮＡに関する電気泳動の結果
を示す図面に代わる写真である。

【図２】本発明のＨＳＶII型用プライマーを用いたＰＣ
Ｒ反応により増幅されたＤＮＡに関する電気泳動の結果
を示す図面に代わる写真である。

【図３】図２の電気泳動像を、放射性同位元素で標識し
たプローブを用いたサザンハイブリッド法により確認し
た結果を模式的に示す説明図である。

【図４】放射性同位元素で標識した本発明のプローブを
用いて、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施
した結果を模式的に示す説明図である。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成３年１２月１９日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００５

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００５】

【課題を解決するための手段】従って、本発明は、配列
表における配列番号１の配列で表される塩基配列の少な
くとも１５塩基のオリゴヌクレオチド部分を含有する第
１のＤＮＡプライマー〔以下、プライマー（１ａ）と称
することがある〕と配列表における配列番号２の配列で
表される塩基配列の少なくとも１５塩基のオリゴヌクレ
オチド部分を含有する第２のＤＮＡプライマー〔以下、
プライマー（２ａ）と称することがある〕との組み合わ
せ、あるいは、配列表における配列番号３の配列で表さ
れる塩基配列の少なくとも１５塩基のオリゴヌクレオチ
ド部分を含有する第１のＤＮＡプライマー〔以下、プラ
イマー（１ｂ）と称することがある〕と配列表における
配列番号４の配列で表される塩基配列の少なくとも１５
塩基のオリゴヌクレオチド部分を含有する第２のＤＮＡ
プライマー〔以下、プライマー（２ｂ）と称することが
ある〕との組み合わせと、ＤＮＡポリメラーゼと、水性
液体被検試料とを含む混合液をＤＮＡ増幅工程にかけ、
続いて、得られた反応液をＤＮＡ検査工程にかけること
を特徴とする、単純ヘルペスウイルスの型特異的検出方
法に関する。本明細書の塩基配列において、Ａはアデニ
ン残基、Ｃはシトシン残基、Ｇはグアニン残基、そして
Ｔはチミン残基の意味である。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１９

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１９】本発明は、更に、ＨＳＶＩ型ＤＮＡおよび
ＨＳＶＩＩ型ＤＮＡの各々の特異的な検出に用いること
のできる２種類のＤＮＡプローブを提供するものでもあ
る。これらのＤＮＡプローブは、（Ａ）配列表における
配列番号５の配列で表される塩基配列の少なくとも１０
塩基のオリゴヌクレオチド部分を含有するＤＮＡプロー
ブ（以下、プローブＡと称することがある）、または
（Ｂ）配列表における配列番号６の配列で表される塩基
配列の少なくとも１０塩基のオリゴヌクレオチド部分を
含有するＤＮＡプローブ（以下、プローブＢと称するこ
とがある）である。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表における配列番号１の配列で表さ
   れる塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含有す
   る第１のＤＮＡプライマーと配列表における配列番号２
   の配列で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
   部分を含有する第２のＤＮＡプライマーとの組み合わ
   せ、あるいは、配列表における配列番号３の配列で表さ
   れる塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含有す
   る第１のＤＮＡプライマーと配列表における配列番号４
   の配列で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
   部分を含有する第２のＤＮＡプライマーとの組み合わせ
   と、ＤＮＡポリメラーゼと、水性液体被検試料とを含む
   混合液をＤＮＡ増幅工程にかけ、続いて、得られた反応
   液をＤＮＡ検査工程にかけること特徴とする、単純ヘル
   ペスウイルスの型特異的検出方法。
2. 【請求項２】 配列表における配列番号５の配列または
   配列表における配列番号６の配列で表される塩基配列か
   らなるオリゴヌクレオチド部分を含有し、標識を担持す
   るプローブと被検試料とを接触させ、前記標識からの信
   号を検出することを特徴とする、単純ヘルペスウイルス
   の型特異的検出方法。