JP3650797B2 - ヒトアデノウイルス５型ｅ１ａおよびｅ１ｂ遺伝子検出用オリゴヌクレオチド - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子と相同性を有し、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子を検出するのに有用なオリゴヌクレオチドに関する。本発明のオリゴヌクレオチドは、ウイルス感染診断薬および研究用試薬として有用である。
【０００２】
【従来の技術】
組み換えアデノウイルスはアデノウイルスの自律増殖性を司るＥ１遺伝子領域を欠失した遺伝子導入ベクターであり、遺伝子治療や基礎研究の分野で有用である。この組み換えウイルスを調製する段階で宿主細胞である２９３細胞のＥ１遺伝子と組み換えアデノウイルスとの間で相同組み換えがおこり、自律増殖性アデノウイルス(replication-competent adenovirus ; ＲＣＡ)が生じることが報告されている（Lochmuller, H.ら「Human Gene Therapy」 5巻1485-1491頁 (1994)）。遺伝子治療や基礎研究に用いられる組み換えアデノウイルスに混入したＲＣＡを検出するために、従来ではＥ１遺伝子を持たないＨｅＬａ細胞に組み換えウイルスを感染させて、その細胞毒性を顕微鏡下で観察する方法やその感染ＨｅＬａ細胞から抽出した全ＤＮＡをサザンブロット分析やＰＣＲ法で検出する方法などが行われてきた（Lochmuller, H.ら「Human Gene Therapy」 5巻1485-1491頁 (1994)；佐藤友美ら 「別冊 実験医学 遺伝子導入＆発現解析実験法」27-42頁 (1997)）。
【０００３】
ＨｅＬａ細胞への細胞毒性を観察する方法は検出感度が低く、サザンブロット分析は放射活性物質を用いるので操作手順が繁雑になる。ＰＣＲによる検出法は感度が高く比較的簡便な操作手順で行えるものであるが、検出用オリゴヌクレオチドプライマーの設計の仕方によっては、それら同士が結合したり、ＨｅＬａ細胞のゲノムＤＮＡに結合したりして正確な検出結果が得られない場合が考えられる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
そこでこれらの問題を解決するため、検出方法としてＰＣＲ法を用いる場合、そのオリゴヌクレオチドプライマーは、自身の結合による副生成物を生じず、ＨｅＬａ細胞のゲノムＤＮＡにも結合せず、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子の該当部分に特異的に結合するように設計する必要がある。ここで、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子とはＥ１遺伝子を構成する遺伝子である。従って、本発明は、ＰＣＲ法を用いて簡便にしかも感度の高いＲＣＡ検出を行うことができるオリゴヌクレオチドを提供することを解決すべき課題とした。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討し、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子を検出するのに適したオリゴヌクレオチドプライマーを検索し、該遺伝子の混入をＰＣＲ法を用いて効率的に検出できる塩基配列を設定し、この塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを作製し、それを用いた検出効果をin vitro実験系において確かめることに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
即ち、本発明によれば、配列表の配列番号１〜４の何れかに記載の塩基配列またはそれらと実質的に同一の塩基配列を有する、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子検出用オリゴヌクレオチドが提供される。
【０００７】
好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは、下記の何れかに記載の塩基配列を有する。
（１）配列表の配列番号１〜４の何れかに記載の塩基配列；
（２）配列表の配列番号１〜４の何れかの塩基配列においてＴをＵに置換した塩基配列；
（３）上記（１）又は（２）に記載の塩基配列と少なくとも７０％以上の相同性を有する塩基配列であって、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子を特異的に検出できる塩基配列；又は、
（４）配列表の配列番号１〜４の何れかの塩基配列において１〜数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列であって、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子を特異的に検出できる塩基配列；
【０００８】
本発明の別の側面によれば、配列表の配列番号１に記載の塩基配列またはそれと実質的に同一の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列表の配列番号２に記載の塩基配列またはそれと実質的に同一の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから成るヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ遺伝子検出用プライマーセットが提供される。
【０００９】
本発明のさらに別の側面によれば、配列表の配列番号３に記載の塩基配列またはそれと実質的に同一の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列表の配列番号４に記載の塩基配列またはそれと実質的に同一の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから成るヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ｂ遺伝子検出用プライマーセットが提供される。
【００１０】
好ましくは、実質的に同一の塩基配列とは、下記の何れかに記載の塩基配列である。
（１）当該塩基配列においてＴをＵに置換した塩基配列；
（２）当該塩基配列と少なくとも７０％以上の相同性を有する塩基配列であって、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子を特異的に検出できる塩基配列；又は、
（３）当該塩基配列において１〜数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列であって、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子を特異的に検出できる塩基配列；
【００１１】
本発明のさらに別の側面によれば、本発明のオリゴヌクレオチドあるいはプライマーセットを用いて試料中のヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子を検出することを含む、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子の検出方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、試料中の核酸を鋳型として、本発明のプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより、試料中のヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子を検出することを含む、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子の検出方法が提供される。
【００１２】
本発明のさらに別の側面によれば、本発明のオリゴヌクレオチドあるいはプライマーセットを含む、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子検出用試薬が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、本発明のオリゴヌクレオチドあるいはプライマーセットを含む、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子検出用キットが提供される。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
（Ｉ）本発明のオリゴヌクレオチドの設計
本発明のオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号１〜４の何れかに記載の塩基配列またはそれらと実質的に同一の塩基配列を有するものであり、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子検出のために使用することができる。
ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子とは、ヒトアデノウイルス５型のＥ１Ａ又はＥ１Ｂタンパク質のアミノ酸配列を規定している構造遺伝子を意味する。本発明のオリゴヌクレオチド化合物は、高力価の組み換えウイルス液中に混入したＲＣＡをＰＣＲ法で高感度に検出するものである。
【００１４】
本発明のオリゴヌクレオチドは以下のようにしてＰＣＲ法の考えに基づいて設計し、それをもとに調製し、その効果を検出されるアデノウイルスのＥ１ＡとＥ１Ｂ遺伝子の検出限界をもとに評価して得られたものである。すなわち、まず、ヒトアデノウイルス５型のＥ１ＡとＥ１Ｂの遺伝子の塩基配列情報を入手する。次に該遺伝子の部分塩基配列に対して相補的な核酸化合物のうち、オリゴヌクレオチドとして効果が期待される核酸化合物を選択し、選択されたオリゴヌクレオチドを合成した。このようにして得られた該オリゴヌクレオチドが高力価の組み換えウイルス液中に混入したＲＣＡをＰＣＲ法で高感度に検出するかどうかを、in vitro実験系を用いて試験した。そして、高力価の組み換えウイルス液中に混入したＲＣＡをＰＣＲ法でＥ１ＡまたはＥ１Ｂ遺伝子をそれぞれ単独、さらにＥ１ＡとＥ１Ｂ遺伝子を同時に高感度に検出するような塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを取得し、これらを本発明のオリゴヌクレオチドとしたものである。
【００１５】
本発明のオリゴヌクレオチドを設計するためには、先ず、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１ＡまたはＥ１Ｂ遺伝子の塩基配列を入手する。これは論文に記載されている情報として、GenBankなどの遺伝子データベースに蓄積されている情報として、さらには、直接的に塩基配列を解析した結果として入手することができる。次に該遺伝子の部分塩基配列に対して相補的な核酸化合物のうち、オリゴヌクレオチド化合物として効果が期待される核酸化合物を選択する。この方法としては、オリゴヌクレオチドの長さ、ＧＣ含量、Ｔｍ値、オリゴヌクレオチド間の相補性、オリゴヌクレオチド内の二次構造などを考慮する方法（井上順子ら、別冊「実験医学PCR法の最新技術」18-24頁(1995)；向井博之ら、「蛋白質核酸酵素 PCR法最前線」41巻 437-452頁 (1996)）などがある。
【００１６】
ところで、特定の塩基配列の有無をＰＣＲ法により検出するにあたっては、その塩基配列のいかなる部分に対応するプライマーセットを選択するかが重要である。プライマーセットの結合位置によってＰＣＲ法による増幅効率が変化することが知られているからである。そして、この予測は一般に困難である。
【００１７】
そこで、本発明者らは次のような観点からヒトアデノウイルス５型Ｅ１ＡまたはＥ１Ｂ遺伝子をコードする領域の一部を増幅し得るプライマーセットを選択した。
（１）プライマー末端がグアニンもしくはシトシンである２６塩基以上５０塩基以下、特に好ましくは３０塩基以上４０塩基以下からなるプライマーセット；
（２）プライマー中のグアニン、シトシン含量が３０％〜７０％程度でプライマーの全範囲を通じてその偏りがないプライマーセット；
（３）そのプライマーセットを用いたＰＣＲ法による増幅産物が１００ｂｐ以上であるようなプライマーセット；
（４）ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子の増幅産物を電気泳動した場合にそれらの泳動距離の差が明確になる程度に、増幅産物の大きさが異なるプライマーセット：及び
（５）プライマーの５’側はヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子配列と７０％以下の相同性しか有さなくてもよいが、３’側は完全に相同の配列を有するように設定されたプライマーセット：
【００１８】
（II）本発明のオリゴヌクレオチドの具体例
本発明のオリゴヌクレオチドの具体例としては、以下のオリゴヌクレオチドが挙げられる。
本発明の第１のオリゴヌクレオチドは、野生型ヒトアデノウイルス５型のＥ１Ａ遺伝子検出用のフォワード側プライマーであり、配列番号１に記載の塩基配列を有する。
本発明の第２のオリゴヌクレオチドは、野生型ヒトアデノウイルス５型のＥ１Ａ遺伝子検出用のリバース側プライマーであり、配列番号２に記載の塩基配列を有する。
上記した第１及び第２のオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして使用してＰＣＲを行うことにより、上記２種のプライマーで挟まれる領域を増幅することができ、これにより野生型ヒトアデノウイルス５型のＥ１Ａ遺伝子を検出することができる。この場合の増幅産物の大きさは９１９ｂｐである。
【００１９】
本発明の第３のオリゴヌクレオチドは、野生型ヒトアデノウイルス５型のＥ１Ｂ遺伝子検出用のフォワード側プライマーであり、配列番号３に記載の塩基配列を有する。
本発明の第４のオリゴヌクレオチドは、野生型ヒトアデノウイルス５型のＥ１Ｂ遺伝子検出用のリバース側プライマーであり、配列番号４に記載の塩基配列を有する。
上記した第３及び第４のオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして使用してＰＣＲを行うことにより、上記２種のプライマーで挟まれる領域を増幅することができ、これにより野生型ヒトアデノウイルス５型のＥ１Ｂ遺伝子を検出することができる。この場合の増幅産物の大きさは４９３ｂｐ程度である。
【００２０】
本発明では、配列表の配列番号１〜４の何れかに記載の塩基配列だけでなく、それらと実質的に同一の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを使用することができる。配列番号１〜４の何れかに記載の塩基配列またはそれらと実質的に同一の塩基配列は、アデノウイルスのＥ１ＡまたはＥ１Ｂ遺伝子の塩基配列に対して相補的な、もしくは実質的に相補的な塩基配列であり、かつＰＣＲ法においてアデノウイルスのＥ１ＡまたはＥ１Ｂ遺伝子を検出するのに適したオリゴヌクレオチド化合物の塩基配列である。
【００２１】
配列番号１〜４で表される塩基配列またはそれらと実質的に同一の塩基配列としては、具体的には、以下の塩基配列の全てを包含する。
（１）配列表の配列番号１〜４の何れかに記載の塩基配列；
（２）配列表の配列番号１〜４の何れかの塩基配列においてＴをＵに置換した塩基配列；
（３）上記（１）又は（２）に記載の塩基配列と少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列であって、ヒトアデノウイルス５型のＥ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子を特異的に検出できる塩基配列；又は、
（４）配列表の配列番号１〜４の何れかの塩基配列において１〜数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列であって、ヒトアデノウイルス５型のＥ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子を特異的に検出できる塩基配列；
【００２２】
本発明のオリゴヌクレオチドの塩基配列の長さは特に限定されるものではないが、好ましくは２６塩基以上５０塩基以下、特に好ましくは３０塩基以上４０塩基以下である。
【００２３】
本発明のオリゴヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）でもリボ核酸（ＲＮＡ）でもよい。リボ核酸の場合はチミジン残基（Ｔ）をウリジン残基（Ｕ）と読み替えればよい。また合成の際に、任意の位置のＴをＵに変えて合成を行い、ウリジン残基を含むＤＮＡであってもよい。同様に任意のＵをＴに変えたチミジン残基を含むＲＮＡであってもよい。また、オリゴヌクレオチド中に修飾ヌクレオチドがあってもよい。
本発明のオリゴヌクレオチドは、ホスホアミダイト法等で合成することができる。合成にあっては、ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を利用すれば便利である。
【００２４】
（III）オリゴヌクレオチドの評価
本発明のオリゴヌクレオチドの評価実験はin vitro実験系を用いて行うことができる。すなわち、組み換えアデノウイルスに混入するＲＣＡをＰＣＲ法で検出するのに有効と予想される塩基配列を持つオリゴヌクレオチド化合物の適性をin vitro実験系において調べることができる。すなわち、in vitro実験系では密度勾配超遠心法で精製されＲＣＡの検出されない野生型ヒトアデノウイルス５型ＤＮＡ、もしくは野生型ヒトアデノウイルス５型ＤＮＡと組み換えアデノウイルスＤＮＡをあらかじめ試験管内で任意の比率で混合したものを該オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行い、得られた反応産物をアガロースゲル電気泳動により調べることが可能である。
【００２５】
本発明では、驚くべきことに、配列番号１〜４に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲ法にて増幅された増幅産物は、１％アガロースゲル電気泳動後にエチジウムブロマイド染色で解析することが可能なほど大量に得られていることが明らかになった。
【００２６】
本発明では、前述した通りプライマーの長さ、末端の塩基、グアニン及びシトシンの分布、増幅産物の大きさ等に関する選定基準に基づき好適なオリゴヌクレオチドを設計し、これを用いることによって上記した顕著な結果が達成されたのである。これは、増幅される領域の塩基配列特有の性質によるものである。
なお、本発明においては、エチジウムブロマイドやサイバーグリーン染色によらずに、ラジオアイソトープや蛍光プローブを使ったドットブロット法等でも解析は可能であるが、この場合についても増幅産物の量が多いことは解析の容易性の観点から見て有利である。このような解析を行う場合、本発明のオリゴヌクレオチドは標識して使用することもできる。
【００２７】
（IV）標識オリゴヌクレオチド
上記（III）で述べたように、本発明のオリゴヌクレオチドは標識して使用することもできる。このような標識されたオリゴヌクレオチドは全て本発明の範囲内に属する。
【００２８】
本発明の標識オリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号１〜４の何れかに記載の塩基配列またはそれらと実質的に同一の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドに標識を結合したものである。標識物としては放射性物質や酵素、蛍光物質、発光物質、抗原、ハプテン、酵素基質、不溶性担体、ビオチン・アビジン系標識などの公知の標識を用いることができる。標識の仕方は末端標識でも、配列の途中に標識してもよい。また、糖、リン酸基、塩基部分への標識であってもよい。
【００２９】
（Ｖ）検出方法
本発明のオリゴヌクレオチドを用いてヒトアデノウイルス５型Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子を検出する場合、（１）本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして検出する方法、（２）本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＤＮＡポリメラーゼ等により伸長反応を行うことにより検出する方法がある。上記（２）の中の好ましい態様によれば、本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用してＰＣＲを行うことにより、目的遺伝子を検出することができる。
【００３０】
上記（１）の場合、本発明のオリゴヌクレオチドを標識化した標識核酸プローブを試料と混合し、該プローブとヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子とをハイブリダイズさせ、ハイブリッド体の標識を適当な検出法で検出することにより、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子を検出することができる。一方、上記（２）の場合、本発明のオリゴヌクレオチドをそのまま核酸プライマーとするか、または該オリゴヌクレオチドを標識化した標識核酸プライマーを試料と混合し、ＤＮＡポリメラーゼ等によりプライマーを伸長させ（好ましくは、ＰＣＲにより標的配列を増幅させる）、得られたプライマー伸長物（ＰＣＲの場合には、増幅産物）を直接測定するか、標識プローブを用いて測定する。
【００３１】
本発明の好ましい態様によれば、本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行うことにより、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子を特異的に増幅することができる。増幅反応に際しては反応時に放射性物質などの標識の結合したヌクレオチドを取り込ませる方法や、増幅産物を電気泳動により分画して特異なバンドを検出することにより、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子を容易に検出することができる。特に、本発明のオリゴヌクレオチドを用いた場合、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ遺伝子の増幅産物と、Ｅ１Ｂ遺伝子の増幅産物とのサイズの相違により、電気泳動後に泳動距離の差異に基づいて、これら２種の増幅産物を容易に判別することが可能である。また、前述の標識オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いれば増幅産物を直接検出することも可能である。
【００３２】
以下、本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲによるヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子の検出方法について詳細に説明する。
目的のヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子の存在の有無を検知しようとする試料としては、遺伝子治療や基礎研究の分野で使用するための組み換えアデノウイルス調製物が挙げられる。この組み換えウイルスを調製する段階で宿主細胞である２９３細胞のＥ１遺伝子と組み換えアデノウイルスとの間で相同組み換えがおこり、自律増殖性アデノウイルス（ＲＣＡ）が生じる場合があることから、本発明の検出方法によって組み換えアデノウイルスの品質管理を行うことができる。あるいはまた、ヒトアデノウイルスを感染させた動物細胞、感染動物より得られる臓器、血液等、患者より得られる血液、唾液、尿等の生体試料を使用することもできる。この中でも血液を使用すれば感染動物、患者の連続診断を簡便に行うことができる。血液成分中のヒトアデノウイルスの検出には、核酸成分を抽出することが好ましい。血液成分等からの核酸成分の調製法は当業者に公知である。
【００３３】
例えば、溶解緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ―ＨＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ2 、０．４５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．４５％ＮＰ４０、１ｍｇ／ｍｌ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ）に細胞を懸濁し、６５℃で１晩インキュベートし、その後、９８℃で１０分間インキュベートすることによりＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫの失活およびＤＮＡの変性を行う。その溶液をフェノール処理３回、クロロホルム処理２回を行った後、エタノール沈殿法によりＤＮＡを回収することができる。このようにして得られるヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子のＤＮＡを含む試料、及び本発明のプライマーセットを用いてＰＣＲ法を行うことができる。
【００３４】
上記した試料に本発明のオリゴヌクレオチドから成るプライマーセットを加えることによって、試料中の目的とするヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子が存在すれば、該プライマーで挟まれた領域を増幅することができる。ＰＣＲの条件は適宜設定することができ、例えば、TOYOBO KOD Dash DNAポリメラーゼを用いれば、９４℃で３０秒（変性）、６２℃で２秒（アニーリング）、７４℃で３０秒（伸長）を１サイクルとし、全部で３０サイクルとすることも可能である。但し、ここに示した条件は一例に過ぎず、用いる酵素、反応温度、反応時間、サイクル数などは適宜変更することも可能である。
【００３５】
ＰＣＲにより生成した目的遺伝子は電気泳動法、あるいは標識プローブを用いるドットブロットハイブリダイゼーション等により検出することができる。プローブとしては増幅領域内でプローブＤＮＡを設計、作製することができる。
【００３６】
（VI）キット
本発明のオリゴヌクレオチド又はそれを用いたプライマーセットはキットとして供給することにより、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子の検出を簡便に行うことができる。
本発明のヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子検出用キットは、本発明のオリゴヌクレオチド又はその標識オリゴヌクレオチドを含むものである。また、本発明のキット中には、ＰＣＲ用試薬、電気泳動試薬、ＤＮＡ抽出用試薬などを含めておくことにより、試料中のヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子の検出をより迅速・簡便・高感度に行うことができる。なおキット中の試薬は溶液でも凍結乾燥物でも良い。
【００３７】
ＰＣＲ用試薬としては、例えば、Tris-HCl、KCl、MgCl2、各種ｄＮＴＰ、Taq DNAポリメラーゼ、水等が挙げられる。電気泳動用試薬としては、例えば、アガロース又はポリアクリルアミドゲル、ローディング緩衝液、エチジウムブロマイド染色用試薬等が挙げられる。ＤＮＡ抽出用試薬としては、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋなどが挙げられる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されることはない。
【００３８】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。
〔実施例１〕
（１）オリゴヌクレオチド化合物の選択
まず、野生型ヒトアデノウイルス５型の遺伝子の塩基配列を公開の遺伝子データベースであるGenBankから入手した。次にＥ１ＡおよびＥ１Ｂの遺伝子の領域を特定し、それらの領域を特異的に検出し得る領域に対しての相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド化合物を、先に提案した方法を用いて選択した（井上順子ら、別冊「実験医学PCR法の最新技術」18-24頁(1995)；向井博之ら、「蛋白質核酸酵素 PCR法最前線」41巻 437-452頁 (1996)）。すなわち、野生型ヒトアデノウイルス５型のＥ１Ａ遺伝子に対しては配列番号５で表される塩基配列について検索した結果、次の２種の核酸化合物がオリゴヌクレオチド化合物候補として選出された。
E1AF2：CTGATCGAAGAGGTACTGGCTGATAATCTTCCACC （配列番号１）
E1AR2：TTATGGCCTGGGGCGTTTACAGCTCAAGTCCAAAG （配列番号２）
【００３９】
また、野生型ヒトアデノウイルス５型のＥ１Ｂ遺伝子に対しては配列番号６で表される塩基配列について検索した結果、次の２種の核酸化合物がオリゴヌクレオチド化合物候補として選出された。
E1BF1：AGTTTTATAAAGGATAAATGGAGCGAAGAAACCC （配列番号３）
E1BR1：AGTGGTCAGCTGCTCTATGGAATACTTCTGCGCC （配列番号４）
【００４０】
（２）オリゴヌクレオチド化合物の作製
以上により選択した塩基配列をもとにしてインビトロジェン（株）にてオリゴヌクレオチド化合物を受託合成し作製した。
【００４１】
（３）in vitro実験系を用いた評価実験
密度勾配超遠心法で精製された野生型ヒトアデノウイルス５型ＤＮＡ(5.3×100〜5.3×106copies)を鋳型とし、該オリゴヌクレオチドをプライマーとしてKOD Dash DNAポリメラーゼ（東洋紡績（株））でＰＣＲ反応（９４℃３０秒、６２℃２秒、７４℃３０秒、３０サイクル）を行った。
さらにin vitroの再構成実験として、密度勾配超遠心法で精製された野生型ヒトアデノウイルス５型ＤＮＡ(5.3×100〜5.3×106copies)と密度勾配超遠心法で精製されＲＣＡの検出されない組み換えアデノウイルスAxCAEGFPのＤＮＡ(1×108copies)をあらかじめ混合したものを鋳型として上記と同様にPCR反応を行った。
【００４２】
得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで電気泳動し、０．５％エチジウムブロマイドで染色し、ＵＶイルミネーターで検出した。結果を図１及び図２に示す。図１及び図２の結果から分かるように、組み換えアデノウイルスＤＮＡの混入の有無に関わらず、5.3×102copiesの野生型ヒトアデノウイルス５型ＤＮＡの鋳型条件でＥ１ＡまたはＥ１Ｂ遺伝子の検出ができた。これは対照実験に用いたプライマーの結果とほぼ同等の効果を示した。ここで、１ｆ、１ｒは対照実験用プライマーである（Dion, L.D.ら「Journal of Virological Methods」 56巻99-107頁 (1996)）。さらに、配列番号１〜４を同時にPCR反応に用いてアデノウイルスのＥ１ＡとＥ１Ｂ遺伝子を同時に検出することができた。
【００４３】
【本発明の効果】
本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲ法によれば、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子を特異的に検出できる。更にラジオアイソトープを使わずに、アガロースゲル電気泳動によるエチジウムブロマイド染色のみで、高感度にヒトアデノウイルス５型Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子を検出することができる。従って、簡便にかつ短時間にヒトアデノウイルス５型Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子の高感度検出が可能である。
【００４４】
また、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることにより、高力価組み換えアデノウイルスに混入するＲＣＡをＰＣＲ法で簡便にしかも高感度に検出することができる。従って、本発明のオリゴヌクレオチドは、信頼性がある正確なタンパク質発現実験の結果を得るために、感染実験に用いられる組み換えアデノウイルス液のＲＣＡの混入を検査することに利用できる。また、組み換えウイルス作製において多数の組み換え体ウイルス候補のクローンをスクリーニングする場合において実施されるＲＣＡ混入検査に利用することができる。
【００４５】
【配列表】
【００４６】
【００４７】
【００４８】
【００４９】
【００５０】
【００５１】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、野生型ヒトアデノウイルス５型ＤＮＡ(5.3×100〜5.3×106copies)を鋳型として、それぞれのプライマーでＰＣＲ反応を行いＥ１ＡまたはＥ１Ｂ遺伝子を検出した結果を示す。
【図２】図２は、野生型ヒトアデノウイルス５型ＤＮＡ(5.3×100〜5.3×106copies)と組み換えアデノウイルスAxCAEGFP DNA(1×108copies)をあらかじめ混合したものを鋳型として、それぞれのプライマーでＰＣＲ反応を行いＥ１ＡまたはＥ１Ｂ遺伝子を検出した結果を示す。最左レーンに挿入遺伝子検出用のプライマーを用いた結果を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子と相同性を有し、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子を検出するのに有用なオリゴヌクレオチドに関する。本発明のオリゴヌクレオチドは、ウイルス感染診断薬および研究用試薬として有用である。
【０００２】
【従来の技術】
組み換えアデノウイルスはアデノウイルスの自律増殖性を司るＥ１遺伝子領域を欠失した遺伝子導入ベクターであり、遺伝子治療や基礎研究の分野で有用である。この組み換えウイルスを調製する段階で宿主細胞である２９３細胞のＥ１遺伝子と組み換えアデノウイルスとの間で相同組み換えがおこり、自律増殖性アデノウイルス(replication-competent adenovirus ; ＲＣＡ)が生じることが報告されている（Lochmuller, H.ら「Human Gene Therapy」 5巻1485-1491頁 (1994)）。遺伝子治療や基礎研究に用いられる組み換えアデノウイルスに混入したＲＣＡを検出するために、従来ではＥ１遺伝子を持たないＨｅＬａ細胞に組み換えウイルスを感染させて、その細胞毒性を顕微鏡下で観察する方法やその感染ＨｅＬａ細胞から抽出した全ＤＮＡをサザンブロット分析やＰＣＲ法で検出する方法などが行われてきた（Lochmuller, H.ら「Human Gene Therapy」 5巻1485-1491頁 (1994)；佐藤友美ら 「別冊 実験医学 遺伝子導入＆発現解析実験法」27-42頁 (1997)）。
【０００３】
ＨｅＬａ細胞への細胞毒性を観察する方法は検出感度が低く、サザンブロット分析は放射活性物質を用いるので操作手順が繁雑になる。ＰＣＲによる検出法は感度が高く比較的簡便な操作手順で行えるものであるが、検出用オリゴヌクレオチドプライマーの設計の仕方によっては、それら同士が結合したり、ＨｅＬａ細胞のゲノムＤＮＡに結合したりして正確な検出結果が得られない場合が考えられる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
そこでこれらの問題を解決するため、検出方法としてＰＣＲ法を用いる場合、そのオリゴヌクレオチドプライマーは、自身の結合による副生成物を生じず、ＨｅＬａ細胞のゲノムＤＮＡにも結合せず、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子の該当部分に特異的に結合するように設計する必要がある。ここで、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子とはＥ１遺伝子を構成する遺伝子である。従って、本発明は、ＰＣＲ法を用いて簡便にしかも感度の高いＲＣＡ検出を行うことができるオリゴヌクレオチドを提供することを解決すべき課題とした。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討し、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子を検出するのに適したオリゴヌクレオチドプライマーを検索し、該遺伝子の混入をＰＣＲ法を用いて効率的に検出できる塩基配列を設定し、この塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを作製し、それを用いた検出効果をin vitro実験系において確かめることに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
即ち、本発明によれば、配列表の配列番号１〜４の何れかに記載の塩基配列またはそれらと実質的に同一の塩基配列を有する、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子検出用オリゴヌクレオチドが提供される。
【０００７】
好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは、下記の何れかに記載の塩基配列を有する。
（１）配列表の配列番号１〜４の何れかに記載の塩基配列；
（２）配列表の配列番号１〜４の何れかの塩基配列においてＴをＵに置換した塩基配列；
（３）上記（１）又は（２）に記載の塩基配列と少なくとも７０％以上の相同性を有する塩基配列であって、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子を特異的に検出できる塩基配列；又は、
（４）配列表の配列番号１〜４の何れかの塩基配列において１〜数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列であって、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子を特異的に検出できる塩基配列；
【０００８】
本発明の別の側面によれば、配列表の配列番号１に記載の塩基配列またはそれと実質的に同一の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列表の配列番号２に記載の塩基配列またはそれと実質的に同一の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから成るヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ遺伝子検出用プライマーセットが提供される。
【０００９】
本発明のさらに別の側面によれば、配列表の配列番号３に記載の塩基配列またはそれと実質的に同一の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列表の配列番号４に記載の塩基配列またはそれと実質的に同一の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから成るヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ｂ遺伝子検出用プライマーセットが提供される。
【００１０】
好ましくは、実質的に同一の塩基配列とは、下記の何れかに記載の塩基配列である。
（１）当該塩基配列においてＴをＵに置換した塩基配列；
（２）当該塩基配列と少なくとも７０％以上の相同性を有する塩基配列であって、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子を特異的に検出できる塩基配列；又は、
（３）当該塩基配列において１〜数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列であって、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子を特異的に検出できる塩基配列；
【００１１】
本発明のさらに別の側面によれば、本発明のオリゴヌクレオチドあるいはプライマーセットを用いて試料中のヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子を検出することを含む、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子の検出方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、試料中の核酸を鋳型として、本発明のプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより、試料中のヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子を検出することを含む、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子の検出方法が提供される。
【００１２】
本発明のさらに別の側面によれば、本発明のオリゴヌクレオチドあるいはプライマーセットを含む、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子検出用試薬が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、本発明のオリゴヌクレオチドあるいはプライマーセットを含む、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子検出用キットが提供される。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
（Ｉ）本発明のオリゴヌクレオチドの設計
本発明のオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号１〜４の何れかに記載の塩基配列またはそれらと実質的に同一の塩基配列を有するものであり、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子検出のために使用することができる。
ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子とは、ヒトアデノウイルス５型のＥ１Ａ又はＥ１Ｂタンパク質のアミノ酸配列を規定している構造遺伝子を意味する。本発明のオリゴヌクレオチド化合物は、高力価の組み換えウイルス液中に混入したＲＣＡをＰＣＲ法で高感度に検出するものである。
【００１４】
本発明のオリゴヌクレオチドは以下のようにしてＰＣＲ法の考えに基づいて設計し、それをもとに調製し、その効果を検出されるアデノウイルスのＥ１ＡとＥ１Ｂ遺伝子の検出限界をもとに評価して得られたものである。すなわち、まず、ヒトアデノウイルス５型のＥ１ＡとＥ１Ｂの遺伝子の塩基配列情報を入手する。次に該遺伝子の部分塩基配列に対して相補的な核酸化合物のうち、オリゴヌクレオチドとして効果が期待される核酸化合物を選択し、選択されたオリゴヌクレオチドを合成した。このようにして得られた該オリゴヌクレオチドが高力価の組み換えウイルス液中に混入したＲＣＡをＰＣＲ法で高感度に検出するかどうかを、in vitro実験系を用いて試験した。そして、高力価の組み換えウイルス液中に混入したＲＣＡをＰＣＲ法でＥ１ＡまたはＥ１Ｂ遺伝子をそれぞれ単独、さらにＥ１ＡとＥ１Ｂ遺伝子を同時に高感度に検出するような塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを取得し、これらを本発明のオリゴヌクレオチドとしたものである。
【００１５】
本発明のオリゴヌクレオチドを設計するためには、先ず、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１ＡまたはＥ１Ｂ遺伝子の塩基配列を入手する。これは論文に記載されている情報として、GenBankなどの遺伝子データベースに蓄積されている情報として、さらには、直接的に塩基配列を解析した結果として入手することができる。次に該遺伝子の部分塩基配列に対して相補的な核酸化合物のうち、オリゴヌクレオチド化合物として効果が期待される核酸化合物を選択する。この方法としては、オリゴヌクレオチドの長さ、ＧＣ含量、Ｔｍ値、オリゴヌクレオチド間の相補性、オリゴヌクレオチド内の二次構造などを考慮する方法（井上順子ら、別冊「実験医学PCR法の最新技術」18-24頁(1995)；向井博之ら、「蛋白質核酸酵素 PCR法最前線」41巻 437-452頁 (1996)）などがある。
【００１６】
ところで、特定の塩基配列の有無をＰＣＲ法により検出するにあたっては、その塩基配列のいかなる部分に対応するプライマーセットを選択するかが重要である。プライマーセットの結合位置によってＰＣＲ法による増幅効率が変化することが知られているからである。そして、この予測は一般に困難である。
【００１７】
そこで、本発明者らは次のような観点からヒトアデノウイルス５型Ｅ１ＡまたはＥ１Ｂ遺伝子をコードする領域の一部を増幅し得るプライマーセットを選択した。
（１）プライマー末端がグアニンもしくはシトシンである２６塩基以上５０塩基以下、特に好ましくは３０塩基以上４０塩基以下からなるプライマーセット；
（２）プライマー中のグアニン、シトシン含量が３０％〜７０％程度でプライマーの全範囲を通じてその偏りがないプライマーセット；
（３）そのプライマーセットを用いたＰＣＲ法による増幅産物が１００ｂｐ以上であるようなプライマーセット；
（４）ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子の増幅産物を電気泳動した場合にそれらの泳動距離の差が明確になる程度に、増幅産物の大きさが異なるプライマーセット：及び
（５）プライマーの５’側はヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子配列と７０％以下の相同性しか有さなくてもよいが、３’側は完全に相同の配列を有するように設定されたプライマーセット：
【００１８】
（II）本発明のオリゴヌクレオチドの具体例
本発明のオリゴヌクレオチドの具体例としては、以下のオリゴヌクレオチドが挙げられる。
本発明の第１のオリゴヌクレオチドは、野生型ヒトアデノウイルス５型のＥ１Ａ遺伝子検出用のフォワード側プライマーであり、配列番号１に記載の塩基配列を有する。
本発明の第２のオリゴヌクレオチドは、野生型ヒトアデノウイルス５型のＥ１Ａ遺伝子検出用のリバース側プライマーであり、配列番号２に記載の塩基配列を有する。
上記した第１及び第２のオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして使用してＰＣＲを行うことにより、上記２種のプライマーで挟まれる領域を増幅することができ、これにより野生型ヒトアデノウイルス５型のＥ１Ａ遺伝子を検出することができる。この場合の増幅産物の大きさは９１９ｂｐである。
【００１９】
本発明の第３のオリゴヌクレオチドは、野生型ヒトアデノウイルス５型のＥ１Ｂ遺伝子検出用のフォワード側プライマーであり、配列番号３に記載の塩基配列を有する。
本発明の第４のオリゴヌクレオチドは、野生型ヒトアデノウイルス５型のＥ１Ｂ遺伝子検出用のリバース側プライマーであり、配列番号４に記載の塩基配列を有する。
上記した第３及び第４のオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして使用してＰＣＲを行うことにより、上記２種のプライマーで挟まれる領域を増幅することができ、これにより野生型ヒトアデノウイルス５型のＥ１Ｂ遺伝子を検出することができる。この場合の増幅産物の大きさは４９３ｂｐ程度である。
【００２０】
本発明では、配列表の配列番号１〜４の何れかに記載の塩基配列だけでなく、それらと実質的に同一の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを使用することができる。配列番号１〜４の何れかに記載の塩基配列またはそれらと実質的に同一の塩基配列は、アデノウイルスのＥ１ＡまたはＥ１Ｂ遺伝子の塩基配列に対して相補的な、もしくは実質的に相補的な塩基配列であり、かつＰＣＲ法においてアデノウイルスのＥ１ＡまたはＥ１Ｂ遺伝子を検出するのに適したオリゴヌクレオチド化合物の塩基配列である。
【００２１】
配列番号１〜４で表される塩基配列またはそれらと実質的に同一の塩基配列としては、具体的には、以下の塩基配列の全てを包含する。
（１）配列表の配列番号１〜４の何れかに記載の塩基配列；
（２）配列表の配列番号１〜４の何れかの塩基配列においてＴをＵに置換した塩基配列；
（３）上記（１）又は（２）に記載の塩基配列と少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列であって、ヒトアデノウイルス５型のＥ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子を特異的に検出できる塩基配列；又は、
（４）配列表の配列番号１〜４の何れかの塩基配列において１〜数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列であって、ヒトアデノウイルス５型のＥ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子を特異的に検出できる塩基配列；
【００２２】
本発明のオリゴヌクレオチドの塩基配列の長さは特に限定されるものではないが、好ましくは２６塩基以上５０塩基以下、特に好ましくは３０塩基以上４０塩基以下である。
【００２３】
本発明のオリゴヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）でもリボ核酸（ＲＮＡ）でもよい。リボ核酸の場合はチミジン残基（Ｔ）をウリジン残基（Ｕ）と読み替えればよい。また合成の際に、任意の位置のＴをＵに変えて合成を行い、ウリジン残基を含むＤＮＡであってもよい。同様に任意のＵをＴに変えたチミジン残基を含むＲＮＡであってもよい。また、オリゴヌクレオチド中に修飾ヌクレオチドがあってもよい。
本発明のオリゴヌクレオチドは、ホスホアミダイト法等で合成することができる。合成にあっては、ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を利用すれば便利である。
【００２４】
（III）オリゴヌクレオチドの評価
本発明のオリゴヌクレオチドの評価実験はin vitro実験系を用いて行うことができる。すなわち、組み換えアデノウイルスに混入するＲＣＡをＰＣＲ法で検出するのに有効と予想される塩基配列を持つオリゴヌクレオチド化合物の適性をin vitro実験系において調べることができる。すなわち、in vitro実験系では密度勾配超遠心法で精製されＲＣＡの検出されない野生型ヒトアデノウイルス５型ＤＮＡ、もしくは野生型ヒトアデノウイルス５型ＤＮＡと組み換えアデノウイルスＤＮＡをあらかじめ試験管内で任意の比率で混合したものを該オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行い、得られた反応産物をアガロースゲル電気泳動により調べることが可能である。
【００２５】
本発明では、驚くべきことに、配列番号１〜４に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲ法にて増幅された増幅産物は、１％アガロースゲル電気泳動後にエチジウムブロマイド染色で解析することが可能なほど大量に得られていることが明らかになった。
【００２６】
本発明では、前述した通りプライマーの長さ、末端の塩基、グアニン及びシトシンの分布、増幅産物の大きさ等に関する選定基準に基づき好適なオリゴヌクレオチドを設計し、これを用いることによって上記した顕著な結果が達成されたのである。これは、増幅される領域の塩基配列特有の性質によるものである。
なお、本発明においては、エチジウムブロマイドやサイバーグリーン染色によらずに、ラジオアイソトープや蛍光プローブを使ったドットブロット法等でも解析は可能であるが、この場合についても増幅産物の量が多いことは解析の容易性の観点から見て有利である。このような解析を行う場合、本発明のオリゴヌクレオチドは標識して使用することもできる。
【００２７】
（IV）標識オリゴヌクレオチド
上記（III）で述べたように、本発明のオリゴヌクレオチドは標識して使用することもできる。このような標識されたオリゴヌクレオチドは全て本発明の範囲内に属する。
【００２８】
本発明の標識オリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号１〜４の何れかに記載の塩基配列またはそれらと実質的に同一の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドに標識を結合したものである。標識物としては放射性物質や酵素、蛍光物質、発光物質、抗原、ハプテン、酵素基質、不溶性担体、ビオチン・アビジン系標識などの公知の標識を用いることができる。標識の仕方は末端標識でも、配列の途中に標識してもよい。また、糖、リン酸基、塩基部分への標識であってもよい。
【００２９】
（Ｖ）検出方法
本発明のオリゴヌクレオチドを用いてヒトアデノウイルス５型Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子を検出する場合、（１）本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして検出する方法、（２）本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＤＮＡポリメラーゼ等により伸長反応を行うことにより検出する方法がある。上記（２）の中の好ましい態様によれば、本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用してＰＣＲを行うことにより、目的遺伝子を検出することができる。
【００３０】
上記（１）の場合、本発明のオリゴヌクレオチドを標識化した標識核酸プローブを試料と混合し、該プローブとヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子とをハイブリダイズさせ、ハイブリッド体の標識を適当な検出法で検出することにより、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子を検出することができる。一方、上記（２）の場合、本発明のオリゴヌクレオチドをそのまま核酸プライマーとするか、または該オリゴヌクレオチドを標識化した標識核酸プライマーを試料と混合し、ＤＮＡポリメラーゼ等によりプライマーを伸長させ（好ましくは、ＰＣＲにより標的配列を増幅させる）、得られたプライマー伸長物（ＰＣＲの場合には、増幅産物）を直接測定するか、標識プローブを用いて測定する。
【００３１】
本発明の好ましい態様によれば、本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行うことにより、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子を特異的に増幅することができる。増幅反応に際しては反応時に放射性物質などの標識の結合したヌクレオチドを取り込ませる方法や、増幅産物を電気泳動により分画して特異なバンドを検出することにより、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子を容易に検出することができる。特に、本発明のオリゴヌクレオチドを用いた場合、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ遺伝子の増幅産物と、Ｅ１Ｂ遺伝子の増幅産物とのサイズの相違により、電気泳動後に泳動距離の差異に基づいて、これら２種の増幅産物を容易に判別することが可能である。また、前述の標識オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いれば増幅産物を直接検出することも可能である。
【００３２】
以下、本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲによるヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子の検出方法について詳細に説明する。
目的のヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子の存在の有無を検知しようとする試料としては、遺伝子治療や基礎研究の分野で使用するための組み換えアデノウイルス調製物が挙げられる。この組み換えウイルスを調製する段階で宿主細胞である２９３細胞のＥ１遺伝子と組み換えアデノウイルスとの間で相同組み換えがおこり、自律増殖性アデノウイルス（ＲＣＡ）が生じる場合があることから、本発明の検出方法によって組み換えアデノウイルスの品質管理を行うことができる。あるいはまた、ヒトアデノウイルスを感染させた動物細胞、感染動物より得られる臓器、血液等、患者より得られる血液、唾液、尿等の生体試料を使用することもできる。この中でも血液を使用すれば感染動物、患者の連続診断を簡便に行うことができる。血液成分中のヒトアデノウイルスの検出には、核酸成分を抽出することが好ましい。血液成分等からの核酸成分の調製法は当業者に公知である。
【００３３】
例えば、溶解緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ―ＨＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ2 、０．４５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．４５％ＮＰ４０、１ｍｇ／ｍｌ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ）に細胞を懸濁し、６５℃で１晩インキュベートし、その後、９８℃で１０分間インキュベートすることによりＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫの失活およびＤＮＡの変性を行う。その溶液をフェノール処理３回、クロロホルム処理２回を行った後、エタノール沈殿法によりＤＮＡを回収することができる。このようにして得られるヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子のＤＮＡを含む試料、及び本発明のプライマーセットを用いてＰＣＲ法を行うことができる。
【００３４】
上記した試料に本発明のオリゴヌクレオチドから成るプライマーセットを加えることによって、試料中の目的とするヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子が存在すれば、該プライマーで挟まれた領域を増幅することができる。ＰＣＲの条件は適宜設定することができ、例えば、TOYOBO KOD Dash DNAポリメラーゼを用いれば、９４℃で３０秒（変性）、６２℃で２秒（アニーリング）、７４℃で３０秒（伸長）を１サイクルとし、全部で３０サイクルとすることも可能である。但し、ここに示した条件は一例に過ぎず、用いる酵素、反応温度、反応時間、サイクル数などは適宜変更することも可能である。
【００３５】
ＰＣＲにより生成した目的遺伝子は電気泳動法、あるいは標識プローブを用いるドットブロットハイブリダイゼーション等により検出することができる。プローブとしては増幅領域内でプローブＤＮＡを設計、作製することができる。
【００３６】
（VI）キット
本発明のオリゴヌクレオチド又はそれを用いたプライマーセットはキットとして供給することにより、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子の検出を簡便に行うことができる。
本発明のヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子検出用キットは、本発明のオリゴヌクレオチド又はその標識オリゴヌクレオチドを含むものである。また、本発明のキット中には、ＰＣＲ用試薬、電気泳動試薬、ＤＮＡ抽出用試薬などを含めておくことにより、試料中のヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子の検出をより迅速・簡便・高感度に行うことができる。なおキット中の試薬は溶液でも凍結乾燥物でも良い。
【００３７】
ＰＣＲ用試薬としては、例えば、Tris-HCl、KCl、MgCl2、各種ｄＮＴＰ、Taq DNAポリメラーゼ、水等が挙げられる。電気泳動用試薬としては、例えば、アガロース又はポリアクリルアミドゲル、ローディング緩衝液、エチジウムブロマイド染色用試薬等が挙げられる。ＤＮＡ抽出用試薬としては、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋなどが挙げられる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されることはない。
【００３８】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。
〔実施例１〕
（１）オリゴヌクレオチド化合物の選択
まず、野生型ヒトアデノウイルス５型の遺伝子の塩基配列を公開の遺伝子データベースであるGenBankから入手した。次にＥ１ＡおよびＥ１Ｂの遺伝子の領域を特定し、それらの領域を特異的に検出し得る領域に対しての相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド化合物を、先に提案した方法を用いて選択した（井上順子ら、別冊「実験医学PCR法の最新技術」18-24頁(1995)；向井博之ら、「蛋白質核酸酵素 PCR法最前線」41巻 437-452頁 (1996)）。すなわち、野生型ヒトアデノウイルス５型のＥ１Ａ遺伝子に対しては配列番号５で表される塩基配列について検索した結果、次の２種の核酸化合物がオリゴヌクレオチド化合物候補として選出された。
E1AF2：CTGATCGAAGAGGTACTGGCTGATAATCTTCCACC （配列番号１）
E1AR2：TTATGGCCTGGGGCGTTTACAGCTCAAGTCCAAAG （配列番号２）
【００３９】
また、野生型ヒトアデノウイルス５型のＥ１Ｂ遺伝子に対しては配列番号６で表される塩基配列について検索した結果、次の２種の核酸化合物がオリゴヌクレオチド化合物候補として選出された。
E1BF1：AGTTTTATAAAGGATAAATGGAGCGAAGAAACCC （配列番号３）
E1BR1：AGTGGTCAGCTGCTCTATGGAATACTTCTGCGCC （配列番号４）
【００４０】
（２）オリゴヌクレオチド化合物の作製
以上により選択した塩基配列をもとにしてインビトロジェン（株）にてオリゴヌクレオチド化合物を受託合成し作製した。
【００４１】
（３）in vitro実験系を用いた評価実験
密度勾配超遠心法で精製された野生型ヒトアデノウイルス５型ＤＮＡ(5.3×100〜5.3×106copies)を鋳型とし、該オリゴヌクレオチドをプライマーとしてKOD Dash DNAポリメラーゼ（東洋紡績（株））でＰＣＲ反応（９４℃３０秒、６２℃２秒、７４℃３０秒、３０サイクル）を行った。
さらにin vitroの再構成実験として、密度勾配超遠心法で精製された野生型ヒトアデノウイルス５型ＤＮＡ(5.3×100〜5.3×106copies)と密度勾配超遠心法で精製されＲＣＡの検出されない組み換えアデノウイルスAxCAEGFPのＤＮＡ(1×108copies)をあらかじめ混合したものを鋳型として上記と同様にPCR反応を行った。
【００４２】
得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで電気泳動し、０．５％エチジウムブロマイドで染色し、ＵＶイルミネーターで検出した。結果を図１及び図２に示す。図１及び図２の結果から分かるように、組み換えアデノウイルスＤＮＡの混入の有無に関わらず、5.3×102copiesの野生型ヒトアデノウイルス５型ＤＮＡの鋳型条件でＥ１ＡまたはＥ１Ｂ遺伝子の検出ができた。これは対照実験に用いたプライマーの結果とほぼ同等の効果を示した。ここで、１ｆ、１ｒは対照実験用プライマーである（Dion, L.D.ら「Journal of Virological Methods」 56巻99-107頁 (1996)）。さらに、配列番号１〜４を同時にPCR反応に用いてアデノウイルスのＥ１ＡとＥ１Ｂ遺伝子を同時に検出することができた。
【００４３】
【本発明の効果】
本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲ法によれば、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子を特異的に検出できる。更にラジオアイソトープを使わずに、アガロースゲル電気泳動によるエチジウムブロマイド染色のみで、高感度にヒトアデノウイルス５型Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子を検出することができる。従って、簡便にかつ短時間にヒトアデノウイルス５型Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子の高感度検出が可能である。
【００４４】
また、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることにより、高力価組み換えアデノウイルスに混入するＲＣＡをＰＣＲ法で簡便にしかも高感度に検出することができる。従って、本発明のオリゴヌクレオチドは、信頼性がある正確なタンパク質発現実験の結果を得るために、感染実験に用いられる組み換えアデノウイルス液のＲＣＡの混入を検査することに利用できる。また、組み換えウイルス作製において多数の組み換え体ウイルス候補のクローンをスクリーニングする場合において実施されるＲＣＡ混入検査に利用することができる。
【００４５】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、野生型ヒトアデノウイルス５型ＤＮＡ(5.3×100〜5.3×106copies)を鋳型として、それぞれのプライマーでＰＣＲ反応を行いＥ１ＡまたはＥ１Ｂ遺伝子を検出した結果を示す。
【図２】図２は、野生型ヒトアデノウイルス５型ＤＮＡ(5.3×100〜5.3×106copies)と組み換えアデノウイルスAxCAEGFP DNA(1×108copies)をあらかじめ混合したものを鋳型として、それぞれのプライマーでＰＣＲ反応を行いＥ１ＡまたはＥ１Ｂ遺伝子を検出した結果を示す。最左レーンに挿入遺伝子検出用のプライマーを用いた結果を示す。
Claims (3)
- （１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドから成るヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ遺伝子検出用プライマーセット；並びに
（２）配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び配列表の配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドから成るヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ｂ遺伝子検出用プライマーセット：
から成るヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子検出用キット。 - 請求項１に記載のキットを用いて試料中のヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子を検出することを含む、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子の検出方法。
- 試料中の核酸を鋳型として、請求項１に記載のキットを用いてＰＣＲを行うことにより、試料中のヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子を検出することを含む、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子の検出方法。
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