CN112779250B - 一种用于鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒的试剂盒及其应用 - Google Patents

一种用于鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒的试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒的试剂盒及其应用。本发明提供了的引物探针组合由PRRS‑F1R1P1和ASF‑F1R1P1组成；PRRS‑F1R1P1由PRRS‑F1、PRRS‑R1和PRRS‑P1组成；PRRS‑F1为序列1所示；PRRS‑R1为序列2所示；PRRS‑P1如序列3所示；ASF‑F1R1P1由ASF‑F1、ASF‑R1和ASF‑P1组成；ASF‑F1为序列4所示；ASF‑R1为序列5所示；ASF‑P1如序列6所示。本发明对于猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒的防控具有重大的应用价值，有助于从源头控制疫情、有效预防猪疫病的大规模爆发。

Description

一种用于鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒 的试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于病毒检测领域，具体涉及一种用于鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒的试剂盒及其应用。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)(又名猪蓝耳病)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive andRespiratorySyndrome，PRRSV)引起的，以母猪繁殖障碍、早产、流产、死胎、木乃伊胎及仔猪呼吸综合征为特征的高度接触性传染病。按临床表现的不同，猪蓝耳病可分为经典猪蓝耳病和高致病性猪蓝耳病。高致病性猪蓝耳病以高度接触性传播、全身出血、肺部实变和母猪繁殖障碍为特征，仔猪、育肥猪和成年猪均可发病和死亡，其中仔猪发病率可达100％、死亡率可达50％以上，母猪流产率可达30％以上。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告的动物疫病，我国2008年新修订的《一、二、三类动物疫病病种名录》将高致病性猪蓝耳病列为一类动物疫病。
非洲猪瘟(African Swine Fever，ASF)是一种由非洲猪瘟病毒(African swinefevervirus，ASFV)引起的传染病，可影响所有年龄的猪，引起出血热，急性发病时的致死率可达100％。非洲猪瘟严重威胁养猪业生产，并且因疫情引发贸易限制，对国际贸易产生重大影响。ASF具有极强的跨境传播能力，已引起各国政府和国际组织越来越多的重视。我国在2018年8月之前从未发现过ASF，并始终将其列为重点防范的外来动物疫病。
目前最常用核酸检测方法有RT-PCR和荧光RT-PCR。RT-PCR和荧光RT-PCR虽然较之以往方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好，且自动化程度高等特点，但是上述方法均只能实现定性和半定量的检测，无法对病毒核酸进行精确定量，在灵敏度和敏感性特异性上仍存在一定的局限性。
数字化PCR(Digital PCR，dPCR)的概念早在1999年就由Bert Vogelstein采用并发表相关文献，其初衷是为了能够从临床样品(如尿液、淋巴液、血浆、粪便等)大量的正常体细胞中检测出微量的突变细胞，但由于当时能用于稀释样品的耗材只是384孔板，因此还不能非常好地体现数字PCR的核心理念——“无限稀释”(terminaldilution)。
Bio-Rad公司的QX200系统核心的微滴化技术能够将一份样品分成20,000个纳升级的微滴，本质上将传统定量PCR的一个test变成20,000个test，大大提高了核酸序列检测的灵敏度和精准度，是对“无限稀释”这一概念的完美演绎，其方法原理可称为微滴式数字化PCR(Droplet Digital PCR，ddPCR)。QX200 ddPCR系统包括两台仪器：微滴发生器和微滴分析仪，及其相关的耗材。微滴发生器将每个样品分成20,000个均匀的纳升级微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。每个微滴都作为一个独立的PCR反应器。随后微滴转移至96孔PCR板上，开展终点PCR扩增。采用微滴分析仪(droplet reader)逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，分析软件可计算给出待检靶分子的浓度或拷贝数。
ABI公司的QuantStudio 3D数字PCR系统是一款基于芯片的仪器，它的第一代芯片能够在每次运行中最多产生20,000个0.8nL液滴，满足了目前大部分数字PCR应用的需求。QuantStudio 3D数字PCR系统包括三台仪器：芯片装载仪、芯片分析仪和GeneAmpPCRSystem 9700，及其相关的耗材。采用芯片数字PCR可实现灵敏且精确的绝对靶位点定量，无需使用参照或标准曲线，从而能够应用于新的领域。研究人员现在不仅可以获得CT值，还可以实现绝对定量，包括小概率事件检测或样本中的精确靶点计数。
与传统的定量PCR相比，数字PCR的精确度和灵敏度更佳。利用微滴式数字PCR技术，研究人员可以检测稀有突变，精确测定拷贝数变异，并对基因表达进行绝对定量。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒的试剂盒及其应用。
本发明首先保护一种引物探针组合，其由引物探针组PRRS-F1R1P1和引物探针组ASF-F1R1P1组成；
所述引物探针组PRRS-F1R1P1由引物PRRS-F1、引物PRRS-R1和探针PRRS-P1组成；
所述引物PRRS-F1为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列1所示的单链核酸分子；
(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的核酸分子；
所述引物PRRS-R1为如下(a3)或(a4)：
(a3)序列表的序列2所示的单链核酸分子；
(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的核酸分子；
所述探针PRRS-P1，一个末端具有荧光报告基团，另一个末端具有荧光淬灭基团，核苷酸序列为如下(a5)或(a6)：
(a5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；
所述引物探针组ASF-F1R1P1由引物ASF-F1、引物ASF-R1和探针ASF-P1组成；
所述引物ASF-F1为如下(a7)或(a8)：
(a7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；
(a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；
所述引物ASF-R1为如下(a9)或(a10)：
(a9)序列表的序列5所示的单链DNA分子；
(a10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；
所述探针ASF-P1，一个末端具有荧光报告基团，另一个末端具有荧光淬灭基团，核苷酸序列为如下(a11)或(a12)：
(a11)序列表的序列6所示的单链DNA分子；
(a12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子；
所述探针PRRS-P1和所述探针ASF-P1具有不同颜色的荧光报告基团。
在本发明的具体实施例中，所述探针PRRS-P1的5’末端标记荧光基团FAM，3’末端标记荧光淬灭基团BHQ1。所述探针ASF-P1的5’末端标记荧光基团HEX，3’末端标记荧光淬灭基团BHQ1。
所述引物探针组合的用途为如下(b1)-(b6)中的任一种：
(b1)鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒；
(b2)制备用于鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒的试剂盒；
(b3)检测待测样本是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒；
(b4)制备用于检测待测样本是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒的试剂盒；
(b5)检测待测样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒的含量；
(b6)制备用于检测待测样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒含量的试剂盒。
本发明还保护所述引物探针组合在如下(b1)-(b6)中任一种中的应用：
(b1)鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒；
(b2)制备用于鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒的试剂盒；
(b3)检测待测样本是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒；
(b4)制备用于检测待测样本是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒的试剂盒；
(b5)检测待测样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒的含量；
(b6)制备用于检测待测样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒含量的试剂盒。
本发明还保护一种试剂盒，其包括所述引物探针组合；所述试剂盒的功能为如下(c1)或(c2)或(c3)：(c1)鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒；(c2)检测待测样本是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒；(c3)检测待测样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒的含量。
所述试剂盒还包括记载有方法Ⅰ和/或方法Ⅱ和/或方法Ⅲ的载体。
本发明还保护一种检测待测病毒是否为猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒的方法(方法Ⅰ)。
本发明的检测待测病毒是否为猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒的方法(方法Ⅰ)包括如下步骤：以待测病毒的总核酸为模板，采用所述引物探针组合进行数字RT-PCR；如果基于探针PRRS-P1相应的荧光基团的检测结果为阳性、待测病毒为或候选为猪繁殖与呼吸综合征病毒，如果基于探针PRRS-P1相应的荧光基团的检测结果为阴性、待测病毒为或候选为非猪繁殖与呼吸综合征病毒；如果基于探针ASF-P1相应的荧光基团的检测结果为阳性、待测病毒为或候选为非洲猪瘟病毒，如果基于探针ASF-P1相应的荧光基团的检测结果为阴性、待测病毒为或候选为非非洲猪瘟病毒。
本发明还保护一种检测待测样本是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒的方法(方法Ⅱ)。
本发明的检测待测样本是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒的方法(方法Ⅱ)包括如下步骤：以待测样本的总核酸为模板，采用所述引物探针组合进行数字RT-PCR；如果基于探针PRRS-P1相应的荧光基团的检测结果为阳性、待测样本含有猪繁殖与呼吸综合征病毒，如果基于探针PRRS-P1相应的荧光基团的检测结果为阴性、待测样本不含有猪繁殖与呼吸综合征病毒；如果基于探针ASF-P1相应的荧光基团的检测结果为阳性、待测样本含有非洲猪瘟病毒，如果基于探针ASF-P1相应的荧光基团的检测结果为阴性、待测样本不含有非洲猪瘟病毒。
本发明还保护一种检测待测样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒的含量的方法(方法Ⅲ)。
本发明的检测待测样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒的含量的方法(方法Ⅲ)包括如下步骤：以待测样本的总核酸为模板，采用所述引物探针组合进行数字RT-PCR；根据猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性微滴的数量得到待测样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒的含量，猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性微滴为基于探针PRRS-P1相应的荧光基团的检测结果为阳性的微滴；根据非洲猪瘟病毒阳性微滴的数量得到待测样本中非洲猪瘟病毒的含量，非洲猪瘟病毒阳性微滴为基于探针ASF-P1相应的荧光基团的检测结果为阳性的微滴。
所述数字RT-PCR包括但不限于微滴数字PCR反应和芯片数字PCR反应。
所述方法Ⅰ或方法Ⅱ或方法Ⅲ中，所述PCR反应体系中，引物PRRS-F1的浓度可为0.9μM，引物PRRS-R1的浓度可为0.9μM，探针PRRS-P1的浓度可为0.2μM，引物ASF-F1的浓度可为0.9μM，引物ASF-R1的浓度可为0.9μM，探针ASF-P1的浓度可为0.2μM。
当所述数字RT-PCR为微滴数字RT-PCR时，所述PCR反应体系可包括One-StepRT-ddPCR Supermix for probes、Reverse transcriptase、DTT、引物PRRS-F1、引物PRRS-R1、探针PRRS-P1、引物ASF-F1、引物ASF-R1、探针ASF-P1和模板。在本发明的具体实施例中，所述PCR反应体系由2×One-Step RT-ddPCR Supermix for probes、Reversetranscriptase、DTT(300mM)、引物PRRS-F1、引物PRRS-R1、探针PRRS-P1、引物ASF-F1、引物ASF-R1、探针ASF-P1、模板和RNase Free dH2O组成。所述PCR反应程序可为：50℃反转录10min；95℃预变性10min；94℃变性30sec、55℃退火60sec，共40个循环；98℃10min。所述PCR反应程序中，升降温速度设置可为2.5℃/sec。
当所述数字RT-PCR反应为芯片数字RT-PCR时，所述PCR反应体系可包括QuantStudioTM3D Digital PCR Master Mix、SuperScriptTMIII Reverse Transcriptase、引物PRRS-F1、引物PRRS-R1、探针PRRS-P1、引物ASF-F1、引物ASF-R1、探针ASF-P1和模板。在本发明的具体实施例中，所述PCR反应体系由QuantStudioTM3D Digital PCRMaster Mix(2×)、SuperScriptTMIII Reverse Transcriptase、引物PRRS-F1、引物PRRS-R1、探针PRRS-P1、引物ASF-F1、引物ASF-R1、探针ASF-P1、模板和RNase Free dH2O组成。所述PCR反应程序可为：50℃反转录10min；96℃预变性10min；55℃退火60sec，60℃延伸60sec，98℃30sec，共40个循环；60℃2min。
本发明还保护一种预混液，其含有引物PRRS-F1、引物PRRS-R1、探针PRRS-P1、引物ASF-F1、引物ASF-R1和探针ASF-P1。
进一步的，所述预混液中，所述引物PRRS-F1、所述引物PRRS-R1、所述探针PRRS-P1、所述引物ASF-F1、所述引物ASF-R1和所述探针ASF-P1的摩尔量比为9:9:2:9:9:2。
更进一步的，所述预混液中，所述引物PRRS-F1的浓度为0.9μM，所述引物PRRS-R1的浓度为0.9μM，所述探针PRRS-P1的浓度为0.2μM，所述引物ASF-F1的浓度为0.9μM，所述引物ASF-R1的浓度为0.9μM，所述探针ASF-P1的浓度为0.2μM。
所述预混液的功能为如下(c1)或(c2)或(c3)：(c1)鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒；(c2)检测待测样本是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒；(c3)检测待测样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒的含量。
本发明还保护一种试剂盒，其包括所述预混液。
进一步的，当所述数字RT-PCR反应为微滴数字RT-PCR时，所述试剂盒还可包括微滴发生油。
更进一步的，所述试剂盒还可包括阴性对照和阳性对照；所述阴性对照为RNaseFree dH2O；所述阳性对照为分别含有猪繁殖与呼吸综合征病毒和非洲猪瘟病毒的特异性基因的质粒溶液。含有猪繁殖与呼吸综合征病毒特异性基因片段的阳性对照质粒为将猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF6、ORF7基因序列插入pUC19载体的BamHI和EcoRI位点间得到的质粒。所述猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF6、ORF7基因的序列如序列7所示。含有非洲猪瘟病毒特异性基因片段的阳性对照质粒为将非洲猪瘟病毒B646L基因序列插入pUC19载体的BamHI和EcoRI位点间得到的质粒。所述非洲猪瘟病毒B646L基因的序列如序列8所示。
所述试剂盒的功能为如下(c1)或(c2)或(c3)：(c1)鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒；(c2)检测待测样本是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒；(c3)检测待测样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒的含量。
本发明还保护所述预混液或所述试剂盒在如下(c1)或(c2)或(c3)中的应用：(c1)鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒；(c2)检测待测样本是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒；(c3)检测待测样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒的含量。
所述试剂盒还包括记载有方法Ⅳ和/或方法Ⅴ和/或方法Ⅵ的载体。
所述方法Ⅳ为一种通过数字RT-PCR检测待测病毒是否为猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒的方法，为如下m1)或m2)：
m1)当所述数字RT-PCR方法为微滴数字RT-PCR方法时，将待测病毒的总核酸或其稀释液作为模板溶液，将2μL模板溶液和18μL所述预混液混合后与70μL微滴发生油同置于微滴生成仪中形成微滴，然后进行RT-PCR扩增，最后在微滴分析仪中进行检测；如果基于探针PRRS-P1相应的荧光基团的检测结果为阳性、待测病毒为或候选为猪繁殖与呼吸综合征病毒，如果基于探针PRRS-P1相应的荧光基团的检测结果为阴性、待测病毒为或候选为非猪繁殖与呼吸综合征病毒；如果基于探针ASF-P1相应的荧光基团的检测结果为阳性、待测病毒为或候选为非洲猪瘟病毒，如果基于探针ASF-P1相应的荧光基团的检测结果为阴性、待测病毒为或候选为非非洲猪瘟病毒；
m2)当所述数字RT-PCR方法为芯片数字RT-PCR方法时，将待测病毒的总核酸或其稀释液作为模板溶液，将2μL模板溶液和18μL所述预混液混合后，取14.5μL通过芯片装载仪自动加载到芯片的微孔中，体系加载完成后，将所述芯片密封，然后进行RT-PCR扩增，最后在芯片分析仪中进行检测；如果基于探针PRRS-P1相应的荧光基团的检测结果为阳性、待测病毒为或候选为猪繁殖与呼吸综合征病毒，如果基于探针PRRS-P1相应的荧光基团的检测结果为阴性、待测病毒为或候选为非猪繁殖与呼吸综合征病毒；如果基于探针ASF-P1相应的荧光基团的检测结果为阳性、待测病毒为或候选为非洲猪瘟病毒，如果基于探针ASF-P1相应的荧光基团的检测结果为阴性、待测病毒为或候选为非非洲猪瘟病毒。
所述方法Ⅴ为一种通过数字RT-PCR检测待测样本是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒的方法，为如下n1)或n2)：
n1)当所述数字RT-PCR方法为微滴数字RT-PCR方法时，将待测样本的总核酸或其稀释液作为模板溶液，将2μL模板溶液和18μL所述预混液混合后与70μL微滴发生油同置于微滴生成仪中形成微滴，然后进行RT-PCR扩增，最后在微滴分析仪中进行检测；如果基于探针PRRS-P1相应的荧光基团的检测结果为阳性、待测样本含有猪繁殖与呼吸综合征病毒，如果基于探针PRRS-P1相应的荧光基团的检测结果为阴性、待测样本不含有猪繁殖与呼吸综合征病毒；如果基于探针ASF-P1相应的荧光基团的检测结果为阳性、待测样本含有非洲猪瘟病毒，如果基于探针ASF-P1相应的荧光基团的检测结果为阴性、待测样本不含有非洲猪瘟病毒；
n2)当所述数字RT-PCR方法为芯片数字RT-PCR方法时，将待测样本的总核酸或其稀释液作为模板溶液，将2μL模板溶液和18μL所述预混液混合后，取14.5μL通过芯片装载仪自动加载到芯片的微孔中，体系加载完成后，将所述芯片密封，然后进行RT-PCR扩增，最后在芯片分析仪中进行检测；如果基于探针PRRS-P1相应的荧光基团的检测结果为阳性、待测样本含有猪繁殖与呼吸综合征病毒，如果基于探针PRRS-P1相应的荧光基团的检测结果为阴性、待测样本不含有猪繁殖与呼吸综合征病毒；如果基于探针ASF-P1相应的荧光基团的检测结果为阳性、待测样本含有非洲猪瘟病毒，如果基于探针ASF-P1相应的荧光基团的检测结果为阴性、待测样本不含有非洲猪瘟病毒。
所述方法Ⅵ为一种通过数字RT-PCR检测待测样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒的含量的方法，为如下s1)或s2)：
s1)当所述数字RT-PCR方法为微滴数字RT-PCR方法时，将待测样本的总核酸或其稀释液作为模板溶液，将2μL模板溶液和18μL所述预混液混合后与70μL微滴发生油同置于微滴生成仪中形成微滴，然后进行RT-PCR扩增，最后在微滴分析仪中进行检测；根据猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性微滴的数量得到待测样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒的含量，猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性微滴为基于探针PRRS-P1相应的荧光基团的检测结果为阳性的微滴；根据非洲猪瘟病毒阳性微滴的数量得到待测样本中非洲猪瘟病毒的含量，非洲猪瘟病毒阳性微滴为基于探针ASF-P1相应的荧光基团的检测结果为阳性的微滴；
s2)当所述数字RT-PCR方法为芯片数字RT-PCR方法时，将待测样本的总核酸或其稀释液作为模板溶液，将2μL模板溶液和18μL所述预混液混合后，取14.5μL通过芯片装载仪自动加载到芯片的微孔中，体系加载完成后，将所述芯片密封，然后进行RT-PCR扩增，最后在芯片分析仪中进行检测；根据猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性微滴的数量得到待测样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒的含量，猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性微滴为基于探针PRRS-P1相应的荧光基团的检测结果为阳性的微滴；根据非洲猪瘟病毒阳性微滴的数量得到待测样本中非洲猪瘟病毒的含量，非洲猪瘟病毒阳性微滴为基于探针ASF-P1相应的荧光基团的检测结果为阳性的微滴。
所述方法Ⅳ或方法Ⅴ或方法Ⅵ中，所述数字RT-PCR为微滴数字RT-PCR时，所述PCR的反应程序可为：50℃反转录10min；95℃预变性10min；94℃变性30sec、55℃退火60sec，共40个循环；98℃10min。所述PCR的反应程序中，升降温速度设置可为2.5℃/sec。
所述方法Ⅳ或方法Ⅴ或方法Ⅵ中，所述数字RT-PCR为芯片数字RT-PCR时，所述PCR的反应程序可为：50℃反转录10min；96℃预变性10min；55℃退火60sec，60℃延伸60sec，98℃30sec，共40个循环；60℃2min。
以上任一所述数字RT-PCR具体可为微滴式数字RT-PCR或芯片式数字RT-PCR。
以上任一所述试剂盒具体可为微滴数字RT-PCR绝对定量检测试剂盒或芯片数字RT-PCR绝对定量检测试剂盒。
以上任一所述数字RT-PCR具体可采用QX200 Droplet Digital PCR系统或QuantStudio 3D数字PCR系统。
以上任一所述待测样本可为待测猪组织样本，例如猪肺样本。
以上任一所述待测病毒可为猪繁殖与呼吸综合征病毒、非洲猪瘟病毒、猪细小病毒、2型猪圆环病毒、伪狂犬病病毒或猪瘟病毒。以上任一所述猪繁殖与呼吸综合征病毒可为猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型或猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型。以上任一所述猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型具体可为VR-2332毒株。以上任一所述猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型具体可为LV毒株。以上任一所述非洲猪瘟病毒具体可为Africanswine fevervirus isolate China/2018/AnhuiXCGQ毒株。以上任一所述猪细小病毒具体可为NADL-2毒株。以上任一所述2型猪圆环病毒具体可为08TJ毒株。以上任一所述伪狂犬病病毒具体可为Bartha毒株。以上任一所述猪瘟病毒具体可为C-strain毒株。
本发明设计并筛选得到了用于鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒的引物探针组合，并且进一步摸索了引物和探针的浓度，找到了最适的引物和探针的工作浓度，以提高数字PCR的扩增效率。
本发明提供了具有高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度、可实现精确定量的数字化RT-PCR试剂盒，用于猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒的检测，可直接定量，无需标准曲线、操作简便、结果准确可靠，特别适合现场检测。本发明对于猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒的防控具有重大的应用价值，有助于从源头控制疫情、有效预防猪疫病的大规模爆发。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中所用的微滴数字PCR均采用Bio-Rad Laboratories,Inc.的QX200Droplet Digital PCR系统(包括两个仪器：QX200微滴生成仪和QX200微滴分析仪)，实施例中所用的热封仪为PX1TMPCR热封仪，实施例中所用的微滴发生卡为DG8TM微滴发生卡(8滴发)，实施例中所用的底座为发生卡底座，实施例中所用的微滴发生油为微滴发生油(用于探针)，实施例中所用的One-step RT-ddPCR Supermix for probes、Reversetranscriptase、300mM DTT均为Bio-Rad Laboratories,Inc.的产品，实施例中所用的
Figure BDA0002267562300000091
Probe qPCR Master Mix，dUTP、GoScript RT Mix for 1-step RT-QPCR均为Promega产品。
下述实施例中所用的芯片数字PCR均采用ABI Laboratories,Inc.的QuantStudio3DDroplet Digital PCR系统(包括三个仪器：QuantStudio 3D Digital PCR ChipLoader、QuantStudio 3D Digital PCR System和GeneAmp PCR System 9700)，实施例中所用的QuantStudioTM3D Digital PCR Chip v2，实施例中所用的QuantStudioTM3D DigitalPCRChip Lid v2，实施例中所用的QuantStudioTM3D Digital PCR Sample Loading Blade，实施例中所用的QuantStudioTM3D Digital PCR Master Mix(2×)、SuperScriptTMIIIReverseTranscriptase均为ABI Laboratories,Inc.的产品。
下述实施例中所用的病毒株及序列号如下：非洲猪瘟病毒毒株为African swinefever virus isolate China/2018/AnhuiXCGQ，在GENBANK中的序列号为MK128995.1；猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型毒株为LV(Lelystad virus)，在GENBANK中的序列号为M96262；猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型毒株为VR-2332，在GENBANK中的序列号为U87392；猪瘟病毒毒株为C-strain，在GENBANK中的序列号为Z46258；猪细小病毒毒株为NADL-2(
Figure BDA0002267562300000101
VR-742TM)，在GENBANK中的序列号为KF913351；2型猪圆环病毒毒株为08TJ，在GENBANK中的序列号为HQ395021；伪狂犬病病毒毒株为Bartha，在GENBANK中的序列号为JF797217。
实施例1、引物及探针的设计与筛选
一、用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物和探针的设计与筛选
通过大量序列获取、分析、比对以及预实验，设计并初步筛选得到四条引物和两条探针，核苷酸序列如下：
PRRS-F1(序列表的序列1)：5’-CVCTTCCADATGCKGYTTGTG-3’；
PRRS-R1(序列表的序列2)：5’-CGCCHCTCCMYGTTTAACAGC-3’；
PRRS-P1(序列表的序列3)：5’-TAVATTCTBGCCCCTHCCCA-3’；
PRRS-F2：5’-CGCTTCCAGATGCRGSTTGTG-3’；
PRRS-R2：5’-CGCCACTCCYKGTTTAACAGC-3’；
PRRS-P2：5’-TADATTCTVGCCCCTBCCCA-3’。
以上核苷酸序列中，R代表A或G，S代表G或C，Y代表C或T，K代表G或T，D代表G、A或T，V代表G、A或C，B代表G、T或C，M代表A或C，H代表A、T或C。
PRRS-F1和PRRS-F2均为上游引物，PRRS-R1和PRRS-R2均为下游引物，PRRS-P1和PRRS-P2均为探针。PRRS-P1的5’末端标记荧光基团FAM，3’末端标记荧光淬灭基团BHQ1。PRRS-P2的5’末端标记荧光基团FAM，3’末端标记荧光淬灭基团BHQ1。
二、用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物探针组的筛选
将步骤一筛选得到的四条引物和两条探针进行随机组合，形成八个引物探针组：由PRRS-F1、PRRS-R1和PRRS-P1组成的引物探针组PRRS-F1R1P1，由PRRS-F1、PRRS-R1和PRRS-P2组成的引物探针组PRRS-F1R1P2，由PRRS-F1、PRRS-R2和PRRS-P1组成的引物探针组PRRS-F1R2P1，由PRRS-F1、PRRS-R2和PRRS-P2组成的引物探针组PRRS-F1R2P2，由PRRS-F2、PRRS-R1和PRRS-P1组成的引物探针组PRRS-F2R1P1，由PRRS-F2、PRRS-R1和PRRS-P2组成的引物探针组PRRS-F2R1P2，由PRRS-F2、PRRS-R2和PRRS-P1组成的引物探针组PRRS-F2R2P1，由PRRS-F2、PRRS-R2和PRRS-P2组成的引物探针组PRRS-F2R2P2。
1、取猪繁殖与呼吸综合征病毒培养物，提取总核酸。
2、以步骤1得到的总核酸为模板，分别采用各个引物探针组进行实时荧光定量RT-PCR。
RT-qPCR的反应体系(20μL)：
Figure BDA0002267562300000111
Probe qPCR Master Mix，dUTP 10μL，GoScript RT Mix for 1-step RT-QPCR 0.5μL，10μM上游引物溶液1.2μL，10μM下游引物溶液1.2μL，10μM探针溶液0.6μL，模板2μL，余量为水。
RT-qPCR的反应程序：45℃10min；95℃2min；95℃15s、60℃1min，40个循环。
采用引物探针组PRRS-F1R1P1进行实时荧光定量RT-PCR，△Rn峰值为1000000。采用另外七个引物探针组进行实时荧光定量RT-PCR，△Rn峰值为300000-500000。采用引物探针组PRRS-F1R1P1的扩增曲线的信号值最强。
三、用于检测非洲猪瘟病毒的引物和探针的设计与筛选
通过大量序列获取、分析、比对以及预实验，设计并初步筛选得到四条引物和两条探针，核苷酸序列如下：
ASF-F1(序列表的序列4)：5’-CGATGATGATKACCTTYGCTBTGA-3’；
ASF-R1(序列表的序列5)：5’-ATTCTCTTSCTCTGGATACGTTARTATG-3’；
ASF-P1(序列表的序列6)：5’-CCACGSGAGGAATACCAACCBAGTG-3’；
ASF-F2：5’-AAACGGCGBCCTCTAARG-3’；
ASF-R2：5’-GGCAGHTTCAAACGTTYCCT-3’；
ASF-P2：5’-TTTGGYTGTCCCAGTCATATCMGTTGC-3’。
以上核苷酸序列中，Y代表C或T，W代表A或T，H代表A、T或C，M代表A或C，S代表G或C，R代表A或G，B代表G、T或C。
ASF-F1和ASF-F2均为上游引物，ASF-R1和ASF-R2均为下游引物，ASF-P1和ASF-P2均为探针。ASF-P1的5’末端标记荧光基团HEX，3’末端标记荧光淬灭基团BHQ1。ASF-P2的5’末端标记荧光基团HEX，3’末端标记荧光淬灭基团BHQ1。
四、用于检测非洲猪瘟病毒的引物探针组的筛选
将步骤一筛选得到的四条引物和两条探针进行随机组合，形成八个引物探针组：由ASF-F1、ASF-R1和ASF-P1组成的引物探针组ASF-F1R1P1，由ASF-F1、ASF-R1和ASF-P2组成的引物探针组ASF-F1R1P2，由ASF-F1、ASF-R2和ASF-P1组成的引物探针组ASF-F1R2P1，由ASF-F1、ASF-R2和ASF-P2组成的引物探针组ASF-F1R2P2，由ASF-F2、ASF-R1和ASF-P1组成的引物探针组ASF-F2R1P1，由ASF-F2、ASF-R1和ASF-P2组成的引物探针组ASF-F2R1P2，由ASF-F2、ASF-R2和ASF-P1组成的引物探针组ASF-F2R2P1，由ASF-F2、ASF-R2和ASF-P2组成的引物探针组ASF-F2R2P2。
1、取经过灭活的含有非洲猪瘟病毒的病料，提取总核酸。
2、以步骤1得到的总核酸为模板，分别采用各个引物探针组进行实时荧光定量RT-PCR。
qPCR的反应体系(20μL)：
Figure BDA0002267562300000121
Probe qPCR Master Mix 10μL，10μM上游引物溶液1.2μL，10μM下游引物溶液1.2μL，10μM探针溶液0.6μL，模板2μL，余量为水。
qPCR的反应程序：95℃2min；95℃15s、60℃1min，40个循环。
采用引物探针组ASF-F1R1P1进行实时荧光定量RT-PCR，△Rn峰值为1000000。采用另外七个引物探针组进行实时荧光定量RT-PCR，△Rn峰值为300000-500000。采用引物探针组ASF-F1R1P1的扩增曲线的信号值最强。
实施例2、数字PCR中相关反应参数的优化
一、退火温度的优化
1、取猪繁殖与呼吸综合征病毒培养物，提取总核酸。
2、取灭活的非洲猪瘟病毒病料，提取总核酸。
3、将步骤1得到的总核酸和步骤2得到的总核酸等质量混合，得到混合核酸。
4、以步骤3得到的混合核酸为模板，采用引物探针组PRRS-F1R1P1和引物探针组ASF-F1R1P1组成的引物组合进行数字RT-PCR。
当所述数字RT-PCR为微滴数字RT-PCR时：
(1)配制如下体系(20μL)：5μL One-Step RT-ddPCR Supermix for probes，2μLReverse transcriptase，1μL 300mM DTT，0.5μL PRRS-F1，0.5μL PRRS-R1，0.25μLPRRS-P1，0.5μL ASF-F1，0.5μL ASF-R1，0.25μL ASF-P1，2μL模板，7.5μL RNase FreedH2O。体系中，上游引物的浓度为0.5μM，下游引物的浓度为0.5μM，探针的浓度为0.25μM。
(2)取微滴发生卡固定于底座上，中间一排的8个孔内每孔加入20μL步骤(1)配制的体系，底部一排的8个孔内每孔加入70μL微滴发生油，然后将固定有微滴发生卡的底座放置于微滴生成仪中形成微滴(微滴生成于微滴发生卡顶部一排的8个孔内)。
(3)取一个96孔板(命名为96孔板Ⅰ)，完成步骤(2)后，从微滴发生卡顶部一排的8个孔中，每个孔取40μL，以一一对应的方式加入96孔板Ⅰ的8个孔中，用热封仪进行封膜。取一个96孔板(命名为96孔板Ⅱ)，完成步骤(2)后，从微滴发生卡顶部一排的8个孔中，每个孔取40μL，以一一对应的方式加入96孔板Ⅱ的8个孔中，用热封仪进行封膜。取一个96孔板(命名为96孔板Ⅲ)，完成步骤(2)后，从微滴发生卡顶部一排的8个孔中，每个孔取40μL，以一一对应的方式加入96孔板Ⅲ的8个孔中，用热封仪进行封膜。取一个96孔板(命名为96孔板Ⅳ)，完成步骤(2)后，从微滴发生卡顶部一排的8个孔中，每个孔取40μL，以一一对应的方式加入96孔板Ⅳ的8个孔中，用热封仪进行封膜。取一个96孔板(命名为96孔板Ⅴ)，完成步骤(2)后，从微滴发生卡顶部一排的8个孔中，每个孔取40μL，以一一对应的方式加入96孔板Ⅴ的8个孔中，用热封仪进行封膜。取一个96孔板(命名为96孔板Ⅵ)，完成步骤(2)后，从微滴发生卡顶部一排的8个孔中，每个孔取40μL，以一一对应的方式加入96孔板Ⅵ的8个孔中，用热封仪进行封膜。
(4)将完成步骤(3)的各个96孔板置于不同的PCR仪中，进行RT-PCR扩增。
RT-PCR扩增程序：50℃反转录10min；95℃预变性10min；94℃变性30sec、退火60sec，共40个循环；98℃10min。采用的升降温速度设置为2.5℃/sec。
96孔板Ⅰ至96孔板Ⅵ所在的PCR仪，依次设置如下退火温度：52.0℃、54.0℃、55.0℃、56.0℃、58.0℃、60.0℃。
(5)完成步骤(4)后，取96孔板，在微滴分析仪中进行检测，猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性的微滴显示蓝色荧光，非洲猪瘟病毒阳性的微滴显示绿色荧光。
采用52.0℃的退火温度，每微升模板中，猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测值为1470copies，非洲猪瘟病毒的检测值为1340copies。采用54.0℃的退火温度，每微升模板中，猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测值为1520copies，非洲猪瘟病毒的检测值为1390copies。采用55.0℃的退火温度，每微升模板中，猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测值为1580copies，非洲猪瘟病毒的检测值为1410copies。采用56.0℃的退火温度，每微升模板中，猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测值为1550copies，非洲猪瘟病毒的检测值为1380copies。采用58.0℃的退火温度，每微升模板中，猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测值为1490copies，非洲猪瘟病毒的检测值为1350copies。采用60.0℃的退火温度，每微升模板中，猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测值为1410copies，非洲猪瘟病毒的检测值为1280copies。
当所述数字RT-PCR为芯片数字RT-PCR时：
(1)配制如下体系(20μL)：10μL QuantStudioTM3D Digital PCR Master Mix(2×)，2μL SuperScriptTMIII Reverse Transcriptase，0.5μL PRRS-F1，0.5μL PRRS-R1，0.25μLPRRS-P1，0.5μL ASF-F1，0.5μL ASF-R1，0.25μL ASF-P1，2μL模板，3.5μL RNaseFreedH2O。体系中，上游引物的浓度为0.5μM，下游引物的浓度为0.5μM，探针的浓度为0.25μM。
(2)取QuantStudioTM3D Digital PCR Chip v2、QuantStudioTM3D Digital PCRChipLid v2、QuantStudioTM3D Digital PCR Sample Loading Blade分别放在QuantStudio3DDigital PCR Chip Loader对应位置上，将14.5μL步骤(1)配制的体系通过芯片装载仪自动加载到芯片的微孔中，体系加载完成后，立即用封油注射器将封油覆盖于芯片表面并将芯片密封，得到芯片Ⅰ。
取QuantStudioTM3D Digital PCR Chip v2、QuantStudioTM3D Digital PCR ChipLidv2、QuantStudioTM3D Digital PCR Sample Loading Blade分别放在QuantStudio3DDigital PCR Chip Loader对应位置上，将14.5μL步骤(1)配制的体系通过芯片装载仪自动加载到芯片的微孔中，体系加载完成后，立即用封油注射器将封油覆盖于芯片表面并将芯片密封，得到芯片Ⅱ。
取QuantStudioTM3D Digital PCR Chip v2、QuantStudioTM3D Digital PCR ChipLidv2、QuantStudioTM3D Digital PCR Sample Loading Blade分别放在QuantStudio3DDigital PCR Chip Loader对应位置上，将14.5μL步骤(1)配制的体系通过芯片装载仪自动加载到芯片的微孔中，体系加载完成后，立即用封油注射器将封油覆盖于芯片表面并将芯片密封，得到芯片Ⅲ。
取QuantStudioTM3D Digital PCR Chip v2、QuantStudioTM3D Digital PCR ChipLidv2、QuantStudioTM3D Digital PCR Sample Loading Blade分别放在QuantStudio3DDigital PCR Chip Loader对应位置上，将14.5μL步骤(1)配制的体系通过芯片装载仪自动加载到芯片的微孔中，体系加载完成后，立即用封油注射器将封油覆盖于芯片表面并将芯片密封，得到芯片Ⅳ。
取QuantStudioTM3D Digital PCR Chip v2、QuantStudioTM3D Digital PCR ChipLidv2、QuantStudioTM3D Digital PCR Sample Loading Blade分别放在QuantStudio3DDigital PCR Chip Loader对应位置上，将14.5μL步骤(1)配制的体系通过芯片装载仪自动加载到芯片的微孔中，体系加载完成后，立即用封油注射器将封油覆盖于芯片表面并将芯片密封，得到芯片Ⅴ。
取QuantStudioTM3D Digital PCR Chip v2、QuantStudioTM3D Digital PCR ChipLidv2、QuantStudioTM3D Digital PCR Sample Loading Blade分别放在QuantStudio3DDigital PCR Chip Loader对应位置上，将14.5μL步骤(1)配制的体系通过芯片装载仪自动加载到芯片的微孔中，体系加载完成后，立即用封油注射器将封油覆盖于芯片表面并将芯片密封，得到芯片Ⅵ。
(3)将步骤(2)密封好的芯片Ⅰ至芯片Ⅵ置于PCR仪(GeneAmp PCR System9700PCR仪)中，进行RT-PCR扩增。
RT-PCR扩增程序：50℃反转录10min；96℃预变性10min；退火60sec，60℃延伸60sec，98℃30sec，共40个循环；60℃2min。芯片Ⅰ至Ⅵ依次设置如下退火温度：52.0℃、54.0℃、55.0℃、56.0℃、58.0℃、60.0℃。
(4)完成步骤(3)后，取经过扩增反应的芯片，在芯片分析仪中进行检测，猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性的微滴显示蓝色荧光，非洲猪瘟病毒阳性的微滴显示红色荧光。
采用52.0℃的退火温度，每微升模板中，猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测值为1496copies，非洲猪瘟病毒的检测值为1340copies。采用54.0℃的退火温度，每微升模板中，猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测值为1521copies，非洲猪瘟病毒的检测值为1388copies。采用55.0℃的退火温度，每微升模板中，猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测值为1593copies，非洲猪瘟病毒的检测值为1402copies。采用56.0℃的退火温度，每微升模板中，猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测值为1552copies，非洲猪瘟病毒的检测值为1392copies。采用58.0℃的退火温度，每微升模板中，猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测值为1537copies，非洲猪瘟病毒的检测值为1363copies。采用60.0℃的退火温度，每微升模板中，猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测值为1489copies，非洲猪瘟病毒的检测值为1311copies。
采用55.0℃的退火温度，检测值与实际值最接近。
结果表明，退火温度可以选择54-56℃，最优退火温度为55℃。
二、引物、探针浓度的优化
1、取猪繁殖与呼吸综合征病毒培养物，提取总核酸。
2、取灭活的非洲猪瘟病毒病料，提取总核酸。
3、将步骤1得到的总核酸和步骤2得到的总核酸等质量混合，得到混合核酸。
4、以步骤3得到的混合核酸为模板，采用引物探针组PRRS-F1R1P1和引物探针组ASF-F1R1P1组成的引物组合进行数字RT-PCR。
当所述数字RT-PCR为微滴数字RT-PCR时：
(1)配制不同体系，具体见表1(表格中的数字为各个组分的加入体积，单位为μL)。用于配制体系的上游引物浓度、下游引物浓度和探针浓度均为20μM。
表1不同体系的配方
Figure BDA0002267562300000151
Figure BDA0002267562300000161
(2)取微滴发生卡固定于底座上，中间一排的8个孔内每孔加入20μL步骤(1)配制的体系，底部一排的8个孔内每孔加入70μL微滴发生油，然后将固定有微滴发生卡的底座放置于微滴生成仪中形成微滴(微滴生成于微滴发生卡顶部一排的8个孔内)。
(3)取96孔板，完成步骤(2)后，从微滴发生卡顶部一排的8个孔中，每个孔取40μL，以一一对应的方式加入96孔板的8个孔中，用热封仪进行封膜。
(4)将完成步骤(3)的各个96孔板置于不同的PCR仪中，进行RT-PCR扩增。
RT-PCR扩增程序：50℃反转录10min；95℃预变性10min；94℃变性30sec、55℃退火60sec，共40个循环；98℃10min。采用的升降温速度设置为2.5℃/sec。
(5)完成步骤(4)后，取96孔板，在微滴分析仪中进行检测，猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性的微滴显示蓝色荧光，非洲猪瘟病毒阳性的微滴显示绿色荧光。
采用体系1，每微升模板中，猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测值为3460copies，非洲猪瘟病毒的检测值为3410copies。采用体系2，每微升模板中，猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测值为3690copies，非洲猪瘟病毒的检测值为3680copies。采用体系3，每微升模板中，猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测值为3860copies，非洲猪瘟病毒的检测值为3720copies。采用体系4，每微升模板中，猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测值为4020copies，非洲猪瘟病毒的检测值为3970copies。
当所述数字RT-PCR为芯片数字RT-PCR时：
(1)配制不同体系，具体见表2(表格中的数字为各个组分的加入体积，单位为μL)。用于配制体系的上游引物浓度、下游引物浓度和探针浓度均为20μM。
表2不同体系的配方
Figure BDA0002267562300000162
Figure BDA0002267562300000171
(2)取QuantStudioTM3D Digital PCR Chip v2、QuantStudioTM3D Digital PCRChipLid v2、QuantStudioTM3D Digital PCR Sample Loading Blade分别放在QuantStudio3DDigital PCR Chip Loader对应位置上，将14.5μL步骤(1)配制的各个体系通过芯片装载仪自动加载到芯片的微孔中，体系加载完成后，立即用封油注射器将封油覆盖于芯片表面并将芯片密封。
(3)将完成步骤(2)的密封好的芯片置于PCR仪(GeneAmp PCR System 9700PCR仪)中，进行RT-PCR扩增。
RT-PCR扩增程序：50℃反转录10min；96℃预变性10min；55℃退火60sec，60℃延伸60sec，98℃30sec，共40个循环；60℃2min。
(4)完成步骤(3)后，取经过扩增反应的芯片，在芯片分析仪中进行检测，猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性的微滴显示蓝色荧光，非洲猪瘟病毒阳性的微滴显示红色荧光。
采用体系1，每微升模板中，猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测值为3482copies，非洲猪瘟病毒的检测值为3427copies。采用体系2，每微升模板中，猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测值为3711copies，非洲猪瘟病毒的检测值为3694copies。采用体系3，每微升模板中，猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测值为3875copies，非洲猪瘟病毒的检测值为3743copies。采用体系4，每微升模板中，猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测值为4033copies，非洲猪瘟病毒的检测值为3998copies。
采用体系4，检测值与实际值最接近。
结果表明，反应体系中，最优的引物探针浓度如下：PRRS-F1 0.9μM、PRRS-R10.9μM、PRRS-P1 0.2μM，ASF-F1 0.9μM、ASF-R1 0.9μM、ASF-P1 0.2μM。
实施例3、试剂盒的制备
一、微滴数字PCR各个试剂的配制
溶液A为一步法ddPCR探针法预混液。每900μL溶液A的组成如下：250μLOne-stepRT-ddPCR Supermix for probes，100μL Reverse transcriptase，50μL 300mMDTT，45μLPRRS-F1溶液(PRRS-F1溶液中PRRS-F1的浓度为20μM)，45μL ASF-F1溶液(ASF-F1溶液中ASF-F1的浓度为20μM)，45μL PRRS-R1溶液(PRRS-R1溶液中PRRS-R1的浓度为20μM)，45μLASF-R1溶液(ASF-R1溶液中ASF-R1的浓度为20μM)，10μL PRRS-P1溶液(PRRS-P1溶液中PRRS-P1的浓度为20μM)，10μL ASF-P1溶液(ASF-P1溶液中ASF-P1的浓度为20μM)，300μLRNase Free dH2O。
溶液B为微滴发生油。
溶液C为阳性对照。溶液C的制备方法：提取含有猪繁殖与呼吸综合征病毒特异性基因片段的质粒，提取含有非洲猪瘟病毒特异性基因片段的质粒，将两种质粒溶液等质量混合，使然后用Tris-EDTA缓冲液(pH8.0、0.01M)稀释，使两种质粒的浓度均为10000个拷贝数/微升。
含有猪繁殖与呼吸综合征病毒特异性基因片段的阳性对照质粒为将猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF6、ORF7基因序列插入pUC19载体的BamHI和EcoRI位点间得到的质粒。所述猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF6、ORF7基因的序列如序列7所示。
含有非洲猪瘟病毒特异性基因片段的阳性对照质粒为将非洲猪瘟病毒B646L基因序列插入pUC19载体的BamHI和EcoRI位点间得到的质粒。所述非洲猪瘟病毒B646L基因的序列如序列8所示。
溶液D为阴性对照RNase Free dH2O。
二、微滴数字PCR绝对定量检测试剂盒的组装
试剂盒组成如下：溶液A、溶液B、溶液C、溶液D，分别独立包装。
三、试剂盒的使用方法
待测样本为待测病毒或待测猪组织，猪组织具体可为猪肺。
1、提取待测样本的总核酸，将总核酸或其稀释液作为模板溶液。
2、取18μL溶液A，加入2μL模板溶液。用等体积溶液D代替模板溶液作为阴性对照处理。用等体积溶液C代替模板溶液作为阳性对照处理。
3、取微滴发生卡固定于底座上，中间一排的8个孔内每孔加入20μL步骤2配制的体系，底部一排的8个孔内每孔加入70μL溶液B，然后将固定有微滴发生卡的底座放置于微滴生成仪中形成微滴(微滴生成于微滴发生卡顶部一排的8个孔内)。
4、取96孔板，完成步骤3后，从微滴发生卡顶部一排的8个孔中，每个孔取40μL，以一一对应的方式加入96孔板的8个孔中，用热封仪进行封膜。
5、将完成步骤4的96孔板置于PCR仪中，进行RT-PCR扩增。
RT-PCR扩增程序：50℃反转录10min；95℃预变性10min；94℃变性30sec、55℃退火60sec，共40个循环；98℃10min。采用的升降温速度设置为2.5℃/sec。
6、完成步骤5后，取96孔板，在微滴分析仪中进行检测，猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性的微滴显示蓝色荧光，非洲猪瘟病毒阳性的微滴显示绿色荧光。
同时满足如下四个条件说明结果可信：①每微升阳性对照中，猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测值为10000拷贝数；②每微升阳性对照中，非洲猪瘟病毒的检测值为10000拷贝数；③每微升阴性对照中，猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测值为0；④每微升阴性对照中，非洲猪瘟病毒的检测值为0。如果模板中检测到猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性的微滴，说明待测样本中含有猪繁殖与呼吸综合征病毒，可根据阳性微滴数量得到猪繁殖与呼吸综合征病毒的拷贝数；如果模板中没有检测到猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性的微滴，说明待测样本中不含有猪繁殖与呼吸综合征病毒。如果模板中检测到非洲猪瘟病毒阳性的微滴，说明待测样本中含有非洲猪瘟病毒，可根据阳性微滴数量得到非洲猪瘟病毒的拷贝数；如果模板中没有检测到非洲猪瘟病毒阳性的微滴，说明待测样本中不含有非洲猪瘟病毒。
四、芯片数字PCR各个试剂的配制
溶液A为一步法ddPCR探针法预混液。每900μL溶液A的组成如下：500μLQuantStudio3D Digital PCR Master Mix(2×)，100μL SuperScriptTMIIIReverseTranscriptase，45μL PRRS-F1溶液(PRRS-F1溶液中PRRS-F1的浓度为20μM)，45μLASF-F1溶液(ASF-F1溶液中ASF-F1的浓度为20μM)，45μL PRRS-R1溶液(PRRS-R1溶液中PRRS-R1的浓度为20μM)，45μL ASF-R1溶液(ASF-R1溶液中ASF-R1的浓度为20μM)，10μLPRRS-P1溶液(PRRS-P1溶液中PRRS-P1的浓度为20μM)，10μLASF-P1溶液(ASF-P1溶液中ASF-P1的浓度为20μM)，100μL RNase Free dH2O。
溶液B为阳性对照。溶液B的制备方法：提取含有猪繁殖与呼吸综合征病毒特异性基因片段的质粒，提取含有非洲猪瘟病毒特异性基因片段的质粒，将两种质粒溶液等质量混合，使然后用Tris-EDTA缓冲液(pH8.0、0.01M)稀释，使两种质粒的浓度均为10000个拷贝数/微升。
溶液C为阴性对照RNase Free dH2O。
五、芯片数字PCR绝对定量检测试剂盒的组装
试剂盒组成如下：溶液A、溶液B、溶液C，分别独立包装。
六、试剂盒的使用方法
待测样本为待测病毒或待测猪组织，猪组织具体可为猪肺。
1、提取待测样本的总核酸，将总核酸或其稀释液作为模板溶液。
2、取18μL溶液A，加入2μL模板溶液。用等体积溶液C代替模板溶液作为阴性对照处理。用等体积溶液B代替模板溶液作为阳性对照处理。
3、将20μL步骤2配制的体系通过芯片装载仪自动加载到芯片的微孔中，体系加载完成后，立即用封油注射器将封油覆盖于芯片表面并将芯片密封。
4、将密封好的芯片置于PCR仪中，进行RT-PCR扩增。
RT-PCR扩增程序：50℃反转录10min；96℃预变性10min；55℃退火60sec，60℃延伸60sec，98℃30sec，共40个循环；60℃2min。
5、完成步骤4后，取经过扩增的芯片，在芯片分析仪中进行检测，猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性的微滴显示蓝色荧光，非洲猪瘟病毒阳性的微滴显示红色荧光。
同时满足如下四个条件说明结果可信：①每微升阳性对照中，猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测值为10000拷贝数；②每微升阳性对照中，非洲猪瘟病毒的检测值为10000拷贝数；③每微升阴性对照中，猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测值为0；④每微升阴性对照中，非洲猪瘟病毒的检测值为0。如果模板中检测到猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性的微滴，说明待测样本中含有猪繁殖与呼吸综合征病毒，可根据阳性微滴数量得到猪繁殖与呼吸综合征病毒的拷贝数；如果模板中没有检测到猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性的微滴，说明待测样本中不含有猪繁殖与呼吸综合征病毒。如果模板中检测到非洲猪瘟病毒阳性的微滴，说明待测样本中含有非洲猪瘟病毒，可根据阳性微滴数量得到非洲猪瘟病毒的拷贝数；如果模板中没有检测到非洲猪瘟病毒阳性的微滴，说明待测样本中不含有非洲猪瘟病毒。
实施例4、特异性检验
待测样本分别为：3D4/21猪肺细胞株、猪细小病毒、2型猪圆环病毒、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒。
采用实施例3制备的试剂盒，按照试剂盒的使用方法进行检测。
各个待测样本均为阴性结果。
实施例5、敏感性比较
对本发明建立的鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒数字PCR检测技术与相关文献、现行的国际标准、团体标准中的猪繁殖与呼吸综合征病毒、非洲猪瘟病毒的检测技术进行比较。
表3敏感性比较中涉及的引物探针组序列
Figure BDA0002267562300000201
Figure BDA0002267562300000211
采用上述实施例2中“数字PCR中相关反应参数的优化”经过优化的数字PCR方法测定本发明实施例2的引物探针及以上对照组1-3的敏感性，具体检测结果如下表4。
表4不同RT-PCR方法检测猪繁殖与呼吸综合征实验样品的敏感性检测结果
拷贝数 10<sup>6</sup> 10<sup>5</sup> 10<sup>4</sup> 10<sup>3</sup> 10<sup>2</sup> 10<sup>1</sup> 5 3
实施例2 + + + + + + + -
对照组1 + + + + - - - -
对照组2 + + + + + - - -
对照组3 + + + + + + - -
表5不同PCR方法检测非洲猪瘟病毒实验样品的敏感性检测结果
拷贝数 10<sup>6</sup> 10<sup>5</sup> 10<sup>4</sup> 10<sup>3</sup> 10<sup>2</sup> 10<sup>1</sup> 5 3
实施例2 + + + + + + + -
对照组4 + + + + + - - -
对照组5 + + + + + + - -
对照组6 + + + + + - - -
可见，本发明所建立的鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒数字PCR检测技术检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的灵敏度为5拷贝/μL，其可检测到的最小质粒数为5拷贝/μL；检测非洲猪瘟病毒的灵敏度为5拷贝/μL，其可检测到的最小质粒数为5拷贝/μL。相比现行的各猪繁殖与呼吸综合征病毒诊断的行业标准的对照组1-3和非洲猪瘟病毒数字PCR检测技术诊断的行业标准的对照组4-6，本发明实施例2的引物组具有更高的灵敏度。对于猪繁殖与呼吸综合征病毒和非洲猪瘟病毒的早期或潜伏期的检测具有更加重要的意义。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>中国动物疫病预防控制中心（农业农村部屠宰技术中心）
<120>一种用于鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒的试剂盒及其应用
<160>8
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)
<223>v = a或g或c
<220>
<221>misc_feature
<222>(9)
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<220>
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<223>k = g或t
<220>
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<210>2
<211>21
<212>DNA
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<220>
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<222>(5)
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<222>(10)
<223>m = a或c
<220>
<221>misc_feature
<222>(11)
<223>y = c或t
<400>2
cgcchctccm ygtttaacag c 21
<210>3
<211>20
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<220>
<221>misc_feature
<222>(3)
<223>v = a或g或c
<220>
<221>misc_feature
<222>(9)
<223>b = g或c或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(16)
<223>h = a或c或t
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tavattctbg ccccthccca 20
<210>4
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<212>DNA
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<220>
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<222>(11)
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<220>
<221>misc_feature
<222>(17)
<223>y = c或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(21)
<223>b = g或c或t
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cgatgatgat kaccttygct btga 24
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<220>
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<222>(9)
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<220>
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<222>(24)
<223>r = a或g
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<212>DNA
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<220>
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<222>(6)
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<220>
<221>misc_feature
<222>(21)
<223>b = g或c或t
<400>6
ccacgsgagg aataccaacc bagtg 25
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<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>7
atggggtcgt ctctagacga cttctgcaat gatagcacag ctccacagaa ggtgcttttg 60
gcgttttcca ttacctacac gccagtgatg atatatgctc taaaggtaag tcgcggccga 120
ctgctagggc ttctgcacct tttgatcttt ctgaattgtg cttttacctt cgggtacatg 180
acattcgtgc actttgagag cacaaatagg gtcgcgctca ctatgggagc agtagttgca 240
cttctttggg gagtgtactc agccatagaa acctggaaat tcatcacctc cagatgccgt 300
ttgtgcttgc taggccgcaa gtacattctg gcccctgccc accacgtcga aagtgccgcg 360
ggctttcatc cgattgcggc aaatgataac cacgcatttg tcgtccggcg tcccggctcc 420
actacggtca acggcacatt ggtgcccggg ttgaaaagcc tcgtgttggg tggcagaaaa 480
gctgttaagc agggagtggt aaaccttgtt aaatatgcca aataacaacg gcaagcagca 540
aaagaaaaag aaggggaatg gccagccagt caatcagctg tgccaaatgc tgggtaagat 600
catcgcccaa caaaaccagt ccagaggcaa gggaccgggg aagaaaaata ggaagaaaaa 660
cccggagaag ccccatttcc ctctagcgac tgaagatgac gtcaggcatc actttacccc 720
tagtgagcgg caattgtgtc tgtcgtcgat ccagactgcc ttcaatcagg gcgctggaac 780
ttgtgccctg tcagattcag ggaggataag ttacactgtg gagtttagtt tgccgacgca 840
acatactgtg cgtctgatcc gcgccacagc atcaccctca gcatga 886
<210>8
<211>1941
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>8
ttaggtactg taacgcagca cagctgaacc gttctgaaga agaagaaagt taatagcaga 60
tgccgatacc acaagatcag ccgtagtgat agaccccacg taatccgtgt cccaactaat 120
ataaaattct cttgctctgg atacgttaat atgaccactg ggttggtatt cctcccgtgg 180
cttcaaagca aaggtaatca tcatcgcacc cggatcatcg ggggttttaa tcgcattgcc 240
tccgtagtgg aagggtatgt aagagctgca gaactttgat ggaaatttat cgataagatt 300
gataccatga gcagttacgg aaatgttttt aataataggt aatgtgatcg gatacgtaac 360
ggggctaata tcagatatag atgaacatgc gtctggaaga gctgtatctc tatcctgaaa 420
gcttatctct gcgtggtgag tgggctgcat aatggcgtta acaacatgtc cgaacttgtg 480
ccaatctcgg tgttgatgag gattttgatc ggagatgttc caggtaggtt ttaatcctat 540
aaacatatat tcaatgggcc atttaagagc agacattagt ttttcatcgt ggtggttatt 600
gttggtgtgg gtcacctgcg ttttatggac acgtatcagc gaaaagcgaa cgcgttttac 660
aaaaaggttg tgtatttcag gggttacaaa caggttattg atgtaaagtt cattattcgt 720
gagcgagatt tcattaatga ctcctgggat aaaccatggt ttaaagcgta tattgcgtct 780
actggggcgt ccagctataa aacgtgactg gcgtacaaaa agtccaggaa attcattcac 840
caaatccttt tgcgatgcaa gctttatggt gataaagcgc tcgccgaagg gaatggatac 900
tgagggaata gcaaggttca cgttctcatt aaaccaaaag cgcaacttaa tccagagcgc 960
aagagggggc tgatagtatt taggggtttg aggtccatta cagctgtaat gaacattacg 1020
tcttatgtcc agatacgttg cgtccgtgat aggagtaata tcttgtttac ctgctgtttg 1080
gatattgtga gagttctcgg gaaaatgctg tgaaagaaat ttcgggttgg tatggctaca 1140
cgttcgctgc gtatcatttt catcggtaag aataggtttg ctttggtgcg gcttgtgcaa 1200
atcatgaatg ttgcatagga gagggccact ggttccctcc accgatacct cctggccaac 1260
caagtgctta tatccagtca ttttatcccc tgggatgcaa aatttgcgca caagcgttgt 1320
gacatccgaa ctatattcgt ctagggaatt tccatttaca tcgaatctta cgttttcata 1380
aagtcgttct ccggggtatt cgcagtagta aaccaagttt cggtacgcat tctttgtgcc 1440
gggtacaatg ggtcttccaa aaggatctac aagcgtgtaa acggcgccct ctaagggtgt 1500
ttggttgtcc cagtcatatc cgttgcgagg aaacgtttga agctgcccat gggcccccat 1560
ctgggacgtg ccctgaatcg gagcatcctg ccaggatgaa tgacatgcac ccaatatatg 1620
atggcccacc atatcatgga aaaagtctcc gtactgggga ataccaaagg taagcttgtt 1680
tcccaaggtg ggggtacccg tatgcgggcg tactttattg tattcaaacc ctactggaac 1740
ataaggctta aaatgcgcat taaaatgcac caaatgtgtt tcttcgattt gactcaaagt 1800
gggttcggga tcgggtttcc cataactttt gttcacattt ttaatgttag agatcctgct 1860
attcagcaag tcttgggcca atataatctt gtcggccttc ccatcgttag caataagaca 1920
aaaagctcct cctgatgcca t 1941

Claims (10)

1.一种引物探针组合，其由引物探针组PRRS-F1R1P1和引物探针组ASF-F1R1P1组成；
所述引物探针组PRRS-F1R1P1由引物PRRS-F1、引物PRRS-R1和探针PRRS-P1组成；
所述引物PRRS-F1为序列表的序列1所示的单链核酸分子；
所述引物PRRS-R1为序列表的序列2所示的单链核酸分子；
所述探针PRRS-P1，一个末端具有荧光报告基团，另一个末端具有荧光淬灭基团，核苷酸序列为序列表的序列3所示的单链DNA分子；
所述引物探针组ASF-F1R1P1由引物ASF-F1、引物ASF-R1和探针ASF-P1组成；
所述引物ASF-F1为序列表的序列4所示的单链DNA分子；
所述引物ASF-R1为序列表的序列5所示的单链DNA分子；
所述探针ASF-P1，一个末端具有荧光报告基团，另一个末端具有荧光淬灭基团，核苷酸序列为序列表的序列6所示的单链DNA分子；
所述探针PRRS-P1和所述探针ASF-P1具有不同颜色的荧光报告基团。
2.权利要求1所述的引物探针组合在如下（b1）-（b6）中任一种中的应用：
（b1）鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒；
（b2）制备用于鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒的试剂盒；
（b3）检测待测样本是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒；
（b4）制备用于检测待测样本是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒的试剂盒；
（b5）检测待测样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒的含量；
（b6）制备用于检测待测样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒含量的试剂盒；
所述应用为非疾病诊断和治疗目的的应用。
3.一种试剂盒，其包括权利要求1所述的引物探针组合；所述试剂盒的功能为如下（c1）或（c2）或（c3）：
（c1）鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒；
（c2）检测待测样本是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒；
（c3）检测待测样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒的含量。
4.一种检测待测病毒是否为猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒的方法，包括如下步骤：以待测病毒的总核酸为模板，采用权利要求1所述的引物探针组合进行数字RT-PCR；如果基于探针PRRS-P1相应的荧光基团的检测结果为阳性、待测病毒为或候选为猪繁殖与呼吸综合征病毒，如果基于探针PRRS-P1相应的荧光基团的检测结果为阴性、待测病毒为或候选为非猪繁殖与呼吸综合征病毒；如果基于探针ASF-P1相应的荧光基团的检测结果为阳性、待测病毒为或候选为非洲猪瘟病毒，如果基于探针ASF-P1相应的荧光基团的检测结果为阴性、待测病毒为或候选为非非洲猪瘟病毒；所述方法为非疾病诊断和治疗目的的方法。
5.一种检测待测样本是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒的方法，包括如下步骤：以待测样本的总核酸为模板，采用权利要求1所述的引物探针组合进行数字RT-PCR；如果基于探针PRRS-P1相应的荧光基团的检测结果为阳性、待测样本含有猪繁殖与呼吸综合征病毒，如果基于探针PRRS-P1相应的荧光基团的检测结果为阴性、待测样本不含有猪繁殖与呼吸综合征病毒；如果基于探针ASF-P1相应的荧光基团的检测结果为阳性、待测样本含有非洲猪瘟病毒，如果基于探针ASF-P1相应的荧光基团的检测结果为阴性、待测样本不含有非洲猪瘟病毒；所述方法为非疾病诊断和治疗目的的方法。
6.一种检测待测样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒的含量的方法，包括如下步骤：以待测样本的总核酸为模板，采用权利要求1所述的引物探针组合进行数字RT-PCR；根据猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性微滴的数量得到待测样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒的含量，猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性微滴为基于探针PRRS-P1相应的荧光基团的检测结果为阳性的微滴；根据非洲猪瘟病毒阳性微滴的数量得到待测样本中非洲猪瘟病毒的含量，非洲猪瘟病毒阳性微滴为基于探针ASF-P1相应的荧光基团的检测结果为阳性的微滴；所述方法为非疾病诊断和治疗目的的方法。
7.一种用于通过数字RT-PCR检测猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒的预混液，其含有权利要求1中所述的引物PRRS-F1、引物PRRS-R1、探针PRRS-P1、引物ASF-F1、引物ASF-R1和探针ASF-P1。
8.一种用于通过数字RT-PCR检测猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒的试剂盒，其包括权利要求7所述的预混液。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括阴性对照和阳性对照；所述阴性对照为RNase Free dH2O；所述阳性对照为含有猪繁殖与呼吸综合征病毒特异性基因质粒溶液和非洲猪瘟病毒特异性基因质粒溶液的混合溶液。
10.权利要求7所述的预混液或权利要求8或9所述的试剂盒在如下（c1）或（c2）或（c3）中的应用：
（c1）鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒；
（c2）检测待测样本是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒；
（c3）检测待测样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或非洲猪瘟病毒的含量；
所述应用为非疾病诊断和治疗目的的应用。
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