JP2003235581A - ヒトアデノウイルス５型ｅ１ａおよびｅ１ｂ遺伝子検出用オリゴヌクレオチド - Google Patents
ヒトアデノウイルス５型ｅ１ａおよびｅ１ｂ遺伝子検出用オリゴヌクレオチドInfo
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 遺伝子治療や基礎研究の分野で遺伝子導入に
有用である組み換えアデノウイルスの自律増殖性アデノ
ウイルス（ＲＣＡ）混入に関する品質管理に用いるＰＣ
Ｒ(polymerase chain reaction)法での検出用オリゴヌ
クレオチド化合物を提供すること。 【解決手段】特定の塩基配列またはそれらと実質的に同
一の塩基配列を有する、ヒトアデノウイルス５型のＥ１
ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子検出用オリゴヌクレオチド。
有用である組み換えアデノウイルスの自律増殖性アデノ
ウイルス（ＲＣＡ）混入に関する品質管理に用いるＰＣ
Ｒ(polymerase chain reaction)法での検出用オリゴヌ
クレオチド化合物を提供すること。 【解決手段】特定の塩基配列またはそれらと実質的に同
一の塩基配列を有する、ヒトアデノウイルス５型のＥ１
ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子検出用オリゴヌクレオチド。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトアデノウイル
ス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子と相同性を有し、ヒトア
デノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子を検出するの
に有用なオリゴヌクレオチドに関する。本発明のオリゴ
ヌクレオチドは、ウイルス感染診断薬および研究用試薬
として有用である。
ス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子と相同性を有し、ヒトア
デノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子を検出するの
に有用なオリゴヌクレオチドに関する。本発明のオリゴ
ヌクレオチドは、ウイルス感染診断薬および研究用試薬
として有用である。
【０００２】
【従来の技術】組み換えアデノウイルスはアデノウイル
スの自律増殖性を司るＥ１遺伝子領域を欠失した遺伝子
導入ベクターであり、遺伝子治療や基礎研究の分野で有
用である。この組み換えウイルスを調製する段階で宿主
細胞である２９３細胞のＥ１遺伝子と組み換えアデノウ
イルスとの間で相同組み換えがおこり、自律増殖性アデ
ノウイルス(replication-competent adenovirus ; ＲＣ
Ａ)が生じることが報告されている（Lochmuller, H.ら
「Human Gene Therapy」 5巻1485-1491頁 (1994)）。遺
伝子治療や基礎研究に用いられる組み換えアデノウイル
スに混入したＲＣＡを検出するために、従来ではＥ１遺
伝子を持たないＨｅＬａ細胞に組み換えウイルスを感染
させて、その細胞毒性を顕微鏡下で観察する方法やその
感染ＨｅＬａ細胞から抽出した全ＤＮＡをサザンブロッ
ト分析やＰＣＲ法で検出する方法などが行われてきた
（Lochmuller, H.ら「Human Gene Therapy」 5巻1485-1
491頁(1994)；佐藤友美ら 「別冊 実験医学 遺伝子
導入＆発現解析実験法」27-42頁 (1997)）。
スの自律増殖性を司るＥ１遺伝子領域を欠失した遺伝子
導入ベクターであり、遺伝子治療や基礎研究の分野で有
用である。この組み換えウイルスを調製する段階で宿主
細胞である２９３細胞のＥ１遺伝子と組み換えアデノウ
イルスとの間で相同組み換えがおこり、自律増殖性アデ
ノウイルス(replication-competent adenovirus ; ＲＣ
Ａ)が生じることが報告されている（Lochmuller, H.ら
「Human Gene Therapy」 5巻1485-1491頁 (1994)）。遺
伝子治療や基礎研究に用いられる組み換えアデノウイル
スに混入したＲＣＡを検出するために、従来ではＥ１遺
伝子を持たないＨｅＬａ細胞に組み換えウイルスを感染
させて、その細胞毒性を顕微鏡下で観察する方法やその
感染ＨｅＬａ細胞から抽出した全ＤＮＡをサザンブロッ
ト分析やＰＣＲ法で検出する方法などが行われてきた
（Lochmuller, H.ら「Human Gene Therapy」 5巻1485-1
491頁(1994)；佐藤友美ら 「別冊 実験医学 遺伝子
導入＆発現解析実験法」27-42頁 (1997)）。
【０００３】ＨｅＬａ細胞への細胞毒性を観察する方法
は検出感度が低く、サザンブロット分析は放射活性物質
を用いるので操作手順が繁雑になる。ＰＣＲによる検出
法は感度が高く比較的簡便な操作手順で行えるものであ
るが、検出用オリゴヌクレオチドプライマーの設計の仕
方によっては、それら同士が結合したり、ＨｅＬａ細胞
のゲノムＤＮＡに結合したりして正確な検出結果が得ら
れない場合が考えられる。
は検出感度が低く、サザンブロット分析は放射活性物質
を用いるので操作手順が繁雑になる。ＰＣＲによる検出
法は感度が高く比較的簡便な操作手順で行えるものであ
るが、検出用オリゴヌクレオチドプライマーの設計の仕
方によっては、それら同士が結合したり、ＨｅＬａ細胞
のゲノムＤＮＡに結合したりして正確な検出結果が得ら
れない場合が考えられる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】そこでこれらの問題を
解決するため、検出方法としてＰＣＲ法を用いる場合、
そのオリゴヌクレオチドプライマーは、自身の結合によ
る副生成物を生じず、ＨｅＬａ細胞のゲノムＤＮＡにも
結合せず、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺
伝子の該当部分に特異的に結合するように設計する必要
がある。ここで、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子とはＥ１遺伝
子を構成する遺伝子である。従って、本発明は、ＰＣＲ
法を用いて簡便にしかも感度の高いＲＣＡ検出を行うこ
とができるオリゴヌクレオチドを提供することを解決す
べき課題とした。
解決するため、検出方法としてＰＣＲ法を用いる場合、
そのオリゴヌクレオチドプライマーは、自身の結合によ
る副生成物を生じず、ＨｅＬａ細胞のゲノムＤＮＡにも
結合せず、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺
伝子の該当部分に特異的に結合するように設計する必要
がある。ここで、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子とはＥ１遺伝
子を構成する遺伝子である。従って、本発明は、ＰＣＲ
法を用いて簡便にしかも感度の高いＲＣＡ検出を行うこ
とができるオリゴヌクレオチドを提供することを解決す
べき課題とした。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意検討し、ヒトアデノウイルス５型
Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子を検出するのに適したオリゴヌ
クレオチドプライマーを検索し、該遺伝子の混入をＰＣ
Ｒ法を用いて効率的に検出できる塩基配列を設定し、こ
の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを作製し、それ
を用いた検出効果をin vitro実験系において確かめるこ
とに成功し、本発明を完成するに至った。
を解決するために鋭意検討し、ヒトアデノウイルス５型
Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子を検出するのに適したオリゴヌ
クレオチドプライマーを検索し、該遺伝子の混入をＰＣ
Ｒ法を用いて効率的に検出できる塩基配列を設定し、こ
の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを作製し、それ
を用いた検出効果をin vitro実験系において確かめるこ
とに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００６】即ち、本発明によれば、配列表の配列番号
１〜４の何れかに記載の塩基配列またはそれらと実質的
に同一の塩基配列を有する、ヒトアデノウイルス５型Ｅ
１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子検出用オリゴヌクレオチドが提供
される。
１〜４の何れかに記載の塩基配列またはそれらと実質的
に同一の塩基配列を有する、ヒトアデノウイルス５型Ｅ
１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子検出用オリゴヌクレオチドが提供
される。
【０００７】好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチド
は、下記の何れかに記載の塩基配列を有する。 （１）配列表の配列番号１〜４の何れかに記載の塩基配
列； （２）配列表の配列番号１〜４の何れかの塩基配列にお
いてＴをＵに置換した塩基配列； （３）上記（１）又は（２）に記載の塩基配列と少なく
とも７０％以上の相同性を有する塩基配列であって、ヒ
トアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子を特異的
に検出できる塩基配列；又は、 （４）配列表の配列番号１〜４の何れかの塩基配列にお
いて１〜数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された
塩基配列であって、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又は
Ｅ１Ｂ遺伝子を特異的に検出できる塩基配列；
は、下記の何れかに記載の塩基配列を有する。 （１）配列表の配列番号１〜４の何れかに記載の塩基配
列； （２）配列表の配列番号１〜４の何れかの塩基配列にお
いてＴをＵに置換した塩基配列； （３）上記（１）又は（２）に記載の塩基配列と少なく
とも７０％以上の相同性を有する塩基配列であって、ヒ
トアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子を特異的
に検出できる塩基配列；又は、 （４）配列表の配列番号１〜４の何れかの塩基配列にお
いて１〜数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された
塩基配列であって、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又は
Ｅ１Ｂ遺伝子を特異的に検出できる塩基配列；
【０００８】本発明の別の側面によれば、配列表の配列
番号１に記載の塩基配列またはそれと実質的に同一の塩
基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列表の配列
番号２に記載の塩基配列またはそれと実質的に同一の塩
基配列を有するオリゴヌクレオチドから成るヒトアデノ
ウイルス５型Ｅ１Ａ遺伝子検出用プライマーセットが提
供される。
番号１に記載の塩基配列またはそれと実質的に同一の塩
基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列表の配列
番号２に記載の塩基配列またはそれと実質的に同一の塩
基配列を有するオリゴヌクレオチドから成るヒトアデノ
ウイルス５型Ｅ１Ａ遺伝子検出用プライマーセットが提
供される。
【０００９】本発明のさらに別の側面によれば、配列表
の配列番号３に記載の塩基配列またはそれと実質的に同
一の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列表
の配列番号４に記載の塩基配列またはそれと実質的に同
一の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから成るヒト
アデノウイルス５型Ｅ１Ｂ遺伝子検出用プライマーセッ
トが提供される。
の配列番号３に記載の塩基配列またはそれと実質的に同
一の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列表
の配列番号４に記載の塩基配列またはそれと実質的に同
一の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから成るヒト
アデノウイルス５型Ｅ１Ｂ遺伝子検出用プライマーセッ
トが提供される。
【００１０】好ましくは、実質的に同一の塩基配列と
は、下記の何れかに記載の塩基配列である。 （１）当該塩基配列においてＴをＵに置換した塩基配
列； （２）当該塩基配列と少なくとも７０％以上の相同性を
有する塩基配列であって、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１
Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子を特異的に検出できる塩基配列；又
は、 （３）当該塩基配列において１〜数個の塩基が欠失、置
換及び／又は付加された塩基配列であって、ヒトアデノ
ウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子を特異的に検出で
きる塩基配列；
は、下記の何れかに記載の塩基配列である。 （１）当該塩基配列においてＴをＵに置換した塩基配
列； （２）当該塩基配列と少なくとも７０％以上の相同性を
有する塩基配列であって、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１
Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子を特異的に検出できる塩基配列；又
は、 （３）当該塩基配列において１〜数個の塩基が欠失、置
換及び／又は付加された塩基配列であって、ヒトアデノ
ウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子を特異的に検出で
きる塩基配列；
【００１１】本発明のさらに別の側面によれば、本発明
のオリゴヌクレオチドあるいはプライマーセットを用い
て試料中のヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺
伝子を検出することを含む、ヒトアデノウイルス５型Ｅ
１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子の検出方法が提供される。本発明
のさらに別の側面によれば、試料中の核酸を鋳型とし
て、本発明のプライマーセットを用いてＰＣＲを行うこ
とにより、試料中のヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又は
Ｅ１Ｂ遺伝子を検出することを含む、ヒトアデノウイル
ス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子の検出方法が提供され
る。
のオリゴヌクレオチドあるいはプライマーセットを用い
て試料中のヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺
伝子を検出することを含む、ヒトアデノウイルス５型Ｅ
１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子の検出方法が提供される。本発明
のさらに別の側面によれば、試料中の核酸を鋳型とし
て、本発明のプライマーセットを用いてＰＣＲを行うこ
とにより、試料中のヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又は
Ｅ１Ｂ遺伝子を検出することを含む、ヒトアデノウイル
ス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子の検出方法が提供され
る。
【００１２】本発明のさらに別の側面によれば、本発明
のオリゴヌクレオチドあるいはプライマーセットを含
む、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子検
出用試薬が提供される。本発明のさらに別の側面によれ
ば、本発明のオリゴヌクレオチドあるいはプライマーセ
ットを含む、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ
遺伝子検出用キットが提供される。
のオリゴヌクレオチドあるいはプライマーセットを含
む、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子検
出用試薬が提供される。本発明のさらに別の側面によれ
ば、本発明のオリゴヌクレオチドあるいはプライマーセ
ットを含む、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ
遺伝子検出用キットが提供される。
【００１３】
【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態につい
て詳細に説明する。 （Ｉ）本発明のオリゴヌクレオチドの設計 本発明のオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号１〜
４の何れかに記載の塩基配列またはそれらと実質的に同
一の塩基配列を有するものであり、ヒトアデノウイルス
５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子検出のために使用すること
ができる。ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺
伝子とは、ヒトアデノウイルス５型のＥ１Ａ又はＥ１Ｂ
タンパク質のアミノ酸配列を規定している構造遺伝子を
意味する。本発明のオリゴヌクレオチド化合物は、高力
価の組み換えウイルス液中に混入したＲＣＡをＰＣＲ法
で高感度に検出するものである。
て詳細に説明する。 （Ｉ）本発明のオリゴヌクレオチドの設計 本発明のオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号１〜
４の何れかに記載の塩基配列またはそれらと実質的に同
一の塩基配列を有するものであり、ヒトアデノウイルス
５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子検出のために使用すること
ができる。ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺
伝子とは、ヒトアデノウイルス５型のＥ１Ａ又はＥ１Ｂ
タンパク質のアミノ酸配列を規定している構造遺伝子を
意味する。本発明のオリゴヌクレオチド化合物は、高力
価の組み換えウイルス液中に混入したＲＣＡをＰＣＲ法
で高感度に検出するものである。
【００１４】本発明のオリゴヌクレオチドは以下のよう
にしてＰＣＲ法の考えに基づいて設計し、それをもとに
調製し、その効果を検出されるアデノウイルスのＥ１Ａ
とＥ１Ｂ遺伝子の検出限界をもとに評価して得られたも
のである。すなわち、まず、ヒトアデノウイルス５型の
Ｅ１ＡとＥ１Ｂの遺伝子の塩基配列情報を入手する。次
に該遺伝子の部分塩基配列に対して相補的な核酸化合物
のうち、オリゴヌクレオチドとして効果が期待される核
酸化合物を選択し、選択されたオリゴヌクレオチドを合
成した。このようにして得られた該オリゴヌクレオチド
が高力価の組み換えウイルス液中に混入したＲＣＡをＰ
ＣＲ法で高感度に検出するかどうかを、in vitro実験系
を用いて試験した。そして、高力価の組み換えウイルス
液中に混入したＲＣＡをＰＣＲ法でＥ１ＡまたはＥ１Ｂ
遺伝子をそれぞれ単独、さらにＥ１ＡとＥ１Ｂ遺伝子を
同時に高感度に検出するような塩基配列を含むオリゴヌ
クレオチドを取得し、これらを本発明のオリゴヌクレオ
チドとしたものである。
にしてＰＣＲ法の考えに基づいて設計し、それをもとに
調製し、その効果を検出されるアデノウイルスのＥ１Ａ
とＥ１Ｂ遺伝子の検出限界をもとに評価して得られたも
のである。すなわち、まず、ヒトアデノウイルス５型の
Ｅ１ＡとＥ１Ｂの遺伝子の塩基配列情報を入手する。次
に該遺伝子の部分塩基配列に対して相補的な核酸化合物
のうち、オリゴヌクレオチドとして効果が期待される核
酸化合物を選択し、選択されたオリゴヌクレオチドを合
成した。このようにして得られた該オリゴヌクレオチド
が高力価の組み換えウイルス液中に混入したＲＣＡをＰ
ＣＲ法で高感度に検出するかどうかを、in vitro実験系
を用いて試験した。そして、高力価の組み換えウイルス
液中に混入したＲＣＡをＰＣＲ法でＥ１ＡまたはＥ１Ｂ
遺伝子をそれぞれ単独、さらにＥ１ＡとＥ１Ｂ遺伝子を
同時に高感度に検出するような塩基配列を含むオリゴヌ
クレオチドを取得し、これらを本発明のオリゴヌクレオ
チドとしたものである。
【００１５】本発明のオリゴヌクレオチドを設計するた
めには、先ず、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１ＡまたはＥ
１Ｂ遺伝子の塩基配列を入手する。これは論文に記載さ
れている情報として、GenBankなどの遺伝子データベー
スに蓄積されている情報として、さらには、直接的に塩
基配列を解析した結果として入手することができる。次
に該遺伝子の部分塩基配列に対して相補的な核酸化合物
のうち、オリゴヌクレオチド化合物として効果が期待さ
れる核酸化合物を選択する。この方法としては、オリゴ
ヌクレオチドの長さ、ＧＣ含量、Ｔｍ値、オリゴヌクレ
オチド間の相補性、オリゴヌクレオチド内の二次構造な
どを考慮する方法（井上順子ら、別冊「実験医学PCR法
の最新技術」18-24頁(1995)；向井博之ら、「蛋白質核
酸酵素 PCR法最前線」41巻 437-452頁 (1996)）など
がある。
めには、先ず、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１ＡまたはＥ
１Ｂ遺伝子の塩基配列を入手する。これは論文に記載さ
れている情報として、GenBankなどの遺伝子データベー
スに蓄積されている情報として、さらには、直接的に塩
基配列を解析した結果として入手することができる。次
に該遺伝子の部分塩基配列に対して相補的な核酸化合物
のうち、オリゴヌクレオチド化合物として効果が期待さ
れる核酸化合物を選択する。この方法としては、オリゴ
ヌクレオチドの長さ、ＧＣ含量、Ｔｍ値、オリゴヌクレ
オチド間の相補性、オリゴヌクレオチド内の二次構造な
どを考慮する方法（井上順子ら、別冊「実験医学PCR法
の最新技術」18-24頁(1995)；向井博之ら、「蛋白質核
酸酵素 PCR法最前線」41巻 437-452頁 (1996)）など
がある。
【００１６】ところで、特定の塩基配列の有無をＰＣＲ
法により検出するにあたっては、その塩基配列のいかな
る部分に対応するプライマーセットを選択するかが重要
である。プライマーセットの結合位置によってＰＣＲ法
による増幅効率が変化することが知られているからであ
る。そして、この予測は一般に困難である。
法により検出するにあたっては、その塩基配列のいかな
る部分に対応するプライマーセットを選択するかが重要
である。プライマーセットの結合位置によってＰＣＲ法
による増幅効率が変化することが知られているからであ
る。そして、この予測は一般に困難である。
【００１７】そこで、本発明者らは次のような観点から
ヒトアデノウイルス５型Ｅ１ＡまたはＥ１Ｂ遺伝子をコ
ードする領域の一部を増幅し得るプライマーセットを選
択した。 （１）プライマー末端がグアニンもしくはシトシンであ
る２６塩基以上５０塩基以下、特に好ましくは３０塩基
以上４０塩基以下からなるプライマーセット； （２）プライマー中のグアニン、シトシン含量が３０％
〜７０％程度でプライマーの全範囲を通じてその偏りが
ないプライマーセット； （３）そのプライマーセットを用いたＰＣＲ法による増
幅産物が１００ｂｐ以上であるようなプライマーセッ
ト； （４）ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子
の増幅産物を電気泳動した場合にそれらの泳動距離の差
が明確になる程度に、増幅産物の大きさが異なるプライ
マーセット：及び （５）プライマーの５’側はヒトアデノウイルス５型Ｅ
１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子配列と７０％以下の相同性しか有
さなくてもよいが、３’側は完全に相同の配列を有する
ように設定されたプライマーセット：
ヒトアデノウイルス５型Ｅ１ＡまたはＥ１Ｂ遺伝子をコ
ードする領域の一部を増幅し得るプライマーセットを選
択した。 （１）プライマー末端がグアニンもしくはシトシンであ
る２６塩基以上５０塩基以下、特に好ましくは３０塩基
以上４０塩基以下からなるプライマーセット； （２）プライマー中のグアニン、シトシン含量が３０％
〜７０％程度でプライマーの全範囲を通じてその偏りが
ないプライマーセット； （３）そのプライマーセットを用いたＰＣＲ法による増
幅産物が１００ｂｐ以上であるようなプライマーセッ
ト； （４）ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子
の増幅産物を電気泳動した場合にそれらの泳動距離の差
が明確になる程度に、増幅産物の大きさが異なるプライ
マーセット：及び （５）プライマーの５’側はヒトアデノウイルス５型Ｅ
１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子配列と７０％以下の相同性しか有
さなくてもよいが、３’側は完全に相同の配列を有する
ように設定されたプライマーセット：
【００１８】（II）本発明のオリゴヌクレオチドの具体
例 本発明のオリゴヌクレオチドの具体例としては、以下の
オリゴヌクレオチドが挙げられる。本発明の第１のオリ
ゴヌクレオチドは、野生型ヒトアデノウイルス５型のＥ
１Ａ遺伝子検出用のフォワード側プライマーであり、配
列番号１に記載の塩基配列を有する。本発明の第２のオ
リゴヌクレオチドは、野生型ヒトアデノウイルス５型の
Ｅ１Ａ遺伝子検出用のリバース側プライマーであり、配
列番号２に記載の塩基配列を有する。上記した第１及び
第２のオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして使
用してＰＣＲを行うことにより、上記２種のプライマー
で挟まれる領域を増幅することができ、これにより野生
型ヒトアデノウイルス５型のＥ１Ａ遺伝子を検出するこ
とができる。この場合の増幅産物の大きさは９１９ｂｐ
である。
例 本発明のオリゴヌクレオチドの具体例としては、以下の
オリゴヌクレオチドが挙げられる。本発明の第１のオリ
ゴヌクレオチドは、野生型ヒトアデノウイルス５型のＥ
１Ａ遺伝子検出用のフォワード側プライマーであり、配
列番号１に記載の塩基配列を有する。本発明の第２のオ
リゴヌクレオチドは、野生型ヒトアデノウイルス５型の
Ｅ１Ａ遺伝子検出用のリバース側プライマーであり、配
列番号２に記載の塩基配列を有する。上記した第１及び
第２のオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして使
用してＰＣＲを行うことにより、上記２種のプライマー
で挟まれる領域を増幅することができ、これにより野生
型ヒトアデノウイルス５型のＥ１Ａ遺伝子を検出するこ
とができる。この場合の増幅産物の大きさは９１９ｂｐ
である。
【００１９】本発明の第３のオリゴヌクレオチドは、野
生型ヒトアデノウイルス５型のＥ１Ｂ遺伝子検出用のフ
ォワード側プライマーであり、配列番号３に記載の塩基
配列を有する。本発明の第４のオリゴヌクレオチドは、
野生型ヒトアデノウイルス５型のＥ１Ｂ遺伝子検出用の
リバース側プライマーであり、配列番号４に記載の塩基
配列を有する。上記した第３及び第４のオリゴヌクレオ
チドをプライマーセットとして使用してＰＣＲを行うこ
とにより、上記２種のプライマーで挟まれる領域を増幅
することができ、これにより野生型ヒトアデノウイルス
５型のＥ１Ｂ遺伝子を検出することができる。この場合
の増幅産物の大きさは４９３ｂｐ程度である。
生型ヒトアデノウイルス５型のＥ１Ｂ遺伝子検出用のフ
ォワード側プライマーであり、配列番号３に記載の塩基
配列を有する。本発明の第４のオリゴヌクレオチドは、
野生型ヒトアデノウイルス５型のＥ１Ｂ遺伝子検出用の
リバース側プライマーであり、配列番号４に記載の塩基
配列を有する。上記した第３及び第４のオリゴヌクレオ
チドをプライマーセットとして使用してＰＣＲを行うこ
とにより、上記２種のプライマーで挟まれる領域を増幅
することができ、これにより野生型ヒトアデノウイルス
５型のＥ１Ｂ遺伝子を検出することができる。この場合
の増幅産物の大きさは４９３ｂｐ程度である。
【００２０】本発明では、配列表の配列番号１〜４の何
れかに記載の塩基配列だけでなく、それらと実質的に同
一の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを使用するこ
とができる。配列番号１〜４の何れかに記載の塩基配列
またはそれらと実質的に同一の塩基配列は、アデノウイ
ルスのＥ１ＡまたはＥ１Ｂ遺伝子の塩基配列に対して相
補的な、もしくは実質的に相補的な塩基配列であり、か
つＰＣＲ法においてアデノウイルスのＥ１ＡまたはＥ１
Ｂ遺伝子を検出するのに適したオリゴヌクレオチド化合
物の塩基配列である。
れかに記載の塩基配列だけでなく、それらと実質的に同
一の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを使用するこ
とができる。配列番号１〜４の何れかに記載の塩基配列
またはそれらと実質的に同一の塩基配列は、アデノウイ
ルスのＥ１ＡまたはＥ１Ｂ遺伝子の塩基配列に対して相
補的な、もしくは実質的に相補的な塩基配列であり、か
つＰＣＲ法においてアデノウイルスのＥ１ＡまたはＥ１
Ｂ遺伝子を検出するのに適したオリゴヌクレオチド化合
物の塩基配列である。
【００２１】配列番号１〜４で表される塩基配列または
それらと実質的に同一の塩基配列としては、具体的に
は、以下の塩基配列の全てを包含する。 （１）配列表の配列番号１〜４の何れかに記載の塩基配
列； （２）配列表の配列番号１〜４の何れかの塩基配列にお
いてＴをＵに置換した塩基配列； （３）上記（１）又は（２）に記載の塩基配列と少なく
とも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましく
は９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有
する塩基配列であって、ヒトアデノウイルス５型のＥ１
Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子を特異的に検出できる塩基配列；又
は、 （４）配列表の配列番号１〜４の何れかの塩基配列にお
いて１〜数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された
塩基配列であって、ヒトアデノウイルス５型のＥ１Ａ又
はＥ１Ｂ遺伝子を特異的に検出できる塩基配列；
それらと実質的に同一の塩基配列としては、具体的に
は、以下の塩基配列の全てを包含する。 （１）配列表の配列番号１〜４の何れかに記載の塩基配
列； （２）配列表の配列番号１〜４の何れかの塩基配列にお
いてＴをＵに置換した塩基配列； （３）上記（１）又は（２）に記載の塩基配列と少なく
とも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましく
は９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有
する塩基配列であって、ヒトアデノウイルス５型のＥ１
Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子を特異的に検出できる塩基配列；又
は、 （４）配列表の配列番号１〜４の何れかの塩基配列にお
いて１〜数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された
塩基配列であって、ヒトアデノウイルス５型のＥ１Ａ又
はＥ１Ｂ遺伝子を特異的に検出できる塩基配列；
【００２２】本発明のオリゴヌクレオチドの塩基配列の
長さは特に限定されるものではないが、好ましくは２６
塩基以上５０塩基以下、特に好ましくは３０塩基以上４
０塩基以下である。
長さは特に限定されるものではないが、好ましくは２６
塩基以上５０塩基以下、特に好ましくは３０塩基以上４
０塩基以下である。
【００２３】本発明のオリゴヌクレオチドは、デオキシ
リボ核酸（ＤＮＡ）でもリボ核酸（ＲＮＡ）でもよい。
リボ核酸の場合はチミジン残基（Ｔ）をウリジン残基
（Ｕ）と読み替えればよい。また合成の際に、任意の位
置のＴをＵに変えて合成を行い、ウリジン残基を含むＤ
ＮＡであってもよい。同様に任意のＵをＴに変えたチミ
ジン残基を含むＲＮＡであってもよい。また、オリゴヌ
クレオチド中に修飾ヌクレオチドがあってもよい。本発
明のオリゴヌクレオチドは、ホスホアミダイト法等で合
成することができる。合成にあっては、ＤＮＡ／ＲＮＡ
合成機を利用すれば便利である。
リボ核酸（ＤＮＡ）でもリボ核酸（ＲＮＡ）でもよい。
リボ核酸の場合はチミジン残基（Ｔ）をウリジン残基
（Ｕ）と読み替えればよい。また合成の際に、任意の位
置のＴをＵに変えて合成を行い、ウリジン残基を含むＤ
ＮＡであってもよい。同様に任意のＵをＴに変えたチミ
ジン残基を含むＲＮＡであってもよい。また、オリゴヌ
クレオチド中に修飾ヌクレオチドがあってもよい。本発
明のオリゴヌクレオチドは、ホスホアミダイト法等で合
成することができる。合成にあっては、ＤＮＡ／ＲＮＡ
合成機を利用すれば便利である。
【００２４】（III）オリゴヌクレオチドの評価
本発明のオリゴヌクレオチドの評価実験はin vitro実験
系を用いて行うことができる。すなわち、組み換えアデ
ノウイルスに混入するＲＣＡをＰＣＲ法で検出するのに
有効と予想される塩基配列を持つオリゴヌクレオチド化
合物の適性をinvitro実験系において調べることができ
る。すなわち、in vitro実験系では密度勾配超遠心法で
精製されＲＣＡの検出されない野生型ヒトアデノウイル
ス５型ＤＮＡ、もしくは野生型ヒトアデノウイルス５型
ＤＮＡと組み換えアデノウイルスＤＮＡをあらかじめ試
験管内で任意の比率で混合したものを該オリゴヌクレオ
チドを用いてＰＣＲを行い、得られた反応産物をアガロ
ースゲル電気泳動により調べることが可能である。
系を用いて行うことができる。すなわち、組み換えアデ
ノウイルスに混入するＲＣＡをＰＣＲ法で検出するのに
有効と予想される塩基配列を持つオリゴヌクレオチド化
合物の適性をinvitro実験系において調べることができ
る。すなわち、in vitro実験系では密度勾配超遠心法で
精製されＲＣＡの検出されない野生型ヒトアデノウイル
ス５型ＤＮＡ、もしくは野生型ヒトアデノウイルス５型
ＤＮＡと組み換えアデノウイルスＤＮＡをあらかじめ試
験管内で任意の比率で混合したものを該オリゴヌクレオ
チドを用いてＰＣＲを行い、得られた反応産物をアガロ
ースゲル電気泳動により調べることが可能である。
【００２５】本発明では、驚くべきことに、配列番号１
〜４に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプ
ライマーとして用いたＰＣＲ法にて増幅された増幅産物
は、１％アガロースゲル電気泳動後にエチジウムブロマ
イド染色で解析することが可能なほど大量に得られてい
ることが明らかになった。
〜４に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプ
ライマーとして用いたＰＣＲ法にて増幅された増幅産物
は、１％アガロースゲル電気泳動後にエチジウムブロマ
イド染色で解析することが可能なほど大量に得られてい
ることが明らかになった。
【００２６】本発明では、前述した通りプライマーの長
さ、末端の塩基、グアニン及びシトシンの分布、増幅産
物の大きさ等に関する選定基準に基づき好適なオリゴヌ
クレオチドを設計し、これを用いることによって上記し
た顕著な結果が達成されたのである。これは、増幅され
る領域の塩基配列特有の性質によるものである。なお、
本発明においては、エチジウムブロマイドやサイバーグ
リーン染色によらずに、ラジオアイソトープや蛍光プロ
ーブを使ったドットブロット法等でも解析は可能である
が、この場合についても増幅産物の量が多いことは解析
の容易性の観点から見て有利である。このような解析を
行う場合、本発明のオリゴヌクレオチドは標識して使用
することもできる。
さ、末端の塩基、グアニン及びシトシンの分布、増幅産
物の大きさ等に関する選定基準に基づき好適なオリゴヌ
クレオチドを設計し、これを用いることによって上記し
た顕著な結果が達成されたのである。これは、増幅され
る領域の塩基配列特有の性質によるものである。なお、
本発明においては、エチジウムブロマイドやサイバーグ
リーン染色によらずに、ラジオアイソトープや蛍光プロ
ーブを使ったドットブロット法等でも解析は可能である
が、この場合についても増幅産物の量が多いことは解析
の容易性の観点から見て有利である。このような解析を
行う場合、本発明のオリゴヌクレオチドは標識して使用
することもできる。
【００２７】（IV）標識オリゴヌクレオチド
上記（III）で述べたように、本発明のオリゴヌクレオ
チドは標識して使用することもできる。このような標識
されたオリゴヌクレオチドは全て本発明の範囲内に属す
る。
チドは標識して使用することもできる。このような標識
されたオリゴヌクレオチドは全て本発明の範囲内に属す
る。
【００２８】本発明の標識オリゴヌクレオチドは、配列
表の配列番号１〜４の何れかに記載の塩基配列またはそ
れらと実質的に同一の塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドに標識を結合したものである。標識物としては放射
性物質や酵素、蛍光物質、発光物質、抗原、ハプテン、
酵素基質、不溶性担体、ビオチン・アビジン系標識など
の公知の標識を用いることができる。標識の仕方は末端
標識でも、配列の途中に標識してもよい。また、糖、リ
ン酸基、塩基部分への標識であってもよい。
表の配列番号１〜４の何れかに記載の塩基配列またはそ
れらと実質的に同一の塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドに標識を結合したものである。標識物としては放射
性物質や酵素、蛍光物質、発光物質、抗原、ハプテン、
酵素基質、不溶性担体、ビオチン・アビジン系標識など
の公知の標識を用いることができる。標識の仕方は末端
標識でも、配列の途中に標識してもよい。また、糖、リ
ン酸基、塩基部分への標識であってもよい。
【００２９】（Ｖ）検出方法
本発明のオリゴヌクレオチドを用いてヒトアデノウイル
ス５型Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子を検出する場合、
（１）本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして検
出する方法、（２）本発明のオリゴヌクレオチドをプラ
イマーとしてＤＮＡポリメラーゼ等により伸長反応を行
うことにより検出する方法がある。上記（２）の中の好
ましい態様によれば、本発明のオリゴヌクレオチドをプ
ライマーとして使用してＰＣＲを行うことにより、目的
遺伝子を検出することができる。
ス５型Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子を検出する場合、
（１）本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして検
出する方法、（２）本発明のオリゴヌクレオチドをプラ
イマーとしてＤＮＡポリメラーゼ等により伸長反応を行
うことにより検出する方法がある。上記（２）の中の好
ましい態様によれば、本発明のオリゴヌクレオチドをプ
ライマーとして使用してＰＣＲを行うことにより、目的
遺伝子を検出することができる。
【００３０】上記（１）の場合、本発明のオリゴヌクレ
オチドを標識化した標識核酸プローブを試料と混合し、
該プローブとヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ
遺伝子とをハイブリダイズさせ、ハイブリッド体の標識
を適当な検出法で検出することにより、ヒトアデノウイ
ルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子を検出することができ
る。一方、上記（２）の場合、本発明のオリゴヌクレオ
チドをそのまま核酸プライマーとするか、または該オリ
ゴヌクレオチドを標識化した標識核酸プライマーを試料
と混合し、ＤＮＡポリメラーゼ等によりプライマーを伸
長させ（好ましくは、ＰＣＲにより標的配列を増幅させ
る）、得られたプライマー伸長物（ＰＣＲの場合には、
増幅産物）を直接測定するか、標識プローブを用いて測
定する。
オチドを標識化した標識核酸プローブを試料と混合し、
該プローブとヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ
遺伝子とをハイブリダイズさせ、ハイブリッド体の標識
を適当な検出法で検出することにより、ヒトアデノウイ
ルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子を検出することができ
る。一方、上記（２）の場合、本発明のオリゴヌクレオ
チドをそのまま核酸プライマーとするか、または該オリ
ゴヌクレオチドを標識化した標識核酸プライマーを試料
と混合し、ＤＮＡポリメラーゼ等によりプライマーを伸
長させ（好ましくは、ＰＣＲにより標的配列を増幅させ
る）、得られたプライマー伸長物（ＰＣＲの場合には、
増幅産物）を直接測定するか、標識プローブを用いて測
定する。
【００３１】本発明の好ましい態様によれば、本発明の
オリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行うこ
とにより、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺
伝子を特異的に増幅することができる。増幅反応に際し
ては反応時に放射性物質などの標識の結合したヌクレオ
チドを取り込ませる方法や、増幅産物を電気泳動により
分画して特異なバンドを検出することにより、ヒトアデ
ノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子を容易に検出す
ることができる。特に、本発明のオリゴヌクレオチドを
用いた場合、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ遺伝子の増
幅産物と、Ｅ１Ｂ遺伝子の増幅産物とのサイズの相違に
より、電気泳動後に泳動距離の差異に基づいて、これら
２種の増幅産物を容易に判別することが可能である。ま
た、前述の標識オリゴヌクレオチドをプライマーとして
用いれば増幅産物を直接検出することも可能である。
オリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行うこ
とにより、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺
伝子を特異的に増幅することができる。増幅反応に際し
ては反応時に放射性物質などの標識の結合したヌクレオ
チドを取り込ませる方法や、増幅産物を電気泳動により
分画して特異なバンドを検出することにより、ヒトアデ
ノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子を容易に検出す
ることができる。特に、本発明のオリゴヌクレオチドを
用いた場合、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ遺伝子の増
幅産物と、Ｅ１Ｂ遺伝子の増幅産物とのサイズの相違に
より、電気泳動後に泳動距離の差異に基づいて、これら
２種の増幅産物を容易に判別することが可能である。ま
た、前述の標識オリゴヌクレオチドをプライマーとして
用いれば増幅産物を直接検出することも可能である。
【００３２】以下、本発明のオリゴヌクレオチドをプラ
イマーとして用いたＰＣＲによるヒトアデノウイルス５
型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子の検出方法について詳細に説
明する。目的のヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１
Ｂ遺伝子の存在の有無を検知しようとする試料として
は、遺伝子治療や基礎研究の分野で使用するための組み
換えアデノウイルス調製物が挙げられる。この組み換え
ウイルスを調製する段階で宿主細胞である２９３細胞の
Ｅ１遺伝子と組み換えアデノウイルスとの間で相同組み
換えがおこり、自律増殖性アデノウイルス（ＲＣＡ）が
生じる場合があることから、本発明の検出方法によって
組み換えアデノウイルスの品質管理を行うことができ
る。あるいはまた、ヒトアデノウイルスを感染させた動
物細胞、感染動物より得られる臓器、血液等、患者より
得られる血液、唾液、尿等の生体試料を使用することも
できる。この中でも血液を使用すれば感染動物、患者の
連続診断を簡便に行うことができる。血液成分中のヒト
アデノウイルスの検出には、核酸成分を抽出することが
好ましい。血液成分等からの核酸成分の調製法は当業者
に公知である。
イマーとして用いたＰＣＲによるヒトアデノウイルス５
型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子の検出方法について詳細に説
明する。目的のヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１
Ｂ遺伝子の存在の有無を検知しようとする試料として
は、遺伝子治療や基礎研究の分野で使用するための組み
換えアデノウイルス調製物が挙げられる。この組み換え
ウイルスを調製する段階で宿主細胞である２９３細胞の
Ｅ１遺伝子と組み換えアデノウイルスとの間で相同組み
換えがおこり、自律増殖性アデノウイルス（ＲＣＡ）が
生じる場合があることから、本発明の検出方法によって
組み換えアデノウイルスの品質管理を行うことができ
る。あるいはまた、ヒトアデノウイルスを感染させた動
物細胞、感染動物より得られる臓器、血液等、患者より
得られる血液、唾液、尿等の生体試料を使用することも
できる。この中でも血液を使用すれば感染動物、患者の
連続診断を簡便に行うことができる。血液成分中のヒト
アデノウイルスの検出には、核酸成分を抽出することが
好ましい。血液成分等からの核酸成分の調製法は当業者
に公知である。
【００３３】例えば、溶解緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ、
１０ｍＭＴｒｉｓ―ＨＣｌ、３ｍＭＭｇＣｌ2 、０．４
５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．４５％ＮＰ４０、１ｍｇ／ｍ
ｌＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ）に細胞を懸濁し、６５℃
で１晩インキュベートし、その後、９８℃で１０分間イ
ンキュベートすることによりＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫの
失活およびＤＮＡの変性を行う。その溶液をフェノール
処理３回、クロロホルム処理２回を行った後、エタノー
ル沈殿法によりＤＮＡを回収することができる。このよ
うにして得られるヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ
１Ｂ遺伝子のＤＮＡを含む試料、及び本発明のプライマ
ーセットを用いてＰＣＲ法を行うことができる。
１０ｍＭＴｒｉｓ―ＨＣｌ、３ｍＭＭｇＣｌ2 、０．４
５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．４５％ＮＰ４０、１ｍｇ／ｍ
ｌＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ）に細胞を懸濁し、６５℃
で１晩インキュベートし、その後、９８℃で１０分間イ
ンキュベートすることによりＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫの
失活およびＤＮＡの変性を行う。その溶液をフェノール
処理３回、クロロホルム処理２回を行った後、エタノー
ル沈殿法によりＤＮＡを回収することができる。このよ
うにして得られるヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ
１Ｂ遺伝子のＤＮＡを含む試料、及び本発明のプライマ
ーセットを用いてＰＣＲ法を行うことができる。
【００３４】上記した試料に本発明のオリゴヌクレオチ
ドから成るプライマーセットを加えることによって、試
料中の目的とするヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ
１Ｂ遺伝子が存在すれば、該プライマーで挟まれた領域
を増幅することができる。ＰＣＲの条件は適宜設定する
ことができ、例えば、TOYOBO KOD Dash DNAポリメラー
ゼを用いれば、９４℃で３０秒（変性）、６２℃で２秒
（アニーリング）、７４℃で３０秒（伸長）を１サイク
ルとし、全部で３０サイクルとすることも可能である。
但し、ここに示した条件は一例に過ぎず、用いる酵素、
反応温度、反応時間、サイクル数などは適宜変更するこ
とも可能である。
ドから成るプライマーセットを加えることによって、試
料中の目的とするヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ
１Ｂ遺伝子が存在すれば、該プライマーで挟まれた領域
を増幅することができる。ＰＣＲの条件は適宜設定する
ことができ、例えば、TOYOBO KOD Dash DNAポリメラー
ゼを用いれば、９４℃で３０秒（変性）、６２℃で２秒
（アニーリング）、７４℃で３０秒（伸長）を１サイク
ルとし、全部で３０サイクルとすることも可能である。
但し、ここに示した条件は一例に過ぎず、用いる酵素、
反応温度、反応時間、サイクル数などは適宜変更するこ
とも可能である。
【００３５】ＰＣＲにより生成した目的遺伝子は電気泳
動法、あるいは標識プローブを用いるドットブロットハ
イブリダイゼーション等により検出することができる。
プローブとしては増幅領域内でプローブＤＮＡを設計、
作製することができる。
動法、あるいは標識プローブを用いるドットブロットハ
イブリダイゼーション等により検出することができる。
プローブとしては増幅領域内でプローブＤＮＡを設計、
作製することができる。
【００３６】（VI）キット
本発明のオリゴヌクレオチド又はそれを用いたプライマ
ーセットはキットとして供給することにより、ヒトアデ
ノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子の検出を簡便に
行うことができる。本発明のヒトアデノウイルス５型Ｅ
１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子検出用キットは、本発明のオリゴ
ヌクレオチド又はその標識オリゴヌクレオチドを含むも
のである。また、本発明のキット中には、ＰＣＲ用試
薬、電気泳動試薬、ＤＮＡ抽出用試薬などを含めておく
ことにより、試料中のヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又
はＥ１Ｂ遺伝子の検出をより迅速・簡便・高感度に行う
ことができる。なおキット中の試薬は溶液でも凍結乾燥
物でも良い。
ーセットはキットとして供給することにより、ヒトアデ
ノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子の検出を簡便に
行うことができる。本発明のヒトアデノウイルス５型Ｅ
１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子検出用キットは、本発明のオリゴ
ヌクレオチド又はその標識オリゴヌクレオチドを含むも
のである。また、本発明のキット中には、ＰＣＲ用試
薬、電気泳動試薬、ＤＮＡ抽出用試薬などを含めておく
ことにより、試料中のヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又
はＥ１Ｂ遺伝子の検出をより迅速・簡便・高感度に行う
ことができる。なおキット中の試薬は溶液でも凍結乾燥
物でも良い。
【００３７】ＰＣＲ用試薬としては、例えば、Tris-HC
l、KCl、MgCl2、各種ｄＮＴＰ、TaqDNAポリメラーゼ、
水等が挙げられる。電気泳動用試薬としては、例えば、
アガロース又はポリアクリルアミドゲル、ローディング
緩衝液、エチジウムブロマイド染色用試薬等が挙げられ
る。ＤＮＡ抽出用試薬としては、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ
Ｋなどが挙げられる。以下の実施例により本発明をさ
らに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定
されることはない。
l、KCl、MgCl2、各種ｄＮＴＰ、TaqDNAポリメラーゼ、
水等が挙げられる。電気泳動用試薬としては、例えば、
アガロース又はポリアクリルアミドゲル、ローディング
緩衝液、エチジウムブロマイド染色用試薬等が挙げられ
る。ＤＮＡ抽出用試薬としては、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ
Ｋなどが挙げられる。以下の実施例により本発明をさ
らに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定
されることはない。
【００３８】
（１）オリゴヌクレオチド化合物の選択
まず、野生型ヒトアデノウイルス５型の遺伝子の塩基配
列を公開の遺伝子データベースであるGenBankから入手
した。次にＥ１ＡおよびＥ１Ｂの遺伝子の領域を特定
し、それらの領域を特異的に検出し得る領域に対しての
相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド化合物
を、先に提案した方法を用いて選択した（井上順子ら、
別冊「実験医学PCR法の最新技術」18-24頁(1995)；向井
博之ら、「蛋白質核酸酵素 PCR法最前線」41巻 437-45
2頁 (1996)）。すなわち、野生型ヒトアデノウイルス
５型のＥ１Ａ遺伝子に対しては配列番号５で表される塩
基配列について検索した結果、次の２種の核酸化合物が
オリゴヌクレオチド化合物候補として選出された。 E1AF2：CTGATCGAAGAGGTACTGGCTGATAATCTTCCACC （配列番号１） E1AR2：TTATGGCCTGGGGCGTTTACAGCTCAAGTCCAAAG （配列番号２）
列を公開の遺伝子データベースであるGenBankから入手
した。次にＥ１ＡおよびＥ１Ｂの遺伝子の領域を特定
し、それらの領域を特異的に検出し得る領域に対しての
相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド化合物
を、先に提案した方法を用いて選択した（井上順子ら、
別冊「実験医学PCR法の最新技術」18-24頁(1995)；向井
博之ら、「蛋白質核酸酵素 PCR法最前線」41巻 437-45
2頁 (1996)）。すなわち、野生型ヒトアデノウイルス
５型のＥ１Ａ遺伝子に対しては配列番号５で表される塩
基配列について検索した結果、次の２種の核酸化合物が
オリゴヌクレオチド化合物候補として選出された。 E1AF2：CTGATCGAAGAGGTACTGGCTGATAATCTTCCACC （配列番号１） E1AR2：TTATGGCCTGGGGCGTTTACAGCTCAAGTCCAAAG （配列番号２）
【００３９】また、野生型ヒトアデノウイルス５型のＥ
１Ｂ遺伝子に対しては配列番号６で表される塩基配列に
ついて検索した結果、次の２種の核酸化合物がオリゴヌ
クレオチド化合物候補として選出された。 E1BF1：AGTTTTATAAAGGATAAATGGAGCGAAGAAACCC （配列番号３） E1BR1：AGTGGTCAGCTGCTCTATGGAATACTTCTGCGCC （配列番号４）
１Ｂ遺伝子に対しては配列番号６で表される塩基配列に
ついて検索した結果、次の２種の核酸化合物がオリゴヌ
クレオチド化合物候補として選出された。 E1BF1：AGTTTTATAAAGGATAAATGGAGCGAAGAAACCC （配列番号３） E1BR1：AGTGGTCAGCTGCTCTATGGAATACTTCTGCGCC （配列番号４）
【００４０】（２）オリゴヌクレオチド化合物の作製
以上により選択した塩基配列をもとにしてインビトロジ
ェン（株）にてオリゴヌクレオチド化合物を受託合成し
作製した。
ェン（株）にてオリゴヌクレオチド化合物を受託合成し
作製した。
【００４１】（３）in vitro実験系を用いた評価実験
密度勾配超遠心法で精製された野生型ヒトアデノウイル
ス５型ＤＮＡ(5.3×10 0〜5.3×106copies)を鋳型とし、
該オリゴヌクレオチドをプライマーとしてKODDash DNA
ポリメラーゼ（東洋紡績（株））でＰＣＲ反応（９４℃
３０秒、６２℃２秒、７４℃３０秒、３０サイクル）を
行った。さらにin vitroの再構成実験として、密度勾配
超遠心法で精製された野生型ヒトアデノウイルス５型Ｄ
ＮＡ(5.3×100〜5.3×106copies)と密度勾配超遠心法で
精製されＲＣＡの検出されない組み換えアデノウイルス
AxCAEGFPのＤＮＡ(1×10 8copies)をあらかじめ混合した
ものを鋳型として上記と同様にPCR反応を行った。
ス５型ＤＮＡ(5.3×10 0〜5.3×106copies)を鋳型とし、
該オリゴヌクレオチドをプライマーとしてKODDash DNA
ポリメラーゼ（東洋紡績（株））でＰＣＲ反応（９４℃
３０秒、６２℃２秒、７４℃３０秒、３０サイクル）を
行った。さらにin vitroの再構成実験として、密度勾配
超遠心法で精製された野生型ヒトアデノウイルス５型Ｄ
ＮＡ(5.3×100〜5.3×106copies)と密度勾配超遠心法で
精製されＲＣＡの検出されない組み換えアデノウイルス
AxCAEGFPのＤＮＡ(1×10 8copies)をあらかじめ混合した
ものを鋳型として上記と同様にPCR反応を行った。
【００４２】得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲル
で電気泳動し、０．５％エチジウムブロマイドで染色
し、ＵＶイルミネーターで検出した。結果を図１及び図
２に示す。図１及び図２の結果から分かるように、組み
換えアデノウイルスＤＮＡの混入の有無に関わらず、5.
3×102copiesの野生型ヒトアデノウイルス５型ＤＮＡの
鋳型条件でＥ１ＡまたはＥ１Ｂ遺伝子の検出ができた。
これは対照実験に用いたプライマーの結果とほぼ同等の
効果を示した。ここで、１ｆ、１ｒは対照実験用プライ
マーである（Dion, L.D.ら「Journal of Virological M
ethods」 56巻99-107頁 (1996)）。さらに、配列番号１
〜４を同時にPCR反応に用いてアデノウイルスのＥ１Ａ
とＥ１Ｂ遺伝子を同時に検出することができた。
で電気泳動し、０．５％エチジウムブロマイドで染色
し、ＵＶイルミネーターで検出した。結果を図１及び図
２に示す。図１及び図２の結果から分かるように、組み
換えアデノウイルスＤＮＡの混入の有無に関わらず、5.
3×102copiesの野生型ヒトアデノウイルス５型ＤＮＡの
鋳型条件でＥ１ＡまたはＥ１Ｂ遺伝子の検出ができた。
これは対照実験に用いたプライマーの結果とほぼ同等の
効果を示した。ここで、１ｆ、１ｒは対照実験用プライ
マーである（Dion, L.D.ら「Journal of Virological M
ethods」 56巻99-107頁 (1996)）。さらに、配列番号１
〜４を同時にPCR反応に用いてアデノウイルスのＥ１Ａ
とＥ１Ｂ遺伝子を同時に検出することができた。
【００４３】
【本発明の効果】本発明のオリゴヌクレオチドをプライ
マーとして用いたＰＣＲ法によれば、ヒトアデノウイル
ス５型Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子を特異的に検出でき
る。更にラジオアイソトープを使わずに、アガロースゲ
ル電気泳動によるエチジウムブロマイド染色のみで、高
感度にヒトアデノウイルス５型Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝
子を検出することができる。従って、簡便にかつ短時間
にヒトアデノウイルス５型Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子の
高感度検出が可能である。
マーとして用いたＰＣＲ法によれば、ヒトアデノウイル
ス５型Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子を特異的に検出でき
る。更にラジオアイソトープを使わずに、アガロースゲ
ル電気泳動によるエチジウムブロマイド染色のみで、高
感度にヒトアデノウイルス５型Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝
子を検出することができる。従って、簡便にかつ短時間
にヒトアデノウイルス５型Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子の
高感度検出が可能である。
【００４４】また、本発明のオリゴヌクレオチドを用い
ることにより、高力価組み換えアデノウイルスに混入す
るＲＣＡをＰＣＲ法で簡便にしかも高感度に検出するこ
とができる。従って、本発明のオリゴヌクレオチドは、
信頼性がある正確なタンパク質発現実験の結果を得るた
めに、感染実験に用いられる組み換えアデノウイルス液
のＲＣＡの混入を検査することに利用できる。また、組
み換えウイルス作製において多数の組み換え体ウイルス
候補のクローンをスクリーニングする場合において実施
されるＲＣＡ混入検査に利用することができる。
ることにより、高力価組み換えアデノウイルスに混入す
るＲＣＡをＰＣＲ法で簡便にしかも高感度に検出するこ
とができる。従って、本発明のオリゴヌクレオチドは、
信頼性がある正確なタンパク質発現実験の結果を得るた
めに、感染実験に用いられる組み換えアデノウイルス液
のＲＣＡの混入を検査することに利用できる。また、組
み換えウイルス作製において多数の組み換え体ウイルス
候補のクローンをスクリーニングする場合において実施
されるＲＣＡ混入検査に利用することができる。
【００４５】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> RIKEN
<120> Oligonucleotides for detection of E1A and E1B gene of human adenov
irus type 5
<130> A21047A
<160> 6
【００４６】
<210> 1
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 1
ctgatcgaag aggtactggc tgataatctt ccacc 35
【００４７】
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 2
ttatggcctg gggcgtttac agctcaagtc caaag 35
【００４８】
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 3
agttttataa aggataaatg gagcgaagaa accc 34
【００４９】
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 4
agtggtcagc tgctctatgg aatacttctg cgcc 34
【００５０】
<210> 5
<211> 986
<212> DNA
<213> Human adenovirus
<400> 5
atgagacata ttatctgcca cggaggtgtt attaccgaag aaatggccgc cagtcttttg 60
gaccagctga tcgaagaggt actggctgat aatcttccac ctcctagcca ttttgaacca 120
cctacccttc acgaactgta tgatttagac gtgacggccc ccgaagatcc caacgaggag 180
gcggtttcgc agatttttcc cgactctgta atgttggcgg tgcaggaagg gattgactta 240
ctcacttttc cgccggcgcc cggttctccg gagccgcctc acctttcccg gcagcccgag 300
cagccggagc agagagcctt gggtccggtt tctatgccaa accttgtacc ggaggtgatc 360
gatcttacct gccacgaggc tggctttcca cccagtgacg acgaggatga agagggtgag 420
gagtttgtgt tagattatgt ggagcacccc gggcacggtt gcaggtcttg tcattatcac 480
cggaggaata cgggggaccc agatattatg tgttcgcttt gctatatgag gacctgtggc 540
atgtttgtct acagtaagtg aaaattatgg gcagtgggtg atagagtggt gggtttggtg 600
tggtaatttt ttttttaatt tttacagttt tgtggtttaa agaattttgt attgtgattt 660
ttttaaaagg tcctgtgtct gaacctgagc ctgagcccga gccagaaccg gagcctgcaa 720
gacctacccg ccgtcctaaa atggcgcctg ctatcctgag acgcccgaca tcacctgtgt 780
ctagagaatg caatagtagt acggatagct gtgactccgg tccttctaac acacctcctg 840
agatacaccc ggtggtcccg ctgtgcccca ttaaaccagt tgccgtgaga gttggtgggc 900
gtcgccaggc tgtggaatgt atcgaggact tgcttaacga gcctgggcaa cctttggact 960
tgagctgtaa acgccccagg ccataa 986
【００５１】
<210> 6
<211> 2318
<212> DNA
<213> Human adenovirus
<400> 6
atggaggctt gggagtgttt ggaagatttt tctgctgtgc gtaacttgct ggaacagagc 60
tctaacagta cctcttggtt ttggaggttt ctgtggggct catcccaggc aaagttagtc 120
tgcagaatta aggaggatta caagtgggaa tttgaagagc ttttgaaatc ctgtggtgag 180
ctgtttgatt ctttgaatct gggtcaccag gcgcttttcc aagagaaggt catcaagact 240
ttggattttt ccacaccggg gcgcgctgcg gctgctgttg cttttttgag ttttataaag 300
gataaatgga gcgaagaaac ccatctgagc ggggggtacc tgctggattt tctggccatg 360
catctgtgga gagcggttgt gagacacaag aatcgcctgc tactgttgtc ttccgtccgc 420
ccggcgataa taccgacgga ggagcagcag cagcagcagg aggaagccag gcggcggcgg 480
caggagcaga gcccatggaa cccgagagcc ggcctggacc ctcgggaatg aatgttgtac 540
aggtggctga actgtatcca gaactgagac gcattttgac aattacagag gatgggcagg 600
ggctaaaggg ggtaaagagg gagcgggggg cttgtgaggc tacagaggag gctaggaatc 660
tagcttttag cttaatgacc agacaccgtc ctgagtgtat tacttttcaa cagatcaagg 720
ataattgcgc taatgagctt gatctgctgg cgcagaagta ttccatagag cagctgacca 780
cttactggct gcagccaggg gatgattttg aggaggctat tagggtatat gcaaaggtgg 840
cacttaggcc agattgcaag tacaagatca gcaaacttgt aaatatcagg aattgttgct 900
acatttctgg gaacggggcc gaggtggaga tagatacgga ggatagggtg gcctttagat 960
gtagcatgat aaatatgtgg ccgggggtgc ttggcatgga cggggtggtt attatgaatg 1020
taaggtttac tggccccaat tttagcggta cggttttcct ggccaatacc aaccttatcc 1080
tacacggtgt aagcttctat gggtttaaca atacctgtgt ggaagcctgg accgatgtaa 1140
gggttcgggg ctgtgccttt tactgctgct ggaagggggt ggtgtgtcgc cccaaaagca 1200
gggcttcaat taagaaatgc ctctttgaaa ggtgtacctt gggtatcctg tctgagggta 1260
actccagggt gcgccacaat gtggcctccg actgtggttg cttcatgcta gtgaaaagcg 1320
tggctgtgat taagcataac atggtatgtg gcaactgcga ggacagggcc tctcagatgc 1380
tgacctgctc ggacggcaac tgtcacctgc tgaagaccat tcacgtagcc agccactctc 1440
gcaaggcctg gccagtgttt gagcataaca tactgacccg ctgttccttg catttgggta 1500
acaggagggg ggtgttccta ccttaccaat gcaatttgag tcacactaag atattgcttg 1560
agcccgagag catgtccaag gtgaacctga acggggtgtt tgacatgacc atgaagatct 1620
ggaaggtgct gaggtacgat gagacccgca ccaggtgcag accctgcgag tgtggcggta 1680
aacatattag gaaccagcct gtgatgctgg atgtgaccga ggagctgagg cccgatcact 1740
tggtgctggc ctgcacccgc gctgagtttg gctctagcga tgaagataca gattgaggta 1800
ctgaaatgtg tgggcgtggc ttaagggtgg gaaagaatat ataaggtggg ggtcttatgt 1860
agttttgtat ctgttttgca gcagccgccg ccgccatgag caccaactcg tttgatggaa 1920
gcattgtgag ctcatatttg acaacgcgca tgcccccatg ggccggggtg cgtcagaatg 1980
tgatgggctc cagcattgat ggtcgccccg tcctgcccgc aaactctact accttgacct 2040
acgagaccgt gtctggaacg ccgttggaga ctgcagcctc cgccgccgct tcagccgctg 2100
cagccaccgc ccgcgggatt gtgactgact ttgctttcct gagcccgctt gcaagcagtg 2160
cagcttcccg ttcatccgcc cgcgatgaca agttgacggc tcttttggca caattggatt 2220
ctttgacccg ggaacttaat gtcgtttctc agcagctgtt ggatctgcgc cagcaggttt 2280
ctgccctgaa ggcttcctcc cctcccaatg cggtttaa 2318
【図１】図１は、野生型ヒトアデノウイルス５型ＤＮＡ
(5.3×100〜5.3×106copies)を鋳型として、それぞれの
プライマーでＰＣＲ反応を行いＥ１ＡまたはＥ１Ｂ遺伝
子を検出した結果を示す。
(5.3×100〜5.3×106copies)を鋳型として、それぞれの
プライマーでＰＣＲ反応を行いＥ１ＡまたはＥ１Ｂ遺伝
子を検出した結果を示す。
【図２】図２は、野生型ヒトアデノウイルス５型ＤＮＡ
(5.3×100〜5.3×106copies)と組み換えアデノウイルス
AxCAEGFP DNA(1×108copies)をあらかじめ混合したもの
を鋳型として、それぞれのプライマーでＰＣＲ反応を行
いＥ１ＡまたはＥ１Ｂ遺伝子を検出した結果を示す。最
左レーンに挿入遺伝子検出用のプライマーを用いた結果
を示す。
(5.3×100〜5.3×106copies)と組み換えアデノウイルス
AxCAEGFP DNA(1×108copies)をあらかじめ混合したもの
を鋳型として、それぞれのプライマーでＰＣＲ反応を行
いＥ１ＡまたはＥ１Ｂ遺伝子を検出した結果を示す。最
左レーンに挿入遺伝子検出用のプライマーを用いた結果
を示す。
フロントページの続き
(72)発明者 鵜飼 英世
茨城県つくば市高野台３丁目１番１号 理
化学研究所 筑波研究所内
(72)発明者 鈴木 恵理香
茨城県つくば市高野台３丁目１番１号 理
化学研究所 筑波研究所内
Ｆターム(参考） 4B024 AA14 CA01 CA09 HA12
4B063 QA01 QA18 QA19 QQ10 QQ42
QR08 QR42 QR55 QR62 QR82
QS25 QS34 QS36 QX02
Claims (9)
- 【請求項１】 配列表の配列番号１〜４の何れかに記載
の塩基配列またはそれらと実質的に同一の塩基配列を有
する、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子
検出用オリゴヌクレオチド。 - 【請求項２】 下記の何れかに記載の塩基配列を有す
る、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。 （１）配列表の配列番号１〜４の何れかに記載の塩基配
列； （２）配列表の配列番号１〜４の何れかの塩基配列にお
いてＴをＵに置換した塩基配列； （３）上記（１）又は（２）に記載の塩基配列と少なく
とも７０％以上の相同性を有する塩基配列であって、ヒ
トアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子を特異的
に検出できる塩基配列；又は、 （４）配列表の配列番号１〜４の何れかの塩基配列にお
いて１〜数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された
塩基配列であって、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又は
Ｅ１Ｂ遺伝子を特異的に検出できる塩基配列； - 【請求項３】 配列表の配列番号１に記載の塩基配列ま
たはそれと実質的に同一の塩基配列を有するオリゴヌク
レオチド、及び配列表の配列番号２に記載の塩基配列ま
たはそれと実質的に同一の塩基配列を有するオリゴヌク
レオチドから成るヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ遺伝子
検出用プライマーセット。 - 【請求項４】 配列表の配列番号３に記載の塩基配列ま
たはそれと実質的に同一の塩基配列を有するオリゴヌク
レオチド、及び配列表の配列番号４に記載の塩基配列ま
たはそれと実質的に同一の塩基配列を有するオリゴヌク
レオチドから成るヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ｂ遺伝子
検出用プライマーセット。 - 【請求項５】 実質的に同一の塩基配列が、下記の何れ
かに記載の塩基配列である、請求項３又は４に記載のプ
ライマーセット。 （１）当該塩基配列においてＴをＵに置換した塩基配
列； （２）当該塩基配列と少なくとも７０％以上の相同性を
有する塩基配列であって、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１
Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子を特異的に検出できる塩基配列；又
は、 （３）当該塩基配列において１〜数個の塩基が欠失、置
換及び／又は付加された塩基配列であって、ヒトアデノ
ウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子を特異的に検出で
きる塩基配列； - 【請求項６】 請求項１又は２に記載のオリゴヌクレオ
チドあるいは請求項３から５の何れかに記載のプライマ
ーセットを用いて試料中のヒトアデノウイルス５型Ｅ１
Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子を検出することを含む、ヒトアデノ
ウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子の検出方法。 - 【請求項７】 試料中の核酸を鋳型として、請求項３か
ら５の何れかに記載のプライマーセットを用いてＰＣＲ
を行うことにより、試料中のヒトアデノウイルス５型Ｅ
１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子を検出することを含む、ヒトアデ
ノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子の検出方法。 - 【請求項８】 請求項１又は２に記載のオリゴヌクレオ
チド、又は請求項３から５の何れかにプライマーセット
を含む、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝
子検出用試薬。 - 【請求項９】 請求項１又は２に記載のオリゴヌクレオ
チド、又は請求項３から５の何れかにプライマーセット
を含む、ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝
子検出用キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002042829A JP3650797B2 (ja) | 2002-02-20 | 2002-02-20 | ヒトアデノウイルス５型ｅ１ａおよびｅ１ｂ遺伝子検出用オリゴヌクレオチド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002042829A JP3650797B2 (ja) | 2002-02-20 | 2002-02-20 | ヒトアデノウイルス５型ｅ１ａおよびｅ１ｂ遺伝子検出用オリゴヌクレオチド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003235581A true JP2003235581A (ja) | 2003-08-26 |
| JP3650797B2 JP3650797B2 (ja) | 2005-05-25 |
Family
ID=27782811
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002042829A Expired - Fee Related JP3650797B2 (ja) | 2002-02-20 | 2002-02-20 | ヒトアデノウイルス５型ｅ１ａおよびｅ１ｂ遺伝子検出用オリゴヌクレオチド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3650797B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114231663A (zh) * | 2021-11-24 | 2022-03-25 | 和元生物技术（上海）股份有限公司 | 一种快速定量腺病毒的E1A基因拷贝数的qPCR方法 |
| CN114277185A (zh) * | 2021-11-06 | 2022-04-05 | 江汉大学 | 一种腺病毒的mnp标记组合、引物对组合、试剂盒及其应用 |
-
2002
- 2002-02-20 JP JP2002042829A patent/JP3650797B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114277185A (zh) * | 2021-11-06 | 2022-04-05 | 江汉大学 | 一种腺病毒的mnp标记组合、引物对组合、试剂盒及其应用 |
| CN114277185B (zh) * | 2021-11-06 | 2023-09-08 | 江汉大学 | 一种腺病毒的mnp标记组合、引物对组合、试剂盒及其应用 |
| CN114231663A (zh) * | 2021-11-24 | 2022-03-25 | 和元生物技术（上海）股份有限公司 | 一种快速定量腺病毒的E1A基因拷贝数的qPCR方法 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3650797B2 (ja) | 2005-05-25 |
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