KR102596123B1 - 가금 아데노바이러스 혈청형 판별을 위한 멀티플렉스 pcr용 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents
가금 아데노바이러스 혈청형 판별을 위한 멀티플렉스 pcr용 프라이머 세트 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 가금 아데노바이러스(FAdV) 혈청형 판별을 위한 멀티플렉스용 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 FAdV-4, FAdV-8b 및 FAdV-11형을 동시에 감별 검출할 수 있는 3개의 프라이머 세트로 이루어진 멀티플렉스 PCR용 프라이머 세트 조성물, 상기 조성물을 포함하는 FAdV 혈청형 판별용 키트 및 상기 조성물을 이용한 FAdV 혈청형 판별 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 가금 아데노바이러스 혈청형(FAdV-4, FAdV-8b 및 FAdV-11) 판별을 위한 멀티플렉스 PCR용 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.
가금 아데노바이러스(fowl adenovirus, FAdV)는 가금류에서 adenoviral gizzard erosion (AGE), hepatitis-hydropericardium syndrome (HHS) 또는 inclusion body hepatitis (IBH)를 유발하는 바이러스이다. FAdV는 수직 및 수평 전파가 가능하며 특히, 분변-구강 경로를 통해 쉽게 전파된다. 감염 후 발생하는 질환은 혈청형(serotype)에 따라 다르며 AGE의 경우 FAdV-1, HHS는 FAdV-4, IBH는 FAdV-2, 8, 11과 관련이 있다. 국내에서는 2017년 이후 FAdV-4, 8b 및 11형이 발생하고 있다.
여러 병원체를 구분하기 위해 다양한 핵산 기반 기술이 개발되었고 특히, 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)은 적은 양의 시료를 이용하고 실험 과정이 간단하며 빠른시간 내에 결과 확인이 가능하기 때문에 가장 많이 사용되고 있는 방법이다. 멀티플렉스(multiplex) PCR이란 하나의 PCR 반응에서 여러 표적 서열을 검출하는 방법을 말한다. 멀티플렉스 PCR은 표적 서열을 구분하기 위해서 여러 세트의 프라이머를 사용하며 서로 다른 DNA 서열에 대한 다양한 크기의 증폭산물(amplicon)을 생성한다. 최근에는 conventional PCR 보다 더 빠르게 병원체를 검출하거나 핵산의 정확한 정량화를 위해서 아가로스 겔을 사용하지 않고 형광 프로브(probe)를 활용한 Real-time PCR 방법을 사용하고 있다. 그러나, 멀티플렉스 Real-time PCR의 세팅은 conventional multiplex PCR에 비하여 고려할 사항이 많고 까다롭다. 여러 종류의 프라이머 뿐 아니라 프로브까지 첨가해야 해서, 이로 인해 증가될 수 있는 프라이머-프로브 다이머(dimer)나 프로브-프로브 다이머, 비특이적 증폭을 고려해야 한다. 또한, 형광 간섭을 피하기 위해 형광 방출 스펙트럼이 겹치지 않으면서 보유하고 있는 기기가 검출가능한 형광 스펙트럼을 가진 형광 염료(dye)를 사용해야 한다.
본 발명에서는 FAdV-4, 8b, 11형의 양/음성을 아가로스 겔 상에서 서로 다른 크기의 밴드를 통해 판단할 수 있는 conventional multiplex PCR을 개발하였다.
한편, 한국공개특허 제2020-0060178호에는 '조류인플루엔자, 뉴캐슬병 및 닭전염성 기관지염 바이러스를 검출하기 위한 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 조류인플루엔자, 뉴캐슬병 및 닭전염성 기관지염 바이러스의 검출 방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2022-0112394호에는 '전염성후두기관염 바이러스, 계두 바이러스 및 세망내피증 바이러스의 동시 다중 PCR 검출용 프라이머 및 그 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 '가금 아데노바이러스 혈청형 판별을 위한 멀티플렉스 PCR용 프라이머 세트 및 이의 용도'에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 가금 아데노바이러스(FAdV)의 세 가지 혈청형(FAdV-4, -8b 및 -11)을 감별 검출할 수 있는 conventional multiplex PCR 시스템을 구축하기 위해, 각 혈청형별 특이 프라이머 세트를 디자인한 후 멀티플렉스 PCR을 수행하여 프라이머 세트간 간섭 및 비특이적 증폭반응이 없음을 확인하였으며, 프라이머 세트간 농도 비율을 조정하여 멀티플렉스 PCR 수행 시 세 가지 혈청형 모두에 높은 민감도를 보이는 조건을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 1; 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 2; 및 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 3;을 포함하는, 가금 아데노바이러스(fowl adenovirus) 혈청형 판별을 위한 멀티플렉스(multiplex) PCR용 프라이머 세트 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 멀티플렉스 PCR용 프라이머 세트 조성물 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 가금 아데노바이러스 혈청형 판별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 가금 아데노바이러스 감염 의심 개체의 분리된 생물학적 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리한 게놈 DNA를 주형으로 하고 본 발명에 따른 멀티플렉스 PCR용 프라이머 세트 조성물을 이용하여 멀티플렉스 PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 가금 아데노바이러스 혈청형 판별 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 가금 아데노바이러스(FAdV) 혈청형 판별을 위한 멀티플렉스(multiplex) PCR용 프라이머 세트 및 이를 이용한 가금 아데노바이러스 혈청형 판별 방법을 이용하면, 비특이적 증폭반응을 배제한 양/음성 판단이 쉽고, 형광 프로브를 사용하는 qPCR보다 PCR 세팅과 실험 방법의 수정이 편하다는 장점이 있다. 또한, 본 발명에서 세팅된 조건을 이용하면 미지의 시료로부터 FAdV-4, FAdV-8b 및 FAdV-11형을 판별할 수 있으므로, 연구실 또는 필드에서 FAdV 감염의 간이진단, FAdV 백신 생산 시 각 seed 간 교차오염의 확인 등에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 가금 아데노바이러스(FAdV) 혈청형별 consensus 서열을 정렬한 결과로, 각 혈청형 특이 프라이머의 위치를 보여준다.
도 2는 FAdV-4, -8b, -11의 세포 배양액을 이용하여 단일(singleplex) PCR을 수행한 결과로, 각 프라이머 세트별 결합(annealing) 온도에 따른 PCR 결과를 보여준다.
도 3은 FAdV-4, -8b 또는 -11 특이 프라이머 세트의 비특이적 증폭반응 여부를 확인한 것으로, 각 혈청형별 프라이머 세트를 다른 혈청형의 게노믹 DNA와 함께 PCR을 진행한 결과를 보여준다.
도 4는 FAdV-4, -8b, -11 특이 프라이머 세트를 모두 혼합한 멀티플렉스(multiplex) 프라이머 세트 조성물을 이용하여 다양한 주형 시료(lane 1 내지 8)와 함께 PCR을 수행한 결과를 보여준다.
도 5는 FAdV-4, -8b, -11 특이 프라이머 세트의 혼합 농도를 조정한 멀티플렉스 프라이머 세트 조성물의 검출 한계를 확인한 결과이다. Primer Working Stock 1 내지 4는 표 10에 개시되어 있다.
도 6은 FAdV-4, -8b, -11의 멀티플렉스 프라이머 세트 조성물(Primer Working Stock 4)을 이용하여 다양한 실험 검체로부터 추출한 게노믹 DNA로 멀티플렉스 PCR을 수행한 결과이다.
도 2는 FAdV-4, -8b, -11의 세포 배양액을 이용하여 단일(singleplex) PCR을 수행한 결과로, 각 프라이머 세트별 결합(annealing) 온도에 따른 PCR 결과를 보여준다.
도 3은 FAdV-4, -8b 또는 -11 특이 프라이머 세트의 비특이적 증폭반응 여부를 확인한 것으로, 각 혈청형별 프라이머 세트를 다른 혈청형의 게노믹 DNA와 함께 PCR을 진행한 결과를 보여준다.
도 4는 FAdV-4, -8b, -11 특이 프라이머 세트를 모두 혼합한 멀티플렉스(multiplex) 프라이머 세트 조성물을 이용하여 다양한 주형 시료(lane 1 내지 8)와 함께 PCR을 수행한 결과를 보여준다.
도 5는 FAdV-4, -8b, -11 특이 프라이머 세트의 혼합 농도를 조정한 멀티플렉스 프라이머 세트 조성물의 검출 한계를 확인한 결과이다. Primer Working Stock 1 내지 4는 표 10에 개시되어 있다.
도 6은 FAdV-4, -8b, -11의 멀티플렉스 프라이머 세트 조성물(Primer Working Stock 4)을 이용하여 다양한 실험 검체로부터 추출한 게노믹 DNA로 멀티플렉스 PCR을 수행한 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 1; 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 2; 및 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 3;을 포함하는, 가금 아데노바이러스(fowl adenovirus, FAdV) 혈청형 판별을 위한 멀티플렉스(multiplex) PCR용 프라이머 세트 조성물을 제공한다.
FAdV는 아데노바이러스과(Adenoviridae)에 속하며 유전체는 분절이 없는 선형의 두 가닥(double-stranded) DNA로 이루어져 있다. 그룹 1에 속하는 가금 아데노바이러스에는 총 12개의 혈청형이 존재하는데 이들 혈청형들 간에는 병원성이 매우 다양하게 나타난다.
본 발명에 따른 멀티플렉스 PCR용 프라이머 세트 조성물에 있어서, 상기 가금 아데노바이러스 혈청형은 FAdV-4, FAdV-8b 또는 FAdV-11형일 수 있다.
본 발명의 상기 멀티플렉스 PCR용 프라이머 세트 조성물은 3개의 프라이머 세트가 조합된 것으로, 프라이머 세트 1 내지 3은 각각 FAdV-4, FAdV-8b 및 FAdV-11형을 증폭할 수 있는 프라이머 세트이다.
본 발명에 있어서 용어, "멀티플렉스 PCR (multiplex polymerase chain reaction)"은, 하나의 주형 DNA에 대한 한 개의 유전자을 증폭하는 단일 PCR과 달리 여러 개의 유전자를 동시에 증폭하는 PCR 기법을 의미한다. 멀티플렉스 PCR에서는 단일 PCR 혼합물에 여러 프라이머 세트가 포함되는데, 이때 서로 다른 DNA 서열에 대해서는 각각에 특이적인 증폭 산물의 크기 범위를 나타내어 크기가 서로 중첩되지 않도록 하는 것이 바람직하다. 멀티플렉스 PCR 기법에서는 여러 종류의 다른 프라이머 세트를 단일 튜브에 넣고 반응시키기 때문에, 프라이머 간에 간섭(interference) 및 억제(inhibition)가 발생할 수 있으므로, 멀티플렉스 PCR에 적용할 때에는 증폭하고자 하는 유전자들에 대한 프라이머들의 선정이 중요하다. 또한 포함되는 여러 프라이머 세트마다 적합한 결합(annealing) 온도가 다를 수 있으므로, 멀티플렉스 PCR 적용 시에는 단일 PCR 반응에서 포함되는 PCR 프라이머 세트 모두가 효과적으로 결합할 수 있도록 멀티플렉스 PCR에 적합한 결합 온도의 최적화가 요구된다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자 하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 15 내지 30 bp의 길이로 사용한다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적이어야만 한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 멀티플렉스 PCR용 프라이머 세트 조성물 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 가금 아데노바이러스(fowl adenovirus) 혈청형 판별용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에서, 멀티플렉스 PCR용 프라이머 세트 및 가금 아데노바이러스 혈청형은 전술한 것과 같다.
본 발명의 키트는 바람직하게는 멀티플렉스 PCR용 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 완충용액 등을 포함할 수 있으며, DMSO (dimethyl sulfoxide), 글리세롤, 베타인(betaine), 포름아미드(formamide), 염화마그네슘 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 또한 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 가금 아데노바이러스 혈청형 판별용 키트에 있어서, 상기 멀티플렉스 PCR용 프라이머 세트 조성물은 바람직하게는 프라이머 세트 1 내지 3이 차례대로 몰농도 기준 0.5~1.5 : 0.5~1.5 : 1.5~2.5의 비율, 바람직하게는 1 : 1 : 2의 비율로 혼합된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 가금 아데노바이러스(fowl adenovirus) 감염 의심 개체의 분리된 생물학적 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리한 게놈 DNA를 주형으로 하고 본 발명에 따른 멀티플렉스 PCR용 프라이머 세트 조성물을 이용하여 멀티플렉스 PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 가금 아데노바이러스 혈청형 판별 방법을 제공한다.
본 발명의 가금 아데노바이러스 혈청형 판별 방법에 있어서, 상기 멀티플렉스 PCR용 프라이머 세트 및 가금 아데노바이러스 혈청형은 전술한 것과 같다.
본 발명에 따른 판별 방법에 있어서, 상기 가금 아데노바이러스 감염 의심 개체는 바람직하게는 닭일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 판별 방법에 있어서, 상기 게놈 DNA 분리 방법은 당업계에 알려진 통상적인 방법을 통하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 닭 개체의 분리된 생물학적 시료 즉, 닭의 혈액, 각종 체액, 장기 유제액 또는 스왑(swab) 시료 등으로부터 DNA를 직접적으로 정제하거나 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 특정한 영역을 특이적으로 증폭하고 이를 분리함으로써 이루어 질 수 있다. 포유동물로부터 체액 및 조직, 생검 등을 획득하는 방법은 당업계에 알려진 통상의 방법을 이용할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 상기 증폭 산물의 확인 즉, 검출은 겔 전기영동, 모세관 전기영동, DNA 칩, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5' 말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 사용 항원 및 검체
본 발명에 사용된 항원의 정보는 다음과 같다.
- FAdV-4 : Strain ADL19 0734
- FAdV-8b : Strain ADL19 0167
- FAdV-11 : Strain ADL18 2047
또한, 본 발명에서 사용한 검체의 정보는 표 1에 나타내었다.
2. 시약 및 기기
본 발명에서 사용한 시약은 하기 표 2와 같으며, MagMAX™ Express (Applied Biosystems™ Cat. 4387987), Nanodrop™ 2000 spectrophotometer (Thermofisher scientific, Cat. ND-2000), SimpliAmp™ Thermal Cycler (Applied Biosystems™, Cat. A47394), Mupid-2-plus (Mupid, Cat. AD110) 및 Agarose gel imaging system (Davinch-k, Cat. MC-2000)을 사용하였다.
3. Conventional multiplex PCR을 위한 혈청형별 프라이머 디자인
각 혈청형(serotype) 특이 프라이머를 디자인하기 위하여 NCBI에 게시된 FAdV-4, -8b 또는 -11의 Hexon gene partial cds 또는 complete cds sequence를 가지고 MEGA 11 소프트웨어를 사용하여 다중 서열 정렬을 진행하였다(ClustalW algorithm 사용). 정렬에 사용된 NCBI 서열정보는 하기 표 3 내지 5에 정리하였다(FAdV-4 45개, FAdV-8b 44개, FAdV-11 36개). 각 혈청형의 consensus sequence를 다시 한번 정렬하여 혈청형간 차이가 많이 나는 부위를 확인하였다. 프라이머 디자인은 일반적으로 따르는 지침 사항에 되도록 맞추되(GC% 50-60, Tm 50-65℃, 프라이머 한쪽 말단은 G 또는 C 염기를 포함할 것, G 또는 C 3반복 미만으로 유지) 각 혈청형간 약 100, 200, 400 bp로 증폭산물(amplicon)의 크기가 차이나며 혈청형간 서열의 차이가 확연한 부위를 우선으로 선정하여 프라이머를 디자인하였다.
4. conventional PCR
MagMAX™ Viral/Pathogen Nucleic Acid Isolation 키트를 이용하여 각 혈청형별 세포 배양액 또는 검체로부터 바이러스 게노믹 DNA를 추출하여 주형으로 사용하였다. 하기 표 6과 같이 PCR 반응물을 조성하고, 표 7의 조건으로 PCR을 진행한 후 1.5% 아가로스/TAE 겔에서 전기영동하여 결과를 확인하였다.
| Reagent | Volume (㎕) |
| Taq polymerase (5 U/㎕) | 0.1 |
| 10X buffer | 2 |
| dNTP mix (2.5 mM each) | 1.6 |
| Primer (X μM each) | 1 |
| Template DNA | 2 |
| DEPC-DW | 13.3 |
| Total | 20 |
| ※ X : 2.5, 5, 10 | |
| Step | Temperature(℃) | Time | |
| Hold | Denaturation | 98 | 5 min |
| 35 cycle | Denaturation | 98 | 30 sec |
| Annealing | Y | 30 sec | |
| Extension | 72 | 30 sec | |
| Hold | Final Extension | 72 | 10 min |
| ※ Y : 56, 58, 60, 62 or 64 | |||
5. TOPO-TA 클로닝을 통한 플라스미드 제작 및 추출
Multiplexing의 검출 한계를 결정하기 위하여 플라스미드를 제작하였다. 먼저 각각의 혈청형별 게노믹 DNA를 가지고 PCR을 진행하였다. 아가로스 겔에서 밴드를 확인하고 겔 elution을 통해 표적 밴드만 추출하여 클로닝에 사용하였다. 6X buffer 1 ㎕, Vector 1 ㎕, purified-PCR product 4 ㎕를 PCR 튜브에서 섞어준 후, 25℃에서 10분간 반응시켰다. 반응물은 E. coli DH5α 형질전환에 사용되었다. 형질전환 클론을 콜로니 PCR을 통해 검증하고, 콜로니 PCR 양성 클론을 시퀀싱 분석 의뢰하여 서열이 정확하게 삽입된 각 혈청형 당 한 개의 클론을 결정하였다(pFAdV-4_209, pFAdV-8b_103, pFAdV-11_426). 결정된 클론은 40 ㎍/㎖ Ampicilin-terrific broth에서 밤새 배양한 후 NucleoBond Xtra Midi 키트를 이용하여 플라스미드를 정제하였다. 정제된 플라스미드는 PCR과 제한효소 절단, nanodrop, 아가로스 겔 로딩으로 검증되었다. 상기 pFAdV-4_209, pFAdV-8b_103 및 pFAdV-11_426 플라스미드에 삽입된 서열은 각각 ADL19 0734 Hexon의 일부(서열번호 7), ADL19 0167 Hexon의 일부(서열번호 8) 및 ADL18 2047 Hexon의 일부(서열번호 9)이다.
6. 플라스미드 copy 수 계산 및 희석액 제조
플라스미드의 copy 수는 아래 수식으로부터 결정되었다.
각 플라스미드에 대한 계산된 1 ng당 copy 수 및 1011 copies/2 ㎕ 용액의 제조방법은 표 8과 같다. 플라스미드 1 ㎕ 당 copy 수를 결정하고 계산된 값에 맞게 희석하여 각 혈청형 3가지 플라스미드가 모두 포함된 1011 copies/2 ㎕ 용액을 제작하였다. 이 용액을 가지고 10진 희석을 진행하여(5 ㎕ pooled plasmid sol. + 45 ㎕ DEPC-DW) 1010 ~ 100 copy/2 ㎕ 용액을 각각 제작하였다. 플라스미드 희석액은 PCR 검출 한계를 결정하는데 사용되었다.
7. 모의 시험
실제 검체에서도 문제 없이 PCR이 진행되는지 확인하기 위해 세포배양액, 간 유제액, 항문 swab의 양성 검체 및 음성 검체를 이용한 모의 시험을 진행하였다. FAdV-4 및 -8b의 각 정방향 및 역방향 프라이머는 반응당 총 농도 0.125 μM이 되도록 하였으며, FAdV-11의 정방향 및 역방향 프라이머는 반응당 총 농도 0.25 μM이 되도록 하였다. 결합 온도는 60℃로 설정하였다.
실시예 1. Conventional multiplex PCR을 위한 혈청형별 프라이머 디자인
각 혈청형의 consensus sequence를 정렬하여 서열 차이가 많이 나는 부위를 확인하였다(도 1). 프라이머 디자인은 일반적으로 따르는 지침 사항에 되도록 맞추되 각 혈청형간 약 100, 200, 400 bp로 증폭 산물의 크기가 차이나며 혈청형간 서열의 차이가 확연한 부위를 선정하여 프라이머를 디자인하였다. 각 프라이머의 서열 및 특징은 표 9에 나타냈다.
| Primer name (target size) |
Sequence (5' → 3') | GC% | Tm(℃) | |
| FAdV-4_cmPCR (209 bp) |
Forward | GGCAGAACGTGTCCGCCT (서열번호 1) | 66.67 | 59.08 |
| Reverse | ACCGTAAGCGTAATTGTACTGA (서열번호 2) | 40.91 | 55.04 | |
| FAdV-8b_cmPCR (103 bp) |
Forward | GGATCGAGGACGATGAAAAC (서열번호 3) | 50.00 | 53.40 |
| Reverse | GCGATTGCCCCAGCTGTTGC (서열번호 4) | 65.00 | 62.24 | |
| FAdV-11_cmPCR (426 bp) |
Forward | GTCATCACGGGTCAGATGACA (서열번호 5) | 52.38 | 57.02 |
| Reverse | CGGCCTGTTTGCCTTCATGA (서열번호 6) | 55.00 | 58.21 | |
실시예 2. 혈청형별 프라이머 세트의 반응성 검증-Singleplex PCR
FAdV-4, -8b, -11의 세포 배양액을 가지고 게노믹 DNA (gDNA)를 추출하여 이를 주형으로 singleplex PCR을 진행하였다. 이때, 비특이적(non-specific) 반응이 생기지 않는 결합(annealing) 온도를 결정하기 위해서 56, 58, 60, 62, 64℃의 서로 다른 결합 온도를 설정하여 PCR을 진행하였다(도 2). 프라이머는 각각 총 농도 0.5 μM로 사용하였다. 그 결과 56℃부터 64℃의 온도 모두에서 비특이적 결합이 확인되지 않았고 FAdV-4형의 64℃를 제외하고 대부분 비슷한 수준의 밴드 밝기를 확인할 수 있었다. 따라서 56~62℃ 사이에서 결합 온도를 결정할 수 있다고 결론지었으며 본 발명에서는 중간값인 60℃로 실험을 진행하였다.
서로 다른 혈청형 간 비특이적 PCR 증폭이 일어나는지 확인하기 위해 각 혈청형 별 프라이머에 각 혈청형의 gDNA를 가지고 PCR을 진행하였다. 프라이머는 총 농도 0.5 μM로 사용하였다. 분석 결과, 3가지 프라이머 세트 모두 다른 혈청형에서 비특이적 증폭은 확인되지 않았다(도 3).
실시예 3. Multiplex PCR
Multiplex PCR을 진행하였을 때 프라이머 간 간섭에 의해 PCR이 잘 되지 않거나 예상되지 않은 비특이적 PCR 증폭을 보일 수 있다. 따라서 먼저 multiplex PCR이 문제없이 진행되는지 확인하기 위해 각 혈청형 별 gDNA를 단일 또는 1:1, 1:1:1 비율로 섞고, 3가지 프라이머 세트를 모두 총 농도 0.5 μM이 되도록 첨가하여 PCR을 진행하였다(도 4). 그 결과, 특별한 비특이적 증폭은 확인되지 않았고 첨가해 준 gDNA별 예상된 크기의 밴드만 검출되었다. 이 결과를 통해 3가지 프라이머 세트 모두 FAdV-4, -8b 및 -11형을 감별할 수 있는 multiplex PCR에 사용할 수 있을 것으로 판단하였다.
실시예 4. Multiplex PCR의 검출 한계 결정 및 민감도 조정
Multiplex용 Primer working stock은 1개 튜브에 6가지 프라이머를 각 농도에 맞추어 DEPC-DW에 희석하여 제조하였고(표 10), 반응 당 1 ㎕를 사용하였다. 검출 한계 결정에 사용하기 위한 플라스미드는 TOPO-TA 클로닝을 통해 제작하였다. 제작된 플라스미드는 nanodrop을 이용하여 농도 및 순도를 체크하고 아가로스 겔 로딩 및 PCR로 검증하였다. 플라스미드는 농도에 따라 copy 수를 계산하여 1011 copies/2 ㎕ (반응에 2 ㎕의 주형을 사용)로 DW에 희석되었다(표 8). 플라스미드는 10진 희석으로 100 copy/2 ㎕까지 희석되었으며 검출 한계는 1010 ~ 100 copy 사이를 측정하였다. 여러 농도의 프라이머 및 플라스미드를 실험에 사용해 본 결과 FAdV-4 및 FAdV-8b 프라이머 세트를 총 농도 0.125 μM로, FAdV-11 프라이머 세트를 총 농도 0.25 μM로 사용하였을 때, 3가지 혈청형 모두에 대해 민감도가 가장 높고 다이머 형성이 적은 것을 확인하였으며, 이 조건(Primer working stock 4)의 검출한계는 3가지 혈청형 모두 103 copy로 확인되었다(도 5).
실시예 5. 실험실 검체를 이용한 FAdV 혈청형 판별 검증
실제 검체에서 문제 없이 multiplex PCR이 진행되는지 확인하기 위해 양성 검체 및 음성 검체를 이용한 모의 시험을 진행하였다. 사용된 검체 정보는 표 1과 같다. 프라이머는 Multiplex용 Primer working stock 4번을 이용하였으며(표 10 참고), 결합 온도는 60℃로 설정하였다. 그 결과 도 6에서와 같이 본 발명의 multiplex PCR용 프라이머 세트는 혈청형간 간섭없이 FAdV-4, -8b 및 -11을 정확하게 판별할 수 있음을 확인할 수 있었다.
Claims (7)
- 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 1; 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 2; 및 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 3;을 포함하는, 가금 아데노바이러스(fowl adenovirus, FAdV) 4, 8b 또는 11형 판별을 위한 멀티플렉스(multiplex) PCR용 프라이머 세트 조성물로서,
상기 프라이머 세트 1 내지 3이 차례대로 몰농도 기준 0.5~1.5 : 0.5~1.5 : 1.5~2.5의 비율로 혼합된 것을 특징으로 하는 멀티플렉스 PCR용 프라이머 세트 조성물. - 삭제
- 제1항에 따른 멀티플렉스 PCR용 프라이머 세트 조성물 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 가금 아데노바이러스(fowl adenovirus) 4, 8b 또는 11형 판별용 키트.
- 제3항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 완충용액을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
- 가금 아데노바이러스(fowl adenovirus) 감염 의심 개체의 분리된 생물학적 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리한 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항에 따른 멀티플렉스 PCR용 프라이머 세트 조성물을 이용하여 멀티플렉스 PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 가금 아데노바이러스 4, 8b 또는 11형 판별 방법. - 삭제
- 제5항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 겔 전기영동, 모세관 전기영동, DNA 칩, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 판별 방법.
Priority Applications (1)
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2023
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