KR102385960B1 - 분석물질-비의존적 신호값을 이용한 타겟 분석물질에 대한 데이터 세트 보정 방법 - Google Patents
분석물질-비의존적 신호값을 이용한 타겟 분석물질에 대한 데이터 세트 보정 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 분석물질-비의존적 신호값을 이용하여 샘플 내 타겟 분석물질에 대한 데이터 세트를 보정하는 방법에 관한 것으로서, 상기 분석물질-비의존적 신호값은 상기 데이터 세트의 배경지역-대표 신호값 또는 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값에 의하여 제공된다. 본 발명의 방법은 데이터 세트들의 기기간 또는 기기내 신호 편차를 제거하는 데 매우 효과적이다. 또한 본 발명의 방법은 소프트웨어로 구현되므로, 본 발명의 방법은 제조사와 관계없이 다양한 분석 기기 (예를 들어 실시간 PCT 기기)에 보편적으로 적용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 진단 데이터 분석에 매우 유용하다.
Description
본 발명은 샘플 내 타겟 분석물질에 대한 데이터 세트를 분석물질-비의존적 신호값을 이용하여 보정하는 방법에 관한 것이다.
중합효소 연쇄반응(Polynucleotide chain reaction; 이하 “PCR”이라한다)으로 공지된 가장 많이 사용되는 핵산 증폭 반응은 이중가닥 DNA의 변성, DNA 주형으로의 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 어닐링 및 DNA 중합효소에 의한 프라이머 연장의 반복된 사이클 과정을 포함한다(Mullis 등, 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호; Saiki et al., (1985) Science 230, 1350-1354).
실시간 PCR(Real-time PCR)은 샘플에서 타겟 핵산을 실시간으로 검출하기 위한 PCR 기반 기술이다. 특정 타겟물질을 검출하기 위하여, 실시간 PCR은 타겟 분자의 양에 비례하여 검출 가능한 형광신호를 방출하는 신호발생수단을 이용한다. 검출 가능한 형광신호의 방출은, 예를 들어 이중 나선 DNA에 결합하여 형광신호를 방출하는 시약(intercalator)을 사용하거나, 형광신호체 및 이의 형광 방출을 억제하는 quencher 분자를 모두 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 방법이 있다. 타겟 분자의 양에 비례하는 형광신호가 실시간 PCR을 통하여 각 사이클 마다 검출되며, 형광신호를 측정하여, 사이클 대비 검출되는 형광신호의 세기를 표시한 증폭곡선(amplification curve) 또는 증폭 프로파일 곡선(amplification profile curve)을 얻게 된다.
형광 신호를 이용한 샘플분석은 다음과 같이 이루어진다. LED 등의 광원을 통하여 발광체(luminant)에 에너지가 공급되면, 발광체의 전자는 더 높은 양자상태로 들뜨게 되고, 궤도전자가 바닥상태로 돌아오면서 발광체는 특정 파장의 빛을 발산한다. 분석기기가 광다이오드 또는 CCD등을 이용하여 이 특정 파장의 빛을 전기적 신호로 변환시켜 샘플 분석에 필요한 정보를 제공한다.
이때 기기 간 LED 광량의 차이(uneven illumination) 및 각 기기에 있는 빛-전기 변환장치의 기능적 편차에 의하여, 동일한 양의 발광체가 샘플에서 분석되어도, 각 분석기기는 기기마다 서로 상이한 수치를 산출하게 된다. 이러한 기기간 신호의 차이를 기기간 편차(inter-instrument variation)라 한다. 기기간 편차 뿐만 아니라, 기기에서 반응이 수행되는 반응웰의 위치 또는 반응혼합물의 농도, 조성의 미세한 차이와 같은 반응환경의 차이에 의하여, 동일한 하나의 분석기기에서 동종, 동량의 타겟물질에 대하여 수행된 복수의 반응의 분석 결과도 신호 수준에 차이가 있을 수 있다. 이러한 동일한 기기에서의 반응들간의 신호차이를 기기내 편차(intra-instrument variation)라고 한다. 또한, 분석물질이 없는 기질인 블랭크를 대상으로 분석하는 경우에도 기기 자체에서 전기적 노이즈 신호가 발생하며, 이것이 정상적인 신호로 기록될 수 있다. 이러한 신호 편차를 발생시키는 전기적 노이즈 신호를 블랭크 신호값이라고 한다. 이러한 블랭크 신호값은 특정한 신호값이 각 사이클마다 더해지거나, 차감된 형태로 나타난다.
정확하고 신뢰성 있는 분석을 위하여, 이러한 문제는 해결되어야 하며, 이를 위한 몇몇 방법이 제안되었다. 가장 기본적인 방법으로, 하드웨어 조정 방법이 사용된다. 예를 들어, 분석기기가 제조될 때, LED 광원과 같은 각 분석 기기의 일부를 보정하여 동일 샘플에 대한 기기간 신호편차를 감소시켜 적정 수준으로 유지한다.
그러나, 이러한 선행 기술은 몇몇 한계를 가지고 있다. 하드웨어 보정 방법은 보정 정확도에 한계가 있으며, 분석 기기의 노후에 따라 발생하는 오차에 대응하기 위해서는 별도의 추가 보정이 필요하다. 더구나, 하드웨어 보정 방법은 단지 기기간 신호 편차만을 감소시킬 수 있을 뿐, 기기내 신호 편차를 감소시키지 못한다. 따라서, 직업적인 하드웨어의 조정 없이 기기간 및 기기내 신호 편차를 감소시킬 수 있는 새로운 데이터 세트 보정 방법의 개발이 필요하다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 인용문헌 및 특허 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌 및 특허의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 타겟 분석물질에 대한 신호발생반응의 데이터 세트의 신호 편차를 정확하고 간편하게 감소시키는 신규한 방법을 개발하기 위하여 노력하였다. 그 결과, 분석물질-비의존적 신호값을 데이터 세트의 신호값에 적용하여 보다 정확하고, 간편하게 보정된 데이터 세트를 제공할 수 있음을 밝혀 내었다. 또한 상기 분석물질-비의존적 신호값으로 두가지 종류의 값을 이용할 수 있음을 밝혀내었다.
따라서, 본 발명의 목적은 샘플 내 타겟 분석물질에 대한 데이터 세트의 보정 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 샘플 내 타겟 분석물질에 대한 데이터 세트의 보정 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 지시를 포함하는 컴퓨터 해독 가능한 기록매체를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 샘플 내 타겟 분석물질에 대한 데이터 세트의 보정 장치를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 샘플 내 타겟 분석물질에 대한 데이터 세트의 보정방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는, 컴퓨터 해독가능한 기록매체에 저장되는 컴퓨터 프로그램을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 실시예, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
I. 분석물질-비의존적 신호값을 이용한 타겟 분석물질의 데이터 세트 보정 방법
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 샘플 내 타겟 분석물질에 대한 데이터 세트의 보정(calibration) 방법을 제공한다:
(a) 상기 데이터 세트 보정을 위한 분석물질-비의존적 신호값을 제공하는 단계; 상기 데이터 세트는 신호발생수단을 이용한 상기 타겟 분석물질에 대한 신호발생반응으로부터 수득되며; 상기 데이터 세트는 상기 신호발생반응의 사이클들 및 신호값들을 포함하는 복수의 데이터 지점을 포함하며; 상기 분석물질-비의존적 신호값은 (i) 상기 데이터 세트의 배경지역-대표 신호값에 의하여; 또는 (ii) 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값에 의하여 제공되며; 상기 배경지역-대표 신호값은 상기 데이터 세트의 기준 사이클에서의 신호값에 의하여 제공되며, 상기 기준 사이클은 데이터 세트에서 샘플 내 타겟 분석물질의 존부에 비의존적으로 신호가 발생하는 배경지역 내에서 선택되며; 상기 표준 데이터 세트는 타겟 분석물질의 표준물질에 대한 신호발생반응에 의하여 제공되며; 및
(b) 상기 분석물질-비의존적 신호값을 상기 데이터 세트의 신호값들에 적용하여 보정된 신호값들을 수득하여 보정된 데이터 세트를 제공하는 단계.
본 발명자들은 타겟 분석물질(예들 들어 타겟 핵산 분자)의 존재 또는 부존재를 나타내는 데이터 세트에서의 기기간 및 기기내 신호 편차를 효과적이고 정확하게 감소시킬 수 있는 새로운 데이터 세트 보정 방법을 개발하기 위하여 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 분석물질-비의존적 신호값을 수득하고, 상기 분석물질-비의존적 신호값을 데이터 세트의 복수의 데이터 지점들의 신호값에 적용하여 샘플 분석에 적합한 보정된 데이터 세트를 얻을 수 있음을 규명하였다.
본 명세서에서 용어 “보정”(calibration) 또는 “조정”(adjustment)은 데이터 세트의 정정(correction), 특히 데이터 세트의 신호값을 분석 목적에 적합하게 정정하는 것을 의미한다.
도 1은 샘플 내 타겟 분석물질에 대한 데이터 세트를 보정하기 위한 본 발명의 일 구현예를 도시한 흐름도이다. 본 발명의 방법을 상세히 설명하면 다음과 같다:
Step (a):
데이터 세트 보정을 위한 분석물질-비의존적 신호값을 제공하는 단계 (S110)
본 발명에 따르면, 데이터 세트 보정을 위한 분석물질-비의존적 신호값이 제공된다. 상기 데이터 세트는 신호발생수단을 이용한 타겟 분석물질에 대한 신호발생반응으로부터 수득되며, 상기 데이터 세트는 신호발생반응의 사이클들 및 상기 사이클들에서의 신호값을 포함하는 복수의 데이터 지점들을 포함한다.
용어 타겟 분석물질은 다양한 물질(예를 들어, 생물학적 물질 및 화합물과 같은 비생물학적 물질)을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 타겟 분석물질은 핵산 분자(예를들어, DNA 및 RNA), 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 지질, 아미노산, 생물학적 화합물, 호르몬, 항체, 항원, 대사물질 및 세포와 같은 생물학적 물질을 포함할 수 있다. 더 구체적으로 상기 타겟 분석물질은 핵산 분자를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 타겟 분석물질은 타겟 핵산 분자일 수 있다.
본 명세서에서 용어 “샘플”(sample)은 생물학적 샘플(예를 들어, 생물학적 원료의 조직 및 체액) 및 비생물학적 샘플(예를 들어, 음식물, 물, 토양)를 포함할 수 있다. 상기 생물학적 샘플은 예컨대, 바이러스, 세균, 조직, 세포, 혈액(예를 들어, 전혈, 혈장 및 혈청), 림프, 골수액, 타액, 객담(sputum), 스왑(swab), 흡인액(aspiration), 젖, 소변, 분변, 안구액, 정액, 뇌 추출물, 척수액, 관절액, 흉선액, 기관지 세척액, 복수 및 양막액일 수 있다. 타겟 분석물질이 타겟 핵산 분자인 경우, 상기 샘플은 핵산 추출과정을 거칠 수 있다. 상기 추출되는 핵산이 RNA인 경우, 추출된 RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사(reverse transcription) 과정을 추가로 거칠 수 있다(참조: Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)).
본 명세서에서 용어 “신호발생반응”은 샘플 내 타겟 분석물질의 특성에 의존적으로 신호를 발생시킬 수 있는 반응을 의미하며, 상기 특성은 예를 들어, 타겟 분석물질의 활성, 양 또는 존재(또는 부존재)일 수 있으며, 특히, 샘플 내 분석물질의 존재 (또는 부존재)일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 신호발생반응은 샘플 내 타겟 분석물질의 존재에 의존적으로 신호를 발생시킨다.
이러한 신호발생반응은 생물학적 또는 화학적 과정을 포함할 수 있다. 상기 생물학적 과정은 PCR, 실시간 PCR, 마이크로어레이, 및 인베이더 분석과 같은 유전적 분석 과정, 면역학적 분석 과정 및 세균 성장 분석을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 신호발생반응은 유전적 분석 과정일 수 있다. 상기 화학적 과정은 화학물질의 생성, 변화 및 분해를 포함하는 화학적 분석을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 신호발생반응은 PCR 또는 실시간PCR일 수 있다.
상기 신호발생반응은 신호 변화를 동반할 수 있다. 본 명세서에서 용어 “신호”는 측정가능한 아웃풋을 의미한다. 상기 신호 변화는 타겟 분석물질의 특성, 구체적으로 존재 또는 부존재를 정성적 또는 정량적으로 지시하는 지시자 역할을 한다. 이러한 지시자의 예는 형광 세기, 발광세기, 화학발광 세기, 생발광 세기, 인광세기, 전하 이동, 전압, 전류, 전력, 에너지, 온도, 점성도, 광 스캐터, 방사능 세기, 반사도, 투광도 및 흡광도를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 빈번히 사용되는 지시자는 형광 세기(fluorescence intensity)이다. 상기 신호 변화는 신호의 증가뿐만 아니라 감소도 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 신호발생반응은 신호값을 증폭하는 반응이다.
본 명세서에서 용어 “신호발생수단”은 분석하고자 하는 타겟 분석물질의 특성, 구체적으로 존재 또는 부존재를 나타내는 신호를 발생하는데 사용되는 어떠한 수단을 의미한다.
다양한 신호발생수단이 알려져 있다. 신호발생수단의 예는 올리고뉴클레오타이드, 표지 및 효소를 포함할 수 있다. 상기 신호발생수단은 표지 자체 및 표지가 결합된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 상기 표지는 형광 표지, 발광 표지, 화학발광 표지, 전기화학적 표지 및 금속 표지를 포함할 수 있다. 상기 인터컬레이팅 염료(intercalting dye)와 같이 표지 자체가 신호발생수단 역할을 할 수 있다. 또는 단일 표지 또는 공여분자 및 수용 분자를 포함하는 상호작용적인 이중 표지가 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드에 결합된 형태로 신호발생수단으로 이용될 수 있다. 신호발생수단은 핵산 절단 효소(예를 들어, 5’-nucleases 및 3’-nucleases)와 같은 신호발생을 위한 추가 구성을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법이 타겟 핵산 분자의 존재 또는 부존재의 결정에 적용되는 경우, 상기 신호발생반응은 공지의 다양한 방법에 따라 수행될 수 있다. 상기 방법은 TaqManTM 프로브 방법 (U.S. Pat. No. 5,210,015), Molecular Beacon 방법 (Tyagi et al., Nature Biotechnology, 14 (3):303(1996)), 스콜피온 방법 (Whitcombe et al., Nature Biotechnology 17:804-807(1999)), 선라이즈(Sunrise or Amplifluor) 방법 (Nazarenko et al., Nucleic Acids Research, 25(12):2516-2521(1997), and U.S. Pat. No. 6,117,635), Lux 방법 (U.S. Pat. No. 7,537,886), CPT (Duck P, et al., Biotechniques, 9:142-148(1990)), LNA 방법 (U.S. Pat. No. 6,977,295), 플렉서(Plexor) 방법 (Sherrill CB, et al., Journal of the American Chemical Society, 126:4550-4556(2004)), HybeaconsTM (D. J. French, et al., Molecular and Cellular Probes (2001) 13, 363-374 and U.S. Pat. No. 7,348,141), 이중 표지된 자가-퀀칭 프로브 (US 5,876,930), 혼성화 프로브 (Bernard PS, et al., Clin Chem 2000, 46, 147-148), PTOCE (PTO cleavage and extension) 방법 (WO 2012/096523), PCE-SH (PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Hybridization) 방법 (WO 2013/115442) and PCE-NH (PTO Cleavage and Extension-Dependent Non-Hybridization) 방법 (PCT/KR2013/012312) 및 CER 방법 (WO 2011/037306)일 수 있다.
본 명세서에서 용어 “증폭” 또는 “증폭반응”은 신호를 증가 또는 감소 시키는 반응을 의미한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 증폭 반응은 신호발생수단을 이용하여 타겟 분석물질의 존재에 의존적으로 발생되는 신호의 증가(또는 증폭)를 의미한다. 상기 증폭 반응은 타겟 분석물질(예를 들어, 핵산 분자)의 증폭을 동반하거나, 동반하지 않을 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 신호발생반응은 타겟 핵산 분자의 증폭을 포함하거나, 포함하지 않고 수행될 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 증폭 반응은 타겟 분석물질의 증폭을 동반한 신호 증폭 반응을 의미한다.
증복반응을 통하여 수득하는 데이터 세트는 증폭 사이클을 포함한다.
본 명세서에서 용어 “사이클”은 일정한 조건의 변화를 수반한 복수의 측정에 있어, 상기 조건의 변화 단위 또는 조건의 변화의 반복 단위를 말한다. 상기 일정한 조건의 변화 또는 조건의 변화의 반복은 예를 들어 온도, 반응시간, 반응횟수, 농도, pH, 측정 대상(예를 들어 타겟 핵산 분자)의 복제 횟수의 변화 또는 변화의 반복을 포함한다. 따라서 사이클은 조건(예를 들어, 온도 또는 농도)의 변화 사이클, 시간 또는 과정(process) 사이클, 단위 운영(unit operation) 사이클 및 재생산(reproductive) 사이클 일 수 있다. 사이클 번호는 상기 사이클의 반복 횟수를 의미한다. 본 명세서에서 용어 “사이클” 및 “사이클 번호” 는 혼용될 수 있다.
예를 들어, 효소 동역학이 조사되는 경우, 기질의 농도를 일정하게 증가시키면서 효소의 반응 속도를 수차례 측정한다. 이 경우, 기질 농도의 증가는 상기 조건의 변화에 해당하며, 기질 농도의 증가 단위가 하나의 사이클에 해당한다. 다른 일예로 핵산의 등온증폭 반응(isothermal amplification)의 경우, 하나의 샘플의 신호를 일정 시간 간격으로 수 차례 측정 된다. 이 경우 반응시간이 조건의 변화이며, 반응시간 단위가 하나의 사이클로 설정된다. 본 발명의 다른 일 구현예에 따르면, 핵산 증폭 반응을 통한 타겟 분석물질의 검출 방법 중 하나로, 타겟 분석물질에 혼성화된 프로브에 의해 발생하는 복수의 형광신호가 일정한 온도의 변화와 함께 측정된다. 이 경우, 온도의 변화가 상기 조건의 변화에 해당하며, 상기 온도가 사이클에 해당한다.
특히, 일련의 반응을 반복하거나, 일정 시간 간격으로 반응을 반복하는 경우, 용어 “사이클”은 상기 반복의 단위를 의미한다. 예를 들어, PCR에서, 사이클은 타겟 핵산 분자의 변성, 타겟 핵산 분자와 프라이머의 어닐링(혼성화) 및 프라이머의 연장을 포함하는 반응 단위를 의미한다. 이 경우 일정한 조건의 변화는 반응의 반복 횟수의 증가이며, 상기 일련의 단계를 포함하는 반응의 반복 단위가 하나의 사이클로 설정된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 타겟 핵산 분자가 샘플에 존재하는 경우, 측정되는 신호값(예를 들어, 신호 강도)은 증폭반응의 사이클의 증가에 따라 증가하거나, 감소한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 타겟 핵산 분자의 존재를 나타내는 신호를 증폭하는 상기 증폭반응은 타겟 분석물질이 증폭되면서, 신호도 증폭되는 방법으로 실시될 수 있다(예를 들어, 실시간 PCR 방법). 또는 상기 증폭 반응은 타겟 분석물질이 증폭되지 않고, 타겟 분석물질의 존재를 나타내는 신호만이 증폭되는 방법으로 실시될 수 있다(예를 들어, CPT method (Duck P, et al., Biotechniques, 9:142-148 (1990)), Invader assay (미국특허 제6,358,691호 및 제6,194,149호)).
타겟 분석물질은 다양한 방법으로 증폭될 수 있다. 예를 들어, 이에 제한되지 아니하나, 다음과 같이 타겟 핵산 분자의 증폭을 위한 다양한 방법이 알려져 있다. PCR (중합효소연쇄반응), LCR (리가아제 연쇄반응, U.S. Pat. No. 4683195 and No. 4683202; A Guide to Methods and Applications (Innis et al., eds, 1990); Wiedmann M, et al., "Ligase chain reaction (LCR)- overview and applications." PCR Methods and Applications 1994 Feb;3(4):S51-64), GLCR (gap filling LCR, WO 90/01069, EP 439182 및 WO 93/00447), Q-beta (Q-beta 레플리카제 증폭, Cahill P, et al., Clin Chem., 37(9):1482-5(1991), U.S. Pat. No. 5556751), SDA (가닥 치환 증폭, G T Walker et al., Nucleic Acids Res. 20(7):1691-1696(1992), EP 497272), NASBA (염기순서기반증폭, Compton, J. Nature 350(6313):91-2(1991)), TMA (전사 매개 증폭, Hofmann WP et al., J Clin Virol. 32(4):289-93(2005); U.S. Pat. No. 5888779).) 또는 RCA (롤링서클 증폭, Hutchison C.A. et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA. 102:17332-17336(2005)).
본 발명의 일 구현예에 따르면, 신호발생수단에 이용되는 표지는 형광(fluorescence)을 포함할 수 있으며, 구체적으로 형광 단일표지 또는 공여 분자(donor molecule) 및 수용 분자(acceptor molecule)를 포함하는 상호작용적인 이중 표지(예컨대, 형광 리포터 분자 및 퀀처 분자 포함)를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 증폭 반응은 타겟 분석물질(구체적으로, 타겟 핵산분자)의 증폭이 수반되면서 신호를 증폭할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 증폭 반응은 PCR, 구체적으로 실시간 PCR에 따라 실시된다.
신호발생반응에 의해 수득된 데이터 세트는 신호발생반응의 사이클들 및 상기 사이클들에서의 신호값들을 포함하는 복수의 데이터 지점을 포함한다.
본 명세서에서 용어 “신호값” 또는 “신호의 값”은 신호발생반응의 사이클들에서 실제 측정되는 신호값(예를 들어, 증폭 반응에 의하여 나타나는 실제 형광 값)을 의미하며, 또는 이의 변형값을 의미한다. 상기 변형값은 측정된 신호값(예를 들어, 신호의 세기)의 수학적으로 가공된 값을 포함할 수 있다. 실제적으로 측정된 신호값의 수학적으로 가공된 신호값의 예는 측정된 신호값의 로그값 또는 도함수값(derivatives)을 포함할 수 있다. 측정된 신호값의 상기 도함수값은 다중 도함수값을 포함한다.
본 명세서에서 용어 “데이터 지점”은 사이클 및 상기 사이클에서의 신호값을 포함하는 하나의 좌표값(a coordinate value)을 의미한다. 용어 “데이터”는 데이터 세트를 구성하는 모든 정보를 의미한다. 예컨대, 증폭 반응의 사이클 및 신호값 각각은 데이터이다. 신호발생반응, 특히 증폭반응에 의해 얻어진 데이터 지점들은 2차원 직교 좌표계에 나타낼 수 있는 좌표값으로 표시될 수 있다. 상기 직교 좌표계에서 X-축은 증폭반응의 사이클을 나타내며, Y-축은 해당 사이클에서 측정 또는 변형된 신호값을 나타낸다.
본 명세서에서 용어 “데이터 세트”는 상기 데이터 지점들의 집합을 의미한다. 상기 데이터 세트는 신호발생수단을 이용한 신호발생반응(예를 들어, 증폭 반응)으로부터 직접 수득한 데이터 지점들의 집합인 원시 데이터 세트일 수 있다. 또는 상기 데이터 세트는 신호발생반응으로부터 직접 수득한 데이터 지점들의 집합을 포함하는 데이터 세트의 변형에 의하여 수득되는 변형된 데이터 세트일 수 있다. 상기 데이터 세트는 신호발생반응으로부터 수득한 데이터 지점들 또는 이의 변형된 데이터 지점들의 일부 또는 전체 일 수 있다.
본 명세서에서 용어 “분석물질-비의존적 신호값”은 샘플 내 타겟 분석물질의 양 또는 존부에 연동되지 않는 신호값을 의미한다. 복수의 데이터 세트들간의 분석물질-비의존적 신호값의 변동은 샘플 내 타겟 분석물질의 존부 또는 양에 의한 것이 아니라 반응의 다양한 요소들의 차이에 의한 것이다. 흥미로운 것은, 상기 분석물질-비의존적 신호값을 이용하여 반응들로부터 수득한 데이터 세트들을 보정하는 경우, 타겟 분석물질이 아닌 다양한 요소들에 의하여 발생한 복수의 데이터 세트들 간의 편차가 감소될 수 있으며, 이로서 더욱 신뢰성 있는 보정된 데이터 세트를 제공할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 분석물질-비의존적 신호값은 실시간 PCR로부터 수득한 데이터 세트의 배경지역에서 검출되는 신호값 일 수 있다. 상기 배경지역에서 검출되는 신호값은 샘플 내 타겟 분석물질의 존부 또는 양과 연관성이 거의 없다.
본 발명의 다른 일 구현예에 따르면, 상기 분석물질-비의존적 신호값은 분석 대상 샘플이 아닌 별도의 물질로부터 수득한 데이터 세트로부터 계산된 총 신호 변화값(total signal change value)일 수 있다.
상기 별도의 물질은 표준 물질(standard material)일 수 있다. 용어 “표준 물질”은 동일 반응 조건에서 수행되는 신호발생반응들에 적용되는 경우, 실질적으로 동일한 수준의 신호값을 발생시키는 물질을 의미한다. 특히, 표준 물질은 신호발생반응이 수행되는 반응 조건들의 차이를 반영하는 신호값을 발생시킬 수 있다. 복수의 데이터 세트들의 각 신호발생반응에 상기 표준 물질을 적용하여 복수의 데이터 세트들 간의 편차를 보정할 수 있다.
본 명세서에서 용어 “총 신호 변화값”은 데이터 세트의 신호 변화량 (증가량 또는 감소량)을 의미한다. 총 신호 변화값은 표준 물질에 대한 신호발생반응을 통하여 수득한 표준 데이터 세트로부터 계산될 수 있다. 표준 물질에 대한 신호발생반응은 분석 대상인 샘플의 데이터 세트를 수득한 것과 동일한 기기 또는 동일한 웰에서 수행될 수 있다. 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값을 이용한 데이터 세트의 보정을 통하여 데이터 세트의 기기간 또는 웰간 편차가 효과적으로 감소할 수 있다.
분석물질-비의존적 신호값은 (i) 분석 대상 샘플을 이용한 신호발생반응으로부터 수득한 데이터 세트 또는 (ii) 별도의 물질을 이용한 신호발생반응으로부터 수득한 데이터 세트에 의하여 제공될 수 있다. 이들 두 구현예에 대하여는 다음 섹션에서 자세히 설명될 것이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 분석물질-비의존적 신호값은 (i) 상기 데이터 세트의 배경지역-대표 신호값에 의하여; 또는 (ii) 표준 데이터 세트에 대한 신호발생반응에 의하여 수득한 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값에 의하여 제공된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)의 데이터 세트는 변형된 데이터 세트일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 데이터 세트는 원시 데이터 세트의 변형된 데이터 세트일 수 있다. 상기 변형은 수학적 변형일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 데이터 세트는 원시 데이터 세트를 수학적으로 가공한 데이터 세트일 수 있다. 구체적으로 상기 데이터 세트는 원시 데이터 세트로부터 배경 신호값을 제거하기 위하여 베이스라인이 차감된 데이터 세트일 수 있다. 상기 베이스라인이 차감된 데이터 세트는 당업계에 공지된 다양한 방법(예컨대, 미국특허 제8,560,247호)을 통하여 얻을 수 있다.
본 명세서에서 용어 “원시 데이터 세트”는 증폭 반응으로부터 직접 수득한 데이터 지점들(사이클 번호 및 신호값을 포함한다)의 집합을 의미한다. 상기 원시 데이터 세트는 실시간 PCR을 수행하기 위한 장치 (예를 들어, thermocycler, PCR 기기 or DNA 증폭기)로부터 최초 수신한 미가공 데이터 지점들의 집합을 의미한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 원시 데이터 세트는 당업계의 기술자들이 통상적으로 이해하고 있는 원시 데이터 세트를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 원시 데이터 세트는 가공 전 데이터 세트를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 원시 데이터 세트는 본 명세서에 기재된 수학적으로 가공된 데이터 세트들의 기초가 되는 데이터 세트를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 원시 데이터 세트는 베이스라인이 차감되지 아니한 데이터 세트(no baseline subtraction data set) 일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 (a)의 데이터 세트는 블랭크 신호값이 제거된 데이터 세트일 수 있다.
용어 “1차 보정 데이터 세트”는 원시 데이터 세트로부터 블랭크 신호값이 제거된 변형된 데이터 세트를 나타내기 위하여 사용된다. 상기 1차 보정 데이터 세트는 변형된 데이터 세트로 기재될 수 있으며, 최종 보정 데이터 세트 또는 2차 보정 데이터 세트와 구분된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 블랭크 신호값은 신호발생수단 없이 수득될 수 있다. 구체적으로, 상기 블랭크 신호값은 표지 자체 또는 타겟 분석물질의 존재에 의해 신호를 발생시키는 표지된 올리고뉴클레오타이드와 같은 신호발생수단이 없이 수행된 반응으로부터 검출된 신호를 말한다. 이러한 블랭크 신호값은 신호발생수단이 없이 측정되므로, 블랭크 신호값에는 기기 대 기기 사이에서 타겟 분석물질의 단위 농도 당 발생하는 신호의 비율적 차이에 의한 신호편차가 적용되지 않는다.
상기 블랭크 신호값은 다양한 방법으로 측정 및 적용될 수 있다. 예를 들어, 서로 다른 기기는 이에 해당하는 각각의 블랭크 신호값이 결정될 수 있다. 하나의 블랭크 신호값이 하나의 기기에 의해 수득되는 여러 데이터 세트들에 적용되며, 서로 다른 기기에서 수득한 데이터 세트들에는 해당 기기에 대응하는 서로 다른 블랭크 신호값이 각각 적용될 수 있다. 또는 하나의 기기 내의 각 웰들에 대하여 서로 다른 블랭크 신호값이 결정될 수 있다. 하나의 기기 내의 각 웰은 고유의 블랭크 신호값을 가질 수 있으며, 하나의 기기 내의 각 웰에서 수득한 데이터 세트들에는 각 웰에 대응하는 상이한 블랭크 신호값이 적용될 수 있다.
상기 블랭크 신호값 제거된 데이터 세트는 블랭크 신호값의 전부 또는 일부가 제거된 데이터 세트일 수 있다. 용어 “제거”는 데이터 세트에 신호값을 더하거나 차감하는 것을 의미한다. 바람직하게는 용어 “제거”는 데이터 세트로부터 신호값을 차감하는 것을 의미한다. 블랭크 신호값이 음수인 경우, 이는 신호값을 더하여 제거될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 블랭크 신호값은 신호발생수단이 없이 수득될 수 있다. 구체적으로 상기 블랭크 신호값은 빈 웰(empty well), 빈 튜브, 증류수가 포함된 튜브 또는 형광분자가 결합된 올리고뉴클레오타이드와 같은 신호발생수단이 없는 실시간 PCR 반응혼합물을 포함하는 튜브를 이용하여 측정될 수 있다. 블랭크 신호값의 측정은 신호발생반응과 함께 수행될 수 있으며, 또는 신호발생반응과 별도로 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 블랭크 신호값의 측정이 신호발생반응과 함께 수행되며, 상기 신호발생반응에 의해 수득한 데이터 세트의 신호값에서 측정된 블랭크 신호값을 차감하는 방법으로 블랭크 신호 전체가 제거될 수 있다.
택일적으로, 신호발생반응에 의해 수득된 데이터 세트의 신호값으로부터 일정한 신호값을 차감하는 방법으로 블랭크 신호값의 일부가 제거될 수 있다. 상기 일정한 신호값은 상기 일정한 신호값을 차감하여 블랭크 신호에 해당하는 신호가 감소되는 범위에서 결정되는 한, 어떠한 값도 가능하다. 예를 들어, 상기 일정한 신호값은 하나의 기기 또는 복수의 기기에서 측정된 복수의 블랭크 신호들을 기초로 결정될 수 있다. 각각의 타겟 분석물질 분석 실험마다 블랭크 신호를 측정하는 것이 곤란한 경우, 하나의 기기 또는 복수의 기기에서 측정된 복수의 블랭크 신호들을 기초로 블랭크 신호값의 일부에 해당하는 일정한 신호값을 결정하고, 상기 결정된 일정한 신호값을 각 데이터 세트에서 일률적으로 차감하는 방법으로 블랭크 신호값이 데이터 세트들로부터 제거될 수 있다.
또는, 상기 일정한 신호값을 데이터 세트로부터 차감한 후 차감된 데이터 세트의 신호값들을 본 발명의 방법에 따라 비율적으로 보정하였을 때, 동량의 타겟 분석 물질에 대한 신호값의 차이가 감소하는 범위에서 상기 일정 신호값이 결정될 수 있다. 이러한 경우, 블랭크 신호의 측정 없이 블랭크 신호의 일부를 제거하여 블랭크 신호가 감소된 데이터 세트를 제공할 수 있다.
본 발명의 방법은 샘플 내 타겟 분석물질에 대한 하나의 데이터 세트를 보정하는 방법일 수 있다. 택일적으로 본 발명의 방법은 복수의 데이터 세트를 보정하는 방법일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 신호발생반응은 서로 다른 반응용기에서 수행되는 동종의 타겟 분석물질에 대한 복수의 신호발생반응이며, 데이터 세트는 상기 복수의 신호발생반응으로부터 수득한 복수의 데이터 세트일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 신호발생반응은 동종의 타겟 분석물질의 검출을 위한 복수의 신호발생반응이며, 데이터 세트는 복수의 데이터 세트일 수 있다.
상기 복수의 신호발생반응은 동일한 종류의 타겟 분석물질(다시말해 동종의 타겟 분석물질)을 검출하기 위한 복수의 신호발생반응일 수 있다. 동일한 종류의 타겟 분석물질은 동일한 종류의 샘플에서 분리된 복수의 타겟 분석물질일 수 있다. 택일적으로 상기 동일한 종류의 타겟 분석물질은 서로 상이한 종류의 샘플에서 분리되었지만, 동일한 신호발생수단(예를 들어 동일한 프로브 또는 동일한 프라이머)에 의하여 검출될 수 있는 복수의 타겟 분석물질일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 복수의 신호발생반응은 상이한 반응환경에서 수행되는 동종의 타겟 분석물질에 대한 복수의 신호발생반응일 수 있다. 상이한 반응환경에서 수행되는 신호발생반응은 다양한 양태를 포함한다. 구체적으로, 상이한 반응환경에서 수행되는 신호발생반응은 기기가 서로 다른 반응, 반응 튜브 또는 웰이 서로 다른 반응, 샘플이 서로 다른 반응, 타겟 분석물질의 양이 서로 다른 반응, 프라이머 또는 프로브가 서로 다른 반응, 신호발생 염색제(dye)가 서로 다른 반응 또는 신호발생수단이 서로 다른 반응을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 복수의 신호발생반응은 서로 상이한 기기에서 수행되는 신호발생반응일 수 있다.
복수의 샘플을 이용하여 복수의 데이터 세트가 수득될 수 있다. 상기 복수의 샘플의 샘플들은 서로 상이할 수 있으며, 특히, 상기 복수의 샘플 중 적어도 2개는 서로 상이할 수 있다. 택일적으로 상기 복수의 샘플의 샘플들은 서로 동일할 수 있다.
기기간 편차는 각기 다른 기기에서 수행된 동일한 타겟 분석물질에 대한 신호발생반응에 의하여 수득한 별도의 데이터 세트들 간의 신호 편차일 수 있다. 택일적으로, 기기간 편차는 동일한 기기에서 수행된 동일한 타겟 분석물질에 대한 신호발생반응의 독립적인 실행에 의하여 수득한 별도의 데이터 세트들 간의 신호 편차일 수 있다. 예를 들어, 동일한 타겟 분석물질에 대한 신호발생반응의 독립적인 수행이 시간 간격을 두고 동일한 기기에서 진행될 수 있다. 이 경우, 기기의 독립적인 운영 각각은 각각 기기로 간주될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 신호발생반응은 별도의 반응용기에서 수행되는 동종의 타겟 분석물질에 대한 복수의 신호발생반응을 포함할 수 있으며, 상기 데이터 세트는 상기 복수의 신호발생반응에서 수득된 복수의 데이터 세트를 포함할 수 있다. 상기 복수의 신호발생반응은 별도의 반응용기에서 수행될 수 있다. 본 명세서에서 용어 “반응용기”는 샘플과 신호발생수단(예를 들어, 프라이머 또는 프로브)이 혼합되어 반응이 일어나는 용기 또는 장치의 일부분을 의미한다. 복수의 신호발생반응이 별도의 반응용기에서 수행될 수 있다는 것은 어떤 신호발생반응이 다른 신호발생반응을 위한 다른 샘플과 다른 신호발생수단과 분리된 샘플과 신호발생수단을 이용하여 수행된다는 것을 의미한다. 예를 들어, 복수의 튜브 또는 플레이트의 복수의 웰에서 수행되는 신호발생반응들은 상기 복수의 신호발생반응에 해당될 수 있다. 신호발생반응들이 동일한 반응용기에서 수행되지만, 시간을 달리하여 수행되는 경우도 역시 상기 복수의 신호발생반응에 해당될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 데이터 세트의 보정에 사용되는 분석물질-비의존적 신호값을 제공하기 전에 신호발생반응에 의하여 수득한 데이터 세트로부터 비정상 신호 (예를 들어, 스파이크 신호 또는 점프 에러)를 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
Step (b):
분석물질-비의존적 신호값을 적용하여 보정된 신호값을 수득하여 보정된 데이터 세트를 제공하는 단계 (S120)
보정된 데이터 세트를 데이터 세트의 신호값에 분석물질-비의존적 신호값을 적용하여 보정된 신호값을 수득하여 제공될 수 있다. 구체적으로, 보정된 데이터 세트는 데이터 세트의 복수의 데이터 지점들의 신호값에 분석물질-비의존적 신호값을 적용하여 보정된 신호값들을 수득하여 제공될 수 있다.
분석물질-비의존적 신호값은 다양한 방식에 의하여 데이터 세트의 신호값에 적용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (b)의 보정된 데이터 세트는 데이터 세트의 신호값들을 분석물질-비의존적 신호값으로 나누어 보정된 신호값을 수득하여 제공될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 보정된 신호값은 다음의 수학식 1에 의하여 제공될 수 있다:
수학식 1
보정된 신호값 = 신호값 / 분석물질-비의존적 신호값
상기 수학식 1의 신호값은 보정전 신호값이다. 상기 보정전 신호값은 분석물질-비의존적 신호값에 의하여 데이터 세트가 보정되기 전 데이터 세트의 신호값을 의미한다. 그러므로, 상기 보정전 신호값은 측정된 신호값이거나, 상기 측정된 신호값의 가공된 신호값일 수 있다. 상기 가공은 분석물질-비의존적 신호값을 이용한 보정과는 독립적으로 수행되는 절차이다. 예를 들어, 상기 신호값의 가공은 상기 신호값에 특정 값을 더하거나 빼는 방식으로 수행될 수 있다. 특히, 상기 가공은 측정된 신호값에서 블랭크 신호값의 전부 또는 일부를 차감하는 것 일 수 있다.
보정된 신호값은 분석물질-비의존적 신호값에 의하여 보정된 신호값을 의미한다. 보정된 데이터 세트는 데이터 세트의 신호값에 대한 보정된 신호값을 이용하여 제공될 수 있다.
택일적으로, 보정된 데이터 세트는 상기 보정된 신호값을 추가로 변형하여 제공될 수 있다. 예를 들어, 분석물질-비의존적 신호값에 의하여 보정된 신호값은 상기 보정된 신호값에 특정 값을 더하거나 차감하는 방법으로 추가 보정 될 수 있다. 구체적으로 상기 분석물질-비의존적 신호값에 의하여 보정된 신호값은 베이스라인 신호값을 차감하는 것으로 추가 보정 될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 (b)의 보정된 데이터 세트는 상기 데이터 세트의 신호값이 보정된 신호값들을 추가로 변형하여 제공될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 단계 (a) 이전에 샘플 내 타겟 핵산에 대한 데이터 세트를 수득하는 신호발생반응을 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 타겟 분석물질에 대한 데이터 세트는 샘플 내 타겟 분석물질의 존재 또는 부존재를 나타내는 정보를 가질 수 있다. 이 경우, 본 발명의 방법에서 제공되는 방법은 “샘플 내 타겟 분석물질의 존재 또는 부존재를 나타내는 데이터 세트의 보정 방법”으로 표현될 수 있다. 샘플 내 타겟 분석물질의 존재 또는 부존재를 나타내는 데이터 세트의 보정은 결국 샘플 내 타겟 분석물질의 존재 또는 부존재를 결정하기 위하여 수행된다. 용어 “샘플 내 타겟 분석물질의 존재 또는 부존재를 결정”한다는 것은 샘플 내 타겟 분석물질의 존재 또는 부존재를 정성적 또는 정량적으로 결정하는 것을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 보정된 데이터 세트는 샘플 내 타겟 분석물질의 정성적 또는 정량적 검출에 이용될 수 있다. 정성적 검출은 화학적 반응성, 용해도, 분자량, 용융점, 방사성 특성 (발광, 흡광), 질량 스펙트럼, 핵 반감기 등 화학적 또는 물리적 특성들에 기초하여 물질을 식별 또는 분류하는 분석을 의미한다. 정량적 검출은 분석물질의 양 또는 농도를 결정(예측) 하고, 이를 적절한 단위의 수치적 값으로 표현하는 분석을 의미한다.
II. 분석 대상 샘플로부터 수득한 데이터 세트에 의하여 제공되는 분석물질-비의존적 신호값을 이용한 타겟 분석물질에 대한 데이터 세트의 보정 방법
분석물질-비의존적 신호값은 분석 대상 샘플에 대한 신호발생반응으로부터 수득한 데이터 세트에 의하여 제공될 수 있다. 이 구현예에 의하면, 데이터 세트의 보정에 사용되는 신호값을 분석 대상 샘플을 위하여 수행되는 반응으로부터 직접 수득할 수 있으므로, 데이터 세트가 월등히 정확하게 보정될 수 있다.
신호발생반응들에 의한 데이터 세트들의 신호값들은 샘플 내 타겟 분석물질의 양에 의존적으로 변화될 수 있다. 예를 들어 실시간 PCR의 경우에는, 만일 타겟 핵산이 샘플 내에 부존재하는 경우, 전체 사이클에 걸쳐 거의 동일한 신호값을 가지는 데이터 세트가 얻어질 것이다. 반대로, 만일 타겟 핵산이 샘플 내에 존재하는 경우라면, 타겟 핵산의 존재 또는 그 양을 반영하는 신호값들을 가지는 데이터 세트가 얻어질 것이다.
한편, 샘플 내에 타겟 분석물질이 존재하여도, 데이터 세트의 일부 구간의 신호값들은 샘플 내 타겟 분석물질의 존재 또는 그 양에 거의 또는 전혀 영향을 받지 않을 수 있다. 예를 들어, 데이터 세트의 배경 지역에서 핵산 증폭 반응의 신호값의 수준은 양성 샘플과 음성 샘플 간에 서로 매우 유사하다. 데이터 세트의 배경 지역의 신호값들은 타겟 핵산의 존부 또는 그 양에 거의 또는 전혀 영향을 받지 않는다. 따라서, 복수의 데이터 세트들 간의 배경지역에서의 신호값의 차이는 기기간 편차 또는 하나의 기기 내에서의 웰간 편차를 반영할 수 있다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 샘플 내 타겟 분석물질에 대한 데이터 세트의 보정 방법을 제공한다:
(a) 상기 데이터 세트 보정을 위한 분석물질-비의존적 신호값을 제공하는 단계; 상기 데이터 세트는 신호발생수단을 이용한 상기 타겟 분석물질에 대한 신호발생반응으로부터 수득되며; 상기 데이터 세트는 상기 신호발생반응의 사이클들 및 신호값들을 포함하는 복수의 데이터 지점을 포함하며;
상기 분석물질-비의존적 신호값은 상기 데이터 세트의 기준 사이클에서의 신호값에 의하여 제공되며, 상기 기준 사이클은 데이터 세트 중 신호 발생이 샘플 내 타겟 분석물질의 존부에 비의존적인 배경 지역 내에서 선택되며; 및
(b) 분석물질-비의존적 신호값을 상기 데이터 세트의 신호값들에 적용하여 보정된 신호값들을 수득하여 보정된 데이터 세트를 제공하는 단계.
Step (a):
데이터 세트 보정을 위한 분석물질-비의존적 신호값을 제공하는 단계
본 발명에 따르면, 분석물질-비의존적 신호값은 데이터 세트의 배경지역-대표 신호값에 의하여 제공될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 배경지역-대표 신호값은 상기 데이터 세트의 기준 사이클에서의 신호값에 의하여 제공되며, 상기 기준 사이클은 데이터 세트 중 신호 발생이 샘플 내 타겟 분석물질의 존부에 비의존적인 배경 지역 내에서 선택된다.
본 명세서에서 용어 “배경지역-대표 신호값”(background-representing signal value)은 데이터 세트의 기저 신호 수준(basal signal level)을 나타내는 대표 신호값을 의미한다. 높은 수준의 배경지역-대표 신호값은 전체적으로 높은 기저 신호 수준을 가지는 데이터 세트로부터 나타나며, 낮은 수준의 배경지역-대표 신호값은 전체적으로 낮은 기저 신호 수준을 가지는 데이터 세트에 의해 나타난다. 따라서, 복수의 데이터 세트들을 자신의 배경지역-대표 신호값을 이용하여 보정하면, 상기 데이터 세트들 간의 신호값의 편차가 감소된다.
배경지역-대표 신호값은 다양한 방법으로 산출할 수 있다. 배경지역-대표 신호값은 타겟 분석물질의 존부에 독립적으로 결정되는 신호값이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 배경지역-대표 신호값은 특정 사이클에서의 신호값으로 결정될 수 있다. 상기 특정 사이클은 기준 사이클로 정의될 수 있다. 상기 특정 사이클은 데이터 세트의 기저 신호 수준을 나타내는 사이클 일 수 있다. 특히, 상기 특정 사이클은 증폭 반응의 배경지역 내 사이클들 중에서 선택될 수 있다.
복수의 데이터 세트들에 적용하기 위하여, 상기 배경지역-대표 신호값은 구체적으로 동일한 기준에 기초하여 결정된다. 동일한 기준에 의하여 결정된 배경지역-대표 신호값을 이용하여 보정하여야 데이터 세트들 간의 신호 편차를 감소시킬 수 있다.
상기 “기준”이라는 용어는 배경지역-대표 신호값을 결정하기 위한 기준점(benchmark)를 의미한다. 상기 기준은 상기 기준에 의하여 결정되는 배경지역-대표 신호값이 데이터 세트의 기저 신호 수준을 나타낼 수 있도록 결정될 수 있다. 상기 기준은 특정 사이클 번호(예를 들어 3사이클 또는 5사이클)의 사이클로 결정될 수 있다. 구체적으로, 상기 기준은 앞, 뒤 사이클들 간의 신호값의 변동이 거의 없는 사이클 또는 사이클 지역일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 배경지역-대표 신호값은 데이터 세트의 기준 사이클에서의 신호값에 의하여 제공될 수 있다.
기준 사이클은 데이터 세트의 사이클들 중에서 선택된다. 상기 기준 사이클은 복수의 데이터 지점들의 신호값들을 보정하기 위하여 사용되는 대표 신호값을 결정하기 위하여 선택되는 사이클이다.
기준 사이클은 사이클의 의미에 따라 기준 온도, 기준 농도 또는 기준 시간을 포함할 수 있다. 예를 들어, 사이클의 단위가 온도인 멜팅 커브 데이터 세트에서는 기준 온도가 기준 사이클일 수 있다. 멜팅 데이터 세트의 구현예에서, 용어 “기준 사이클” 및 “기준 온도”는 혼용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 기준 사이클은 샘플 내 타겟 분석물질의 존부에 비의존적인 신호가 발생되는 배경 지역에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 데이터 세트가 신호발생반응들에 의한 복수의 데이터 세트인 경우, 상기 기준 사이클은 각 데이터 세트의 기준 사이클 그룹에서 선택될 수 있으며, 상기 각 데이터 세트의 기준 사이클 그룹은 서로 동일한 방식으로 제공된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 기준 사이클은 각 데이터 세트의 기준 사이클 그룹에서 선택되며, 상기 기준 사이클 그룹은 동일한 조건에 기초하여 생성된다. 상기 동일한 기준은 모든 데이터 세트들에서 기준 사이클을 결정하는데 동일하게 적용될 수 있다.
상기 신호발생반응은 상이한 반응용기에서 수행되는 동종의 타겟 분석물질에 대한 복수의 신호발생반응일 수 있으며, 상기 데이터 세트는 상기 복수의 신호발생반응으로부터 수득한 복수의 데이터 세트를 포함할 수 있다. 상기 데이터 세트가 복수의 데이터 세트인 경우 각 데이터 세트의 기준 사이클 그룹은 서로 동일한 방식으로 제공될 수 있다. 상기 기준 사이클 그룹은 다양한 접근법으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 상기 기준 사이클 그룹은 신호값들의 수준이 유사하게 측정되는 사이클을 포함할 수 있다. 상기 기준 사이클 그룹은 신호값들의 수준이 실질적으로 동일한 증폭 구간 이전의 사이클을 포함할 수 있다. 상기 기준 사이클 그룹은 신호값들의 변동계수가 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%이내인 사이클을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 기준 사이클은 각 데이터 세트의 기준 사이클 그룹에서 선택될 수 있으며, 상기 각 데이터 세트의 기준 사이클 그룹은 서로 동일한 방식으로 제공된다. 상기 복수의 데이터 세트는 각 데이터 세트에 동일한 방식 (공통의 조건 또는 미리 결정된 기준)에 의하여 제공되는 기준 사이클 그룹에서 결정된 기준 사이클 또는 사이클들을 이용하여 보정될 수 있다.
기준 사이클 그룹은 단일 사이클일 수 있으며, 각 데이터 세트의 상기 단일 사이클의 번호는 서로 동일할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 복수의 데이터 세트의 보정을 위하여 동일한 기준 사이클이 제공될 수 있다. 데이터 세트가 복수의 데이터 세트인 경우, 동일한 기준 사이클에 상기 복수의 데이터 세트에 적용되고, 동일한 판단기준(criteria)에 의하여 분석될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 복수의 데이터 세트가 동일한 기준 사이클을 이용하여 보정될 수 있다.
내부 또는 상호 비교 분석에 사용되거나, 동일 임계값(threshold)와 같이 동일 판단기준(criteria)에 의하여 분석되는 데이터 세트들은 그 신호 편차가 최소화 되어야 한다. 동일 판단기준으로 분석되는 데이터 세트의 범위는 분석 목적에 따라 적절히 결정할 수 있으며, 이에 제한되지 아니하나, 예를 들어 동일 타겟 분석물질에 대한 복수의 데이터 세트, 동일 종류 샘플에 대한 복수의 데이터 세트, 동일 반응 혼합물(예를 들어, 동일 형광물질, 동일 프로브 등)을 사용하는 복수의 데이터 세트들은 각각 동일 판단기준으로 분석될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 데이터 세트가 복수의 데이터 세트인 경우, 기준 사이클에서의 신호값이 실질적으로 동일하다면, 상기 복수의 데이터 세트 중 적어도 2개의 데이터 세트는 서로 상이한 기준 사이클이 적용될 수 있다.
기준 사이클은 미리 결정된 사이클이거나, 실험에 의하여 결정될 수 있다. 상기 기준 사이클은 데이터 세트의 사이클들 중에서 선택될 수 있다. 구체적으로, 상기 기준 사이클은 데이터 세트에서 증폭 신호가 거의 검출되지 않는 구간의 사이클들 중에서 선택될 수 있다.
예를 들어, 데이터 세트가 핵산 증폭 반응에 의하여 수득되는 경우, 상기 기준 사이클은 배경신호 지역에서 선택되는 것이 바람직하다. 배경지역은 신호발생반응에서 증폭 신호가 충분히 검출되지 전의 초기 단계를 의미한다.
배경 지역은 다양한 방법으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 핵산 증폭 과정에 의하여 수득한 데이터 세트의 1차 미분한 결과에서 특정 임계값을 초과하는 기울기를 가지는 첫번째 데이터 지점의 사이클이 배경 지역의 마지막 사이클로 결정될 수 있다. 또는 핵산 증폭 과정에 의하여 수득한 데이터 세트의 1차 미분한 결과에서 첫번째 피크의 시작 사이클을 배경 지역의 마지막 사이클로 결정될 수 있다. 또는 곡률이 최대가 되는 데이터 지점을 배경 지역의 마지막 사이클로 결정할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 신호값의 증폭 반응은 배경 지역 및 신호 증폭 지역의 신호값을 모두 제공할 수 있으며, 기준 사이클은 상기 배경 지역에서 선택될 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 신호발생반응은 PCR 또는 실시간 PCR이며, 기준 사이클은 PCR 또는 실시간 PCR의 신호 증폭 구간 이전의 배경 지역에서 선택될 수 있다. 동일한 타겟에 대하여 동일한 조건에서 PCR 또는 실시간 PCR을 수행하여 수득한 데이터 세트는 초기 배경 지역의 신호값이 이론적으로 동일하거나, 적어도 유사한 값을 가져야 한다. 그 이유는 초기 배경 지역의 신호값은 타겟 분석물질의 농도와 무관하게 타겟 분석물질에 의하여 발생하는 신호값의 수준이 매우 낮기 때문이다. 따라서, 상기 기준 사이클은 배경 지역 내에서 선택되는 것이 바람직하다.
그러므로, 상기 기준 사이클은 50, 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9 또는 8 번째 사이클 이하일 수 있다. 본 발명의 기준 사이클은 초기 노이즈 신호를 피하여 선택될 수 있다. 상기 기준 사이클은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 번째 사이클 이상일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 상기 기준 사이클은 배경 지역에 위치하는 1-30 사이클, 2-30 사이클, 2-20 사이클, 2-15 사이클, 2-10 사이클, 2-8 사이클, 3-30 사이클, 3-20 사이클, 3-15 사이클, 3-10 사이클, 3-9 사이클, 3-8 사이클, 4-8 사이클 또는 5-8 사이클로부터 결정될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 기준 사이클은 하나의 기준 사이클 일 수 있다. 하나의 사이클이 기준 사이클로 이용될 수 있으며, 데이터 세트의 기준 사이클에서의 신호값이 배경지역-대표 신호값을 제공하기 위하여 이용될 수 있다. 택일적으로, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 기준 사이클은 적어도 2개의 기준 사이클을 포함할 수 있다.
기준 사이클은 적어도 2개의 기준 사이클을 포함할 수 있으며, 데이터 세트에서 기준 사이클에 해당하는 신호값은 적어도 2개의 신호값들을 포함할 수 있다.
보정을 위한 배경지역-대표 신호값은 상기 적어도 2개의 기준 사이클에 대응하는 사이클들에서의 신호값들로부터 계산된 신호값을 이용하여 제공될 수 있다. 예를 들어 기준 사이클을 4, 5 및 6 번째 사이클로 지정하고, 데이터 세트의 4, 5 및 6번째 사이클의 신호값의 평균을 배경지역-대표 신호값을 제공하는데 이용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 기준 사이클이 데이터 세트의 일정 범위의 사이클들 내에서 선택되는 경우, 상기 기준 사이클은 동일 판단 기준으로 분석되는 데이터 세트들에서는 그 신호값이 동일하거나, 적어도 유사한 값을 가지는 사이클들 중에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 복수의 데이터 세트의 배경지역-대표 신호값들은 동일한 기준 사이클을 이용하여 제공될 수 있다. 각 데이터 세트에 적용되는 배경지역-대표 신호값은 동일한 기준 사이클을 이용하여 독립적으로 결정될 수 있다. 각 배경지역-대표 신호값이 동일한 기준 사이클을 이용하여 복수의 데이터 세트로부터 계산되는 경우, 상기 복수의 데이터 세트들 사이의 배경지역-대표 신호값들의 편차는 상기 복수의 데이터 세트들 사이의 신호 편차를 반영한다. 따라서, 데이터 세트들을 상기 배경지역-대표 신호값들을 이용하여 보정하는 경우, 상기 복수의 데이터 세트들 간의 신호 편차가 감소될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 (a)의 데이터 세트는 변형된 데이터 세트일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 데이터 세트는 원시 데이터 세트의 변형된 데이터 세트일 수 있다. 상기 변형은 수학적 변형일 수 있다. 상기 변형은 분석 목적에 따라 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 변형은 특정 양의 신호값을 제거하거나, 블랭크 신호를 제거하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 (a)의 데이터 세트는 블랭크 신호가 제거된 데이터 세트 일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 블랭크 신호는 신호발생수단의 사용 없이 수득한 신호값일 수 있다.
Step (b):
배경지역-대표 신호값을 데이터 세트의 신호값에 적용하여 보정된 신호값을 수득하여 보정된 데이터 세트를 제공하는 단계
보정된 데이터 세트는 데이터 세트의 신호값들에 배경지역-대표 신호값을 적용하여 보정된 신호값을 수득하여 제공될 수 있다. 특히, 보정된 데이터 세트는 데이터 세트의 복수의 데이터 지점의 신호값들에 배경지역-대표 신호값을 적용하여 보정된 신호값들을 수득하여 제공될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 보정된 데이터 세트는 배경지역-대표 신호값으로 데이터 세트의 신호값들을 나누어 보정된 신호값들을 수득하여 제공될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 보정된 신호값들은 다음의 수학식2에 의하여 제공될 수 있다:
수학식 2
보정된 신호값 = 신호값 / 배경지역-대표 신호값
상기 수학식 2의 신호값은 보정전 신호값이다. 상기 보정전 신호값은 측정된 신호값이거나, 상기 측정된 신호값의 가공된 신호값일 수 있다. 상기 가공은 배경지역-대표 신호값을 이용한 보정과는 독립적으로 수행되는 절차이다. 예를 들어, 상기 신호값의 가공은 상기 신호값에 특정 값을 더하거나 빼는 방식으로 수행될 수 있다. 특히, 상기 가공은 측정된 신호값에서 블랭크 신호값의 전부 또는 일부를 차감하는 것 일 수 있다.
상기 데이터 세트의 신호값에 대한 보정된 신호값에 의하여 보정된 데이터 세트가 제공될 수 있다.
택일적으로, 상기 보정된 데이터 세트는 상기 데이터 세트의 신호값에 대한 보정된 신호값을 추가로 변형하여 제공될 수 있다.
택일적으로, 상기 보정된 신호값은 배경지역-대표 신호값을 적용하고, 추가 변형을 하여 제공될 수 있다.
상기 데이터 세트가 복수의 데이터 세트인 경우, 상기 추가 변형은 상기 복수의 데이터 세트에 동일한 방식으로 적용될 수 있다.
III. 별도의 물질로부터 수득한 데이터 세트에 의하여 제공된 분석물질-비의존적 신호값을 이용한 타겟 분석물질에 대한 데이터 세트의 보정 방법
분석물질-비의존적 신호값은 분석 대상 샘플이 아닌, 별도의 물질로부터 수득한 데이터 세트에 의하여 제공될 수 있다. 분석물질-비의존적 신호값이 분석 대상 샘플이 아닌 별도의 물질로부터 수득되는 경우에는 분석물질-비의존적 신호값을 산출하기 위한 신호발생반응이 샘플에 대한 신호발생반응이 수행된 반응용기와 상이한 별도의 반응용기에서 수행되므로, 분석물질-비의존적 신호값에 대한 분석물질의 영향을 방지할 수 있다.
상기 별도의 물질은 각 반응의 반응 환경을 반영하는 신호를 발생시키는 한, 어떠한 물질도 가능하다. 상기 별도의 물질은 샘플 내 타겟 분석물질과 동일한 물질일 수 있으며, 또는 샘플 내 타겟 분석물질과 상이한 물질일 수 있다.
다음과 같은 방식으로, 실질적으로 동일한 표준 물질을 이용하여 상이한 반응용기(예를 들어, 상이한 기기)로부터 수득한 각 데이터 세트를 보정할 수 있다: 우선, 각 반응용기에서 수행되는 신호발생반응으로부터 데이터 세트를 수득하고, 실질적으로 동일한 표준물질을 이용하여 각 반응용기에서 수행된 신호발생반응으로부터 분석물질-비의존적 신호값을 제공하기 위한 데이터 세트를 수득한다. 그리고, 동일한 표준물질을 이용하여 수득한 상기 데이터 세트에 의하여 제공되는 분석물질-비의존적 데이터 세트를 적용하여 각 반응용기에 대한 데이터 세트를 보정한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 샘플 내 타겟 분석물질의 보정 방법을 제공한다:
(a) 상기 데이터 세트 보정을 위한 분석물질-비의존적 신호값을 제공하는 단계; 상기 데이터 세트는 신호발생수단을 이용한 상기 타겟 분석물질에 대한 신호발생반응으로부터 수득되며; 상기 데이터 세트는 상기 신호발생반응의 사이클들 및 상기 사이클들에서의 신호값들을 포함하는 복수의 데이터 지점을 포함하며; 상기 분석물질-비의존적 신호값은 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값에 의하여 제공되며; 상기 표준 데이터 세트는 타겟 분석물질의 표준 물질에 대한 신호발생반응에 의하여 수득되며; 및
(b) 상기 분석물질-비의존적 신호값을 상기 데이터 세트의 신호값들에 적용하여 보정된 신호값들을 수득하여 보정된 데이터 세트를 제공하는 단계.
상기 분석물질-비의존적 신호값은 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값에 의하여 다양한 접근법으로 제공될 수 있다. 예를 들어, 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값 자체가 분석물질-비의존적 신호값으로 지정될 수 있다. 또는, 상기 총 신호 변화값의 변형된 값이 분석물질-비의존적 신호값으로 지정될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 분석물질-비의존적 신호값은 타겟 분석물질의 표준 물질에 대한 신호발생반응에 의하여 수득한 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값일 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 타겟 분석물질에 대한 데이터 세트를 보정하는 방법을 제공한다:
(a) 상기 데이터 세트 보정을 위한 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값을 제공하는 단계; 상기 데이터 세트는 신호발생수단을 이용한 상기 타겟 분석물질에 대한 신호발생반응으로부터 수득되며; 상기 데이터 세트는 상기 신호발생반응의 사이클들 및 신호값들을 포함하는 복수의 데이터 지점을 포함하며; 상기 분석물질-비의존적 신호값은 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값에 의하여 제공되며; 상기 표준 데이터 세트는 타겟 분석물질의 표준 물질에 대한 신호발생반응에 의하여 수득되며; 및
(b) 상기 총 신호 변화값을 상기 데이터 세트의 신호값들에 적용하여 보정된 신호값들을 수득하여 보정된 데이터 세트를 제공하는 단계.
Step (a):
데이터 세트 보정을 위한 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값을 제공하는 단계
본 발명의 일 구현예에 따르면, 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값이 데이터 세트 보정을 위하여 제공된다. 상기 표준 데이터 세트는 타겟 분석물질의 표준 물질에 대한 신호발생반응에 의하여 수득된다.
본 명세서에서 용어 “표준 물질”은 표준 데이터 세트를 제공할 수 있는 물질을 의미한다. 상기 표준 데이터 세트는 분석물질-비의존적 신호값을 제공하기 위하여 상기 표준 물질을 이용한 신호발생반응을 통하여 수득한 데이터 세트이다.
상기 표준 물질은 동일 반응 조건하에서 수행되는 신호발생반응들에 적용되는 경우 실질적으로 동일한 수준의 신호값을 발생시키는 물질일 수 있다. 표준 물질은 타겟 분석물질과 동종의 물질일 수 있다. 특히, 복수의 반응용기에 적용된 상기 표준 물질은 동일한 농도를 가질 수 있다. 상기 표준 물질이 농도가 알려진 것일 것은 중요하다. 하지만, 복수의 반응에 동일한 농도의 표준 물질이 적용되는 한 상기 표준 물질이 반드시 농도가 알려진 것일 필요는 없다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 표준 데이터 세트는 농도가 알려진 타겟 분석물질에 대한 신호발생반응을 수행하여 얻어진 데이터 세트일 수 있다.
표준 데이터 세트는 타겟 분석물질에 대한 표준 물질을 이용하여 수득한 데이터 세트를 의미한다. 상기 표준 데이터 세트는 샘플 내 타겟 분석물질이 분석되는 반응 환경을 반영하는 데이터 세트이다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 표준 데이터 세트는 타겟 분석물질에 대한 신호발생반응으로부터 데이터 세트를 수득할 때 사용한 것과 동일한 반응 자리를 이용하여 수득할 수 있다.
상기 반응자리(reaction site)는 샘플에 대한 반응 또는 실험이 수행되는 물리적 공간을 말한다. 상기 반응자리는 기기(예를 들어, PCR기기) 및 기기의 일부(예를 들어, PCR 기기에 형성된 반응웰)를 포함할 수 있다. 상기 반응자리는 PCR 증폭과 같은 타겟 분석물질 검출을 위하여 형성된다.
상기 표준 데이터 세트는 타겟 분석물질에 대한 신호발생반응으로부터 데이터 세트를 얻기 위하여 사용된 것과 동일한 웰 또는 기기를 사용하여 수득할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 표준 데이터 세트는 보정대상인 타겟 분석물질에 대한 데이터 세트와 별도로 얻어질 수 있다. 샘플 내 타겟 분석물질에 대한 데이터 세트와 동일한 반응 조건에서 표준 데이터 세트가 수득되는 경우, 표준 데이터 세트를 위한 신호발생반응은 반드시 샘플 내 타겟 분석물질을 검출하고자 하는 신호발생반응과 동시에 수행될 필요는 없다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 표준 데이터 세트는 보정하려는 데이터 세트와 동시에 수득될 수 있다. 이 경우 상기 표준 데이터 세트는 샘플 내 타겟 분석물질에 대한 데이터 세트가 수득되는 반응 조건과 동일한 반응 조건에서 반응이 수행되어 수득 될 수 있다. 이로서 기기를 사용할 때마다 나타나는 신호의 변화를 보상하기 위한 미세한 보정도 가능하다.
동일한 조건에서 동일한 신호발생반응이 수행되는 경우 이론적으로 일정한 값을 가지는 요소를 공통 요소(common factor)라 한다. 상기 공통 요소는 예를 들어 총 신호 변화값, 임계값(threshold)이상의 신호값을 가지는 첫번째 데이터 지점의 사이클 수 또는 베이스라인 구간의 사이클에서의 신호값일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 데이터 세트는 공통 요소의 하나인 총 신호 변화값을 이용하여 보정될 수 있다. 본 명세서에서 용어 “총 신호 변화값”은 데이터 세트의 신호 변화량(증가량 또는 감소량)을 의미한다. 상기 총 신호 변화값은 전체 데이터 세트의 신호 변화량(증가량 또는 감소량)일 수 있으며, 또는 데이터 세트의 일부 구간의 신호 변화량(증가량 또는 감소량)일 수 있다. 예를 들어, 상기 총 신호 변화값은 데이터 세트에서 신호의 변화가 가장 큰 사이클의 신호 변화값일 수 있다. 구체적으로, 상기 총 신호 변화값은 데이터 세트의 베이스라인의 신호값과 최대 신호값의 차이일 수 있으며, 또는 데이터 세트의 베이스라인의 신호값과 마지막 사이클의 신호값의 차이일 수 있다.
한편, 총 신호 변화값이 데이터 세트의 일부 구간에서 결정되는 경우, 상기 총 신호 변화값은 상기 일부 구간의 첫번째 사이클과 마지막 사이클의 신호값의 차이일 수 있으며, 또는 상기 일부 구간에서 최대 신호값과 최소 신호값의 차이일 수 있다. 동일한 조건에서 타겟 분석물질에 대한 표준 물질에 대한 신호발생반응이 수행된다면, 신호발생반응이 동일한 기기에서 수행되거나 또는 상이한 기기에서 수행되더라도 이론적으로 일정한 총 신호 변화값이 수득되어야 한다. 그러므로, 복수의 데이터 세트간의 신호 편차는 상기 총 신호 변화값에 기반한 보정에 의하여 감소될 수 있다.
총 신호 변화값(TSC)은 배경지역의 신호값과 증폭된 산물의 신호값의 차이이다. 표준 물질을 이용한 복수의 신호발생반응이 동일한 반응 환경 (예를 들어, 동일한 프라이머 또는 프로브 등)에서 수행되는 경우, 표준 물질의 농도의 차이가 있어도 TSC는 동일한 값을 가질 것이다.
그러므로, 복수의 데이터 세트가 TSC에 의하여 보정되는 경우, 상기 표준 물질은 반드시 동일한 농도가 사용될 필요가 없다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 신호발생반응은 상이한 반응용기에서 수행되는 동종의 타겟 분석물질에 대한 복수의 신호발생반응 일 수 있으며, 데이터 세트는 상기 복수의 신호발생반응에서 수득한 복수의 데이터 세트일 수 있다.
상기 복수의 데이터 세트는 복수의 샘플을 이용하여 수득될 수 있다. 상기 복수의 샘플은 서로 상이한 샘플일 수 있으며, 구체적으로, 상기 복수의 샘플 중 적어도 2개의 샘플은 서로 상이한 샘플일 수 있다. 택일적으로 상기 복수의 샘플은 모두 동일한 샘플일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 복수의 데이터 세트의 각 데이터 세트에 대한 개별 표준 데이터 세트가 제공될 수 있으며, 개별 총 신호 변화값이 제공될 수 있다. 상기 개별 표준 데이터 세트는 타겟 분석물질의 동일한 표준 물질에 대한 개별 신호발생반응에 의하여 수득될 수 있다.
샘플 내 타겟 분석물질에 대한 데이터 세트가 복수의 데이터 세트인 경우, 상기 복수의 데이터 세트의 보정을 위하여 복수의 데이터 세트의 각 데이터 세트에 대한 개별 표준 데이터 세트가 제공될 수 있다. 상기 개별 표준 데이터 세트는 상기 복수의 데이터 세트의 각 데이터 세트와 동일한 반응 조건 하에서 타겟 분석물질에 대한 표준 물질을 이용하여 수득될 수 있다.
상기 복수의 데이터 세트에 대한 각 표준 데이터 세트를 제공하기 위하여 사용되는 표준 물질은 동일한 표준물질 일 수 있다.
동일한 표준물질을 이용하여 개별 표준 데이터 세트를 수득하고, 상기 복수의 데이터 세트를 상기 복수의 데이터 세트 각각에 대한 개별 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값을 이용하여 보정하여, 상기 복수의 데이터 세트들 간의 신호 편차를 감소시킬 수 있다. 복수의 데이터 세트 각각은 타겟 분석물질의 표준 물질에 대한 신호발생반응에 의하여 수득한 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값에 의하여 보정될 수 있다.
상기 복수의 데이터 세트를 보정하기 위한 상기 총 신호 변화값은 각 데이터 세트의 반응 조건에 따라 서로 상이할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 데이터 세트가 2 이상의 데이터 세트인 경우, 적어도 2개의 데이터 세트에 대한 적어도 2개의 총 신호 변화값은 서로 상이할 수 있다.
한편, 복수의 데이터 세트 중에서, 동일한 반응 조건에서 수행된 신호발생반응에 의하여 수득한 데이터 세트들은 동일한 총 신호 변화값에 의하여 보정될 수 있다. 따라서, 복수의 데이터 세트는 적어도 2개의 그룹으로 분류될 수 있으며, 각 그룹의 데이터 세트를 보정하기 위한 개별 총 신호 변화값이 제공될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 복수의 데이터 세트는 적어도 2개의 데이터 세트 그룹으로 분류되며, 각 데이터 세트 그룹을 보정하기 위하여 각각 독립적인 총 신호 변화값이 제공되며; 상기 각 데이터 세트 그룹은 1 이상의 데이터 세트를 포함할 수 있다.
상기 복수의 데이터 세트는 다양한 기준에 의하여 동일한 그룹으로 분류될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 동일한 반응 환경에 의하여 수득한 데이터 세트는 동일한 그룹으로 분류될 수 있다. 예를 들어, 동일한 반응용기 또는 동일한 기기로부터 수득한 데이터 세트들 또는 동일한 배치 번호의 시약들을 이용한 신호발생반응에 의하여 수득한 데이터 세트들은 동일한 그룹으로 분류될 수 있다. 동일한 그룹에 속하는 데이터 세트들은 동일한 TSC에 의하여 보정되고, 상이한 그룹에 속하는 데이터 세트들은 상이한 TSC에 의하여 보정될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 복수의 데이터 세트 각각을 보정하기 위하여 대표 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값이 동일하게 제공될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 복수의 데이터 세트에 대한 대표 표준 데이터 세트가 제공될 수 있다. 상기 데이터 세트가 복수의 데이터 세트인 경우, 단일 대표 표준 데이터 세트가 상기 복수의 데이터 세트에 적용될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 복수의 데이터 세트는 단일 대표 표준 데이터 세트를 이용하여 보정될 수 있다.
동일한 반응 조건에서 수행되는 신호발생반응들에 의하여 얻어진 데이터 세트들의 그룹은 동일한 표준 데이터 세트 다시 말해, 대표 표준 데이터 세트에 의하여 보정될 수 있다. 상기 대표 표준 데이터 세트는 다른 반응 조건에서 수행되는 신호발생반응에 의하여 얻어진 표준 데이터 세트와 상이하며, 상기 다른 표준 데이터 세트는 다른 그룹의 데이터 세트들에 적용될 수 있다. 따라서, 서로 상이한 그룹의 데이터 세트들 간의 편차는 각 데이터 세트의 그룹에 해당하는 각 표준 데이터 세트를 적용하여 감소될 수 있다.
동일한 그룹에 속하는 모든 데이터 세트를 보정하기 위하여 하나의 대표 표준 데이터 세트를 적용하면 동일 그룹에 속하는 데이터 세트 각각에 대한 개별 표준 데이터 세트를 준비하기 위한 시간과 노력이 소비되는 것을 피할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)의 데이터 세트는 변형된 데이터 세트일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 데이터 세트는 원시 데이터 세트의 변형된 데이터 세트일 수 있다. 상기 변형은 수학적 변형(mathematical modification)일 수 있다.
상기 변형은 분석 목적에 따라 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 변형은 일정 신호값의 제거 또는 블랭크 신호의 제거 일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 (a)의 데이터 세트는 블랭크 신호가 제거된 데이터 세트 일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 블랭크 신호는 신호발생수단 없이 수득한 신호값일 수 있다.
Step (b):
표준 데이터 세트의 총 신호 변화값을 데이터 세트의 신호값에 적용하여 보정된 신호값을 수득하여 보정된 데이터 세트를 제공하는 단계
표준 데이터 세트의 총 신호 변화값을 데이터 세트의 신호값에 적용하여 보정된 신호값을 수득하여 보정된 데이터 세트를 제공할 수 있다. 구체적으로, 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값을 데이터 세트의 복수의 데이터 지점의 신호값들에 적용하여 보정된 신호값들을 수득하여 보정된 데이터 세트를 제공할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 보정된 데이터 세트는 데이터 세트의 신호값들을 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값으로 나누어 보정된 신호값들을 수득하여 제공할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 보정된 신호값들은 다음의 수학식 3에 의하여 제공될 수 있다.
수학식 3
보정된 신호값 = 신호값 / 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값
상기 수학식 3의 신호값은 보정전 신호값이다.
상기 보정전 신호값은 측정된 신호값이거나, 상기 측정된 신호값의 가공된 신호값일 수 있다. 상기 가공은 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값을 이용한 보정과는 독립적으로 수행되는 절차이다. 예를 들어, 상기 신호값의 가공은 상기 신호값에 특정 값을 더하거나 빼는 방식으로 수행될 수 있다. 특히, 상기 가공은 측정된 신호값에서 블랭크 신호값의 전부 또는 일부를 차감하는 것 일 수 있다.
상기 데이터 세트의 신호값에 대한 보정된 신호값에 의하여 보정된 데이터 세트가 제공될 수 있다.
택일적으로, 상기 보정된 데이터 세트는 상기 데이터 세트의 신호값에 대한 보정된 신호값을 추가로 변형하여 제공될 수 있다. 예를 들어, 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값에 의하여 보정된 데이터 세트는 상기 보정된 데이터 세트로부터 특정 양의 신호를 더하거나 빼는 방식으로 추가로 보정될 수 있다.
택일적으로, 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값에 의하여 보정된 데이터 세트는 여기에 특정 값을 곱하거나 나누는 방식으로 추가로 보정될 수 있다. 상기 특정 값은 뒤에 상세히 설명할 기준 총 신호 변화값(reference total signal change value; R-TSC)일 수 있다. 상기 데이터 세트가 복수의 데이터 세트인 경우, 상기 복수의 데이터 세트에 적용될 상기 특정 값은 동일한 값 일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 보정된 신호값은 데이터 세트의 신호값들에 보정 계수(calibration coefficient)를 적용하여 제공될 수 있으며, 상기 보정 계수는 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값과 기준 총 신호 변화값 사이의 관계를 정하여 제공될 수 있으며, 상기 기준 총 신호 변화값은 임의로 정해진 값일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 데이터 세트의 신호값들은 데이터 세트의 신호값들에 보정 계수를 적용하여 보정될 수 있다.
상기 보정 계수는 보정을 위하여 데이터 세트의 복수의 데이터 지점에 적용되는 값이다. 상기 데이터 세트의 복수의 데이터 지점의 신호값들에 상기 보정 계수를 적용하여 보정된 데이터 세트를 제공할 수 있다.
상기 보정 계수는 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값과 기준 총 신호 변화값 사이의 관계를 정하여 제공될 수 있다. 상기 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값과 기준 총 신호 변화값 사이의 관계는 다양한 방법으로 나타낼 수 있으며, 예를 들어 상기 관계는 수학적으로 정의될 수 있다. 구체적으로, 상기 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값과 기준 총 신호 변화값 사이의 관계는 상기 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값과 기준 총 신호 변화값의 차이(difference)일 수 있다. 구체적으로, 상기 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값과 기준 총 신호 변화값 사이의 관계는 상기 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값과 기준 총 신호 변화값의 비율(ratio)일 수 있다.
기준 총 신호 변화값은 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값과 비교하여 보정 계수를 결정하는데 사용되는 값을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 기준 총 신호 변화값은 타겟 분석물질에 대한 신호발생반응으로부터 데이터 세트를 수득하는데 사용되는 것과는 다른 반응 자리에서 수행된 신호발생반응으로부터 수득한 데이터 세트를 포함하는 1 이상의 데이터 세트로부터 결정될 수 있다.
구체적으로, 상기 기준 총 신호 변화값은 타겟 분석물질에 대한 신호발생반응으로부터 데이터 세트를 수득하는데 사용되는 것과는 다른 반응 자리에서 수행된 신호발생반응으로부터 수득한 데이터 세트를 타겟 분석물질에 대한 신호발생반응으로부터 데이터 세트를 수득하는데 사용되는 것과는 동일한 반응 자리에서 수행된 신호발생반응으로부터 수득한 데이터 세트와 함께 사용하여 결정될 수 있다.
보다 구체적으로 상기 기준 총 신호 변화값은 타겟 분석물질에 대한 신호발생반응으로부터 데이터 세트를 수득하는데 사용된 반응 자리와 상이한 반응 자리를 이용한 신호발생반응으로부터 수득한 데이터 세트에 의하여 결정될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 기준 총 신호 변화값은 미리 결정된 총 신호 변화값 일 수 있다. 상기 기준 총 신호 변화값은 기준 (또는 표준) 용기 또는 기기를 이용하여, 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값을 수득할 때와 실질적으로 동일한 표준 물질을 이용하여 수득할 수 있다.
본 발명의 상기 기준 총 신호 변화값은 타겟 분석물질의 표준 물질에 대한 신호발생반응으로부터 수득한 데이터 세트에 의하여 결정될 수 있다. 택일적으로, 본 발명의 상기 기준 총 신호 변화값은 타겟 분석물질의 표준 물질에 대한 복수의 신호발생반응으로부터 수득한 복수의 데이터 세트의 총 신호 변화값들로부터 계산될 수 있다. 이 경우 상기 기준 총 신호 변화값은 타겟 분석물질의 표준 물질에 대한 복수의 신호발생반응으로부터 수득한 복수의 데이터 세트의 총 신호 변화값들의 평균 또는 중간값으로 결정되거나, 실험자가 타겟 분석물질의 표준 물질에 대한 복수의 신호발생반응의 결과를 기초로 미리 결정한 값일 수 있다.
택일적으로, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 표준 데이터 세트가 복수의 표준 데이터 세트인 경우, 상기 기준 총 신호 변화값은 상기 복수의 표준 데이터 세트로부터 결정될 수 있다. 예를 들어, 상기 복수의 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값 중 하나가 기준 총 신호 변화값으로 결정될 수 있다. 또는 상기 복수의 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값들의 평균 또는 중간값이 상기 기준 총 신호 변화값으로 결정될 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 샘플 내 타겟 분석물질에 대한 데이터 세트의 보정 방법을 제공한다:
(a) 상기 데이터 세트 보정을 위한 보정 계수(calibration coefficient)를 제공하는 단계; 상기 데이터 세트는 신호발생수단을 이용한 상기 타겟 분석물질에 대한 신호발생반응으로부터 수득되며; 상기 데이터 세트는 상기 신호발생반응의 사이클들 및 신호값들을 포함하는 복수의 데이터 지점을 포함하며; 상기 보정 계수는 (i) 타겟 분석물질의 표준 물질에 대한 신호발생반응에 의하여 수득한 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값의 (ii) 미리 결정된 기준 총 신호 변화값에 대한 비율에 의하여 제공되며; 및
(b) 상기 보정 계수를 상기 데이터 세트의 신호값들에 적용하여 보정된 신호값들을 수득하여 보정된 데이터 세트를 제공하는 단계.
상기 데이터 세트에서 블랭크 신호값을 제거하고, 상기 블랭크 신호값이 제거된 데이터 세트에 상기 보정 계수를 적용하여 데이터 세트를 보정할 수 있다. 본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 샘플 내 타겟 분석물질에 대한 데이터 세트의 보정 방법을 제공한다:
(a) 상기 데이터 세트로부터 블랭크 신호값을 감소시켜 블랭크 신호값이 감소된 1차 보정 데이터 세트를 제공하는 단계; 상기 데이터 세트는 신호발생수단을 이용한 상기 타겟 분석물질에 대한 신호발생반응으로부터 수득되며; 상기 데이터 세트는 상기 신호발생반응의 사이클들 및 신호값들을 포함하는 복수의 데이터 지점을 포함하며;
(b) 상기 데이터 세트 보정을 위한 보정 계수를 제공하는 단계; 상기 보정 계수는 (i) 타겟 분석물질의 표준 물질에 대한 신호발생반응에 의하여 수득한 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값의 (ii) 미리 결정된 기준 총 신호 변화값에 대한 비율에 의하여 제공되며; 및
(c) 상기 1차 보정 데이터 세트의 신호값들에 상기 보정 계수를 적용하여 보정된 신호값들을 수득하여 2차 보정 데이터 세트를 제공하는 단계.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 방법은 상기 단계 (a) 이전에 샘플 내 타겟 분석물질에 대한 데이터 세트를 수득하기 위하여 신호발생반응을 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 데이터 세트는 샘플 내 상기 타겟 분석물질의 존재 또는 부존재를 나타내는 정보를 가질 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 보정된 데이터 세트는 샘플 내 타겟 분석물질의 정성적 또는 정량적 검출에 이용되는 것일 수 있다.
IV. 기록 매체, 장치 및 컴퓨터 프로그램
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명의 샘플 내 타겟 분석물질에 대한 데이터 세트의 보정 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 지시를 포함하는 컴퓨터 해독 가능한 기록매체를 제공하며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 상기 데이터 세트 보정을 위한 분석물질-비의존적 신호값을 제공하는 단계; 상기 데이터 세트는 신호발생수단을 이용한 상기 타겟 분석물질에 대한 신호발생반응으로부터 수득되며; 상기 데이터 세트는 상기 신호발생반응의 사이클들 및 신호값들을 포함하는 복수의 데이터 지점을 포함하며; 상기 분석물질-비의존적 신호값은 (i) 상기 데이터 세트의 배경지역-대표 신호값에 의하여; 또는 (ii) 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값에 의하여 제공되며; 상기 배경지역-대표 신호값은 상기 데이터 세트의 기준 사이클에서의 신호값에 의하여 제공되며, 상기 기준 사이클은 데이터 세트에서 샘플 내 타겟 분석물질의 존부에 비의존적으로 신호가 발생하는 배경지역 내에서 선택되며; 상기 표준 데이터 세트는 타겟 분석물질의 표준물질에 대한 신호발생반응에 의하여 제공되며; 및
(b) 상기 분석물질-비의존적 신호값을 상기 데이터 세트의 신호값들에 적용하여 보정된 신호값들을 수득하여 보정된 데이터 세트를 제공하는 단계.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명의 샘플 내 타겟 분석물질에 대한 데이터 세트 보정 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는, 컴퓨터 해독 가능한 기록매체에 저장되는 컴퓨터 프로그램을 제공하며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 상기 데이터 세트 보정을 위한 분석물질-비의존적 신호값을 제공하는 단계; 상기 데이터 세트는 신호발생수단을 이용한 상기 타겟 분석물질에 대한 신호발생반응으로부터 수득되며; 상기 데이터 세트는 상기 신호발생반응의 사이클들 및 신호값들을 포함하는 복수의 데이터 지점을 포함하며; 상기 분석물질-비의존적 신호값은 (i) 상기 데이터 세트의 배경지역-대표 신호값에 의하여; 또는 (ii) 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값에 의하여 제공되며; 상기 배경지역-대표 신호값은 상기 데이터 세트의 기준 사이클에서의 신호값에 의하여 제공되며, 상기 기준 사이클은 데이터 세트에서 샘플 내 타겟 분석물질의 존부에 비의존적으로 신호가 발생하는 배경지역 내에서 선택되며; 상기 표준 데이터 세트는 타겟 분석물질의 표준물질에 대한 신호발생반응에 의하여 제공되며; 및
(b) 상기 분석물질-비의존적 신호값을 상기 데이터 세트의 신호값들에 적용하여 보정된 신호값들을 수득하여 보정된 데이터 세트를 제공하는 단계.
프로그램 지시들은 프로세서에 의하여 실행될 때, 프로세서가 상술한 본 발명의 방법을 실행하도록 한다. 상기 샘플 내 타겟 분석물질에 대한 데이터 세트의 보정 방법에 대한 프로그램 지시들은 데이터 세트 보정을 위한 분석물질-비의존적 신호값을 제공하는 지시 및 상기 분석물질-비의존적 신호값을 상기 데이터 세트의 신호값들에 적용하여 보정된 신호값을 수득하여 보정된 데이터 세트를 제공하는 지시를 포함할 수 있다.
상기 기술한 본 발명의 방법은 독립 실행형 컴퓨터, 네트워크 부착 컴퓨터 또는 실시간 PCR 장치와 같은 데이터 수집 장치에 있는 프로세서와 같은 프로세서에 내장될 수 있다.
컴퓨터 해독가능한 기록매체는 당업계에 공지된 다양한 저장 매체, 예를 들어, CD-R, CD-ROM, DVD, 플래쉬 메모리, 플로피 디스크, 하드 드라이브, 포터블 HDD, USB, 마그네틱 테이프, MINIDISC, 비휘발성 메모리 카드, EEPROM, 광학 디스크, 광학 저장매체, RAM, ROM, 시스템 메모리 및 웹 서버를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
데이터 세트는 다양한 방식으로 수집될 수 있다. 예를 들어, 데이터 세트는 PCR 데이터 수집 장치에 있는 프로세서에 의해 수집될 수 있다. 데이터 세트는 실시간으로 프로세서에 제공될 수 있고 또는 메모리 유닛 또는 버퍼에 저장되고 실험 완료 후 프로세서에 제공될 수 있다. 유사하게는, 데이터 세트는, 상기 수집 장치와의 네트워크 연결(예컨대, LAN, VPN, 인터넷 및 인트라넷) 또는 직접 연결(예컨대, USB 또는 다른 직접 유선 연결 또는 무선 연결)에 의해 데스크탑 컴퓨터 시스템과 같은 별도의 시스템에 제공될 수 있고, 또는 CD, DVD, 플로피 디스크 및 포터블 HDD와 같은 포터블 매체 상에 제공될 수 있다. 유사하게, 데이터 세트는, 노트북 또는 데스크탑 컴퓨터 시스템과 같은 클라이언트에 네트워크 연결(예컨대, LAN, VPN, 인터넷, 인트라넷 및 무선 통신 네트워크)을 통하여 서버 시스템에 제공될 수 있다.
본 발명을 실행하는 프로세서에 구현된 지시들은 로직 시스템에 포함될 수 있다. 상기 지시는 비록 소프트웨어 기록 매체(예컨대, 포터블 HDD, USB, 플로피 디스크, CD 및 DVD)로 제공될 수 있지만, 다운로드 가능하고 메모리 모듈(예컨대, 하드 드라이브 또는 로컬 또는 부착 RAM 또는 ROM과 같은 다른 메모리)에 저장될 수 있다. 본 발명을 실행하는 컴퓨터 코드는, C, C++, Java, Visual Basic, VBScript, JavaScript, Perl 및 XML과 같은 다양한 코딩 언어로 실행될 수 있다. 또한, 다양한 언어 및 프로토콜은 본 발명에 따른 데이터와 명령의 외부 및 내부 저장과 전달에 이용될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 컴퓨터 프로세서, 및 (b) 상기 컴퓨터 프로세서에 커플링된 상기 본 발명의 컴퓨터 해독가능한 기록매체를 포함하는, 샘플 내 타겟 분석물질에 대한 데이터 세트의 보정 장치(device)를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 장치는 샘플 및 신호발생수단을 수용할 수 있는 반응용기, 상기 반응용기의 온도를 조절하는 온도조절 수단 및/또는 증폭 사이클에서의 신호를 검출하는 검출기를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 컴퓨터 프로세서는 사이클에서의 신호값을 수신할 뿐만 아니라, 샘플 또는 데이터 세트를 분석하거나, 샘플 내 타겟 분석물질에 대한 보정된 데이터 세트를 수득할 수 있다. 상기 컴퓨터 프로세서는 하나의 프로세서가 상술한 퍼포먼스를 모두 실행하도록 구축될 수 있다. 택일적으로, 여러 개의 프로세서가 각각의 퍼포먼스를 실행하도록 프로세서 유닛이 구축될 수 있다.
본 발명의 일 구현에에 따르면, 상기 프로세서는 타겟 분석물질(예컨대, 타겟 핵산분자)의 검출에 이용되는 종래의 장치(예컨대, 실시간 PCR 장치)에 소프트웨어를 인스톨 하여 구현시킬 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명에 의하면, 데이터 세트에 분석물질-비의존적 신호값을 적용하는 간단한 방식으로 데이터 세트를 보정할 수 있으며, 이로서 기기간 및 기기내 신호 편차를 효과적으로 감소시킬 수 있다. 특히, 기기간 신호 편차 뿐만 아니라, 기기내 신호 편차를 본 발명에 의하여 감소시킬 수 있어, 정확하고 재현성이 우수한 데이터 세트 분석이 가능하다. 본 발명에서 비롯된 효과 및 결과로부터 상이한 반응 자리(예를 들어, 상이한 반응 용기 또는 상이한 웰)에서의 신호발생반응들 간의 모든 유형의 신호 편차가 소프트웨어 유형의 공정에 의하여 효과적으로 대폭 감소될 수 있음을 알 수 있다.
(b) 본 발명의 보정 방법은 소프트웨어로 구현될 수 있으므로, 제조사에 관계 없이 다양한 분석 기기(예를 들어, 실시간 PCR 기기)에 범용적으로 적용될 수 있다. 그러므로, 본 발명의 방법은 하드웨어적 보정 방법에 비하여 매우 간편하고 범용성이 우수하다.
(c) 축퇴성(degenerate) 프라이머 및/또는 프로브를 사용하는 RNA 바이러스의 검출에서는 신호 편차가 매우 중요한 문제이다. 본 발명의 방법에 의하면, 신호 편차를 획기적으로 감소시킬 수 있다. 그러므로, 본 발명의 방법은 RNA 바이러스를 검출하기 위한 축퇴성 프라이머 및/또는 프로브 사용에 따른 신호 편차의 문제에 대하여 탁월한 해결방법이 될 수 있다.
도 1은 샘플 내 타겟 분석물질에 대한 데이터 세트를 보정하기 위한 방법의 일 구현예를 도시한 흐름도이다.
도 2a는 배경신호의 기기간 및 기기내 신호 편차를 확인하기 위하여, 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트의 증폭 곡선을 나타낸 것이다.
도 2b는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 원시 데이터 세트의 베이스라인이 차감된 증폭곡선 및 상기 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 분석한 결과이다.
도 3a는 배경신호에 대한 기기간 신호 편차 및 기기내 신호편차를 확인하기 위하여, 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트의 증폭곡선을 나타낸 것이다.
도 3b는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트의 베이스라인이 차감된 증폭곡선 및 상기 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4a는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개의 표준 데이터 세트의 베이스라인이 차감된 증폭곡선 및 각 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값을 나타낸 것이다.
도 4b는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 총 신호 변화값(total signal change value; TSC)을 이용한 본 발명의 신호 변화량 기반 표준화 방법(Signal Variation-based Normalization method; SVN)에 따라 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트의 증폭곡선을 나타낸 것이다.
도 4c는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 TSC를 이용한 SVN에 따라 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트의 베이스라인이 차감된 증폭곡선 및 상기 보정된 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5a는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개의 표준 데이터 세트의 베이스라인이 차감된 증폭곡선 및 각 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값을 나타낸 것이다.
도 5b는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 TSC를 이용한 SVN에 따라 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트의 증폭곡선을 나타낸 것이다.
도 5c는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 TSC를 이용한 SVN에 따라 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트의 베이스라인이 차감된 증폭곡선 및 상기 보정된 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 TSC를 이용한 SVN에 따라 보정한 후, R-TSC를 이용하여 추가로 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트의 베이스라인이 차감된 증폭곡선 및 상기 보정된 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 TSC를 이용한 SVN에 따라 보정한 후, R-TSC를 이용하여 추가로 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트의 베이스라인이 차감된 증폭곡선 및 상기 보정된 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 8a는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트의 멜팅 커브를 나타낸 것이다.
도 8b는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트의 변화값을 플롯팅하여 수득한 멜팅 피크 및 상기 데이터 세트들의 최대 변화값들의 기기간 및 기기내 변동계수를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 9a는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트의 멜팅 커브를 나타낸 것이다.
도 9b는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트의 변화값을 플롯팅하여 수득한 멜팅 피크 및 상기 데이터 세트들의 최대 변화값들의 기기간 및 기기내 변동계수를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 10a는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개의 표준 멜팅 데이터 세트의 멜팅 커브 및 각 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값을 나타낸 것이다.
도 10b는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트를 총 신호 변화값(total signal change value; TSC)을 이용한 본 발명의 신호 변화량 기반 표준화 방법(Signal Variation-based Normalization method; SVN)에 따라 보정하여 수득한 보정된 멜팅 데이터 세트의 멜팅 커브를 나타낸 것이다.
도 10c는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트를 TSC를 이용한 SVN에 따라 보정하여 수득한 보정된 멜팅 데이터 세트의 변화값을 플롯팅하여 수득한 보정된 멜팅 데이터 세트의 멜팅 피크 및 상기 보정된 멜팅 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 11a는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개의 표준 멜팅 데이터 세트의 멜팅 커브 및 각 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값을 나타낸 것이다.
도 11b는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트를 총 신호 변화값(TSC)을 이용한 본 발명의 신호 변화량 기반 표준화 방법(SVN)에 따라 보정하여 수득한 보정된 멜팅 데이터 세트의 멜팅 커브를 나타낸 것이다.
도 11c는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트를 TSC를 이용한 SVN에 따라 보정하여 수득한 보정된 멜팅 데이터 세트의 변화값을 플롯팅하여 수득한 보정된 멜팅 데이터 세트의 멜팅 피크 및 상기 보정된 멜팅 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트를 TSC를 이용한 SVN에 따라 보정한 후, R-TSC를 이용하여 추가로 보정하여 수득한 보정된 멜팅 데이터 세트의 변화값을 플롯팅하여 수득한 보정된 멜팅 데이터 세트의 멜팅 피크 및 상기 보정된 멜팅 데이터 세트의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트를 TSC를 이용한 SVN에 따라 보정한 후, R-TSC를 이용하여 추가로 보정하여 수득한 보정된 멜팅 데이터 세트의 변화값을 플롯팅하여 수득한 보정된 멜팅 데이터 세트의 멜팅 피크 및 상기 보정된 멜팅 데이터 세트의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 14a는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개의 표준 데이터 세트의 베이스라인이 차감된 증폭곡선과 TSC 및 R-TSC에 의하여 제공된 각 표준 데이터 세트의 보정계수(calibration coefficient)를 나타낸 것이다.
도 14b는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 보정계수를 이용한 신호 변화량 기반 표준화 방법(SVN)에 따라 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트들의 베이스라인이 차감된 증폭곡선 및 상기 보정된 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 15a는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개의 표준 데이터 세트의 베이스라인이 차감된 증폭곡선과 TSC 및 R-TSC에 의하여 제공된 각 표준 데이터 세트의 보정계수(calibration coefficient)를 나타낸 것이다.
도 15b는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 보정계수를 이용한 신호 변화량 기반 표준화 방법(SVN)에 따라 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트들의 베이스라인이 차감된 증폭곡선 및 상기 보정된 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 16a는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개의 표준 멜팅 데이터 세트의 멜팅 커브와 TSC 및 R-TSC에 의하여 제공된 각 표준 데이터 세트의 보정계수(calibration coefficient)를 나타낸 것이다.
도 16b는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트를 보정계수를 이용한 SVN에 따라 보정하여 수득한 보정된 멜팅 데이터 세트들의 변화값을 폴롯팅하여 수득한 보정된 멜팅 데이터 세트의 멜팅 피크 및 상기 보정된 멜팅 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 17a는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개의 표준 멜팅 데이터 세트의 멜팅 커브와 TSC 및 R-TSC에 의하여 제공된 각 표준 데이터 세트의 보정계수(calibration coefficient)를 나타낸 것이다.
도 17b는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트를 보정계수를 이용한 SVN에 따라 보정하여 수득한 보정된 멜팅 데이터 세트들의 변화값을 폴롯팅하여 수득한 보정된 멜팅 데이터 세트의 멜팅 피크 및 상기 보정된 멜팅 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 18a는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 본 발명의 기준 신호 기반 표준화 방법(Reference Signal-based Normalization method; RSN)에 따라 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트의 증폭곡선을 나타낸 것이다.
도 18b는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 본 발명의 기준 신호 기반 표준화 방법(Reference Signal-based Normalization method; RSN)에 따라 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트의 베이스라인이 차감된 증폭곡선 및 상기 보정된 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 18c는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 본 발명의 RSN에 따라 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트의 증폭곡선을 나타낸 것이다.
도 18d는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 본 발명의 RSN에 따라 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트의 베이스라인이 차감된 증폭곡선 및 상기 보정된 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 19a는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 단일 기준 사이클을 이용한 본 발명의 기기 블랭크 신호 제거 및 기준 신호 기반 표준화 방법(Instrument Blank signal Subtraction and Reference Signal-based Normalization method; IBS-RSN)에 따라 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트의 증폭곡선을 나타낸 것이다.
도 19b는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 단일 기준 사이클을 이용한 IBS-RSN에 따라 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트의 베이스라인이 차감된 증폭곡선 및 상기 보정된 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 19c는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 3개의 기준 사이클을 이용한 IBS-RSN에 따라 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트의 증폭곡선을 나타낸 것이다.
도 19d는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 3개의 기준 사이클을 이용한 IBS-RSN에 따라 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트의 베이스라인이 차감된 증폭곡선 및 상기 보정된 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 20a는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 단일 기준 사이클을 이용한 본 발명의 기기 블랭크 신호 제거 및 기준 신호 기반 표준화 방법(Instrument Blank signal Subtraction and Reference Signal-based Normalization method; IBS-RSN)에 따라 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트의 증폭곡선을 나타낸 것이다.
도 20b는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 단일 기준 사이클을 이용한 IBS-RSN에 따라 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트의 베이스라인이 차감된 증폭곡선 및 상기 보정된 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 20c는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 3개의 기준 사이클을 이용한 IBS-RSN에 따라 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트의 증폭곡선을 나타낸 것이다.
도 20d는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 3개의 기준 사이클을 이용한 IBS-RSN에 따라 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트의 베이스라인이 차감된 증폭곡선 및 상기 보정된 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2a는 배경신호의 기기간 및 기기내 신호 편차를 확인하기 위하여, 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트의 증폭 곡선을 나타낸 것이다.
도 2b는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 원시 데이터 세트의 베이스라인이 차감된 증폭곡선 및 상기 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 분석한 결과이다.
도 3a는 배경신호에 대한 기기간 신호 편차 및 기기내 신호편차를 확인하기 위하여, 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트의 증폭곡선을 나타낸 것이다.
도 3b는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트의 베이스라인이 차감된 증폭곡선 및 상기 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4a는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개의 표준 데이터 세트의 베이스라인이 차감된 증폭곡선 및 각 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값을 나타낸 것이다.
도 4b는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 총 신호 변화값(total signal change value; TSC)을 이용한 본 발명의 신호 변화량 기반 표준화 방법(Signal Variation-based Normalization method; SVN)에 따라 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트의 증폭곡선을 나타낸 것이다.
도 4c는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 TSC를 이용한 SVN에 따라 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트의 베이스라인이 차감된 증폭곡선 및 상기 보정된 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5a는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개의 표준 데이터 세트의 베이스라인이 차감된 증폭곡선 및 각 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값을 나타낸 것이다.
도 5b는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 TSC를 이용한 SVN에 따라 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트의 증폭곡선을 나타낸 것이다.
도 5c는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 TSC를 이용한 SVN에 따라 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트의 베이스라인이 차감된 증폭곡선 및 상기 보정된 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 TSC를 이용한 SVN에 따라 보정한 후, R-TSC를 이용하여 추가로 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트의 베이스라인이 차감된 증폭곡선 및 상기 보정된 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 TSC를 이용한 SVN에 따라 보정한 후, R-TSC를 이용하여 추가로 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트의 베이스라인이 차감된 증폭곡선 및 상기 보정된 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 8a는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트의 멜팅 커브를 나타낸 것이다.
도 8b는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트의 변화값을 플롯팅하여 수득한 멜팅 피크 및 상기 데이터 세트들의 최대 변화값들의 기기간 및 기기내 변동계수를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 9a는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트의 멜팅 커브를 나타낸 것이다.
도 9b는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트의 변화값을 플롯팅하여 수득한 멜팅 피크 및 상기 데이터 세트들의 최대 변화값들의 기기간 및 기기내 변동계수를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 10a는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개의 표준 멜팅 데이터 세트의 멜팅 커브 및 각 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값을 나타낸 것이다.
도 10b는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트를 총 신호 변화값(total signal change value; TSC)을 이용한 본 발명의 신호 변화량 기반 표준화 방법(Signal Variation-based Normalization method; SVN)에 따라 보정하여 수득한 보정된 멜팅 데이터 세트의 멜팅 커브를 나타낸 것이다.
도 10c는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트를 TSC를 이용한 SVN에 따라 보정하여 수득한 보정된 멜팅 데이터 세트의 변화값을 플롯팅하여 수득한 보정된 멜팅 데이터 세트의 멜팅 피크 및 상기 보정된 멜팅 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 11a는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개의 표준 멜팅 데이터 세트의 멜팅 커브 및 각 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값을 나타낸 것이다.
도 11b는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트를 총 신호 변화값(TSC)을 이용한 본 발명의 신호 변화량 기반 표준화 방법(SVN)에 따라 보정하여 수득한 보정된 멜팅 데이터 세트의 멜팅 커브를 나타낸 것이다.
도 11c는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트를 TSC를 이용한 SVN에 따라 보정하여 수득한 보정된 멜팅 데이터 세트의 변화값을 플롯팅하여 수득한 보정된 멜팅 데이터 세트의 멜팅 피크 및 상기 보정된 멜팅 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트를 TSC를 이용한 SVN에 따라 보정한 후, R-TSC를 이용하여 추가로 보정하여 수득한 보정된 멜팅 데이터 세트의 변화값을 플롯팅하여 수득한 보정된 멜팅 데이터 세트의 멜팅 피크 및 상기 보정된 멜팅 데이터 세트의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트를 TSC를 이용한 SVN에 따라 보정한 후, R-TSC를 이용하여 추가로 보정하여 수득한 보정된 멜팅 데이터 세트의 변화값을 플롯팅하여 수득한 보정된 멜팅 데이터 세트의 멜팅 피크 및 상기 보정된 멜팅 데이터 세트의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 14a는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개의 표준 데이터 세트의 베이스라인이 차감된 증폭곡선과 TSC 및 R-TSC에 의하여 제공된 각 표준 데이터 세트의 보정계수(calibration coefficient)를 나타낸 것이다.
도 14b는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 보정계수를 이용한 신호 변화량 기반 표준화 방법(SVN)에 따라 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트들의 베이스라인이 차감된 증폭곡선 및 상기 보정된 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 15a는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개의 표준 데이터 세트의 베이스라인이 차감된 증폭곡선과 TSC 및 R-TSC에 의하여 제공된 각 표준 데이터 세트의 보정계수(calibration coefficient)를 나타낸 것이다.
도 15b는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 보정계수를 이용한 신호 변화량 기반 표준화 방법(SVN)에 따라 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트들의 베이스라인이 차감된 증폭곡선 및 상기 보정된 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 16a는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개의 표준 멜팅 데이터 세트의 멜팅 커브와 TSC 및 R-TSC에 의하여 제공된 각 표준 데이터 세트의 보정계수(calibration coefficient)를 나타낸 것이다.
도 16b는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트를 보정계수를 이용한 SVN에 따라 보정하여 수득한 보정된 멜팅 데이터 세트들의 변화값을 폴롯팅하여 수득한 보정된 멜팅 데이터 세트의 멜팅 피크 및 상기 보정된 멜팅 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 17a는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개의 표준 멜팅 데이터 세트의 멜팅 커브와 TSC 및 R-TSC에 의하여 제공된 각 표준 데이터 세트의 보정계수(calibration coefficient)를 나타낸 것이다.
도 17b는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트를 보정계수를 이용한 SVN에 따라 보정하여 수득한 보정된 멜팅 데이터 세트들의 변화값을 폴롯팅하여 수득한 보정된 멜팅 데이터 세트의 멜팅 피크 및 상기 보정된 멜팅 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 18a는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 본 발명의 기준 신호 기반 표준화 방법(Reference Signal-based Normalization method; RSN)에 따라 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트의 증폭곡선을 나타낸 것이다.
도 18b는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 본 발명의 기준 신호 기반 표준화 방법(Reference Signal-based Normalization method; RSN)에 따라 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트의 베이스라인이 차감된 증폭곡선 및 상기 보정된 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 18c는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 본 발명의 RSN에 따라 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트의 증폭곡선을 나타낸 것이다.
도 18d는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 본 발명의 RSN에 따라 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트의 베이스라인이 차감된 증폭곡선 및 상기 보정된 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 19a는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 단일 기준 사이클을 이용한 본 발명의 기기 블랭크 신호 제거 및 기준 신호 기반 표준화 방법(Instrument Blank signal Subtraction and Reference Signal-based Normalization method; IBS-RSN)에 따라 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트의 증폭곡선을 나타낸 것이다.
도 19b는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 단일 기준 사이클을 이용한 IBS-RSN에 따라 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트의 베이스라인이 차감된 증폭곡선 및 상기 보정된 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 19c는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 3개의 기준 사이클을 이용한 IBS-RSN에 따라 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트의 증폭곡선을 나타낸 것이다.
도 19d는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 3개의 기준 사이클을 이용한 IBS-RSN에 따라 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트의 베이스라인이 차감된 증폭곡선 및 상기 보정된 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 20a는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 단일 기준 사이클을 이용한 본 발명의 기기 블랭크 신호 제거 및 기준 신호 기반 표준화 방법(Instrument Blank signal Subtraction and Reference Signal-based Normalization method; IBS-RSN)에 따라 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트의 증폭곡선을 나타낸 것이다.
도 20b는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 단일 기준 사이클을 이용한 IBS-RSN에 따라 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트의 베이스라인이 차감된 증폭곡선 및 상기 보정된 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 20c는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 3개의 기준 사이클을 이용한 IBS-RSN에 따라 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트의 증폭곡선을 나타낸 것이다.
도 20d는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 3개의 기준 사이클을 이용한 IBS-RSN에 따라 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트의 베이스라인이 차감된 증폭곡선 및 상기 보정된 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 신호 변화량 기반 표준화 방법(SVN)에 의한 데이터 세트 보정 및 보정 데이터 세트의 분석
실시간 PCR 기기의 기기 간 신호 편차를 최소화하기 위해 하드웨어적으로 입출력 신호 세기를 조절하는 방법이 널리 사용되고 있다. 예를 들어, 광원(예를 들어 LED 및 할로겐 램프(Halogen lamp))의 출력 세기를 조정하거나, 또는 검출기(Detector)의 필터(Filter)에서 입력 세기의 조정을 통하여 신호를 보정한다.
본 실시예에서는 데이터 세트의 증폭 신호의 편차를 수정하기 위하여 본 발명의 신호 변화량 기반 표준화 방법(Signal Variation-based Normalization; SVN)을 사용하였다. SVN 방법은 상기 설명한 표준 데이터 세트의 총 신호 변화량을 이용하는 방법의 명칭이다. 다음의 3개 그룹의 데이터 세트에 대한 신호 편차가 비교 분석 되었다: (i) 하드웨어적으로 미보정된 기기에서 수득한 데이터 세트 그룹, (ii) 하드웨어적으로 보정된 기기에서 수득한 데이터 세트 그룹 및 (iii) SVN에 의하여 소프트웨어적으로 보정된 데이터 세트 그룹.
<1-1> 데이터 세트 준비
타겟 핵산 분자에 대한 실시간 PCR은 표 1에 기재된 3대의 CFX96™ Real-Time PCR Detection Systems (Bio-Rad)에서 TaqMan 프로브를 신호발생수단으로 사용하여 증폭 사이클 50회로 수행되었다. 타겟 핵산 분자는 Ureaplasma urealyticum의 지놈 DNA를 사용하였다. 상호작용적 이중 표지는 TaqMan 프로브에 리포터 분자(FAM) 및 퀀처 분자(BHQ-1)를 결합하여 사용하였다.
반응은 타겟 핵산 분자, 업스트림 프라이머, 다운스트림 프라이머, TaqMan 프로브 및 MgCl2, dNTPs 및 Taq DNA polymerase를 포함하는 마스터 믹스가 포함된 튜브에서 수행되었다. 반응 혼합물이 포함된 튜브를 실시간 thermocycler (CFX96, Bio-Rad)에 장착하고, 15분간 95℃에서 변성 후, 95℃ 10초, 60℃ 60초 및 72℃ 10초를 1 사이클로 하여 50 사이클을 진행하였다. 각 사이클마다 60℃에서 신호를 측정하였다.
동일한 타겟 핵산이 동일한 농도로 포함된 샘플을 이용하여 각 기기별로 96개 웰에서 95개의 반응을 동일한 조건에서 수행하였다. 또한 상기 96개 웰 중 남겨진 웰에서 상기 95개의 반응과 함께 농도가 알려진 타겟 분석물질을 포함하는 샘플을 이용한 반응을 동시에 수행하였으며, 이것은 표준 반응으로 이용되었다. 상기 반응에서 수득한 데이터 세트 및 표준 데이터 세트를 분석하여 기기간, 기기내 신호 편차 및 SVN 방법에 의한 상기 신호 편차의 감소 수준을 분석하였다.
3개의 기기를 하드웨어적인 보정을 하지 아니한 미보정 상태로 반응을 진행하여 3개 그룹의 데이터 세트를 수득하고, 하드웨어적인 보정을 하고 반응을 진행하여 3개 그룹의 데이터 세트를 수득하여, 총 6개 그룹의 원시 데이터 세트들을 준비하였다. 각 그룹은 96개 반응을 통하여 95개의 데이터 세트와 1개의 표준 데이터 세트를 포함한다.
상기 원시 데이터 세트들로부터 베이스라인 차감된 데이터 세트들을 구하였다. 베이스라인 차감된 데이터 세트는 다음과 같은 방법으로 수득하였다. 실시간 PCR 반응을 통해 얻어진 원시 데이터 세트에서 3번째 사이클로부터 증폭이 시작되기 전 사이클까지를 베이스라인으로 설정하고, 상기 구간의 사이클에 대한 신호값의 회귀직선 방정식을 구한다. 각 사이클마다 측정된 신호값에서 해당 사이클에서 상기 회귀직선 방정식을 통해 계산된 신호값을 차감하여 베이스라인 차감된 데이터 세트를 구한다.
| 기기번호 | 실시간 PCR 기기 |
| 기기 1 | CFX96 Real-time Cycler (Bio-Rad) |
| 기기 2 | |
| 기기 3 |
<1-2> 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트 분석
상기 실시예 <1-1>에서 얻어진 원시 데이터 세트 및 이들의 베이스라인 차감된 데이터 세트가 사용되었다. 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트와 이로부터 얻어진 3개 그룹의 베이스라인 차감된 데이터 세트의 신호 편차를 분석하였다.
3개 기기의 배경신호 세기를 비교하기 위하여, 베이스라인이 차감되지 않은 원시 데이터 세트들을 플로팅하여 베이스라인 차감이 없는 증폭곡선(No Baseline Subtraction Curve)을 수득하였다(도 2A 참조).
도 2A에서 보는 바와 같이, 각 기기별로 배경신호가 분리되어 나타나는 것을 확인할 수 있으며, 이는 동일한 조건의 증폭반응이므로 동일한 세기의 배경 신호가 플로팅 될 것이라는 이론적 기대와 다른 결과이었다.
증폭구간의 신호 편차를 비교하기 위하여, 3개의 기기들로부터 수득한 베이스라인이 차감된 데이터 세트를 플로팅 하여 베이스라인이 차감된 증폭 곡선(Baseline Subtracted Curve)을 준비하였다.
베이스라인이 차감된 데이터 세트들의 마지막 사이클(50 번째 사이클)을 분석 사이클(analytical cycle)로 정하고, 상기 50 번째 사이클에서 증폭 신호의 변동계수(Coefficient of variation, CV)를 수득하였다(도 2B 참조). 상기 변동계수는 데이터의 표준편차를 산술 평균으로 나눈 것이다. 기기내 변동계수는 단일 기기에서 측정된 복수의 반응에 대한 결과들 중에서 특정 사이클에 대응하는 신호값들의 표준편차와 산술평균으로 산출하였다. 기기간 변동계수는 실험에 사용된 3개의 기기에서 측정된 모든 반응에 대한 결과 데이터 세트에서 특정 사이클에 대응하는 신호값들의 표준편차와 산술평균으로 산출하였다.
베이스라인 차감된 증폭 곡선(Baseline Subtracted Curve)의 마지막 사이클에서 증폭 신호의 변동계수를 도 2B에 나타내었다. 기기 1, 2, 및 3의 증폭 신호의 기기내 변동계수는 5.2%, 9.1% 및 4.5%로 각각 확인되었으며, 기기 1, 2, 및 3의 증폭 신호의 기기간 변동계수는 49.3%로 확인되었다.
<1-3> 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트 분석
실시예 <1-1>에서 수득한 원시 데이터 세트들 및 이들의 베이스라인 차감된 데이터 세트를 사용하였다. 하드웨어적으로 보정된 기기들로부터 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트 및 이로부터 얻어진 베이스라인 차감된 3개 그룹의 데이터 세트의 신호 편차를 분석하였다.
실시예 <1-2>에 기재된 것과 동일한 방법으로 베이스라인 차감 없는 증폭 곡선(No Baseline Subtracted Curve)을 분석하였다. 도 3A에 보는 바와 같이, 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트에 비하여 기기간 배경 신호의 편차는 감소한 것을 확인하였다.
실시예 <1-2>에서와 동일한 방법으로 베이스라인 차감된 증폭 곡선(Baseline Subtracted Curve)의 마지막 사이클에서의 증폭 신호의 변동계수를 분석하였다. 도 3B에서 보는 바와 같이, 기기 1, 2, 및 3의 증폭 신호의 기기내 변동계수는 5.3%, 7.8% 및 4.8%로 각각 확인되었으며, 기기 1, 2, 및 3의 증폭 신호의 기기간 변동계수는 17.7%로 확인되었다.
실시예 <1-2>의 하드웨어적으로 미보정된 기기에서 수득한 데이터 세트의 결과와 상기 결과를 비교하면, 증폭신호의 기기내 변동계수는 큰 변화가 없는 것으로 확인되었으며, 증폭신호의 기기간 변동계수는 31.6%p(percentage points) 감소한 것으로 확인되었다.
이와 같은 결과로부터, 하드웨어 조정에 의한 보정은 기기의 증폭신호의 기기간 변동계수를 일부 감소시킬 수 있지만, 여전히 기기간(inter-instrument)에는 상당 수준의 신호 편차가 존재하는 것을 확인하였다.
<1-4> SVN에 의하여 소프트웨어적으로 보정된 데이터 세트의 분석
신호 변화량 기반 표준화 방법(SVN)은 각 기기의 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값(TSC)에 추가로 기준 총 신호 변화값(R-TSC)를 사용하여 데이터 세트를 비율적으로 표준화 하는 방법이다.
총 신호 변화값(TSC)은 대응하는 표준 데이터 세트의 신호 변화(증가 또는 감소)량을 의미한다. 상기 표준 데이터 세트는 알려진 농도(표준 농도)의 타겟 분석물질의 신호발생반응을 통하여 수득한 데이터 세트를 의미한다. 각 기기의 표준 데이터 세트는 알려진 농도의 타겟 분석물질을 이용하여 기기에서 신호발생반응을 수행하여 얻어진다.
기준 총 신호 변화값(R-TSC)은 표준 기기로부터 얻어진 데이터 세트의 총 신호 변화값 또는 복수의 데이터 세트의 총 신호 변화값으로부터 결정될 수 있다. 또한 상기 기준 총 신호 변화값(R-TSC)은 대응하는 타겟 분석물질에 대한 복수의 신호발생반응의 결과를 기초로 실험자에 의하여 결정될 수 있다.
본 발명에서 원시 데이터 세트의 보정 효과는 TSC를 적용하는 것에 의하여 나타나는 것이며, 또한 R-TSC에 의하여 상기 보정된 데이터 세트의 신호 세기의 수치가 추가로 조정될 수 있다.
SVN을 이용한 데이터 세트 보정 결과, 기기간 신호 편차가 추가로 감소되는 것을 확인하였다.
<1-4-1> 총 신호 변화값을 이용한 SVN에 의한 데이터 세트의 보정
본 실시예에서는 각 기기로부터 얻어진 데이터 세트에 총 신호 변화값(TSC)을 적용하는 SVN 방법에 의하여 데이터 세트들을 보정하였다. 실시예 <1-1>에서 수득한 6개 그룹의 원시 데이터 세트를 다음의 단계들에 따라 SVN 방법으로 소프트웨어적으로 보정하였다.
<단계 1>
실험 대상 샘플로부터 데이터 세트를 수득하기 위한 신호발생반응과 동일한 반응 조건으로 표준 농도의 타겟 분석물질을 이용한 표준 신호발생반응을 수행하여 기기 고유의 표준 데이터 세트를 수득하고, 총 신호 변화값을 상기 표준 데이터 세트로부터 수득하였다.
상기 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값을 계산하기 위하여, 상기 수득한 표준 데이터 세트로부터 실시예 <1-1>에 기재한 바와 같이 베이스라인을 차감하여 베이스라인 차감된 데이터 세트를 구하고, 상기 베이스라인 차감된 데이터 세트로부터 총 신호 변화값을 산출하였다. 베이스라인 차감된 데이터 세트의 50번째 사이클(End-point)의 RFU를 총 신호 변화값으로 지정하였다.
본 실시예에서는 각 기기별로 표준 데이터 세트를 수득하였으며, 기기 고유의 총 신호 변화값을 산출하였다. 하드웨어적으로 미보정된 또는 보정된 기기 1, 2 및 3그로부터 수득한 표준 데이터 세트에 대한 총 신호 변화값들(TSCs)이 표 2에 보는 바와 같이 측정되었다(도 4A 및 도 5A 참조).
| 표준 데이터 세트들의 총 신호 변화값(RFU) | ||
| 하드웨어 조정 | - | + |
| 기기 1 | 2585 | 3506 |
| 기기 2 | 4419 | 5512 |
| 기기 3 | 9075 | 4450 |
<단계 2>
각 기기로부터 얻은 원시 데이터 세트들의 모든 사이클에서의 신호값들을 각 기기로부터 얻은 상기 기기 고유의 TSC를 이용하여 보정하였다.
보정된 신호값 (RFU) = 원시 데이터 세트의 신호값 (RFU)÷TSC
실시예 <1-1>에서 제공된 6개 그룹의 원시 데이터 세트를 상기 단계 1 및 2에 따라 보정하여 6개 그룹의 보정된 데이터 세트를 수득하였다.
A. 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트의 보정 결과 분석
하드웨어적으로 미보정된 기기 1, 2 및 3으로부터 수득한 각각의 표준 데이터 세트로부터 기기 고유의 TSC들을 산출하였다(도 4A 참조). 하드웨어적으로 미보정된 기기 1, 2 및 3으로부터 수득한 데이터 세트들을 기기 고유의 TSC를 이용한 SVN방법에 의해 보정하였으며, 그 결과인 보정 데이터 세트를 분석하였다.
도 4B 및 4C는 하드웨어적으로 미보정된 기기 1, 2 및 3으로부터 수득한 데이터 세트를 상기 단계 1 및 2에 따라 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트의 증폭곡선(도 4B) 및 기기간 및 기기내 변동계수(도 4C)를 나타낸다.
상기 보정된 데이터 세트들을 플로팅하여 증폭곡선을 수득하였다. 도 4B는 보정된 데이터 세트들을 베이스라인 차감 없이 플로팅하여 얻은 증폭곡선(No Baseline Subtraction Curve)이며, 이의 배경지역 및 증폭구간의 신호 세기를 비교하였다. 3개 기기로부터의 신호값이 표준화된 것을 확인하였으며, 구체적으로, 배경지역의 신호들이 서로 유사하게 되고, 동시에 증폭구간의 신호들이 유사하게 된 것을 확인하였다.
또한, 상기 보정된 데이터 세트로부터 베이스라인을 차감하고, 베이스라인이 차감된 데이터 세트를 플로팅하여 베이스라인 차감된 증폭 곡선을 수득하고, 50번째 사이클에서의 변동계수를 산출하였다. 도 4C가 베이스라인 차감된 증폭곡선을 나타내며, 여기에서 증폭구간의 신호 편차를 비교하였다. 증폭 신호의 변동계수를 분석한 결과, 기기내 증폭신호의 변동계수는 각각 5.2%, 9.1% 및 4.5%로 나타났으며, 기기간 증폭신호의 변동계수는 7.0%로 확인되었다.
다음의 3개의 변동계수를 비교 분석 하였다: (i) 실시예 <1-2>의 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트들의 신호의 변동계수, (ii) 실시예 <1-3>의 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트들의 신호의 변동계수, 및 (iii) 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트들을 본 실시예의 TSC를 이용한 SVN으로 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트들의 신호의 변동계수.
표 3에서 보는 바와 같이, 기기 고유의 TSC를 이용하여 SVN으로 보정된 보정된 데이터 세트는 다음과 같은 특징을 가진다: 하드웨어적으로 미보정된 기기에서 수득한 데이터 세트와 비교하였을 때, 기기간 증폭신호의 변동계수는 42.3%p (percentage points)만큼 대폭 감소하는 것을 확인하였다. 또한 하드웨어적으로 보정된 기기에서 수득한 데이터 세트와 비교하였을 때, 기기간 증폭신호의 변동계수는 10.7%p (percentage points)만큼 현저히 감소하는 것을 확인하였다.
이로서 본 발명의 SVN에 의한 신호 보정 방법은 기기 고유의 표준 데이터 세트로부터 수득한 총 신호 변화값(TSC)을 이용하여 기기간 신호 편차를 효과적으로 감소시킬 수 있음을 확인하였다.
| 보정 방법 | TSC를 이용한 SVN | - | - | + |
| 하드웨어 조정 | - | + | - | |
| 증폭신호 분석결과 (변동계수, CV %) |
기기 1 | 5.2 | 5.3 | 5.3 |
| 기기 2 | 9.1 | 7.8 | 9.1 | |
| 기기 3 | 4.5 | 4.8 | 4.5 | |
| Total | 49.3 | 17.7 | 7.0 |
B. 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트의 보정 결과 분석
하드웨어적으로 보정된 기기 1, 2 및 3으로부터 수득한 각각의 표준 데이터 세트로부터 기기 고유의 TSC들을 산출하였다(도 5A 참조).
하드웨어적으로 보정된 기기 1, 2 및 3으로부터 수득한 데이터 세트들을 기기 고유의 TSC를 이용한 SVN방법에 의해 보정하였으며, 그 결과인 보정 데이터 세트를 분석하였다.
도 5B 및 5C는 하드웨어적으로 보정된 기기 1, 2 및 3으로부터 수득한 데이터 세트를 상기 단계 1 및 2에 따라 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트의 증폭곡선(도 5B) 및 기기간 및 기기내 변동계수(도 5C)를 나타낸다.
상기 보정된 데이터 세트들을 플로팅하여 증폭곡선을 수득하였다. 도 5B는 보정된 데이터 세트들을 베이스라인 차감 없이 플로팅하여 얻은 증폭곡선(No Baseline Subtraction Curve)이며, 이의 배경지역 및 증폭구간의 신호 세기를 비교하였다. 3개 기기로부터의 신호값이 표준화된 것을 확인하였으며, 구체적으로, 배경지역의 신호들이 서로 유사하게 되고, 동시에 증폭구간의 신호들이 유사하게 된 것을 확인하였다.
또한, 상기 보정된 데이터 세트로부터 베이스라인을 차감하고, 베이스라인이 차감된 데이터 세트를 플로팅하여 베이스라인 차감된 증폭 곡선을 수득하고, 50번째 사이클에서의 변동계수를 산출하였다. 도 5C가 베이스라인 차감된 증폭곡선을 나타내며, 여기에서 증폭구간의 신호 편차를 비교하였다. 증폭 신호의 변동계수를 분석한 결과, 기기내 증폭신호의 변동계수는 각각 5.3%, 7.8% 및 4.8%로 나타났으며, 기기간 증폭신호의 변동계수는 6.4%로 확인되었다.
다음의 3개의 변동계수를 비교 분석 하였다: (i) 실시예 <1-2>의 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트들의 신호의 변동계수, (ii) 실시예 <1-3>의 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트들의 신호의 변동계수, 및 (iii) 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트들을 본 실시예의 TSC를 이용한 SVN으로 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트들의 신호의 변동계수.
표 4에서 보는 바와 같이, 기기 고유의 TSC를 이용하여 SVN으로 보정된 보정된 데이터 세트는 다음과 같은 특징을 가진다: 하드웨어적으로 미보정된 기기에서 수득한 데이터 세트와 비교하였을 때, 기기간 증폭신호의 변동계수는 42.9%p (percentage points)만큼 대폭 감소하는 것을 확인하였다. 또한 하드웨어적으로 보정된 기기에서 수득한 데이터 세트와 비교하였을 때, 기기간 증폭신호의 변동계수는 11.3%p (percentage points)만큼 현저히 감소하는 것을 확인하였다.
이로서 본 발명의 SVN에 의한 신호 보정 방법은 기기 고유의 표준 데이터 세트로부터 수득한 총 신호 변화값(TSC)을 이용하여 기기간 신호 편차를 효과적으로 감소시킬 수 있음을 확인하였다. 흥미롭게도, 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트도 SVN에 의하여 추가로 보정될 수 있으며, 이로서 기기간 편차가 더욱 정교하게 정정되는 것을 확인하였다.
| 보정 방법 | TSC를 이용한 SVN | - | - | + |
| 하드웨어 조정 | - | + | + | |
| 증폭신호 분석결과 (변동계수, CV %) |
기기 1 | 5.2 | 5.3 | 5.3 |
| 기기 2 | 9.1 | 7.8 | 7.8 | |
| 기기 3 | 4.5 | 4.8 | 4.8 | |
| Total | 49.3 | 17.7 | 6.4 |
<1-4-2> 총 신호 변화값 및 기준 총 신호 변화값을 이용한 SVN에 의한 데이터 세트 보정
본 실시예에서는 각 기기로부터 얻어진 데이터 세트에 총 신호 변화값(TSC) 및 기준 총 신호 변화값(R-TSC)를 적용하여 데이터 세트들을 보정하였다. 실시예 <1-1>에서 수득한 6개 그룹의 원시 데이터 세트를 다음의 단계들에 따라 SVN 방법으로 소프트웨어적으로 보정하였다.
<단계 1>
실시예 <1-4-1>에서와 동일하게, 표준 데이터 세트로부터 총 신호 변화값들(TSCs)을 측정하였다(표 2참조).
<단계 2>
각 기기로부터 얻은 원시 데이터 세트들의 모든 사이클에서의 신호값들을 각 기기로부터 얻은 상기 기기 고유의 TSC를 이용하여 보정하였다.
1차 보정된 신호값 (RFU) = 원시 데이터 세트의 신호값 (RFU) ÷TSC
<단계 3>
본 실시예에서는 실시예 <1-1>의 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 수득한 데이터 세트들의 총 신호 변화값의 평균값(도 3B 참조)과 유사한 RFU 4500을 R-TSC로 지정하였다(도 4A 및 도 5A 참조). 2차 보정된 신호값은 상기 1차 보정된 신호값에 R-TSC를 적용하여 수득하였다.
2차 보정된 신호값 (RFU) = 1차 보정된 신호값 (RFU) X R-TSC
실시예 <1-1>에서 제공된 6개 그룹의 원시 데이터 세트를 상기 단계 1 내지 단계 3에 따라 보정하여 6개 그룹의 보정된 데이터 세트를 수득하였다.
A. 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트의 보정 결과 분석
하드웨어적으로 미보정된 기기 1, 2 및 3으로부터 수득한 데이터 세트들을 TSC 및 R-TSC를 이용한 SVN방법에 의해 보정하였으며, 그 결과인 보정 데이터 세트를 분석하였다. 그 결과, 보정된 데이터 세트의 신호 편차는 도 4B에 나타난 바와 동일하였으나, 신호의 세기(Y축 값)는 도 4B에 나타난 결과와 상이한 것을 확인하였다.
도 6은 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트를 상기 단계 1 내지 단계 3에 따라 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트의 베이스라인 차감된 증폭곡선 및 기기내 및 기기간 변동계수를 나타낸 것이다.
도 6에서 나타난 바와 같이, 기기내 증폭신호의 변동계수는 각각 5.2%, 9.1% 및 4.5%로 나타났으며, 기기간 증폭신호의 변동계수는 7.0%로 확인되었다. 본 실시예의 표준화된 증폭 신호의 기기내 및 기기간 변동계수는 도 4C에 나타난 실시예 <1-4-1>의 것과 동일하지만, 이들의 신호 세기 (Y축 값)는 서로 상이한 것을 확인하였다.
B. 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트의 보정 결과 분석
하드웨어적으로 보정된 기기 1, 2 및 3으로부터 수득한 데이터 세트들을 TSC 및 R-TSC를 이용한 SVN방법에 의해 보정하였으며, 그 결과인 보정 데이터 세트를 분석하였다. 그 결과, 보정된 데이터 세트의 신호 편차는 도 5B에 나타난 바와 동일하였으나, 신호의 세기(Y축 값)는 도 5B에 나타난 결과와 상이한 것을 확인하였다.
도 7은 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트를 상기 단계 1 내지 단계 3에 따라 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트의 베이스라인 차감된 증폭곡선 및 기기내 및 기기간 변동계수를 나타낸 것이다.
도 7에서 나타난 바와 같이, 기기내 증폭신호의 변동계수는 각각 5.3%, 7.8% 및 4.8%로 나타났으며, 기기간 증폭신호의 변동계수는 6.4%로 확인되었다. 본 실시예의 표준화된 증폭 신호의 기기내 및 기기간 변동계수는 도 5C에 나타난 실시예 <1-4-1>의 것과 동일하지만, 이들의 신호 세기 (Y축 값)는 서로 상이한 것을 확인하였다.
그러므로, SVN은 TSC 적용에 의하여 데이터 세트에 대한 보정 효과를 나타내며, 추가로 R-TSC는 보정된 데이터 세트의 신호 세기를 적절하게 조정하는데 기여하는 것을 알 수 있었다.
실시간 PCR 기기로부터의 신호를 SVN을 이용하여 보정하는 방법은 간편하고 소프트웨어적인 방식으로 기기간 신호 편차를 감소시킬 수 있다. 또한 각 웰에서 얻은 TSC를 이용하여 한 기기내 각 웰의 신호를 보정하면 기기내 신호 편차를 감소시킬 수 있다.
더구나, SVN을 이용한 보정 방법은 하드웨어 적이 아닌 소프트웨어적인 방식으로 데이터 세트를 보정하므로 다양한 실시간 PCR 기기에 범용적으로 적용될 수 있다. 이에 더하여, 본 발명의 SVN 방법은 하드웨어적으로 이미 보정된 신호들을 추가로 보정할 수 있다. 실시간 PCR 기기와 같은 기기는 일반적으로 시장에 출시되기 전에 하드웨어적 보정을 거치게 된다. 이와 같이 하드웨어적으로 보정된 기기에 적용되는 경우, 본 발명의 방법은 기기가 더 정교하게 보정된 신호값을 제공할 수 있게 한다.
실시예 2: 신호 변화량 기반 표준화 방법(SVN)에 의한 멜팅 데이터 세트 보정 및 보정 데이터 세트의 분석
상기 실시예 1에서는 핵산 증폭 데이터 세트가 SVN 방법에 의하여 보정되었다. 실시예 2에서는 멜팅 데이터 세트도 본 발명의 방법에 의하여 소프트웨어적으로 보정될 수 있는지 시험하였다.
다음의 3개 그룹의 멜팅 데이터 세트에 대한 신호 편차가 비교 분석 되었다: (i) 하드웨어적으로 미보정된 기기에서 수득한 멜팅 데이터 세트 그룹, (ii) 하드웨어적으로 보정된 기기에서 수득한 멜팅 데이터 세트 그룹 및 (iii) 멜팅 데이터 세트를 SVN에 의하여 소프트웨어적으로 보정하여 수득한 보정된 멜팅 데이터 세트 그룹.
<2-1> 멜팅 데이터 세트 준비
타겟 핵산분자에 대한 멜팅 분석은 표 5에 기재된 6대의 CFX96™ Real-Time PCR Detection Systems (Bio-Rad)에서 PTOCE 어세이(WO 2012/096523)를 신호발생수단으로 사용하여 증폭 사이클 50회로 수행되었다. 타겟 핵산분자는 Human beta-globin의 DNA를 사용하였다. 상호작용적 이중 표지는 리포터 분자(Quasar 670) 및 퀀처 분자(BHQ-2)가 표지된 CTO(이중 표지된 CTO)를 사용하였다.
반응은 타겟 핵산 분자, 다운스트림 프라이머, 업스트림 프라이머, 이중 표지된 CTO, PTO 및 MgCl2, dNTPs 및 Taq DNA polymerase를 포함하는 마스터 믹스가 포함된 튜브에서 수행되었다. 반응 혼합물이 포함된 튜브를 실시간 thermocycler (CFX96, Bio-Rad)에 장착하고, 15분간 95℃에서 변성 후, 95℃ 30초, 60℃ 60초 및 72℃ 30초를 1 사이클로 하여 50 사이클을 진행하였다. 멜팅 데이터 세트는 실시간 PCR 결과물을 55℃에서 85℃까지 가온하면서 0.5℃ 단위로 온도별 형광신호를 측정하여 수득하였다. 멜팅 데이터 세트에서 온도가 사이클로 간주된다. 신호 증폭 데이터 세트에서 시간 또는 멜팅 데이터 세트에서 온도가 단일 측정 단위 일 수 있다.
각 기기별로 동일한 타겟 핵산서열이 동일한 농도로 포함된 샘플을 이용하여 24개 반응을 동일한 조건에서 수행하였으며, 각 기기마다 농도가 알려진 타겟 분석물질을 포함하는 샘플을 이용한 하나의 반응을 동시에 수행하였으며, 이것은 표준 반응으로 이용되었다. 상기 반응에서 수득한 멜팅 데이터 세트들 및 표준 멜팅 데이터 세트를 분석하여 기기간 및 기기내 멜팅 신호 편차 수준 및 본 방법에 의한 상기 멜팅 신호 편차의 감소 수준을 분석하였다.
하드웨어적인 보정을 하지 아니한 3대의 기기와 하드웨어적인 보정을 한 3대의 기기로 구성된 총 6대의 PCR 기기들을 사용하여 온도에 따른 형광값들(RFUs)로 구성된 총 6개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트들을 수득하였다. 각 그룹은 96웰에서 반응에서 수득한 24개의 데이터 세트와 1개의 표준 데이터 세트를 포함한다.
수득한 원시 멜팅 데이터 세트의 음수 변화값을 계산하여 원시 멜팅 데이터 세트의 변화값을 구하였다. 상기 변화값 계산을 위하여, 아래 식에 따라 최소자승법(Least Square Method)을 원시 멜팅 데이터 세트에 적용하였으며, 원시 멜팅 데이터 세트의 변화값이 음수 변화값 형태로 수득되었다.
I: 데이터 세트에서 변화값을 구하려는 사이클 번호
xi: i번째 사이클의 사이클 번호
yi: i번째 사이클에서 측정된 신호세기
si : i번째 사이클에서 데이터의 변화량
“a”및 “b”: 0이상 10이하의 정수
n: a + b + 1, 변화값 산출에 사용되는 데이터의 갯수
본 실시예에서는, 상기 a 및 b는 1을 사용하였다. I-a가 1보다 작아지는 데이터 지점은 I-a를 1로 될 수 있도록 a를 변화시켰다. I+b가 모든 데이터 지점의 개수보다 커지는 데이터 지점에서는 I+b가 모든 데이터 지점의 개수와 동일하게 되도록 b를 변화시켰다.
원시 멜팅 데이터 세트를 플로팅하여 멜팅 커브를 얻었으며, 멜팅 변화값 곡선(멜팅 피크)은 원시 멜팅 데이터 세트의 변화값들을 플로팅하여 얻었다.
| 하드웨어 조정 | 기기 번호 | 실시간 PCR 기기 |
| 조정 없음 | 기기 1 | CFX96 Real-time Cycler (Bio-Rad) |
| 기기 2 | ||
| 기기 3 | ||
| 조정함 | 기기 1 | |
| 기기 2 | ||
| 기기 3 |
<2-2> 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트의 분석
상기 실시예 <2-1>에서 수득한 원시 멜팅 데이터 세트 및 이의 변화값을 이용하였다. 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트 및 상기 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트의 변화값들의 신호 편차를 분석하였다.
3개 기기의 전체적인 멜팅 신호 패턴을 확인하기 위하여 원시 멜팅 데이터 세트를 플로팅하여 멜팅 커브(melting curve)를 수득하였다(도 8A 참조).
멜팅 커브 분석 결과, 도 8A에서 보는 바와 같이, 동일한 조건의 증폭반응이므로 이론상 동일한 멜팅 시작 온도에서의 신호 및 온도 증가에 따라 동일한 세기의 신호 변화가 플로팅 되어야 하지만 기기간 신호가 구분되어 나누어지는 것을 확인하였다.
멜팅 커브 분석에서 신호를 비교하기 위하여, 3개의 기기 각각에서 수득한 원시 멜팅 데이터 세트의 변화값들을 플로팅하여 멜팅 변화값 커브(멜팅 피크)를 수득하였다. 상기 멜팅 피크의 편차가 멜팅 데이터 세트의 변화값들의 편차이다.
멜팅 피크의 값(slope)이 최고가 되는 지점을 분석 온도(analytical temperature)로 지정하고, 상기 분석 온도에서의 멜팅 피크의 값의 변동계수를 계산하였다. 멜팅 피크의 변동계수, 다시말해, 멜팅 데이터 세트의 변화값의 변동계수는 분석 온도에서의 멜팅 피크의 값의 변동계수이다. 변동계수의 계산 방법은 실시예 <1-2>에 기재되어 있다.
도 8B에서와 같이, 멜팅 피크의 변동계수를 확인한 결과, 기기내 멜팅 피크의 변동계수는 5.0%, 6.0%, 그리고 7.7%로 확인되었고, 기기간 멜팅 피크의 변동계수는 38.0%로 확인되었다.
<2-3> 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트의 분석
실시예 <2-1>에서 하드웨어적으로 보정된 기기에서 수득한 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트와 3개 그룹의 상기 원시 멜팅 데이터 세트의 변화값들의 신호 편차를 실시예 <2-2>에 기재된 것과 동일한 방법으로 분석하였다.
실시예 <2-2>에 기재된 것과 동일한 방법으로 멜팅 커브를 분석한 결과, 도 9A에서 보는 바와 같이, 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트에 비하여 기기간 신호의 편차는 감소하였다.
실시예 <2-2>에서와 동일한 방법으로 멜팅 변화값 곡선(멜팅 피크)의 변화값의 변동계수를 산출하였다. 도 9B에서와 같이, 기기 내 변화값 변동계수는 5.7%, 6.1%, 그리고 7.4%로 각각 확인되었고, 기기간 변화값 변동계수는 12.9%로 확인되었다.
상기 결과를 실시예 <2-2>의 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트 결과와 비교하면, 멜팅피크의 기기내 변동계수는 큰 차이가 없는 것으로 확인되었고, 멜팅피크의 기기간 변동계수는 25.1%p (percentage points) 만큼 감소하는 것으로 확인되었다.
이와 같은 결과로부터, 하드웨어 조정에 의한 보정 방법이 멜팅 피크의 기기간 변동계수를 일부 감소시킬 수 있지만, 여전히 기기간 상당한 신호 편차가 존재하는 것을 확인하였다.
<2-4> SVN을 이용하여 소프트웨어적으로 보정된 멜팅 데이터 세트 분석
<2-4-1> 총 신호 변화값을 이용한 SVN에 의한 멜팅 데이터 세트의 보정
본 실시예에서는 각 기기에서 수득한 멜팅 데이터 세트에 총 신호 변화값(TSC)을 적용한 SVN 방법에 의하여 멜팅 데이터 세트를 보정하였다. 실시예 <2-1>에서 수득한 6개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트를 다음의 단계에 따라 소프트웨어적으로 보정하였다:
<단계 1>
실험 대상 샘플로부터 멜팅 데이터 세트를 수득하기 위한 신호발생반응과 동일한 반응 조건으로 표준 농도의 타겟 분석물질을 이용한 표준 신호발생반응을 수행하여 기기 고유의 표준 멜팅 데이터 세트를 수득하였다.
총 신호 변화값은 상기 표준 멜팅 데이터 세트의 멜팅 피크로부터 산출하였다. 표준 멜팅 데이터 세트의 멜팅 피크의 기울기의 최대값을 총 신호 변화값(TSC)으로 지정하였다.
본 실시예에서는 각 기기에서 표준 멜팅 데이터 세트를 수득하고 총 신호 변화값을 각각 산출하였다. 하드웨어적으로 미보정 또는 보정된 기기 1, 2 및 3으로부터 각각 수득한 표준 멜팅 데이터 세트들의 총 신호 변화값은 표 6에 나타난 바와 같이 측정 되었다(도 10A 및 11A 참조).
| 하드웨어 조정 | 기기 번호 | 표준 멜팅 데이터 세트의 TSC (Slope) |
| _ | 기기 1 | 228 |
| _ | 기기 2 | 490 |
| _ | 기기 3 | 606 |
| + | 기기 1 | 480 |
| + | 기기 2 | 595 |
| + | 기기 3 | 516 |
<단계 2>
각 기기로부터 얻은 원시 멜팅 데이터 세트들의 모든 온도에서의 신호값들을 각 기기로부터 얻은 상기 기기 고유의 TSC를 이용하여 보정하였다.
보정된 신호값 (RFU) = 원시 멜팅 데이터 세트의 신호값 (RFU) ÷TSC
실시예 <2-1>에서 제공된 6개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트를 상기 단계 1 내지 2에 따라 보정하여 6개 그룹의 보정된 멜팅 데이터 세트를 수득하였다.
A. 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트의 보정 결과 분석
하드웨어적으로 미보정된 기기 1, 2 및 3으로부터 수득한 각각의 표준 멜팅 데이터 세트로부터 기기 고유의 TSC들을 산출하였다(도 10A 참조). 하드웨어적으로 미보정된 기기 1, 2 및 3으로부터 수득한 멜팅 데이터 세트들을 기기 고유의 TSC를 이용한 SVN방법에 의해 보정하였으며, 그 결과인 보정 멜팅 데이터 세트를 분석하였다.
도 10B는 상기 하드웨어적으로 미보정된 각 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트를 상기 단계 1 및 2를 통하여 보정한 결과를 나타내는 멜팅 커브를 나타낸다. 도 10C는 상기 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트를 상기 단계 1 및 2를 통하여 보정한 결과를 나타내는 멜팅 피크로부터 수득한 기기내 및 기기간 변동 계수를 나타낸다. 멜팅 커브는 TSC를 이용한 SVN에 의하여 보정된 멜팅 데이터 세트를 플로팅하여 수득하였으며, 원시 멜팅 데이터 세트는 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득하였다.
도 10B는 보정된 멜팅 데이터 세트를 플로팅하여 수득한 멜팅 커브를 나타내며, 멜팅 신호의 세기를 비교할 수 있다. 3개의 기기로부터의 멜팅 데이터 세트의 신호값이 보정된 것을 확인하였으며, 멜팅 신호들이 서로 유사하게 된 것을 확인하였다.
상기 보정된 멜팅 데이터 세트로부터 원시 멜팅 데이터 세트의 변화값을 수득하고, 상기 원시 멜팅 데이터 세트의 변화값들을 플로팅하여 멜팅 변화값 커브(멜팅 피크)를 수득하였으며, 상기 멜팅 변화값 커브로부터 변동계수를 산출하였다.
멜팅 피크의 변동계수 (다시 말해, 멜팅 데이터 세트의 변화값들의 변동계수)를 분석하였다. 기기내 멜팅 피크의 변동계수는 5.0%, 6.0% 및 7.7%로 각각 나타났으며, 기기간 멜팅 피크의 변동계수는 7.0%로 확인되었다.
다음의 3개의 변동계수를 비교 분석하였다: (i) 실시예 <2-2>의 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트들의 변화값들로부터 산출한 멜팅 피크의 변동계수, (ii) 실시예 <2-3>의 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트들의 변화값들로부터 산출한 멜팅 피크의 변동계수, 및 (iii) 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트들을 본 실시예의 TSC를 이용한 SVN으로 보정하여 수득한 보정된 멜팅 데이터 세트들의 변화값들로부터 산출한 멜팅 피크의 변동계수.
표 7에서 보는 바와 같이, TSC를 이용하여 SVN으로 보정된 보정된 멜팅 데이터 세트는 다음과 같은 특징을 가진다: 하드웨어적으로 미보정된 기기에서 수득한 멜팅 데이터 세트와 비교하였을 때, 기기간 멜팅 피크의 변동계수는 31.0%p (percentage points)만큼 대폭 감소하는 것을 확인하였다. 또한 하드웨어적으로 보정된 기기에서 수득한 멜팅 데이트 세트와 비교하였을 때, 기기간 변화값의 변동계수는 5.9%p (percentage points)만큼 현저히 감소하는 것을 확인하였다.
이로서 총 신호 변화값(TSC)을 이용한 SVN에 의한 신호 보정 방법은 멜팅 데이터 세트의 기기간 신호 편차를 효과적으로 감소시킬 수 있음을 확인하였으며, 이는 기기의 하드웨어적 보정 없이 총 신호 변화값을 이용한 SVN만으로도 전통적인 하드웨어적 보정보다 월등히 효과적인 멜팅 신호 보정 효과를 달성할 수 있음을 시사한다.
| 보정 방법 | TSC를 이용한 SVN | - | - | + |
| 하드웨어 조정 | - | + | - | |
| 멜팅신호 분석결과 (변동계수, CV %) |
기기 1 | 5.0 | 5.7 | 5.0 |
| 기기 2 | 6.0 | 6.1 | 6.0 | |
| 기기 3 | 7.7 | 7.4 | 7.7 | |
| Total | 38.0 | 12.9 | 7.0 |
B. 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트의 보정 결과 분석
하드웨어적으로 보정된 기기 1, 2 및 3으로부터 수득한 각각의 표준 멜팅 데이터 세트로부터 기기 고유의 TSC들을 산출하였다(도 11A 참조). 하드웨어적으로 보정된 기기 1, 2 및 3으로부터 수득한 멜팅 데이터 세트들을 상기 기기 고유의 TSC를 이용한 SVN방법에 의해 보정하였으며, 그 결과인 보정된 멜팅 데이터 세트를 분석하였다.
도 11B는 상기 하드웨어적으로 보정된 각 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트를 상기 단계 1 및 2를 통하여 보정한 결과를 나타내는 멜팅 커브를 나타낸다. 도 11C는 상기 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트를 상기 단계 1 및 2를 통하여 보정한 결과를 나타내는 멜팅 피크로부터 수득한 기기내 및 기기간 변동 계수를 나타낸다. 멜팅 커브는 TSC를 이용한 SVN에 의하여 보정된 멜팅 데이터 세트를 플로팅하여 수득하였으며, 원시 멜팅 데이터 세트는 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득하였다.
도 11B는 보정된 멜팅 데이터 세트를 플로팅하여 수득한 멜팅 커브를 나타내며, 멜팅 신호의 세기를 비교할 수 있다. 3개의 기기로부터의 멜팅 데이터 세트의 신호값이 보정된 것을 확인하였으며, 멜팅 신호들이 서로 유사하게 된 것을 확인하였다.
멜팅 피크의 변동계수를 분석하였다(도 11C 참조). 기기내 멜팅 피크의 변동계수는 5.7%, 6.1% 및 7.4%로 각각 나타났으며, 기기간 멜팅 피크의 변동계수는 6.8%로 확인되었다.
다음의 3개의 변동계수를 비교 분석하였다: (i) 실시예 <2-2>의 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트들의 변화값들로부터 산출한 멜팅 피크의 변동계수, (ii) 실시예 <2-3>의 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트들의 변화값들로부터 산출한 멜팅 피크의 변동계수, 및 (iii) 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트들을 본 실시예의 TSC를 이용한 SVN으로 보정하여 수득한 보정된 멜팅 데이터 세트들의 변화값들로부터 산출한 멜팅 피크의 변동계수.
표 8에서 보는 바와 같이, TSC를 이용하여 SVN으로 보정된 보정된 멜팅 데이터 세트는 다음과 같은 특징을 가진다: 하드웨어적으로 미보정된 기기에서 수득한 멜팅 데이터 세트와 비교하였을 때, 기기간 멜팅 피크의 변동계수는 31.2%p (percentage points)만큼 대폭 감소하는 것을 확인하였다. 또한 하드웨어적으로 보정된 기기에서 수득한 멜팅 데이트 세트와 비교하였을 때, 기기간 변화값의 변동계수는 6.1%p (percentage points)만큼 현저히 감소하는 것을 확인하였다.
이로서 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트도 SVN에 의하여 추가로 보정될 수 있으며, 이로서 멜팅 데이터 세트의 기기간 편차가 더욱 정교하게 정정되는 것을 확인하였다.
| 보정 방법 | TSC를 이용한 SVN | - | - | + |
| 하드웨어 조정 | - | + | + | |
| 멜팅신호 분석결과 (변동계수, CV %) |
기기 1 | 5.0 | 5.7 | 5.7 |
| 기기 2 | 6.0 | 6.1 | 6.1 | |
| 기기 3 | 7.7 | 7.4 | 7.4 | |
| Total | 38.0 | 12.9 | 6.8 |
<2-4-2> 총 신호 변화값 및 기준 총 신호 변화값을 이용한 SVN에 의한 멜팅 데이터 세트 보정
본 실시예에서는 각 기기로부터 얻어진 멜팅 데이터 세트에 총 신호 변화값(TSC) 및 기준 총 신호 변화값(R-TSC)를 적용한 SVN 방법에 의하여 멜팅 데이터 세트들을 보정하였다. 실시예 <2-1>에서 수득한 6개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트를 다음의 단계들에 따라 SVN 방법으로 소프트웨어적으로 보정하였다:
<단계 1>
실시예 <2-4-1>에서와 동일하게, 표준 멜팅 데이터 세트로부터 총 신호 변화값들(TSCs)을 측정하였다(표 6 참조).
<단계 2>
각 기기로부터 얻은 원시 멜팅 데이터 세트들의 모든 온도에서의 신호값들을 각 기기로부터 얻은 상기 기기 고유의 TSC를 이용하여 보정하였다.
1차 보정된 신호값 (RFU) = 원시 멜팅 데이터 세트의 신호값 (RFU) ÷TSC
<단계 3>
본 실시예에서는 실시예 <2-1>의 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 수득한 데이터 세트들의 총 신호 변화값의 평균값(도 9B 참조)과 유사한 기울기값 540을 R-TSC로 지정하였다(도 10A 및 도 11A 참조). 2차 보정된 신호값은 상기 1차 보정된 신호값에 R-TSC를 적용하여 수득하였다.
2차 보정된 신호값 (RFU) = 1차 보정된 신호값 (RFU) X R-TSC
실시예 <2-1>에서 제공된 6개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트를 상기 단계 1 내지 단계 3에 따라 보정하여 6개 그룹의 보정된 멜팅 데이터 세트를 수득하였다.
A. 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트의 보정 결과 분석
하드웨어적으로 미보정된 기기 1, 2 및 3으로부터 수득한 멜팅 데이터 세트들을 TSC 및 R-TSC를 이용한 SVN방법에 의해 보정하였으며, 그 결과인 보정된 멜팅 데이터 세트를 분석하였다. 그 결과, 보정된 멜팅 데이터 세트의 신호 편차는 도 10B에 나타난 바와 동일하였으나, 신호의 세기(Y축 값)는 도 10B에 나타난 결과와 상이한 것을 확인하였다.
도 12는 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트를 상기 단계 1 내지 단계 3에 따라 보정하여 수득한 보정된 멜팅 데이터 세트의 변화값을 플로팅하여 수득한 보정된 멜팅 데이터 세트의 멜팅 피크 및 상기 멜팅 피크의 기기내 및 기기간 변동계수를 나타낸 것이다.
도 12에서 나타난 바와 같이, 멜팅 피크의 기기내 증폭신호의 변동계수는 각각 5.0%, 6.1% 및 7.7%로 나타났으며, 기기간 증폭신호의 변동계수는 7.0%로 확인되었다. 본 실시예의 표준화된 데이터 세트의 멜팅 피크의 기기내 및 기기간 변동계수는 도 10C에 나타난 실시예 <2-4-1>의 것과 동일하지만, 이들의 신호 세기 (Y축 값)는 서로 상이한 것을 확인하였다.
B. 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트의 보정 결과 분석
하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트들을 TSC 및 R-TSC를 이용한 SVN방법에 의해 보정하였으며, 그 결과인 보정된 멜팅 데이터 세트를 분석하였다. 그 결과, 보정된 멜팅 데이터 세트의 신호 편차는 도 11B에 나타난 바와 동일하였으나, 신호의 세기(Y축 값)는 도 11B에 나타난 결과와 상이한 것을 확인하였다.
도 13은 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트를 상기 단계 1 내지 단계 3에 따라 보정하여 수득한 보정된 멜팅 데이터 세트의 변화값을 플로팅하여 수득한 보정된 멜팅 데이터 세트의 멜팅 피크 및 상기 멜팅 피크의 기기내 및 기기간 변동계수를 나타낸 것이다.
도 13에서 나타난 바와 같이, 멜팅 피크의 기기내 증폭신호의 변동계수는 각각 5.7%, 6.1% 및 7.4%로 나타났으며, 기기간 증폭신호의 변동계수는 6.8%로 확인되었다. 본 실시예의 표준화된 데이터 세트의 멜팅 피크의 기기내 및 기기간 변동계수는 도 11C에 나타난 실시예 <2-4-1>의 것과 동일하지만, 이들의 신호 세기 (Y축 값)는 서로 상이한 것을 확인하였다.
그러므로, SVN은 TSC 적용에 의하여 멜팅 데이터 세트에 대한 보정 효과를 나타내며, 추가로 R-TSC는 보정된 데이터 세트의 신호 세기를 적절하게 조정하는데 기여하는 것을 알 수 있었다.
따라서, SVN을 이용하여 신호를 보정하는 방법은 증폭 신호 뿐만 아니라 멜팅 신호의 보정에 적용될 수 있으며, 유사한 효과를 나타낸다. 멜팅 커브 분석은 신호 검출을 위하여 정교한 온도 컨트롤을 필요로 하기 때문에, 증폭 커브 분석에 비하여 장비간 신호 편차가 발생할 가능성이 높다. 따라서, 멜팅 커브 분석에서 본 보정 방법의 장점이 더욱 강조될 것이다.
실시예 3: 보정계수를 이용한 신호 변화량 기반 표준화 방법(SVN)에 의한 데이터 세트 보정 및 보정된 데이터 세트의 분석
본 실시예에서는 보정계수를 이용한 SVN이 증폭신호 데이터 세트 및 멜팅 데이터 세트의 편차를 보정하는데 사용되었다.
다음의 3개 그룹의 데이터 세트에 대한 신호 편차가 비교 분석 되었다: (i) 하드웨어적으로 미보정된 기기에서 수득한 데이터 세트 그룹, (ii) 하드웨어적으로 보정된 기기에서 수득한 데이터 세트 그룹 및 (iii) SVN에 의하여 소프트웨어적으로 보정된 데이터 세트 그룹.
<3-1> 증폭 데이터 세트의 보정 및 분석
<3-1-1> 증폭 데이터 세트 준비
실시예 <1-1>에서 수득한 원시 증폭 데이터 세트가 사용되었다.
<3-1-2> 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 증폭 데이터 세트 분석
실시예 <1-2>에 나타난 바와 같이, 기기 1, 2 및 3의 증폭 신호에 대한 기기내 변동계수는 각각 5.2%, 9.1% 및 4.5%로 나타났으며, 기기 1, 2 및 3의 증폭 신호에 대한 기기간 변동계수는 49.3%로 분석되었다(도 2B 참조).
<3-1-3> 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 증폭 데이터 세트 분석
실시예 <1-3>에 나타난 바와 같이, 기기 1, 2 및 3의 증폭 신호에 대한 기기내 변동계수는 각각 5.3%, 7.8% 및 4.8%로 나타났으며, 기기 1, 2 및 3의 증폭 신호에 대한 기기간 변동계수는 17.7%로 분석되었다(도 3B 참조).
<3-1-4> SVN에 의하여 소프트웨어적으로 보정된 증폭 데이터 세트의 분석
본 실시예에서는 각 기기로부터 수득한 데이터 세트에 보정계수를 적용하는 SVN 방법에 의하여 증폭 데이터 세트를 보정하였다. 실시예 <1-1>에서 수득한 6개 그룹의 원시 증폭 데이터 세트를 다음의 단계들에 따라 SVN 방법으로 소프트웨어적으로 보정하였다.
<단계 1>
실시예 <1-4-1>에 나타난 바와 같이, 하드웨어적으로 미보정된 또는 보정된 기기 1, 2 및 3으로부터 각각 수득한 표준 증폭 데이터 세트의 총 신호 변화값(TSC)이 측정되었다 (표 2 참조).
<단계 2>
실시예 <1-4-2>에 나타난 바와 같이, RFU 4500가 R-TSC로 지정되었다.
<단계 3>
표 9에서 보는 바와 같이, 각 기기의 보정계수는 각 기기의 TSC 및 R-TSC에 의하여 다음과 같이 산출되었다(도 14A 및 도 15A 참조).
보정계수 = TSC÷R-TSC
| 하드웨어 조정 |
기기번호 | A) 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값 (TSC) |
B) 기준 총 신호 변화값(R-TSC) |
C) R-TSC에 대한 TSC의 비율 [A/B] |
| - | 1 | 2585 | 4500 | 0.57 |
| 2 | 4419 | 4500 | 0.98 | |
| 3 | 9075 | 4500 | 2.02 | |
| + | 1 | 3506 | 4500 | 0.78 |
| 2 | 5512 | 4500 | 1.22 | |
| 3 | 4450 | 4500 | 0.99 |
<단계 4>
각 기기로부터 수득한 상기 보정계수를 이용하여 각 기기로부터 수득한 데이터 세트들의 모든 사이클에서의 신호값을 보정하였다.
보정된 신호값 (RFU) = 원시 증폭 데이터 세트의 신호값 (RFU)÷보정계수
실시예 <1-1>에서 제공된 6개 그룹의 원시 데이터 세트를 상기 단계 1 내지 4에 따라 보정하여 6개 그룹의 보정된 데이터 세트를 수득하였다.
A. 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 증폭 데이터 세트의 보정 결과 분석
하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트를 보정계수를 이용한 SVN방법에 의해 보정하였으며, 그 결과인 보정 데이터 세트를 분석하였다(도 14B 참조).
도 14B에서 보는 바와 같이, 증폭 신호의 기기내 변동계수는 각각 5.2%, 9.1% 및 4.5%이었으며, 증폭 신호의 기기간 변동계수는 7.0% 이었다.
B. 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 증폭 데이터 세트의 보정 결과 분석
하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트를 보정계수를 이용한 SVN방법에 의해 보정하였으며, 그 결과인 보정 데이터 세트를 분석하였다(도 15B 참조).
도 15B에서 보는 바와 같이, 증폭 신호의 기기내 변동계수는 각각 5.3%, 7.8% 및 4.8%이었으며, 증폭 신호의 기기간 변동계수는 6.4% 이었다.
분석 결과, 보정계수(C-coe)를 이용한 SVN 방법에 의하여 보정된 결과는 상기 실시예 <1-4-2>의 TSC 및 R-TSC를 이용한 SVN 방법에 의하여 보정된 결과와 동일한 것으로 나타났다.
<3-2> 멜팅 데이터 세트의 보정 및 분석
<3-2-1> 멜팅 데이터 세트의 준비
실시예 <2-1>에서 수득한 원시 멜팅 데이터 세트가 사용되었다.
<3-2-2> 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트 분석
실시예 <2-2>에 나타난 바와 같이, 기기 1, 2 및 3의 멜팅 신호에 대한 기기내 변동계수는 각각 5.0%, 6.0% 및 7.7%로 나타났으며, 기기 1, 2 및 3의 멜팅 신호에 대한 기기간 변동계수는 38.0%로 분석되었다(도 8B 참조).
<3-2-3> 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트 분석
실시예 <2-3>에 나타난 바와 같이, 기기 1, 2 및 3의 멜팅 신호에 대한 기기내 변동계수는 각각 5.7%, 6.1% 및 7.4%로 나타났으며, 기기 1, 2 및 3의 멜팅 신호에 대한 기기간 변동계수는 12.9%로 분석되었다(도 9B 참조).
<3-2-4> SVN에 의하여 소프트웨어적으로 보정된 멜팅 데이터 세트의 분석
본 실시예에서는 각 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트에 보정계수를 적용하는 SVN 방법에 의하여 멜팅 데이터 세트를 보정하였다. 실시예 <2-1>에서 수득한 6개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트를 다음의 단계들에 따라 SVN 방법으로 소프트웨어적으로 보정하였다.
<단계 1>
실시예 <2-4-1>에 나타난 바와 같이, 하드웨어적으로 미보정된 또는 보정된 기기 1, 2 및 3으로부터 각각 수득한 표준 멜팅 데이터 세트의 총 신호 변화값(TSC)이 측정되었다 (표 2 참조).
<단계 2>
실시예 <2-4-2>에 나타난 바와 같이, 기울기값 540이 R-TSC로 지정되었다.
<단계 3>
표 10에서 보는 바와 같이, 각 기기의 보정계수는 각 기기의 TSC 및 R-TSC에 의하여 다음과 같이 산출되었다(도 16A 및 도 17A 참조).
보정계수 = TSC÷R-TSC
| 하드웨어 조정 |
기기번호 | A) 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값 (TSC) |
B) 기준 총 신호 변화값(R-TSC) |
C) R-TSC에 대한 TSC의 비율 [A/B] |
| - | 1 | 228 | 540 | 0.42 |
| 2 | 490 | 540 | 0.91 | |
| 3 | 606 | 540 | 1.12 | |
| + | 1 | 480 | 540 | 0.89 |
| 2 | 595 | 540 | 1.10 | |
| 3 | 516 | 540 | 0.96 |
<단계 4>
각 기기로부터 수득한 상기 보정계수를 이용하여 각 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트들의 모든 온도에서의 신호값을 보정하였다.
보정된 신호값 (RFU) = 원시 멜팅 데이터 세트의 신호값 (RFU)÷보정계수
실시예 <2-1>에서 제공된 6개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트를 상기 단계 1 내지 4에 따라 보정하여 6개 그룹의 보정된 멜팅 데이터 세트를 수득하였다.
A. 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트의 보정 결과 분석
하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트를 보정계수를 이용한 SVN방법에 의해 보정하였으며, 그 결과인 보정된 멜팅 데이터 세트를 분석하였다(도 16B 참조).
도 16B에서 보는 바와 같이, 멜팅 신호의 기기내 변동계수는 각각 5.0%, 6.0% 및 7.7%이었으며, 멜팅 신호의 기기간 변동계수는 7.0% 이었다.
B. 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트의 보정 결과 분석
하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트를 보정계수를 이용한 SVN방법에 의해 보정하였으며, 그 결과인 보정된 데이터 세트를 분석하였다(도 17B 참조).
도 17B에서 보는 바와 같이, 멜팅 신호의 기기내 변동계수는 각각 5.7%, 6.1% 및 7.4%이었으며, 멜팅 신호의 기기간 변동계수는 6.8% 이었다.
분석 결과, 보정계수(C-coe)를 이용한 SVN 방법에 의하여 보정된 결과는 상기 실시예 <2-4-2>의 TSC 및 R-TSC를 이용한 SVN 방법에 의하여 보정된 결과와 동일한 것으로 나타났다.
상기 실시예 <3-1-4> 및 <3-2-4>에 나타난 바와 같이, 보정계수를 이용한 SVN 방법에 의하여 데이터 세트를 보정하는 것은 TSC를 직접 이용하거나, TSC와 R-TSC의 조합을 이용한 SVN 방법에 의하여 데이터 세트를 보정하는 것과 동일한 보정 결과를 나타낼 수 있다는 것을 확인하였다.
실시예 4: 기준 신호 기반 표준화 방법(RSN)에 의한 데이터 세트 보정 및 보정된 데이터 세트의 분석
본 실시예에서는 기준 사이클에서의 신호값을 이용하는 기준 신호 기반 표준화 방법(Reference Signal-based Normalization; RSN)을 이용하여 데이터 세트의 증폭 신호 편차를 보정하였다. 상기 RSN 방법은 전술한 데이터 세트의 배경지역-대표 신호값을 이용하는 방법의 명칭이다.
다음의 3개 그룹의 데이터 세트에 대한 신호 편차가 비교 분석 되었다: (i) 하드웨어적으로 미보정된 기기에서 수득한 데이터 세트 그룹, (ii) 하드웨어적으로 보정된 기기에서 수득한 데이터 세트 그룹 및 (iii) RSN 또는 IBS-RSN에 의하여 소프트웨어적으로 보정된 데이터 세트 그룹.
<4-1> 데이터 세트 준비
실시예 <1-1>에서 수득한 원시 데이터 세트가 사용되었다.
<4-2> 기기 블랭크 신호의 측정
원시 데이터 세트는 일반적으로 형광 분자에 의하여 발생하는 신호 및 형광 분자가 없어도 기기에서 기본적으로 발생하는 기기 블랭크 신호(instrument blank signal)를 모두 포함하고 있다. 따라서, 형광 분자에 의하여 발생하는 신호만을 이용하여 더욱 정확한 결과를 얻기 위해서는 기기 블랭크 신호를 측정하고, 이를 원시 데이터 세트에서 차감하는 것이 필요하다.
본 실시예에서는 빈 튜브를 측정하여 수득한 신호를 기기 블랭크 신호로 이용하였다.
기기 블랭크 신호의 측정은 실시간 PCR에서 신호를 검출하는 온도 부근에서 이루어질 수 있으며, 증폭 사이클 반복을 동반하거나, 동반하지 않고 측정될 수 있다. 본 실시예에서는 실시예 <1-1>에 기술된 것과 동일 조건에서 10개 사이클의 증폭이 수행되었으며, 10번째 사이클에서 측정된 신호값을 기기 블랭크 신호로 사용하였다. 각 조건별로 기기 블랭크 신호는 표 11과 같이 측정되었다.
| 기기 번호 | 하드웨어적으로 미보정된 기기의 기기 블랭크 신호 | 하드웨어적으로 보정된 기기의 기기 블랭크 신호 |
| 기기 1 | RFU 2525 | RFU 2977 |
| 기기 2 | RFU 3152 | RFU 3638 |
| 기기 3 | RFU 3629 | RFU 3010 |
<4-3> 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트 분석
실시예 <1-2>에 나타난 바와 같이, 기기 1, 2 및 3의 증폭 신호에 대한 기기내 변동계수는 각각 5.2%, 9.1% 및 4.5%로 나타났으며, 기기 1, 2 및 3의 증폭 신호에 대한 기기간 변동계수는 49.3%로 분석되었다(도 2B 참조).
<4-4> 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 증폭 데이터 세트 분석
실시예 <1-3>에 나타난 바와 같이, 기기 1, 2 및 3의 증폭 신호에 대한 기기내 변동계수는 각각 5.3%, 7.8% 및 4.8%로 나타났으며, 기기 1, 2 및 3의 증폭 신호에 대한 기기간 변동계수는 17.7%로 분석되었다(도 3B 참조).
<4-5> RSN에 의하여 소프트웨어적으로 보정된 데이터 세트의 분석
기준 신호 기반 표준화 방법(RSN)은 상기 실시예 1 내지 3에서 사용된 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값(TSC) 대신 데이터 세트의 기준 사이클에서의 신호값을 이용하여 데이터 세트를 보정하는 방법이다. 실시예 <1-1>에서 수득한 6개 그룹의 원시 데이터 세트를 다음의 단계들에 따라 RSN 방법으로 소프트웨어적으로 보정하였다.
<단계 1>
원시 데이터 세트의 배경지역(베이스라인 영역)에 있는 특정 사이클을 기준 사이클로 지정하였다. 본 실시예에서는 5번째 사이클이 기준 사이클로 지정되었으며, 각 데이터 세트의 기준 사이클에서의 신호값이 기준 신호(reference signal; RS)로 지정되었다.
<단계 2>
각 데이터 세트의 RS를 이용하여 각 데이터 세트의 모든 사이클에서의 신호값들을 보정하였다.
보정된 신호값 (RFU) = 원시 데이터 세트의 신호값 (RFU) ÷ RS
실시예 <1-1>에서 제공된 6개 그룹의 원시 데이터 세트를 상기 단계 1 내지 2에 따라 보정하여 6개 그룹의 보정된 데이터 세트를 수득하였다.
A. 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트의 보정 결과 분석
하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트를 기준 신호를 이용한 RSN 방법에 의해 보정하였으며, 그 결과인 보정 데이터 세트를 분석하였다(도 18A 및 18B 참조).
도 18B에서 보는 바와 같이, 증폭 신호의 기기내 변동계수는 각각 2.3%, 3.0% 및 1.1%이었으며, 증폭 신호의 기기간 변동계수는 12.1% 이었다.
다음의 3개의 변동계수(coefficient of variation)가 비교 분석 되었다: (i) 실시예 <1-2>의 하드웨어적으로 미보정된 기기에서 수득한 데이터 세트의 신호 변동계수, (ii) 실시예 <1-3>의 하드웨어적으로 보정된 기기에서 수득한 데이터 세트의 신호 변동계수 및 (iii) 본 실시예의 하드웨어적으로 미보정된 기기에서 수득한 데이터 세트를 RS를 이용한 RSN 방법에 의하여 보정하여 제공된 보정된 데이터 세트의 신호 변동계수.
표 12에서 보는 바와 같이, RS를 이용한 RSN 방법에 의하여 보정된 데이터 세트는 다음과 같은 특징을 가진다: 하드웨어적으로 미보정된 기기에서 수득한 데이터 세트와 비교하였을 때, (i) 기기내 증폭 신호의 변동계수는 절반이상 대폭 감소하는 것을 확인하였으며, (ii) 기기간 증폭 신호의 변동계수는 37.2 %p (percentage points)만큼 대폭 감소하는 것을 확인하였다. 또한, 하드웨어적으로 보정된 기기에서 수득한 데이터 세트와 비교하였을 때, (i) 기기내 증폭 신호의 변동계수는 절반이상 대폭 감소하는 것을 확인하였으며, (ii) 기기간 증폭 신호의 변동계수는 5.6 %p (percentage points)만큼 감소하는 것을 확인하였다.
본 발명의 RSN 방법은 기기간 뿐만 아니라 기기내 웰간 신호 편차를 감소시킬 수 있음을 확인하였다. 특히, RSN 방법은 기기를 하드웨어적으로 보정하는 방법보다 월등히 우수한 보정 효과를 나타내는 것이 확인 되었으며, 이는 기기의 하드웨어적 보정 없이도 하드웨어적 보정보다 월등히 우수한 신호 보정 효과를 RSN 방법에 의하여 달성할 수 있음을 시사한다.
| 보정 방법 | RS를 이용한 RSN | - | - | + |
| 하드웨어 조정 | - | + | - | |
| 증폭신호 분석결과 (변동계수, CV %) |
기기 1 | 5.2 | 5.3 | 2.3 |
| 기기 2 | 9.1 | 7.8 | 3.0 | |
| 기기 3 | 4.5 | 4.8 | 1.1 | |
| Total | 49.3 | 17.7 | 12.1 |
B. 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트의 보정 결과 분석
하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트를 기준 신호를 이용한 RSN 방법에 의하여 보정하였으며, 그 결과인 보정된 데이터 세트를 분석하였다(도 18C 및 18D 참조).
도 18D에 나타난 바와 같이, 기기내 증폭신호의 변동계수는 2.3%, 2.3% 및 1.8%로 각각 나타났으며, 기기간 증폭신호의 변동계수는 4.2%로 확인되었다.
다음의 3개의 변동계수(coefficient of variation)가 비교 분석 되었다: (i) 실시예 <1-2>의 하드웨어적으로 미보정된 기기에서 수득한 데이터 세트의 신호 변동계수, (ii) 실시예 <1-3>의 하드웨어적으로 보정된 기기에서 수득한 데이터 세트의 신호 변동계수 및 (iii) 본 실시예의 하드웨어적으로 보정된 기기에서 수득한 데이터 세트를 RS를 이용한 RSN 방법에 의하여 보정하여 제공된 보정된 데이터 세트의 신호 변동계수.
표 13에서 보는 바와 같이, RS를 이용한 RSN 방법에 의하여 보정된 데이터 세트는 다음과 같은 특징을 가진다: 하드웨어적으로 미보정된 기기에서 수득한 데이터 세트와 비교하였을 때, (i) 기기내 증폭 신호의 변동계수는 절반이상 대폭 감소하는 것을 확인하였으며, (ii) 기기간 증폭 신호의 변동계수는 45.1 %p (percentage points)만큼 대폭 감소하는 것을 확인하였다. 또한, 하드웨어적으로 보정된 기기에서 수득한 데이터 세트와 비교하였을 때, (i) 기기내 증폭 신호의 변동계수는 절반이상 대폭 감소하는 것을 확인하였으며, (ii) 기기간 증폭 신호의 변동계수는 13.5 %p (percentage points)만큼 감소하는 것을 확인하였다.
본 발명의 RSN 방법은 기기간 뿐만 아니라 기기내 웰간 신호 편차를 감소시킬 수 있음을 확인하였다. 특히, 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트도 RSN에 의하여 추가로 보정될 수 있으며, 이로서 데이터 세트의 기기간 및 기기내 편차도 더욱 정교하게 정정될 수 있음을 확인하였다.
| 보정 방법 | RS를 이용한 RSN | - | - | + |
| 하드웨어 조정 | - | + | + | |
| 증폭신호 분석결과 (변동계수, CV %) |
기기 1 | 5.2 | 5.3 | 2.3 |
| 기기 2 | 9.1 | 7.8 | 2.3 | |
| 기기 3 | 4.5 | 4.8 | 1.8 | |
| Total | 49.3 | 17.7 | 4.2 |
<4-6> IBS-RSN에 의하여 소프트웨어적으로 보정된 데이터 세트의 분석
기기 블랭크 신호에 해당하는 신호값을 데이터 세트로부터 차감하는 경우, RSN 방법을 이용한 데이터 세트의 보정은 더욱 정확해진다. 본 실시예에서는 증폭신호의 편차를 보정하기 위하여 기기 블랭크 신호 제거 및 기준 신호 기반 표준화 방법(Instrument Blank signal Subtraction and Reference Signal-based Normalization; IBS-RSN)을 이용하였다. 실시예 <1-1>에서 수득한 6개 그룹의 원시 데이터 세트를 다음의 단계에 따라 IBS-RSN 방법으로 소프트웨어적으로 보정하였다.
<단계 1>
실시예 <1-1>의 원시 데이터 세트로부터 실시예 <4-2>에서 측정한 기기 블랭크 신호를 다음식과 같이 차감하여 1차 보정된 데이터 세트를 수득하였다.
1차 보정된 데이터 세트 = 원시 데이터 세트 - 기기 블랭크 신호
상기 식을 이용하여 계산하여, 하드웨어적으로 미보정된 기기의 원시 데이터 세트를 이용하여 수득한 3개 그룹의 1차 보정 데이터 세트 및 하드웨어적으로 보정된 기기의 원시 데이터 세트를 이용하여 수득한 3개 그룹의 1차 보정 데이터 세트를 포함하는 총 6개 그룹의 1차 보정된 데이터 세트들이 제공되었다.
<단계 2>
상기 1차 보정된 데이터 세트의 배경지역 (베이스라인 영역)의 특정 사이클이 기준 사이클로 지정되었다. 본 실시예에서는 5번째 사이클 또는 3번째에서 5번째 사이클 영역이 기준 사이클(RC)로 지정되었다. 각 데이터 세트의 5번째 사이클의 신호값 또는 3번째에서 5번째 사이클 영역의 신호값의 평균값이 각 데이터 세트의 기준 신호(RS)로 지정되었다.
<단계 3>
각 데이터 세트의 모든 사이클의 신호값들이 각 데이터 세트로부터 수득한 RS를 이용하여 보정되었다.
2차 보정된 신호값 (RFU) = 1차 보정된 데이터 세트의 신호값 (RFU)÷RS
상기 단계 1 내지 3에 따라, 6개 그룹의 1차 보정된 데이터 세트들을 보정하여 6개 그룹의 2차 보정된 데이터 세트들을 수득하였다.
A. 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트의 보정 결과 분석
하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트들을 기준 신호를 이용한 RSN 방법에 의해 보정하였으며, 그 결과인 보정 데이터 세트를 분석하였다(도 19A-D 참조).
데이터 세트의 5번째 사이클에서의 신호값을 기준신호로 이용한 RSN 방법에 의하여 데이터 세트를 보정한 결과가 도 19A 및 19B에 나타나 있다.
도 19B에 나타난 바와 같이, 증폭 신호의 기기내 변동 계수는 각각 1.1%, 1.3% 및 0.8%로 나타났으며, 기기간 증폭신호의 변동계수는 1.3%로 확인되었다.
3번째에서 5번째 사이클 영역의 신호값의 평균값을 기준신호로 이용한 RSN 방법에 의하여 데이터 세트를 보정한 결과가 도 19C 및 19D에 나타나 있다.
도 19D에 나타난 바와 같이, 증폭 신호의 기기내 변동 계수는 각각 1.2%, 1.3% 및 0.9%로 나타났으며, 기기간 증폭신호의 변동계수는 1.3%로 확인되었다.
다음의 4개의 변동계수가 비교 분석 되었다: (i) 실시예 <1-2>의 하드웨어적으로 미보정된 기기에서 수득한 데이터 세트의 신호 변동계수, (ii) 실시예 <1-3>의 하드웨어적으로 보정된 기기에서 수득한 데이터 세트의 신호 변동계수, (iii) 본 실시예의 하드웨어적으로 미보정된 기기에서 수득한 데이터 세트를 하나의 기준 사이클에서의 기준 신호를 이용한 RSN 방법에 의하여 보정하여 제공된 보정된 데이터 세트의 신호 변동계수, 및 (iv) 본 실시예의 하드웨어적으로 미보정된 기기에서 수득한 데이터 세트를 2 이상의 기준 사이클에서의 평균 기준 신호를 이용한 RSN 방법에 의하여 보정하여 제공된 보정된 데이터 세트의 신호 변동계수.
표 14에서 보는 바와 같이, 기준 신호를 이용한 RSN 방법에 의하여 보정된 데이터 세트는 다음과 같은 특징을 가진다: (i) 기기내 증폭 신호의 변동계수는 절반이상 대폭 감소하는 것을 확인하였으며, (ii) 기기간 증폭 신호의 변동계수는 48.0 %p (percentage points)만큼 대폭 감소하는 것을 확인하였다. 또한, 하드웨어적으로 보정된 기기에서 수득한 데이터 세트와 비교하였을 때, (i) 기기내 증폭 신호의 변동계수는 절반이상 대폭 감소하는 것을 확인하였으며, (ii) 기기간 증폭 신호의 변동계수는 16.4 %p (percentage points)만큼 현저히 감소하는 것을 확인하였다.
본 발명의 IBS-RSN 방법을 이용한 본 발명의 신호 보정 방법은 기기간 및 기기내 웰간 신호 편차를 감소시킬 수 있음을 확인하였다. 특히, IBS-RSN 방법은 하드웨어 기반의 보정 방법에 비하여 탁월한 보정 효과를 가지며, 이는 기기의 하드웨어적 보정 없이도 IBS-RSN 방법에 의하여 하드웨어적 보정보다 월등히 우수한 신호 보정 효과를 달성할 수 있음을 시사한다.
| 보정 방법 | RS를 이용한 RSN | - | - | + (5번째 사이클에서의 RS) |
+ (3번째 내지 5번째 사이클의 RS) |
| 하드웨어 조정 | - | + | - | - | |
| 증폭신호 분석결과 (변동계수, CV %) |
기기 1 | 5.2 | 5.3 | 1.1 | 1.2 |
| 기기 2 | 9.1 | 7.8 | 1.3 | 1.3 | |
| 기기 3 | 4.5 | 4.8 | 0.8 | 0.9 | |
| Total | 49.3 | 17.7 | 1.3 | 1.3 |
B. 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트의 보정 결과 분석
하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트를 기준 신호를 이용한 RSN 방법에 의하여 보정하였으며, 그 결과인 보정된 데이터 세트를 분석하였다(도 20A 및 20D 참조).
데이터 세트의 5번째 사이클에서의 신호값을 기준신호로 이용한 RSN 방법에 의하여 데이터 세트를 보정한 결과가 도 20A 및 20B에 나타나 있다.
도 20B에 나타난 바와 같이, 증폭 신호의 기기내 변동 계수는 각각 1.2%, 1.7% 및 0.9%로 나타났으며, 기기간 증폭신호의 변동계수는 1.6%로 확인되었다.
3번째에서 5번째 사이클 영역의 신호값의 평균값을 기준신호로 이용한 RSN 방법에 의하여 데이터 세트를 보정한 결과가 도 20C 및 20D에 나타나 있다.
도 20D에 나타난 바와 같이, 증폭 신호의 기기내 변동 계수는 각각 1.3%, 1.7% 및 1.0%로 나타났으며, 기기간 증폭신호의 변동계수는 1.6%로 확인되었다.
다음의 4개의 변동계수가 비교 분석 되었다: (i) 실시예 <1-2>의 하드웨어적으로 미보정된 기기에서 수득한 데이터 세트의 신호 변동계수, (ii) 실시예 <1-3>의 하드웨어적으로 보정된 기기에서 수득한 데이터 세트의 신호 변동계수, (iii) 본 실시예의 하드웨어적으로 보정된 기기에서 수득한 데이터 세트를 하나의 기준 사이클에서의 기준 신호를 이용한 RSN 방법에 의하여 보정하여 제공된 보정된 데이터 세트의 신호 변동계수, 및 (iv) 본 실시예의 하드웨어적으로 보정된 기기에서 수득한 데이터 세트를 2 이상의 기준 사이클에서의 평균 기준 신호를 이용한 RSN 방법에 의하여 보정하여 제공된 보정된 데이터 세트의 신호 변동계수.
표 15에서 보는 바와 같이, 기준 신호를 이용한 RSN 방법에 의하여 보정된 데이터 세트는 다음과 같은 특징을 가진다: (i) 기기내 증폭 신호의 변동계수는 절반이상 대폭 감소하는 것을 확인하였으며, (ii) 기기간 증폭 신호의 변동계수는 47.7 %p (percentage points)만큼 대폭 감소하는 것을 확인하였다. 또한, 하드웨어적으로 보정된 기기에서 수득한 데이터 세트와 비교하였을 때, (i) 기기내 증폭 신호의 변동계수는 절반이상 대폭 감소하는 것을 확인하였으며, (ii) 기기간 증폭 신호의 변동계수는 16.1 %p (percentage points)만큼 감소하는 것을 확인하였다.
본 발명의 IBS-RSN 방법을 이용한 본 발명의 신호 보정 방법은 기기간 및 기기내 웰간 신호 편차를 감소시킬 수 있음을 확인하였다. 특히, 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트도 IBS-RSN에 의하여 추가로 보정될 수 있으며, 이로서 데이터 세트의 기기간 및 기기내 편차도 더욱 정교하게 정정될 수 있음을 확인하였다.
| 보정 방법 | RS를 이용한 RSN | - | - | + (5번째 사이클에서의 RS) |
+ (3번째 내지 5번째 사이클의 RS) |
| 하드웨어 조정 | - | + | + | + | |
| 증폭신호 분석결과 (변동계수, CV %) |
기기 1 | 5.2 | 5.3 | 1.2 | 1.3 |
| 기기 2 | 9.1 | 7.8 | 1.7 | 1.7 | |
| 기기 3 | 4.5 | 4.8 | 0.9 | 1.0 | |
| Total | 49.3 | 17.7 | 1.6 | 1.6 |
IBS-RSN을 이용하여 실시간 PCR 기기의 신호를 보정하는 본 발명의 방법은 간편하고 소프트웨어적 방식으로 기기내 및 기기간 신호 편차를 감소시키는데 활용될 수 있으며, RSN을 이용한 방법에 비하여 우수한 보정 효과를 나타낸다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (23)
- 다음의 단계를 포함하는 샘플 내 타겟 분석물질에 대한 데이터 세트의 보정 방법:
(a) 상기 데이터 세트 보정을 위한 분석물질-비의존적 신호값을 제공하는 단계; 상기 데이터 세트는 신호발생수단을 이용한 상기 타겟 분석물질에 대한 신호발생반응으로부터 수득되며; 상기 데이터 세트는 상기 신호발생반응의 사이클들 및 신호값들을 포함하는 복수의 데이터 지점을 포함하며; 상기 분석물질-비의존적 신호값은 (i) 상기 데이터 세트의 배경지역-대표 신호값에 의하여; 또는 (ii) 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값에 의하여 제공되며; 상기 배경지역-대표 신호값은 상기 데이터 세트의 기준 사이클에서의 신호값에 의하여 제공되며, 상기 기준 사이클은 데이터 세트에서 샘플 내 타겟 분석물질의 존부에 비의존적으로 신호가 발생하는 배경지역 내에서 선택되며; 상기 표준 데이터 세트는 타겟 분석물질의 표준물질에 대한 신호발생반응에 의하여 제공되며; 및
(b) 상기 분석물질-비의존적 신호값을 상기 데이터 세트의 신호값들에 적용하여 보정된 신호값들을 수득하여 보정된 데이터 세트를 제공하는 단계.
- 제1항에 있어서, 상기 분석물질-비의존적 신호값은 (i) 상기 데이터 세트의 배경지역-대표 신호값 또는 (ii) 표준 데이터 세트를 위한 신호발생반응에 의하여 수득된 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 상기 보정된 데이터 세트는 상기 데이터 세트의 신호값들을 상기 분석물질-비의존적 신호값으로 나누어 수득한 보정된 신호값들에 의하여 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 타겟 분석물질에 대한 데이터 세트는 샘플 내 상기 타겟 분석물질의 존재 또는 부존재를 나타내는 정보를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 신호발생반응은 샘플 내 상기 타겟 분석물질의 존재에 의존적으로 신호를 발생시키는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 신호발생반응은 상기 신호값의 증폭 반응인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 타겟 분석물질은 타겟 핵산 분자인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 신호발생반응은 타겟 핵산 분자의 증폭이 동반되거나, 동반되지 않고 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 신호발생반응은 PCR(polymerase chain reaction) 또는 실시간 PCR인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 신호발생반응은 별도의 반응용기들에서 수행되는 동종의 타겟 분석물질에 대한 복수의 신호발생반응을 포함하며, 상기 데이터 세트는 상기 복수의 신호발생반응에서 수득된 복수의 데이터 세트인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 기준 사이클은 각 데이터 세트의 기준 사이클 그룹에서 선택되며, 상기 각 데이터 세트의 상기 기준 사이클 그룹은 서로 동일한 방식으로 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 복수의 데이터 세트의 각 데이터 세트의 보정을 위하여 동일한 기준 사이클이 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 복수의 데이터 세트는 적어도 2개의 데이터 세트 그룹으로 분류되며, 각 데이터 세트 그룹을 보정하기 위하여 각각 독립적인 총 신호 변화값이 제공되며; 상기 각 데이터 세트 그룹은 1 이상의 데이터 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 복수의 데이터 세트 각각을 보정하기 위하여 대표 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값이 동일하게 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 복수의 신호발생반응은 서로 상이한 기기(instrument)에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 (a)의 데이터 세트는 변형된 데이터 세트인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 (a)의 데이터 세트는 블랭크 신호값이 제거된 데이터 세트인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 블랭크 신호값은 신호발생수단을 사용하지 않고 수득된 신호값인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 보정된 데이터 세트는 샘플 내 타겟 분석물질의 정성적 또는 정량적 검출에 이용되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 방법은 다음의 단계를 상기 단계 (a) 이전에 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법: 샘플 내 타겟 분석물질에 대한 데이터 세트를 수득하기 위하여 신호발생반응을 수행하는 단계.
- 샘플 내 타겟 분석물질에 대한 데이터 세트의 보정 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 지시를 포함하는 컴퓨터 해독 가능한 기록매체로서, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 상기 데이터 세트 보정을 위한 분석물질-비의존적 신호값을 제공하는 단계; 상기 데이터 세트는 신호발생수단을 이용한 상기 타겟 분석물질에 대한 신호발생반응으로부터 수득되며; 상기 데이터 세트는 상기 신호발생반응의 사이클들 및 신호값들을 포함하며; 상기 분석물질-비의존적 신호값은 (i) 상기 데이터 세트의 배경지역-대표 신호값에 의하여; 또는 (ii) 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값에 의하여 제공되며; 상기 배경지역-대표 신호값은 상기 데이터 세트의 기준 사이클에서의 신호값에 의하여 제공되며, 상기 기준 사이클은 데이터 세트에서 샘플 내 타겟 분석물질의 존부에 비의존적으로 신호가 발생하는 배경지역 내에서 선택되며; 상기 표준 데이터 세트는 타겟 분석물질의 표준물질에 대한 신호발생반응에 의하여 제공되며; 및
(b) 상기 분석물질-비의존적 신호값을 상기 데이터 세트의 신호값들에 적용하여 보정된 신호값들을 수득하여 보정된 데이터 세트를 제공하는 단계.
- (a) 컴퓨터 프로세서, 및 (b) 상기 컴퓨터 프로세서에 커플링된 상기 제21항의 컴퓨터 해독가능한 기록매체를 포함하는, 샘플 내 타겟 분석물질에 대한 데이터 세트의 보정 장치.
- 샘플 내 타겟 분석물질에 대한 데이터 세트의 보정방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는, 컴퓨터 해독가능한 기록매체에 저장되는 컴퓨터 프로그램으로서, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 상기 데이터 세트 보정을 위한 분석물질-비의존적 신호값을 제공하는 단계; 상기 데이터 세트는 신호발생수단을 이용한 상기 타겟 분석물질에 대한 신호발생반응으로부터 수득되며; 상기 데이터 세트는 상기 신호발생반응의 사이클들 및 신호값들을 포함하며; 상기 분석물질-비의존적 신호값은 (i) 상기 데이터 세트의 배경지역-대표 신호값에 의하여; 또는 (ii) 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값에 의하여 제공되며; 상기 배경지역-대표 신호값은 상기 데이터 세트의 기준 사이클에서의 신호값에 의하여 제공되며, 상기 기준 사이클은 데이터 세트에서 샘플 내 타겟 분석물질의 존부에 비의존적으로 신호가 발생하는 배경지역 내에서 선택되며; 상기 표준 데이터 세트는 타겟 분석물질의 표준물질에 대한 신호발생반응에 의하여 제공되며; 및
(b) 상기 분석물질-비의존적 신호값을 상기 데이터 세트의 신호값들에 적용하여 보정된 신호값들을 수득하여 보정된 데이터 세트를 제공하는 단계.
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