KR101334072B1

KR101334072B1 - 핵산 정량 방법 및 키트

Info

Publication number: KR101334072B1
Application number: KR1020100118387A
Authority: KR
Inventors: 양인철; 강민정; 유한나; 박상열; 김숙경
Original assignee: 한국표준과학연구원
Priority date: 2010-11-25
Filing date: 2010-11-25
Publication date: 2013-11-29
Also published as: US9297038B2; KR20120056716A; WO2012070788A3; US20130295577A1; WO2012070788A2; WO2012070788A9

Abstract

본 발명은 랜덤 프라이머를 이용하는 실시간 PCR을 이용하여 숙주 세포 유래 핵산 불순물을 비롯한 핵산, 특히 미량 핵산을 정량하는 방법 및 키트에 관한 것이다.

Description

핵산 정량 방법 및 키트{Methods and kits for the quantification of nucleic acids}

본 발명은 핵산의 정량에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 랜덤 프라이머(random primer)를 이용하는 실시간 중합효소연쇄반응(real-time polymerase chain reaction, 이하 '실시간 PCR'이라 함)을 이용하여 핵산, 특히 미량 핵산, 예를 들어 숙주 세포 유래 핵산 불순물을 정량하는 방법 및 키트에 관한 것이다.

DNA의 정확한 정량은 DNA가 주요 분석 타겟인 대부분의 분자생물학적 적용에서 품질 보증을 위한 출발점이다. 타겟 DNA의 농도가 매우 낮거나 분석을 위해 제한된 양의 샘플만이 이용 가능한 분석적 적용에 있어서 미량 DNA의 정량은 특히 중요하다. 법의학적 DNA 분석, 병원성 물질의 정량 및 생물의약품에서 숙주 세포 DNA 불순물의 정량이 이러한 카테고리에 속한다. 이들 분야에서 미량 수준 DNA 정량 기술의 중요성으로 인해, 분석의 불확실성을 최소화하고 분석 결과를 정량하기 위하여 특별한 가이드라인이 제시되고 있다. 예를 들어, 미국식품의약국(FDA) 가이드라인은 생물의약품에서 숙주 세포 DNA의 허용 가능한 잔여 량을 100 pg/용량으로 정하고 있고, 세계보건기구(WHO)와 유럽연합(EU)은 숙주 세포 DNA의 허용 가능한 한계를 10 ng/용량 이하로 정하고 있다.

다양한 DNA 정량 방법이 특정 용도를 위해 개발 및 적용되어 오고 있다. UV 스펙트로포토메트리(spectrophotometry)로 판독하는 260 ㎚에서의 DNA 흡광도는 DNA 정량을 위한 가장 보편적인 방법이다. 그러나 이 기술은 미량 수준의 DNA 정량에 사용하기에는 민감도와 정확성에 심각한 한계를 가지고 있다. 또한, 뉴클레오타이드, RNA 및 단백질의 오염이 UV 흡광도에 기초한 DNA 정량을 심각하게 방해한다. 형광-기초한 기술 역시 DNA 정량을 위해 널리 사용되어 왔다. 이들 방법은 적절한 검량 표준이 제공되는 경우 DNA 정량에서 UV 스펙트로포토메트리에 비해 훨씬 높은 민감도와 정확성을 나타낸다. 그러나 이 방법 역시 오염으로부터 자유롭지 못하며 4 pg 미만의 DNA에 대해서는 적용할 수 없다.

몇몇 방법들이 극미량의 DNA, 특히 생물의약품에서 잔여 숙주 세포 DNA의 정량 목적을 위해 개발되었다. 혼성화(hybridization) 방법은 랜덤 및 서열-특이적 프로브에 혼성화되는 DNA의 방사성동위원소 또는 화학발광 검출에 의존한다. '스레스홀드(threshold) 방법'이라 명명된 또 다른 방법은 타겟 단일가닥 DNA를 민감하게 포획하는 단일가닥 결합 단백질(single strand binding protein, SSB)의 항체-매개된 검출 및 정량을 이용한다. 혼성화 방법과 스레스홀드 방법 모두 피코 그램 수준의 DNA를 정량하기에 충분한 정도로 감도가 높고 서열-비의존적이며 모든 DNA 종(universal DNA species)에 적용 가능한 점에서 장점을 갖는다. 그러나, 이들은 분석 시간이 상대적으로 길고, 노동 집약적이며, 과정이 복잡하다는 단점을 갖는다.

소량 DNA 분석의 또 다른 보편적인 방법은 PCR과 실시간 PCR이다. 극도의 민감성과 실험의 간편성으로 인해, PCR은 DNA의 정성 및 정량 분석 모두를 위해 제1의 실험실적 선택방안이 되어 왔다. 그러나 DNA 정량 분석을 위한 실시간 PCR 방법의 단점은 그의 서열 특이성(sequence specificity)으로부터 유래된다. PCR은 전체 DNA 함량을 정량하는 것이 아니라 특정 유전자의 함량을 정량하기 위한 방법이다. 따라서, 전체 DNA의 양을 직접적으로 측정할 수 없고 단지 특정 유전자의 양으로부터 간접적으로 계산할 수 있을 뿐이다. 또한 PCR은 그 서열 특이성으로 인해 하나의 게놈 카피를 넘는 DNA 양에 대한 것으로 적용이 제한된다. 인간 유전체의 경우 개별 유전자가 하나의 카피를 갖게 하는 1 게놈의 양은 약 3 pg에 해당한다. 이상적인 PCR 조건에서 가장 효율적인 반응이 일어난다고 가정하더라도 특정 유전자를 대상으로 하는 PCR 방법의 정량 한계는 3 pg이며 일반적인 PCR 성능을 고려하면 포유동물 유전체 DNA 기준 수십 pg의 정량 한계를 보인다. 따라서, PCR은 매우 민감하고 바이러스와 세균으로부터의 펨토 그램 량의 DNA 정량을 가능하게 하지만, 포유 세포로부터의 DNA에 대해서는 이와 유사한 정도로 민감하지는 않다. 포유 세포에 대한 PCR의 제한된 감도를 극복하기 위하여 rRNA 유전자나 Alu 반복체(Alu repeat)와 같은 다중-카피 유전자를 증폭하는 방법이 개발되었다. 그러나, 이 방법은 통상적인 분석 환경에서는 달성하기 어려운, 전체 게놈 함량의 비편향된 분포와 타겟 다중-카피 유전자의 카피 수의 일관성이라는 가정에 기초한 것이므로 여전히 한계를 가지고 있다. 아래 표 1에 공지의 미량 DNA 정량 기술을 요약하여 나타내었다.

	혼성화	스레스홀드 (Threshold)	PCR
특이성	랜덤 서열 종 특이적	단일가닥 DNA, 비-종 특이적	타겟 서열 특이적
최소 검출 길이(bp)	50	600	150
방해물질에 대한 내성	++	+	+
시간	48	6	2
민감도	6 pg	3 pg	<1 pg

(문헌 [T.Wolter, A. Richter, Assays for controlling host cell impurities in biopharmaceuticals, Bioprocess Int. 3 (2005) 40-46])

따라서, 펨토 그램 수준의 DNA를 정량하기 위한 민감하고 확립된 방법을 개발하는 것이 매우 중요하다 할 것이다.

본 발명자들은 기존에는 서열 특이성에 기초하여 특정 유전자의 함량을 측정하는데 사용되어 온 실시간 PCR을 랜덤 프라이머로 수행함으로써 핵산, 특히 서브게놈 함량(subgenomic content) 이하의 미량 핵산을 높은 민감도와 정확성으로 정량할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 목적은 핵산, 특히 미량 핵산, 예를 들어 숙주 세포 유래 핵산 불순물을 정량하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 핵산, 특히 미량 핵산, 예를 들어 숙주 세포 유래 핵산 불순물을 정량하는 키트를 제공하기 위한 것이다.

본 발명은

정량 대상 핵산에 대해 랜덤 프라이머를 이용한 실시간 PCR을 수행하고;

표준 물질로서의 기지 량(known amount)의 핵산에 대해 랜덤 프라이머를 이용한 실시간 PCR을 수행하여 얻은 증폭 결과와 핵산 량의 상관관계에 기초하여, 상기 정량 대상 핵산에 대한 실시간 PCR에 의한 증폭 결과로부터 정량 대상 핵산의 양을 결정하는:

단계를 포함하는, 핵산의 정량 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

표준 물질로서 기지 량의 핵산; 및

랜덤 프라이머:

를 포함하는, 본 발명에 따른 핵산의 정량 방법에 사용하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명에 따르면, 핵산, 특히 미량 핵산, 예를 들어 숙주 세포 유래 핵산 불순물을 높은 민감도와 정확성으로 효율적으로 정량할 수 있다. 본 발명은 법의학적 용도, 생물의약품의 핵산 불순물 검사 등에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 HPD, CTD, HSD, λ DNA에 대한 실시간 DOP-PCR의 증폭 프로파일과 관련 표준 곡선을 나타낸 그래프이고;
도 2는 HPD에 대한 실시간 DOP-PCR 산물의 아가로스 젤 전기영동 결과를 보여주는 사진이며;
도 3은 HPD에 대한 실시간 DOP-PCR의 증폭 프로파일을 나타낸 그래프이고;
도 4는 HPD에 대한 실시간 DOP-PCR 산물의 아가로스 젤 전기영동 결과를 보여주는 사진이며;
도 5는 랜덤 프라이머(R.P), 또는 특이적 프라이머(S.P)를 이용한 실시간 정량 PCR, 및 피코그린 분석(P.G)에 대한 DNA 농도 측정값의 분포를 나타낸 그래프이고;
도 6은 실시간 DOP-PCR, 다중카피 유전자 PCR(Yb8) 및 단일카피 유전자 PCR(TH01)의 정량 성능을 나타낸 그래프이며;
도 7은 앵커 서열에 따른 실시간 DOP-PCR의 정량 성능을 나타낸 그래프이다.

본 발명에서, '미량' 핵산은 1 ㎍ 이하의 핵산을 가리키는 것이고, '극미량' 핵산은 3 pg 이하의 핵산을 가리키는 것이다.

본 발명에서, '핵산'은 DNA, 예를 들어 게놈 DNA는 물론, RNA를 포함하는 개념으로서, 정량 대상 핵산이 RNA인 경우 역전사(reverse transcription) 반응을 이용하여 cDNA를 합성하고, 합성된 cDNA를 이용하여 실시간 PCR을 수행할 수 있다.

본 발명에서, '랜덤 프라이머'는 랜덤 염기서열을 포함하는 프라이머를 가리키는 것으로서, 전체적으로 랜덤 염기서열로 이루어진 것과 일부 랜덤 염기서열을 갖는 것을 모두 포함하는 개념이다.

본 발명은 랜덤 프라이머를 이용하여 실시간 PCR을 수행함으로써 서브게놈 함량 이하의 핵산을 높은 민감도와 정확성으로 정량할 수 있다는 새롭고도 놀라운 발견에 기초한 것이다.

본 발명은 기존에는 서열 특이성에 기초하여 수행되어 온 실시간 PCR을 랜덤 프라이머를 이용하여 서열 비특이적으로 수행하는 것을 특징으로 한다. 또한, 특정 유전자의 함량을 측정하는데 사용되어 온 실시간 PCR을 핵산의 정량에 사용하는 것을 특징으로 한다. 즉, 본 발명은 서열 비특이적 증폭을 실시간 PCR과 결합하여 서브게놈 함량 이하의 DNA를 정량하는 것을 특징으로 하는 것이다.

본 발명은 정량 대상 핵산을 랜덤 프라이머를 이용한 실시간 PCR을 이용하여 증폭하고, 얻어진 증폭 결과로부터, 표준 물질로서 기지 량의 핵산에 대해 랜덤 프라이머를 이용한 실시간 PCR을 수행하여 얻은 증폭 결과와 핵산 량의 상관관계를 이용하여, 정량 대상 핵산의 양을 결정하는 것을 포함하는, 핵산의 정량 방법을 제공한다. 예를 들어, 실시간 PCR의 C_t(threshold cycles) 값을 이용하여 정량 대상 핵산을 정량할 수 있다.

본 발명의 일례에 따르면, 정량 대상 핵산은 서브게놈 함량 이하의 양으로 존재하는 것이다. 정량 대상 핵산은 예를 들어, 80 fg 내지 8 ng, 특히 800 fg 내지 8 ng의 양으로 존재하는 것이다.

본 발명의 일례에서, 정량 대상 핵산은 숙주 세포 유래 핵산 불순물이다.

본 발명에서, 랜덤 프라이머를 이용하는 실시간 PCR은 실시간 DOP-PCR(degenerate oligonucleotide primed PCR, Roche)인 것이 보다 바람직하다. DOP-PCR은 샘플 DNA를 그의 기원 및 서열에 무관하게 전체 게놈 증폭을 가능하게 한다(Telenius, H. et al. (1992), Cytogenetic analysis by chromosome painting using dop-pcr amplified flow-sorted chromosomes. Genes, Chromosomes and Cancer, 4:257-263). 실시간 DOP-PCR은 특정 유전자를 타겟으로 하는 통상의 PCR 방법에 비해 두 가지 잠재적인 장점을 갖는바, 한 가지는 서열 비의존성(sequence independency)이고 다른 한 가지는 하나의 게놈 카피에 해당하는 양의 DNA로 제한되지 않는 높은 민감도이다. DOP-PCR은 타겟 DNA의 서열과 종(species)이 알려져 있지 않아도 서브게놈 량의 DNA로부터 앰플리콘(amplicons)을 성공적으로 생성할 수 있다. 본 발명에 따른 실시간 DOP-PCR에서는, 예를 들어, 서열번호 1(CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG, 밑줄친 부분: 앵커 서열)의 프라이머, 상기 프라이머의 앵커 서열을 변형시켜 얻어진 서열번호 2(CCGACTCGAGNNNNNNATTTCG), 서열번호 3(CCGACTCGAGNNNNNNCGGGTC) 또는 서열번호 4(CCGACTCGAGNNNNNNTGTTCG)의 프라이머, 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있다.

본 발명에 따르면, 정확한 양이 알려진 HPD(human placenta DNA)를 이용하여 실험한 결과, 800 fg ~ 8 ng 범위에서 효율적인 정량이 가능하며, 80 fg이 검출한계(LOD)인 것으로 확인되었다. 또한, 양을 알고 있는 모의 샘플을 제작하여 정량해본 결과, 약 4 pg 샘플에서 정확도 5%, 정밀도 15% 정도의 정량효율을 보였다. 이는 특이적 유전자 증폭이나 피코그린 방법에 의해서는 달성할 수 없는 높은 민감도와 정확도이다.

본 발명은 또한 랜덤 프라이머를 이용하는 실시간 PCR을 이용한 핵산 정량 키트를 제공한다. 상기 키트는 표준 물질로서 기지 량의 핵산, 및 랜덤 프라이머를 포함하는 것일 수 있다. 또한, 통상적인 실시간 PCR 혼합물, 예를 들어 DNA 중합효소(예: Taq polymerase), 완충용액, 형광염료(예: SYBR) 등을 추가로 포함할 수 있다. 실시간 PCR 혼합물은 예를 들어 SYBR premix EX Taq™(Takara)에 기초하여 준비할 수 있다.

본 발명은 적절한 표준 DNA를 사용하여, 법의학이나 생물의약품의 핵산 불순물 검사와 같은 미량 DNA의 정량에 유용하게 사용할 수 있을 것으로 예상된다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 어떤 식으로든지 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1: 실시간 DOP-PCR의 유효성 시험

인간 태반 DNA(human placenta DNA, HPD)(Sigma St. Louis, MO)를 초음파처리에 의해 1~5 kb로 단편화한 후 ICP-OES(Inductively Coupled Plasma-Optical Emission Spectrometer)에 의해 정량하였다. 검량 표준을 ICP-OES-정량된 HPD의 중량분석된 연속 희석에 의해 준비하였다. 또한 시험 샘플을 동일한 HPD의 특정 농도로의 중량분석 희석에 의해 준비하였다. 송아지 흉선 DNA(calf thymus DNA, CTD)(Sigma), 청어 정자 DNA(herring sperm DNA, HSD)(Sigma) 및 λ DNA(Fermentas)를 260 ㎚에서의 흡광도를 측정하여 정량하였다. HPD에 대한 DNA 샘플의 농도 비율은 CTD : HSD : λ DNA = 4.4 : 7.8 : 0.5였다. 이 값을 기지 농도의 HPD에 의해 검량하였다. 500 ~ 1500 bp HPD 샘플을 Alu I 및 Hinf I 제한효소(GE healthcare)로의 단일 또는 이중 분해에 의해 제조하였다.

축퇴 올리고뉴클레오타이드 프라이머(degenerate oligonucleotide primer, 5'-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3'; 서열번호 1)를 합성하였다(Genotech, 대전, 한국). 모든 실시간 PCR 혼합물을 SYBR premix EX Taq™(Takara)에 기초하여 준비하였다. 반응 혼합물은 2 μM 프라이머, 80 fg에서 80 ng 범위의 게놈 DNA 주형을 함유하였다. 실시간 PCR을 CFX manager™ V1.5 소프트웨어(Bio-rad, Hercules, CA)에 의해 작동되는 Miniopticon™ 장치(Bio-rad, Hercules, CA)에서 최종 부피 15 ㎕로 수행하였다. 실시간 DOP-PCR을 공지의 과정을 약간 변형하여 수행하였다. 간략하게는, 95 ℃ 10분 최초 변성 후, 5회의 저 엄격도(low stringency) 주기를 94 ℃ 1분, 32 ℃ 1분 30초, 72 ℃ 3 분 및 72 ℃ 3 분으로 수행하였다. 그런 다음 94 ℃ 1분, 62 ℃ 1분 및 72 ℃ 2분으로 이루어지는 35회의 고 엄격도(high stringency) 주기를 수행하고 72 ℃ 7 분간 최종 연장에 의해 반응을 완료하였다.

실시간 DOP-PCR의 유효성을 80 fg에서 80 ng으로 조정한 4가지 상이한 게놈 DNA 샘플에 적용하여 시험하였다. 미지 샘플의 농도를 결정하기 위하여 게놈 DNA를 10배 희석하여 표준 곡선을 만들었다. DOP-PCR은 매우 다양한 상이한 앰플리콘을 증폭하지만, 모든 증폭 프로파일은 전형적인 특정 유전자의 PCR의 것과 유사하였다. 프로파일은 DNA 종에 무관하게 800 fg에서 8 ng까지 10배 희석된 일련의 샘플로부터 C_t(threshold cycles) 사이에 일정한 간격을 나타내었다. 얻어진 표준 곡선은 1.0에 가까운 R² 값에 의해 나타내어지는 바와 같이 매우 선형이어서 이 범위에서 DNA 정량의 높은 정확성과 유효성을 보여주었다.

C_t 값과 게놈 DNA 양의 선형 회귀는 각각 75%, 86% 및 73% PCR 효율에 해당하는 네거티브 선형성(기울기 = -4.1, -3.7, 또는 -4.2)을 나타내었다. 각 주기 마다 PCR 산물의 2배화(doubling)를 반영하는, 최적의 효율(100%)은 기울기 -3.32를 특징으로 한다. 일반적으로 증폭 효율이 90%에서 110% 사이인 분석이 고려되지만, 랜덤 프라이머에 기초한 증폭은 73%와 86% 사이였다.

도 1에 표준 물질 HPD의 실시간 DOP-PCR 프로파일(A) 및 이로부터 얻어진 표준곡선(B)을 나타내었다.

도 2에 주형으로서 HPD(레인 2), 증폭 산물(레인 3-7) 및 NTC(no-template control, 레인 8)의 아가로스 전기영동 결과를 나타내었다. 주형으로 1 내지 5 kb의 절단된 형태의 HPD를 사용하였다. 각각 투입 게놈 DNA 양의 증폭 산물들은 0.1 내지 3 kb 범위의 산물 길이를 갖는 증폭과 0.25 내지 1 kb의 도말 강도(smear intensity)를 나타내었다.

도 3 및 4에 각각 HPD의 증폭 프로파일과, 아가로스 젤 전기영동 결과를 나타내었다. 상기 도면에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 실시간 DOP-PCR을 이용한 DNA 정량 방법은 약 500 bp의 작은 DNA에도 적용 가능한 것으로 확인되었다.

실시예 2: 미지 DNA 샘플의 정량

유효 범위 내에서 랜덤 프라이머를 이용하는 정량 실시간 PCR의 정확성 및 신뢰성을 입증하기 위하여, 두 가지 DNA 정량 방법, 피코그린 분석(PicoGreenㄾ assay)과 특이적 프라이머를 사용하는 정량 실시간 PCR 분석을 비교를 위해 사용하였다.

특이적 프라이머로 인간 게놈 DNA를 정량하기 위하여, 법의학적 용도로 널리 사용되고 있는 인간 타이로신 하이드록실레이즈(TH01) 유전자에 있는 STR(Short Tandem Repeat) 서열을 포함하도록 분석을 설계하였다. 염색체 11(11p15.5) 내에 위치한 TH01의 서열은 GenBank locus AF536811로부터 유래되었다. TH01 좌위의 증폭을 위한 특이적 프라이머(F: 5'-AGGGTATCTGGGCTCTGG-3'; 서열번호 5, R: 5'-GGCTGAAAAGCTCCCGATTAT-3'; 서열번호 6)를 합성하였다(Genotech, 대전, 한국). TH01 좌위는 하기 주기 조건에 의해 증폭하였다: 95 ℃ 3 분간 최초 변성 및 94 ℃ 5초 및 60 ℃ 34 초의 35 주기.

주형으로 HPD를 사용한 경우 앰플리콘 크기는 180 bp였다. 특이적 프라이머를 이용한 증폭 산물은 아가로스 젤 상에서 단일의 샤프한 밴드, 용융곡선에서 단일 피크, 및 86.6% 내지 100.9% 범위의 증폭 효율을 나타내었다. SYBR 그린 I을 랜덤 및 특이적 프라이머-기초 분석 모두를 위한 인터컬레이팅(intercalating) 염료로 사용하여 증폭 중 형광 성질을 모니터링하였다. 또 다른 형광측정 방법으로는 이중가닥 DNA에 결합할 때 형광을 나타내는 피코그린을 사용하였다. 이것은 250 pg/㎖ 이하의 DNA를 검출하는 감도를 가지고 있는 것으로 보고되어 있다.

아래 표 2는 농도 측정값의 통계치를 요약하여 나타낸 것이고, 도 5는 랜덤 프라이머(R.P), 또는 특이적 프라이머(S.P)를 이용한 실시간 정량 PCR, 및 피코그린 분석(P.G)에 대한 DNA 농도 측정값의 분포를 나타낸 것이다.

측정 타입	예상값 (pg/㎕)	관찰값 (pg/㎕)	표준편차 (pg/㎕)	정밀도 (%)	정확도 (%)
R.P	386.4	402.8	35.1	8.7	4.2
S.P	386.4	407.6	48.9	12.0	5.5
P.G	386.4	333.7	25.6	7.7	-13.6
R.P	3.82	3.63	0.54	14.9	-5.0
S.P	3.82	N/A	N/A	N/A	N/A
P.G	3.82	N/A	N/A	N/A	N/A

R.P, S.P 및 P.G에 대한 DNA 농도 예상값은 386.4 및 3.82 pg/㎕였다. R.P와 S.P에 대한 평균 DNA 농도 측정값은 각각 402.8 pg/㎕와 407.6 pg/㎕로서 예상값 보다 조금 높았다. 그러나 P.G에 대한 평균 DNA 농도 측정값은 333.7 pg/㎕로 예상값 보다 훨씬 낮았다. 따라서, R.P의 관찰된 평균은 세 가지 DNA 정량 방법 중에서 가장 정확한 값을 나타내었다.

상기한 바와 같이, 세 가지 방법 모두 약 400 pg/㎕ 농도에서는 적용 가능하나, 랜덤 프라이머 방법만이 3.8 pg/㎕의 농도를 결정하는데 적용 가능한 것으로 나타났다.

유전자, 특히 단일카피 유전자의 특정 부분을 증폭하기 위해서는, PCR 주형을 위해 7 카피 이상의 유전자가 요구된다. 하나의 반수체 핵 카피는 3.3 pg 인간 게놈 DNA 내에 있다. 특이적 프라이머를 이용하는 정량값의 한계는 80 pg/㎕, 24 카피로 예상되었다. 8 pg/㎕, 2.4 카피 내의 DNA를 증폭하는 것은 불가능하였다. 특이적 프라이머를 사용하는 정량 실시간 PCR의 민감도를 증가시키기 위하여, Alu, rDNA, mtDNA와 같은 다중카피 유전자가 이 분석에 도입되었다. 그러나, 다중카피 유전자는 세포나 개체 간에 많은 변화가 있다. 따라서, 다중카피 유전자를 이용하는 이 분석으로부터 정확한 결과를 얻는 것은 어렵다.

피코그린은 샘플 당 약 50 pg dsDNA의 최종 민감도를 위해 2 ㎖ 부피 중 25 pg/㎖ dsDNA 또는 200 ㎕ 부피 중 250 pg/㎖ dsDNA를 검출하는 민감도를 갖는 것으로 보고되었다. 따라서, 800 pg/㎖ dsDNA 검출 감도를 달성하기 위하여, DNA 총량이 50 pg이 되는 62.5 ㎕ 부피의 DNA가 필요하였다. 이에 비해 랜덤 프라이머에 기초한 정량 실시간 PCR의 경우, 800 pg/㎖ DNA를 1 ㎕ 부피로 검출하는 것이 가능하였다. 이것은 랜덤 프라이머를 이용하는 정량 실시간 PCR이 유효 범위 내에서 미지 샘플을 정량하는데 정확한 데이터를 제공하는 것을 나타내는 것이다.

도 6에 다양한 PCR 방법(A. 실시간 DOP-PCR, B. 다중카피 유전자에 대한 PCR(Yb8), C. 단일카피 유전자에 대한 PCR(TH01))의 정량 성능을 비교하여 나타내었다. 도 6에 나타난 바와 같이, 단일카피 유전자에 대한 PCR은 80 pg의 정량한계를 나타내고 다중카피 유전자에 대한 PCR은 800 fg의 정량한계를 나타냄에 비해, 본 발명에 따른 실시간 DOP-PCR은 80 fg의 정량한계를 나타내는 것으로 확인되었다.

실시예 3: 앵커 서열에 따른 실시간 DOP-PCR의 성능 비교

상기 실시예 1에서 서열번호 1의 프라이머에서 앵커 서열을 변화시킨 서열번호 2 내지 4의 프라이머를 합성하고, 이들 프라이머를 이용하여 실시간 DOP-PCR을 수행하였다. 도 7에 표준 물질 HPD의 실시간 DOP-PCR 프로파일을 나타내었다. 도 7에 나타난 바와 같이, 프라이머의 앵커 서열 간 다소 차이는 있지만, 전체적으로 유사한 증폭 프로파일을 나타내어, 미량의 핵산 정량에 효과적으로 사용될 수 있는 것으로 확인되었다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

정량 대상 핵산에 대해 랜덤 프라이머를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하고;
표준 물질로서 기지 량의 핵산에 대해 랜덤 프라이머를 이용하여 실시간 PCR을 수행하여 얻은 증폭 결과와 핵산 량의 상관관계에 기초하여, 상기 정량 대상 핵산의 실시간 PCR에 의한 증폭 결과로부터 정량 대상 핵산의 양을 결정하는:
단계를 포함하며, 상기 실시간 PCR은 실시간 DOP-PCR인, 극미량 핵산의 정량 방법.
삭제
제1항에 있어서, 정량 대상 핵산이 80 fg 내지 8 ng의 양으로 존재하는 것인, 핵산의 정량 방법.
제1항에 있어서, 정량 대상 핵산이 게놈 DNA, 또는 RNA로부터 역전사 반응에 의해 합성된 cDNA인 것인, 핵산의 정량 방법.
제1항에 있어서, 정량 대상 핵산이 숙주 세포 유래 핵산 불순물인 것인, 핵산의 정량 방법.
제1항에 있어서, 법의학적 용도, 또는 생물의약품의 핵산 불순물을 정량하기 위해 사용되는, 핵산의 정량 방법.
제1항에 있어서, 랜덤 프라이머로 서열번호 1 내지 4의 프라이머 중 하나 이상을 이용하는, 핵산의 정량 방법.
제1항에 있어서, 실시간 PCR의 C_t(threshold cycles) 값을 이용하여 정량 대상 핵산의 양을 결정하는, 핵산의 정량 방법.
표준 물질로서 기지 량의 핵산; 및
랜덤 프라이머:
를 포함하는, 제1항 및 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 핵산의 정량 방법에 사용하기 위한 키트.