CN114774583A - 一种同时检测BCoV和BRV的试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种同时检测BCoV和BRV的试剂盒，针对BCoV和BRV基因序列发明了特异性引物和探针，并且可以同时检测BCoV和BRV；所述试剂盒具有高灵敏度，能够直接定量，自动分析出结果，不依赖Ct值，不用建立标准曲线；快速高效、操作简便、重复性好的优点，可以对低丰度的目的基因进行检测的特点，通过临床试验对比现有的qPCR检测，BCoV检出阳性样本9个，阳性率为10.98％；BRV检出阳性样本10个，阳性率为12.2％。而采用本申请提供试剂盒检出BCoV阳性样本15个，阳性率为18.29％；BRV检出阳性样本12个，阳性率为14.63％；BCoV和BRV混合感染检出阳性样本5个，阳性率为6.1％。通过应本申请提供的检测试剂盒，为有效防控BCoV和BRV提供技术支持，对于养牛业具有巨大的潜在开发价值。

Description

一种同时检测BCoV和BRV的试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及病毒检测试剂盒的技术领域，更具体的涉及一种同时检测牛冠状病毒和牛轮状病毒的试剂盒与应用的技术领域。
技术背景
牛冠状病毒，BCoV属于冠状毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)的一种多形性、有囊膜、单股正链的RNA病毒。1972年美国的Mebus等在犊牛和成年牛的腹泻病料中检出BCoV，我国也于1995年成功分离获得一株牛冠状病毒，该病呈世界性分布。BCoV也可感染隐窝肠细胞，使小肠和结肠隐窝的绒毛萎缩，固有层坏死，可引起1周至3个月龄的新生牛犊出现水样腹泻。BCoV主要的感染途径是粪口感染和呼吸道气溶胶感染，携带病原体的动物从上呼吸道粘膜分泌物和消化道的排泄物中排毒，造成同群其它动物感染发病。感染牛可持续带毒并排毒，导致牛群持续发病。
牛轮状病毒(Bovine rotavirus，BRV)属于呼肠孤病毒科轮状病毒属的双股RNA病毒。1969年Mebus最早在犊牛中发现轮状病毒，之后澳大利亚科学家也发现了同类病毒。1980年福建畜牧兽医研究所首次在我国发现BRV的存在，随后在各地牛群中陆续分离出不同株型的BRV。该病毒可引起1～7日龄犊牛精神沉郁、酸中毒，并会出现食欲废绝及水样腹泻等临床症状。该病可通过粪-口途径传播，主要感染空肠和回肠成熟的绒毛上皮细胞。该病毒具有株型众多、易发重排、宿主广泛、传播迅速等生物学特性，加之该病致死率最高达50％，尚无高效疫苗和特效药物，使得牛养殖业遭受了巨大的经济损失。另外，已证实轮状病毒可在人畜间交叉传播，也对人类公共卫生安全存在潜在威胁
发明内容
针对目前致犊牛腹泻的主要病毒危害养牛业和现有检测方法不足的问题。本发明旨在提供一种具有灵敏度高、特异性好、准确度和精确度高，可实现精确定量，能够同时检测出BCoV和BRV的检测试剂盒。通过应用该试剂盒能够实现便利、快速、高效、灵敏、痕量、特异、绝对定量的对BCoV和BRV进行检测的方法，该试剂盒为后续对这两种病毒的预防、早期诊断、及时防控和净化具有重要意义。
为了实现本发明的目的,本发明的技术方案如下：
本申请提供一种同时检测BCoV和BRV的试剂盒，所述试剂盒中含有特异性引物和探针组合，包括以下2对特异性引物和2条特异探针，其核苷酸序列分别为：
BCOV上游引物：5’-GATCTACTTCACGCGCATCC-3’，
BCOV下游引物：5’-GTGGCTTAGTGGCATCCTTG-3’，
BCOV探针：5’-FAM-TGGCTCTACTGCGCGATCCTGCA-BHQ1-3’；
BRV上游引物：5’-CAATGTGGCTGAATGCAGGA-3’，
BRV下游引物：5’-GCGGTAGTCAACACTCTTCG-3’，
BRV探针：5’-HEX-TGCGCTATCAACGCACCAGCT-BHQ1-3’。
所述同时检测BCoV和BRV的试剂盒，中包括：(1)上述两套引物和探针；(2)2×ddPCR SuperMix for Probes；(3)RNase-Free ddH2O；(4)待检测样品的cDNA；(5)微滴生成油；(6)微滴发生卡；(7)微滴发生卡密封胶垫；(8)96孔PCR反应板；(9)热封箔膜。
更进一步的，本申请还提供一种同时检测BCoV和BRV的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
(1)、提取待检样品的总RNA，反转录为cDNA；
(2)、配置ddPCR反应体系，并加入待检样品的cDNA；
(3)、微滴的生成；
(4)、微滴PCR扩增反应；
(5)、反应结束后，机器读取荧光信号，自动计算目的基因含量；样品检测结果≥1copies/μL判断为阳性，样品检测结果＜1copies/μL判断为阴性。
所述双重ddPCR反应总体系为20μL，其中包括：(1)2×ddPCR SuperMix forProbes10μL；(2)两套上、下游引物分别加450nM；(3)两种探针分别加250nM；(4)待检cDNA模板2μL；(5)RNase-Free ddH2O补足至20μL。
所述微滴PCR扩增反应条件为：95℃预变性10min；94℃变性30s，58℃退火1min，40个循环；98℃10min；4℃终止反应，升降温速率2℃/s。
更进一步的，本申请还提供了一种同时检测BCoV和BRV的试剂盒在同时检测BCoV和BRV中的应用。
本申请还提供了一种同时检测BCoV和BRV试剂盒的使用方法在同时检测BCoV和BRV中的应用。
通过采用上述提供的技术方案，本发明获得以下有益效果∶
本发明提供一种同时检测BCoV和BRV的试剂盒，针对BCoV和BRV基因序列发明了特异性引物和探针，并且可以同时检测BCoV和BRV；所述试剂盒具有高灵敏度，能够直接定量，自动分析出结果，不依赖Ct值，不用建立标准曲线；快速高效、操作简便、重复性好的优点，可以对低丰度的目的基因进行检测的特点，通过临床试验对比现有的qPCR检测，BCoV检出阳性样本9个，阳性率为10.98％；BRV检出阳性样本10个，阳性率为12.2％。而采用本申请提供试剂盒检出BCoV阳性样本15个，阳性率为18.29％；BRV检出阳性样本12个，阳性率为14.63％；BCoV和BRV混合感染检出阳性样本5个，阳性率为6.1％。通过应本申请提供的检测试剂盒，为有效防控BCoV和BRV提供技术支持，对于养牛业具有巨大的潜在开发价值。
附图说明
图1所示为标准曲线。
其中图A为BCoV测定结果；图B为BRV测定结果，以下附图均相同。
图2所示为特异性检测结果。
图3所示为ddPCR敏感性试验结果。
其中图A及图B中1-8中质粒浓度为1×106～1×10-1copies/μL。
图4所示为ddPCR特异性试验结果。
图5所示为BCoV和BRV双重ddPCR反应结果。
具体实施方式：
以下实施例用于进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例一：BCoV和BRV qPCR和ddPCR检测引物和探针的设计与合成
本实施例根据Genbank已发表的BCoV和BRV基因组序列，针对基因保守区域进行适用于qPCR和ddPCR的特异性引物及相应的探针设计，由苏州金唯智生物科技有限公司进行合成。引物设计如下：
BCOV上游引物：5’-GATCTACTTCACGCGCATCC-3’，
BCOV下游引物：5’-GTGGCTTAGTGGCATCCTTG-3’，
BCOV探针：5’-FAM-TGGCTCTACTGCGCGATCCTGCA-BHQ1-3’；
BRV上游引物：5’-CAATGTGGCTGAATGCAGGA-3’，
BRV下游引物：5’-GCGGTAGTCAACACTCTTCG-3’，
BRV探针：5’-HEX-TGCGCTATCAACGCACCAGCT-BHQ1-3’。
实施例二：BCoV和BRV TaqMan探针荧光定量PCR方法的建立
使用天根生化科技(北京)有限公司的SuperReal荧光定量预混试剂(探针法)进行反应，设置BCoV和BRV的反应总体系均为20μL，其中2×SuperReal PreMix 10μL，上、下游引物浓度为300nM，探针浓度为200nM，模板2μL，ddH2O补足至20μL。反应条件为：95℃预变性15min；95℃变性10s，58℃退火30s，共40个循环。在该条件的基础上，对引物浓度、探针浓度进行优化。
(1)引物浓度优化
分别选用BCoV和BRV的质粒标准品浓度1×106copies/μL为模板，设定上、下游引物终浓度分别为200、300、400、500、600、700、800、900nM时进行TaqMan探针荧光定量PCR反应，确定最佳引物浓度。结果如表1所示：当BCoV和BRV上、下游引物终浓度为300nM时，反应Ct值最小。按照优先选取Ct值最小、用量最省的原则，分别选择300nM为BCoV和BRV的最佳引物浓度。
表1：引物浓度的优化
引物浓度(nM) BCoV(Ct值) BRV(Ct值)
200 23.9 23.62
300 23.89 23.54
400 24.88 23.81
500 23.96 24.02
600 23.95 23.68
700 23.9 23.75
800 23.96 23.6
900 23.87 23.77
(2)探针浓度优化
分别选用BCoV和BRV的质粒标准品浓度1×106copies/μL为模板，设定探针终浓度分别为150、200、250、300、350、400、450nM时进行TaqMan探针荧光定量PCR反应，确定最佳引物浓度。结果如表2所示：当BCoV和BRV探针终浓度分别为150nM和500nM时，反应Ct值最小。按照优先选取Ct值最小的原则，分别选择150nM和500nM为BCoV和BRV的最佳探针浓度。
表2：探针浓度的优化
探针浓度(nM) BCoV(Ct值) BRV(Ct值)
150 23.94 24.03
200 23.96 23.72
250 23.97 23.48
300 24.93 23.3
350 24.93 23.25
400 24.91 23.21
450 24.94 23.14
500 - 23.05
(3)标准曲线的建立
将初始浓度为1×1010copies/μL的BCoV和BRV质粒标准品进行10倍梯度稀释(1×109～1×102copies/μL)，进行qPCR反应，结果参见附图1，各浓度范围的扩增曲线均具有良好的线性关系。BCoV的标准曲线的回归方程为y＝-3.4792x+43.435，标准曲线相关系数(R2)为0.9993，扩增效率为93.83％。BRV的标准曲线的回归方程为y＝-3.369x+44.292，标准曲线相关系数(R2)为0.9997，扩增效率为98.07％。
(4)敏感性
将BCoV和BRV质粒标准品进行10倍稀释成8个梯度(1×109～1×102copies/μL)，进行qPCR反应。结果如表3所示，BCoV质粒浓度为1000copies/μL时，Ct值小于35，故该方法的检测下限为1000copies/μL；同理，BRV检测下限为1000copies/μL。
表3：敏感性
拷贝数(copies/μL) BCoV(Ct值) BRV(Ct值)
1×10<sup>9</sup> 12.08 14.07
1×10<sup>8</sup> 15.47 17.3
1×10<sup>7</sup> 18.92 20.65
1×10<sup>6</sup> 22.68 24.15
1×10<sup>5</sup> 26.27 27.37
1×10<sup>4</sup> 29.83 30.84
1×10<sup>3</sup> 33.05 33.92
1×10<sup>2</sup> 36.09 37.8
(5)特异性
利用已优化的qPCR方法分别对BCoV和BRV和H2O进行qPCR反应评估其特异性。结果参见附图2，仅当BCoV和BRV为阳性对照时有扩增曲线，其他均无扩增曲线，说明该方法特异性良好。
(6)重复性
利用已优化的BCoV和BRV qPCR方法评估重复性，对1×107～1×105copies/μL的质粒标准品进行批内和批间重复试验。结果如表4、表5所示，BCoV和BRV(的批内、批间重复试验变异系数均小于3％，表明本申请建立的BCoV和BRV qPCR检测方法重复性和稳定性良好。
表4：BCoV重复性
Figure BDA0003549163080000091
表5：BRV重复性
Figure BDA0003549163080000092
实施例三：BCoV和BRV单重ddPCR方法的建立
使用实施例一所述的引物组和探针，用已制备的BCoV和BRV质粒标准品为模板，采用Bio-Rad QX200 ddPCR系统进行ddPCR反应，其包括以下步骤：
(1)反应体系的配置：ddPCR实验采用Bio-Rad公司ddPCRTM SuperMix for Probes试剂盒，使用上述设计合成的引物及探针，设置BCoV和BRV单重ddPCR的反应总体系为20μL：(1)2×ddPCR SuperMix for Probes10μL；(2)上、下游引物450nM；(3)探针250nM；(4)待检cDNA模板2μL；(5)RNase-Free ddH2O补足至20μL。体系配置完成后，充分混匀后短暂离心去除气泡。
(2)微滴生成：将20μL样品反应体系加入已放入holder中的新DG8 cartridge中间一排的8个孔内，在DG8 cartridge最底下一排8个孔中各加入70μL微滴生成油(DG Oil)，盖上胶垫(gasket)，将以上holder轻轻地平稳放置于微滴生成仪中，开始生成微滴；微滴生成于DG8 cartridge最上面一排孔内，小心缓慢的吸取40μL微滴液，转移到96孔板内；全部加完后用预热好的PX1热封仪对96孔板进行封膜。
(3)微滴PCR扩增：封好膜之后进行PCR反应，在PCR仪上完成。反应条件为：反应条件为：95℃预变性10min；94℃变性30s，58℃退火1min，40个循环；98℃10min；4℃终止反应，升降温速率2℃/s。4℃稳定1小时后，进行下一步实验。
(4)微滴信号读取：将完成PCR扩增的96孔板放入plate holder中组装，轻轻地平稳放入微滴读取仪中；打开QuantaSoft软件，实验之前做一次Flush System，按照96孔板中样品信息进行设置，设置完成后即可进行荧光信号采集，结束后机器会自动分析结果，人工核实后保存结果。
实施例四：评估单重ddPCR的敏感性
将BCoV和BRV质粒标准品浓度稀释为1×106～1×10-1copies/μL，使用实例三的ddPCR反应体系和操作方法进行反应。结果参见附图3，所建立的BCoV ddPCR方法最低能检测到的浓度为1copies/μL；所建立的BRV ddPCR方法最低能检测到的浓度为2.4copies/μL。
实施例五：评估单重ddPCR的特异性
基于实例三的ddPCR反应体系和操作方法分别对BVDV、BEV、BCoV、BRV和H2O进行ddPCR反应评估其特异性。结果参加附图4，仅当BCoV和BRV为阳性对照时能产生阳性液滴，其他均为阴性液滴，说明该方法特异性良好。
实施例六：、评估单重ddPCR的重复性
基于实例三的ddPCR反应体系和操作方法分别对BCoV和BRV进行反应，同时重复3组，再分不同时段检测3次，计算拷贝数变异系数对BCoV和BRV单重ddPCR方法批内和批间重复性进行评估。结果如表6所示，BCoV批内、批间重复试验变异系数均小于5.1％。将BRV质粒标准品稀释为4.51×105和4.51×106copies/μL两个浓度进行批内和批间重复性试验，结果如表7所示，BRV批内、批间重复试验变异系数均小于5.1％。表明本研究建立的BCoV和BRVddPCR检测方法重复性和稳定性较好。
表6：BCoV ddPCR重复性
Figure BDA0003549163080000111
表7：BRV ddPCR重复性
Figure BDA0003549163080000121
实施例七：BCoV和BRV双重ddPCR方法的建立
使用实施例一所设计的引物组和探针，用已制备的BCoV和BRV质粒标准品为模板，使用实例三的ddPCR操作方法进行反应，双重ddPCR反应体系为：(1)2×ddPCR SuperMixfor Probes10μL；(2)两套上、下游引物分别加450nM；(3)两种探针分别加250nM；(4)待检cDNA模板2μL；(5)RNase-Free ddH2O补足至20μL。结果参见附图5，蓝色液滴代表BCoV的阳性液滴，绿色液滴代表BRV的阳性液滴，橙色液滴代表BCoV和BRV双阳性液滴。结果表明，本发明建立的BCoV和BRV双重ddPCR反应体系可对BCoV或BRV或BCoV和BRV同时检出。
实施例八：双重ddPCR临床样本的检测
本发明所用的82份犊牛腹泻样品均采集自新疆乌鲁木齐和昌吉地区周边牛场。样品于-80℃保存。
提取临床样本病毒总RNA，反转录为cDNA后，分别用qPCR和双重ddPCR方法进行检测。结果如表8所示，qPCR中，BCoV检出阳性样本9个，阳性率为10.98％；BRV检出阳性样本10个，阳性率为12.2％。ddPCR中，BCoV和BRV双重ddPCR中检出BCoV阳性样本15个，阳性率为18.29％；BRV检出阳性样本12个，阳性率为14.63％；BCoV和BRV混合感染检出阳性样本5个，阳性率为6.1％。以上结果说明，ddPCR检测灵敏度更高，能够检测出痕量病毒样品，且操作更加简便，无需建立标准曲线就可以进行绝对定量。
表8：临床样本检测结果
Figure BDA0003549163080000131
综上所述，本发明提供的一种基于微滴式数字PCR技术检测牛冠状病毒和牛轮状病毒的引物、探针和方法，灵敏度高、重复性好，能精准检测、且高效便捷，结果可靠，可应用于临床上牛冠状病毒和牛轮状病毒感染的检测，同时还能对牛冠状病毒和牛轮状病毒进行绝对定量，有利于牛冠状病毒和牛轮状病毒的监测和防控。
如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。

Claims (7)

1.一种同时检测BCoV和BRV的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有特异性引物和探针组合，包括以下2对特异性引物和2条特异探针，其核苷酸序列分别为：
BCOV上游引物：5’-GATCTACTTCACGCGCATCC-3’，
BCOV下游引物：5’-GTGGCTTAGTGGCATCCTTG-3’，
BCOV探针：5’-FAM-TGGCTCTACTGCGCGATCCTGCA-BHQ1-3’；
BRV上游引物：5’-CAATGTGGCTGAATGCAGGA-3’，
BRV下游引物：5’-GCGGTAGTCAACACTCTTCG-3’，
BRV探针：5’-HEX-TGCGCTATCAACGCACCAGCT-BHQ1-3’。
2.如权利要求1中所述的一种用于同时检测BCoV和BRV的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：(1)如权利要求1中所述的两套引物和探针；(2)2×ddPCR SuperMixforProbes；(3)RNase-Free ddH2O；(4)待检测样品的cDNA；(5)微滴生成油；(6)微滴发生卡；(7)微滴发生卡密封胶垫；(8)96孔PCR反应板；(9)热封箔膜。
3.如权利要求1所述的一种同时检测BCoV和BRV的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、提取待检样品的总RNA，反转录为cDNA；
(2)、配置ddPCR反应体系，并加入待检样品的cDNA；
(3)、微滴的生成；
(4)、微滴PCR扩增反应；
(5)、反应结束后，机器读取荧光信号，自动计算目的基因含量；样品检测结果≥1copies/μL判断为阳性，样品检测结果＜1copies/μL判断为阴性。
4.如权利要求3所述的一种同时检测BCoV和BRV的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述双重ddPCR反应总体系为20μL，其中包括：(1)2×ddPCR SuperMix forProbes 10μL；(2)两套上、下游引物分别加450nM；(3)两种探针分别加250nM；(4)待检cDNA模板2μL；(5)RNase-Free ddH2O补足至20μL。
5.如权利要求3所述的一种同时检测BCoV和BRV的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述微滴PCR扩增反应条件为：95℃预变性10min；94℃变性30s，58℃退火1min，40个循环；98℃10min；4℃终止反应，升降温速率2℃/s。
6.如权利要求1至权利要求5中任意一项所述的一种同时检测BCoV和BRV的试剂盒在同时检测BCoV和BRV中的应用。
7.如权利要求1至权利要求5中任意一项所述的一种同时检测BCoV和BRV试剂盒的使用方法在同时检测BCoV和BRV中的应用。
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JP2012125220A (ja) * 2010-12-17 2012-07-05 Univ Of Miyazaki 牛ａ群ロタウイルスおよび牛コロナウイルスの迅速同時検出方法
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Title
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