JP3200624B2 - ウイルスの遺伝子型の識別方法 - Google Patents
ウイルスの遺伝子型の識別方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ウイルス，特にキュウ
リモザイクウイルスを、オリゴヌクレオチドを用いてそ
の種類を識別するウイルスの遺伝子型の識別方法に関す
るものである。
リモザイクウイルスを、オリゴヌクレオチドを用いてそ
の種類を識別するウイルスの遺伝子型の識別方法に関す
るものである。
【０００２】
【従来の技術】ＣＭＶ（キュウリモザイクウイルス）
は，単子葉草本植物から双子葉木本植物までの極めて広
い宿主範囲を持つＲＮＡ型植物ウイルスであり、多くの
農作物に感染してモザイク病を引き起こす重要病原ウイ
ルスである。ＣＭＶは，他の全ての植物ウイルスと同じ
く，有効な防除薬剤がないため，その防除対策確立のた
めに抵抗性品種育成を目的とした遺伝子源の探索，弱毒
ウイルスの開発等が積極的に進められている。
は，単子葉草本植物から双子葉木本植物までの極めて広
い宿主範囲を持つＲＮＡ型植物ウイルスであり、多くの
農作物に感染してモザイク病を引き起こす重要病原ウイ
ルスである。ＣＭＶは，他の全ての植物ウイルスと同じ
く，有効な防除薬剤がないため，その防除対策確立のた
めに抵抗性品種育成を目的とした遺伝子源の探索，弱毒
ウイルスの開発等が積極的に進められている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかし最近になり，Ｃ
ＭＶには外被タンパク質の遺伝子型が異なる２種類の系
統群（Ｉ型およびＩＩ型）が存在し，両者が相互に混合
感染して複合ウイルス病害を引き起こす可能性も考慮す
る必要が生じてきた。そのため，両者の有無を明確に判
定できる検定技術の確立なしには、ＣＭＶの効果的な防
除及び抵抗性作物の効率的な開発が困難な状況にある。
ＭＶには外被タンパク質の遺伝子型が異なる２種類の系
統群（Ｉ型およびＩＩ型）が存在し，両者が相互に混合
感染して複合ウイルス病害を引き起こす可能性も考慮す
る必要が生じてきた。そのため，両者の有無を明確に判
定できる検定技術の確立なしには、ＣＭＶの効果的な防
除及び抵抗性作物の効率的な開発が困難な状況にある。
【０００４】本発明は上述の事情に対処するものであっ
て、ＣＭＶの効果的な防除及び抵抗性作物の効率的な開
発をするために、ＣＭＶ系統群の種類を簡単且つ適正に
識別する方法を提供することを目的とする。
て、ＣＭＶの効果的な防除及び抵抗性作物の効率的な開
発をするために、ＣＭＶ系統群の種類を簡単且つ適正に
識別する方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】上記の目的を達成するた
めに本発明は、下記の配列群から選ばれる配列からなる
オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、ウイル
ス感染組織より抽出したＲＮＡから、ウイルスＲＮＡの
塩基配列と相補な配列及び相同な配列の二本鎖のＤＮＡ
を合成し、該ＤＮＡを電気泳動分析することによりウイ
ルスの種類を視覚検出することを特徴とする。 （１） ５’−ＡＧＹＣＣＴＴＣＣＧＡＡＧＡＡＡＹＣ
ＴＡＧＧＡＧＡ−３’ （２） ５’−ＣＧＡＧＴＣＡＴＧＧＡＣＡＡＡＴＣＴ
ＧＡＡＴＣＡＡ−３’ （３） ５’−ＡＣＡＴＣＴＡＴＴＡＣＣＣＴＧＡＡＡ
ＣＣＧＣＣＴＧ−３’
めに本発明は、下記の配列群から選ばれる配列からなる
オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、ウイル
ス感染組織より抽出したＲＮＡから、ウイルスＲＮＡの
塩基配列と相補な配列及び相同な配列の二本鎖のＤＮＡ
を合成し、該ＤＮＡを電気泳動分析することによりウイ
ルスの種類を視覚検出することを特徴とする。 （１） ５’−ＡＧＹＣＣＴＴＣＣＧＡＡＧＡＡＡＹＣ
ＴＡＧＧＡＧＡ−３’ （２） ５’−ＣＧＡＧＴＣＡＴＧＧＡＣＡＡＡＴＣＴ
ＧＡＡＴＣＡＡ−３’ （３） ５’−ＡＣＡＴＣＴＡＴＴＡＣＣＣＴＧＡＡＡ
ＣＣＧＣＣＴＧ−３’
【０００６】
【作用】本発明における方法の基礎として、本出願人
は、ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ ＤＮＡデー
タバンクにおいて公開されている９種類のＣＭＶ分離株
の外被タンパク質遺伝子の塩基配列（登録番号：Ｊ０２
０５９，Ｄ００３８５，Ｄ００４６２，Ｄ００４６３，
Ｄ１０５３９，Ｄ１０５３８，Ｄ１２４９９，Ｌ１５３
３６，Ｓ５７８３４）を詳細に解析した。そして全ての
分離株で不変の塩基配列部分（ＣＭＶ共通配列）と，Ｉ
型あるいはＩＩ型の系統群内ではほぼ不変であるが、そ
れそれの系統群間では大きく異なる塩基配列部分（系統
群特異的配列）を見いだした。
は、ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ ＤＮＡデー
タバンクにおいて公開されている９種類のＣＭＶ分離株
の外被タンパク質遺伝子の塩基配列（登録番号：Ｊ０２
０５９，Ｄ００３８５，Ｄ００４６２，Ｄ００４６３，
Ｄ１０５３９，Ｄ１０５３８，Ｄ１２４９９，Ｌ１５３
３６，Ｓ５７８３４）を詳細に解析した。そして全ての
分離株で不変の塩基配列部分（ＣＭＶ共通配列）と，Ｉ
型あるいはＩＩ型の系統群内ではほぼ不変であるが、そ
れそれの系統群間では大きく異なる塩基配列部分（系統
群特異的配列）を見いだした。
【０００７】そしてＣＭＶ系統群の種類を識別するため
に、まず、上述したＣＭＶ共通配列に相補的なオリゴヌ
クレオチド，すなわち、５’−ＡＧＹＣＣＴＴＣＣＧＡ
ＡＧＡＡＡＹＣＴＡＧＧＡＧＡ−３’の配列からなるオ
リゴヌクレオチドを用いることにより、両系統群のＣＭ
ＶのゲノムＲＮＡに対するｃＤＮＡを調製する。次に、
得られたｃＤＮＡに、系統群特異的配列からなるオリゴ
ヌクレオチド，すなわち、５’−ＣＧＡＧＴＣＡＴＧＧ
ＡＣＡＡＡＴＣＴＧＡＡＴＣＡＡ−３’，５’−ＡＣＡ
ＴＣＴＡＴＴＡＣＣＣＴＧＡＡＡＣＣＧＣＣＴＧ−３’
の配列からなるオリゴヌクレオチドを加えて、ＤＮＡ複
製酵素による複製反応を行うと、それそれの系統に特異
的なＤＮＡ断片が合成される。そして得られたＤＮＡ断
片を電気泳動分析することにより、ＣＭＶの種類を判別
することが可能になる。
に、まず、上述したＣＭＶ共通配列に相補的なオリゴヌ
クレオチド，すなわち、５’−ＡＧＹＣＣＴＴＣＣＧＡ
ＡＧＡＡＡＹＣＴＡＧＧＡＧＡ−３’の配列からなるオ
リゴヌクレオチドを用いることにより、両系統群のＣＭ
ＶのゲノムＲＮＡに対するｃＤＮＡを調製する。次に、
得られたｃＤＮＡに、系統群特異的配列からなるオリゴ
ヌクレオチド，すなわち、５’−ＣＧＡＧＴＣＡＴＧＧ
ＡＣＡＡＡＴＣＴＧＡＡＴＣＡＡ−３’，５’−ＡＣＡ
ＴＣＴＡＴＴＡＣＣＣＴＧＡＡＡＣＣＧＣＣＴＧ−３’
の配列からなるオリゴヌクレオチドを加えて、ＤＮＡ複
製酵素による複製反応を行うと、それそれの系統に特異
的なＤＮＡ断片が合成される。そして得られたＤＮＡ断
片を電気泳動分析することにより、ＣＭＶの種類を判別
することが可能になる。
【０００８】
【実施例】以下、本発明の実施例を具体的に説明する。
【０００９】まず、準備段階としてオリゴヌクレオチド
の合成を行う。詳細には、図１に示すＣＭＶ共通配列に
相補的な２５塩基のオリゴヌクレオチド（Ｃ３Ｅ２
Ｃ）、同じく図１に示す系統群Ｉ及び系統群ＩＩの各々
の特異的配列からなる２５塩基のオリゴヌクレオチド
（ＹＲ３Ｓ７，ＰＲ３Ｓ４）を、市販のＤＮＡ／ＲＮＡ
合成機（パーキンエルマー社３９２型ＤＮＡ／ＲＮＡ合
成装置）を用いて、シアノエチル・フォスフォアミダイ
ト法により、アデニンフォスフォアミダイト，グアニン
フォスフォアミダイト，シトシンフォスフォアミダイト
及びチミンフォスフォアミダイトをそれぞれ配列に従っ
てカップリングさせることにより合成する。ここで図中
の塩基配列中の「Ｙ」は、その部分の塩基のみＴとＣを
混合してオリゴヌクレオチドを合成することを意味する
ものである。
の合成を行う。詳細には、図１に示すＣＭＶ共通配列に
相補的な２５塩基のオリゴヌクレオチド（Ｃ３Ｅ２
Ｃ）、同じく図１に示す系統群Ｉ及び系統群ＩＩの各々
の特異的配列からなる２５塩基のオリゴヌクレオチド
（ＹＲ３Ｓ７，ＰＲ３Ｓ４）を、市販のＤＮＡ／ＲＮＡ
合成機（パーキンエルマー社３９２型ＤＮＡ／ＲＮＡ合
成装置）を用いて、シアノエチル・フォスフォアミダイ
ト法により、アデニンフォスフォアミダイト，グアニン
フォスフォアミダイト，シトシンフォスフォアミダイト
及びチミンフォスフォアミダイトをそれぞれ配列に従っ
てカップリングさせることにより合成する。ここで図中
の塩基配列中の「Ｙ」は、その部分の塩基のみＴとＣを
混合してオリゴヌクレオチドを合成することを意味する
ものである。
【００１０】次にＣＭＶ感染試料よりＲＮＡの抽出を行
う。詳細には、２５℃，１００，０００ルクスの照度で
１６時間照明した環境制御室で育苗したタバコ（品種サ
ムソン）の葉に、系統群ＩのＣＭＶ分離株であるＣＭＶ
−Ｙ及び系統群ＩＩのＣＭＶ分離株であるＣＭＶ−Ｐの
それぞれを、単独あるいは混合して塗末接種する。（但
し、タバコの葉は完全に展開しているものとする） そして育苗と同一条件に４日間保った後、ウイルス接種
葉を切取り、予め−８０℃で３０分間予冷しておいた乳
鉢に、切除した前記タバコ葉約１ｇと液体窒素１０ｍｌ
を加え、タバコ葉が粉末状になるまで乳棒で磨砕し、こ
れに市販のＲＮＡ抽出試薬「Ｉｓｏｇｅｎ」（日本ジー
ン社製）を１０ｍｌ加えて、シャーベット状態になるよ
うに混和する。
う。詳細には、２５℃，１００，０００ルクスの照度で
１６時間照明した環境制御室で育苗したタバコ（品種サ
ムソン）の葉に、系統群ＩのＣＭＶ分離株であるＣＭＶ
−Ｙ及び系統群ＩＩのＣＭＶ分離株であるＣＭＶ−Ｐの
それぞれを、単独あるいは混合して塗末接種する。（但
し、タバコの葉は完全に展開しているものとする） そして育苗と同一条件に４日間保った後、ウイルス接種
葉を切取り、予め−８０℃で３０分間予冷しておいた乳
鉢に、切除した前記タバコ葉約１ｇと液体窒素１０ｍｌ
を加え、タバコ葉が粉末状になるまで乳棒で磨砕し、こ
れに市販のＲＮＡ抽出試薬「Ｉｓｏｇｅｎ」（日本ジー
ン社製）を１０ｍｌ加えて、シャーベット状態になるよ
うに混和する。
【００１１】上述のシャーベット状物を室温２０℃〜２
５℃に３０分間静置した後、遠心分離（２２，５００
ｇ，１０分間）によって得られた液体に、クロロホルム
を２ｍｌ加え、３０秒間激しく撹拌後、再び遠心分離
（２２，５００ｇ，１０分間）して水相を回収する。得
られた水相に８ｍｌのイソプピルアルコールを加えて撹
拌した後、室温２０℃〜２５℃に１５分間静置する。そ
してこれを遠心分離（２２，５００ｇ，１０分間）して
得られた沈殿に、７０％エチルアルコールを加えて遠心
分離（２２，５００ｇ，１０分間）する操作を２回繰り
返した後、室温２０〜２５℃の室温で３０分間沈殿を乾
燥する。そして乾燥した沈殿を市販のＤＥＰＣ処理水
（ナカライテスク社）１００μｌに溶解してＲＮＡを抽
出する。
５℃に３０分間静置した後、遠心分離（２２，５００
ｇ，１０分間）によって得られた液体に、クロロホルム
を２ｍｌ加え、３０秒間激しく撹拌後、再び遠心分離
（２２，５００ｇ，１０分間）して水相を回収する。得
られた水相に８ｍｌのイソプピルアルコールを加えて撹
拌した後、室温２０℃〜２５℃に１５分間静置する。そ
してこれを遠心分離（２２，５００ｇ，１０分間）して
得られた沈殿に、７０％エチルアルコールを加えて遠心
分離（２２，５００ｇ，１０分間）する操作を２回繰り
返した後、室温２０〜２５℃の室温で３０分間沈殿を乾
燥する。そして乾燥した沈殿を市販のＤＥＰＣ処理水
（ナカライテスク社）１００μｌに溶解してＲＮＡを抽
出する。
【００１２】次にｃＤＮＡの合成と二本鎖ＤＮＡの合成
を行う。詳細には、３μｌのＲＮＡ液に市販のＤＥＰＣ
処理水（ナカライテスク社）を５μｌと、５μＭの濃度
に調整したオリゴヌクレオチドＣ３Ｅ２Ｃを１μｌを混
合し、６５℃で１０分間静置した後、０℃に急冷する。
これに２００ｍＭジチオスレイトールを１μｌと市販の
ｃＤＮＡ合成反応液（ファルマシア社製Ｆｉｒｓｔ−Ｓ
ｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ）を
５μｌ加え、３７℃に１時間静置してｃＤＮＡの合成を
行う。そして合成反応を終了した反応液から過剰のヌク
レオチドを除くため、市販のスピンカラムによるゲルろ
過を行う。具体的には、１，５００ｇ１分間の遠心処理
を予め施した市販のスピンカラム（ファルマシア社製Ｍ
ｉｃｒｏＳＰｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ Ｓ−２００）のゲル
担体上面に、反応液を添加した後、１，５００ｇ２分間
の遠心処理を実施し、スピンカラムを通過したろ液を回
収する。そして得られたろ液に１／１０容の３Ｍ酢酸ナ
トリウム液及び２．５倍容のエチルアルコールを加えて
−８０℃に１５分間静置する。これを遠心分離（２２，
５００ｇ，１０分間）して得られた沈殿に、７０％エチ
ルアルコールを加えて遠心分離（２２，５Ｏ０ｇ，１０
分間）する操作を２回繰り返したの後、室温２０〜２５
℃の室温で３０分間沈殿を乾燥する。
を行う。詳細には、３μｌのＲＮＡ液に市販のＤＥＰＣ
処理水（ナカライテスク社）を５μｌと、５μＭの濃度
に調整したオリゴヌクレオチドＣ３Ｅ２Ｃを１μｌを混
合し、６５℃で１０分間静置した後、０℃に急冷する。
これに２００ｍＭジチオスレイトールを１μｌと市販の
ｃＤＮＡ合成反応液（ファルマシア社製Ｆｉｒｓｔ−Ｓ
ｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ）を
５μｌ加え、３７℃に１時間静置してｃＤＮＡの合成を
行う。そして合成反応を終了した反応液から過剰のヌク
レオチドを除くため、市販のスピンカラムによるゲルろ
過を行う。具体的には、１，５００ｇ１分間の遠心処理
を予め施した市販のスピンカラム（ファルマシア社製Ｍ
ｉｃｒｏＳＰｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ Ｓ−２００）のゲル
担体上面に、反応液を添加した後、１，５００ｇ２分間
の遠心処理を実施し、スピンカラムを通過したろ液を回
収する。そして得られたろ液に１／１０容の３Ｍ酢酸ナ
トリウム液及び２．５倍容のエチルアルコールを加えて
−８０℃に１５分間静置する。これを遠心分離（２２，
５００ｇ，１０分間）して得られた沈殿に、７０％エチ
ルアルコールを加えて遠心分離（２２，５Ｏ０ｇ，１０
分間）する操作を２回繰り返したの後、室温２０〜２５
℃の室温で３０分間沈殿を乾燥する。
【００１３】次に上述のようにして得られた沈殿を滅菌
超純水７μｌに溶解し、これに７０ｍＭ塩化マグネシウ
ムおよび１ｍＭジチオスレイトールを含む１００ｍＭ
Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を２μｌ、０．６
ｍＭデオキシアデノシン三リン酸を１μｌ、０．６ｍＭ
デオキシグアノシン三リン酸を１μｌ、０．６ｍＭデオ
キシチミジン三リン酸を１μｌ、３，０００Ｃｉ／ｍｍ
ｏｌの［α-32Ｐ］デオキシシチジン三リン酸を５μ
ｌ、５μＭに調製した２種のオリゴヌクレオチドＹＲ３
Ｓ７およびＰＲ３Ｓ４をそれぞれ１μｌずつ、２Ｕ／ｋ
ｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔを１μｌ加えて、３７℃
で１０分間ＤＮＡ合成反応を行う。これに３Ｍ酢酸ナト
リウム（ｐＨ５．０）を３．０μｌ、５Ｍ塩化ナトリウ
ムを６μｌ、１０Ｕ／μｌのＭｕｎｇ ｂｅａｎ ｎｕｃ
ｌｅａｓｅを１μｌ加え、３７℃で１０分間静置した
後、１０μｌを２％アガロースゲルでの電気泳動解析に
用いる。分子量マーカーとして、ｌｋｂｐ ＤＮＡラダ
ー（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）を用いる。
超純水７μｌに溶解し、これに７０ｍＭ塩化マグネシウ
ムおよび１ｍＭジチオスレイトールを含む１００ｍＭ
Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を２μｌ、０．６
ｍＭデオキシアデノシン三リン酸を１μｌ、０．６ｍＭ
デオキシグアノシン三リン酸を１μｌ、０．６ｍＭデオ
キシチミジン三リン酸を１μｌ、３，０００Ｃｉ／ｍｍ
ｏｌの［α-32Ｐ］デオキシシチジン三リン酸を５μ
ｌ、５μＭに調製した２種のオリゴヌクレオチドＹＲ３
Ｓ７およびＰＲ３Ｓ４をそれぞれ１μｌずつ、２Ｕ／ｋ
ｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔを１μｌ加えて、３７℃
で１０分間ＤＮＡ合成反応を行う。これに３Ｍ酢酸ナト
リウム（ｐＨ５．０）を３．０μｌ、５Ｍ塩化ナトリウ
ムを６μｌ、１０Ｕ／μｌのＭｕｎｇ ｂｅａｎ ｎｕｃ
ｌｅａｓｅを１μｌ加え、３７℃で１０分間静置した
後、１０μｌを２％アガロースゲルでの電気泳動解析に
用いる。分子量マーカーとして、ｌｋｂｐ ＤＮＡラダ
ー（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）を用いる。
【００１４】次にキュウリモザイクウイルスの遺伝子型
の識別を行う。詳細には、まず、１０ｃｍ×８Ｃｍのサ
イズのゲル（Ｇ）で、１００Ｖ定電圧条件で、ブロムフ
ェノールブルーが８ｃｍ移動するまで通電する。次に
０．１μｇ／ｍｌエチジウムブロマイドで１０分間染色
後、ＵＶトランスイルミネーターの透過照明で写真撮影
して分子量マーカーの位置を記録する。その後ゲルをサ
ランラップに包み、Ｘ線フィルム（Ｋｏｄａｋ社Ｂｉｏ
Ｍａｘ ＭＳ）に露光する。そして３０分〜３時間の露
光の後、感光したフィルムを現像し、ＤＮＡ断片のバン
ドバターン肉眼で判読する。
の識別を行う。詳細には、まず、１０ｃｍ×８Ｃｍのサ
イズのゲル（Ｇ）で、１００Ｖ定電圧条件で、ブロムフ
ェノールブルーが８ｃｍ移動するまで通電する。次に
０．１μｇ／ｍｌエチジウムブロマイドで１０分間染色
後、ＵＶトランスイルミネーターの透過照明で写真撮影
して分子量マーカーの位置を記録する。その後ゲルをサ
ランラップに包み、Ｘ線フィルム（Ｋｏｄａｋ社Ｂｉｏ
Ｍａｘ ＭＳ）に露光する。そして３０分〜３時間の露
光の後、感光したフィルムを現像し、ＤＮＡ断片のバン
ドバターン肉眼で判読する。
【００１５】Ｉ型ＣＭＶが感染している場合には，８７
９塩基または８８１塩基の二本鎖ＤＮＡが合成され（系
統によりサイズが異なる）、またＩＩ型ＣＭＶが感染し
ている場合には、６７３塩基の二本鎖ＤＮＡが合成され
ることからＣＭＶゲノムの塩基配列から予想される。図
２に示すように、Ｉ型ＣＭＶに属するＣＭＶ−Ｙ系統お
よびＩＩ型ＣＭＶに属するＣＭＶ−Ｐ系統のそれぞれを
単独接種した個体から抽出したＲＮＡ（Ｙ，Ｐ）では、
それぞれ予想される１種類の大きさのＤＮＡ断片が現像
したＸ線フィルムに現れ、ＣＭＶ−Ｙ系統およびＣＭＶ
−Ｐ系統を混合接種した個体から抽出したＲＮＡ（Ｙ＋
Ｐ）では、予想される２種類の大きさのＤＮＡ断片像が
共に現れ、電気泳動の移動度の違いから両者は容易に識
別できる。
９塩基または８８１塩基の二本鎖ＤＮＡが合成され（系
統によりサイズが異なる）、またＩＩ型ＣＭＶが感染し
ている場合には、６７３塩基の二本鎖ＤＮＡが合成され
ることからＣＭＶゲノムの塩基配列から予想される。図
２に示すように、Ｉ型ＣＭＶに属するＣＭＶ−Ｙ系統お
よびＩＩ型ＣＭＶに属するＣＭＶ−Ｐ系統のそれぞれを
単独接種した個体から抽出したＲＮＡ（Ｙ，Ｐ）では、
それぞれ予想される１種類の大きさのＤＮＡ断片が現像
したＸ線フィルムに現れ、ＣＭＶ−Ｙ系統およびＣＭＶ
−Ｐ系統を混合接種した個体から抽出したＲＮＡ（Ｙ＋
Ｐ）では、予想される２種類の大きさのＤＮＡ断片像が
共に現れ、電気泳動の移動度の違いから両者は容易に識
別できる。
【００１６】
【発明の効果】以上説明したように、本発明によると、
これまで識別が困難であった遺伝子型の異なる２種類の
ＣＭＶ系統群の識別が容易となり、抵抗性遺伝資源の的
確な評価が実現し、ＣＭＶの効果的な防除技術及び抵抗
性作物の効率的な開発が実現できるようになる。
これまで識別が困難であった遺伝子型の異なる２種類の
ＣＭＶ系統群の識別が容易となり、抵抗性遺伝資源の的
確な評価が実現し、ＣＭＶの効果的な防除技術及び抵抗
性作物の効率的な開発が実現できるようになる。
【図１】オリゴヌクレオチドの塩基配列を示す図であ
る。
る。
【図２】２種類のキュウリモザイク系統のｃＤＮＡ断片
の電気泳動後のイメージを示す図である。
の電気泳動後のイメージを示す図である。
Ｇ １．５％アガロースゲル板 Ｍ サイズ測定用標準ＤＮＡを入れた試料槽 Ｙ ＣＭＶ−Ｙ系統に感染したタバコから抽出したＲＮ
Ａを鋳型とするＤＮＡを入れた試料槽 Ｐ ＣＭＶ−Ｐ系統に感染したタバコから抽出したＲＮ
Ａを鋳型とするＤＮＡを入れた試料槽 Ｙ＋Ｐ ＣＭＶ−Ｙ系統とＣＭＶ−Ｐ系統を同時接種し
たタバコから抽出したＲＮＡを鋳型とするＤＮＡを入れ
た試料槽 Ｈ ウイルスに感染していないタバコから抽出したＲＮ
Ａを鋳型とするＤＮＡを入れた試料槽
Ａを鋳型とするＤＮＡを入れた試料槽 Ｐ ＣＭＶ−Ｐ系統に感染したタバコから抽出したＲＮ
Ａを鋳型とするＤＮＡを入れた試料槽 Ｙ＋Ｐ ＣＭＶ−Ｙ系統とＣＭＶ−Ｐ系統を同時接種し
たタバコから抽出したＲＮＡを鋳型とするＤＮＡを入れ
た試料槽 Ｈ ウイルスに感染していないタバコから抽出したＲＮ
Ａを鋳型とするＤＮＡを入れた試料槽
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平８−56672（ＪＰ，Ａ) 特開 平７−327700（ＪＰ，Ａ) Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏ ｌ．126，ｐ．217−226（1982) Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ. 70（２），ｐ．499−504（1989) Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ. 70（５），ｐ．1065−1073（1989) Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ. 71（10），ｐ．2243−2249（1988) Ａｎｎ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．Ｓ ｏｃ．Ｊｐｎ．，Ｖｏｌ．54ｐ．516− 5222（1988) Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．31 （３），ｐ．379−384（1994) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/70 C12N 15/09 ZNA ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- 【請求項１】 下記の配列群から選ばれる配列からなる
オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、キュウ
リモザイクウイルス感染組織より抽出したＲＮＡから、
キュウリモザイクウイルスＲＮＡの塩基配列と相補な配
列及び相同な配列の二本鎖のＤＮＡを合成し、該ＤＮＡ
を電気泳動分析することによりキュウリモザイクウイル
スの種類を視覚検出することを特徴とするキュウリモザ
イクウイルスの遺伝子型の識別方法。 （１） ５’−ＡＧＹＣＣＴＴＣＣＧＡＡＧＡＡＡＹＣＴＡＧＧＡＧＡ−３’ （２） ５’−ＣＧＡＧＴＣＡＴＧＧＡＣＡＡＡＴＣＴＧＡＡＴＣＡＡ−３’ （３） ５’−ＡＣＡＴＣＴＡＴＴＡＣＣＣＴＧＡＡＡＣＣＧＣＣＴＧ−３’
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|---|---|---|---|
| JP15494697A JP3200624B2 (ja) | 1997-06-12 | 1997-06-12 | ウイルスの遺伝子型の識別方法 |
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| JP15494697A JP3200624B2 (ja) | 1997-06-12 | 1997-06-12 | ウイルスの遺伝子型の識別方法 |
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| JPH11200A JPH11200A (ja) | 1999-01-06 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15494697A Expired - Lifetime JP3200624B2 (ja) | 1997-06-12 | 1997-06-12 | ウイルスの遺伝子型の識別方法 |
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| JP (1) | JP3200624B2 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100496012B1 (ko) * | 2002-11-29 | 2005-06-16 | 대한민국 | 오이모자이크바이러스 진단용 특이 프라이머 |
-
1997
- 1997-06-12 JP JP15494697A patent/JP3200624B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| Ａｎｎ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，Ｖｏｌ．５４ｐ．５１６−５２２２（１９８８） |
| Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．１２６，ｐ．２１７−２２６（１９８２） |
| Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．７０（２），ｐ．４９９−５０４（１９８９） |
| Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．７０（５），ｐ．１０６５−１０７３（１９８９） |
| Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．７１（１０），ｐ．２２４３−２２４９（１９８８） |
| Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．３１（３），ｐ．３７９−３８４（１９９４） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH11200A (ja) | 1999-01-06 |
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