CN108152501A - A群牛轮状病毒检测试剂盒和该病毒抗体胶体金试剂制备方法 - Google Patents
A群牛轮状病毒检测试剂盒和该病毒抗体胶体金试剂制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种A群牛轮状病毒检测试剂盒，包含试剂R1和试剂R2。本发明还涉及一种A群牛轮状病毒检测试剂盒的制备方法，包括烧制胶体金；将抗体与胶体金纳米颗粒偶联，得到偶联抗体的纳米金颗粒溶液；离心，沉淀用含稳定剂、防腐剂的缓冲液重悬，调整浓度。本发明具有较高的检测灵敏度和特异性，稳定性好，操作简单，反应时间短；适用于全自动生化分析仪、特种蛋白仪及分光光度计，反应后不产生沉淀，便于反应杯清洗；本发明试剂盒与IPMA、ELISA、免疫荧光、免疫层析等方法对样本中BRoV检测数据统计分析，检测结果可靠，较胶乳法生产成本更低，具有较大的市场竞争力。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体的说是一种A群牛轮状病毒检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
轮状病毒是各种幼龄动物和婴幼儿病毒性腹泻的病原之一。1968年Mebus等人在美国阿拉斯加州一农场犊牛腹泻粪便中首次发现牛轮状病毒（Bovine rotavirus，BRoV），以后在欧洲、美洲、澳大利亚、新西兰、日本等都发现了由牛轮状病毒引起的犊牛腹泻。
BRoV属于呼肠孤病毒科轮状病毒属的双链RNA病毒，BRoV感染时引起犊牛爆发肠道机能紊乱的一种急性肠道传染病，以呕吐、腹泻、脱水和酸碱平衡紊乱为主要特征，给养牛业带来严重的危害。BRoV病毒粒子略呈圆形，具有双层衣壳，直径65-75nm。中央是一个电子致密六角形核心，为RV的芯髓，直径37-40nm；芯髓周围绕有一个电子透明层，壳粒由此向外呈辐射状排列，构成内衣壳；外周是一层由光滑薄膜构成的外衣壳，厚约20nm，是在内质网膜上芽生时获得的。以核心为毂，以呈辐射状排列的内衣壳为轮辐，以外衣壳为辋，构成特征性的轮状结构。电子显微镜水平下可以对轮状病毒与呼肠孤病毒加以区分。电子显微镜观察发现，轮状病毒的内衣壳壳粒为棍棒状，向外呈辐射状排列，外周为一层由光滑薄膜构成的外衣壳，故而病毒粒子表面光滑；相反，呼肠孤病毒内衣壳的壳粒接近球形或呈短棱柱状，外衣壳的壳粒清楚可见，故整个病毒的表面呈粗糙颗粒状。此外，轮状病毒的核心小于呼肠孤病毒的核心。
BRoV存在多种血清型，我国牛群中轮状病毒感染以A群为主，在A群BRoV中VP6蛋白是群抗原，在各毒株中高度保守。我国BRoV的诊断主要依赖于实验室的常规诊断，这些常规的诊断技术有其优点，但也有其固有的缺点。成本高、需要特殊的昂贵的仪器、需要特殊技术人员、存在有害物质等因素影响了对BRoV的及时诊断，尤其是对BRoV的现地诊断，从而也影响了对BRoV的及时预防和治疗。
随着单克隆抗体技术的发展和全自动生化分析仪、蛋白分析仪的普及，免疫比浊技术已经发展出多种快速免疫比浊检测技术，已被广泛应用于临床诊断、生物材料分析的等技术实践中。
纳米颗粒增强比浊法（Particle-enhanced turbidimetric immunoassay,PETIA）是一种较为稳定、准确的均相免疫比浊检测方法。
PETIA法大体分为两种：一种是散射比浊检测法，另一种是透射比浊检测法。这两种方法的基本原理非常相似，都是在高分子纳米微球的表面交联单克隆抗体，当交联有抗体的微球与抗原结合后，在短时间内会迅速聚集在一起，改变了反应液的散光性能或透光性能。而且，反应液散光性能或透光性能（即吸光度）的改变与被测抗原的浓度有较强的相关性,在一定范围内可以反映被测抗原的浓度。
PETIA检测方法是在均相反应体系中进行抗原、抗体反应及结果的测定。抗原、抗体反应后，直接测定反应液的吸光度值，省却了ELISA法反复孵育和洗板等烦琐操作步骤，几分钟就能获得结果，省时省力。
此外，PETIA操作步骤的简化也相应地避免了许多人为操作因素和试剂、环境等外界因素的干扰，稳定性和重复性都较好，能较真实地反映被测物质的存在情况。纳米级粒子的推出解决了对单克隆抗体结合的能力不强，临床检测的线性范围窄，干扰因素多，实验稳定性差等问题，大大促进了免疫比浊法在临床上的广泛应用。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种A群牛轮状病毒检测试剂盒，该检测试剂盒具有较高的检测灵敏度和特异性，稳定性好，操作简单，反应时间短； 可适用于全自动生化分析仪、特种蛋白仪及分光光度计，反应后不产生沉淀，便于反应杯清洗。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种A群牛轮状病毒抗体胶体金试剂的制备方法，该方法不需要预处理样本，操作简便、准确可靠、重复性好，可用于全自动生化分析仪、特种蛋白仪及分光光度计上使用。
为解决第一个技术问题，本发明提供了一种A群牛轮状病毒检测试剂盒，包含试剂R1和试剂R2；所述试剂R1为pH 6.0-8.0的缓冲液，其包括稳定剂、高分子加速剂、表面活性剂和防腐剂；所述试剂R2为A群牛轮状病毒抗体胶体金试剂，其包括稳定剂、抗A群牛轮状病毒抗体纳米金颗粒、防腐剂和缓冲液。
进一步地，所述试剂R1的缓冲液包括醋酸盐缓冲液、氯化铵缓冲液、磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷TRIS缓冲液、硼砂-氢氧化钠缓冲液、甘氨酸缓冲液、3-(N-吗啉)丙磺酸MOPS缓冲液、3-(环己胺)-2-羟基-1-丙磺酸CAPSO缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES缓冲液中的一种或几种。
进一步地，所述试剂R1的稳定剂包括亚氨基二乙酸、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠、乙二胺四乙酸二钠、二乙烯三胺五乙酸钠、1,2-环己二醇缩水甘油、甘露糖、葡萄糖、壳聚糖、山梨醇和牛血清蛋白中的一种或几种；所述试剂R1的防腐剂包括叠氮钠、苯酚、Proclin、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯和乙基汞硫代硫酸钠中的一种或几种；所述试剂R1的高分子加速剂包括脂肪醇聚氧乙烯醚、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸钠、聚乙二醇、羟丙基甲基纤维素和羟甲基纤维素钠中的一种或几种；所述试剂R1的表面活性剂包括Triton系列、Tween系列、月桂醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚和聚氧乙烯辛基苯醚中的一种或几种。
优选的，所述试剂R1的稳定剂为质量体积比0.2-2% 的牛血清蛋白BSA；所述试剂R1的高分子加速剂为质量体积比0.2-0.5% 的聚乙二醇PEG8000；所述试剂R1的防腐剂为质量体积比0.1-0.5%的Proclin300；所述试剂R1的表面活性剂为质量体积比0.05-0.1%Tween20；所述试剂R1的缓冲液为pH6.0-8.0的磷酸盐缓冲液。
进一步地，所述试剂R2的缓冲液包括磷酸盐缓冲液、硼酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、Tris-Cl缓冲液、HEPS缓冲液中的一种或多种；所述试剂R2的稳定剂包括小牛血清、BSA、脱脂乳、明胶、甘露糖、葡萄糖、壳聚糖、山梨醇、甲醇、乙醇、乙二醇、丙三醇、Triton、Tween一种或几种；所述试剂R2的防腐剂包括叠氮钠、苯酚、Proclin、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯和乙基汞硫代硫酸钠中的一种或几种；所述试剂R2的抗A群牛轮状病毒抗体包括鼠抗A群BRoV单克隆抗体、羊抗A群BRoV多克隆抗体、兔抗A群BRoV多克隆抗体、鸡抗A群BRoV单克隆抗体一种或多种混合。
优选的，所述试剂R2的稳定剂为质量体积比10-20%蔗糖、质量体积比0.5-2% BSA和质量体积比3-10%甘油；所述试剂R2的抗A群牛轮状病毒抗体纳米金颗粒为标记有鼠抗A群BRoV单克隆抗体的粒径为60±1.5nm的金纳米颗粒；所述试剂R2的防腐剂为质量体积比0.1-0.5%的Proclin300；所述试剂R2的缓冲液为pH6.0-8.0的磷酸盐缓冲液。金纳米颗粒与抗体质量比为1:0.8-1:1.6。
为解决第二个技术问题，本发明提供一种A群牛轮状病毒抗体胶体金试剂的制备方法，该方法包括如下步骤：步骤1）烧制胶体金；步骤2）将抗体与胶体金纳米颗粒偶联，得到偶联抗体的纳米金颗粒溶液；步骤3）离心，沉淀用含稳定剂、防腐剂的缓冲液重悬，调整浓度至为0.2。
其中，步骤1）具体的包括：步骤1.1）配制1%氯金酸溶液，将1g氯金酸加入100mL超纯水中，4℃避光保存备用；步骤1.2）配制1%柠檬酸三钠溶液，将1g柠檬酸三钠溶于100mL超纯水中，备用；步骤1.3）在清洗干净的圆底烧瓶中加超纯水100mL，放入磁力搅拌子1枚，加入1%氯金酸溶液1mL，600rpm高速搅拌并加热至溶液沸腾，迅速加入1%柠檬酸三钠溶液1.5mL，继续加热和搅拌10min，溶液颜色先变黑后变红，停止加热并继续搅拌10min，然后停止搅拌恢复至室温并用超纯水恢复至100mL；制得胶体金溶液，超滤去掉小分子备用。
步骤2）具体的包括：步骤2.1）利用抗A群牛轮状病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株，以体内诱生腹水的方式制备抗体；步骤2.2）用Protein G柱进行纯化，0.01M PBS、pH7.2、4℃透析过夜，12000rpm 、4℃离心30min，收集上清即得A群牛轮状病毒单克隆抗体，用紫外分光光度计或蛋白分析仪测定得出抗体浓度；步骤2.3）取100mL胶体金溶液，用1%调节pH至7.5-10.0，按最适蛋白量缓慢加入A群牛轮状病毒单克隆抗体，在磁力搅拌器下反应10min，加入BSA溶液至最终浓度为1%，继续搅拌5min，得到A群牛轮状病毒单克隆抗体金标复合物，4℃过夜。
步骤3）具体的包括：步骤3.1）将A群牛轮状病毒单克隆抗体金标复合物以3000rpm离心30min；步骤3.2）去除聚合凝集杂质，再以12000rpm、 4℃离心30min，弃上清，用重悬液（1%BSA+0.01MPBS）复溶，重复洗涤3次；步骤3.3）收集沉淀，用质量体积比20%蔗糖、质量体积比2% BSA、质量体积比10%甘油、质量体积比0.5%的Proclin300作为稳定剂的0.01M的PBS缓冲液（pH7.2）重悬沉淀，调整浓度至为0.2，分装备用。
本发明产生了如下有益效果：
1）本发明试剂盒具有较高的检测灵敏度和特异性，稳定性好，操作简单，反应时间短，从检测导出结果最多只需10min；
2）本发明试剂盒可适用于全自动生化分析仪、特种蛋白仪及分光光度计，反应后不产生沉淀，便于反应杯清洗；
3）本发明试剂盒与IPMA、ELISA、免疫荧光、免疫层析等方法对样本中BRoV检测数据统计分析，无显著差异，检测结果可靠，同时较胶乳法生产成本更低，具有较大的市场竞争力；
4）通过纳米金颗粒标记的A群牛轮状病毒抗体与待检样本反应前后溶液的浊度变化判断A群牛轮状病毒的存在与否。该方法不需要预处理样本，操作简便、准确可靠、重复性好，可用于全自动生化分析仪、特种蛋白仪及分光光度计上使用。
具体实施方式
本发明提供了一种A群牛轮状病毒检测试剂盒，其包含试剂R1和试剂R2。试剂R1为pH 6.0-8.0的缓冲液，其包括稳定剂、高分子加速剂、表面活性剂和防腐剂；所述试剂R2为A群牛轮状病毒抗体胶体金试剂，其包括稳定剂、抗A群牛轮状病毒抗体纳米金颗粒、防腐剂和缓冲液。
其中，试剂R1的缓冲液包括醋酸盐缓冲液、氯化铵缓冲液、磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷TRIS缓冲液、硼砂-氢氧化钠缓冲液、甘氨酸缓冲液、3-(N-吗啉)丙磺酸MOPS缓冲液、3-(环己胺)-2-羟基-1-丙磺酸CAPSO缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES缓冲液中的一种或几种。试剂R1的稳定剂包括亚氨基二乙酸、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠、乙二胺四乙酸二钠、二乙烯三胺五乙酸钠、1,2-环己二醇缩水甘油、甘露糖、葡萄糖、壳聚糖、山梨醇和牛血清蛋白中的一种或几种；试剂R1的防腐剂包括叠氮钠、苯酚、Proclin、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯和乙基汞硫代硫酸钠中的一种或几种；所述试剂R1的高分子加速剂包括脂肪醇聚氧乙烯醚、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸钠、聚乙二醇、羟丙基甲基纤维素和羟甲基纤维素钠中的一种或几种；所述试剂R1的表面活性剂包括Triton系列、Tween系列、月桂醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚和聚氧乙烯辛基苯醚中的一种或几种。
作为一种优选方案，本发明的试剂R1的稳定剂为质量体积比0.2-2% 的牛血清白蛋白BSA；所述试剂R1的高分子加速剂为质量体积比0.2-0.5% 的聚乙二醇PEG8000；所述试剂R1的防腐剂为质量体积比0.1-0.5%的Proclin300；所述试剂R1的表面活性剂为质量体积比0.05-0.1% Tween20；
所述试剂R2的缓冲液包括磷酸盐缓冲液、硼酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、Tris-Cl缓冲液、HEPS缓冲液中的一种或多种；所述试剂R2的稳定剂包括小牛血清、BSA、脱脂乳、明胶、甘露糖、葡萄糖、壳聚糖、山梨醇、甲醇、乙醇、乙二醇、丙三醇、Triton、Tween一种或几种；所述试剂R2的防腐剂包括叠氮钠、苯酚、Proclin、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯和乙基汞硫代硫酸钠中的一种或几种；所述试剂R2的抗A群牛轮状病毒抗体包括鼠抗A群BRoV单克隆抗体、羊抗A群BRoV多克隆抗体、兔抗A群BRoV多克隆抗体、鸡抗A群BRoV单克隆抗体一种或多种混合。
作为一种优选方案，试剂R2的稳定剂为质量体积比10-20%蔗糖、质量体积比0.5-2% BSA和质量体积比3-10%甘油；所述试剂R2的抗A群牛轮状病毒抗体纳米金颗粒为标记有鼠抗A群BRoV单克隆抗体的粒径为60±1.5nm的金纳米颗粒；所述试剂R2的防腐剂为质量体积比0.1-0.5%的Proclin300；所述试剂R2的缓冲液为pH6.0-8.0的磷酸盐缓冲液。金纳米颗粒与抗体质量比为1:0.8-1:1.6。
其中，试剂R2为群牛轮状病毒抗体胶体金试剂，本发明提供一种试剂R2的制备方法该方法包括如下步骤：步骤1）烧制胶体金；步骤2）将抗体与胶体金纳米颗粒偶联，得到偶联抗体的纳米金颗粒溶液；步骤3）离心，沉淀用含稳定剂、防腐剂的缓冲液重悬，调整浓度至为0.2。
其中，步骤1）具体的包括：步骤1.1）配制1%氯金酸溶液，将1g氯金酸加入100mL超纯水中，4℃避光保存备用；步骤1.2）配制1%柠檬酸三钠溶液，将1g柠檬酸三钠溶于100mL超纯水中，备用；步骤1.3）在清洗干净的圆底烧瓶中加超纯水100mL，放入磁力搅拌子1枚，加入1%氯金酸溶液1mL，600rpm高速搅拌并加热至溶液沸腾，迅速加入1%柠檬酸三钠溶液1.5mL，继续加热和搅拌10min，溶液颜色先变黑后变红，停止加热并继续搅拌10min，然后停止搅拌恢复至室温并用超纯水恢复至100mL；制得胶体金溶液，超滤去掉小分子备用。
步骤2）具体的包括：步骤2.1）利用抗A群牛轮状病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株，以体内诱生腹水的方式制备抗体；步骤2.2）用Protein G柱进行纯化，0.01M PBS、pH7.2、4℃透析过夜，12000rpm 、4℃离心30min，收集上清即得A群牛轮状病毒单克隆抗体，用紫外分光光度计或蛋白分析仪测定得出抗体浓度；步骤2.3）取100mL胶体金溶液，用1%调pH至7.5-10.0，按最适蛋白量缓慢加入A群牛轮状病毒单克隆抗体，在磁力搅拌器下反应10min，加入BSA溶液至最终浓度为1%，继续搅拌5min，得到A群牛轮状病毒单克隆抗体金标复合物，4℃过夜。
步骤3）具体的包括：步骤3.1）将A群牛轮状病毒单克隆抗体金标复合物以3000rpm离心30min；步骤3.2）去除聚合凝集杂质，再以12000rpm、 4℃离心30min，弃上清，用重悬液（1%BSA+0.01MPBS）复溶，重复洗涤3次；步骤3.3）收集沉淀，用质量体积比20%蔗糖、质量体积比2% BSA、质量体积比10%甘油、质量体积比0.5%的Proclin300作为稳定剂的0.01M的PBS缓冲液（pH7.2）重悬沉淀，调整浓度至为0.2，分装备用。
本发明的检测原理是利用抗原抗体反应，先加入试剂R1，使样本中抗原位点暴露，若待测样本中存在A群BRoV，则加入试剂2后，金标抗BRoV抗体与BRoV抗原反应形成不溶的抗原抗体复合物，从而产生一定浊度变化；若待测样本中不存在A群BRoV，则加入试剂2反应后溶液浊度不变，从而判断待测样本中A群牛轮状病毒的存在与否。
其中，纳米金颗粒以类似胶体状态存在，又称为胶体金。本发明所提供基于胶体金免疫比浊法的A群BRoV检测试剂盒中，试剂R1是一种促使抗原位点暴露促进抗原抗体反应的缓冲液，可以使用如表成分所示缓冲液。
| 磷酸二氢钠 | 0.286g |
| 磷酸氢二钠 | 2.865g |
| BSA | 2g |
| PEG8000 | 0.5g |
| Proclin300 | 0.5g |
| Tween-20 | 0.1g |
| 纯水 | 100mL |
作为一种具体实施方式，A群牛轮状病毒检测试剂盒的制备方法包括以下步骤：
1.60nm胶体金制备过程
所需玻璃器皿用重铬酸钾浓硫酸洗液浸泡48h，自来水冲洗，洗洁精洗涤干净，自来水冲洗10遍，蒸馏水冲洗3遍，蒸馏水浸泡24h后用去离子水冲洗3遍，烘箱烘干备用；
1%氯金酸溶液配置：1g氯金酸加入100mL超纯水中，4℃避光保存备用；
1%柠檬酸三钠溶液配置：1g柠檬酸三钠溶于100mL超纯水中；
在清洗干净的1000mL圆底烧瓶中加超纯水100mL，放入磁力搅拌子1枚，加入1%氯金酸溶液1mL，600rpm高速搅拌并加热至溶液沸腾，迅速加入1%柠檬酸三钠溶液1.5mL，继续加热和搅拌10min，溶液颜色先变黑后变红，停止加热并继续搅拌10min，然后停止搅拌恢复至室温并用超纯水恢复至100mL。电镜观察制得的胶体金粒径约为40±1.2nm，超滤去掉小分子备用。
2.试剂R2制备过程
A群牛轮状病毒单克隆抗体制备：利用抗A群牛轮状病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株，以体内诱生腹水的方式大量制备抗体，用Protein G柱进行纯化，0.01M PBS（pH7.2）4℃透析过夜，12000rpm 4℃离心30min，收集上清即得A群牛轮状病毒单克隆抗体，用紫外分光光度计或蛋白分析仪测定OD280nm得出抗体浓度；
100mL胶体金溶液用1% K2CO3调节pH至9.6，按最适蛋白量缓慢加入A群牛轮状病毒单克隆抗体，在磁力搅拌器下反应10min，加入BSA溶液至终浓度为1%，继续搅拌5min，即得A群牛轮状病毒单克隆抗体金标复合物，4℃过夜；
次日，3000rpm离心30min，去除聚合凝集杂质，再于12000rpm 4℃离心30min，弃上清，用重悬液（1%BSA+0.01MPBS）复溶，重复洗涤3次；
收集沉淀，用质量体积比20%蔗糖、质量体积比2% BSA、质量体积比10%甘油、质量体积比0.5%的Proclin300作为稳定剂的0.01M的PBS缓冲液（pH7.2）重悬沉淀，调整浓度至OD540nm为0.2，分装备用。
试剂盒检测样本操作方法：
基于胶体金免疫比浊的A群牛轮状病毒检测试剂盒使用方法如下（日立7180全自动生化分析仪）
待测样本准备：现场用一次性取样勺取新鲜的呕吐物或粪便装入无菌采样管中，称取1g溶于1ml样品稀释液中，4℃ 3000rpm离心15min取上清至于冰盒中备用；
测定波长：主波长：540nm，副波长800nm；
试剂比例：R1:S:R2=200uL:10uL:60uL；
读点方式：在先加入试剂R1再加入样品S，反应5min后加入试剂R2，3s后读取吸光度A1，反应5min后读取吸光度A2，计算吸光度变化。
试剂盒试验结果分析：
（1）临界值及检测限确定
参考值以临界值为依据，样本中A群BRoV的存在与否是通过样本吸光度值与临界值之间的比较来判定的。
结果的判定：待测样本OD值≥CUT OFF值时，判为A群BRoV阳性；反之，为阴性。
采用21份5%BSA溶液作为阴性样本，用本试剂盒进行检测，记录检测结果，见表1。计算20次结果的均值与标准差SD，以均值加3倍标准差作为报告方法的临界值（CUT OFF=+3SD）。
其OD值中最小为0.179，最大为0.363，△为0.256，SD为0.048，CUT OFF=0.400，即当检测样本OD值≥0.4时判定为阳性。
表1 阴性样本检测OD值
| 样本 | OD值 | 样本 | OD值 | 样本 | OD值 |
| 1 | 0.287 | 8 | 0.228 | 15 | 0.238 |
| 2 | 0.321 | 9 | 0.275 | 16 | 0.235 |
| 3 | 0.288 | 10 | 0.189 | 17 | 0.214 |
| 4 | 0.309 | 11 | 0.185 | 18 | 0.276 |
| 5 | 0.363 | 12 | 0.212 | 19 | 0.299 |
| 6 | 0.247 | 13 | 0.283 | 20 | 0.198 |
| 7 | 0.279 | 14 | 0.211 | 21 | 0.274 |
将纯化后的浓度为100ng/mL的A群BRoV按照7个梯度倍比稀释后进行检测（50ng/mL、25ng/mL、12.5 ng/mL、6.25 ng/mL、3.12 ng/mL、1.58 ng/mL、0.79 ng/mL）。结果显示，本发明检测试剂盒具有较高的灵敏度，最低检测限为1.58ng/mL。
（2）交叉反应检测
将牛轮状病毒、牛病毒性腹泻、产肠毒素大肠杆菌K88/K99/987P/F18粗体样品对其进行检测，根据测得的OD值比较待测样品的P/N值。结果表明，牛病毒性腹泻和大肠杆菌检测OD值均小于CO值0.4，同时P/N值均小于2.1，而牛轮状病毒OD值为2.568，P/N值为10.8（见表2）。表明本发明检测试剂盒特异性良好。
表2 交叉反应结果
| 待测抗原 | OD值 | P/N值 |
| BRoV | 2.169 | 8.87 |
| K88 | 0.276 | 1.16 |
| K99 | 0.366 | 1.06 |
| 987P | 0.339 | 1.11 |
| F18 | 0.241 | 1.76 |
| BDV-MD | 0.339 | 1.15 |
（3）不精密度分析
包括批内不精密度和批间不精密度的检测。
批内不精密度：连续重复测定BRoV阳性样本10次，操作按说明书进行，计算测定结果的平均值、标准偏差SD以及变异系数CV，结果见表3。
批间不精密度包括不同批次试剂及不同检测时间的不精密度检测。取3批检测试剂盒分别在不同时间（初检、第3天、第6天）检测BRoV阳性样本10次，共重复3次，计算出平均值、标准偏差SD以及变异系数CV等，结果见表3。结果表明，本发明检测试剂盒批内、批间不精密度CV值均低于15%。
表3 批内、批间不精密度检测结果
本发明产生了如下有益效果：
1）本发明试剂盒具有较高的检测灵敏度和特异性，稳定性好，操作简单，反应时间短，从检测导出结果最多只需10min；
2）本发明试剂盒可适用于全自动生化分析仪、特种蛋白仪及分光光度计，反应后不产生沉淀，便于反应杯清洗；
3）本发明试剂盒与IPMA、ELISA、免疫荧光、免疫层析等方法对样本中BRoV检测数据统计分析，无显著差异，检测结果可靠，同时较胶乳法生产成本更低，具有较大的市场竞争力；
4）通过纳米金颗粒标记的A群牛轮状病毒抗体与待检样本反应前后溶液的浊度变化判断A群牛轮状病毒的存在与否。该方法不需要预处理样本，操作简便、准确可靠、重复性好，可用于全自动生化分析仪、特种蛋白仪及分光光度计上使用。
综上所述，本发明不限于上述具体实施方式。本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的前提下，可做若干的更改或修饰。上述更改或修饰均落入本本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种A群牛轮状病毒检测试剂盒，包含试剂R1和试剂R2，其特征在于：
所述试剂R1为pH 6.0-8.0的缓冲液，其包括稳定剂、高分子加速剂、表面活性剂和防腐剂；
所述试剂R2为A群牛轮状病毒抗体胶体金试剂，其包括稳定剂、抗A群牛轮状病毒抗体纳米金颗粒、防腐剂和缓冲液。
2.根据权利要求1所述的A群牛轮状病毒检测试剂盒，其特征在于：
所述试剂R1的缓冲液包括醋酸盐缓冲液、氯化铵缓冲液、磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷TRIS缓冲液、硼砂-氢氧化钠缓冲液、甘氨酸缓冲液、3-(N-吗啉)丙磺酸MOPS缓冲液、3-(环己胺)-2-羟基-1-丙磺酸CAPSO缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES缓冲液中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的A群牛轮状病毒检测试剂盒，其特征在于：
所述试剂R1的稳定剂包括亚氨基二乙酸、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠、乙二胺四乙酸二钠、二乙烯三胺五乙酸钠、1,2-环己二醇缩水甘油、甘露糖、葡萄糖、壳聚糖、山梨醇和牛血清蛋白中的一种或几种；
所述试剂R1的防腐剂包括叠氮钠、苯酚、Proclin、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯和乙基汞硫代硫酸钠中的一种或几种；
所述试剂R1的高分子加速剂包括脂肪醇聚氧乙烯醚、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸钠、聚乙二醇、羟丙基甲基纤维素和羟甲基纤维素钠中的一种或几种；
所述试剂R1的表面活性剂包括Triton系列、Tween系列、月桂醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚和聚氧乙烯辛基苯醚中的一种或几种。
4.根据权利要求3所述的A群牛轮状病毒检测试剂盒，其特征在于：
所述试剂R1的稳定剂为质量体积比0.2-2% 的牛血清蛋白BSA；
所述试剂R1的高分子加速剂为质量体积比0.2-0.5% 的聚乙二醇PEG8000；
所述试剂R1的防腐剂为质量体积比0.1-0.5%的Proclin300；
所述试剂R1的表面活性剂为质量体积比0.05-0.1% Tween20；
所述试剂R1的缓冲液为pH6.0-8.0的磷酸盐缓冲液。
5.根据权利要求1所述的A群牛轮状病毒检测试剂盒，其特征在于：
所述试剂R2的缓冲液包括磷酸盐缓冲液、硼酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、Tris-Cl缓冲液、HEPS缓冲液中的一种或多种；
所述试剂R2的稳定剂包括小牛血清、BSA、脱脂乳、明胶、甘露糖、葡萄糖、壳聚糖、山梨醇、甲醇、乙醇、乙二醇、丙三醇、Triton、Tween一种或几种；
所述试剂R2的防腐剂包括叠氮钠、苯酚、Proclin、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯和乙基汞硫代硫酸钠中的一种或几种；
所述试剂R2的抗A群牛轮状病毒抗体包括鼠抗A群BRoV单克隆抗体、羊抗A群BRoV多克隆抗体、兔抗A群BRoV多克隆抗体、鸡抗A群BRoV单克隆抗体一种或多种混合。
6.根据权利要求5所述的A群牛轮状病毒检测试剂盒，其特征在于：
所述试剂R2的稳定剂为质量体积比10-20%蔗糖、质量体积比0.5-2% BSA和质量体积比3-10%甘油；
所述试剂R2的抗A群牛轮状病毒抗体纳米金颗粒为标记有鼠抗A群BRoV单克隆抗体的粒径为60±1.5nm的金纳米颗粒；
所述试剂R2的防腐剂为质量体积比0.1-0.5%的Proclin300；
所述试剂R2的缓冲液为pH6.0-8.0的磷酸盐缓冲液；
金纳米颗粒与抗体质量比为1:0.8-1:1.6。
7.一种A群牛轮状病毒抗体胶体金试剂的制备方法，其特征是包括以下步骤：
步骤1）烧制胶体金；
步骤2）将抗体与胶体金纳米颗粒偶联，得到偶联抗体的纳米金颗粒溶液；
步骤3）离心，沉淀用含稳定剂、防腐剂的缓冲液重悬，调整浓度至为0.2。
8.根据权利要求7所述的A群牛轮状病毒抗体胶体金试剂的制备方法，其特征是所述步骤1）具体的包括：
步骤1.1）配制1%氯金酸溶液，将1g氯金酸加入100mL超纯水中，4℃避光保存备用；
步骤1.2）配制1%柠檬酸三钠溶液，将1g柠檬酸三钠溶于100mL超纯水中，备用；
步骤1.3）在清洗干净的圆底烧瓶中加超纯水100mL，放入磁力搅拌子1枚，加入1%氯金酸溶液1mL，600rpm高速搅拌并加热至溶液沸腾，迅速加入1%柠檬酸三钠溶液1.5mL，继续加热和搅拌10min，溶液颜色先变黑后变红，停止加热并继续搅拌10min，然后停止搅拌恢复至室温并用超纯水恢复至100mL；制得胶体金溶液，超滤去掉小分子备用。
9.根据权利要求7所述的A群牛轮状病毒抗体胶体金试剂的制备方法，其特征是所述步骤2）具体的包括：
步骤2.1）利用抗A群牛轮状病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株，以体内诱生腹水的方式制备抗体；
步骤2.2）用Protein G柱进行纯化，0.01M PBS、pH7.2、4℃透析过夜，12000rpm 、4℃离心30min，收集上清即得A群牛轮状病毒单克隆抗体，用紫外分光光度计或蛋白分析仪测定得出抗体浓度；
步骤2.3）取100mL胶体金溶液，用1% K2CO3调节pH至7.5-10.0，按最适蛋白量缓慢加入A群牛轮状病毒单克隆抗体，在磁力搅拌器下反应10min，加入BSA溶液至最终浓度为1%，继续搅拌5min，得到A群牛轮状病毒单克隆抗体金标复合物，4℃过夜。
10.根据权利要求7所述的A群牛轮状病毒抗体胶体金试剂的制备方法，其特征是所述步骤3）具体的包括：
步骤3.1）将A群牛轮状病毒单克隆抗体金标复合物以3000rpm离心30min；
步骤3.2）去除聚合凝集杂质，再以12000rpm、 4℃离心30min，弃上清，用重悬液（1%BSA+0.01MPBS）复溶，重复洗涤3次；
步骤3.3）收集沉淀，用质量体积比20%蔗糖、质量体积比2% BSA、质量体积比10%甘油、质量体积比0.5%的Proclin300作为稳定剂的0.01M的PBS缓冲液重悬沉淀，调整浓度至为0.2，分装备用。
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