SE460727B - Vektor innehaallande dna-sekvens kodande foer ett ytantigen hos hepatit b virus - Google Patents

Description

460 727 2 gering av viruset. Denna svårighet har redan delvis kringgåtts, mera speciellt vad beträffar serotypen 523. Hela DNA (cellupp- byggnad) från viruset har identifierats och klonats, speciellt i E. coli, efter en inledande insättning därav på den unika po- sitionen EcoRI av en vektor Agt.WES. AB, enligt tekniken av FRITSCH A., POURCEL C., CHARNAY P. et TIOLLAIS P. (1978) C.R.

Acad. de Paris, 287, 1 453-l 456).

Idag är sekvensen för polypeptiderna I och II desamma, varvid lokaliseringen i viral DNA i den sekvens, som kodar dessa peptider, inte har realiserats..

Syftet med uppfinningen är att åstadkomma en DNA-sekvens som är mycket kortare än den virala DNA i sig själv, innehållan- de den sekvens som är lämpad för kodning av den peptidsekvens som ger de immunogena egenskaper som, när den införes i organism- en till ett levande värddjur, möjliggör inducering av framställ- ning av det sistnämnda antikroppar med förmåga att så småningom skydda samma värddjur mot virala hepatit B-virus, speciellt när detta befinner sig i virulent tillstånd.

Uppfinningen härrör inte enbart från den fullständiga nu- kleotidanalysen av celluppbyggnaden av Dane-partikeln, vilken föreliggande uppfinnare har utfört, utan från den idé som de har haft för att identifiera den gen (i fortsättningen benämnd "gen_ SV) som kodar nämnda polypeptider, att undersöka i den sålunda förut fastlagda fullständiga nukleotidstrukturen efter cellupp- byggnaden av Dane-partikeln, av sekvenserna för de nukleotider, som uppvisar förmåga att koda de för dessa polypeptider kända proximala och terminala sekvenserna.

Det är känt, att Peterson och medarbetare har rapporterat, speciellt i de ovan omtalade artiklarna, att den proximala se- kvensen (första N-terminala amínosyra) för de 15 första amino- syrorna i princip analyserades enligt följande: met glu asn íle thr ser gly phe leu gly pro leu leu val ser och att den terminala sekvensen för samma polypeptider (sista C-terminala aminosyra) var följande: “ val tyr'ile.

Figur 1 visar en schematisk bild av celluppbyggnaden för Dane-partikeln. Denna omfattar två trådar, fibrer eller strängar bl och bz, varvid den kortaste av dessa (bz) normalt är blottad i den del som representeras av en streckad linje på ritningen. 10 15 20 25 30 35 3 460 727 Det är känt, att denna DNA innefattar enbart ett säte EcoRI.

Pilen fl anger riktningen för numreringen av de nukleotider, av vilka den längsta tråden bl består, och pilen fz anger rikt- ningen för transkriptionen av viruset DNA, speciellt av cell- maskineriet för de celler, i vilka hepatit B-viruset intränger, vilket uttrycket gen S har avseende på.

Sätet eller stället BcoRI kan sålunda numreras 0 eller,som man nu har bestämt på ett mera exakt sätt för hepatit B-virus tillhörande serotyp 323, 3182.

Den heldragna inre cirkeln E ger skalan i procent för längden av DNA och gör det möjligt att precisera positionerna för vissa av dess delar.

Siffrorna 3', 5'och~S', 3' i den inre delen av bilden gäl- ler de terminala ändar som är bärare av samma siffror i de kon- ventionella bilderna av ändarna av nukleinsyrakedjor.

Enligt uppfinningen har det visats att "gen S" i huvudsak utgjorde det längsta fragmentet av tråden bl beläget mellan po- sitionerna 73,6 och 95,1 i den schematiska bilden visad i figur 1. Förkortningarna "Start" och "Stop" visar punkterna för början och slutet av transkriptionen av "gen S".

Figurerna 2A, 2B och ZC är representativa för den termina- la delen av nämnda celluppbyggnad, belägen speciellt mellan po- sitionerna 60,4 och 100 (i procent av längden av DNA). Var och en av bokstäverna i figur 2 motsvarar på konventionellt sätt nå- gon av de fyra nukleotider som utgör basen för DNA: A: Adenin G: Guanin T: Thymin C: Cytosin De nedre linjerna i varje par av linjer, varav figurerna ZA, 2B och 2C består, motsvarar den nukleinsyra som svarar mot nukleotidkedjan bz.

Den analysteknik som har använts för att fastlägga den mera detaljerade bild, som figurerna 2A, 2B och 2C visar, kommer kort- fattat att beskrivas nedan.

Karakteriseringen av nukleotidsekvensen för "gen S", så- som den gäller inom ramen för föreliggande uppfinning, och vars proximala ändar p "S" och terminala ändar t "S" anges i figurerna ZA, 2B och ZC, resulterar i ett konstaterande av att: 10 15 20 25 30 35 460 727 - de 14 första tripletterna (i riktningen för pilen fz) utgående från nukleotiden numrerad 3030 relativt den termi- nala änden EcoRI, uppvisar förmåga att koda respektive l4 första aminosyror i den proximala sekvensen för de 15 första aminosyror- na i nämnda polypeptider: - de 4 sista tripletterna GTA TAC ATT TAA som kan läsas på komplementkedjan bz till kedjan transkriberad bl motsvarar respektive 3 terminala aminosyror i nämnda polypeptider och ett slutkodon; - denna nukleotidsekvens (678 nukleotider) innefattar inte något.slutkodon, åtminstone om man godkänner den lektyr som anger att den första tripletten "läst" på DNA av cellmaski- neriet är AUG (motsvarande komplementtråden till ATG); - den fullständiga översättningen av den genetiska in- formation som börjar med det ursprungliga ATG-kodonet leder till en teoretisk polypeptid med 226 aminosyror och med en molekyl- vikt av 25 422 dalton.

Nukleotidstrukturen för "gen S" liksom polypeptidkedjan härrörande ftån översättningen av "gen S" visas i fïgurerna 3A, SB och 3C.

Dessa värden är helt och hållet överensstämmande med an- givna analysvärden, som härrör från den elektroforetiska rörlig-" heten hos polypeptid I i polyakrylamidgeler och som tidigare har beskrivits av de angivna författarna (referenserna 9-12 enligt den bibliografi som âterfinnes i slutet av föreliggande beskriv- ning). _ Den observerade skillnaden vid nivån för den femtonde ami- nosyran i den proximala peptidsekvensen för polypeptid I: leucin enligt figurerna ZA, ZB, 2C och SA, SB, SC omtalade ovan, och ej serin enligt vad nämnda författare har konstaterat, kan må- hända tillskrivas det faktum att dessa författare har arbetat med en annan genetisk variant än den som har varit föremål för föreliggande studium. Man kan konstatera, att skillnaden för öv- rigt kan anges som suhstitution av en enda nukleotid i triplet- ten "TTA" i "S-genen", som speciellt visas i figurerna ZA, 2B och 2C, och 3A, 3B, SC istället för "TCA", den ena av tripletter- na med förmåga att undergå translation till serínl- Uppfinningen avser sålunda mera speciellt en vektor enligt patentkraven 1-4 innehållande de nukleinsyrafragment som kan 10 15 20 25 30 35 40 460 727 skäras av från DNA i Dane-partikeln, varvid dessa fragment mera- speciellt utmärkes av att de innehåller den del av "S-genen" som uppvisar förmåga att koda den del av proteinet i virusets hölje som är ansvarig för de immunologiska egenskaperna hos hepatit B-virus.

Sålunda hänför sig uppfinningen till en vektor innehållande en nukleinsyra innefattande högst av storleksordningen 1000-1100 nukleotider, varvid den mera speciellt utmärkas av att den är lämpad, eller uppvisar förmåga, att koda en immunogen peptidsek- vens, som i sig självt kan inducera produktion in vivo av anti- kroppar, vilka är aktiva med avseende på hepatit B-virus, varvid fdenna peptidsekvens i huvudsak innehåller den i fig. 3A, 3B, 3C visade strukturen, eller vilken som helst annan peptidsekvens som uppvisar ekvivalenta immunogena egenskaper.

Uppfínningen hänför sig sålunda till en vektor för utveck- ling av nämnda nukleotidsekvens i en mikroorganism eller i eukariotceller med villkor att den genetiska sammanslagningen har àstadkommits under bevarande av fasen för läsning av "gen S".

De enligt uppfinningen använda nukleotidsekvenserna upp- visar i förhållande till varandra en föränderlighet-som, under dessas utvhuüng, leder till bildning av variantdeterminanter en- ligt undertypen av hepatit B-virus (undertyperna d, w, y, r, för grupp al- För den ena av den i fig. SA, SB, SC visade peptidsekven- serna kan man observera, att den första aminosyran i nämnda se- kvens: metionin, är N-terminal och att aminosyran i den motsatta ändenzisoleucin, är C-terminal. _ Uppfinningen avser dessutom mera speciellt den i fig 4A, 4B visade nukleotidsekvensen, som kodar peptidsekvensen såsom den framgår av fig. 5 eller vilken som helst analog peptidse- kvens uppvisande ekvivalenta ímmunogena egenskaper.

Med det ovan använda uttrycket "ekvivalent peptidsekvens" förstås varje peptidsekvens, i vilken vissa delar inte kan vara § exakt identiska med motsvarande delar i den i fig. 3A, SB, SC och 5 visade peptidsekvensen, varvid dessa variationer kan be- ro på lokala mutationer, som inte påverkar den generella immuno- gena karaktären hos proteinet, eller på strukturmodifikationer som beror på de olika serotyper, bland vilka proteinerna av i- frågavarande slag är benägna att uppträda (speciellt serumtyperna I ÉÉE» ÉÉI °ch ÉXI)° 10 15 20 25 30 35 460 727 6 Uppfinningen avser mera speciellt nukleotidsekvensen inne- hållande peptidsekvensen såsom den visas i fig. 6 eller vilken som helst analog peptidsekvens med ekvivalenta immunogena egenskaper.

Uppfinningen avser närmare bestämt följande peptidsekvenser: Alanin-Glutamin-Glycin-Treonin-Serin Treonin-Alanin-Glutamin-Glycin-Treonin-Serin Treonin-Treonin-Alanin-Glutamin-Glycin-Treonin-Serin I den första av de ovan angivna peptiderna är alaninänden N-terminal och serinänden C-terminal.

I den andra och tredje av de angivna peptiderna är treonin- änden N-terninal och urin-änden C-terninal.

Som exempel kan nämnas att man speciellt kan framställa pentapeptiden utgående från den C-terminala serinen, till vilken man kopplar treoninen medelst metoden av Castro beskriven i Tetra- hêdron Letters, 1975, nr 14, sid 1219-1222. Därefter kopplar man på aminosyrorna glycin, glutamin och alanin enligt metoden kallad repeterad blandanhydrid (metod rema) och beskriven av Beierman i Chemistry and Biology of Peptides, Ed. J. Meienhofer, Ann. Arbour Science Publ., Ann. Arb. Mich. 351 (1972). ' Pentapeptiden kan ge produkter som är resultatet av fixe- ring av pentapeptiden vid en större bärarmolekyl, speciellt av . polypeptid- eller proteintyp, kompositioner innehållande denna pentapeptid i fixeringsprodukter, speciellt tillsammans med en farmaceutiskt acceptabel bärare, och mera speciellt vacciner mot hepatit B. Dessa farmaceutiska bärare är på känt sätt lämpade för det valda administrationssättet, speciellt för den orala, parenterala eller rektala vägen eller medelst nebulisation genom slemhinnor, speciellt näsans.

Hexapeptíden och polypeptiden med sju aminosyror kan syn- tetiseras medelst kända metoder för peptidsyntes.

Dessa peptider är hållna för att vara det antigena sätet eller feaktionsstället i de ovan escalade polypeptiderna av större storlek och ansvariga för vaccineringsförmägan hos virushöljet (Journal of Biol. Stand. 1976, 1, 295-304, RAO och VYAS “Bio- chemícal Characterization of Hepatitis B Surface Antigen in Relation to Serologic Activity").

De DNA-fragment som uppvisar förmåga att koda produktionen av sådana pentapeptider, hexapeptider och polypeptider med sju aminosyror år: ' 10 15 20 25 30 35 7 460 727 - för pentapeptiden, speciellt polynukleotiden med formeln: S' GCT CAA GGA ACC TCT 3' 3' GGA GTT CCT TGG AGA 5' A - för hexapeptiden, speciellt polynukleotiden med formeln: S' ACT GCT CAA GGA ACC TCT 3' *3' TGA CGA GTT CCT TGG'AGA S' - för polypeptiden med sju aminosyror polynukleotiden med formeln: S' ACT ACT GCT.CAA GGA ACC TCT 3' 3' TGA TGA CGA GTT CCT TGG AGA 5' eller i vart och ett av dessa tre fall, den polynukleotid som är komplementår i förhållande till respektive av de föregående tre polynukleotiderna, eller varje_polynukleotid, i vilken var och en av tripletterna kan ersättas med varje analog triplett med förmåga att koda produktionen av samma aminosyra.

Nukleinsyran kan vidare karakteriseras av att den innefat- tar åtminstone en av de båda trådar som inbördes kompletterar varandra i en DNA-sekvens såsom representeras i fig. 4A, 4B (i vilka figurer siffrorna likaså motsvarar positionerna för de första nukleotiderna i vart och ett av de på varandra följande fragmenten av tio nukleotider representerade gentemot position EcoRI som ej visas i figuren: det är självklart att dessa tal inte stör nivån för karakteriseringen av nukleotidsekvensen av ifrågavarande slag). Detta DNA-fragment begränsas av två Hincll- -ställen.

Det torde sålunda observeras, att denna nukleotidsekvensl motsvarar den genetiska information vars translation leder till den i fig. 5 representerade peptidsekvensen.

På sedvanligt sätt möjliggör de ekvivalentatnukleotidsek- venserna med enkeltråd eller dubbla trådar, varav speciellt trå- den med den struktur som framgår av följden av nedre rader i fig. 4A, 4B, DNA med motsvarande dubbeltråd, eller motsvarande messenger-RNA, speciellt den som representeras av de komplemen- tära sammanlånkningarna av nukleotider som utgöres av de nedre linjerna av de olika par av linjer som finns i fig. 4A, 4B (rikt- ningen för pilen f2).. H På samma sätt ligger inom uppfinningens ram de nukleotid- kedjor som skiljer sig från de föregående genom vissa triplet- 10 15 20 ' 25 30 ss 460 727 8 ter eller små sekvenser av tripletter, under förutsättning att dessa nukleotidsekvenser fortfarande uppvisar förmåga att koda en polypeptid under bevarande av de immunogena aktiviteter som är karakteristiska för viralt hepatit-B-virus. Generellt rör det sig om kedjor av nukleotider som, om så erfordras, efter denature- ring av dubbelsträngad DNA för framställning av nukleinsyror med motsvarande enkelsträng fortfarande uppvisar förmåga att hybri- díseras över åtminstone cirka 90% av sin längd med en av DNA- -trådarna eller -strängarna i figurerna 4A, 4B.

Föredragna nukleinsyror är de som kan utskäras ur DNA från viral hepatit och som, när de har dubbla strängar, utmärkes av närvaro i den ena av sina ändar av en ytterände Hincll Hhal, AvaI eller EcoRI och pä sin andra kant av en ytterände AvaIII, HincII eller Hhal.

Positionerna för dessa olika ytterändar relativt sätet EcoRI är schematiskt ätergivna i fig, ZA, ZB, ZC.

Nukleinsyran är avsedd att införlivas i en vektor som till- låter expression därav i en bakterie och i eukariotceller speci- ellt i syfte att producera ett protein eller en peptid med för- måga att i organismen till en levande värdcell inducera produk- tion av antikroppar, vilka är aktiva mot viralt hepatit B-virus.

Proteinet eller peptiden härflrande från translationen av nukleo- tidsekvensen enligt uppfinningen kan användas som vaccinerings- medel eller som medel för användning inom diagnostiken.

Nukleinsyran kan likaså användas som sond eller detektor för att i blodprover eller serumprov påvisa närvaro av Dane-par- tikeln, HBs-antigen eller fragment av detta, etc, (medelst klas- sisk teknik för hybridisering DNA-DNA).

Andra utmärkande drag för uppfinningen kommer att fram- gå av den beskrivning som nu följer av metoder för analys, iden- tifiering och produktion av DNA-fragment enligt uppfinningen.

Härvid kommer naturligtvis att hänvisas till bifogade ritningar, för vilka gäller att figurerna redan har presenterats ovan. Siff- rorna inom parentes hänför sig till de bibliografiska referenser som återfinns i slutet av beskrivningen.

Uppfinningen hänför således till speciella vektorer, - som möjliggör expression av de ovan omtalade nukleotidsekvenser- na, speciellt i form av ett hybridprotein, i vilket ett protein- 10 15 20 25 30 35 9 460 727 fragment, som uppvisar den immunologiska karaktären för HBsAg, är anordnat nära eller kopplat till en bärarmolekyl som bibring- ar aggregatet immunogena eller immunoreaktiva egenskaper, med förmåga att inducera produktion av skyddande antikroppar med av- seende på viral infektion i organismen hos värdcellen, i vilken detta protein_tidigare har introducerats.

Speciellt avser uppfinningen en vektor - fag eller plas- mid - innehållande åtminstone en del laktosoperon, mera speciellt ,promotorn och Z-genen i denna operon, varvid denna vektor utmär- kes av att den är modifierad för insättning eller införsel, i fas, i ett lämpligt säte av Z-genen, såsom sätet EcoRI hos vilken som helst av DNA-fragmenten enligt huvudpatentet, spe- ciellt de som innehåller den största delen av "S-genen". Den hänför sig likaså till de av dessa modifierade vektorer, i vil- ka åtminstone en del av det DNA-fragment som kodar den största delen av B-galaktosidaset är ersatt med ett DNA-fragment med förmåga att koda för varje annan icke immunogen bärarmolekyl, eller vars eventuella immunologiska egenskaper, om sådana exi- sterar, inte stör egenskaperna för den peptiddel som uppvisar de immunologiska egenskaperna för HBsAg, till exempel i huvudsak den som utbreder sig i läsriktningen utgående från dess säte HhaI.

Uppfinningen möjliggör framställning av ett hybridpro- tein, som utmärkes av att det innehåller en polypeptidsekvens uppvisande de specifika immunologiska egenskaperna för HBsAg, nära en polypeptidsekvens, vilken utgöres av huvuddelen av B-galaktosidase, som spelar rollen som proteinbärare.

Härmed avses emellertid inte enbart denna speciella I hybridmolekyl, vars väsentliga roll är att utgöra en modell av ett protein konstruerat enligt genetisk fackmannateknik och upp- visande immunogena och immunoreaktiva egenskaper, vilka är ka- rakteristiska för antigenet HBsAg, utan även vilket som helst annat hybridprotein, i vilket hela eller en del av dess B~ga- laktosidasparti kan ersättas med vilken som helst annan icke immunogen bärarmolekyl, eller vars eventuella immunologiska egen- skaper, om sådana existerar, inte stör egenskaperna för den pep- tïddel som uppvisar de immunologiska egenskaperna för HBsAg.

.Andra kännetecken för uppfinningen kommer att framgå av nedanstående beskrivning av föredragna utföringsexempel i kom-« bination med ritningarna, på vilka: l0 460 727 10 - figurerna la och lh schematiskt illustrerar de successiva stegen för framställning av en vektor av plasmidtyp under,inför- livande av ett fragment av HBV DNA, _ - figurerna 2a och Zc schematiskt illustrerar de ursprung- liga strukturerna för den använda vektorn (figur Za) den slutli- gen erhållna modifierade vektorn (figur Zb) och den för det hy- bridprotein som blir resultatet av expression av denna modifie- rade vektor i E.coli (figur 2c).

A NUKLEOTIDSEKVENSER Använda produkter och metoder _ - Aflxäada sflzvmßz ack äeaiäka nfadskse: De använda restriktionsenzymerna: BamHI, Hhal, Hincll, Haern, xbaI, Mbox, áinfl, apan, xbox, ar de som tillverkas av Biolabs. Man använder DNA-polymeras I från Boehringer. Det alkaliska bakteriefosfataset och polynukleotid-kínaset erhölls från P.L. Biochemicals. De kemiska medlen var följande: Dimetylsulfat (Aldrich) Hydrazin (Eastman Kodak) Akrylamid och bis-akrylamid (kristalliserad två gånger - SERVA) Dideoxinukleotidtrifosfater och deoxinukleotidtrifostater (P.L. Biochemicals), Piperidin (Merck) omdestillerad under vakuum" ' fïšmštšllninfi åV_DÉ^.H§VQ Hela HBV-gencelluppbyggnaden (undertyp avg) klonades i E. coli under utnyttjande av det unika restriktionssätet EcoRI för vektorn Ägt.WES. ÄB (14). Denna klonade DNA benämnes i fort- sättningen"Eco HBV DNA".

Rekombinantbakteriofagen utvecklades i Petriskål på agar och erhållen DNA utvanns på känt sätt. Efter digestion av DNA med restriktionsenzymet EcoRI renades sekvensen Eco HBV DNA ge- nom ultracentrifugering, i en sukrosgradient, enligt tekniken beskriven i de bibliografiska referenserna (16, 17).

- .Efemäflšllflins av_1>!!^;f:asmsfl1 aäzkzfl_fi.ísfv_ 10 till 20 pikomol av Eco HBV DNA hydrolyserades fullstän- digt av de olika restriktionsenzymerna, under de betingelser som rekommenderas av fabrikanten. DNA-fragmenten defosforylerades med alkaliskt fosfatas, vilket sedan inaktiverades genom en alka- libehandling. DNA utfälldes sedan i etanol, enligt den teknik 10 15 20 25 30 11 460 727 som beskrivs i artikel (18). Efter återupplösning i en buffert (baserad på spermidin märktes DNA i sina ytterändar 5' med en ATP Anp] (soon ci/mu tillverkad av New ßngiend Nuclear) een med polynukleotid-kinas (enligt tekniken beskriven i artikel (19).

Restriktionsfragmenten av DNA separerades genom elektro- fores på polyakrylamidgel och eluerades därefter. De märkta ytterändarna avsöndrades genom elektrofores på polyakrylamid- gel på i och för sig känt sätt, efter restriktion med ett annat enzym eller genom denaturering av DNA-fragmenten av ifrågavaran- de slag.

- Bestämning av strukturen för nukleotidsekvenserna i DNA Primärstrukturen för fragmenten av DNA med dubbelsträng eller enkelsträng bestämdes i huvudsak medelst tekniken beskri- ven av Maxam och Gilbert (19). Vidare användes metoden med ter- minala kedjeinhibitorer beskriven av Sanger'et al (20) och till- lämpad av Maat och Smith (21), vad beträffar de dubbelšträngade' fragmenten märkta i en av sina ytterändar S”.

Produkterna av den kemiska och enzymatiska reaktionen ana- lyserades genom elektrofores i geler med akrylamidsekvens med 8, 16 eller 25 $, med 1 mm tjocklek.

Metoder för och resultat av analysen I syfte att bestämma om genuppbyggnaden HBV uppvisar för- måga att koda polypeptiderna I och II märktes samtliga fragment HaeIII (restriktionssäten HaeIII för celluppbyggnaden HBV visa- de i fig. 1 med små pilar) i sina ytterändar 5”. Väsentliga de- lar av deras primärstrukturer bestämdes medelst metoden av Maxam och Gilbert. Nukleotidsekvenserna med förmåga att koda de proxi- mala och terminala aminosyrasekvenserna för polypeptiderna I och II lokaliserades i fragmenten HaeIII E och Haelll F, tidigare lokaliserade på restriktionsbilden för celluppbyggnaden HBV (enligt tekniken beskriven i referensen (17). Det är dessa nu- kleotidsekvenser som man har ansett utgöra ytterändarna av "gen S", som i sig själva upptar positionerna 73,6 och 95,1 gentemot restriktionssätet EcoRI (fig. 1) av redan angivna skäl.

Sekvensen av nukleotider mellan dessa båda positioner ana- lyserades under användning av kända kemiska metoder, speciellt med hjälp av metoden med kemisk nedbrytning med hydrazindimetyl- sulfat och metoden för kedjeterminering. Bland de olika kemiska 10 15 20 zs 30 35 460 727 U reaktioner som har föreslagits av Maxam och Gilbert utvaldes en partiell rening med myrsyra och spjälkning med piperidin, vilket är metoder som ger band med lika stark intensitet på autoradiogram för de fragment som avslutas av en guanin och en adenin. Likaså användes reaktionerna med hydrazin följda av spaltning med piperidin, för erhållande av band med lika stor intensitet, för nukleotiderna cytosin och tymidin: den elektroforetiska fraktioneringen av produkterna från dessa bada reaktioner ger för samtliga baser en fläck i den ena el- ler den andra av de använda gelkolonnerna. Denna procedur underlättar läsningen a; gelautoradiogrammet. Den hydrazin- reaktion i närvaro av natriumklorid som är specifik för cyto- sín gör det möjligt att skilja denna nukleotid från tymídin och reaktionen med dimetylsulfat följd av spjälkníng av det specifika piperidinet för guanin gör det möjligt att skilja sistnämnda nukleotid fràn adenin.

För att man skall försäkra sig om största möjliga grad av precision framställdes distinkta sekvenser av nukleotíder bildande olika fragment, som inbördes överlappar varandra, genom hydrolys av Eco HBV DNA medelst olika restriktions- enzymer: Bamhi, Hinfl, Hpall, HaeIII och HincII.

Pâ detta sätt bekräftades analysen av var och en av de restriktionssäten som användes som utgångspunkter för de första studerade fragmenten medelst analys av distinkta frag- ment, i vilka restriktionssätena för de första fragmenten be- fann sig mellan de nya ytterändarna av dessa distinkta frag- ment; "gen S" visad_i fig. 3A, 3B, 3C, vilken börjar med initieringskodonet ATG innefattar 227 tripletter, varav ett slutkodon TAA. De tre kodoner, som svarar mot de tre amino- syrorna í den terminala karboxíänden av motsvarande polypep- tid, är belägna inom samma läsomráde eller -ram, omedelbart före slutkodonet TAA. Den ena av de båda andra läsområdena (borttagna från det föregående med 1 resp. 2 nukleotider) är likaså utblottad pà slutkodon men kodar ett helt och hållet annorlunda protein av ovannämnda polypeptider I och II. Det tredje läsomràdet innefattar 10 slutkodoner (5 TAG, 4 TGA, 1 TAA). I den andra DNA-strängen befinner sig de tre läsom- 10 15 20 25 30 35 13 460 727 rådena stängda av respektive ll, ll och 6 stoppkodoner för- delade längs DNA-sekvensen.

Såsom redan har angivits ovan leder den fullständiga translationen av den genetiska information som börjar med initieringskodonet ATG till en teoretisk polypeptid med 226 aminosyror, vilket motsvarar en molekylvikt av 25 422 dalton.

Det bör betonas, att nukleotidfrekvensen motsvarande "gen S" normalt borde läsas helt och hållet under transla- tionen.

Inom uppfinningens ram ligger även nukleotidkedjor av den ovan beskrivna typen "gen S", vilken omfattar små komplet- terande sekvenser, vilka kan innehålla upp till ett hundratal nukleotider eller vilka tvärtom kan vara utarmade därpå, utan att motsvarande genetiska information förändras (22, 23).

' De olika fragment av uppfinningen som har definierats ovan kan erhållas utgående från DNA-frekvensen benämnd Eco HBV DNA, under utnyttjande av motsvarande restriktionsenzymet och av fraktioneringsmetoder kända för DNA-fragment, speciellt på en polyakrylamidgel och under utnyttjandezmt de migrerar eller vandrar vissa avstånd, som är funktioner av deras mole- kylvikt. Sålunda kan man t.ex. erhålla det fragment, vars ena ytterände är begränsad av ett säte EcoRI och vars andra är be- gränsad av ett säte AvaIII under utnyttjande av en restriktion Eco HBV DNA med enzymet AvaIII, varvid det sökta fragmentet består i det minsta erhållna fragmentet (ett enda säte AvaIII i Eco HBV DNA).

Det fragment, som avgränsas av de motsatta ytterändarna EcoRI och Hhal, erhålles genom att man först utför hydrolys av Eco HBV DNA med EcoRI och därefter utför partiell hydrolys med restriktionsenzymet Hhal. Man utvinner därvid bland ro- striktionsprodukterna den som innehåller sätet av AvaIII.

Dessa restriktionsmetoder har naturligtvis enbart beskri- vits i exemplifierande syfte, då det är uppenbart att fack- mannen på området är i stånd att bestämma ordningsföljden för behandlingen med restriktionsenzymerna för isolering, speci- ellt utgående frán Eco HBV DNA, av de fragment som har de an- vända restriktionsytterändarna.

Det kan tilläggas att för alla använda tillämpningar dessa restriktionsoperationer kan utföras i en 10 mM Tris- 10 15 20 25 30 35 460 727 14 -buffert; pH 7,8; MgCl 2 6 mM; B-merkaptoetanol 6 mM, varvid samma medium dessutom och företrädesvis innehåller S0 mM NaCl, när EcoRI användes.

Såsom redan har omtalats, avser uppfinningen användning av de beskrivna DNA-fragmenten som reagens, vilka möjliggör diagnostik av närvaro i ett serum av Dane-partiklar eller partiklar härledda därifrån, uppburna av en DNA med förmåga att koda ett immunogent protein som är karakteristiskt för hepatit B.

Ifrågavarande DNA enligt uppfinningen kan likaså inför- livas i en vektor, vilken tillåter, under förutsättning att införlivandet har åstadkommits i fas, expression av denna DNA i en bakterie eller annan mikroorganism eller i eucaryot-' celler.

B - VEKTORBR INNEHALLANDE EN NUKLEOTIDSEKVENS AV ANTIGENBT HBS___; Konstruktion av en bakteriofag som rekombinerar Ålak HBs-1 Produkterna för nivån för de olika stegen i denna kon- struktion åskådliggörs i fig. la och lh. De är likaså angivna med beteckningarna la till lh.

I fig. la har positionerna restriktionsenzymsäten angivits.

Efter behandling av DNA + HBV med restriktionsenzymet Hhal separerar man ett fragment av DNA (lb) innehållande 1 084 par baser, och mera speciellt hela "gen S", genom elektro- fores med en agarosgel och elektroeluering (fig. lb). Man fram- ställer utgående från detta underfragment, som i förväg har behandlats med endonukleaset S1, ett underfragment (lc) (fig. lc), som härrör från förlängning av underfragmentet (lb) i dess ytterändar med DNA-element betecknade "EcoRI för "gen S" och för vissa -linkers" med formeln: S' GGAATTCC CCTTAAGG 3' Det erhållna fragmentet klonas, efter bildning av de ko- hesiva ytterändarna EcoRI, i plasmiden pBR322.

Den erhållna plasmiden, vilken nedan benämnes pBRHBs (fig. ld) innehåller ett enda restriktionssäte Xbal beläget i närheten av huvudet av "gen S".

Genom sönderdelning av den rekombinerànß plasmiden 10 15 20 25 30 35 15 460 727 pBRHBs med en blandning av enzymer EcoRI och Xbal produceras ett DNA-fragment innehållande approximativt 980 baspar och omfattande huvuddelen av "gen S" (fig. le). Detta fragment av- 'skiljes och renas genom elektrofores över en agarosgel. Det erhållna fragmentet behandlas pà nytt med endonukleaset S1 och förses därefter på nytt med ytterändar EcoRI med hjälp av nämnda "EcoRI linkers" och utsättes sedan för en behandling med endonukleaset EcoRI för áterbildning av motsvarande ko- hesiva ytterändar. Fragmentet i fig. le, vilket innefattar ca 980 baspar, injiceras sedan genom smältning in vitro i sätet EcoRI i plasmiden pBR322, till bildning av plasmiden pXbaHBs (fig. lf). Denna plasmid klonas pá vanligt sätt såsom plasmi- den pBR322.

Ett flertal kloner har erhållits.

Man extraherar och renar, efter behandling med EcoRI av DNA för tre av dessa kloner, pXbaHBs-1, pXbaHBs-1, pXbaHBs-3 (fig. lg), de fragment som nedan kommer att benämnas "HBS-fragment" (fig. lh).

Nukleotidsekvenserna för ytterändarna av dessa fragment (som normalt erhålles i det inre av "S-genen") bestämmes under användning av proceduren beskriven av MAXAM och GILBERT (Proc.

Nar. Acad. sci. usA lg, 560-564 (1977). Dessa beszämningar har visat, att nukleotidsekvenserna i de terminala ändarna, svarande mot "S-genen", inte var identiska i de tre klonerna (fig. lg), varvid skillnaderna sannolikt beror pà heterogeni- teter bildade under digestionen med endonukleas Sl.

De båda fragment, som härrör från pXbaHBs-1 och pXbaBHs-2, injiceras genom smältning in vitro i celluppbygg- naden av bakteriofagen Äplac S-1 (21), vilken enbart har ett enda säte EcoRI beläget i närheten av ytteränden av lak Z- -genen. Vad beträffar läsningen av genen lak Z, såsom den kan härledas från sekvensen av aminosyror i B-galaktosidas (23), kan man konstatera - vilket även erfarenheten bekräftar - att införandet av fragmentet H85 från pXbaHBs-l i sätet EcoRI i genen lak Z från Aplac 5-1 bör leda till att läsningsfasen bi- behalles adekvat för "gen S". I motsats därtill skulle det komma att visa sig att ett införande av fragmentet HBs från pXbaHBs-2 inte kunde ske i föregående vektor under bíbevarande av lämplig läsning. Det har icke desto mindre använts som 10 15 20 25 30 35 16 460 727 bevis vid tidigare utförda försök.

Dessa operationer utfördes under användning av konven- tionella metoder. Mera speciellt gäller att "HBs-fragmenten" från pXbaHBs-1, pXbaHBs-2 infördes med hjälp av ett ligas i DNA på lplac 5-1 som tidigare hade utsatts för klyvning med EcoRI. De erhållna blandningarna av DNA-fragmenten användes därefter för transfektering av stammen C600RecBC rk'mk' av E. coli. De bakteriekloner som bildade lak- som ett resultat av införandet av HBs-fragmenten i sätena EcoRI av genen lakZ förökades och renades enligt metoden beskriven í (21).

DNA från de olika bakteriofagerna utvanns och oriente- ringarna för de införda DNA-fragmenten bestämdes genom elektro- foretisk analys av deras restriktionsfragment BamHI. Man kunde därvid konstatera, att två fager benämnda Å-lakHBs-1 och A1akHBs-2 svarande mot plasmiden pXbaHBs-1 och pXbaHBs-2 inne- höll ett korrekt orienterat HBs-fragment.

Fíg. Za är en schematisk bild av vektorn Äplac 5-l före dess modifiering med fragmentet HBs-1 härrörande från pXbaHBs-1.

Pig. 2 är en schematisk bild av en del av samma vektor visande den modifikation som har introducerats i dess gen Z genom injicering i dess säte EcoRI av nämnda fragment HBs-1.

Fig. Zc visar schematiskt strukturerna för den erhållna hybridpolypeptiden som ett resultat av expressionen av den en- ligt fig. 2b modifierade vektorn.

Expressionen erhölls genom transfektion av en bakterie- stam frän E. coli, speciellt en stam HfrA1akX74.

Stammar av E. coli, speciellt en stam av E. coli HfrAlakX74 omvandlades av plac 5-1, ÅlakHBs-1 respektive AlakHBs-2. Efter odling utsattes cellerna för lysis och er- hållna lysat analyserades genom elektrofores med en polyakryl- amidgel SDS (24), och proteinerna detekterades genom blàfärg- ning med coomassie. Man konstaterar närvaro av ett intensivare band bland expressionsprodukterna för Äplac 5-1 vid nivån för motsvarande position, för ett jämförelseprov, till den som gäl- ler för ß-galaktosidas (molekylvikt 116 248) och ett distinkt band bland expressionsprodukterna för AlakHBs-l (ej närvarande bland expressionsprodukterna för AlakHBs-2), vilket motsvarar ett nytt protein med en molekylvikt av storleksordningen 135 000-141 000. 10 15 20 ZS 30 35 460 727 Proteinerna syntetiserade av bakterierna transfekterade såväl av Alakflßs-l som av Aplac S-1 märkes med metionin (358). När dessa proteiner bringas i kontakt med ett anti- --HBsAg-serum och ett autoradiogram utföres på en polyakryl- amidgel SDS, kan man bland expressionsprodukterna enbart för AlakHBs-1 konstatera närvaro av ett band, vilket inte motsva- ras av nágot ekvivalent band bland expressionsprodukterna för de övriga vektorerna. Detta band försvinner på ett specifikt sätt när immunoutfällningen åstadkommes i närvaro av icke märkt HBsAg. Man observerar vidare samma band bland expressions- produkterna för ÅlakHBs-l, när immunoutfällningen utföres med ett antiserum med avseende på 8-galaktosidas.

Den antagna strukturen för den del av det erhållna hybrid- proteinet som ligger vid stället för sammansmältning mellan genen lakZ och fragmentet HBs-l framgår av fig. Zc, som visar fragmentet "B-gal", vilket motsvarar B-galaktosidas (1005 aminosyror), fragmentet HBsAg (192 aminosyror), varvid dessa fragment är separerade medelst en aminosyra prolin, som mot- svarar en del av "EcoRI linker" ingående i vektorn ÅlakHBs-l.

C - FORFARANDE FOR FRAMSTÃLLNING AV EN IMMUNOGEN MOLEKYL UNDER ANVÄNDNING AV VEKTORN ENLIGT UPPFINNINGEN Enligt uppfinningen är det sålunda möjligt att framställa ett protein med lägre molekylvikt än för de ovan omtalade po- lypeptiderna I eller II, och med samma immunogena egenskaper.

Resultaten visar att E. coli, eller vilken som helst annan lämplig mikroorganism, såsom en bakterie eller en kultur av eukaryotceller, kan infekteras med AlakHBs-l och syntetise- ra ett protein med en molekylvikt av storleksordningen 138 000 samt uppvisande de antigena determinanterna för på samma gång HBsAg som B-galaktosidas. Denna molekyl är representativ för de hybridpolypeptider som kan erhållas medelst förfarandet en- ligt uppfinningen, i vilka HBsAg är bunden till en protein- bärare (härrörande från partiell eller total substitution av fragmentet B-galaktosidas), varvid dessa hybrider icke desto mindre uppvisar de antigena egenskaperna för HBsAg. Dessa nya molekyler är användbara för produktion av vacciner, vilka är aktiva mot viral hepatit B.

Såsom torde vara uppenbart, och såsom framgår av vad som redan har beskrivits ovan, är uppfinningen icke begränsad 460 727 18 enbart till de appliceringsaätt och utföringsformer som har beskrivits mera i detalj; den innefattar tvärt om alla tänkbara varianter därav. g Som bilaga till föreliggande beskrivning följer nu en bibliografi och speciellt de referenser som har omtalats inom ramen för föreliggande uppfinning. 10 15 A20 ZS 30 35 10 11 12 13 14 15 460 727 REFERENSER Blumberg. B. S. (1977) Science 197, 17-25 'Dane D. S.. Cameron C. H., and Brigss M. (1970) . Burrell C. J., 19 Lanaec 1, 695-698 who Technical Report series, number 602 (1976) Summers J., 0'Conne1 A., and Millman I. (1975) Proc.

Nat. Acad. Sci. USA 12, 4 597-4 601 Hruska J. F., Clayton D. A., Rubenstein J. L. R. and Robinson w. s. (1917) J. viral. g¿, ses-saz i ( | I Landers T. A., Greenberg ä. B. and Robinson W. S. (1977) J. Virol. 11, 368-376 Charnay P., Pourcel C., Louise A., Fritsch A. and Tiollais P. (1979) Proc. Nat. Acad. Sci. USA. lg 2 222-2 226 Dreesman G. R., Hollinger P. 8., Surians J. R., Fujioka R. B., Brunschwig J. P. and Melnick J. L. (1972) J. Virol. lg, 469-476 Gerin J. L. (1974) in Mecanisms of virus disease Ed. W. S. Robinson. C. R. Fox pp 215-24 Menlo Park ' W. A. Benjamin Suarez M., Hollinger F. B. (1975) J. Virol. 1§, Dreesman G. R., Chairez R., Courtney R. J. and Melnick J. L. 508-515 Shih J. W. and Gerin J. L. (1977) J. Virol. gl. § 1 219-1 222 § Peterson D. L., Roberts I. M. and Vyas G. N. (1977) - Ä Proc. Nat. Acad. Sci. USA 11. 1 530-1 S34 Peterson D. L., Chien D. Y., Vyas G. N., Nitecki D. and Bond H. (1978) in Viral Hepatitis, Ed. G. vyas.

S. Cohen and R. Schmid, The Franklin Institute Press, Philadelphia, S69-573 Fritsch A., Pourcel C., Charnay P. and Tiollais P. (1978) C. R. Acad. Sc. Paris ggl, 1 453-1 456 Mackay P., Greenaway P. J.. (1979) Nature 279 E Hofschneider P. H. and Murray K. 43-47- 460 727 20 16 - Tiollais P., Perricaudet M., Pettersson U. and philipsan L. (1916) cène ¿, 49-63 § 17 - Hérissé J., Courtois G., and Galibert F.'(1978) cène.¿, 279~294 5 18 - Kroeker W. D. and Laskowski M. S. R. (1977) Anal.

Biochem._1g, 63-72 ' 19 - Maxam A. M. and Gilbert W. (1977) Proc. Nat. Acad. sei. usA 15; sso-ss4 20 - Sanger F.. Nicklen S. and Eoulson A. R. (1977) Prøc. 10 Nat. Acad. Sci. USA 11. 5 463-5 467 _21 - Maa: J. and smith A. J. w. (1978) Mucleic Acid. nes.

A A §{ 4 ss?-4 545 '22 - Be;get S.§M.¿fÜncre C. and Sharp P. A. (1977) Proc. 7, R JMa:;,¿e¿d**sç¿¿;qsA.1¿._3 171-3 115 "l5~§23 -Chow L. T.. GëffnasfRÄÜÉ., B:oRer T. R., and Roberts J.

Jn¿f1 ¶¿(1977)/fc¿1i*¿g;V1fs '*24 Ä Shiraishi H., Kbhama T.,'Shirachi R. and Ishida N. 1 ï(1971) J. een. virox. gg, 201-21o : ,.“25 - Struck D. K., Lennarz W. J., and Brew K. (1978) J. '29y .“ai°1.'chem. gg;, s vas-s 794 'ÜÄ3É6~-”Reddy~V. B., Thimmappaya.B., Dhar R., Subramanian K. N. ' * ..zg¿n73. s.. Pan J-, celma c.-L. and weissman s. M. §(;97s)¿§=¿eå;e§2Qg._494-soga} ¥Riei§§W.¿?Öón§šašas}R:;¿Ha:§eman G.. Roqiers R., Van ,fidaÉNoošda@Å.. Vansñénåerswyn H., Van Herreweqhe J., "=a:vo1=haç§:s«c.>and,ys¿b;erc*M. (;97a) Nacure g1;. , §11s¿i17fÜåÜ.f, _-f'Mf'.J ~~'.~ 7 ,, R ~ h_fi:Mq"“»_ hd fRïr¿G;;fl./åfiariéll B.íG.,ÄBrQWn'Nf.L.. Ooulson A. R., °ru¿aës áiïczf Hbcchison iir c. A.; siocombe P. M. and shut» M. .gue77fiM§çfig§f3g§i.§s1-6917 _ ¿ 7 ' RW=lkë1*;É..J-7'R*=._+ «JNQFßhFPP P- °~ dnd Fíddçš J 'CE¿(1978) 5§ççne@..$oc. 10 15 20 25 30 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 S1 52 4 Laskey R. A. and Mills A. D., Eur. J. Biochem. åá. 21 460 727 Galibert F.. Mandart E.. Fitoussi F.. Tiollais P. and Charnay P.. Nature 221. 646-650 (1979) Pasek M. et al.. Nature 282. S75-579 (1979) Williams E. W., Klaus G. G. B. and Bond. H. 1 114-1 118 (1972) Sanchez Y..

Vyas G. N., J. Immunol. 128.

Hollinger F. B., Dreesman G. R., Cabral G. and Melnick J. L., in Viral Hepatitis (Ed. Vyas G. N.

Cohen S. N. and Schmid R.) Franklin Institute.

Philadelphia, (1978) Purcell R. RL, and Gerin J. L., Am. J. Med. sei. glg, 395-399 (1975) Hilleman M. R. et al.. Am. J. Med. Sci. (1975) Maupas P., Coursaqet P..'Goudeau A. and Drucker J., Lancet 1. 1 367-1 370 (1976) Emtaqe J. S. et al., Nature ggå, 171-174 (1980) Itakura K. et al.. $cience 128, 1 056-1 063 (1977) 270. 401-404 Goeddel D. V. et al.. Prox. Nat. Acad. Sci. USA lg, '1os-110 (1979) Pourcel C., Marchal C.. Louise A., Fritsch A. and Tiollais P., Molec. Gen. Genet. 110, 161-169 (1979) Bolivar F. et al., Gene 2, 95-113 (1977) Fowler A. V. and Zabin I., Nat. Acad. sci. USA 11. 1 so7-1 510 (1977) Laemmli U. K., Nature 221, 680-685 Burqess R. R., J. Biol. Chem. 211.

Banner w. M. and Laskey R. A., Eur. 83-88 (1974) Prcc. (1970) 6 168-6 176 (1969) J. Biochem. iá. 335-341 (1975) Iwakura Y.. Ito K. and Ishihama A.. Molec. Gen. Genet. f låå. 1-23 (1974) Talwai G. P., et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 11, 218-222 (1976)

Claims (2)

1. PêéQfKZAZV “ 1 Vektor för omvandling av en míkroorganism, vilken vektor är modifierad medelst en DNA-insats härrörande från en klonad DNA, som i sin tur är erhàllen från en polymeras-repa- rerad DNA för ett hepatit B-virus, vilken vektor på känt sätt sammanställts och försetts med nämnda DNA-insats, k ä n n e - t e c k n a d av att nämnda insats består antingen av ett nukleín- syrafragment, som i sig självt ingår i följande nukleotíd- sekvens: . /VVIGGIIf/ILS. 1111021101 1930 - 1mwm 1000010100 11290 wmm1 0101000001 mm " 1010 110000111vv10 1000011110 2000 1000101001 1000101001 ' 2000 1 0111101111 - 0011101110 111101 001 ' 101111000 - 1010110110 I 1010110110 1110001010 2110 ~_ I, 0011101110 111110 1001 2170 2120 - CGGCÅGUVVI ACCUWNIEA _ ' -CCCGTCGTIT TGGGUTICT 2230 22110 V IMTNSGNB ITTTCTNVIA- 1111100110 1101011111 I 2290 2100 . 1050 1900 0110010001 1 00101110 0110010101 00101110 ' 2010 2020 0101011000 1010100100 1101011000 1010100100 I 2070 2080 0111101111100 001101111101 0101011100 0011011101 2130 1101vv10001 1011000100 1101110001 1011000100 i 2190 2200 CCCACMTIC ITGAMTAC GGGTGTTNW TGTATG 2250 2260 UITTCITIGII I I I I I IGTAT G IAAGNWIT ANVWÄMT/I 1 2310 2320 21110 1 1970 GCCCIIIGACC CGGGIACTGG " 2C-30_ ' 0001100000 0001100000 2000 100001101101 mmmun 21.00 11111001011 1111001011 2210 111001111101 111100111101 2270 0110101101 011101111101 ~ 2330 /ICCUITMM TCCMïG/IUI TNICCC/ITM ÅÅTITAGÅGA GTNICCCC/IT IGGGTATTGT MGTIACTGT AITGGGTATT TTAAATCTCT (AITGGGGTA 2350 I 2360 AMATCC 2111 . 21120 21170 /1-1-.1/'16101-'116 ITGTCACCCC 1115' 2 2370 2380 21130' - 211110 21110 21300 2390 _ TNWIGTATA CCCNVWÅCA MÅG/WVIIT GGTMCÅGCG ATITIICATAT GGGTTICTGT TITCITITM CEATTGTCGC 21150 0101101010 1100000001 1110010110 1110011 11111- 01011101010 11100000001 1110010110 1110011-1111 0101110001 _ 211111) ' 0111000011 0011011010. 11101111000 1011011110 1010001101 0111000011 0011001010 1101111000 10111011110 1010001001 7011) 1020 0100000100 1100000100 2010 0011000001 0011000001 2100 0101110001 0101110001 2100 10101111w10 1010111110 2220 ' 1110000101 1110000101 2200 1010000100 1010001100 2110 0101110111 0110111110vv1 2100 GTNVW1GGG ' CAITITTCCC 21160 CTGNVßCf/I 2021) W460 727 2530 GAAACEGGCT CTTTGCCCEA 2590 VÅATÅCAGGTG TTÅTGTCCAC 2650 TCCTTGAECA ÅGGAACTCBT 2710 ' AATTÅGAGGA TTÅATCTCCT 2770 GCATAGCAGC CGTÅTCGTCG 2830 AGGACAAGTT 7007077000 2890 GCCAAGACÅC CGGTTCTGTG 2950 CTGCGGTATT GACGCCATAA 3010 TIIIÅGGAÅT 0000700770 3070 GATTGACGAT CTAACTGCTA . 2500 0000000007 0700000700 2000 0007770007 0770000000 ' 2000 0700700700 0070007000 2720 0000000000 0777000007 2780' AGGATGAAGA TCCTACTTCT 2800 GGAGGACAAG CCTCCTGTTC 2900 'ACGGTÅBTTC 7000070000 2900 0700000770 0007007000 3020 0070070700 0000700007 m7 0000070000 7700070700 Hincl1(29ó3) 24 -\/*0 zsso 0000700000 0007070077 2010 0000000777 000000000 2070 0007000000 7000000007 . 2730 0007000770 7070700000 2700 0000007007 0077070070 2050 0007700700 7000000007 2010 0000700000 TGTTCTCCAT ACAAGAGGTA 3090 C^ßTAGTCA6 GTCÅTCAGTC ä pS 2560 TTTTCCAAA AAAAGGCTTT 2620 GGTÅCAGCAA CCATGTCETT 2680 ' TGGTCCCGTG AQCAGGGCAC 2740 ÄUÅGTCCAEA TATCAGGTCT 2800 AAAACGCCGC TTTTGCGGC6 2860 GTGATTGGAG CACTÅACCTC 2920 ATTGAGAGAA TAACTCTCTT 2980 GAAAAACCCC 7 CTTTTTGGGG 3000' GTT CA CAAGT T 3100 AACAGGGTTT TTGTCCCAÅÅ 2570 ' GCCCAGGATG CEGGTCC¶AC ' 2630 CAGGAGGGAT GTCCTCCCTÅ 2690 CTGGTTGTTG GACCAACAAC 2750 ÅGAÅCCAACA ~TCTTGGTTGT 2810 AGACACATCC TCTGTGTAGG 2870 GTTGGGGACT CAAßCCCTGA 2950 GTCCACCACG CAGGTGGTGC 2990 GCCTGTÅACA C6GACATTGT' 3050 0007000000 0000000077 3110' ÅCTGTTCCIG TGÅCÅNIVKI , Hha IÖOÉÖ) Åva 1( 3053) 2500 0700007000 7000070000 _2000 0007000007 7070707000 2700 0000700700 7007000000 2700 0000007000 TCTTCTÅCTC ' 2 2820 AGCGATAACC TCGCEÅTTG6 2880 GCGAÅHTTTG CGCTTAAAAL 2900 AGTCTÅGACT TCAEATCTGA 3000 1 CGAGAAGGGG GCTCTTCCCC 3060 T CGÅEAA CTCTT 3120 AACTGGAGCC TTGÅCCTCGG eller av ett nukleinsyraàféragment, som ingår i en nuQléptíg-z7 sekvens vilken kodar för följande peptidsekvens: mm .mm mm mm mm mm mm mm mm. mm wJmD PÉTGLUAWILETHRSERGLYPTELEUGLY 60 AAC TGT TCT TAG GAG TGT TATC GGC GTC PGA ATC CTC ACA ATA CCG CAG AKS nu: Lau ma m: Pm em 120 AGA GAC TTA TCT CTC AAT TTGACA LEUTHR mmm CACCTGA TGGTGGACT TRPTRPTHRSÉRLEUASN 150 mms www TIS mm mmm mmm mmm mmm Pb VI .d%&. Twmm mm” .mmm mmm mmm mmm www www må Må mmm www - 2110 CCA ATA CCG ACC TAC ACA GAC GCC GCA NV\ mm me Mm mm MW mm mm 26 460727 710 TAGGACGÅCGATACG AT C CTG CTG CTA TGC ILELEIJLEIJEUCYS AAGGPGAPG ITCCTCTTC LEUPHE TPG_ T ATC ATC A ILE '_ILE PHE 3G) GAA GÅC CTG ATA CITCTGGACTAT LEULEIJASPTYR 330 T Tee feeïec ccï eeï Acc ßec Ace eeA ccA THR seR THR eLY Pm wmwï mm mmwwmmfl mmmmemw mwmmwwm www www mm 3% PGG ACA Afß AEA TGG C TCC TGT TGC .TGT ACC R) SER CYS CYS CYS THR m cee me eeï new Aee Ace een Me ecï 'ur (IC ATC. CFA TCA TCC TGG GCT TIC ÜGA NV\ PRO ILE PRO SER SER TRP l\U\ PIE GLY IYS TTC TCC ETC GLN ACC TGT CYS och att nämnda insats kodar för en immunogen peptid, som ingår i ett hepatit B-ytantigen och framkallar antikroppar in vivo mot ifrågavarande hepatit B-virus, varvid nämnda insats är in- förlivad i vektorn för att möjliggöra expression av insatsen i en lämplig bakterie eller eukaryot cell, när vektorn inför- livas däri.

2. Vektor enligt krav 1, att DNA-insatsen innefattar upp till 1200 nukleotider i korrekt GAT CTA CCC GAA CTT~ LEU Act TGG TRP GAG CTC LEU AAG TTC PHE ABT TCA SER GGT CCA PRO AAT 11A LEU ACC TGG TTÜ* crc eAe GLU TCA ABT SER CAT GTA VAL CAA GTT VAL TCA AGT SER GGC CCG PRO CAT GEA NUV- 'TAT TYR 27 Ace eee Aer eee Tee eccüïcA ecc Slte HaeIII TAP ALA SEA ALA eeT CCA PRO CAC GTG VAL GAT COA LEU AAT TTA. LEU GGG CCC PRO AGG TCC SER GAA CTT LEU ccc eee eLy TAC ATG VET TAC ATG VET ACC TGG TRP ATA ILE TAG ATC ILE TCO AGC SER GAC CTG UHJ ATG TAC TYR TAA ATT ILE GGT CCA PRO AAT TTA LEU GAC CTG LEU ATT 5' TAA 3' STOP ~ TAA ATT ILE ATG TAC k ä n n e t e c k n_a d ¶eeo'727 GCA AAG TTC PHE sun ' rAA en vAL 570 cAA en vAL eee AIA ïAï TYR eso TcA Aer sER ego AAA Trr PHE \. . aV 28 Éåšgqrazéèzang i vektorn för att koda en polypeptid med de ímmunogena egenskaperna hos följande polypeptidsekvens: GLN PRO ILE VAL THR Lvs A få TRP LEU 30 mä ßsN Pm ILE uau GLY THR E TRP SER GLY PRO SER SER THR m: LEU SER ALA SER PHE LEU PRO PRO ILE 2A 50 ARGAELBJNRILEPRoGLNSERLEU/SPSERIRP [EU GLN CYS LEU ASP SER GLN ASP GLY SER THR SER PHÉ AO ASN SER 70 PRO PHÉ PiE PRO GLY ILE lm- 'IYR THR 150 GLY GLY 160 l-.YS LEU lä] VAL LEU 220 PHÉ GLN THR THR 'IYR CYS LEU GLY THR SER TYR ARG LEU LEU GLY MET SER 'IHR SER VET CYS THR LBJTRP VAL PRO LEU SER SER ILE LEU TRP GLY ASN TRP LEU uau GLY TYR CY S GLU PHE VAL LEU VAL Vektor enligt krav 1 eller 2, av att DNA-insatsen innehåller en sekvens med formeln: TH 60 HIS MET ä) CYS PRO 120 PRO PRO 150 ILE TRP 180 VAL ILE 210 SER YYR m2 seR cvs LEU vAL cYs æR PRo Am em TRP PRO 226 ILE VAL PRO LEU I LE CYS ARG CY S I Uf SER TRP PH APLE CY S THR ARG PHE PRO THR CYS âššš LEU SER ARG LEU LEU CYS CY S SER ARG VAL TRP PRO 50 GLY S CYS 80 PLE LEU 110 ILE »HA lAO THR SER 170 PíE GLY 'ZIIJ 'TYR LEU k ä n n e t e c k n a d -----_-_- ...___ .. -_ A __d_v%___ ___ _ _ AAC TTG TCA AGT SER GTT GLN AGT TCA SER - CCA GGT GLY AAC TTG GAT CT A GAT CTA TTA AAT ASN GGT CCA ATA TAT TYR TGT ACA CTG GAC -ASP ccc ess GVLY AGC TCG SER TGG ACC THR CCG -CGC ARG TCT AGC TCG SER CCT GGA GLY GTC GLN TCT SER ACC TGG TRP TAG ATC l LE ACC TGG TRP TGA ACT THR TCC SER ACA TGT CYS TAC- ATG GAG CTC ACC TGG TRP TGG' ACC THR GGT CCA PRO GGA CCT PRO TGT CYS TGT THR TGA THR GTG VAL TGG ACC THR GGT CCA GAC Cl G TAT ATA l LE TCT SER ACA TGT CY S AGG TCC SER TGA ACT THR GCC CCG NTG GGC CCG PRO CTC LEU GAA CTT _!FU TTA AAT ASN ACA TGT CY S GCA CGT NTG ASN TH' _ ,_.___ áí_._____ 460 727 TAG ATC ILE GAG CTC LEU GTT CAA GLN GGT CCA Pm ACG TGC CYS TGG ACC THR TTT ' AAA LYS T GGG CCC PRO TAG ATC T LE TAG ATC T LE CCA GGT eLy vfr STTeBg CCT GGA AAG TTC PHE MG. TTC PHE TAC ATG AGG TOC GLY GCC CGG ARG AGA TCT SER GGA CCT Pm TAG AI C ITT] SER - TGG ACC THR TAC ATG VET mc Tcß _ssR GGT CUT PRO GAG CTC LETJ AAC TTG LETJ AAC TTG -LEu mHI Aßï TCA SER ACG TGC CY S ATA TAT TYR CTG GAC ASP AGT TCA STÉR 30 AAG TTC PHE AAC TTG LEU GGG CCC Pm TGT ACA THR TAC ATG TVET GGG CCC Pm ccI GGA GLY AGG TCC SER TAG ATC ILE GTT VAL GTT VAL TGG ACC THR TGA ACT THR TCC SER TTA AAT ACC TGG TRP CTG GAA CTT ACA TGT CYS Tcß mac seR TGA ACT THR ACA TGT CYS TGC CYS (GA GCT GAC CTG LEU GAC CT G LEU CCT Pm TGC ACG THR GCT AGG TGC CYS TGG ACC THR NTG TTC PTTE GAT CT A LEU CTG GAC ASP GAT CTA CCT GGA GLY GTT GLN ACA TGT CYS ACA TGT CYS CCT' GGA GLY 270 TGC CYS 'šm ATA TAT TYR 350 TAA ATT T LE 360 GGT CCA Pm 390 CCT GGA GLY A20 TGG ACC A50 TAA ATT TLF. A80 'T T T' TYS á T 1 T Y T T T T T T T T T 31 460 727 S10 AAeeATAcccTcAcfffïešAerceeecAA/Te TTc cTA Tee eAe Teei TcA ecc ceT TTc STte HaeTlT TAP ATA see ALA AAe PH: sAe Aee AcceAe TTA AATeAT cAceeTAAA cAA Tcc Tee cTc AeT TTA cTA eTe ccA Trr err- seR TAP Leu see Leu Leu vAL Pm PHE vAL57 e eTcAccAAeeATccceAAAeeeeeTeAcAA cAeTeeTTceTAeeecTTTeccccAcTeTT eLN TAP PHe vAL eLY La: sL-:R PPo TAP vAL . eee Ace eAA AeT TAA TAT Acc TAc TAc Ace ATA Tee cTT TTA eTT ATA Tee ATe ATe Tee TAT TRPLEUSERVALTLETRPTETPHTPPTYR ezo Acc ccc eeT TcA eAc ATe Tee TAe AAc TcA Tee eee ccA AeT cTe TAc Aec ATe »TTe AeT TRP eLY PPo see LLTJ TYR seR TLf Leu serågo eeeAAAAATeeceAcAATeeTTAAAAeAAA ccc TTT TTA ceecTe TTA ceA ATT Trc TTT PPo PHP: Leu PRo Lfu LHT PRo TLL-ï PAL: PTTP. PHE LEU TRP GLU ACA GAA ÅCC CAT ATG TAA ATT 5' TGT CTT TGG GTA TAC ATT T/V\ 3' CYS LEU TRP V/\|_ TYR lUÉ STOP - 4. Vektor enligt något av de föregående kraven, k ä n n e t e c k n a d av att den består av en plasmid inne- fattande åtminstone en del av laktosoperonen, inkluderande pro- motorn och åtminstone en del av Z-genen av denna operon, varvid DNA-insatsen är insatt i nämnda del av Z-genen.