JP2811321B2 - ヒトｂ型肝炎ウイルスの検出方法 - Google Patents
ヒトｂ型肝炎ウイルスの検出方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ヒトＢ型肝炎ウイルス（以下、HBVと略
す）の特定のDNA領域の検出方法に関する。
す）の特定のDNA領域の検出方法に関する。
本発明はまた、このような検出のための検出キットに
関する。
関する。
HBV感染には、急性感染（一過性感染）と慢性感染
（持続感染）がある。HBVが感染すると、多くの場合、
一過性の不顕性感染となり、その後一部は顕性の急性肝
炎となり、やがて免疫となる。極く一部は不顕性感染の
まま持続感染へと移行する。
（持続感染）がある。HBVが感染すると、多くの場合、
一過性の不顕性感染となり、その後一部は顕性の急性肝
炎となり、やがて免疫となる。極く一部は不顕性感染の
まま持続感染へと移行する。
臨床症状だけからＢ型肝炎を他の肝炎と区別すること
は難しく、確定診断が必要である。
は難しく、確定診断が必要である。
一般に、HBV感染の確定診断は、免疫血清学的な方法
で行われている。また、近年スポット（Spot）あるいは
サザン ブロット（Southernblot）法によるHBV DNAの
検出が、感度の良い方法として盛んに用いられてきた。
で行われている。また、近年スポット（Spot）あるいは
サザン ブロット（Southernblot）法によるHBV DNAの
検出が、感度の良い方法として盛んに用いられてきた。
その感度は、HBV DNA1pg程度といわれており、ウイル
スにして105個が必要と考えられる。したがって、更に
高感度の検出方法が求められている。
スにして105個が必要と考えられる。したがって、更に
高感度の検出方法が求められている。
HBV DNAの検出方法として従来用いられてきたスポッ
ト法、サザンブロット法では、HBV DNAが1pg以上ないと
検出できないこと、また、免疫血清学的な方法は時間が
かかりすぎることなどの問題があった。
ト法、サザンブロット法では、HBV DNAが1pg以上ないと
検出できないこと、また、免疫血清学的な方法は時間が
かかりすぎることなどの問題があった。
近年、PCR（ポリメラーゼ チェーン リアクショ
ン）法が高感度遺伝子診断法として開発された〔メソッ
ズ イン エンザイモロジー（Methods in Enezymolog
y）第155巻、第335〜350頁（1987）〕。
ン）法が高感度遺伝子診断法として開発された〔メソッ
ズ イン エンザイモロジー（Methods in Enezymolog
y）第155巻、第335〜350頁（1987）〕。
PCR法は目的とする遺伝子のみを特異的に酵素的に増
幅し、少ない試料から高感度に、また短時間に目的遺伝
子を検出するのに有用な方法である。
幅し、少ない試料から高感度に、また短時間に目的遺伝
子を検出するのに有用な方法である。
PCR法によれば酵素として、例えば耐熱性タックポリ
メラーゼを用い、DNAの変性（94℃）の工程、プライマ
ーDNAのアニーリング（55℃）の工程、DNA相補鎖の酵素
的合成（72℃）の工程より成る温度サイクルを任意の回
数繰返すことで目的遺伝子のみを指数的に増幅すること
ができる。
メラーゼを用い、DNAの変性（94℃）の工程、プライマ
ーDNAのアニーリング（55℃）の工程、DNA相補鎖の酵素
的合成（72℃）の工程より成る温度サイクルを任意の回
数繰返すことで目的遺伝子のみを指数的に増幅すること
ができる。
例えば温度サイクルを25回繰返せば、目的DNAは約10
万倍に増幅され、微量試料より高感度にHBV DNAを検出
するには、このPCR法が最も有効である。
万倍に増幅され、微量試料より高感度にHBV DNAを検出
するには、このPCR法が最も有効である。
PCR法の最高感度は10-6pgのHBV DNAがあれば検出でき
ることにあるが、この最高感度を得るには、ウイルスDN
A中で理想的な増幅領域を選定する必要がある。
ることにあるが、この最高感度を得るには、ウイルスDN
A中で理想的な増幅領域を選定する必要がある。
本発明の目的は、HBV DNAを検出する際、PCR法の最高
感度が得られるHBV DNA増幅領域を明らかにし、その検
出方法、及びそれに用いるキットを提供することにあ
る。
感度が得られるHBV DNA増幅領域を明らかにし、その検
出方法、及びそれに用いるキットを提供することにあ
る。
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明はHBVのＳ
領域中に示される特定のDNA領域を、一対のオリゴヌク
レオチドプライマーを用いて増幅させることを特徴とす
るHBVの検出方法に関し、第２の発明は、上記第１の発
明を用いて検出を行うための検出キットであって、特定
のDNA領域を増幅させるためのプライマー対及び増幅さ
れたDNAを検出するためのプローブを含有していること
を特徴とするHBV検出キットに関する。
領域中に示される特定のDNA領域を、一対のオリゴヌク
レオチドプライマーを用いて増幅させることを特徴とす
るHBVの検出方法に関し、第２の発明は、上記第１の発
明を用いて検出を行うための検出キットであって、特定
のDNA領域を増幅させるためのプライマー対及び増幅さ
れたDNAを検出するためのプローブを含有していること
を特徴とするHBV検出キットに関する。
HBVのＳ領域には４つの亜型、adw、adr、ayw、ayrが
認められている。このうち、ａは共通抗原決定基で亜型
の特異性を担っているのは相互排他的なｄ、ｙ及びｗ、
ｒとよばれる抗原決定基である。
認められている。このうち、ａは共通抗原決定基で亜型
の特異性を担っているのは相互排他的なｄ、ｙ及びｗ、
ｒとよばれる抗原決定基である。
前記課題を解決する手段として、HBVのＳ領域の範囲
で、４つの亜型に共通なDNA領域を選定し、PCR法を用い
たHBV DNA増幅に必要なオリゴヌクレオチドプライマーD
NAを合成し、続いて実際に肝生検試料よりDNAを調製
し、PCR法で増幅させ、高い検出感度を有する領域を選
定することが必要である。
で、４つの亜型に共通なDNA領域を選定し、PCR法を用い
たHBV DNA増幅に必要なオリゴヌクレオチドプライマーD
NAを合成し、続いて実際に肝生検試料よりDNAを調製
し、PCR法で増幅させ、高い検出感度を有する領域を選
定することが必要である。
本発明者らは、このため鋭意研究を重ね、４つの亜型
にかなり共通な増幅領域、PCR法に最適のプライマーDNA
配列、また増幅されたDNA領域を効率よく検出するプロ
ーブ配列を見出した。また、このHBVの特定の領域を増
幅、検出するためのプライマーとプローブより成るキッ
トを作成し、本キットを用いることにより、４つの亜型
のHBVが同時に、しかも簡便に検出できることを見出
し、本発明を完成させた。
にかなり共通な増幅領域、PCR法に最適のプライマーDNA
配列、また増幅されたDNA領域を効率よく検出するプロ
ーブ配列を見出した。また、このHBVの特定の領域を増
幅、検出するためのプライマーとプローブより成るキッ
トを作成し、本キットを用いることにより、４つの亜型
のHBVが同時に、しかも簡便に検出できることを見出
し、本発明を完成させた。
以下、順を追って本発明を具体的に説明する。
HBV DNAは既にクローニングされており、その全塩基
配列は、ヌクレイック アシッズ リサーチ（Nucleic
Acids Research）、第11巻、第4601〜4610頁（1983）、
ネーチャー（Nature）、第281巻、第646〜650頁（197
9）、及びネーチャー、第282巻、第575〜579頁（1979）
などに記載されている。
配列は、ヌクレイック アシッズ リサーチ（Nucleic
Acids Research）、第11巻、第4601〜4610頁（1983）、
ネーチャー（Nature）、第281巻、第646〜650頁（197
9）、及びネーチャー、第282巻、第575〜579頁（1979）
などに記載されている。
HBVのＳ領域には４つの亜型が認められる。これらの
亜型は、地理的な分布を異にし、我国ではadr型とadw型
が90％を占め、東北地方にはadw型が約半数近くみられ
るが、関東から九州まで、南にいくほどadr型が多くな
る。このＳ領域の範囲で各亜型にほぼ共通なDNA領域を
選定した（表１）。
亜型は、地理的な分布を異にし、我国ではadr型とadw型
が90％を占め、東北地方にはadw型が約半数近くみられ
るが、関東から九州まで、南にいくほどadr型が多くな
る。このＳ領域の範囲で各亜型にほぼ共通なDNA領域を
選定した（表１）。
この領域を増幅させるためには、オリゴヌクレオチド
プライマーDNA、すなわち増幅領域の５′末端から約20
塩基のセンス配列及び３′末端から約20塩基のアンチセ
ンス配列を有する各亜型に共通なプライマーDNA対が必
要である。
プライマーDNA、すなわち増幅領域の５′末端から約20
塩基のセンス配列及び３′末端から約20塩基のアンチセ
ンス配列を有する各亜型に共通なプライマーDNA対が必
要である。
このプライマー対は前述の選定DNA領域にアニーリン
グができるものであるば良いが、その一例として表２に
示すようなプライマーDNAをDNA合成機により合成するこ
とができ、HPLCにて精製することができる。
グができるものであるば良いが、その一例として表２に
示すようなプライマーDNAをDNA合成機により合成するこ
とができ、HPLCにて精製することができる。
検出するHBV DNA標品については、HBV DNAをクローニ
ングしたプラスミド、及びＢ型肝炎患者の肝生検試料等
により調製することができる。
ングしたプラスミド、及びＢ型肝炎患者の肝生検試料等
により調製することができる。
肝組織からのDNAの調製は公知の確立された方法を用
いればよい。
いればよい。
PCR法についてはタックポリメラーゼを含む遺伝子増
幅キット及び自動遺伝子増幅装置が、パーキン・エルマ
ー・シータス社から市販されており、これらを用い、本
発明のプライマー対を用いて、特定のDNA領域の増幅反
応を行えばよい。
幅キット及び自動遺伝子増幅装置が、パーキン・エルマ
ー・シータス社から市販されており、これらを用い、本
発明のプライマー対を用いて、特定のDNA領域の増幅反
応を行えばよい。
増幅後のHBV DNAの検出は、例えばアガロースゲル電
気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、スポット
法、及びサザンブロット法を用いて行うことができる。
スポット法、サンブロット法の際、Ｓ領域の各亜型に共
通な領域をプローブDNAとして選択することにより、す
べての亜型のHBVを同時に検出することができる。
気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、スポット
法、及びサザンブロット法を用いて行うことができる。
スポット法、サンブロット法の際、Ｓ領域の各亜型に共
通な領域をプローブDNAとして選択することにより、す
べての亜型のHBVを同時に検出することができる。
プローブDNAとしては、上記の条件を満たせば何でも
よいが、その一例を示せば、表３のようなプローブがあ
る。
よいが、その一例を示せば、表３のようなプローブがあ
る。
このプローブDNAは、前記プライマーDNAと同様の方法
で合成、精製することができる。該プローブDNAは、標
識化することにより、高感度な検出が可能となる。標識
化の方法としては公知の方法なら何でも良いが、例えば
T4ポリヌクレオチドキナーゼを用い、プローブDNAの
５′末端を32Pで標識化するアイソトープ標識方法でも
良いし、プローブDNAの酵素標識、蛍光標識、ビオチン
−アビジン系での標識、またケミプローブのようにプロ
ーブDNAにスルホン基を導入し、それを抗体を用いて認
識するような方法での標識方法等の非アイソトープ標識
方法でも良い。
で合成、精製することができる。該プローブDNAは、標
識化することにより、高感度な検出が可能となる。標識
化の方法としては公知の方法なら何でも良いが、例えば
T4ポリヌクレオチドキナーゼを用い、プローブDNAの
５′末端を32Pで標識化するアイソトープ標識方法でも
良いし、プローブDNAの酵素標識、蛍光標識、ビオチン
−アビジン系での標識、またケミプローブのようにプロ
ーブDNAにスルホン基を導入し、それを抗体を用いて認
識するような方法での標識方法等の非アイソトープ標識
方法でも良い。
検出感度の検出は、HBV DNAが10〜10-6pg含まれるよ
うに、健常なヒト血液より調製した、HBVに感染してい
ないゲノムDNAにて希釈した試料を用い、前記PCR法で増
幅後、例えばドットハイブリダイゼーションを用いて行
うことができる。
うに、健常なヒト血液より調製した、HBVに感染してい
ないゲノムDNAにて希釈した試料を用い、前記PCR法で増
幅後、例えばドットハイブリダイゼーションを用いて行
うことができる。
本発明のプライマー対、プローブを用いれば10-6pgの
HBV DNAを検出することができ、このようにして、HBV D
NA配列の中で、PCR法の最高感度で検出できる有効な検
出領域（表１）が明らかとなり、各亜型のHBVを一度に
かつ高感度に検出することができるようになった。
HBV DNAを検出することができ、このようにして、HBV D
NA配列の中で、PCR法の最高感度で検出できる有効な検
出領域（表１）が明らかとなり、各亜型のHBVを一度に
かつ高感度に検出することができるようになった。
Ｂ型慢性肝炎（活動性）患者の肝内HBV DNAは、イン
ターフェロン治療により消失する例が20〜25％存在す
る。
ターフェロン治療により消失する例が20〜25％存在す
る。
しかし、これらの例では、血中HBs抗体が消失するわ
けではなく、従来のサザンブロット法での検出限界以下
である1pg以下のHBVが肝内に残存していると考えられ
る。高感度HBV DNAの検出は、これら微量の肝内HBV DNA
を含む試料を用い、前記PCR法で増幅後、例えばサザン
ブロット法を用いて行うことができる。
けではなく、従来のサザンブロット法での検出限界以下
である1pg以下のHBVが肝内に残存していると考えられ
る。高感度HBV DNAの検出は、これら微量の肝内HBV DNA
を含む試料を用い、前記PCR法で増幅後、例えばサザン
ブロット法を用いて行うことができる。
実際、従来のサザンブロット法によれば肝内HBV DNA
の検出が陰性とでる４例すべてにおいて、PCR法後のサ
ザンブロット法ではHBV DNAを検出することができた。
の検出が陰性とでる４例すべてにおいて、PCR法後のサ
ザンブロット法ではHBV DNAを検出することができた。
また、本発明に従って、HBV特定DNA領域を増幅させる
ためのプライマー対、及び増幅されたDNA領域を検出す
るためのプローブをそろえてキットしておくことによ
り、各亜型のHBVの検出を同時にしかも簡便に行うこと
ができる。キットに用いる試薬は溶液状でも良いし、連
結乾燥物でもよい。
ためのプライマー対、及び増幅されたDNA領域を検出す
るためのプローブをそろえてキットしておくことによ
り、各亜型のHBVの検出を同時にしかも簡便に行うこと
ができる。キットに用いる試薬は溶液状でも良いし、連
結乾燥物でもよい。
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する
が、本発明はこれら実施例に限定されない。
が、本発明はこれら実施例に限定されない。
実施例１ PCR法によるHBV S領域の増幅と検出 （１−１）肝組織DNAの調製 血中HBs抗原、HBe抗原陽性のＢ型慢性活動性肝炎患者
５例（男性２例、女性３例）のうち、３例にインターフ
ェロン−α、２例にインターフェロン−βを、１日300
〜600万単位ずつ28回投与した。投与直前及び投与終了
１週間後に、肝生検により肝組織を得た。得られた肝組
織５〜20mgをホモジナイズ後、50mMトリス（Tris）HC
l、pH8.0、50mM EDTA、200mM NaCl、２％SDS、500μg/m
lのプロテネースＫを含む1mlの溶液に懸濁し、37℃で７
時間処理した。次に、フェノールとクロロホルムの等量
混合液1mlを加え、静かにかくはんし、12000rpmで15分
間遠心後、水層を分離した。このフェノール／クロロホ
ルム処理を更に２回行い、得られた水層に0.4mlの3M酢
酸ナトリウム及び4mlのエタノールを加え充分かくはん
し、−70℃で15分間放置後、12000rpmで15分間遠心し
て、DNAの沈殿を回収した。沈殿は80％のエタノールで
洗浄した後、乾燥させ、1mlのTEバッファーに溶解し
た。DNAは約10〜50μｇ回収できた。
５例（男性２例、女性３例）のうち、３例にインターフ
ェロン−α、２例にインターフェロン−βを、１日300
〜600万単位ずつ28回投与した。投与直前及び投与終了
１週間後に、肝生検により肝組織を得た。得られた肝組
織５〜20mgをホモジナイズ後、50mMトリス（Tris）HC
l、pH8.0、50mM EDTA、200mM NaCl、２％SDS、500μg/m
lのプロテネースＫを含む1mlの溶液に懸濁し、37℃で７
時間処理した。次に、フェノールとクロロホルムの等量
混合液1mlを加え、静かにかくはんし、12000rpmで15分
間遠心後、水層を分離した。このフェノール／クロロホ
ルム処理を更に２回行い、得られた水層に0.4mlの3M酢
酸ナトリウム及び4mlのエタノールを加え充分かくはん
し、−70℃で15分間放置後、12000rpmで15分間遠心し
て、DNAの沈殿を回収した。沈殿は80％のエタノールで
洗浄した後、乾燥させ、1mlのTEバッファーに溶解し
た。DNAは約10〜50μｇ回収できた。
（１−２）オリゴヌクレオチドプライマーDNA及びプロ
ーブDNAの合成及び精製 PCR法により特定領域のDNA配列を増幅させるには、そ
の領域の５′末端より約20塩基のセンス配列、及び３′
末端より約20塩基のアンチセンス配列のオリゴヌクレオ
チド プライマーDNAが必要である。また、HBV DNAをハ
イブリダイゼーション法により同定するためには、オリ
ゴヌクレオチド プローブDNAが必要である。前記表
２、表３で示したプライマーDNA、及びプローブDNAを、
アプライド バイオシステムズ社のDNA合成機を用いて
合成し、脱保護の後、イオン交換HPLC（TSKゲル、DEAE
−2SWカラム）で精製し、セプーパク（Sep−pak）C18
（ウォーターズ社）で脱塩し、各DNA約50μｇを得た。
ーブDNAの合成及び精製 PCR法により特定領域のDNA配列を増幅させるには、そ
の領域の５′末端より約20塩基のセンス配列、及び３′
末端より約20塩基のアンチセンス配列のオリゴヌクレオ
チド プライマーDNAが必要である。また、HBV DNAをハ
イブリダイゼーション法により同定するためには、オリ
ゴヌクレオチド プローブDNAが必要である。前記表
２、表３で示したプライマーDNA、及びプローブDNAを、
アプライド バイオシステムズ社のDNA合成機を用いて
合成し、脱保護の後、イオン交換HPLC（TSKゲル、DEAE
−2SWカラム）で精製し、セプーパク（Sep−pak）C18
（ウォーターズ社）で脱塩し、各DNA約50μｇを得た。
（１−３）HBV S領域のPCR法による増幅 Ｂ型慢性活動性肝炎患者５例の肝生検による肝組織よ
り、（１−１）に記載のように調製したDNA0.5μｇを0.
5ml用チューブ（バイオビック社）に採り、95℃で10分
間加熱処理した後、ジーン アンプ TMキット（Gene A
mp TM kit）（パーキン・エルマー・シータス社）中の1
0μの10倍濃度増幅用バッファー〔100mMトリス−HC
l、pH8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.1％（w/v）ゼラ
チン〕、16μの1,25mM dNTP混合液（dATP、dGTP、dCT
P、dTTP）、1mlの100μM P1プライマー、１μの100μ
M P2プライマー、0.5μの2.5ユニット／μタックポ
リメラーゼを加え、更に滅菌水を加えて、100μの溶
液にした。
り、（１−１）に記載のように調製したDNA0.5μｇを0.
5ml用チューブ（バイオビック社）に採り、95℃で10分
間加熱処理した後、ジーン アンプ TMキット（Gene A
mp TM kit）（パーキン・エルマー・シータス社）中の1
0μの10倍濃度増幅用バッファー〔100mMトリス−HC
l、pH8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.1％（w/v）ゼラ
チン〕、16μの1,25mM dNTP混合液（dATP、dGTP、dCT
P、dTTP）、1mlの100μM P1プライマー、１μの100μ
M P2プライマー、0.5μの2.5ユニット／μタックポ
リメラーゼを加え、更に滅菌水を加えて、100μの溶
液にした。
この反応液に100μのミネラルオイル（シグマ社）
を重層した後、自動遺伝子増幅装置サーマル・サイクラ
ー（パーキング・エルマー・シータス社）により増幅反
応を行った。反応条件は、94℃で１分間（変性）→55℃
で２分間（プライマーのアニーリング）→72℃で３分間
（合成反応）のサイクルを、25サイクル行った。
を重層した後、自動遺伝子増幅装置サーマル・サイクラ
ー（パーキング・エルマー・シータス社）により増幅反
応を行った。反応条件は、94℃で１分間（変性）→55℃
で２分間（プライマーのアニーリング）→72℃で３分間
（合成反応）のサイクルを、25サイクル行った。
反応後、上層のミネラルオイルを除去した後、反応液
の10μを採り、３％ヌッシーブ（Nussieve）GTG ア
ガロース・１％シーケム（Sea−Kem）アガロース（FMC
社）ゲル電気泳動を行い、エチジウム ブロマイドでDN
Aを染色し、増幅されたDNAを確認した。各サンプルにお
いて432bpのバンドを確認した。
の10μを採り、３％ヌッシーブ（Nussieve）GTG ア
ガロース・１％シーケム（Sea−Kem）アガロース（FMC
社）ゲル電気泳動を行い、エチジウム ブロマイドでDN
Aを染色し、増幅されたDNAを確認した。各サンプルにお
いて432bpのバンドを確認した。
（１−４）HBV領域（表１）を用いたHBV DNAの検出感度
の検定 領域（表１）を用いて、HBV DNAの検出限界をクロー
ン化されたHBV DNAフラグメント（3.2kb）を用いたモデ
ル実験系を造り検定した。
の検定 領域（表１）を用いて、HBV DNAの検出限界をクロー
ン化されたHBV DNAフラグメント（3.2kb）を用いたモデ
ル実験系を造り検定した。
ヒトの全ゲノムDNAの鎖長を３×109bpとして、HBV DN
Aフラグメント10コピー／ゲノムDNAとなるように、HBVD
NAフラグメントを健常なヒトの血液から通常の方法で得
たゲノムDNAにより希釈した。すなわち、106pgのHBV DN
Aフラグメントを10μｇの健常なゲノムDNAで10倍ずつ段
階的に希釈し、HBV DNAフラグメント10〜10-6コピー／
ゲノムDNAのモデル テンプレートDNAを調製した。
Aフラグメント10コピー／ゲノムDNAとなるように、HBVD
NAフラグメントを健常なヒトの血液から通常の方法で得
たゲノムDNAにより希釈した。すなわち、106pgのHBV DN
Aフラグメントを10μｇの健常なゲノムDNAで10倍ずつ段
階的に希釈し、HBV DNAフラグメント10〜10-6コピー／
ゲノムDNAのモデル テンプレートDNAを調製した。
この場合、10-6コピー／ゲノムDNAの１μｇは、HBV D
NA1分子分、約10-6pgに相当する。
NA1分子分、約10-6pgに相当する。
各モデル テンプレートDNA1μｇを用いて（１−３）
に示した方法で、領域（表１）を増幅させた。更に、通
常のドットハイブリダイゼーションを行った。
に示した方法で、領域（表１）を増幅させた。更に、通
常のドットハイブリダイゼーションを行った。
すなわち、領域（表１）を用いることにより、試料中
の１分子HBV DNA（10-6pg）を検出することができ、PCR
法の最高感度の検出を行うことができた。
の１分子HBV DNA（10-6pg）を検出することができ、PCR
法の最高感度の検出を行うことができた。
（１−５）サザンブロット法によるHBV DNAの確認 （１−３）で得たアガロースゲルを1.5M NaCl、0.5M
NaOHの変性溶液中に充分浸るように入れ、60分間放置し
た。
NaOHの変性溶液中に充分浸るように入れ、60分間放置し
た。
次に変性液を1.5M NaCl、0.5Mトリス−HCl、pH7.2の
中和溶液に変え、60分間放置した。ニトロセルロース
メンブランをブロットするゲルの大きさに合せて切り、
通常の毛細管現象によるサザンブロッティングを行っ
た。15時間後、ニトロセルロース メンブランを回収
し、真空下、80℃で２時間ベーキングを行い、ゲルから
トランスファーしたDNAをメンブランに固定させた。こ
のメンブランは、プレハイブリダイゼーション バッフ
ァー（５倍濃度デンハーツ液、５倍濃度SSPE、0.2％SD
S、200μg/mlサケ精子DNA）10ml中、65℃で４時間プレ
ハイブリダイゼーションを行った。
中和溶液に変え、60分間放置した。ニトロセルロース
メンブランをブロットするゲルの大きさに合せて切り、
通常の毛細管現象によるサザンブロッティングを行っ
た。15時間後、ニトロセルロース メンブランを回収
し、真空下、80℃で２時間ベーキングを行い、ゲルから
トランスファーしたDNAをメンブランに固定させた。こ
のメンブランは、プレハイブリダイゼーション バッフ
ァー（５倍濃度デンハーツ液、５倍濃度SSPE、0.2％SD
S、200μg/mlサケ精子DNA）10ml中、65℃で４時間プレ
ハイブリダイゼーションを行った。
次に、32Pにより５′末端をラベルにした前記表３記
載のプローブDNAを加え、60℃で15時間ハイブリダイゼ
ーションを行った。プローブの32P−ラベルはメガラベ
ル キット（MEGALABEL Kit）（宝酒造社）を用いて次
のように行った。
載のプローブDNAを加え、60℃で15時間ハイブリダイゼ
ーションを行った。プローブの32P−ラベルはメガラベ
ル キット（MEGALABEL Kit）（宝酒造社）を用いて次
のように行った。
10pmol/μのプローブDNA1μ、１μの10倍濃度
リン酸化バッファー、10μCi/μの〔γ−32P〕ATP
（アマーシャム社）５μ、10ユニットのT4−ポリヌク
レオチド キナーゼ１μを含む反応液に滅菌水２μ
を加えて10μにし、37℃で30分間反応させた。反応
後、95℃で５分間処理し、ハイブリダイゼーションに用
いた。
リン酸化バッファー、10μCi/μの〔γ−32P〕ATP
（アマーシャム社）５μ、10ユニットのT4−ポリヌク
レオチド キナーゼ１μを含む反応液に滅菌水２μ
を加えて10μにし、37℃で30分間反応させた。反応
後、95℃で５分間処理し、ハイブリダイゼーションに用
いた。
ハイブリダイゼーション後、メンブランを２倍濃度SS
PE、0.2％SDSを含む洗浄液１を用いて室温で５分間、更
に60℃で20分間洗浄し、続いて、0.2倍濃度SSPE、0.2％
SDSを含む洗浄液２を用いて60℃で20分間洗浄した。メ
ンブランは乾燥させた後、Ｘ線フィルム（富士フィルム
社）を入れたカセット内で−80℃、15時間感光させ、オ
ートラジオグラフをとった。
PE、0.2％SDSを含む洗浄液１を用いて室温で５分間、更
に60℃で20分間洗浄し、続いて、0.2倍濃度SSPE、0.2％
SDSを含む洗浄液２を用いて60℃で20分間洗浄した。メ
ンブランは乾燥させた後、Ｘ線フィルム（富士フィルム
社）を入れたカセット内で−80℃、15時間感光させ、オ
ートラジオグラフをとった。
サンプルすべてに432bpのところにバンドが現れた。
従来のサザンブロット法では、５例中４例が陰性であ
った（表４参照）。
った（表４参照）。
実施例２ HBV増幅・検出キットの作成 試料中のHBV DNAを増幅・検出するためのキットを作
成した。
成した。
DNA増幅用プライマーとして、P1、P2が各４μＭ溶液
となるようにTEバッファー100μに溶解し、HBVプライ
マー液（Ａ剤）とした。
となるようにTEバッファー100μに溶解し、HBVプライ
マー液（Ａ剤）とした。
DNA検出用プローブとして前記表３記載のプローブDNA
2μｇをTEバッファー20μに溶解し、HBVプローブ液
（Ｂ剤）とした。Ａ剤、Ｂ剤を一組としHBV増幅検出キ
ットとした（表５参照）。
2μｇをTEバッファー20μに溶解し、HBVプローブ液
（Ｂ剤）とした。Ａ剤、Ｂ剤を一組としHBV増幅検出キ
ットとした（表５参照）。
〔発明の効果〕 以上詳細に説明したように、本発明によりPCR法を用
いたHBV DNAの高感度検出に有効な領域〔Ｉ〕が明らか
になり、ヒトＢ型肝炎ウイルスの高感度検出方法及びキ
ットが提供された。
いたHBV DNAの高感度検出に有効な領域〔Ｉ〕が明らか
になり、ヒトＢ型肝炎ウイルスの高感度検出方法及びキ
ットが提供された。
Claims (3)
- 【請求項１】下記式I: で表される特定のDNA領域を、一対のオリゴヌクレオチ
ドプライマーを用いて増幅させることを特徴とするヒト
Ｂ型肝炎ウイルスの検出方法。 - 【請求項２】請求項１記載の特定のDNA領域を増幅させ
るためのプライマー対が、下記式II: で表されるプライマー対である請求項１記載の検出方
法。 - 【請求項３】請求項１記載の方法を用いて検出を行うた
めの検出キットであって、特定のDNA領域を増幅させる
ためのプライマー対、及び増幅されたDNAを検出するた
めのプローブを含有していることを特徴とするヒトＢ型
肝炎ウイルス検出キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17719789A JP2811321B2 (ja) | 1989-07-11 | 1989-07-11 | ヒトｂ型肝炎ウイルスの検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17719789A JP2811321B2 (ja) | 1989-07-11 | 1989-07-11 | ヒトｂ型肝炎ウイルスの検出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0343100A JPH0343100A (ja) | 1991-02-25 |
| JP2811321B2 true JP2811321B2 (ja) | 1998-10-15 |
Family
ID=16026878
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17719789A Expired - Fee Related JP2811321B2 (ja) | 1989-07-11 | 1989-07-11 | ヒトｂ型肝炎ウイルスの検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2811321B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2674253B1 (fr) * | 1991-03-19 | 1995-10-20 | Diagnostics Pasteur | Composition lyophilisee pour la multiplication de sequences d'acides nucleiques. |
| JP2000270876A (ja) * | 1999-03-26 | 2000-10-03 | Genome Science Laboratories Co Ltd | Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の変異検出方法および検出キット |
| SG90149A1 (en) * | 2000-07-18 | 2002-07-23 | Government Of The Republic Of | Diagnostic assay |
-
1989
- 1989-07-11 JP JP17719789A patent/JP2811321B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0343100A (ja) | 1991-02-25 |
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