JP5835683B2 - 牛a群ロタウイルスおよび牛コロナウイルスの迅速同時検出方法 - Google Patents
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Description
[1] 以下の(a)のオリゴヌクレオチドと、(b)のオリゴヌクレオチドとから構成される、牛A群ロタウイルス(BRV)検出用プライマーセット。
(a) 配列番号1に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または、配列番号1に示す塩基配列に対して90%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、牛A群ロタウイルス検出用プライマーとして機能しうるオリゴヌクレオチド
(b) 配列番号2に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または、配列番号2に示す塩基配列に対して90%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、牛A群ロタウイルス検出用プライマーとして機能しうるオリゴヌクレオチド
[2] 以下の(c)のオリゴヌクレオチドと、(d)のオリゴヌクレオチドとから構成される、牛コロナウイルス(BCoV)検出用プライマーセット。
(c) 配列番号3に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または、配列番号3に示す塩基配列に対して90%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、牛コロナウイルス検出用プライマーとして機能しうるオリゴヌクレオチド
(d) 配列番号4に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または、配列番号4に示す塩基配列に対して90%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、牛コロナウイルス検出用プライマーとして機能しうるオリゴヌクレオチド
[3] [1]に記載のプライマーセットと[2]に記載のプライマーセットを含む、牛A群ロタウイルス(BRV)と牛コロナウイルス(BCoV)の同時検出用キット。
[4] 検体より抽出したRNAを鋳型とし、[1]に記載のプライマーセットを用いてRT-PCR増幅を行い、得られた増幅産物を検出する工程を含む、牛A群ロタウイルス(BRV)の検出方法。
[5] 検体より抽出したRNAを鋳型とし、[2]に記載のプライマーセットを用いてRT-PCR増幅を行い、得られた増幅産物を検出する工程を含む、牛コロナウイルス(BCoV)の検出方法。
[6] 検体より抽出したRNAを鋳型とし、[1]に記載のプライマーセットと[2]に記載のプライマーセットの両方を用いてPCR増幅を行い、得られた各増幅産物を検出する工程を含む、牛A群ロタウイルス(BRV)と牛コロナウイルス(BCoV)の同時検出方法。
[7] 検体が糞便である、[4]〜[6]のいずれかに記載の方法。
(a) BRVのVP6遺伝子、およびBCoVのN遺伝子のPCR増幅産物を電気泳動した場合にそれらの泳動距離の差が明確になる程度に、PCR増幅産物の大きさが異なること。
(b) 増幅される領域の塩基数が、BRVでは370〜390bp、BCoVでは590〜610bpであること。
(c) プライマー長は鋳型DNAとの間の特異的なアニーリングが可能とするために、15〜25bpの範囲であること。
(d)アニーリング温度はTm(melting temperature)に依存するので、特異性の高いPCR増幅産物を得るため、Tm値が55〜65℃で互いに近似したプライマーを選定すること。
(e)プライマーの3’末端の塩基配列と鋳型DNA配列との相同性が高いこと。
(f) プライマーはダイマーや立体構造を形成しないように、両プライマー間の相補的配列を避けること。
(g) 鋳型DNAとの安定な結合を確保するため、GC含量を約50%にし、プライマー内においてGC-richあるいはAT-richが偏在しないようにする。
BRVF:5’-ATGGGTACGATGTGGCTCAA-3’(配列番号1)
BRVR:5’-ACCGCTGGTGTCATGTTTGG-3’(配列番号2)
BCoVF:5’-CGATCAGTCCGACCAATCTA-3’(配列番号3)
BCoVR:5’-GAGGTAGGGGTTCTGTTGCC-3’(配列番号4)
GenBankに登録されている46株の牛A群ロタウイルス(BRV)のVP6遺伝子、17株の牛コロナウイルス(BCoV)のN遺伝子の塩基配列をGenBankよりダウンロードし、アラインメントソフト(DNASTAR)を用いてウイルス株相互のアラインメントを行い、上記の標的配列においてウイルス株間で保存性の高い配列(高度保存配列)を検索した。また、Oligo 6.31 (http://www.oligo.net/)を用いて、至適のプライマーとなりうる領域を検索したところ、BRVのVP6遺伝子の高度保存配列は552-571位と915-934位に、BCoVのN遺伝子の高度保存配列は29477-29496位と30054-30073位に見出された。BRVについては、上記552-571位の高度保存配列に相補的なフォワードプライマー、および、915-934位の高度保存配列に相補的なリバースプライマーを、候補プライマーとして設計した。BCoVについては、上記29477-29496位の高度保存配列に相補的なフォワードプライマー、および、上記30054-30073位の高度保存配列に相補的なリバースプライマーを、候補プライマーとして複数設計した。最終的に、下記の2組のプライマーセットを確立した。
BRVF:5’-ATGGGTACGATGTGGCTCAA-3(配列番号1)
BRVR:5’-ACCGCTGGTGTCATGTTTGG-3’(配列番号2)
BCoVF:5’-CGATCAGTCCGACCAATCTA-3’(配列番号3)
BCoVR:5’- GAGGTAGGGGTTCTGTTGCC-3’(配列番号4)
検体としてBRV(6505株)およびBCoV(カケガワ株)の培養上清を用いた。100μlの培養上清からRNAをQIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN社)を用いて抽出し、50μlのRNA抽出液を得た。得られたRNA抽出液(RNAサンプル)5μlをPCRの鋳型とし、実施例1で確立したBRV検出用プライマーセットとBCoV検出用プライマーセットを用い、one-step RT-PCR(Takara One Step RT-PCR Kit AMV;TAKARA社)を1 tubeあたり50μlの反応液で実施した。
RNAサンプル 5μl
各プライマー(20mM) 1μl X 4
RT-PCR緩衝液 5μl
AMV Reverse Transciptase XL (5U/μl) 1μl
RNase inhibitor (40U/μl) 1μl
MgCl2 (25mM) 10μl
dNTP mixture (各10mM) 5μl
DNAポリメラーゼ(AMV-Optimized Taq: 5U/μl) 1μl
RNase Free dH2O 18μl
50℃で30分の逆転写(RT)反応の後、最初に94℃で5分の熱変性反応、次いで94℃で50秒の熱変性反応、55℃で50秒のアニーリング、72℃で60秒の伸長反応を1サイクルとして計30サイクルを行い、最後に72℃で10分の伸長反応を行った。
下痢症状を呈した牛の糞便検体(28検体)をPBS(リン酸緩衝液)で20%(v/v)に希釈し、遠心(750×g, 10分)により上清を得た。100μlの上清から、実施例2と同様にしてRNAを抽出し、前記BRV検出用プライマーセットとBCoV検出用プライマーセットを用いて、実施例2と同条件にてPCRを行い、BRVとBCoVの同時検出を行った。
Claims (7)
- 以下の(a)のオリゴヌクレオチドと、(b)のオリゴヌクレオチドとから構成される、牛A
群ロタウイルス(BRV)検出用プライマーセット。
(a) 配列番号1に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または、配列番号1に示
す塩基配列に対して90%以上の同一性を有する塩基配列からなり、牛A群ロタウイルス検出用プライマーとして配列番号1に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと同一の機能を有するオリゴヌクレオチド
(b) 配列番号2に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または、配列番号2に示
す塩基配列に対して90%以上の同一性を有する塩基配列からなり、牛A群ロタウイルス検出用プライマーとして配列番号2に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと同一の機能を有するオリゴヌクレオチド - 以下の(c)のオリゴヌクレオチドと、(d)のオリゴヌクレオチドとから構成される、牛コ
ロナウイルス(BCoV)検出用プライマーセット。
(c) 配列番号3に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または、配列番号3に示
す塩基配列に対して90%以上の同一性を有する塩基配列からなり、牛コロナウイルス検出用プライマーとして配列番号3に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと同一の機能を有するオリゴヌクレオチド
(d) 配列番号4に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または、配列番号4に示
す塩基配列に対して90%以上の同一性を有する塩基配列からなり、牛コロナウイルス検出用プライマーとして配列番号4に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと同一の機能を有するオリゴヌクレオチド - 請求項1に記載のプライマーセットと請求項2に記載のプライマーセットを含む、牛A
群ロタウイルス(BRV)と牛コロナウイルス(BCoV)の同時検出用キット。 - 検体より抽出したRNAを鋳型とし、請求項1に記載のプライマーセットを用いてRT-PCR増幅を行い、得られた増幅産物を検出する工程を含む、牛A群ロタウイルス(BRV)の検出方法。
- 検体より抽出したRNAを鋳型とし、請求項2に記載のプライマーセットを用いてRT-PCR増幅を行い、得られた増幅産物を検出する工程を含む、牛コロナウイルス(BCoV)の検出方法。
- 検体より抽出したRNAを鋳型とし、請求項1に記載のプライマーセットと請求項2に記
載のプライマーセットの両方を用いてPCR増幅を行い、得られた各増幅産物を検出する工
程を含む、牛A群ロタウイルス(BRV)と牛コロナウイルス(BCoV)の同時検出方法。 - 検体が糞便である、請求項4〜6のいずれかに記載の方法。
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