CN114231663A - 一种快速定量腺病毒的E1A基因拷贝数的qPCR方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种qPCR定量方法，尤其涉及一种快速定量腺病毒的E1A基因拷贝数的qPCR方法。用于快速鉴定腺病毒(adenovirus)E1A区的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，快速定量方法包括：(1)模板DNA提取及构建有E1A基因的质粒标准品；(2)PCR反应；(3)通过标准曲线的线性方程计算E1A基因拷贝数。本发明方法方便快捷，能在较短的时间内定量腺病毒(adenovirus)的E1A基因拷贝数，且不需要昂贵的仪器设备；灵敏度高，特异性好，本发明对于腺病毒(adenovirus)的E1A基因的临床诊断和科学研究具有较高的参考价值，适于推广应用。

Description

一种快速定量腺病毒的E1A基因拷贝数的qPCR方法

技术领域

本发明涉及一种qPCR定量方法，尤其涉及一种快速定量腺病毒的基因拷贝数的qPCR方法。

背景技术

人体腺病毒基因组转录产生mRNA，已知的转录单位至少有5个，其中E1区位于病毒基因组左侧，可再分成E1A和E1B，与细胞转化有关。腺病毒对呼吸道、胃肠道、尿道和膀胱、眼、肝脏等均可感染，而E1A作为腺病毒特异性基因又同时具有双向调控多种基因转录的作用，并且作为新发现的一种抗癌基因而受到广泛关注，因此建立一种更快速更准确的生物学定量方法不论是对腺病毒引发的感染的确证及临床用药，还是对实验是科学研究及相对应的药物开发具有重要意义。目前鉴定腺病毒(adenovirus)的E1A区的分子生物方法有普通PCR，ELISA等方法，以上各种方法虽然可能在临床上提供较好的价值，但因无法定量、定量不准、灵敏度低等不同的原因未能在临床上大规模推广使用。目前尚未有将qPCR法应用于定量腺病毒(adenovirus)的E1A基因拷贝数。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明的提供了一组用于快速鉴定腺病毒(adenovirus)E1A区的特异性引物，及一种用qPCR染料法快速鉴定腺病毒(adenovirus)E1A区的方法。

本发明公开了一种快速鉴定腺病毒E1A区的特异性引物，包括上游引物和下游引物；所述上游引物的序列如SEQ ID No.1所示；所述下游引物的序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还公开了一种用于快速鉴定腺病毒E1A区的试剂盒，其所述的特异性引物。

进一步地，所述的试剂盒，其还包括PCR扩增反应试剂。

进一步地，所述的试剂盒，其中所述PCR为荧光定量PCR。

本发明公开了所述的特异性引物在制备用于快速鉴定腺病毒E1A区的试剂盒中的用途。

本发明公开了一种快速定量鉴定腺病毒E1A区的方法，包括以下步骤：

S1待检样品模板DNA的提取；

S2利用权利要求1所述的特异性引物和S1中的模板DNA及质粒标准品OB01进行荧光定量PCR；所述质粒标准品OB01需要梯度稀释；

S3以质粒标准品的LOG拷贝数为x、Ct值为y线性回归得到线性方程；

S4将待检样品的Ct值代入S3中的线性方程，从而得到拷贝数，达到E1A基因定量的目的。

与现有技术相比，本发明取得了以下显著的技术效果：

1.引物的特异性强，提高了鉴定腺病毒(adenovirus)E1A区的灵敏度；

2.利用qPCR染料法，能够快速定量鉴定腺病毒(adenovirus)E1A区；

3.鉴定方法方便快捷、定量精准、灵敏度高，适于推广应用。

附图说明

图1为溶解曲线图，横坐标是温度(℃)，纵坐标是信号强度导数；

图2是标准曲线的扩增曲线图，横坐标是循环数，纵坐标是相对信号强度；

图3是待检样品DNA扩增曲线图，横坐标是循环数，纵坐标是相对信号强度；

图4是空白对照扩增曲线图，横坐标是循环数，纵坐标是相对信号强度；

图5是标准品DNA溶液、待检样品DNA溶液与空白溶液扩增曲线图，横坐标是循环数，纵坐标是相对信号强度。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

本发明根据腺病毒(adenovirus)E1A区的保守区设计1条特异性引物，利用qPCR染料法技术，根据扩增结果快速鉴定腺病毒(adenovirus)E1A区。

用于快速鉴定腺病毒(adenovirus)E1A区的特异性引物，包括：

上游引物：5’-GCAGAGAGCCTTGGGTCC-3’(SEQ ID No.1)；

下游引物：5’-TGGAAAGCCAGCCTCGT-3’(SEQ ID No.2)；

包含腺病毒(adenovirus)E1A区的质粒标准品OB01的序列如SEQ ID No.3所示；腺病毒(adenovirus)E1A区的序列如SEQ ID No.4所示。

一种快速鉴定腺病毒(adenovirus)E1A区的方法，具体包括如下步骤：

(1)模板DNA的提取：

1.1取100μl样品或空白溶液到1.5ml干净的离心管中，加入10μl 5M NaCl溶液，然后加入100μl蛋白酶K消化液，漩涡振荡10秒，取出快速离心5秒。放置在55℃水浴60分钟。

1.2将磁珠置于室温下或37℃水浴10分钟，在漩涡振荡器充分振荡5秒。从水浴中取出样本，快速离心30秒，加入200μl工作结合液，在漩涡振荡器上充分振荡5秒。快速离心10秒后在样本混合物中分别加入200μl异丙醇，及10μl磁珠。将装有全部混合物的离心管置于漩涡振荡器上振荡5分钟，快速离心10秒后静置于磁性分离架上。

1.3待溶液澄清，磁珠完全分离后，用枪头小心移去上清。

1.4从磁性分离架上取下含有磁珠的离心管，加入700μl洗涤液A，用漩涡振荡器振荡10秒使磁珠和洗涤液A混匀；快速离心10秒后，将离心管重置于磁性分离架上。待溶液澄清，磁珠完全分离后，用枪头移去上清液，完成第1次磁珠洗涤。

1.5从磁性分离架上取下含有磁珠的离心管，加入700μl洗涤液B，用漩涡振荡器振荡40秒使磁珠和洗涤液B混匀；快速离心10秒后，将离心管重置于磁性分离架上。待溶液澄清，磁珠完全分离后，用枪头移去上清液，完成第2次磁珠洗涤。

1.6从磁性分离架上取下离心管，打开管盖在室温下干燥1～3分钟，除去残留的乙醇。沿离心管壁加入100μl洗脱液，用漩涡振荡器轻微振荡3秒使磁珠和洗脱液混匀，70℃水浴7分钟，水浴过程中可再次振荡混匀2～3次。

1.7孵育完成后，将离心管置高速离心机8000rpm/min离心1分钟，然后静置于磁性分离架上，待磁珠分离后，用枪头小心转移溶液到干净的离心管中。将上一步获得的离心管快速离心10秒，然后静置于磁性分离架上，待磁珠分离后，用枪头再次转移溶液到干净离心管，所得即为样本纯化液。

(2)PCR反应：

2.1引物稀释：根据引物摩尔数，用ddH₂O稀释引物至3μM，每管50μl分装于1.5ml管中，-20℃保存待用；

2.2标准品质粒OB01梯度稀释，质粒长度5673bp，浓度：49.4ng/μl，根据计算公式：(6.02×10²³)×(质粒浓度ng/μl×10^-9)/(质粒碱基数×660)，折算成拷贝数为7.94E+09copies/μl

2.3按下表配制PCR反应液：

组分	体积(μl)
		TB GREEN	15
E1A-F 3μM	1
		E1A-R 3μM	1
50×ROX	0.6
		超纯水	2.4

2.4将PCR反应液按20μl/孔分装至PCR反应孔中，在各孔中分别加入10μl已经配制好的标准品DNA溶液、待检样品DNA溶液与空白溶液。每个样品均需设置三复孔。

2.5 PCR反应液制备好后，混匀，置掌上离心机离心10秒钟，按顺序放入PCR仪器内。设置反应程序为：

2.6荧光定量PCR仪配置：设置PCR反应体积为30μl，报告荧光基团为SYBR，点击START即开始检测。

2.7实验结束后，关闭仪器，分析整理数据。

(3)结果判断：

3.1熔解曲线：理论Tm值84.3±2℃，ABI的荧光定量PCR仪7500，检测的Tm值为83.1℃。判断为E1A基因特异性扩增。图1为溶解曲线图，横坐标是温度(℃)，纵坐标是信号强度导数。

3.2扩增曲线

3.2.1标准曲线：以LOG拷贝数为x、Ct值为y线性回归，线性方程：y＝-3.377x+33.804，R²＝0.999。

图2是标准曲线的扩增曲线图，横坐标是循环数，纵坐标是相对信号强度。

3.2.2样品通过将Ct值代入线性方程，从而得到拷贝数，达到E1A基因定量的目的。

图3是待检样品DNA扩增曲线图，横坐标是循环数，纵坐标是相对信号强度。

图4是空白对照扩增曲线图，横坐标是循环数，纵坐标是相对信号强度：

图5是标准品DNA溶液、待检样品DNA溶液与空白溶液扩增曲线图，横坐标是循环数，纵坐标是相对信号强度。

序列表

<110> 和元生物技术（上海）股份有限公司

<120> 一种快速定量腺病毒的E1A基因拷贝数的qPCR方法

<130> L21100641F

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcagagagcc ttgggtcc 18

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tggaaagcca gcctcgt 17

<210> 3

<211> 5673

<212> DNA

<213> OB01

<400> 3

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgtatctcag gaggtgtgtt 420

agaaggaccg gagtcacagc tatccgtact actattgcat tctctagaca caggtgatgt 480

cgggcgtctc aggatagcag gcgccatttt aggacggcgg gtaggtcttg caggctccgg 540

ttctggctcg ggctcaggct caggttcaga cacaggacct tttaaaaaaa tcacaataca 600

aaattcttta aaccacaaaa ctgtaaaaat taaaaaaaaa attaccacac caaacccacc 660

actctatcac ccactgccca taattttcac ttactgtaga caaacatgcc acaggtcctc 720

atatagcaaa gcgaacacat aatatctggg tcccccgtat tcctccggtg ataatgacaa 780

gacctgcaac cgtgcccggg gtgctccaca taatctaaca caaactcctc accctcttca 840

tcctcgtcgt cactgggtgg aaagccagcc tcgtggcagg taagatcgat cacctccggt 900

acaaggtttg gcatagaaac cggacccaag gctctctgct ccggctgctc gggctgccgg 960

gaaaggtgag gcggctccgg agaaccgggc gccggcggaa aagtgagtaa gtcaatccct 1020

tcctgcaccg ccaacattac agagtcggga aaaatctgcg aaaccgcctc ctcgttggga 1080

tcttcggggg ccgtcacgtc taaatcatac agttcgtgaa gggtaggtgg ttcaaaatgg 1140

ctaggaggtg gaagattatc agccagtacc tcttcgatca gctggtccct ggctgtcttc 1200

atcatcatta tcactgtttc ttagccaatc taaaactcca gttcccatag ccacattaaa 1260

cttcattttt tgatacactg acaaactaaa ctctttgtcc aatctctctt tccactccac 1320

aattctgctc tgaatacttt gagcaaactc agccacaggt ctgtaccaaa ttaacataag 1380

aagcaaagca atgccacttt gaattatcct cttttctaac aaaaactcac tgcgttccag 1440

gcaatgcttt aaataatctt tgggcctaaa atctatttgt tttacaaatc tggcctgcag 1500

tgttttaggc acactgtact cattcatggt gactattcca gggggaaata tttgagttct 1560

tttatttagg tgtttctttt ctaagtttac cttaacactg ccatccaaat aatcccttaa 1620

attgtccagg ttattaattc cctgacctga aggcaaatct ctggactccc ctccagtgcc 1680

ctttacatcc tcaaaaacta ctaaaaactg gtcaatagct actcctagct caaagttcag 1740

cctgtccaag ggcaaattaa catttaaagc tttcccccca cataattcaa gcaaagcagc 1800

tgctaatgta gttttaccac tatcaattgg tcctttaaac agccagtatc tttttttagg 1860

aatgttgtac accatgcatt ttaaaaagtc atacaccact gaatccattt tgggcaacaa 1920

acagtgtagc caagcaactc cagccatcca ttcttctatg tcagcagagc ctgtagaacc 1980

aaacattata tccatcctat ccaaaagatc attaaatctg tttgttaaca tttgttctct 2040

agttaattgt aggctatcaa cccgcttttt agctaaaaca gtatcaacag cctgttggca 2100

tatggttttt tggtttttgc tgtcagcaaa tatagcagca tttgcataat gcttttcatg 2160

gtacttatag tggctgggct gttctttttt aatacatttt aaacacattt caaaactgta 2220

ctgaaattcc aagtacatcc caagcaataa caacacatca tcacattttg tttccattgc 2280

atactctgtt acaagcttcc aggacacttg tttagtttcc tctgcttctt ctggattaaa 2340

atcatgctcc tttaacccac ctggcaaact ttcctcaata acagaaaatg gatctctagt 2400

caaggcacta tacatcaaat attccttatt aaccccttta caaattaaaa agctaaaggt 2460

acacaatttt tgagcatagt tattaatagc agacactcta tgcctgtgtg gagtaagaaa 2520

aaacagtatg ttatgattat aactgttatg cctacttata aaggttacag aatatttttc 2580

cataattttc ttgtatagca gtgcagcttt ttcctttgtg gtgtaaatag caaagcaagc 2640

aagagttcta ttactaaaca cagcatgact caaaaaactt agcaattctg aaggaaagtc 2700

cttggggtct tctacctttc tcttcttttt tggaggagta gaatgttgag agtcagcagt 2760

agcctcatca tcactagatg gcatttcttc tgagcaaaac aggttttcct cattaaaggc 2820

attccaccac tgctcccatt catcagttcc ataggttgga atctaaaata cacaaacaat 2880

tagaatcagt agtttaacac attatacact taaaaatttt atatttacct tagagcttta 2940

aatctctgta ggtagtttgt ccaattatgt cacaccacag aagtaaggtt ccttcacaaa 3000

gatcaagtcc aaaccacatt ctaaagcaat cgaagcagta acaatcaacc cacacaagtg 3060

gatctttcct gtataatttt ctattttcat gcttcatcct cagtaagcac agcaagcata 3120

tgcagttagt agacattttc tttacacact caggccattg tttgcagtat attgcatcaa 3180

caccaggatt taaggaagaa gcaaatacct cagttgcatc ccagaagcct ccaaagtcag 3240

gttgatgagc atattttact ccatcttcca ttttcttgta cagagtattc attttcttca 3300

ttttttcttc atctcctcct ttatcaggat gaaactcctt gcattttttt aaatatgcct 3360

ttctcatcag aggaatattc ccccaggcac tcctttcaag accggatcct ctagagtcga 3420

cctgcaggca tgcaagcttg gcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt 3480

atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg 3540

cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg 3600

gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc 3660

gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc 3720

ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata 3780

acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg 3840

cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct 3900

caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa 3960

gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc 4020

tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt 4080

aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg 4140

ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg 4200

cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct 4260

tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc 4320

tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg 4380

ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc 4440

aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt 4500

aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa 4560

aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat 4620

gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct 4680

gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg 4740

caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag 4800

ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta 4860

attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg 4920

ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg 4980

gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct 5040

ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta 5100

tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg 5160

gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc 5220

cggcgtcaat acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg 5280

gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga 5340

tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg 5400

ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat 5460

gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc 5520

tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca 5580

catttccccg aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct 5640

ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc gtc 5673

<210> 4

<211> 986

<212> DNA

<213> Ad5 E1A

<400> 4

atgagacata ttatctgcca cggaggtgtt attaccgaag aaatggccgc cagtcttttg 60

gaccagctga tcgaagaggt actggctgat aatcttccac ctcctagcca ttttgaacca 120

cctacccttc acgaactgta tgatttagac gtgacggccc ccgaagatcc caacgaggag 180

gcggtttcgc agatttttcc cgactctgta atgttggcgg tgcaggaagg gattgactta 240

ctcacttttc cgccggcgcc cggttctccg gagccgcctc acctttcccg gcagcccgag 300

cagccggagc agagagcctt gggtccggtt tctatgccaa accttgtacc ggaggtgatc 360

gatcttacct gccacgaggc tggctttcca cccagtgacg acgaggatga agagggtgag 420

gagtttgtgt tagattatgt ggagcacccc gggcacggtt gcaggtcttg tcattatcac 480

cggaggaata cgggggaccc agatattatg tgttcgcttt gctatatgag gacctgtggc 540

atgtttgtct acagtaagtg aaaattatgg gcagtgggtg atagagtggt gggtttggtg 600

tggtaatttt ttttttaatt tttacagttt tgtggtttaa agaattttgt attgtgattt 660

ttttaaaagg tcctgtgtct gaacctgagc ctgagcccga gccagaaccg gagcctgcaa 720

gacctacccg ccgtcctaaa atggcgcctg ctatcctgag acgcccgaca tcacctgtgt 780

ctagagaatg caatagtagt acggatagct gtgactccgg tccttctaac acacctcctg 840

agatacaccc ggtggtcccg ctgtgcccca ttaaaccagt tgccgtgaga gttggtgggc 900

gtcgccaggc tgtggaatgt atcgaggact tgcttaacga gcctgggcaa cctttggact 960

tgagctgtaa acgccccagg ccataa 986

Claims (6)

1.一种快速鉴定腺病毒E1A区的特异性引物，包括上游引物和下游引物；所述上游引物的序列如SEQ ID No.1所示；所述下游引物的序列如SEQ ID No.2所示。

2.一种用于快速鉴定腺病毒E1A区的试剂盒，其包括权利要求1所述的特异性引物。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其还包括PCR扩增反应试剂。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其中所述PCR为荧光定量PCR。

5.根据权利要求1所述的特异性引物在制备用于快速鉴定腺病毒E1A区的试剂盒中的用途。

6.一种快速定量鉴定腺病毒E1A区的方法，包括以下步骤：

S1待检样品模板DNA的提取；

S2利用权利要求1所述的特异性引物和S1中的模板DNA及质粒标准品OB01进行荧光定量PCR；所述质粒标准品OB01需要梯度稀释；

S3以质粒标准品的LOG拷贝数为x、Ct值为y线性回归得到线性方程；

S4将待检样品的Ct值代入S3中的线性方程，从而得到拷贝数，达到E1A基因定量的目的。

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