CN116814863A - 一种用于检测猴痘病毒的实时荧光定量pcr试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测猴痘病毒的实时荧光定量PCR试剂盒及应用，属于猴痘核酸检测领域。该试剂盒包括引物qPCR‑F、引物qPCR‑R和探针qPCR‑P，DNA引物以及探针与目标序列混合进行核酸扩增反应；DNA引物qPCR‑F的序列如SEQ I D NO.2所示；DNA引物qPCR‑R的序列如SEQ I D NO.3所示；DNA探针qPCR‑P的序列如SEQ I D NO.3所示；探针qPCR‑P的5’端由FAM修饰，qPCR‑P的3’端由BHQ1修饰。与现有技术相比，本发明的试剂盒灵敏度高和特异性强，能较稳定地检测猴痘病毒核酸，有望为今后应用于猴痘病毒的早期筛查、诊断和疗效评估奠定坚实的基础。

Description

一种用于检测猴痘病毒的实时荧光定量PCR试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及猴痘核酸检测领域，具体涉及一种用于检测猴痘病毒核酸的实时荧光定量PCR技术及应用。

背景技术

猴痘(Monkeypox，MPX)是由猴痘病毒(monkeypox virus，MPXV)引起的人畜共患性疾病。MPXV由双链DNA和外膜组成，是痘病毒科(包括牛痘病毒、天花病毒和其他痘病毒)正痘病毒属(OPXV)的成员，主要分为西非群株和刚果盆地群株。除了通过猴子传播外，该病毒还通过冈比亚袋鼠和非洲松鼠等啮齿动物传播。MPXV也能感染人类，但其感染率和死亡率明显低于天花病毒。MPXV主要通过直接接触感染者的体液、患病组织或呼吸道飞沫传播。患者会出现头痛、发热、淋巴结肿大以及类似水疱状皮疹等症状。潜伏期通常为7至14天，症状持续时间2至4周，致死率在0％～11％之间，绝大多数患者可康复。目前还没有针对MPX的针对性治疗方案，因此，准确的检测对于早期发现病例、快速鉴别诊断和控制病毒传播至关重要。

目前可以通过病毒分离和培养技术、电子显微镜活检、痘病毒抗原的免疫组织化学染色以及抗正痘病毒IgM和IgG抗体的血清学研究来检测MPXV。然而，上述诊断测试既是不确定的，也需要冗长的培养过程。根据病毒的流行病学特征和监测需要，MPXV感染的确认最适合通过病毒核酸分子扩增，特别是聚合酶链反应(PCR)技术可以快速检测MPXV DNA。各种诊断标本可直接从皮疹中获得，包括皮肤、水疱体液和结痂。在短时间内对痘病毒可以进行早期筛查诊断。

聚合酶链式反应技术(PCR)被发明以来，由于其简单、廉价、可靠、快速、灵敏的优质，PCR可能是分子生物学中使用最广泛的技术。qPCR是由PCR技术发展出来的一种技术，通过在DNA扩增过程中，以荧光信号侦测每次PCR循环后产物总量的方法，不单有PCR的快速、灵敏，更有专一性更高、可实时监控、可重复精确定量等优势。TaqMan探针法核心是探针分子，TaqMan探针是单链DNA，5’端偶联发光基团，3’端偶联淬灭基团，游离的完整探针是检测不到荧光信号的，发光基团发出的荧光会被淬灭基团吸收淬灭，探针被水解，发光基团和淬灭基团远离就可以检测到荧光信号。反应开始时，模板链经热变性解链形成单链，TaqMan探针优先跟模板链退火，引物随后退火到模板上，之后进行链的延伸，延伸过程中Taq酶发挥5’-3’外切酶活性，遇到探针会从5’端逐个碱基切除探针，发光基团会跟淬灭基团分开，因此荧光检测系统可以接收到荧光信号，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，荧光信号的累积和PCR产物形成是同步的。TaqMan探针法的特异性除了由引物提供，更由探针分子保证，因其退火温度更高，所以TaqMan探针法特异性更好，在一个反应体系中加入多条探针，可以做多个基因同时检测。qPCR技术作为猴痘病毒的常规诊断首选方法，具有快速、经济、高效、减少实验室差异和样本污染等多重优势。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提出了一种用于检测猴痘病毒的实时荧光定量PCR试剂盒及应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

本发明的第一方面，涉及一种用于检测猴痘病毒的实时荧光定量PCR试剂，包括：

引物qPCR-F，序列为SEQ ID NO.2；

引物qPCR-R，序列为SEQ ID NO.3；以及

探针qPCR-P，序列为SEQ ID NO.4。

可选地，所述探针qPCR-P的5’端由FAM修饰，qPCR-P的3’端由BHQ1修饰

本发明的第二方面，涉及一种试剂盒，包括：

上述的试剂；

反应试剂；以及

目标DNA，序列为SEQ ID NO.1。

可选地，所述反应试剂包括Tris、KCl、MbCl2、dNTPs与Taq酶。

本发明的第三方面，涉及非诊断目的上述的试剂，或者上述的试剂盒在检测体外样本是否含有猴痘病毒中的应用。

可选地，所述应用包括以下步骤：

根据目标DNA设计DNA引物和探针；

加入反应试剂、引物与探针，进行核酸扩增；

扩增后进行变性与退火，观察扩增曲线。

可选地，所述的核酸扩增步骤中，引物qPCR-F、引物qPCR-R以及探针qPCR-P的浓度均为10μmol/L。

可选地，所述退火温度为56℃。

本发明的有益效果：

本发明的猴痘检测技术作为猴痘病毒的常规诊断首选方法，具有快速、经济、高效、减少实验室差异和样本污染等多重优势。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

图1为一种用于检测猴痘病毒核酸的实时荧光定量PCR试剂盒及应用方法的示意图。A表示实时荧光定量PCR检测方法的具体步骤。

图2为实施例1中ABI-7500和琼脂糖凝胶电泳技术验证用于检测猴痘病毒核酸的实时荧光定量PCR技术的反应条件优化结果。图2a为引物浓度的优化图，从左至右分别为2μM-12μM梯度以及阴性对照结果。图2b为探针浓度的优化图，从左至右分别为2μM-12μM梯度以及阴性对照结果。图2c为退火温度优化图，从左至右分别为50℃-58℃梯度以及阴性对照结果。检测结果显示，qPCR-R、qPCR-F加入量均为8μM、探针加入量为8μM、退火温度为56℃时反应效果最佳。且ABI-7500结果与琼脂糖凝胶电泳结果一致。

图3为实施例2中用于检测猴痘病毒核酸的实时荧光定量PCR技术及应用方法灵敏度分析结果。从左至右依次为5.0×10⁷copy/mL到5.0×10¹copy/mL的梯度范围以及阴性对照。检测结果显示最低检测限＜500copies/μL，且ABI-7500结果与琼脂糖凝胶电泳结果一致。

图4为实施例3中用于检测猴痘病毒核酸的实时荧光定量PCR技术及应用方法特异性分析结果。从左至右依次为猴痘假病毒(MPX PV)、牛痘假病毒(CPX PV)、单纯疱疹病毒(HS PV)、水痘假病毒(VZ PV)、巨细胞假病毒(HCM PV)及阴性对照。检测结果显示扩增结果均未观察到除存在靶标假病毒外的产物，且ABI-7500结果与琼脂糖凝胶电泳结果一致。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1一种用于检测猴痘病毒核酸的实时荧光定量PCR检测方法及其反应条件的优化

本实施例根据已公开的猴痘病毒序列进行多序列比对，筛选出F3L基因中长度为91个碱基的保守序列作为检测靶标。序列分别如下：

根据F3L基因的保守序列设计两个引物和一个探针，分别记为引物qPCR-F、引物qPCR-R和探针qPCR-P。上述探针qPCR-P的5’端由FAM修饰，qPCR-P的3’端由BHQ1修饰。上述的引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成、纯化。相关序列见下表(表1)：

表1：本实施例所用探针序列

根据选定的检测序列合成将以F3L基因的保守区定为检测靶点，将其插入质粒pUC57作为阳性模板，用于该技术反应条件的优化。在16μL预混液(Tris、KCl、MbCl₂、dNTPs、Taq酶)中加入0.5μL qPCR-F、0.5μL qPCR-R、1μL qPCR-P、2μLdH₂0和5μL DNA模板，制备总体积为25μL的混合物；通过振荡混匀离心后使用ABI 7500荧光定量PCR仪进行核酸扩增并对其结果进行判读。将ABI 7500荧光定量PCR仪扩增程序设置为：94摄氏度变性30分钟；94摄氏度变性5秒；53摄氏度退火20秒；72摄氏度延伸30秒。扩增40个循环后观察扩增曲线。将25μL扩增产物在2％琼脂糖凝胶上进行结果验证。通过调节引物加入量(2μM～12μM)、探针加入量(2μM～12μM)和退火温度(50℃～58℃)对反应条件进行优化。结果如图2所示，在qPCR-R、qPCR-F加入量均为8μM、探针加入量为8μM、退火温度为56℃时反应效果最佳。

实施例2一种用于检测猴痘病毒核酸的实时荧光定量PCR技术及应用方法灵敏度分析

根据选定的检测序列合成含有目的序列片段的标准质粒作为阳性模板，用于分析该系统的检测灵敏度。以F3L基因的保守区为检测靶点，将其插入质粒pUC57Z中，进行灵敏度检测。重组质粒通过测序进行验证。将合成的质粒分别用TAE/Mg²⁺缓冲液稀释，质粒浓度采用Nanodrop 1000分光光度计测定，拷贝数计算公式为:(6.02×10²³)×(ng/μL×10^-9)/(DNA长度×660)＝拷贝数/μL。将标准重组质粒以1.0×10⁷copy/mL～1.0×10¹copy/mL进行梯度稀释。将质粒分梯度加入总体积25μL的混合物(16μL预混液(Tris、KCl、MbCl₂、dNTPs、Taq酶)中加入0.5μL qPCR-F、0.5μL qPCR-R、1μL qPCR-P、2μLdH₂0和5μL DNA模板)；通过振荡混匀离心后使用ABI 7500荧光定量PCR仪进行核酸扩增并对其结果进行判读。将ABI7500荧光定量PCR仪扩增程序设置为：94摄氏度变性30分钟；94摄氏度变性5秒；53摄氏度退火20秒；72摄氏度延伸30秒。扩增40个循环后观察扩增曲线。将25μL扩增产物在2％琼脂糖凝胶上进行结果验证。结果如图3所示，ABI-7500结果与琼脂糖凝胶电泳的结果一致显示本发明的检测灵敏度(即最低检测浓度)>＜500copies/μL。

实施例3一种用于检测猴痘病毒核酸的实时荧光定量PCR技术及应用方法特异性分析

购买与猴痘病毒同属的假病毒(猴痘假病毒，MPX PV、牛痘假病毒，CPX PV、单纯疱疹病毒，HS PV、水痘假病毒，VZ PV、巨细胞假病毒，HCM PV)进行其特异性检测。将溶解在TAE buffer中的假病毒加入总体积25μL的混合物(16μL预混液(Tris、KCl、MbCl₂、dNTPs、Taq酶)中加入0.5μL qPCR-F、0.5μL qPCR-R、1μL qPCR-P、2μLdH₂0和5μL DNA模板)；通过振荡混匀离心后使用ABI 7500荧光定量PCR仪进行核酸扩增并对其结果进行判读。将ABI7500荧光定量PCR仪扩增程序设置为：94摄氏度变性30分钟；94摄氏度变性5秒；53摄氏度退火20秒；72摄氏度延伸30秒。扩增40个循环后观察扩增曲线。将25μL扩增产物在2％琼脂糖凝胶上进行结果验证。结果如图4所示，ABI-7500结果与琼脂糖凝胶电泳的结果一致显示本发明的检测方法具有较高的特异性。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。

Claims (8)

1.一种用于检测猴痘病毒的实时荧光定量PCR试剂，包括：

引物qPCR-F，序列为SEQ ID NO.2；

引物qPCR-R，序列为SEQ ID NO.3；以及

探针qPCR-P，序列为SEQ ID NO.4。

2.根据权利要求1所述的用于检测猴痘病毒的实时荧光定量PCR试剂，其特征在于，所述探针qPCR-P的5’端由FAM修饰，qPCR-P的3’端由BHQ1修饰。

3.一种试剂盒，包括：

权利要求1或2所述的试剂；

反应试剂；以及

目标DNA，序列为SEQ ID NO.1。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述反应试剂包括Tris、KCl、MbCl2、dNTPs与Taq酶。

5.非诊断目的的权利要求1或2所述的试剂，或者权利要求3或4所述的试剂盒在检测体外样本是否含有猴痘病毒中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：

根据目标DNA设计DNA引物和探针；

加入反应试剂、引物与探针，进行核酸扩增；

扩增后进行变性与退火，观察扩增曲线。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的核酸扩增步骤中，引物qPCR-F、引物qPCR-R以及探针qPCR-P的浓度均为10μmol/L。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述退火温度为56℃。